basophiles

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basophiles

ANALYSE DU CD 203c EN CYTOMETRIE EN FLUX
POUR DETECTER L’ACTIVATION DES BASOPHILES
DANS L’ALLERGIE AUX MEDICAMENTS
INTERET ET LIMITES
___________
J. BIENVENU, A.L. DEBARD, A. ROZIERES,
M.C. GUTOWSKI, D. GAUJAC, G. MONNERET
J.F. NICOLAS, N. SAAD, Y. BENOIT, G. COZON
Laboratoire d’Immunologie et UF d’immunoallergologie
Centre Hospitalier Lyon-Sud
Consultation d’Allergo-Anesthésie
Hôpital Edouard-Herriot
POURQUOI ETUDIER LE BASOPHILE
?
• Activation des mastocytes et des basophiles à l’origine des réactions
d’hypersensibilité immédiate
• Les basophiles sont présents dans le sang circulant contrairement aux
mastocytes dont ils présentent la majorité des propriétés en particulier
pour détecter une sensibilisation
• Ces cellules sont caractérisées par la présence de récepteurs de forte
affinité pour les IgE (Fc εRI). Après « pontage » de ces récepteurs par
l’allergène, les médiateurs libérés déclenchent les phénomènes allergiques
• La cytométrie en flux représente une technique de choix pour étudier
une population faiblement représentée comme les basophiles
PRINCIPE DU TEST D’ACTIVATION DU BASOPHILE
• Reproduire ″in vitro″, après incubation en présence
d’allergène de basophiles sensibilisés, les conditions ayant
conduit aux phénomènes allergiques cliniques observés
chez le patient exposé à cet allergène
• L’allergène doit posséder au moins deux épitopes distincts
pour créer un pontage entre deux molécules d’IgE fixées
sur les Fc εRI.
N.B. Les médicaments sont assimilés à des haptènes
monovalents.
MARQUEURS DE L’ACTIVATION DES
BASOPHILES
• Libération d’histamine
• Libération de cytokines : IL-4, IL-13
• Expression du CD63
• Sur expression du CD203c
LE CD 63
• CD63 (gp53) membre de la superfamille des protéines
transmembranaires de type 4
• Antigène exprimé sur des plaquettes, les basophiles, les
mastocytes, les monocytes et les monocytes/macrophages
• Les basophiles au repos n’expriment que très peu l’antigène CD63 car
il est lié aux granules intracytoplasmiques
• L’activation des basophiles entraîne la fusion des granules avec la
membrane plasmique et donc l’expression du CD63 à la surface des
cellules
LE CD 203c
•
CD 203C : ectonucléotide pyrophosphatase/phosphodiesterase (E-NPP3) qui
agit sur les déoxynucléotides, le NAD
•
Initialement détecté dans l’utérus, la prostate et certains carcinomes du côlon,
le CD 203c a été mis en évidence à la surface des basophiles et des
mastocytes de manière sélective et constitutive (AC monoclonal 97 A6)
•
Fonction inconnue dans la physiopathologie du basophile et de l’allergie
•
L’activation des basophiles, en particulier par un allergène, induit une
surexpression rapide (5 min) du CD 203c
•
L’IL-3 augmente l’expression de CD 203c, mais processus lent (90 min)
COMPARAISON DES PROPRIETES
DU CD 203c ET DU CD 63
• Le CD 63 n’est pas exprimé de manière
constitutive sur le basophile contrairement au
CD 203c
• Après stimulation par un allergène, l’expression
du CD 63 est plus lente (15 min) que celle du
CD 203c (5 min) : processus de signalisation et
de stockage différents pour ces deux molécules
CD203c
% activated
basophils
60
40
30
CD63
20
10
MFI
(% increase / control)
Higher range of variation
of CD203c in comparison
with CD63
50
500
CD203c
400
300
200
CD63
100
1/5000 1/1000 1/500 1/100
Neg
Latex dilutions
Basophil activation test by flow cytometry
(principle of triple staining in whole blood)
Anti IgE
Anti IgE
Anti CD45
Anti
CD45
Anti CD63
Monneret et al., Clin Exp Immunology 1999
Voies de signalisation intracellulaire
SENSIBILITE ET SPECIFICITE DU CD63
CD63
Allergie
Se
IgE spécifiques
Sp
Se
Sp
Alimentaires
80-82%
63-100%
69-79%
78%
Latex
90-93%
100%
70-88%
100%
Pollen de cyprès
91%
100%
76%
100%
Myorelaxants
54%
100%
62%
100%
β-lactamines
42-50%
93%
25-39%
86%
d’après N. Abuaf
IDENTIFICATION DES BASOPHILES PAR LE
CRTH2
• CRTH2 (chemoattractant receptor-homologous molecule
expressed on Th2 cells, Hirai H. et al. J. Exp Med 2001)
est le second récepteur de la prostaglandine D2
• Exprimé sur
basophiles
les
Th2,
les
éosinophiles
et
les
• CRTH2 améliore l’identification des basophiles par
rapport au marquage anti IgE très variable d’un sujet à
l’autre
Whole blood
ungated cells
Gated cells from A
TH2 lymphocytes
A
CD3
SSC
Eosinophils
basophils
CRTH2
CD203c
PROTOCOLE D’ETUDE DE L’ACTIVATION DES
BASOPHILES EN CYTOMETRIE EN FLUX (CD 203c)
Témoin négatif
PBS
Témoin positif
tests
20 μL
Anti-IgE ou fMLP
20 μL
Allergène dilué
20 μL
CRTH2 FITC
10 μL
10 μL
10 μL
CD203cPE
10 μL
10 μL
10 μL
CD3 PC5
10 μL
10 μL
10 μL
Solution
d’activation
100 μL
100 μL
100 μL
Sang EDTA
100 μL
100 μL
100 μL
Vortexer et incuber 15 min à 37°C.
Ajouter 2mL de solution de lyse
Vortexer et incuber 10 minutes à température ambiante
Centrifugation 5 minutes à 200g - Laver au PBS
Reprendre avec du PBS / 0;1% paraformaldéhyde
Vortexer 5s et analyser au cytomètre
MISE EN EVIDENCE D’ UNE ACTIVATION EN PRESENCE
D’ UN ANTIBIOTIQUE
Contrôle neg
Contrôle pos ( IgE )
Allergène ( clamoxyl® )
MISE EN EVIDENCE D’ UNE ACTIVATION EN PRESENCE
D’ UN CURARE
Contrôle neg
Contrôle pos ( IgE )
Allergène ( Célocurine® )
POPULATION ETUDIEE
•
47 patients (16 hommes, 31 femmes) se présentant à la consultation
d’Allergologie du CHLS entre mars 2005 et juin 2006 pour réactions
secondaires à la prise d’antibiotiques
•
Prise en charge :
interrogatoire, examen clinique, tests cutanés, analyse du CD203c
•
Molécules en cause
38
Amoxicilline
(Clamoxyl)
13
Ceftriaxone
(Rocéphine)
4
Ofloxacine
(Oflocet)
2
Pristinamycine
(Pyostacine)
2
Penicilline G
RESULTATS
(47 patients)
Diagnostic clinique
Test
CD 203c
-
27 réactions d’intolérance
négatif
(n = 27)
-
1 réaction d’HS type III
négatif
(n = 1)
-
5 réactions d’HSR type IV
négatif
(n = 5)
-
14 réactions d’hypersensibilité immédiate
positif
(n = 6)
* 11 HSI Amoxicilline
douteux (n = 1)
négatif
(n = 4)
* 1 HSI Bacampicilline (Penglobe)
négatif
(n = 1)
* 1 HSI Pristinamycine (Pyostacine)
positif
(n = 1)
* 1 HSI Cefatrizine (Cefaperos)
négatif
(n = 1)
Caractéristiques du test CD 203c
Spécificité = 100%
sensibilité = 50 %
HYPERSENSIBILITE A L’AMOXICILLINE
CD 203c et RAST
RAST Amoxicilline (C6) (k U/L)
1,03
< 0,35
< 0,35
0,42
< 0,35
0,45
< 0,35
0,65
< 0,35
< 0,35
CD 203c
négatif
douteux
négatif
négatif
positif
positif
positif
négatif
positif
positif
Sensibilité = 50 %
Sensibilité = 40 %
CD 203 + Rast
Sensibilité = 80 %
POPULATION
• 317 patients (116 ♂, 201 ♀); 44,9 Years
[6 months to 82 years].
• Involved drugs :
Myorelaxants
antibiotics
insulins
others
53%
23%
20%
4%
* others:
Anti-inflammatory
molecule;
radio contrast agent;
Latex, Vaccine, …
CHARACTERISTICS OF CD 203c TEST
Specificity: 97 %
PPV: 94 %
NPV:65 %
CHARACTERISTICS OF CD 203c TEST
EXPRESSION SPONTANEE DU CD203c IMPORTANTE
CHEZ L’ENFANT
Adulte
Enfant d’âge < 1 an
DIMINUTION DE L'EXPRESSION BASALE DU CD203c
AU COURS DES PREMIERS MOIS DE LA VIE
MFI CD203c
0,5
34,5
40
1
28,7
2
23,7
35
2
27,4
2
26,4
3
21,5
3
23,8
4
16,9
4
20,7
4
18,9
6
15,8
7
10,5
7
15,6
8
11,4
9
14,4
14
12,7
15
7,2
Adulte
5
MFI CD203c
AGE ( mois )
30
R2 = 0,7426
25
20
15
10
adulte
5
0
0
5
10
AGE (mois)
15
MARQUAGES CD203c PE -CD63 FITC
Negatif
Positif
Allergene
EN CONCLUSION
Mettre au point un test d’activation des
basophiles
pour
les
médicaments,
haptènes monovalents le plus souvent, est
un sujet très difficile.
La sensibilité des différents tests reste
faible, mais la spécificité est excellente.
PERSPECTIVES
Nécessité d’une standardisation :
•
Consensus sur le plan du diagnostic clinique
•
Amélioration de la présentation de l’haptène médicamenteux au système
immunitaire
•
Choix de l’anticoagulant
•
Sang total ou couche leucocytaire « buffy coat »
•
Utilisation d’IL-3
•
Mode d’identification des basophiles (IgE, CRTH2…)
•
Choix du marqueur d’activation CD 203c/CD 63 ou nouveaux marqueurs
(CD 13, CD 164, CD 107…)
•
Mode d’expression des résultats (MFI, pourcentage de basophiles
dépassant un seuil)
Il est urgent de mettre en place des études multicentriques
Identification of CD13, CD107a, and CD164 as novel basophil-activation
markers and dissection of two response patterns in time kinetics of IgE
dependent upregulation (Hennersdorf et al. Cell Res. 2005 May)
CD13, CD107a et CD164 ont été
identifiés comme de nouveaux
marqueurs d’activation du
basophile.
Identification of CD13, CD107a, and CD164 as novel basophil-activation
markers and dissection of two response patterns in time kinetics of IgE
dependent upregulation (Hennersdorf et al. Cell Res. 2005 May)
En étudiant la cinétique d’apparition de ces
marqueurs, les auteurs définissent deux
groupes de marqueurs :
– "CD203c group" (CD13, CD164 et
CD203c)
– "CD63 group" (CD63, CD107a)
en lien avec deux mécanismes
d’activation différents du basophile
Apport des allergènes recombinants
dans l’exploration de l’allergie au latex
L. Selman, F. Bienvenu
Laboratoire d’Immunologie
CHLS
Allergie au latex : généralités
• Historique :
– 1927 : premier cas décrit d’hypersensibilité au latex
– 1979 : premier cas décrit d’urticaire de contact avec des gants
en latex.
