Extraction des molécules actives contenues dans les feuilles de

Extraction des molécules actives contenues dans les feuilles de Senecio
faujasioïdes (Asteraceae)
Extraction of the active molecules contained in the leaves of Senecio faujasioïdes
(Asteraceae)
Velomalala Noeliharisoa Mandimbisolofo, Raherimandimby Marson, Ramamonjisoa Daniel.
Laboratoire de Biotechnologie et Microbiologie, Département de Biochimie Fondamentale et Appliquée,
Faculté des sciences d’Antananarivo. Ankatso, B-906 Antananarivo Madagascar.
E-mail : [email protected].
Résumé
Les feuilles de Senecio faujasioïdes (Asteraceae), arbrisseau endémique de Madagascar contiennent des
principes actifs. Cet article fait d’abord le point des connaissances sur cette plante et aborde ensuite la
recherche des extraits performants et la détermination des molécules actives dans l’extrait brut (EB) et de ses
fractions purifiées (N1, N2, N3, N4 et N5). Cette étude a pour objectif de chercher des molécules actives dans
cette plante afin de produire des médicaments utiles à l’homme. L’extraction aqueuse à froid,
hydroalcoolique à froid, à l’ethanol absolu hydroalcoolique à chaud et aqueuse à chaud ont été utilisé comme
méthode d’extraction ; et traitement par la chaleur, dialyse et précipitation par l’éthanol 50% comme
méthode de purification. Ce test microbiologique révèle que l’extraction aqueuse à chaud (D) est le type
d’extraction donnant les meilleurs résultats vis-à-vis de Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus
cereus, Enterococcus faecalis, Salmonella typhi et Salmonella antarctica. La fraction obtenue par traitement
par la chaleur (N1), la fraction issue du dialysat notée N 3 et la fraction issue du culot de la précipitation par
l’éthanol 50 % notée N5 présentent les mêmes profils chromatographiques. Un métabolite secondaire à
l’occurrence la leucoanthocyane a été trouvé dans l’extrait brut (EB). Les fractions N1, N3 et N5 contiennent
des leucoanthocyanes.
Enfin, Il a été observé que résultats de la chromatographie sur couche mince correspond aux résultats du
criblage phytochimique. Car les constituants montrés par les deux bandes sont des leucoanthocyanes et des
protéines. De même, ces résultats sont comparables aux méthodes de purification car le traitement par la
chaleur permet d’éliminer certaines macromolécules telles que les protéines qui coagulent sous l’effet de la
chaleur. L’éthanol 50 % permet la précipitation des molécules peu solubles et les grosses molécules comme
les leucoanthocyanes.
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Abstract
The leaves of Senecio faujasioïdes (Asteraceae), endemic shrub of Madagascar contain active principles.
This article first makes the point of the knowledge on this plant and approach the research of the effective
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excerpts and the determination of the active molecules then in the raw excerpt (EB) and of its purified
fractions(N1, N2, N3, N4 et N5). This survey has for objective to look for the active molecules in this plant in
order to produce some medicines useful to the man. The cold aqueous extraction, cold hydroalcoholic, to the
ethanol absolute hydroalcoholic to hot and aqueous to hot has been used like method of extraction; and
treatment by the heat, dialysis and precipitation by the ethanol 50% as method of purification The
microbiological test reveals that the aqueous extraction to hot (D) is the type of giving extraction the best
results opposite Bacillus subtilis. Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus, Enterococcus faecalis,
Salmonella typhi and Salmonella antarctica. The fraction gotten by treatment by the heat (N1), the fraction
descended of dialyzed it noted N3 and the fraction descended of the cheek of the precipitation by the ethanol
50% noted N5 present the same chromatographic profiles. A secondary metabolite to the occurrence the
leucoanthocyane has been found in the raw excerpt (EB). The N1 fractions, N3 and N5 contain some
leucoanthocyanes.
Finally, it has been observed that results of the chromatography on thin film correspond to the results of the
sifting phytochimic. Because them constituent shown by the two strips are the leucoanthocyanes and
proteins. In the same way, these results are comparable to the methods of purification because the treatment
by the heat permits to eliminate some macromolecules as the proteins that coagulate under the effect of the
heat. The ethanol 50% permits the precipitation of the molecules little soluble and the big molecules as the
leucoanthocyanes.
