Notice d`utilisation – PUMA HCV kit

PRINCIPE DU TEST
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1. Objectif d’utilisation
Le kit PUMA HCV est un test de RT-PCR en temps réel permettant la détection quantitative du
virus de l’hépatite C (charge virale) dans le plasma / sérum humain. En combinaison avec la
présentation clinique et les autres marqueurs biologiques du statut de la maladie, la mesure de la
charge virale VHC est destinée à être utilisée pour la surveillance de la progression de la maladie et
le suivi de patients infectés par le VHC recevant ou non une thérapie antivirale. Le test repose sur le
principe de l'amplification en temps réel de l'ARN viral présent dans les échantillons, ce qui permet la
quantification précise des produits des PCR pendant la phase exponentielle du processus
d’amplification.
2. Avantages
Grace à la détection en temps réel du signal fluorescent pendant et/ou après chaque cycle
PCR, les données de PCR quantitative peuvent être obtenues dans un délai très bref. Ainsi, aucun
traitement post-PCR n'est requis, ce qui favorise non seulement une diminution considérable du
risque de contamination du produit de PCR, mais permet également d'éviter d'ultérieures
contaminations d'échantillons par des amplicons produits lors de réactions antérieures.
3. Mécanismes moléculaires
Le test PUMA HCV exploite le principe de RT-PCR par hydrolyse d'une sonde nucléotidique
doublement marquée avec un groupement 5' reporter fluorescent (ex : FAMTM) et un groupement 3'
quencher non-fluorescent (ex : MGB). Pendant la PCR, les amorces sens et ami-sens s‘hybrident à
une séquence spécifique au niveau des amplicons. La sonde contenue dans le même mélange
réactionnel s‘hybride à une séquence cible de l‘amplicon. Lorsque la sonde est intacte, la proximité
spatiale entre le reporter et le quencher inhibe la fluorescence du reporter principalement par un
transfert d'énergie de type Förster. Pendant la PCR, la sonde se fixe spécifiquement entre les deux
sites où sont hybridées les amorces sens et anti-sens et inhibe toute activité de la Taq polymérase.
Dans le même temps, sa fonction 5'-3' exonucléase qui clive Ia sonde entre le reporter et le quencher
est activée. Le reporter, libéré du quencher, émet un signal fluorescent enregistré en temps réel par
des capteurs. Ainsi débarrassée des fragments de sonde, la séquence cible peut être lue et amplifiée
par la Taq polymérase.
L'augmentation du signal de fluorescence est détectée seulement si la séquence cible est
complémentaire a la sonde et si elle est amplifiée pendant la PCR, Ainsi, une amplification non
spécifique ne peut pas être détectée. Grâce à ce principe réactionnel, le signal de fluorescent est
directement proportionnel à l'amplification de la cible pendant la PCR.
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4. Phases réactionnelles
L'évolution de l'amplification est représentée par une courbe d'allure sigmoïde, pouvant être
divisée en deux phases :
1) Une phase correspondant à une amplification exponentielle au cours de laquelle la quantité
de produit de PCR obtenue à chaque moment est directement fonction du nombre de copies initiales.
Au début de la phase d‘amplification exponentielle, le moment où le signal sort du bruit de fond
correspond à un nombre de cycles, appelé Ct (pour Cycle threshold).
2) L'amplification exponentielle est suivie d'une phase de plateau qui correspond à un
ralentissement de l'amplification, dû à l'épuisement des réactifs.
5. Etapes opérationnelles
Le kit PUMA HCV comprend deux grandes étapes opérationnelles :
1. Préparation de l'échantillon : l'ARN viral est extrait, purifié et concentré à l’aide de la technique
d’extraction choisie (réactifs non fournis dans ce kit). Ex : QIAmp Viral RNA minikit (Qiagen)
Volume d’échantillon : 140 µL ; Volume d’élution : 60 µL.
2. Rétro-transcription de l’ARN en ADN puis amplification de l’ADN généré. L’ARN du VHC est
mesuré et quantifié. La charge virale de l’échantillon testé est obtenue en extrapolant de la
droite d’étalonnage (gamme de standards fournie dans le kit), la charge virale correspondant à
la valeur Ct de l’échantillon.
Le kit PUMA HCV permet de tester jusqu’à 92 échantillons de patients (100 tests au total en incluant
la gamme de standards et les contrôles).