– 1986 : mise en évidence du rôle des IgE dans ces
manifestations cliniques
• Fréquence :
– 1 à 2% de la population générale
– 5% chez le personnel soignant (12% du personnel des blocs et
réa)
– 20% des chocs anaphylactiques per-opératoires chez l’adulte,
80% chez l’enfant
Allergie au latex : facteurs de risque
Expositions répétées au latex naturel :
- Professionnelles : Médicales/paramé
dicales/paramédicales (5(5-15%),
industrie du latex, coiffeur, …
-Multiopérations : Spina bifida (30(30-60%)
Risque de sensibilisation au latex naturel
Sensibilisation
Atopie
(Facteur × 2-5)
(Banane, Avocat, Kiwi, Châtaigne…
Châtaigne…)
Diagnostic de l’allergie au latex
Consultation en allergologie :
Interrogatoire et examen clinique
Signes cliniques évocateurs d’une allergie au latex
Suspicion d’allergie au latex
1. Test in vivo = Prick-test
2. Test in vitro : détermination des IgE spécifiques du latex naturel
Bilan discordant
Bilan positif
Bilan négatif
Test de provocation
Positif
Allergie au latex
Négatif
Absence d’allergie au latex
Les protéines du latex
• 240 protéines
• 13 allergènes identifiés par l’International Union
of Immunological Societies :
Hev b n
Hevea brasiliensis Ordre de découverte
Fabrication des allergènes recombinants
Extraction
ARNm
poly-(A)
poly-(A)
poly-(A)
poly-(A)
poly-(A)
poly-(A)
Synthèse ADNc, insertion dans
un vecteur d’expression
Transformation d’un système d’expression
Latex naturel
Extraction,
immobilisation
sur une phase solide
Production d’allergènes recombinants
Immobilisation sur une phase solide
Allergène standard : Latex
ImmunoCAP
Allergène recombinant
ImmunoCAP
Allergènes du latex et profils de sensibilisation
Allergène
Famille moléculaire
Spina bifida
Exposition
professionnelle
Hev b 1
Facteur d’élongation
du latex
Majeur
Mineur
Hev b 2
Endo-ß-1,3-Glucanase
Majeur
Majeur
Majeur
Mineur
Hev b 3
Hev b 4
Lécithinase
Mineur
Mineur
Hev b 5
Protéine acide
Majeur
Majeur
Hev b 6.01
Chitinase de classe I
prohévéine
Majeur
Majeur
Hev b 6.02
Hévéine mature
Majeur
Majeur
Hev b 6.03
Domaine C-terminal
de la prohévéine
Mineur
Mineur
Allergènes du latex et profils de sensibilisation
Allergène
Spina bifida
Exposition
professionnelle
Hev b 7
Protéine patatine - like
Mineur
Mineur
Hev b 8
Profiline
Mineur
Mineur
Hev b 9
Enolase
Mineur
Mineur
Hev b 10
Mn superoxyde
dismutase
Mineur
Mineur
Hev b 11
Mineur
Mineur
Hev b 12
Lipid protein transfer
Mineur
Mineur
Hev b 13
Estérase
Majeur
Majeur
Définition de profils de sensibilisation
90%
Spina bifida
P rofes s ionnels
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
rHev b 1 nHev b 2 rHev b 3 rHev b 5
rHev b rHev b 7 rHev b 8 rHev b 11 rHev b
6.01
12
rHev b
13
Raulf-Heimsoth et al. Clin Exp Allergy. 2007; 37(11):1657-1667
Cas des patients ayant présenté un choc
anaphylactique
90%
Chocs
Autres
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
rHev b 1
rHev b 2
rHev b 3
rHev b 5
rHev b
6.01
rHev b
6.02
rHev b 8
rHev b 9
rHev b 11
Allergènes du latex et réactions croisées
Allergène
Hev b 1
Facteur d’élongation du latex
Hev b 2
Endo-ß-1,3-Glucanase
Réactions croisées
Poivron, tomate
Hev b 3
Hev b 4
Lécithinase
Hev b 5
Protéine acide
Hev b 6.01
prohévéine
Panallergène
Banane, avocat, châtaigne,
kiwi
Hev b 6.02
Hévéine mature
Panallergène
Banane, avocat, châtaigne,
kiwi
Hev b 6.03
Domaine C-terminal de la
prohévéine
Allergène
Hev b 7
Protéine patatine - like
Pomme de terre, tomate
Hev b 8
Profiline
Panallergène
Pollens, fruits
Hev b 9
Enolase
Moisissures (Alternaria,
Cladosporium)
Hev b 10
Mn superoxyde dismutase
Moisissures (Aspergillus
fumigatus)
Hev b 11
Fruits (châtaigne)
Hev b 12
Lipid protein transfer
Panallergène
Fruits
Hev b 13
Estérase
rHev b
1
2
3
4
5
6.01
6.02
6.03
7
8
9
10
11
12
Aliments d’origine végétale
Chitinase
classe I
Glucanase
Patatine
LTP
Profiline
Pollens
Profiline
Moisissures
Enolase
MnSOD
Etude réalisée au CHLS
• Objectifs :
– Optimiser le diagnostic de l’allergie au latex par
l’utilisation des allergènes recombinants du latex
– Cibler les allergènes recombinants du latex d’intérêt
diagnostique
• Population :
– 161 patients sensibilisés biologiquement au latex
– 2 groupes :
• Allergie au latex confirmée (119 patients)
• Sensibilisation biologique sans allergie clinique au latex (42
patients)
13
Fréquence des allergènes recombinants
du latex dans la population allergique
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
rHev b 1
rHev b 2
rHev b 3
rHev b 5
rHev b 6.01 rHev b 6.02
rHev b 8
rHev b 9
rHev b 11
Résultats population allergique :
• Forte corrélation entre rHev b 6.01 et 6.02 :
– Sur 93 patients positifs pour rHev b 6.01, 85 sont également
positifs pour rHev b 6.02 (1 seul patient est positif pour rHev b
6.02 et négatif pour rHev b 6.01)
• Forte corrélation entre rHev b 2 et rHev b 6.01/02 :
– Sur 84 patients positifs en rHev b2 :
• 83 sont également positifs en rHev b 6.01 et en rHev b 6.02
• 1 n’est positif qu’en rHev b 6.02
• 1 n’est positif qu’en rHev b 2
rHev b 2 n’est plus commercialisé depuis Janvier 2007
rHev b 6.01 est donc l’allergène recombinant permettant
de dépister un maximum de patients allergiques
• Corrélation entre rHev b 6.01/02 et tests
cutanés :
– 93 patients avec des IgE anti-rHev b 6.01 :
– 83 tests cutanés ont été réalisés :
• 79 sont positifs en prick-test
• 2 sont négatifs en prick-test mais positifs au test
au gant
• 2 seulement sont négatifs
Cas clinique : Mme C. Michèle
• Aide soignante
• Terrain atopique :
– Asthme à l’ambroisie
depuis 1995
– 2004 : allergie aux fruits
exotiques
• 2005 : urticaire géante et
œdème 15 min après la
mise de gants en latex
• Tests cutanés au latex
positifs
• K82 : 5.41 kU/L
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
rHev b 1 : <0.10
rHev b 2 : 1.47
rHev b 3 : <0.10
rHev b 5 : 2.60
rHev b 6.01 : 2.27
rHev b 6.02 : 2.27
rHev b 8 : <0.10
rHev b 9 : <0.10
rHev b 11 : <0.10
Broméline : <0.10
Allergie professionnelle au latex : réorientation de l’agent dans
un service sans latex
• rHev b 5 :
– Présence d’IgE dirigées contre rHev b 5 moins
bien corrélée avec la présence des IgE antirHev b 6.01 par rapport aux IgE anti-rHev b
6.02 et rHev b 2 :
• Sur 71 sérums positifs en rHev b 5, 57 seulement
réagissent également avec rHev b 6.01
– 7 patients sur 119 ont un rHev b 5 isolé et une
clinique évocatrice d’une allergie au latex :
• 3 tests cutanés sur 6 réalisés sont négatifs
Cas clinique : M. Z. Oualid
• Externe en médecine
• Clinique très évocatrice
d’une allergie au latex :
– Rhinoconjonctivite à
l’arrivée dans le service
• K82 : 4.39 kU/L
• Mais :
– Prick-test négatif
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
rHev b 1 : <0.10
rHev b 2 : <0.10
rHev b 3 : <0.10
rHev b 5 : 1.84
rHev b 6.01 : <0.10
rHev b 6.02 : <0.10
rHev b 8 : <0.10
rHev b 9 : <0.10
rHev b 11 : <0.10
Broméline : <0.10
Population non allergique
• Latex positif /rHev b 8 isolé (33 patients)
– 29 tests cutanés négatifs sur 29 testés
– Tous les patients sont polliniques
– A noter :
• Dans la population« allergique et non pollinique »,
rHev b8 est seulement retrouvé chez 2 patients sur
57.
Latex « faussement positif » chez certains
patients polliniques sensibilisés à la
profiline
Population non allergique
• Latex positif / recombinants négatifs (9
patients) :
– Broméline isolément positive chez 8 patients
présence d’IgE anti-carbohydrate (faux
positifs)
– Un patient négatif pour tous les recombinants
testés et pour la broméline
Fabrication des allergènes recombinants
poly-(A)
poly-(A)
poly-(A)
poly-(A)
poly-(A)
poly-(A)
Extraction
ARNm
Synthèse ADNc, insertion dans
un vecteur d’expression
Transformation d’un système d’expression
Latex naturel
Extraction,
immobilisation
sur une phase solide
Production d’allergènes recombinants
Immobilisation sur une phase solide
Allergène standard : Latex
ImmunoCAP
Allergène recombinant
ImmunoCAP
Exemples :
• B. Marie :
– Terrain atopique :
• Rhinite allergique
saisonnière
• Œdème des lèvres
avec kiwi, ananas et
banane
– K82 : 2.60 kU/L
• R. Marilyne :
– Aide soignante
– Terrain atopique :
• Rhinite allergique
• Allergie aux pollens de
graminées
– K82 : 2.51 kU/L
• B.Marie :
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
• R. Marilyne :
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
rHev b 1 : <0.10
rHev b 2 : <0.10
rHev b 3 : <0.10
rHev b 5 : <0.10
rHev b 6.01 : <0.10
rHev b 6.02 : <0.10
rHev b 8 : 3.12
rHev b 9 : <0.10
rHev b 11 : <0.10
Brom : <0.10
rHev b 1 : <0.10
rHev b 2 : 0.36
rHev b 3 : <0.10
rHev b 5 : 1.65
rHev b 6.01 : 0.96
rHev b 6.02 : 0.96
rHev b 8 : <0.10
rHev b 9 : <0.10
rHev b 11 : <0.10
Brom : <0.10
– Prick test : positif
– Prick test : négatif
• Conclusion :
– K82 faussement positif
chez une patiente
pollinique
• Conclusion :
– Allergie professionnelle
au latex
Au final
Consultation en allergologie :
Interrogatoire et examen clinique
Suspicion d’allergie au latex
1. Test in vivo = Prick-test
2. Test in vitro : détermination des IgE spécifiques du latex naturel
Bilan positif
Bilan discordant
Bilan négatif
Détermination des IgE spécifiques dirigées
contre les allergènes recombinants du latex
IgE anti-rHev b 6.01
IgE anti-rHev b 5
Allergie au latex
Monosensibilisation
rHev b 8
Absence d’allergie au latex
Conclusion
• Utilisation des allergènes recombinants
dans le diagnostic de l’allergie au latex :
– Aide dans les cas posant un problème
diagnostic
– Définition de profils de sensibilisation intérêt pour l’immunothérapie spécifique
– Meilleure compréhension des réactions
croisées
Diagnostic immunobiologique de l’hypersensibilité
retardée aux médicaments
Aurore ROZIERES
AHU – INSERM U851-Laboratoire d’Immunologie CHLS
Réaction d’hypersensibilité aux médicaments
MISE EN JEU DE L’IMMUNITE SPECIFIQUE
♦ Réactions immé
immédiates (Angiooed
(Angiooedèème,
me, Choc Anaphylactique)
⇒ IgE spé
spécifiques
♦ Réactions retardé
retardées (Syndrome de Lyell, Toxidermie maculomaculo-papuleuse )
⇒Lymphocytes T spé
spécifiques
EXPRESSION CLINIQUE
REACTION BENIGNE
Erythème Polymorphe
Exanthème maculo-papuleux
DRESS Syndrome (Drug Reaction with
Eosinophilia and Systemic Symptoms )
Nécrolyse Epidermique Toxique (Lyell)
REACTION GRAVE
Classification des réactions d’hypersensibilité allergiques aux
médicaments de type IV
CLASSIFICATION DE GELL ET
COOMBS MODIFIEE
MECANISME EFFECTEUR
TYPE IV a
Th-1 IFN-γγ
Activation des monocytes
TYPE IV b
Th-2 (IL-5 et IL-4)
Inflammation éosinophilique
TYPE IV c
CTL ( perforine / Granzyme)
CD4 ou CD8 cytotoxiques
TYPE IV d
LT - IL-8
Recrutement et activation de neutrophiles
EXEMPLE DE REACTIONS
D’HYPERSENSIBILITE
Eczéma
Exanthème maculo-papuleux
Exanthème bulleux
Exanthème pustuleux
D’après Pichler WJ. Classification des réactions d’hypersensibilité allergiques aux médicaments de type IV.