Mots clés : Senecio faujasioïdes, Bacillus subtilis, leucoanthocyanes, principes actifs
Keywords : Senecio faujasioïdes, Bacillus subtilis, leucoanthocyanes, actives principles.
1. Introduction
a) Généralité. L’utilisation des plantes contre les parasites des cultures, en particulier les insectes, remonte à
des temps immémorables. Il semble que les Chinois et les Arabes aient été les premiers à connaître la
propriété des plantes insecticides comme le tabac (Jus) ou le pyrèthre (Fleurs), etc.… Elles sont aussi
utilisées pour la chasse et pour la pêche.[1]
En France, Jean de la Quantinie protégeait ses poiriers contre l’insecte (Tyngis pyri) en pulvérisant de jus de
tabac. Au début de XIXe siècle, on connaissait parfaitement la poudre de Persane, insecticide qui n’était
autre que des fleurs broyées de Pyrèthre utilisé encore de nos jours. Vers la même époque, les fermiers
américains employaient des graines d’une Liliacée: le Schoenocaulon officinale. Gray pour détruire les poux
de leur bétail. Mac Indoo et Sievers signalaient la présence des principes toxiques pour certains pucerons,
chez cinq espèces du genre Anona (Anonaceae), A. cherimola, A. glabra, A. reticulata, A. spinescens, A.
squamosa.
En 1941, Swingle décrit les propriétés insecticides d’une poudre de racines de Trypterygium Hook
(Celastrinae). Les agriculteurs chinois de la province de Che-Kiang utilisent régulièrement cette préparation
à l’état frais contre les chenilles de Lépidoptères. WANG. H (1941) signale que les graines d’une
leguminosae : le Pachyrhizus erosus Urb, contiennent également un principe insecticide. On trouve dans les
graines de Milletia pachycarpe Benth (Leguminosae) une substance rotenoïde qui rappelle celle contenue
dans les Derris et Lonchocarpus.[2]
Diverses études ont fait ressortir que de nombreuses plantes possèdent des propriétés bactéricides,
insecticides, fongicides et rodenticides et sont utilisées pour traiter différentes maladies.
Dans cet article, nous envisageons d’abord une description succincte de la plante étudiée et nous présentons
ensuite les différentes méthodes d’extraction et purification, les résultats de tests microbiologiques sur
quelques bactéries des extraits bruts ainsi que les chromatogrammes des fractions purifiés.
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b) Le Senecio faujasioïdes. S. faujasioides est un arbrisseau sarmenteux lianoïde à tige grêle dès la base (ne
formant pas de tronc), à rameaux étalés-diffus, plus ou moins pubescents au moins à l’état jeune, rarement
glabre. Les feuilles sont alternes espacées (entre-nœuds de 0,5-2 cm) persistantes, coriaces, glabres,
brièvement pétiolées (environ 5mm), à limbe elliptique, ovale ou oblong, arrondi au sommet ou obtus ou
aigu, vert foncé et luisant à la face supérieure, plus pâle à la face inférieure.[3]
L’espèce faujasioïdes est donc une plante largement répartie dans tout Madagascar et c’est une espèce
endémique.[4]
Elle fait partie des asteraceae qui est la famille la plus vaste parmi les phanérogames, et elle est la plus
distribuée dans le monde.[5][6] Les fleurs sont soit en inflorescence élémentaire en capitules, soit des
capitules en corymbe, en panicule, grappe ou épis. Les fruits sont des akènes de forme variée.[4]
2. Matériel et Méthodes
2.1. Description du cadre d’étude :
Cette étude a pour but de trouver des principes actifs dans les organes aériens de la plante en faisant des
extractions et purifications dont les extraits bruts seront testés avec les bactéries responsables de certaines
maladies telles que les bactéries Gram positif : Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Bacillus
cereus, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium et les bactéries à Gram négatif comme Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi et Salmonella antarctica.[7][8][9]
Pour la chromatographie sur couche mince (CCM), des plaques de gel de silice en plastique ou en verre, de
dimension 20 x 20 cm seront utilisées. Il s’agit d’un gel de silice muni d’un indicateur de fluorescence à une
longueur d’onde égale à 254 nm, étalé sur une feuille plastique ou sur un verre.