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COMPOSITION DU KIT
Réactifs
Type
Volume ou
Quantité par tube
Nombre de tubes
Conservation
HCV Enzyme
Mix
RT, polymérase et
tampon
1,1 ml
1
-20°C
HCV + CI Oligos
Sets
Amorces et sondes
(HCV + contrôle
interne)
187 µl
1
-20°C
Water
Eau pour biologie
mol.
1 ml
1
-20°C
HCV RNA Panel *
RNA-s : 5
concentrations de
7
3
2,5.10 à 5.10
UI/ml
500µl
5
-20°C
HCV Positive
Control **
RNA-s : 3.10 UI/ml
3
500 µl
1
-20°C
HCV Negative
Control **
Tampon
500 µl
1
-20°C
RNA Internal
Control *
-
Lyophilisé
1
-20°C
* Le contrôle interne lyophilisé doit être resuspendu dans 600µl d’eau RNase / DNAse free (fournie).
** A extraire.
STOCKAGE DES REACTIFS
 Le kit PUMA HCV est transporté à -20°C.
 A réception, le coffret doit être conservé à -20°C. Dans ces conditions, les réactifs sont stables
jusqu’à la date de péremption indiquée sur l’étiquette.
Dans tous les cas, il est recommandé de préparer des aliquots en microtubes stériles, apyrogènes et
« nuclease free », de fermer Ies tubes avec les bouchons appropriés et les étiqueter soigneusement
en indiquant le nom du réactif, le lot, et la date de péremption.
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MATERIEL REQUIS MAIS NON FOURNI











Pipettes 1-10 µL, 20-200 µL et 100-1000 µL.
Embouts de pipettes avec filtre.
Centrifugeuse de paillasse.
Vortex de paillasse.
Thermocycleur « ouvert » pour PCR en temps réel.
Gants à usage unique.
Microtubes stériles.
Microplaques avec film adhésif.
Kit d’extraction manuelle ou automatisée d’acides nucléiques (ARN) adapté au prélèvement.
Réfrigérateur.
Portoirs de tubes.
L'instrument de PCR en temps réel utilisé pour le test est un système «ouvert» qui possède au
moins les caractéristiques principales suivantes :
- essais quantitatifs de PCR en temps réel.
- bloc de thermocyclage programmable.
- source d'excitation : LEDs, lampe ou laser;
- jeux de filtres (longueurs d‘onde Excitation/Émission) adaptés pour la détection des
fluorophores "reporter" des sondes FAM et Cy5.
- connexion avec un ordinateur utilisant un logiciel spécifique d‘analyse permettant la
récupération des données de fluorescence, la conduite des essais de quantification absolue, et
l’interprétation des résultats.
PRÉCAUTIONS D’EMPLOI
Le kit PUMA HCV est un test exclusivement réservé à être utilisé par du personnel de
laboratoire qualifié et soumis aux bonnes pratiques de laboratoire en biologie, conscient des risques
biologiques et formé à l'analyse en biologie moléculaire. L'interprétation des résultats obtenus à partir
de ce test est de la responsabilité du biologiste chef de laboratoire ou d'un technicien de laboratoire
dûment autorisé.
Des différences dans le traitement des échantillons et dans les procédures techniques
peuvent conduire à des résultats ininterprétables.
-
-
-
Pour toute manipulation, porter des gants et revêtir une blouse de laboratoire. Le port de
lunettes de sécurité est fortement recommandé pour la manipulation des échantillons de
sérum/plasma et des composants du kit présentant un risque infectieux potentiel.
Ne pas manger, boire, ou fumer dans les différentes zones de travail du laboratoire.
Ne jamais pipeter les réactifs à la bouche. Eviter les contacts avec la peau et les muqueuses.
Si les réactifs ou les échantillons entrent en contact avec la peau ou les yeux, laver
abondamment avec une grande quantité d'eau et contacter un médecin si une irritation se
développe.
Utiliser les nouveaux cônes à filtres afin d’éviter les contaminations croisées entre les
échantillons et les réactifs.
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-
-
-
Utiliser des consommables « nuclease-free « (ex. pipettes, cônes, tubes).
Les échantillons doivent être manipulés et éliminés comme s'ils étaient à risques infectieux. Ils
nécessitent les précautions d'usage, telles celles décrites dans « Biosafety in Microbiological
and Biomedical Laboratories (BMBL) » (www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf).