DIAGNOSTIC DE L’HYPERSENSIBILITE AUX
MEDICAMENTS
MANIFESTATIONS CLINIQUES
- Toxidermies érythémateuses
- DRESS
- Lyell, Stevens-Johnson
IMPUTABILITE
TESTS CUTANES / TESTS BIOLOGIQUES
Patch / IDR
lecture 48 heures
Tests +
Tests –
Hypersensibilité
Allergique
Hypersensibilité
Non Allergique
HSR
Diagnostic de l’hypersensibilité retardée
REACTIVITES CROISEES
TESTS EPICUTANES – PATCH-TESTS
48h à 72h
Amoxicillin
O
H2N
NH
O
S
CH3
N
O
O
MEDICAMENTS
Antibiotiques ( ß-lactamines ; sulfonamides …)
CH3
O
BUT DU PROJET
BUT DU TRAVAIL
Le but de ce travail est de caractériser les LT effecteurs des réactions
d’HS allergique retardée aux médicaments par une analyse du rôle
respectif des LT CD4+ et CD8+ dans leur développement.
Physiopathologie de l’HSR aux médicaments
Lésion Clinique
Sensibilisation par voie systémique
Epiderme
LT
Orale
LT
LT
LT
Derme
LT
LT
LT
LT
1
3
4
LT
Nassif and al. J Allergy Clin Immunol. 2004
Teraki and al. J Allergy Clin Immunol. 2003
Hari and al. Clin Exp Allergy. 2001
Hertl and al.J Invest Dermatol. 1993
LT
LT
Extravasation
Migration et maturation des CD
JDE
Vaisseau sanguin
Lymphe afférente
2
Lymphe efférente
LT
LT
LT
Phase de sensibilisation
Ganglion drainant
Phase de révélation
Recirculation des LT
Activation des LT
5
LT
I.V
Recrutement des LT
Capture de l’Ag
Couche cornée
PARTIE I
PARTIE I : ANALYSE DES EVENEMENTS
INITIATEURS DE LA REACTION
INFLAMMATOIRE
METHODE
DEUX APPROCHES
1- Analyse du recrutement cutané
cutané au niveau des tests cutané
cutanés
2- Analyse des LT spé
spécifiques d’
d’amox dans le sang
périphé
riphérique des patients
SUJETS INCLUS DANS L’ETUDE
Patients ayant une HSR à l’amoxicilline (Patch(Patch-test positif Amox.
Amox. /
PatchPatch-test né
négatif Ceft.)
Ceft.)
LT CD8+ infiltrent précocement le site d’application de l’amoxicilline
Analyse Immunohistochimique
Analyse Histologique
Anti-CD8
Anti-CD3
1
4
7
2
5
8
3
6
9
Amox
48h
Amox
12h
Ceft.
12h
LT CD8+ qui infiltrent la lésion sont IFNγ +
Patients HSR Amox.
Amox.
Contrôles
A
1
NS
12h
NT
2
48h
12h
3
48h
12h
4
48h
12h
5
48h
12h
48h
CD8
IFNγ
IFNγ
CD4
Actine
B
CD8
CD4
IFN-γ
80
140
20
0
NS
NT
1
2
3
4
5
6
120
80
60
40
20
0
NS
NT
1
2
3
4
5
6
% DO CD4 / DO Actine
40
% DO IFN-γ / DO Actine
% DO CD8/ DO Actine
100
60
100
80
60
40
20
0
NS
NT
1
2
3
4
5
6
LT CD8+ qui infiltrent la lésion sont CTLs
Patch-test Amox (12h)
CD8
Normal Skin
Granzyme B
TUNEL
Skin patch-test 12h
Perforin
CD1a
Skin patch-test 12h
CONCLUSION I
► L’analyse de la cinétique de recrutement des LT cutanés montre une
infiltration précoce par des LT CD8+ cytotoxiques (IFN-γ+, GrB+, perf+) 12 heures
après l’application du médicament.
► Cette infiltration cutanée est associée à une apoptose des kératinocytes
identifiée par un marquage TUNEL.
► Le recrutement des LT CD4+ intervient, quant à lui, plus tardivement.
Présence de LT spécifiques CD8+ IFN-γ+GrB+ d’amox chez les
patients allergiques
A
PBMCs
PBMCs déplétés CD8+
PBMCs déplétés CD4
B
120
100
9
4
70
1
60
50
40
11
14
5
12
10
8
13
7
30
15
2123 20 2217 19 16
25
24
18
20
10
5
4 8
1
9
10
11 7
14
13 12
0
Patients
Controles
Amox 1mg/ml
Patients
15
1822 172120 16
19
25
24
GrB SFC/106 PBMC
100
80
IFNγ SFC/106 PBMC
IFNγ SFC/106 PBMC
90
80
60
40
20
12
35
14
30
11
13
25
20
15
10
20 25
23
18
12 11
14
13
0
0
Ceft 1mg/ml
40
5
23
Controles
45
Amox
1mg/ml
Amox
0,6mg/ml
Amox
0,3mg/ml
Ceft
1mg/ml
Patients
Controles
Patients
Amox 1mg/ml
CONCLUSION II
► L’analyse des LT du sang périphérique a permis de mettre en
évidence la présence de LT CD8+ spécifiques d’amox sécréteurs d’IFN-γ et
de GrB après la restimulation par l’amox chez les sujets allergiques avec
une fréquence de LT CD8+ spécifiques d’amox comprise entre 50 et 150 /
106 PBMCs.
► Les LT CD8+ spécifiques d’amox jouent un rôle prépondérant dans
l’initiation de l’HSR aux médicaments se présentant sous la forme d’EMP.
18 2023
25
Controles
Ceft 1mg/ml
Physiopathologie de l’HSR aux médicaments
Voie Systémique
(Orale ou IV)
Epiderme
CD8
Orale
IFN-γγ
CD8
I.V
IFN-γγ
CD8
CD8
Derme
CD4
CD8
Cellules
dendritiques
CD4
CD4
CD8
CD4
CD4
Lymphocytes T
CD4+
Extravasation
Vaisseau sanguin
Lymphe efférente
CD8
CD4
Phase de sensibilisation
CD8
Lymphocytes T
CD8+
Ganglion drainant
Phase d’élicitation
PARTIE II
PARTIE II: DETECTION DES LT SPECIFIQUES DU
MEDICAMENT CHEZ DES SUJETS ALLERGIQUES
AUX MEDICAMENTS
Recirculation des LT
Lymphe afférente
Activation des LT
Migration et maturation des CD
JDE
IFN-γγ
CD8
Recrutement des LT
Capture de l’Ag
Couche cornée
INTERET
DIAGNOSTIC BASE SUR LES TESTS CUTANES
1- Accessibilité
Accessibilité à un centre d’
d’allergie au mé
médicament (peu de
centres en France; hospitalisation des patients )
2- Effets secondaires : sensibilisation – déclenchement d’
d’une
réaction
3- Aide dans les cas d’
d’interpré
interprétation des tests difficiles
Les tests biologiques existants
Test de Transformation Lymphocytaire:
Sang hépariné
Index de stimulation (SI) =
cpm avec l’
l’antigè
antigène / cpm sans
l’antigè
antigène
Ficoll
PBMC
Médicament 2
Médicament 1
RPMI 1640
10% sérum autologue
Témoin négatif
Témoin positif
5 jours
Ajout Thymidine Tritiée
12h
Mesure de l’incorporation de thymidine
Avantages:
-Mesure de la prolifération
-Inconvénients:
-Sensibilité moyenne ( 60-70% βlactams
-Utilisation de radioactivité
-5 jours de culture
Test ELISPOT IFN-γ
anti-IFN-γγ
Médicament
anti-IFN-γγ
Avantages:
-Méthode rapide
-Bonne sensibilité
-Quantification du nombre de
cellules productrices d’une cytokine
DETERMINATION DES SEUILS
A
Sujets Controles
Amox
+
IFN-γγ
SFC
18
B
Patients HSR Amox
C 150
SFC 1.106 PBMCs
IFN-γ SFC/106 PBMC
8
78
40
30
100
20
10
0
-
+
Amox
1mg/ml
Ceft
1mg/ml
50
0
1mg/ml
0.5mg/ml 0.1mg/ml
Concentration Amox
METHODE
SUJETS INCLUS
3 groupes:
- AmoxAmox-HSR n=22
- AmoxAmox-Tolerant n=15
- AmoxAmox-HSI n=15
METHODE
-Test de Transformation Lymphocytaire
-ELISPOT IFN-γ
RESULTATS (1)
ELISPOT IFN-γγ
TEST DE TRANSFORMATION
LYMPHOCYTAIRE
7
7
6
Index Stimulation
8
5
DT
H
Am
ox-
1 5 188
2120 19 17
9 4 11 143
2
10156 137
12 16
- Sensibilité
Sensibilité : 91%
- Specificité
Specificité : 95%
83 19 7 2106
11
5
4
13
1
4 12
15
6
1410 7 11
5 9 8
32
1
8
4
5
6
15
19
21 2
209 314
18
22
171011112
16
13
8 11
4
5
7 16
9 2
3 10
5 8 10
13
3 2
4
11
12
15 1 14
7
9
6
11 22
7 1 133
198
20145 417
15 16
21918
210
12 6
10
5 11
3 1 7
4 6
8 2 9
14 6
9 2 813 5 411
1
7
10 31215
0
Am
oxtol
era
nt
Am
oxIH
S
0
1
5 14
10
6
7 9
1215 2 811
3 13
4
IH
S
1
24 1011 3 7 9 6
5
8
Am
ox-
10
2
Am
oxtol
era
nt
17
40
3
DT
H
20
50
Am
ox-
30
10
5
2 1121
121813 15
14 1
15 6 4
20
22
19
16
3
60
4
Am
oxIH
S
70
9
DT
H
90
80
7
Am
oxDT
H
100
Am
oxtol
era
nt
IFN-γγ SFC/1.106 PBMC
110
Ceft. 1mg/ml
Amox 1mg/ml
Ceft. 1mg/ml
Am
ox-
120
Amox 1mg/ml
Am
oxtol
era
nt
Am
oxIH
S
130
- Sensibilité
Sensibilité : 68%
- Spé
Spécificité
cificité : 95%
RESULTATS (2) - Corrélation entre LTT et ELISPOT
7.5
p<0,05
Stimulation Index
LTT
7
5.0
2.5
4
5
6
16 155 14
3
20 18 21
2
22
1 1211 10
19
17
8
9
13
R=0,54
0
0
25
50
75
IFN-γ SFC/ 106 PBMC
100
125
ELISPOT Assay
35
14
25
20
LTT
3
16
30
13
1
3
1
15
19 15
22
21
10
11
17
5
10
12
20
9
2
18
0
1
2
3
7
6
5
8
4
4
5
Stimulation Index
6
7
Nbre d’années entre accident allergique et test
Nbre d’années entre accident allergique et test
RESULTATS (3) – Etude du maintien des LT spécifiques
35
ELISPOT assay
3 16
30
14
25
1 13
20
19 15
22
15
10
17
20
6
5
122 5
4 18
0
0
25
50
7
21
11
10
9
75
8
100
IFN-γ SFC/ 1.106 PBMC
125
150
RESULTATS (4) – Analyse des réactivités croisées
B
A
3
1,5
1
0,5
Ti
ca
rcl
lin
Am
p ic
ill
Ba
in
ca
mp
ici
lli
n
Pe
ni
G
Ce
ft r
iax
on
0
IFN-γ SFC / 106 PBMC
2
60
50
40
30
20
10
0
Ti
ca
rci
lli
n
Am
p ic
ill
in
Ba
ca
mp
ici
lli
n
Pe
ni
G
Ce
ft r
iax
on
Index Stimulation
2,5
70
CONCLUSION III
► 20/22 patients (91%) testés ont un nombre significatif de cellules T
spécifiques de pénicillines sécrétrices d’ IFN-γ, alors que le Test de Transformation
Lymphocytaire (TTL) n’est positif que pour 15 des 22 patients (68%) testés.
► L’ELISPOT IFN-γ est capable de détecter les réactions croisées entre
différentes molécules chimiques.