Pour l’extraction, l’éthanol 75% et l’éthanol absolu sont utilisés.
2.2. Méthodologie :
Il s’agit d’une étude chimique et analytique de la plante.
La population cible est constituée des bactéries trouvées dans la blessure, la plaie, la suppuration et
l’endocardite et pourrait être employés pour la fabrication des médicaments utiles à l’homme.
Test d’antibiogramme :
Le test se déroule en 3 jours successifs :

Premier jour :
Chaque souche pure est ensemencée sur bouillon nutritif, puis incubée à 37°C pendant 24 h ; c’est le
relancement de la culture des souches.

Deuxième jour :
Chaque souche préalablement relancée est diluée de façon à avoir une concentration bactérienne
égale à 10 3 cellules / ml : cette préparation constitue l’inoculum. Après, 1 ml de cet inoculum est
ensemencé uniformément selon la technique d’inondation dans une boite de Pétri contenant le
milieu MUELLER HINTON de 4 mm d’épaisseur. La boite est laissée à la température ambiante
pendant 1 min afin que les germes puissent bien adhérer à la surface de la gélose. L’excès de
suspension bactérienne est éliminé par aspiration, puis la boite est séchée à l’étuve à 37°C pendant
15 min. Les disques stériles pour antibiogramme (préalablement autoclavés) ont été imprégnés de 20
μl d’extrait. Ils sont ensuite déposés à la surface du milieu ensemencé, à l’aide d’une pince fine. La
préparation est incubée à 37°C pendant 24 h. Chaque test est effectué en 2 exemplaires.

Troisième jour :
Après incubation, le diamètre du halo d’inhibition formé autour de chaque disque est mesuré et leurs
moyennes calculées.
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2.3. Technique :
Comme méthode d’extraction, l’extraction aqueuse à chaud, hydroalcoolique à chaud, aqueuse à froid,
hydroalcoolique à froid et extraction à l’éthanol absolu seront utilisés. Comme méthode de purification, le
traitement par la chaleur, la dialyse et la précipitation par l’éthanol 50% seront effectués. Et RMN 1H comme
méthode de détermination structurale.
a) Extraction :
Les feuilles âgées et jeunes de S. faujasioïdes récoltées à Ambatolampy, région Vakinankaratra, ont été
lavées délicatement avec de l’eau du robinet afin d’enlever divers
contaminants tels que les poussières fines, les toiles d’araignées, … puis conservées au congélateur. Avant
chaque extraction, l’organe à utiliser est décongelé et pesé.
Vingt cinq g de ces feuilles ont été broyées puis délayées dans 200 ml d’eau distillée selon un rapport 1/
8 (p/v). Le mélange ainsi obtenu a été chauffé à reflux sous agitation magnétique à 60 °C pendant 2h,
puis laissé macérer pendant une nuit au réfrigérateur à 4°C. Une agitation du macérât pendant 30 min à
la température ambiante suivie d’une filtration sur quatre épaisseurs de gaze a été effectuée. Le filtrat
obtenu est centrifugé à 10000 rpm pendant 30 min à l’aide d’une centrifugeuse. La même centrifugeuse et
le même rotor seront utilisés pour toutes les opérations de centrifugations ultérieures. Le surnageant a été
concentré comme précédemment, et le culot a été éliminé. Le surnageant issu de la deuxième
centrifugation constitue notre extrait brut noté EB. Une extraction a été effectuée de même manière que
précédant en utilisant l’hydroalcoolique et d’autres aussi en employant le froid, hydroalcoolique et
l’éthanol absolu.
b) Purification
L’extrait brut le plus actif vis-à-vis des germes sera purifié par la méthode de traitement par la chaleur,
dialyse et précipitation par l’éthanol 50 %.