Nettoyer et désinfecter soigneusement tous les plans de travail avec une solution préparée
extemporanément à 0,5% d'hypochlorite de sodium dans de l'eau déminéralisée ou distillée.
Après chaque essai, les consommables (et déchets) doivent être considérés comme
contaminés et traités avec une solution d'hypochlorite de sodium à 0.5% ou avec tout autre
agent d'inactivation.
Se laver soigneusement les mains après toutes manipulations.
Eliminer les réactifs non utilisés, les déchets et les échantillons testés selon la réglementation
en vigueur dans le pays aux niveaux local, régional et national.
Tous les réactifs ont été spécialement formulés pour être utilisés dans ce test de PCR
quantitatif. Aucune substitution ne doit être faite afin d’assurer des performances optimales.
Les composants de ce kit sont testés comme une seule association : ne pas mélanger les
réactifs de lots différents.
La qualité de l’amplification dépend aussi de la qualité de l'extraction de I'ARN et de sa
préservation. Utiliser de préférence la technique d'extraction recommandée. Omunis n’est pas
responsable de la qualité des résultats obtenus avec des éléments, du matériel et un protocole non
recommandé. Ne pas utiliser des réactifs d'extraction au-delà de la date de péremption indiquée.
Ne pas utiliser le kit au-delà de sa date de péremption.
CONDITIONS D'UTILISATION
Le flux de travail dans le laboratoire de biologie moléculaire doit être unidirectionnel, en
commençant dans la zone de pré-amplification et en finissant dans la zone d'amplification.
Le mélange réactionnel (mix) doit être préparé dans une pièce séparée ou sous une hotte de
sécurité biologique.
Pour assurer la séparation des phases de préparation de l'échantillon, du mix et de
l'amplification, chaque zone de travail et/ou pièce doit avoir ses propres équipements (cf. Matériels
requis et non fournis) incluant les pipettes, les embouts de pipettes, les réactifs, etc... Ces
équipements ne doivent pas quitter la zone à laquelle ils ont été attribués.
L'utilisation de la méthode de charge virale de I'ARN VHC doit être limitée à du personnel bien
entraîné aux techniques de PCR et plus spécifiquement au processus entier (préparation de
l'échantillon et essai de RT-PCR) de l'essai PUMA HCV (combiné avec une extraction).
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PRELEVEMENTS ET PREPARATION DES ECHANTILLONS
1. Prélèvements
Des échantillons de sérum ou de plasma peuvent être testés indifféremment avec le kit PUMA
HCV.
Dans le cas d’une analyse à partir de plasma, le sang doit être prélevé dans des tubes stériles
avec un anticoagulant de type EDTA ou citrate. En effet, l'héparine inhibe la réaction de PCR temps
réel et ne doit pas être utilisée avec le kit PUMA HCV. L’ajout d’anticoagulants n’est pas nécessaire
dans le cas d’une analyse à partir de sérum (tube sec).
2. Préparation des échantillons
Une fois prélevés, les échantillons peuvent être conservés soit à température ambiante
pendant maximum 4h, soit à -20°C pour des durées plus longues. Un échantillon de sérum/plasma
peut être congelé et décongelé deux fois sans impact négatif significatif sur le rendement en ARN
extrait et donc sur le signal obtenu après amplification.
Si des cryoprécipités sont visibles, ils peuvent être enlevés par centrifugation brève et les
échantillons doivent être traités immédiatement. Cette étape n’aura pas d’impact sur les résultats du
test.
La préparation de la gamme, des contrôles et de l’échantillon de sérum/plasma pour
l'isolement de I’ARN, se fera à l’aide d’un kit d’extraction non fourni. Le kit est validé pour une
extraction avec le kit d’extraction manuel QIAmp Viral RNA Mini Kit (Qiagen) et avec le kit d’extraction
automatisé Viral NA (Diasorin) et l’automate Arrow (Nordiag) selon le protocole du fabricant.
AJOUT ET EXRACTION DU CONTROLE INTERNE
Le kit PUMA HCV inclut un contrôle interne d’extraction ARN. Celui-ci doit être ajouté au
tampon de lyse avant l’extraction à raison de 4 µL par échantillon. L’extraction d’ARN peut ensuite
être réalisée selon le protocole du fabricant.