► L’ELISPOT IFN-γ apparaît plus sensible que le TTL pour la détection des
LT spécifiques de pénicillines
► Ces données montrent que l’ELISPOT IFN-γ est une nouvelle méthode qui
permettrait d’améliorer le diagnostic de l’allergie aux β-lactames et peut aider au
choix d’un traitement antibiotique alternatif.
TRANSFERT TECHNOLOGIE FONDAMENTAL VERS DIAGNOSTIC
IMMUNOBIOLOGIQUE
REMERCIEMENTS
U 851
Directeur: J Marvel
Equipe JF NICOLAS
Anca Hennino
Marc Vocanson
Karen Rodet
Josette Benetière
Hélène Perrin
Gaëlle Poyet
Amine Achachi
Sabine Debeer
Béatrice Vanbervliet
Rosine Tédone
Marie T. Ducluzeau
Cyril Chavagnac
Marlene Bonneville
Audrey Nosbaum
Plateau
d’Immunomonitorage
J BIENVENU
Grégoire Cozon
Laure Denis
Paul Rouzaire
Charlotte Cuerq
Laboratoire d’Immunologie
J BIENVENU
Grégoire Cozon
Françoise Bienvenu
Laure Denis
Paul Rouzaire
Charlotte Cuerq
Karine Dumas
Marie-Claude Gutowski
Daniele Gaujac
Service Immunologie et Allergologie Clinique JF Nicolas
Frederic Berard
Nathalie Gunera- Saad
Benoit Ben Said
Isabelle Guillot
Le diagnostic biologique en allergologie :
méthodes et choix pratiques
DESC Allergologie CHLS 2008
Laurence Guilloux
Laboratoire Marcel Mérieux
La biologie apporte des arguments objectifs pour diagnostiquer
une sensibilisation vis à vis d’un produit allergénique mais ne fait
en rien la preuve de la maladie allergique.
Les résultats de ces examens devront être étroitement liés à
l’interrogatoire et à l’examen clinique du patient pour établir une
relation de cause à effet entre l’exposition à l’allergène et le
déclenchement des signes cliniques.
La qualité analytique des tests biologique doit être la plus
performante possible.
2
Crit
ères de qualit
é d'un test
Critères
qualité
Critères analytiques
– Détectabilité / Sensibilité
– Précision / Reproductibilité
– Exactitude / Justesse (accord entre la valeur mesuré
mesurée et la
valeur "vraie" valeur de consensus)
consensus)
• étalonnage
• liné
linéarité
arité et parallé
parallélisme des courbes de dilution sur
l’étendue
tendue
de
la gamme
’é
– Spécificité
Critères Cliniques
– Spécificité
– Sensibilité
– Valeur prédictive positive : VPP
– Valeur prédictive négative : VPN
3
Crit
ères analytiques (1)
Critères
Limite de détection : Plus petite concentration fournissant une
réponse significativement différente de celle d'un blanc;
concerne le domaine des concentrations faibles ou nulles.
Sensibilité : Aptitude à différencier des échantillons de
concentrations différentes ; intéresse l'ensemble de la zone de
lecture.
Précision : qualité de l’accord entre des mesures répétées
effectuées dans des conditions déterminées. On l’exprime
habituellement par l’écart type ou le coefficient de variation.
4
Crit
ères analytiques (2)
Critères
L'exactitude ou la justesse d'une méthode représentent la qualité
de l'accord entre la valeur mesurée et la valeur "vraie" ou sa
meilleure estimation en dehors des erreurs aléatoires.
Il est donc nécessaire de disposer de la valeur "vraie", souvent
impossible pour les immunodosages ; valeur de consensus.
La spécificité d'un dosage est son aptitude à mesurer l'analyte
désiré et seulement celui-ci, même si des substances de
structure proche se trouvent en quantité importante dans
l'échantillon. Il est évident que cette qualité est ici directement
liée à la nature des anticorps utilisés mais surtout à celle du
produit allergisant.
5
Crit
ères cliniques
Critères
Tests +
Tests -
Malades
VP
FN
VP
VP + FN
VP
VPP =
VP + FP
Se =
Non malades
FP
VN
VN
VN + FP
VN
VPN =
VN + FN
Sp =
6
Th
éorème de Bayes
Théorème
p x Se
VPP =
p x Se + (1(1-p)(1p)(1-Sp)
Sp)
(1(1- p)Sp
VPN =
(1(1-p)Sp + p(1p(1-Se)
7
Caractéristiques du PAPPC-RIA
PAPPC-RIA
Seuil 0.8 % B/T
Seuil 1.1 % B/T
Seuil 0.8 % B/T
Seuil 1.1 % B/T
n = 537
n = 537
n = 93
n = 93
p1
p2
p1
p2
p1
p2
p1
p2
Sensibilité
0.85
0.85
0.82
0.82
0.86
0.86
0.86
0.86
Spécificité
0.91
0.91
0.93
0.93
0.86
0.86
0.95
0.95
VPP
0.62
0.0009
0.66
0.001
0.53
0.0006
0.77
0.002
VPN
0.97
0.999
0.97
0.999
0.97
0.999
0.97
0.999
p1 = prévalence dans la population étudiée : 0.153
p2 = prévalence estimée dans la population Française anesthésiée (1/6500 x 0.60)
8
Nomenclature actuelle des actes de biologie
Tests d’orientation
Tests d’identification des allergènes
Mais encore
Tests cellulaires
• HL
• Cytométrie de flux
(CD45/anti
(CD45/anti--IgE/CD63)
IgE/CD63)
•
LTC4
Tests dynamiques
• Histamine
• Tryptase
• LTE4 urinaire
• ECP
9
De quels tests disposons nous?
Tests d’orientation correspondent à la recherche d'IgE
spécifiques sans identification individuelle : test unitaire vis à vis
d'allergènes mélangés dans le même réactif ou sur le même support.
Recherche de pneumallergènes ;
Une seule cotation par patient
B 55
Recherche de trophallergènes ;
Cotation limitée à 3 allergènes, un test
B 55
Les cotations de ces tests ne sont plus cumulables avec le dosage
des IgE totales.
10
De quels tests disposons nous ?
Test d'identification fait appel à des dosages d'IgE spécifiques
avec mention obligatoire des résultats de l'investigation initiale :
test de dépistage, lecture et interprétation des tests cutanés ou motif
de la non réalisation de ces tests.
Tests unitaire vis à vis d'allergènes multiples séparés dans un
même réactif ou sur un même support :
Une seule cotation par patient
IgE spécifiques, allergène unique :
Pneumallergènes (limitée à 5 Ag )
Trophallergènes (limitée à 5 Ag )
B 80
B 55
B 55
11
Nomenclature: cotations autorisées sur une même prescription
IgE T Dépistage
Pneum
IgE totales Réf. 1200
Dépistage Pneum
Réf. 1201 ; 1 C max
Dépistage Troph
NON
NON
Dépistage
Troph
Multi
allergènes
Identif
Pneum
Identif
Troph
RAST
latex
RAST
venins
RAST
pénni
NON
NON
NON
NON
OUI
OUI
OUI
OUI
NON
NON
NON
OUI
OUI
OUI
NON
NON
NON
OUI
OUI
OUI
NON
NON
OUI
OUI
OUI
OUI
OUI
OUI
OUI
OUI
OUI
OUI
OUI
OUI
NON
OUI
NON
NON
NON
NON
NON
NON
NON
NON
NON
NON
NON
OUI
« RAST » latex
Réf. 966
OUI
OUI
OUI
OUI
OUI
OUI
« RAST » venins
Réf. 967; 5C max
OUI
OUI
OUI
OUI
OUI
OUI
OUI
« RAST » curares, penni
Réf. 968; 5C max
OUI
OUI
OUI
OUI
OUI
OUI
OUI
Réf.1202 ; 3C max
Multi allergènes
Réf.1203 (CLA)
Identification Pneum
Réf.1204 ; 5C max
Identification Troph
réf.1205 ; 5 C max
OUI
OUI
12
Janvier 2004
Tests dd’orientation
’orientation en allergie respiratoire
Phadiatop ; Phadia
Analogues ;
Alatop ; Siemens Dpc
Allergie screen ; Siemens Ciba Corning
Stallertest ; Biomérieux
13
Analogues du PhadiatopTM
Alatop
d1 e1 g2 m1
e5 g6 m6
Allergy screen
w1 t3
w9 t17
w19
d1 e1 g2
d2 e3 g5
e5 g6
m2
m3
m6
t3
t7
t9
t17
w1 i6
w6
w9
w19
Stallertest
d1 e1 g3
e2
m2
m6
t3
t9
w1 i6
w21
14
Tests d’orientation (pneumallergènes)
Performances du Phadiatop
Métata-analyse à partir des ré
résultats de 20 études ré
réunissant 2700 patients :
Sensibilité
Sensibilité : 91 %
Spé
Spécificité
cificité : 93 %
Corré
Corrélation avec le diagnostic clinique : 92 %
Stallertest versus Phadiatop
Étude de A. Sabbah et col. (Rev fr Allergol 1998) : 155 patients, sensibilité
sensibilité 75% versus
94% pour Phadiatop, VPP 98% versus 100 %, VPN 79% versus 94%
Alatop versus Phadiatop
AlatopTM
Étude Guilloux et col. (Rev Fr Allergol 2003; 43:97)
Concordance globale : 96.6 %
Allergy Screen versus Phadiatop
Etude Hamberger et col. (EAACI 2003)
Concordance globale : 90 % (n=189)
PhadiatopTM
n = 320
Négatif
Limite
Positif
Négatif
202
17
7
Limite
8
5
3
Positif
4
2
15 72
Limites dd’un
’un test dd’orientation
’orientation vis à vis des
pneumallerg
ènes
pneumallergènes
• Faux négatif
– Tous les pneumallergè
pneumallergènes ne sont pas repré
représenté
sentés (cyprè
(cyprès,…
s,…)
– Chez l’
l’enfant, les premiè
premières sensibilisations sont alimentaires
• « Faux positif »
– On dé
détecte une sensibilisation qui n’
n’est pas responsable de la pathologie
observé
observée.
Avis allergologique spécialisé
16
IgE totales : techniques
Il existe au moins une quinzaine de réactifs sur le marché (Abbott,
Biomérieux, Biorad, DPC France, Hycor Biomédical, Phadia, Roche
Diagnostic system... ).
Les techniques se diffé
différencient par la nature du support, du conjugué
conjugué, par
l'é
l'étendue de la gamme d'é
d'étalonnage et encore par leurs diffé
différences de
sensibilité
sensibilité.
Leurs performances analytiques sont comparables (cf. contrôle de
qualité National et International).
17
IgE totales : interprétation, indication
Interprétation
• Facteurs individuels faisant varier le taux des IgEt :
Age, composante gé
génétique, degré
degré d'exposition à l'allergè
l'allergène.
• Autres affections modifiant le taux des IgEt :
Parasitoses, dé
déficit immunitaires, infections virales et bacté
bactériennes
Indication
Le dosage des IgEt n'est pas un test de premiè
première intention pour le diagnostic
d'atopie. Il garde cependant un inté
intérêt dans le bilan allergologique (jeunes enfants,
sujets bons ou mauvais ré
répondeurs, polysensibilisé
polysensibilisés).
18
Pr
évalence de l'allergie alimentaire
Prévalence
• Elle est estimée aujourd'hui en France à 3.5 %
Urticaire, Asthme
Angio-oedème
Choc anaphylactique
« Dermatite atopique »
• Les pourcentages de ces manifestations dépendent étroitement de
l'âge du patient.