• Traitement par la chaleur
L’extrait à traiter est chauffé dans un bain-marie bouillant pendant 15 min à 96°C. Le précipité formé
est écarté par centrifugation à 2200 tours.min -1 pendant 15 min. Le surnageant est recueilli et le culot
est éliminé. L’extrait est noté N1.
• La dialyse
La technique usuelle consiste à bouillir la membrane dans de l’eau pendant 15 min, l’eau est ensuite
éliminée puis le traitement est répété 3 à 4 fois. La membrane ainsi préparée est conservée dans de l’eau
distillée à 4°C. Avant chaque utilisation, la membrane doit être rincée à l’eau distillée.
• Mise en œuvre de la dialyse :
Le fragment de boudin à dialyse contenant l’extrait N 1 à dialyser (15 ml) est fermé à chaque
extrémité par un nœud. Il est introduit dans le liquide de contre-dialyse (1500 ml d’eau distillée)
et l’ensemble est soumis à une agitation magnétique afin d’éviter la formation d’un gradient de
concentration au voisinage du boudin. Le liquide de contre dialyse est renouvelé fréquemment
pour accélérer la diffusion et maintenir la différence de concentration entre les deux milieux.
A la fin de la dialyse, le liquide à l’intérieur du boudin appelé adialysat et celui à l’extérieur du
boudin appelé dialysat sont tous les deux concentrés jusqu’à un volume final de 15 ml. L’extrait
issu de l’adialysat est noté N2 et celui issu du dialysat est noté N3.
• Précipitation par éthanol 50%
De l’éthanol absolu est additionné petit à petit (v/v) à un volume déterminé d’un extrait aqueux sous
agitation magnétique. Le mélange est laissé reposer pendant 15 min à 4°C. Le précipité apparu est
ensuite éliminé par centrifugation à 2200 tours.min -1 pendant 15 min. L’alcool est évaporé du surnageant
tandis que le culot est repris dans de l’eau distillée qui donnera l’extrait noté N 5. L’extrait issu du
surnageant est noté N4.
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c) Concentration
Toutes les opérations d’évaporation de solvant, de réduction de volume ou de concentration des différents
extraits seront réalisés à 55°C à l’aide d’un évaporateur rotatif, relié à une pompe à vide.
d) Détermination de la concentration et du rendement
A l’issue de chaque type d’extraction et de chaque étape de purification, l’extrait ou la fraction obtenue
sera évaporée à sec, et le résidu sec sera pesé afin de déterminer sa concentration et son rendement.
e) Méthodes analytiques
• Chromatographie sur couche mince
Sur une plaque découpée aux dimensions voulues, les extraits à chromatographier seront déposés à l'aide
d'un capillaire, en fins tirets horizontaux de 7 mm de long, espacés de 6 mm et situés à 1,5 cm du bord
inférieur et à 1,3 cm des bords latéraux de la plaque. Les dépôts seront séchés à l'aide d'un séchoir à main.
La plaque précédemment préparée sera placée verticalement dans une cuve à chromatographier
préalablement saturée par les vapeurs du solvant de migration. Ses parois internes seront tapissées de
papier filtre imprégné de solvant. Le solvant de migration qu’on va utiliser sera le Butanol /Acide
acétique /Eau distillée: 60/20/20 (p/p/p). C’est une migration ascendante qui sera arrêtée quand le
front de migration du solvant arrive à 0,5 cm du bord supérieur de la plaque. Cette dernière sera retirée de
la cuve, puis séchée au moyen d'un séchoir à main. La révélation des chromatogrammes sera assurée par
deux méthodes:
-La première consiste en l'examen des spots en lumière ultra - violette sous une longueur d’onde égale à
254 et à 366 nm.
-Pour la deuxième méthode, il s'agit d'une pulvérisation sur la plaque du réactif à la vanilline sulfurique .[10]
[11][12]
• Détection des familles chimiques de l'extrait
Pour chaque opération de détection, le résidu d'évaporation à sec de 1ml de l'extrait à étudier est utilisé.