PRÉPARATION DE LA REACTION DE PCR
1. Préparation du mélange réactionnel
Calculer le nombre d’échantillons à tester, sans oublier les cinq points de la gamme de
standard VHC de charge virale décroissante (2,5.107 5.106 5.105 5.104 et 5.103 UI/ml). Le contrôle
positif et le contrôle négatif et un blanc (ex : eau pour biologie moléculaire).
Dans un microtube stérile de 1.5 ml ou 2 ml, préparer le mélange réactionnel suivant pour
chaque échantillon. Pour N échantillons, multiplier par «N+10%» tous les volumes indiqués :
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2. Préparation de la plaque PCR
 Homogénéiser le mélange réactionnel obtenu la solution obtenue en vortexant. Centrifuger
brièvement le tube afin de récupérer les éventuelles gouttelettes présentes sur les bords du
tube ou dans le capuchon.
 Répartir dans chacun des puits de la microplaque PCR adaptée au système d’amplification
12 µl du mélange réactionnel précédent.
S’assurer de ne pas faire de bulles lors du dépôt du mélange dans la microplaque.
 Homogénéiser en vortexant quelques secondes chacun des 5 tubes contenant les points de la
gamme (2,5.107, 5.106, 5.105, 5.104 et 5.103 UI/ml), contrôles (positifs et négatifs) ou
échantillons (patients et eau) puis centrifuger brièvement les tubes avant ouverture pour faire
tomber les gouttes se trouvant dans le capuchon. Déposer 8 µl de chaque point de gamme,
contrôle et échantillon dans les puits à tester de la plaque contenant 12 µl de mélange
réactionnel. Chaque puits à tester contient alors un volume total de 20 µl.
 Fermer soigneusement la microplaque PCR avec le film adhésif approprié et la placer dans
l’instrument de PCR en temps réel.
 Lancer l’amplification selon le programme donné (cf tableau ci-dessous)
Note: pour des instructions détaillées concernant un essai de quantification, se référer au manuel d'utilisation
spécifique à l'instrument de PCR en temps réel et son logiciel.
a) Après avoir soigneusement scellé la plaque de PCR avec un film adhésif adapté, installer
la plaque dans l’instrument de PCR en temps réel.
Note: à partir de cette étape et jusqu'à élimination de la plaque analysée, contenant des cibles amplifiées, ne
jamais déplacer ou enlever le film adhésif couvrant la plaque
b) Effectuer l‘essai de PCR en temps réel selon la programmation des paramètres suivants:
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Le kit PUMA HCV peut être utilisé avec différents systèmes ouverts d’amplification/analyses.
A ce jour, les tests ont été optimisés avec le LightCycler 480 II Real-Time PCR (Roche).
Il est nécessaire de vérifier que les systèmes utilisés ont été installés, calibrés et
vérifiés d’après les recommandations et les instructions du fabricant.
ANALYSE DES
RESULTATS
DONNEES
ET
INTERPRETATION
DES
1. Paramétrage du logiciel
Lorsqu’un logiciel spécifique dédié au système de PCR en temps réel est utilisé, consulter le
manuel d’utilisation décrivant la saisie des données et le mode opératoire pour la quantification de la
charge virale.
Le logiciel permet au moins de :
-
-
Choisir le type de fluorophore
Ajuster le seuil ou l'établir automatiquement pour chaque puits-test
Reporter la répartition des standards, contrôles et échantillons à tester dans le plan de plaque
Construire la droite d‘étalonnage utilisée pour le dosage quantitatif
Etablir la feuille de résultats décrivant les données de chaque puits-test dont : la position du
puits, le fluorophore mesuré, l'identification de l'échantillon, la valeur de Ct, la quantité initiale
de la cible dans l'échantillon (ex. valeur en UI/ml ou log10 de la quantité).
Reporter toutes les données d‘analyses
Après la fin de l'essai de PCR en temps réel et la récupération des données :
1. Vérifier et déterminer le réglage du seuil;
2. Noter les valeurs de Ct de chaque point de gamme HCV (intersection entre le seuil et la
courbe d'amplification);
3. Vérifier ensuite, vérifier les critères d‘acceptation de l'essai avant d'interpréter les résultats de
chaque échantillon.