19
Fr
équence de l'allergie alimentaire suivant l'âge
Fréquence
393 observations pédiatrie
%
432 observations tout âge
35
32%
(données CICBAA, 1999)
25
17%
15
5
12%
1%
16%
10%
7%
3%
1%
20
0-6 M 6M-1A 1-3A 3-6A 6-15A 15-30 30-45 45-60 + 60 ANS
Tableaux cliniques rencontr
és au cours de
rencontrés
l'allergie alimentaire en fonction de l'âge (n = 703)
%
100
* DA
° Choc anaphylactique
¤ Asthme
+ Oedème de Quincke
90
80
70
* *
*
60
(CICBAA, 1999)
50
+
40
*
30
20
+
10+
°
¤
0-0.5
¤°
0.5-1
0-0.5 0.5-
+
¤
¤°
1-3
°
3-6
+
+
°
+
+
°
¤
*
°
°
¤
*
6-15
1515-30
°
¤
*
3030-45
+
¤
*
4545-60
¤
*
*
> 60
21
Age (ans)
Fr
équence des allerg
ènes alimentaires chez l'enfant
Fréquence
allergènes
(< 15 ans, nombre dd’AA
’AA = 1374, nombre dd’observations
’observations = 886)
Blanc oeuf
Arachide
Lait de vache
Légumineuses
Poissons
Groupe noix
32.8 %
26.1 %
10.6 %
5.2 %
4.4 %
4.1 %
(34%)*
(23%)
(8%)
(3%)
(5%)
(3%)
Additifs
Groupe cé
céréales
Groupe latex
Crustacé
Crustacés
Viandes
Sésame
2.6 %
2.4 % (2%)
2.2 %
1.7 % (2%)
1.7 % (2.5%)
1.4 %
Les A.A. aux allergè
allergènes animaux repré
représentent la moitié
moitié des allergies (51.2 %)
L'allergie au sé
sésame est actuellement en progression, comme celle du groupe noix et
des lé
légumineuses
L’allergie à la moutarde diminue (1.0 % versus 6 %)
*donné
*données 1998
22
(données CICBAA 2002)
Fr
équence des allerg
ènes alimentaires chez l'adulte
Fréquence
allergènes
(> 15 ans, nombre dd’AA
’AA = 418, nombre dd’observations
’observations = 241)
Rosacé
Rosacées
Groupe latex
Ombellifè
Ombellifères
Groupe noix
Groupe cé
céréales
Arachide
14.9 % (15%)*
14.1 % (14%)
9.8 % (11%)
9.1 % (7%)
6.0 % (2%)
5.3 % (4%)
Blanc oeuf
Légumineuses
Sésame
Additifs
Composé
Composées
Crustacé
Crustacés
4.3 % (5%)
3.6 % (3%)
3.3 % (4%)
2.6 %
2.6 %
2.6 % (3%)
Les A.A. aux végétaux sont largement majoritaires chez l'adulte : 71.3%
Leur fré
fréquence augmente avec l'âge, parallè
parallèlement à l'acquisition de la
sensibilisation pollinique.
Ces 3 derniè
dernières anné
années; augmentation AA du groupe fruits secs et cé
céréales.
*donné
*données 1998
23
(CICBAA 2002)
Tests dd’orientation
’orientation (trophallerg
ènes)
(trophallergènes)
Les Trophatop (Phadia), les IMMU Troph (DPC)
Enfant (fx26, fx27, fx28)
Adulte (fx5, fx24, fx25)
Allergènes choisis en fonction des prévalences des
sensibilisations observés chez l'enfant et chez l'adulte.
Les autres mélanges
Ils correspondent en général à des familles d'aliments (produits
de la mer, aromates , farines etc...…)
24
Les Trophatop ((Phadia),
Phadia), les IMMU troph (DPC), les ……
……..
Enfants
Adultes
fx 26
fx 27
fx 28
70.5 % *
16.1 %
7.0 %
fx 5
fx 24
fx 25
22.5 %
25.8 %
16.4 %
Total
93.6 %
Total
64.7 %
fx5 : lait, BO, poisson, arachide, soja, blé
blé
fx24 : noisette, crevette, kiwi, banane
fx25 : graine de sé
sésame, levure de biè
bière, ail, cé
céleri
fx26 : lait, BO, arachide, moutarde
fx27 : poisson, noisette, soja, blé
blé
fx28 : crevette, kiwi, bœ
bœuf, sé
sésame
25
* Taux de couverture théorique en admettant une sensibilité idéale de 100% (CICBAA 2002)
Limites des tests dd’orientation
’orientation vis à vis des
trophallerg
ènes
trophallergènes
• Faux négatif
Tous les allergè
allergènes alimentaires ne sont pas repré
représenté
sentés, en particulier
chez l’
l’adulte.
• « Faux positif »
On dé
détecte des IgEs qui ne sont pas responsables de la sensibilisation,
sensibilisation, en
particulier avec les allergè
allergènes vé
végétaux (problè
(problèmes des ré
réactions croisé
croisées
entre pollens et aliments).
Avis allergologique spécialisé
26
IgE spécifiques (allergène unique)
De nombreuses techniques actuellement disponibles mais dont les
qualités analytiques peuvent être très différentes .
Parmi les principales :
Biomérieux : Vidas
J2L ELITECH : Hycor, Dexall
LabBO Immunosystèmes : ENEA System
Phadia : UniCAP IgE spécifiques
Siemens: DPC ; Immulite 2000, Bayer Diagnostic; ADVIA Centaur
27
IgE spécifiques (méthodes)
• Toutes les méthodes dérivent de la technique initiale du
RAST (Radio Allergo Sorbent Test, Pharmacia)
• Fixation de l’
l’allergè
allergène
• Incubation avec le sé
sérum
• Révélation des complexes AgAg-Ac par un antianti-IgE marqué
marqué
• Il n’y a pas de technique de référence
• Il n’y a pas de standard international IgE spécifiques
(tendance actuelle, standard IgE totales WHO 75/502)
28
CAP System Pharmacia
IgE spécifiques
de l’échantillon
Allergènes fixés à la
phase solide
Anti-IgE-125I
Mousse de
cellulose
Comptage de la
radioactivité liée à
la phase solide
IgEs
ImmunoCAP
29
IgEs : Immulite 2000
PA
bille
S
B
allergène
30
cpm
Qualités analytiques requises pour un dosage quantitatif
des IgE spécifiques
Calibration correcte par rapport au standard choisi,
Extrait allergé
allergénique de qualité
qualité et standardisé
standardisé, couplage sur une phase solide
de capacité
capacité adapté
adaptée (large excè
excès des composants allergé
allergéniques) et sans
dénaturation des proté
protéines,
Liné
Linéarité
arité des valeurs obtenues lors de tests de dilution
Bonne pré
précision/reproductibilité
cision/reproductibilité (<15 % pour les IgES selon NCCLS)
31
Test unitaire vis à vis d’allergènes multiples
sur un même support
CLA ; BMD ( 30 Allergè
Allergènes)
• Contraintes économie de santé
• Techniques souffrent d’un manque de sensibilité et de
spécificité (Rev Fr Allergol, 1998 et 2002)
• Limite d’une telle démarche si prescrit d’emblée;
– Fré
Fréquence maladie allergiques bien moindre que fré
fréquence des IgE
spé
spécifiques dé
détecté
tectés
– Réactions croisé
croisées
• Risque d’erreur diagnostique et de conduite thérapeutique
inadaptée.
32
Quand demander des IgEs unitaires
• TC impossible à réaliser
• DA sé
sévère
• Traitement anti histaminique
• Allergè
Allergène non disponible ou « interdit »
• Discordance clinique/TC (diagnostic différentiel rhinite et asthme NA)
• Avant une désensibilisation
• Avant des mesures d’évictions contraignantes
33
Interprétation d’un dosage quantitatif d’IgEs sériques
Un taux d’IgEs circulant permet-il ?
– de poser le diagnostic d’allergie,
– de suivre l’évolution de cette allergie
et d’en évaluer le pronostic
– et donc d’en déduire une attitude thérapeutique
34
Un taux dd’IgEs
’IgEs peut
-il poser le diagnostic dd’allergie
’allergie ?
peut-il
•Pour :
• Pneumallergènes : Pastorello et col. JACI 1995; Wood et col. JACI 1999
• Latex : Bernardini et col. Clin Exp Allergy 1999.
• Allergènes alimentaires : permettrait d’éviter la réalisation de TPO.
Sampson et col . JACI 1997; Hill et col. Clin Exp Allergy 2001; GarciaGarcia-Ara et
JACI
2002
é
et
col.
;
etc…
…
col. J Allergy Clin Immunol 2001 ; Rancé
Ranc
etc
•Mais : surtout dans l’allergie alimentaire
• Grande hétérogénéité de prévalence des populations étudiées
• Ne corrèle pas avec résultats TPO si aliments principalement d’origine
végétale (Pastorello et col. JACI 1999)
• Certains TPO positifs ne sont pas IgE médiés (Niggemnn et col. JACI 2001)
•Attention : Un taux d’
d’IgEs ne permet aucun pronostic sur la sé
sévérité
rité de l’
l’allergie
35
Pneumallergènes et latex
• Pastorello et col. (JACI 1995;96:580-87)
Seuil
CAP SPT
Tous allergè
allergènes 11.7
32.2
Ag. saisonniers 10.7
32.4
d. Pteronyssinus 8.4
31.2
Sensibilité
Sensibilité %
CAP
SPT
65.2
61.1
75.5
61.6
61.6
66.3
Spé
Spécificité
cificité %
CAP
SPT
76.6
60.3
76.5
61.0
72.8
55.6
Valeur diag. %
CAP
SPT
141.8 121.4
152.0 122.6
134.4 121.9
267 patients avec symptômes et SPT +, 232 patients asymptomatiques
asymptomatiques et
SPT +, 243 sujets sains non allergiques
• Wood et col (JACI 1999)
Dans l’
l’asthme au chat, IgEs e1 > 0.35 kU/l, sensibilité
sensibilité 69%, spé
spécificité
cificité
100%, VPP 100%, VPN 73%
• Bernardini et col. (Clin Exp Allergy 1999).
Dans la population atteinte de spina bifida un taux > 3.5 kU/l serait un
des facteurs de risque de ré
réaction clinique
36
Allergènes alimentaires
Etude de H.A. Sampson (JACI 1997; 100: 444444-451)
But de l'étude
Évaluer les critères de qualité cliniques des TC et des dosages d'IgE
spécifiques par rapport au DBPCFC.
Patients
Durant 10 ans, 300 enfants évalué
valués par DBPCFC
Description de la population : 100 % allergique
• D.A. 100%
• Asthme et rhinite allergique 50%
• IgE élevé
levées 80%
• Anté
Antécédents familiaux d'atopie 90%
Sélection randomisé
randomisée de 196 patients parmi les 300 caracté
caractérisé
risés pour
un dosages biologiques d'IgE par CAP System FEIA
Age (6 mois à 18 ans, m=5 ans 2 mois), sexe ( 117 garç
garçons et 79 filles)
Résultats
37
Etude de H.A. Sampson (suite 2)
: CAP ( seuil 0.35) / DBPCFC
: CAP (Optimal decision point) /DBPCFC
Nbre patients +/+/Corré
Corrélation %
Sensibilité
Sensibilité %
Spé
Spécificité
cificité %
VPP sur pop. étudié
tudiée
VPN sur pop. étudié
tudiée
VPP extrapolé
extrapolée
VPN extrapolé
extrapolée
Oeuf
145/51
84/83
84/83
98/82
98/82
45/
45/84
84/94
84/94
88/62
88/62
17/36
17/36
99/98
99/98
ODC = 3.4 kU/l
kU/l pour l'œ
l'œuf,
=10.7 kU/l
kU/l pour l'arachide
= 8.1 pour le blé
blé
Lait
95/101
64
100
30
57
100
2
100
Ara
136/60
79/80
79/80
97/76
97/76
38/88
38/88
78/94
78/94
85/62
85/62
15/41
15/41
99/99
99/99
Soja
34/62
37
94
25
21
95
12
97
Blé
Blé
23/162
29/73
29/73
96/70
96/70
20/73
20/73
14/25
14/25
97/95
97/95
15/22
15/22
98/96
98/96
Poisson
52/144
72
94
65
49
97
30
99
38
Etude de H.A. Sampson (suite 3)
Seuil d'expression clinique
Absence
Absence
d'allergie d'allergie
avec une avec une
certitude certitude
de 95 % de 90 %
Oeuf
Lait
Arachide
Poisson
0.9
0.6
1
0.35
5
Soja
Blé
2
5
5
79
0.8
Variations
individuelles
Allergie
affirmée
avec une
certitude
de 90 %
Allergie
affirmée
avec une
certitude
de 95 %
2
23
9
9.5
6
32
15
20
65 Certitude à 50 %
100 Certitude à 75 %
39
Autres études
Sampson HA
Rancé F
Roberts G
JACI 1997 et 2001
JACI 2002
JACI 2005
Seuil (kUA/l)
6m -18y
Seuil
Seuil
-16y
Arachide
0.35
15
15
0.35
14
57
15
Prévalence
69
69
81
48.8
48.8
48.8
52
Sensibilité
97
73
57
96.6
44
15.3
28
Spécificité
38
92
100
62.4
95.2
100
96
VPP
78
95
100
71
100
91
VPN
85
36
95.1
55.4
53
40
Boyano
Martinez
Sampson
Blanc
oeuf
Roehr
Autres études
Oster
balle
Rancé
JACI
2003
Rev Fr
All
2003
Seuil
2m-11y
Seuil
Seuil
JACI 1997 et
2001
Clin Exp
Allergy
2001
JACI
2001
Seuil (kUA/l)
6m-18y
Seuil
<2y
0.54.9y
Célik-Bilgibi
Clin Exp Allergy
2005
Seuil
1m-16y
0.35
6
7
0.35
17.5
1.5
P
73
73
80
79
67
63
Se
98
72
61
91
28
63
97
Sp
45
90
95
77
100
99
51
VPP
84
95
98
94
100
100
80
VPN
88
38
68
52
68
89
95
Sampson
JACI 1997 et
2001
Lait
Seuil (kUA/l)
6m-18y
0.35 32
7.5
0.35
12.6 59
67
67
67
95
99
41
Autres études
Roehr
Keskin
Célik-Bilgibi
JACI 2001
JACI
2001
Ann Allergy Asthma
Immunol 2005
Clin Exp
Allergy 2005
Seuil
<12 mois
Seuil
2m-11y
Seuil
1.5-84 mois
Seuil
1m-16y
Garcia-Ara
32
0.35
5
17.5
0.59
0.84
4.2
0.35
88.8
49
p
49
49
66
44
44
63
62
62
62
49
Se
100
51
34
84
30
22
78
74
61
83
Sp
30
98 100
56
99
96
71
86
100
53
VPP
57
95 100
61
95
86
81
90
100
63
VPN
100
36
81
64
54
66
67
61
76
90
42
Un taux dd’IgEs
’IgEs peut
-il poser le diagnostic dd’allergie
’allergie ?
