Myxomatose

SECTION 2.6.
LAGOMORPHA
CHAPITRE 2.6.1.
MYXOMATOSE
RÉSUMÉ
La myxomatose est une maladie majeure du lapin européen due au virus myxomateux (VM), un
membre de la famille des Poxviridae. Le diagnostic de la myxomatose, ses caractéristiques
cliniques mises à part, fait appel à l’isolement et à l’identification du virus ou à la mise en évidence
de ses antigènes. La présence d’une réponse immunitaire humorale autorise un diagnostic
rétrospectif de la forme subaiguë de la maladie, et peut permettre une estimation de la prévalence
de l’infection dans une population de lapin. La maladie est caractérisée classiquement par le
développement de lésions cutanées nodulaires des plus évocatrices.
Identification de l’agent pathogène : lors de la présence de lésions cutanées sur un cadavre de
lapin, la présence de l’antigène viral peut être révélée par un test d’immunodiffusion utilisant un
fragment de lésion. Des cultures en couche monocellulaire de cellules de rein de lapin, inoculées à
partir de lésions, développent un effet cytopathogène caractéristique des poxvirus. La présence du
virus peut alors être confirmée par immunofluorescence et examen au microscope électronique en
coloration négative.
L’identification de l’infection, par inoculation de lapins avec des prélèvements suspects, est plus
longue mais demeure précieuse pour confirmer la présence d’un virus infectieux et évaluer sa
pathogénicité.
Épreuves sérologiques : la mise en évidence et le titrage des anticorps spécifiques apparaissant
au cours de l’infection naturelle ou à la suite de la vaccination, est réalisée par la méthode
classique de fixation du complément ou par la méthode immuno-enzymatique (ELISA) récemment
développée, plus sensible et non affectée par les facteurs pro- ou anti-complémentaires. La
difficulté réside dans l’obtention de prélèvements de sang à partir de membres représentatifs d’une
population. Ce problème peut être résolu en récoltant sur du papier filtre du sang séché qui sera
plus tard élué et examiné en immunofluorescence indirecte ou en ELISA. Des prélèvements en
tubes microcapillaires peuvent aussi être utilisés en ELISA.
Des tests d’immunodiffusion qualitative en gélose permettent de révéler à la fois les antigènes et
les anticorps humoraux.
Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique :
des vaccins à virus vivants préparés à partir du virus du fibrome de Shope ou du virus myxomateux
modifié sont disponibles pour l’immunisation des lapins.
A. INTRODUCTION
La myxomatose est une maladie majeure du lapin européen (Oryctolagus cuniculus) due au virus myxomateux
(VM), un membre de la famille des Poxviridae. Ce virus a été isolé pour la première fois en Uruguay en 1898 à
partir de lapins de laboratoire et a été caractérisé comme un poxvirus en 1927. Dans les conditions naturelles, il
affecte deux espèces de léporidés : Sylvilagus brasiliensis en Amérique du Sud (souches sud-américaines) et
Sylvilagus bachmani en Californie (souches californiennes) (7). Chez leur hôte naturel, les souches virales
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n’induisent qu’un fibrome bénin, la maladie généralisée ne se produisant seulement que chez les jeunes. Chez le
lapin européen, deux formes de la maladie ont été décrites : la forme nodulaire (ou classique) et la forme
non-myxomateuse (respiratoire).
La forme nodulaire due à une souche virulente du VM est caractérisée par des lésions cutanées exubérantes et
une immunodépression, souvent associées à des surinfections de l’appareil respiratoire par des bactéries
contaminantes Gram négatives. Des souches prototypes isolées de foyers australiens ou européens
caractérisent les différents degrés de virulence (du niveau I au niveau V) tels qu’ils sont établis sur des lapins de
laboratoire (8). Après infection par une souche de niveau I (la plus virulente), le premier symptôme est une
boiterie du côté du point d’inoculation qui devient protubérant et s’ulcère. Une blépharo-conjonctivite aiguë et un
œdème du périnée et du scrotum se développent graduellement. Les lésions cutanées secondaires apparaissent
entre environ 6 et 7 jour (7). La mort peut éventuellement survenir entre le 8e et le 15e jour après l’infection. Lors
d’une infection avec des souches des niveaux II à V, les symptômes sont en général identiques excepté que
l’évolution est plus lente et moins grave. Quand les animaux survivent, les lésions guérissent progressivement. Le
taux de mortalité varie de 20 % à 100 % selon la souche virale. La transmission habituelle de la forme nodulaire
se fait par des insectes piqueurs, mais une transmission de lapin à lapin est possible lorsqu’ils sont enfermés,
mais elle est limitée. Cette forme est plus fréquemment observée dans les petits élevages (2). Les symptômes de
la forme non myxomateuse sont essentiellement respiratoires, les nodules cutanés étant petits et peu nombreux.