2. Critères de validation de l’essai
 Gamme des Standards :
- La valeur de la pente est comprise entre -3,6 et -2,9 inclus.
- Le coefficient de corrélation R2 de la courbe est compris entre 0,95 et 1,00 inclus, avec
idéalement R2  0,98.
 Contrôle négatif :
Idéalement, la fluorescence émise par un contrôle négatif ne doit pas couper la ligne de seuil.
C’est un indicateur d’amplification non spécifique. Si la fluorescence dépasse le seuil, vérifier la
présence d’une courbe atypique (voir ci-dessous). Dans le cas d’une courbe d’amplification, une
contamination ou une erreur de distribution dans la plaque est à supposer.
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 Contrôle positif :
La valeur du contrôle positif doit être mesurée avant 32 cycles.
En l’absence d’amplification d’un contrôle positif, cela laisse supposer la présence d’un inhibiteur de
PCR ou une erreur dans la distribution des réactifs. Dans ce cas il est nécessaire de renouveler la
série d’analyse.
 Courbe atypique :
Certains échantillons présentent des courbes atypiques qui ne sont pas caractéristiques de
courbes d’amplification. Dans ce cas, il ne faut pas considérer le résultat comme interprétable et
renouveler l’analyse de l’échantillon.
 Contrôle interne d’extraction et d’amplification (tube « HCV Internal Control »)
Pour une utilisation du contrôle interne comme mentionné dans le protocole, en supposant
une extraction de 100% d’efficacité et en utilisant 1:10 de l’ARN extrait dans la réaction, une valeur de
Ct de 28 est attendue. Cependant, cette valeur peut varier de manière significative selon l’efficacité
de l’extraction, la quantité d’ARN ajoutée dans la réaction de PCR et des paramètres de l’instrument
d’analyse utilisé. Des valeurs de Ct dans une plage de 28±3 sont considérées comme normales.
Quand l’amplification du gène cible résulte en un nombre élevé de copies, le contrôle interne
fourni peut ne pas produire de courbe d’amplification (notamment pour des charges virales
supérieures à 10 000 IU/ml). Ce résultat est normal et n’invalide pas le test. Il doit être interprété
comme un résultat positif malgré l’absence de signal du control interne. Ce phénomène est le résultat
d’une compétition dans l’amplification de la cible entre le contrôle interne et la cible virale dans le cas
d’un nombre élevé de copies.
3. Interprétation des résultats
 Si les propriétés de la gamme des standards ne sont pas atteintes ou si les critères de
validation des contrôles positifs et négatifs ne sont pas remplis, la série entière d’analyses doit
être renouvelée.
 Un résultat est considéré positif quand la charge virale VHC mesurée est supérieure au seuil
de 80 IU/ml.
 Un résultat de charge virale VHC détectée inférieur au seuil de 700 U/I ml peut aussi être
considéré comme positif, mais la valeur de charge virale ne peut pas être précisément
quantifiée. Il est recommandé d’indiquer pour ces échantillons « détectable en dessous du
seuil de quantification ».
 Un résultat est négatif, ou « non détecté », quand aucune valeur n’est obtenue ou que la
valeur est inférieure au seuil de détection (70 UI/ml).
L'essai est invalidé, si les propriétés de la droite d'étalonnage ne sont pas atteintes, ou si un
des contrôles (négatif ou positif) n‘entre pas dans les critères attendus, précédemment décrits. Par
conséquent, l'analyse entière (préparation et isolement de I’ARN des échantillons, standards et
contrôles, et amplification) doit être renouvelée.
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PERFORMANCES
1. Comparaison technique
Les performances du kit PUMA HCV ont été comparées à la technique COBAS Taqman HCV
Test v2.0 (Roche Diagnostics).
2. Matériel utilisé
L’extraction de l’ARN du VHC a été réalisée par la technique automatisée Qiacube DSP virus
Spin kit (Qiagen) à partir d’un prélèvement de 400 µL de sérum et avec une élution de 50 µL. La
rétro-transcription et l’amplification ont été réalisées avec le LightCycler 480 II Real-Time PCR
(Roche).
3. Matériel biologique utilisé
Un total de 43 échantillons de sérum de patients testés positifs pour le VHC (concentration
médiane de la charge virale = 5,66 log10 IU/ml) et de 21 échantillons de sérum de patients testés
négatifs pour le VHC (incluant 5 échantillons positifs en ADN VHB, 1 échantillon positif en ARN VIH)
ont été fournis par le service spécialisé d’un laboratoire externe (échantillons testés par la technique
COBAS Taqman HCV Test v2.0 de Roche).