peut-il
•Pour :
• Pneumallergènes : Pastorello et col. JACI 1995; Wood et col. JACI 1999
• Latex : Bernardini et col. Clin Exp Allergy 1999.
• Allergènes alimentaires : permettrait d’éviter la réalisation de TPO.
Sampson et col . JACI 1997; Hill et col. Clin Exp Allergy 2001; Garcia-Ara et col. J
Allergy Clin Immunol 2001 ; Rancé et col. JACI 2002 ; etc…
•Mais : surtout dans l’
l’allergie alimentaire
• Grande hé
hétérogé
rogénéité
ité de pré
prévalence des populations étudié
tudiées
• Ne corrè
corrèle pas avec ré
résultats TPO si aliments principalement d’
d’origine vé
végétale
(Pastorello et col. JACI 1999)
• Certains TPO positifs ne sont pas IgE mé
médié
diés (Niggemnn et col. JACI 2001)
•Attention : Un taux d’
d’IgEs ne permet aucun pronostic sur la sé
sévérité
rité de l’
l’allergie
43
Un taux dd’IgEs
’IgEs peut
-il permettre de suivre un
peut-il
patient et dd’envisager
’envisager le pronostic de son allergie ?
Allergie au lait
Allergie au blanc d’œuf
Allergie à l’arachide
44
Suivi du patient et pronostic de l’allergie
Dans l’allergie au lait,
Decrease
in sIgE
over 12
months
(%)
Probability of
developing
tolerance
Egg
allergy
Milk
allergy
• Les enfants chez qui cette allergie persiste ont au dé
départ
50
0.52
0.31
des taux d’
d’IgEs plus élevé
levés
75
0.65
0.45
médiane 78 versus 4 kU/l (Sicherer Clin Exp Allergy 1999)
90
0.78
0.66
5.8 versus 1.3 (Niggemann J Invest Allergol Clin Immunol 2004)
95
0.95
0.94
5.9 versus 1.4 (Garcia -Ara Clin Exp Allergy 2004)
mais à titre individuel ne permet pas de les diffé
différentier.
• Pour Vanto (J Pediatr 2004)
un taux d’IgEs < 2 kU/l identifie correctement 82% des enfants qui
développeront une tolérance à l’age de 4 ans,
un taux >2 identifie correctement 71% des enfants avec une allergie
persistante.
• Etude de Perry (JACI 2004) chez 159 enfants suivis et retesté
retestés en TPO,
53% ont un test – avec un taux d’IgEs < 2 kU/l
et 68% ont un test - avec un taux < 0.35
• Pour Shek (Shek JACI 2004) la rapidité
rapidité de la dé
décroissance des IgEs est un
facteur de pronostic d’
’
acquisition
de
la
tolé
é
rance
d
tol
Dans l’allergie au blanc d’œuf
• Les enfants chez qui cette allergie persiste ont au dé
départ
des taux d’
d’IgEs plus élevé
levés
5.7 versus 0.5 (Niggemann J Invest Allergol Clin Immunol 2004)
mais à titre individuel ne permet pas de les différentier.
•
Decrease
in sIgE
over 12
months
(%)
45
Probability of
developing
tolerance
Egg
allergy
Milk
allergy
50
0.52
0.31
75
0.65
0.45
90
0.78
0.66
95
0.95
0.94
Chez enfants moins de 2 ans et seulement chez ceux qui ont des symptômes cutané
cutanés,
la diminution du taux d’
d’IgEs est associé
associée à l’apparition tolé
tolérance (BoyanoBoyano-Martinez,
JACI 2002)
• Etude de Perry (JACI 2004) chez 131 enfants suivis et retesté
retestés en TPO 60% ont un
test – avec un taux d’
d’IgEs < 2 kU/l
kU/l
• Si le taux d’
d’IgEs est <2.5, il n’
n’y a pas de diffé
différence significative entre enfants qui ont
un TPO + et ceux qui ont TPO - (Knight JACI 2004)
•
Pour Shek (Shek JACI 2004) la rapidité
rapidité de la dé
décroissance des IgEs est un facteur de
pronostic d’
d’acquisition de la tolé
tolérance
46
l’allergie
Dans l’allergie à l’arachide
Hourihane (BMJ 1998)
1998) pas de diffé
différence significative chez enfants
tolé
tolérants/non tolé
tolérants.
Skolnick (JACI 2001)
• TPO – dans 61% des cas si IgEs <5 kU/l
• et TPO - dans 56% des cas si IgEs <20 kU/l
Etude de Ham Pong (Allergy and Asthma news 2004) aprè
après 2 ans sans
réaction,
• 70% TPO – (42/60) avec des valeurs de TC et d’IgEs plus faibles, mais non discriminantes
à titre individuel.
• Dans 21% cas IgE – ont donné un TPO +
Etude de Perry (JACI 2004) chez 169 enfants suivis et retesté
retestés en TPO,
• si l’histoire clinique est très évocatrice,
- 60% ont un test – avec un taux d’IgEs < 2 kU/l
- et 76% si taux <0.35.
• si l’histoire clinique est peu évocatrice,
- 80% TPO – si taux <2
- et 88% si taux <0.35
47
En fait
Problème
Problème de
de l’homogénéité
l’homogénéité de
de la
la cohorte
cohorte (âge,
(âge, prévalence
prévalence de
de
l’allergie,
l’allergie, expression
expression clinique
clinique différente,
différente, DA
DA ou
ou non,
non, TPO)
TPO)
-- aussi
aussi bien
bien àà l’inclusion
l’inclusion
-- que
que tout
tout au
au long
long du
du suivi,
suivi, en
en terme
terme
. de
de régime
régime alimentaire,
alimentaire,
. d’environnement
d’environnement allergénique
allergénique
. d’infections……
d’infections……
48
– IgE ; qu’un des protagonistes de la maladie allergique
• Les IgEs ne sont pas repré
représentative des IgEs tissulaires ni
quantitativement, ni qualitativement,
• Importance des RC
– Familles molé
moléculaires
– Profilines
– CCD
– De nombreux autres facteurs interviennent :
•
•
•
•
Etat inflammatoire
Infections
Stress physique et psychologique
Exposition à des irritants et autres facteurs environnementaux
49
Antigénicité et allergie croisée ; notions fondamentales
Capacité que présente un antigène à se lier avec un anticorps
dirigé contre une molécule antigénique différente.
Soit les antigè
antigènes,
nes, de nature multivalente, possè
possèdent en commun un
même épitope,
pitope, dans ce cas l'anticorps dirigé
dirigé initialement contre le premier
Ag, que l'on appelle immunogè
immunogène, se trompe et reconnaî
reconnaît le second Ag,
ces deux Ag ont par dé
définition une identité
identité partielle.
partielle.
Soit le second antigè
antigène porte un épitope structurellement trè
très proche
de l'immunogè
l'immunogène, l'anticorps correspondant pourra également le
reconnaî
reconnaître mais avec une force de liaison bien infé
inférieur; il n'y a aucune
identité
identité entre les deux Ag.
50
Classification ggénérale
énérale des rréactions
éactions crois
ées
croisées
Agents allergisants croisants « proches »
- Plus deux espè
espèces sont proches phylogé
phylogéniquement
et plus leur composition biochimique a des chances de se ressembler.
ressembler.
Proximité taxonomique
Forte homologie séquentielle
Agents allergisants croisants "éloignés "
- Position taxonomique éloigné
loignée
mais plus une fonction cellulaire est importante et plus les gè
gènes codant
pour cette proté
protéine sont bien conservé
conservés entre les espè
espèces.
Même fonction cellulaire
Famille molé
moléculaire
Homologie spatiale
51
R
Réactions
éactions crois
croisées
ées concernant les agents
allergisants "proches" (I)
Pollens de graminé
graminées : Féstuceae (dactyle) et Hordeae (blé
(blé)
Pollens d'Herbacé
d'Herbacées : Composé
Composées, genre Ambrosia et Arté
Artémisia
Pollens d'arbres : Famille des bé
bétulacé
tulacées (bouleau, charme), des Corylacé
Corylacées
(noisetiers), et des Fagacé
Fagacées (hêtre, châtaignier) possè
possèdent un allergè
allergène majeur
croisant qui correspond à une famille de proté
protéines de ré
résistance aux maladies.
Acariens : d1 et d2, les acariens de stockage (Acarus siro et Tyrophagus
putrescentiae)
putrescentiae) pré
présentent également une ré
réactivité
activité croisé
croisée avec Der p1.
Moisissures : Nombreuses ré
réactions croisé
croisées entre les multiples espè
espèces de
moisissures.
52
R
éactions crois
ées concernant les agents
Réactions
croisées
allergisants "proches" (II)
Animaux : Une des ré
réactions croisé
croisées entre animaux pourrait reposer sur une
sensibilisation à l'albumine.
Insectes : Réactions croisé
croisées entre famille des vespidé
vespidés dues à des allergè
allergènes
croisants comme la hyaluronidase,
hyaluronidase, la phospholipase A1 et l'antigè
l'antigène 5, Ag 5 qui
pré
présente des relations structurales avec une famille de proté
protéines de ré
résistance aux
maladies pré
présente chez la tomate et le tabac.
Aliments : Poissons ; allergè
allergène M (Gad c1) de la morue. Crustacé
Crustacés ; crevette et
crabe (tropomyosine
). Légumes et fruits ; Famille des solané
(tropomyosine).
solanées : pomme de terre,
tomate, aubergine. Famille des crucifè
crucifères : moutarde, radis, navet, chou fleur.