On pourrait penser que cette forme n’est pas transmise par des vecteurs et qu’elle survient plutôt dans les grands
élevages intensifs, mais il convient d’être prudent avant d’avancer cette hypothèse, car la forme non
myxomateuse a aussi été observée chez des lapins sauvages. Jusqu’à présent, ces formes de myxomatose n’ont
été signalées qu’en France (5, 15), en Espagne (18) et plus récemment en Belgique (16).
Le spectre d’hôtes du VM est très étroit et ne présente aucun risque pour les humains.
B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC
Dans la mesure où les signes de la maladie deviennent plus discrets avec l’atténuation des souches de virus,
l’envoi de prélèvements au laboratoire devient de plus en plus nécessaire. Cependant, le tropisme cutané est
réduit dans le cas des souches non myxomateuses du VM, et l’expression clinique de la forme non myxomateuse
rend le diagnostic clinique plus difficile que dans le cas de la forme classique. Les différentes techniques
disponibles varient dans leur capacité à détecter le VM dans les lésions myxomateuses typiques, dans l’œdème
des paupières ou des organes génitaux. Néanmoins, le diagnostic des formes atténuées ou des formes atypiques
(non myxomateuses) doit être confirmé par isolement du virus sur des lignées de cellules sensibles telles que la
lignée RK-13 (ATCC CCL37) et par identification du virus par les méthodes immunologiques. Dans tous les cas,
l’agent causal peut aussi être identifié par la mise en évidence de l’acide nucléique du VM par amplification en
chaîne par polymérase (PCR) ; les techniques moléculaires n’ont pas été évaluées quant à leur utilité
diagnostique.
1.
Identification de l’agent pathogène
Une portion de lésion (myxome, organes ou tissus, notamment les paupières) est excisée à l’aide de ciseaux. Le
myxome est débarrassée de l’épiderme et de la couche superficielle du derme. Elle est lavée en solution
physiologique tamponnée au phosphate (PBS) additionné d’antibiotiques comme défini ci-dessous, puis broyée et
homogénéisée à une dilution de 1 g de tissu pour 4,5 à 9,0 ml de PBS. Les cellules sont rompues par deux cycles
de congélation-décongélation, ou par ultrasonication, afin de libérer les virions et les antigènes. Cette suspension
est centrifugée pendant 5 à 10 min à 1 500 g. Le surnageant est utilisé pour les épreuves.
a)
Culture
L’isolement du virus en culture de cellules peut utiliser des cultures de cellules de première explantation de
rein de lapin (RK), ou des cellules établies en lignée continue, telle que la lignée RK-13, en milieu Opti-MEM
(MEM pour milieu essentiel minimal) contenant 2 % de sérum de veau ; 300 Unités Internationales (UI)/ml
de pénicilline ; 300 μg/ml de streptomycine ; 100 μg/ml de gentamycine ; 50 UI/ml de nystatine
(mycostatine) ; et 5 μg/ml d’amphotéricine (fungizone). L’inoculum est représenté par le surnageant de
l’homogénat de lésion ou par du jetage oculo-respiratoire repris en Opti-MEM additionné de 2 % de sérum
de veau et d’antibiotiques. L’inoculum est retiré de la couche de cellules au bout de 2 h. Les cellules sont
rincées avec un faible volume de milieu puis recouvertes de milieu d’entretien (Opti-MEM).
Un effet cytopathogène (ECP) typique des poxvirus (14) se développe en 24 à 48 h (à 37 °C et 5 % de
CO2), mais avec certaines souches, il peut être plus lent et n’apparaître qu’au bout de 7 jours. Selon la
souche de virus, des groupes de cellules voient leur cytoplasme confluer et forment des syncytia de taille
variable, renfermant de 2 à 50 noyaux et même rassemblant jusqu’à une centaine de noyaux. Le noyau de
certaines cellules présente des altérations, la chromatine formant des agrégats basophiles de taille et en
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nombre variables, donnant à la culture un aspect en peau de léopard. Les inclusions intracytoplasmiques
éosinophiles, lorsqu’elles sont présentes, demeurent discrètes. Les cellules infectées s’arrondissent, se
contractent, deviennent pycnotiques puis se lysent et se détachent de leur support (verre ou plastique). A la
longue, toutes les cellules seront infectées et la couche monocellulaire se détache complètement.