4. Performances
Sensibilité
100% (43/43) des échantillons ont été trouvés positifs par le kit PUMA HCV (concentration
médiane de la charge virale = 5,38 log10 IU/ml).
Spécificité
100% (21/21) des échantillons ont été trouvés négatifs par le kit PUMA HCV.
Limite de détection
La limite de détection du test est de 80 IU/ml. Elle a été calculée en utilisant 19 concentrations
(10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 IU/ml) d’un
échantillon de référence « 2nd WHO International Standard for HCV RNA Nucleic Acid Amplification
Techniques (NIBSC 06/102) » dans 10 tests différents.
Linéarité de la gamme des Standards
La linéarité de la gamme des standards a été mesurée en réalisation 10 analyses
indépendantes pour chaque point de dilution de la gamme : R2 = 0,987.
Variabilité intra-essais
La variation intra-essais a été mesurée en testant dans une seule PCR, 9 réplicats de 5
échantillons cliniques quantifiés par la technique Roche (420, 8700, 25000, 510000, 9460000 IU/ml).
Le coefficient de variation moyen intra-essais est 3,1% (1,76 à 5,79%).
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Variabilité inter-essais
La variation inter-essais a été mesurée en testant :
10 analyses indépendantes de 10 échantillons cliniques quantifiés par la technique Roche (2.104,
3.104, 105, 1,25.105, 106, 2,6.106, 3,7.106, 4,2.106, 6,9.106 IU/ml), par le même opérateur.
Le coefficient de variation moyen inter-essais est 2,7% (1,49 à 5,89%).
Table 1. Variabilité intra et inter-essais.
Intra-run
Sample 1 (2,62 Log10 IU/ml)
Sample 2 (3,94 Log10 IU/ml)
LPC (4,40 Log10 IU/ml)
Sample 4 (5,71 Log10 IU/ml)
Sample 5 (6,98 Log10 IU/ml)
Average (6,30 Log10 IU/ml)
Inter-run
STD 1 (6,84 Log10 IU/ml)
STD 2 (6,41 Log10 IU/ml)
STD 3 (6,62 Log10 IU/ml)
STD 4 (6,00 Log10 IU/ml)
STD 5 (4,48 Log10 IU/ml)
HPC (6,00 Log10 IU/ml)
STD 6 (5,00 Log10 IU/ml)
STD 7 (5,10 Log10 IU/ml)
STD 8 (6,57 Log10 IU/ml)
STD 9 (3,30 Log10 IU/ml)
Average (5,99 Log10 IU/ml)
Mean (Ct)
SD (Ct)
%CV
34,53
29,82
28,18
24,36
20,62
27,50
0,61
0,63
0,54
0,95
1,19
0,78
1,76
2,12
1,91
3,90
5,79
3,09
20,28
22,64
20,77
23,73
27,30
22,44
27,56
26,30
20,55
31,65
25,70
0,60
1,33
0,45
1,22
0,41
0,39
0,42
0,59
0,39
0,85
0,53
2,95
5,89
2,17
5,14
1,49
1,73
1,53
2,24
1,90
2,68
2,01
Détection des génotypes VHC
Le virus de l’hépatite C est composé de 6 génotypes. La capacité du test à détecter les
différents génotypes du VHC a été évaluée à l’aide du « non-WHO Reference Material 2nd HCV RNA
Genotype Panel for NAAT (NIBSC code: 08/264) » contenant les 6 génotypes différents. La totalité
des génotypes du panel a été détectée (100%).
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Fig. 1. Corrélation PUMA HCV Kit et CTM.
Fig. 2. Bland–Altman entre CTM et Puma HCV Kit.
Comparaison de la technique Roche et du test PUMA HCV pour la quantification de l’ARN du VHC dans le sérum de
64 patients.
NOTE
Il convient de notifier tout incident grave, en lien avec le dispositif, au fabricant et à l'autorité
compétente de l'État membre dans lequel l'utilisateur est établi.
SIGNIFICATION DES SYMBOLES UTILISES
Référence
Nombre de réactions
Température de stockage
Fabricant
Date d’expiration
Numéro de lot
Attention
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