53
Homologies des albumines
Chien
Chat
Porc
Bœuf
Mouton
Lapin
Souris
Poulet
Chien
Chat
Porc Bœuf Mouton Lapin
Souris Poulet
100
86.4
78
76.7
77.9
73.9
71.4
46.7
100
79.5
78.4
77.4
75.9
73.1
46.4
100
80
78.3
74.9
70.5
43.7
100
92.4
72.1
69.5
44.6
100
72.9
69.2
44.8
100
71.6
46.3
100
44.4
100
54
(d’après Spitzauer et col. Int Arch Allergy Appl Immunol 2001; 124:95-6)
R
Réactions
éactions crois
croisées
ées entre agents allergisants
""éloignés"
éloignés"
Réactions croisées entre pollens :
- Arbres et herbacé
herbacées (Cryptomeria japonica et ambroisie) : Cry j 1 et Amb a 1; PEC
- Arbres et graminé
graminées (olé
(oléacé
acées et ivraie) : Ole e 1 et Lol p 11; Ole e 11-like
Réactions croisées entre trophallergènes et pneumallergènes:
- Fruits rosacé
rosacées et bé
bétulacé
tulacées ( pomme, bouleau ) : Bet v 1 et Mal d 1; PR10
- Ombellifè
Ombellifères, herbacé
herbacées, bé
bétulacé
tulacées (cé
(céleri, armoise, bouleau ) : Api g 1 et Bet v 1; PR10
Art v 1 et proté
protéine homologue dans bouleau et cé
céleri ; PEC
Réactions croisées entre aéroallergènes non polliniques et aliments :
- Latex, ficus, fruits : CHI ; Hev b 6, Mus p 1, Pers a 1 et Cas s 5
- Acariens, escargots : Tropomyosine ; Der p 10 et Cra g 1
- Syndrome oeufoeuf-oiseaux : Sérum Albumine
- Chat, viande de porc : Albumines ; Fel d 2 et homologue
55
Quelques familles moléculaires
Famille
Fonction
Exemples
2S albumines
Protéine de stockage des
graines
Moutarde, noix, colza,
sésame, arachide, ricin
Albumines
Transport et pression
artérielle
Sérum et viande : porc, chat,
chien, lapin, bœuf, cheval
Calcium-binding
proteins
Super famille liant le Ca++
Parvalbumine des poissons
Pollens : bétulacées,
oléacées, graminées
Chitinases
Protéines de défenses (PR
3/4/8) s’attaquent à la
chitine des insectes
Latex, avocat, banane, kiwi,
châtaigne etc…
Profilines
Rôles cellulaires
régulateurs
Ubiquitaires
Protéines PR-10
(Bet v1-like)
Protéines de défenses,
mode d’action inconnu
Fruits des rosacées,
bétulacées, légumineuses,
ombellifères,
56
Rôle de l’environnement du patient
• Allergie à la pomme
• En Europe du Nord; origine de la sensibilisation est
l’allergie au pollen de bouleau
• Bassin méditerranéen; sensibilisation directe aux fruits des
rosacées (pêche)
• Ailleurs; pollinose aux herbacées (armoise)
• Rôle des familles moléculaires
•
•
•
PR 10 pour Bet v 1 et Mal d 1
Lipid-transfer proteins pour Mal d 3 et Pru p 3
Pectates lyases pour xxx et Art v 1
57
D’après H. Malandain 2001
Familles moléculaires: latex et aliments
B1,3
Avocat
Banane
xxxx
Chataîgne
CHI 2
CHI 3 LYS
Pers a 1
xxxx
xxxx
xxxx
xxxx
xxxx
Mus p 1
Cas s 5
Figue
Hévéa
(latex)
CHI 1
xxxx
Hev b 6.01
Hev b 6.02
Hev b 11w
Kiwi
xxxx
Papaye
xxxx
P de terre
xxxx
xxxx
Hev b 6.03
héva
mine
xxxx
B1, 3 = béta 1, 3-glucanases
xxxx
Hev b 8
Hev b 7
xxxx
xxxx
xxxx
xxxx
xxxx
xxxx
Soja
Tomate
PAT
xxxx
xxxx
Hev b2
P
xxxx
Sola t 1
Gly m 3
xxxx
xxxx
58
D’après H. Malandain 2001
Le syndrome Porc
-Chat
Porc-Chat
Constat clinique : Fréquemment des patients allergiques à la viande de
porc présentent également une allergie aux épithélia de chat (A. Sabbah).
- Groupe A : 30 sujets sensibilisés et / ou allergiques à la viande de
porc ; présence d'IgE spécifiques anti chat détectée dans 90% des cas.
- Groupe B : 25 sujets non sensibilisés à la viande de porc présence
d'IgE spécifiques anti chat détectée dans seulement 41 % des cas.
Il existe également une sensibilisation à d'autres aliments d'origine animale
chez les patients allergiques à la viande de porc ( 77 % viande de bœuf, 58
% lait vache ).
Etude sérologique : Protéine commune de 67 Kd (albumine, Fel d 2)
59
Le syndrome Oeuf
Oeuf-Oiseau
-Oiseau
L'allergie à l'œuf est fréquente chez l'atopique, particulièrement chez
l'enfant. L'antigène responsable est en général le blanc d'œuf
(ovalbumine, ovomucoide, ovotransferrine ). La voie de sensibilisation
habituelle est la voie digestive. Dans le syndrome oeuf-oiseau, il s'agit
le plus souvent d'adultes, un des allergènes majeur en cause semble
être la livétine du jaune d'œuf et la voie de sensibilisation est
majoritairement la voie respiratoire.
Par des techniques de RAST inhibition :
- Faibles réactions croisées entre plumes, sérum et blanc d'œuf.
- Fortes réactions croisées entre plumes, sérum et livétine du jaune d'œuf
(étude de Mandallaz et Coll. ).
Par des techniques de Western Blot :
- Protéine de 66 Kd correspondant à la sérum albumine (F. de Blay).
60
CLA-30 Trophallergènes
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
1 Amande
2 Noisette
3 Avocat
4 Banane
5 Agrumes
6 Tomate
7 Pomme de terre
8 Pois
9 Arachide
10 Soja
11 Céleri
4
3
4
3
4
3
4
2
2
3
4
• 12 Bœuf
• 13 Poulet
• 14 Porc
• 15 Palourde
• 16 Crevette
• 17 Crabe
• 18 Morue
• 19 Thon
0
0
0
1
1
0
0
1
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
Ail
Oignon
Levure
Sésame
Riz
Maîs
Blé
Lait
Caséine
Jaune d’œuf
Blanc d’œuf
4
3
1
2
3
3
3
1
1
1
0
61
IgE anti carbohydrate CCD (cross-reactive carbohydrate determinants)
(cross
(cross-reactive
determinants)
α(1-6)-fucose
GlcNAc
Man
N
Xyl
Fuc
β(1-2)-xylose α(1-3)-fucose
La plupart processus glycosylation communs aux eucaryotes, mais plantes
et invertébrés structures non retrouvées chez mammifères et donc immunogènes.
IgE dirigé
dirigés contre des NN-Glycannes des plantes et insectes dé
décrits pour la
premiè
première fois par Aalberse en 1981 et responsables de ré
réactivité
activités croisé
croisées entre des
allergè
allergènes aussi diffé
différents qu’
qu’un pollen, un venin d’
d’abeille, un extrait d’
d’arachide.
62
Etude van der Veen (JACI 1997;100:327- 34)
606 patients avec symptômes d’
d’asthme ou rhinite,
– 173 soit 29 % sont allergiques pollens de graminé
graminées (prick
(prick et RAST +)
• 50 (29%) ont des RAST positifs arachide sans signe clinique, ni TC +
– 32 sé
sérums ont pu être étudié
tudiés
• RAST arachide + (mé
(médiane 3.0 IU/ml, 0.9 à 18.0)
• 29 soit 91% ont des IgE CCD (mé
(médiane 0.8 IU/ml, 0.1 à 10.8)
63
Evaluation des allergènes alimentaires majeurs de l’enfant
17.5
Concordance globale: 92 %
Concordance à 1 classe: 95 %
0.35 0.7
3.5
Résultats Arachide
CAP = 17,3 / I 2000 = 0,31
Résultats bromé
broméline et inhibition
CAP bromé
broméline = 6,9
Inhibition par la bromé
broméline : oui
TC arachide
Négatif
0.1
DPC IMMULITE 2000, kU/L
52.5 100
f13F13
Arachide
n = 148
(54+94) LAM M érieux
0.1
0.35 0.7
3.5
17.5
52.5 100
Pharm acia C AP, kU /L
64
Anti- peanut IgE in 125 patients according to the
sensitization to grass pollens
Patients
group
Atopic
Peanut Skin Prick
Test
(mm)
DBPCFC*,
threshold of
reactivity (mg)
CAP
peanut sIgE (kU/L)
IMMULITE peanut
sIgE (kU/L)
Median
Range
Median
Range
Median
Range
Median
Range
Ia (n=29)
22
8
5–16
100
4.4–7000
92
1.4– >100
>100
1.1– >100
Ib `(n=29)
29
10
0.5–17
265
4.4–7000
49
3.3– >100
>100
3.1–>100
IIa (n=26)
11
0
0-0
nd
nd
<0.35
<0.35– 0.35
All negative
exept one
<0.10
<0.10– 0.91
All negative
exept one
IIb (n=41)
41
0
0-1.5
nd
nd
0.68
<0.35– 53
22>0.35
0.11
<0.10–14
11>0.35
Ia : Peanut allergic patients without sensitisation to grass pollen
pollen
Ib : Peanut allergic patients with sensitisation to grass pollen
65
IIa : Control group without sensitisation to grass pollen
L Guilloux, DA Moneret-Vautrin et col. AAAAI 2006
IIb : Control group with sensitisation to grass pollen
Anti- peanut IgE in 125 patients according to the
sensitization to grass pollens
Patients
group
Atopic
Peanut Skin Prick
Test
(mm)
DBPCFC*,
threshold of
reactivity (mg)
CAP
peanut sIgE (kU/L)
IMMULITE peanut
sIgE (kU/L)
Median
Range
Median
Range
Median
Range
Median
Range
Ia (n=29)
22
8
5–16
100
4.4–7000
92
1.4– >100
>100
1.1– >100
Ib `(n=29)
29
10
0.5–17
265
4.4–7000
49
3.3– >100
>100
3.1–>100
IIa (n=26)
11
0
0-0
nd
nd
<0.35
<0.35– 0.35
All negative
exept one
<0.10
<0.10– 0.91
All negative
exept one
IIb (n=41)
41
0
0-1.5
nd
nd
0.68
<0.35– 53
22>0.35
0.11
<0.10–14
11>0.35
Ia : Peanut allergic patients without sensitisation to grass pollen
pollen
Ib : Peanut allergic patients with sensitisation to grass pollen
66
IIa : Control group without sensitisation to grass pollen
L Guilloux, DA Moneret-Vautrin et col. AAAAI 2006
IIb : Control group with sensitisation to grass pollen
N
CCD et latex
Table 3. Numbers of positive IgE results (rBet v 2 and
bromelain in patients with true-and false positive IgE for NRL
True
Positive
(n=17)
False
positive
(n=21)
BRO
rBet
v2
BRO +
rBet v2
None
Total
positive
0
0
0
17
rBet v2 : 0
BRO: 0
2
rBet v2 : 11
BRO : 17
P<0.00001
8
2
9
NRL, natural rubber latex
Ebo and col.Clin Exp Allergy 2004;34:137-144
67
IgE anti CCD
• Prévalence
• IgE anti CCD chez 41% patients polliniques (Mari A, JACI 1999),
pré
prévalence moyenne de 20 à 40 % , une fré
fréquence plus importante est
décrite pour le pollen d’
d’olivier (50(50-65%) et celui de cyprè
cyprès (jusqu’à
(jusqu’à 100%),
Fötisch et al. (Glycoconjugate
(Glycoconjugate journal 2000, Review)
Review)
• Présence d’IgE anti CCD chez patients allergiques aux venins d’abeille et de guêpe
vespula qui expliqueraient forte proportion de CAP positifs pour les 2 venins
venins
(Hemmer W, JACI 2001).
• Plusieurs famille de protéines sont glycosylées; IgEIgE-CCD dé
démontré
montrés pour l’
l’arachide
(Ara h 1), tomate (Lyc
(Lyc e 2), cé
céleri (Api g 8), pomme, kiwi, noisette (Cor a 11), Soja
(Gly m Bd), carotte, mangue, cerise (Pru
(Pru av 1, Pru av 4).
• Rôle de ces AC ?
• Pour certains auteurs aucun intérêt clinique (Van der Veen MJ, JACI 1997; Mari A,
Inter Arch Allergy Immunol 2002)
• Pour d’autres rôle dans allergie au cyprès (Afferni C, Clin Exp Allergy 1999), à
l’olivier (Batanero E, JACI 1999) ou encore au céleri (Fotisch K).