 Les leucoanthocyanes: test de BATE- SMITH [13][14][15] :
Un volume de 0,5 ml d'acide chlorhydrique 6N sera additionné dans le troisième tube. Le
mélange sera ensuite porté au bain-marie à 100°C pendant 30 min. Après refroidissement, si
l'extrait contient des leucoanthocyanes, une coloration rouge apparaîtra.
 Les tanins et les polyphenols
Le résidu sera dissous dans 2ml d'eau distillée. La solution ainsi obtenue sera répartie en 4
parties égales dans 4 tubes à essai. Le premier tube sera utilisé comme témoin, tandis que les 3
autres servent à détecter et à identifier les tanins et les composés polyphénoliques.[8][15][16][17]
[18]
• Test à la gélatine
Quatre gouttes de gélatine aqueuse à 1% seront ajoutées dans le deuxième tube. La présence de tanins
condensés de type catéchique sera marquée par l'apparition d'un précipité blanc, suivie d'un virage de
coloration.
• Test à la gélatine salée
Pour le troisième tube, 4 gouttes de gélatine salée (gélatine 1% dans une solution de chlorure de sodium)
seront ajoutées. La présence de tanins hydrolysables de type pyrogallique sera révélée par la formation
d'un précipité.
• Test au chlorure ferrique
Quatre gouttes de chlorure ferrique en solution méthanolique seront ajoutées dans le quatrième tube. La
présence de tanins se traduit par un précipité et un changement de couleur.
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f) Méthodes de détermination structurale du principe actif :
La structure de la famille chimique impliquée dans l’activité de la plante sera effectuée par la technique de
RMN ou Résonance Magnétique Nucléaire et l’appareil spectrométrie. La RMN est une technique utilisant
les propriétés de ressource des atomes placés dans un champ magnétique élevé.
La méthode repose sur le magnétisme nucléaire. Les noyaux de certains atomes comme le proton 1H, le
carbone 13C possèdent un moment cinétique de spin P et également un moment magnétique .
par la relation suivante
= P avec
le rapport gyromagnétique, et
noyau à nombre quantique de spin I = ½ ou m 1 =
pour m1 = ½ et
est défini
/P est la constante caractéristique du
½ les fonctions d’ondes propres sont les suivantes
pour m1 = - ½ m1 correspond au nombre quantique magnétique qui caractérise l’état
stationnaire du noyau. Celui-ci est relié aux nombres de spin I du noyau. Le nombre total possible des états
stationnaires ou propres du noyau est donc égal à 2I + 1. Par conséquent le proton ne peut exister par
rapport à son moment de spin que dans deux états stationnaires. Hors champ magnétique, les états
et
ont la même énergie, on dit qu’ils sont dégénérés. Ce n’est que dans un champ magnétique statique
homogène de valeur B0 et par suite de l’interaction entre B 0 et
que cette dégénérescence est levée. La
séparation d’énergie ainsi produite qui est proportionnelle à l’intensité du champ B 0 crée la condition
nécessaire à l’existence d’une transition spectroscopique et constitue ainsi la base de la spectroscopie par
Résonance Magnétique Nucléaire.
g) Analyse des données :
A la fin de l’expérience, des molécules actives seront obtenues dont la structure sera déterminée.
3. Résultats et Discussions
Après avoir procédé aux différentes méthodes chimiques, nous avons les résultats suivants :
•
Cinq extraits : aqueuse à froid, hydroalcoolique à froid, éthanolique absolu à froid, hydroalcoolique à
chaud et aqueuse à chaud qui constitue l’extrait brut EB.
•
Les tests d’antibiogramme sont représentés par le tableau I.
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Tableau I:
de feuilles
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Diamètres des halos d’inhibition (en mm) lors des tests d’antibiogramme sur les extraits
Test
TYPE
D’EXTRACTION
Aqueuse à
Test sur
Test sur
Test
Test sur
sur
P.
Escherichi
Test sur
sur
Test sur
Test sur
Test
B.
B.
E.
S.
sur S.
megateuim
cereus
faecalis
antarctica
typhi
B.