68
•
CCD ajoute un degré supplémentaire de complexité aux
niveau des réactions croisées
• Aprè
Après celles dues à des familles taxonomiquement proches
• Aprè
Après celles dues à des proté
protéines appartenant à des mêmes familles
comme PR10, LTP, profilines
• Pertinence clinique n’est pas vraiment démontrée
• Facteur de risque de dé
développer multiples sensibilisations
• Rôle d’
d’adjuvant
• Rôle dans la conformation des épitopes proté
protéiques
Mais forte interférence au niveau biologique
69
Allergènes recombinants
• Définition: l’application de la technologie de l’
l’ADN recombinant pour la
production de proté
protéines allergé
allergéniques permet d’
d’obtenir des ré
réactifs standardisé
standardisés
et parfaitement caracté
caractérisé
risés sur le plan immunochimique et pouvant être produit
à grande échelle. Un grand nombre d’
d’allergè
allergènes majeurs et mineurs ont été
cloné
clonés.
Il est né
nécessaire de valider l’
l’activité
activité immunologique des allergè
allergènes
recombinants par rapport à celle des allergè
allergènes naturels correspondants
(utilisation de technique in vitro et in vivo, modè
modèles animaux et chez l’
l’homme
TC et de provocation)
• Inté
Intérêt:
– Amé
Amélioration des extraits utilisé
utilisés aussi bien pour in vivo que in vitro
– Bases molé
moléculaires des ré
réactivité
activités croisé
croisées
70
•
•
•
•
•
•
Pollens de graminées; rPhl p 1, 2, 5b, 6, 7,11, 12
Pollens d’herbacées; rPar j 2
Pollens d’arbres; rBet v 1, 2, 4
Microorganismes; rAsp f 1, 2, 3, 4, 6
Aliments; rPen a1
Latex; rHev b 1, 2, 3, 5, 6.01, 6.02, 8, 9, 11
71
arbres
r Phl p 7
Calcium binding
herbacées
graminées
72
Recombinants
Extraits allergéniques
SPT
Phl p 1 +
Phl p2 +
Phl p5 +
Phl p 7 = Betv 4 +
Phléole +
Bouleau +
Ambroisie +
Co-sensibilisation ?
Bet v1 Bet v 2 -
Réactivité croisée ?
Pas de sensibilisation pollen de bouleau
73
Symptômes; rhino conjonctivite au printemps et début été,
sévère rhino conjonctivite et asthme durant saison des graminées,
syndrome orale quand consomme noisette.
TC et RAST avec extraits
Bouleau +
Phléole +
Armoise +
Noisette +
Résultats; sensibilisation au bouleau,
graminées, herbacées et allergie noisettes
Utilisation des recombinants
rBet v1 –
rBet v 2= 4.5 kU/l
rPhl p 1 –
rPhl p 2 –
rPhl p 5 –
rPhl p 6 –
rPhl p 7 –
rPhl p 12 =6.6 kU/l
Sensibilisation isolée à la profiline
Immunothérapie possible bouleau et graminée,
Éviction noisettes
Thérapeutique symptomatique 74
Arbre décisionnel pour une immunothérapie
au pollen de graminée
TC +
Extrait de phléole
IgE spécifiques +
extrait phléole
IgE spécifiques
recombinants phléole
rPhl p 1
rPhl p 5
Intérêt
Immunothérapie
rPhl p 7, rPhl p12
rPhl p 1,5 +
rPhl p 7,12 -
rPhl p 1,5 +
rPhl p 7, 12 +
Haute
moyenne
rPhl p 1,5 –
rPhl p7, 12 +/-
basse
75
Mothes et valenta
Intérêt diagnostique des IgEs aux
allergènes recombinants d’arachide
G. Kanny et col, CICBAA 2008
CHU Nancy
76
• But: montrer intérêt du dosage des IgEs vis-à-vis de 3
allergènes majeurs recombinants de l’arachide : rAra h 1,
h 2, h 3 et du rAra h 8
• Etude précédente : montrait en TC chez 30 patients TPO +
à l’arachide que
– TC rAra h 2 + 100%
– 53% était monosensibilisés à Ara h 2
– Les patients polysensibilisés présentaient des réactions plus graves
G. Kanny et col, CICBBA 2008
77
• Nouvelle étude
– avec 94 patients allergiques à l’arachide (TPO +)
– 50 contrôles non atopiques
– 39 contrôles atopiques (TC + bouleau et graminées)
IgEs
Contrôles
NA
Contrôles
A
Allergiques
arachide
Sensibilité
%
Spécificité
%
f13
1
22
94
100
44
rAra h 1
0
0
74
79
100
rAra h 2
0
1
93
99
97
rAra h3
0
1
62
66
97
rAra h 8
0
33
45
48
15
– 18 patients sont monosensibilisés à Ara h 2 (19%)
– 12 sont cosensibilisés à Ara h 1 et Ara h 2
– 62 sont polysensibilisés aux 3
78
Conclusion
• Haute sensibilité et spécificité d’Ara h 2 pour le
diagnostic de l’AA à l’arachide
• Spécificité particulièrement importante chez des
patients polliniques où le taux de faux + avec f13
atteint 56% (confirme étude LMM/ CHU Nancy)
• Absence de pertinence d’Ara h 8 chez les sujets
polliniques (RX avec bet v1)
• Polysensibilisation apparaît être un facteur de gravité,
associé à un seuil de réactivité plus bas lors TPO
standardisés.
79
Conclusion sur dosages des IgE sp
écifiques circulants
spécifiques
La pré
présence d’
d’IgEs peut permettre d’identifier les produits allergéniques et de parler de
sensibilisation. Les résultats doivent être confrontés à la clinique et aux TC. La
connaissance des différentes réactions croisées est indispensable (intérêt des
recombinants).
En ce qui concerne le dosage quantitatif des IgEs :
– Les valeurs seuils,
seuils si elles sont utiles en allergie alimentaire pour diminuer le
nombre de tests de provocations orales, ne peuvent être applicable directement
au cabinet du médecin, car dépendent étroitement de la prévalence de l’allergie,
de la nature des signes cliniques, de l’âge des patients dans la population
sélectionnée. Ces valeurs (principalement pour les allergènes d’origine végétale)
peuvent être complètement faussées par la présence éventuelle d’IgE
carbohydrate, d’IgE profiline …..
– Généralement, un résultat né
négatif donne une bonne VPN et peut permettre
suivant les allergènes et si l’histoire clinique n’est pas convaincante, de redonner
par ex. l’aliment en ambulatoire.
80
Selon la nomenclature actuelle des actes de biologie
Tests de d’orientation
Tests d’identification des allergènes
Mais encore
Tests cellulaires
• HL
• Cytométrie de flux
(CD45/anti
(CD45/anti--IgE/CD63)
IgE/CD63)
•
LTC4
Tests dynamiques
• Histamine
• Tryptase
• LTE4 urinaire
• ECP
81
Test d'histamino
-libération : technique
d'histamino-libération
1-Sang veineux prélevé sur héparine et dilué au 4/5 en tampon
Tris ACM.
2-Solution incubée 40 min à 37°C avec différentes dilutions des
solutions commerciales de curares.
3-Les tubes sont ensuite centrifugés et les surnageants congelés à 20° C jusqu’au dosage de l'histamine par une technique RIA
(Immunotech).
4-Les résultats sont exprimés en % de l'histamine totale libérable.
HL % = 100 x a - b
c-b
a : taux d'histamine avec Ag
b : taux d'histamine avec tampon
c : taux d'histamine maximum libérable
82
Test d'histamino
-libération : rrésultat
ésultat type
d'histamino-libération
% HL
* Norcuron
*
50 -
+ Tracrium
*
*
*
+
+
+
+
*
+
(Concentration curare)83
Histamino
-libération curares : population éétudiée
tudiée
Histamino-libération
Nous avons analysé les résultats des tests d'histamino- libération chez
77 patients dont le diagnostic d'accident peropératoire à un curare a été
retenu lors du bilan seondaire réalisé à la consultation d'allergoanesthésie (hôpital E. Herriot, Lyon). Les myorelaxants responsables
ont été :
Celocurine
Alloferine
Norcuron
Pavulon
n = 22
n= 7
n = 17
n= 9
Tracrium
Esméron
Mivacron
n = 15
n= 6
n= 1
84
Histamino
-libération curares : rrésultats
ésultats
Histamino-libération
Malade +
54
23
HL +
HL -
Malade 0
30
Sensibilité : 54 / 77 = 70.1 %
Spécificité : 30 / 30 = 100 %
85
Histamino
-libération: sensibilit
é en fonction
Histamino-libération:
sensibilité
du curare responsable
7
6
22
15
Tracrium
9
Pavulon
Norcuron
Esméron
Célocurine
17
Alloférine
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
86
Curares : corr
élation IDR
-HL
corrélation
IDR-HL
Corrélation IDR et tests d'histamino-libération, tous curares confondus,
qu'il ait ou non provoqué l'accident chez les 76 patients ayant fait un
accident per opératoire.
n = 287
Concordance : 79.4 %
Sensibilité : 63.8 %
IDR + IDR HL + 97
4
HL - 55
131
Dans 2.6 % l' HL est + et permet de faire le diagnostic d'une sensibilisation.
87
Int
érêt du test dd’histamino-libération
’histamino-libération
Intérêt
Test en général moins sensible que les tests cutanés et que la
recherche des IgE spécifiques.
Intérêt quand discordance entre clinique, TC et IgE circulantes.
Quand l’allergène n’existe pas couplé à un support solide.
Dans l’exploration des réactions croisées (myorelaxants), ou le
suivi d’une désensibilisation (venins d’hyménoptères)
88
Cytom
étrie de flux : curares
Cytométrie
Étude d’Abuaf et al.; JACI 99
Série rétrospective de 33 patients et de 29 sujets contrôles.
L’activation des basophiles a été mesurée par cytométrie de flux
en utilisant un triple marquage (CD63, CD45, Anti-IgE).
Les tests effectués vis à vis du MR ayant provoqué l’accident chez
les 28 patients ayant une réaction typique donnent une réponse + à
au moins 2 des 3 marqueurs. Le CD63 est celui qui est le plus
souvent altéré (64%). Spécificité du test 93%.
Bien que moins sensible que les TC (64% versus 100%), test plus
spécifique (93% versus 63%).
89
L
’histamine
L’histamine
L'histamine est synthétisée au niveau de l'appareil de golgi
du mastocyte, par décarboxylation de l'histidine.
Lors du mécanisme de dégranulation, elle est libérée du
réseau de protéoglycanes par échange cationique.
Sa durée de vie est de l'ordre de quelques minutes (chez le
sujet sain).
Deux voies catalytiques en permettent un rapide
métabolisme : la méthylation (70%) et l'oxydation (30%).
90
Histamine plasmatique
Dosage radio-immunologique
Prélèvement : tube plastique, EDTA, centrifugation douce à +
4°C, décantation loin du culot cellulaire.
Valeur attendue : < 10 nmol/l
Interprétation
Pic 5 à 10 min après début accident. Le métabolisme de
l'histamine est saturable. De ce fait, sa demi-vie augmente : elle est
de 10 à 20 min dans les réactions sévères.
Il existe des faux négatifs (fin de grossesse, traitement
héparinique) et des faux positifs (hémolyse, mauvaise condition de
prélèvement).
91
Tryptase
La tryptase est une endoprotéase neutre présente dans les granules
des mastocytes. Elle est stockée complexée à l'héparine sous forme
d'une structure tetramèrique de 134 kD composée de 2 sous unités
α et 2 sous unité β (seule forme biologiquement active).
Sa concentration est de l'ordre de 10 à 12 pg par mastocyte
pulmonaire et 35 pg par mastocyte cutané. Sa concentration dans le
basophile est 500 fois plus faible.
Sa demi- vie est d'environ 90 min à 120 min.
Son ultime rôle physiologique est encore mal connu. In vitro, elle
clive C3 pour former C3a, elle inactive le fibrinogène et active une
collagènase. Elle aurait peut être un rôle dans la génération de
kinines.
92
Tryptase sérique
Dosage
Prélèvement sur tube sec, dosage initialement RIA (Ac ne
reconnaissaient que les chaînes β), actuellement par IE et les Ac
reconnaissent les chaînes α et β .
Valeur attendue : < 13.5 μ g/l (mais large dispersion des valeurs
normales).
Interprétation
Taux de tryptase augmenté 15 à 30 min après début incident, pic entre
30 min et 2 h, retour à des valeurs normales en 8 à 12 h. Les taux
observés sont proportionnels à la gravité de l'accident. La tryptase est
absente au cours des maladies cardiaques ou infectieuses, ce qui en fait
un marqueur de choix des accidents anaphylactoïdes.
Il peut exister des faux positifs lors de prélèvement post mortem et en
cas de mastocytose.
93

basophiles

Transcription

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