S.
aerugin
a coli
Subtilis
aureus
osa
6
6
10
21
8
6
6
10
11
6
6
6
16
20
8
8
9
9
6
6
6
12
12
6
6
10
14
6
6
12
32
10
12
10
9
10
6
6
6
10
6
6
7
13
12
Froid
Hydroalcoolique
à froid
Ethanolique
absolu à froid
Aqueuse à
Chaud
Hydroalcoolique
à chaud
Cinq fractions purifiées : la fraction issue du traitement par la chaleur notée N 1, la fraction issue de
l’adialysat notée N2, la fraction issue du dialysat notée N 3, la fraction issue du surnageant de la précipitation
par l’éthanol 50 % notée N4 et la fraction issue du culot de la précipitation par l’éthanol 50 % notée N 5.
L’extraction aqueuse à chaud a été retenue comme type d’extraction donnant les meilleurs résultats
préliminaires. Les tests d’antibiogramme sur les 5 extraits préparés ont montré que l’extrait aqueux à chaud
noté EB est très actif vis à vis des germes tests et performant par rapport à l’extrait d’acétate d’éthyle de
feuilles de Chassalia bojeriana (Rubiacées) surtout vis-à-vis des B. subtilis dont les diamètres du halo
d’inhibition sont respectivement 32 et 9. L’extrait aqueux à froid de feuilles occupe la deuxième place.
Cette activité de l’extrait aqueux à chaud (EB) pourrait être liée à la présence des métabolites secondaires.
On constate qu’à concentrations égales, les germes tests sont plus sensibles à l’extrait aqueux à chaud (EB)
qu’à l’extrait hydroalcoolique à froid, aqueux à froid et éthanol absolu à froid. Les constituants de l’extrait
EB sont des leucoanthocyanes dont les spectres RMN 1H qui présente un doublet à 8,9 ppm avec un
constante de couplage de 2Hz, typique des positions 6 et 8 des flavonoïdes au sens large et COSY qui permet
de décrire un enchaînement de type méthylène en position benzylique- méthyne oxygéné- méthyne oxygéné
en position benzylique et la structure sont montrée par la figure 1, 2 et 3.
Notre extrait a presque le même résultat que l’extrait hydroéthanolique qui contient de leucoanthocyane de
feuilles de C. bojeriana (Rubiacées). La concentration de cet extrait est de 408,4 µg.µl -1 et son rendement par
rapport au matériel végétal frais de départ est de 1, 63 %. Cet extrait est largement concentré par rapport à
l’extrait aqueux à chaud et l’extrait butanolique de feuilles de C. bojeriana de concentrations respectives
213, 47 µg.µl-1 et 67, 3 µg.µl-1.
Le chromatogramme d’EB révélé sous U.V à 254 nm montre 2 bandes majeures. L’extrait aqueux à chaud
(EB) possède donc au moins 2 constituants différents dont un lui conféreraient ses activités antibactériennes.
Notre extrait possède moins de constituants que l’extrait hydroalcoolique à chaud de feuilles de V. pectoralis
qui possède 5 bandes composés de 4 majeures et 1 mineure donc possède au moins 5 constituants.
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Figure 1: Spectre RMN 1H du proanthocyane.
Figure 2: Spectre COSY du proanthocyane.
Figure 3: Leucoanthocyane ou proanthocyane.
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4. Conclusions
À l’issue de ce travail, il ressort que les principes actifs de cette plante peuvent être extractibles à froid, mais
l’extraction à chaud est la plus performante. Notons que les opérations de congélation et de décongélation ne
modifient pas leurs activités. Les résultats de la chromatographie sur couche mince correspondent aux
résultats du criblage phytochimique. Car les constituants chimiques montrés par les bandes sont des
leucoanthoncyanes dont le poids moléculaire a été déterminé par la technique de dialyse et se situe entre 500
et 3000 Daltons. De même ces résultats sont comparables aux méthodes de purification car le traitement par
la chaleur permet d’éliminer certaines macromolécules telles que les protéines qui coagulent sous l’effet de
la chaleur. L’éthanol permet la précipitation des molécules peu soluble et les grosses molécules comme les
leucoanthocyanes.
Pas de conflits d’intérêts.
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