Le virus du fibrome de Shope produit tout d’abord des foyers d’accumulation de cellules arrondies qui
prolifèrent et s’empilent (14). À la périphérie, les cellules récemment infectées montrent de légères
modifications nucléaires et des inclusions cytoplasmiques acidophiles nombreuses et précoces. La couche
cellulaire est détruite en plusieurs jours.
b)
Méthodes immunologiques
Les tests d’immunodiffusion en gélose (IDG) sont de réalisation facile et rapide – les résultats peuvent être
obtenus en 24 h. Les plaques de gélose sont préparées avec de l’agar Noble (0,6 g), de l’éthylène diamine
tétra-acétique (EDTA) (2,5 g), du chlorure de sodium (4,5 g), et de l’eau distillée (500 ml) contenant du
thiomersal (merthiolate) à 1/100 000. L’antisérum de référence (voir ci-dessous) et l’échantillon à tester sont
placés dans des puits opposés de 6 mm de diamètre, séparés de 5 mm. Une autre technique consiste à
déposer un fragment de lésion directement sur la gélose, à 5 mm d’un disque de papier filtre imprégné de
l’antisérum. Des lignes de précipitation, habituellement jusqu’à 3, apparaissent en 48 h, indiquant la
présence d’antigènes du VM. Une ligne unique apparaît lors de réaction hétérologue avec le virus du
fibrome de Shope.
Les épreuves d’immunofluorescence indirecte (IFI) peuvent être appliquées sur les cultures à partir de 24 h
d’incubation. Les épreuves d’IFI révèlent la multiplication intracytoplasmique du virus mais ne peuvent
distinguer le VM de celui du fibrome de Shope. L’inoculation de cellules d’embryon de poulet (trypsinisées à
11 jours d’incubation) n’entraîne pas d’ECP mais est propice à la détection des antigènes viraux par
immunofluorescence.
c)
Microscopie électronique
La microscopie électronique en coloration négative peut être appliquée à un fragment de lésion cutanée. La
3
technique est simple et rapide, donnant des résultats en 1 h. Environ 1 mm de tissu est disposé sur un
verre de montre et 3 gouttes d’eau distillée sont ajoutées. Après 1 à 2 min à la température ambiante une
grille de microscopie électronique revêtue de formvar et de carbone est posée sur le liquide. Après 1 min,
l’excès de liquide est éliminé délicatement à l’aide d’un papier filtre et, immédiatement une goutte d’une
solution aqueuse à 2 % de molybdate d’ammonium, pH 7,0 ; est déposée sur la grille. Au bout de 10 s,
l’excès de liquide est absorbé à l’aide d’un papier filtre et la grille est prête pour l’examen au microscope
électronique. Lors d’examen positif, des particules typiques de poxvirus peuvent être vues mais cette
méthode ne permet pas de différencier le VM de celui du fibrome de Shope.
d)
Tests d’inoculation
L’inoculation d’un lapin par voie intradermique permet aussi d’identifier le virus grâce à ses caractéristiques
pathogènes (niveaux de virulence, formes classique ou non-myxomateuse), à savoir son tropisme cutané
(forme nodulaire) et oculo-respiratoire (forme non myxomateuse). Elle doit être évitée si possible, mais
présente l’avantage de permettre d’apprécier la virulence en fonction du type d’inflammation des lésions
(local ou généralisé), de l’étendue des lésions et du temps de survie, ainsi que de distinguer le virus du
fibrome de Shope (avec une simple lésion fibromateuse locale) du virus myxomateux (capable d’entraîner
une infection généralisée chez l’adulte). On choisira des lapins domestiques pesant environ 2 kg, non
vaccinés et chez lesquels on vérifiera préalablement l’absence d’anticorps (14).
L’inoculum peut être le surnageant d’une lésion homogénéisée (avec antibiotiques) ou le produit d’une
culture. Un volume de 0,1 à 0,2 ml est injecté par voie intradermique à la face postérieure de l’oreille ou
dans la région dorso-lombaire préalablement débarrassée de ses poils. L’inoculum peut faire l’objet
d’injections de dilutions sériées en tampon salin à raison de un site par dilution. Une lésion primaire
apparaîtra au point d’injection en 2 à 5 jours, suivie d’une conjonctivite. En utilisant 5 sites par dilution il est
possible de calculer une dose infectieuse 50 % (DI50). Si l’animal survit, la maladie peut être confirmée par
la sérologie 15 jours plus tard.
2.
Épreuves sérologiques
Les anticorps apparaissent en 8 à 13 jours. Lors de formes non létales ou après vaccination, le titre atteint un
sommet entre 20 à 60 jours ; il décline ensuite et les anticorps deviennent indétectables au bout de 6 à 8 mois en
l’absence de ré-infection (données correspondant à la fixation du complément [FC]) (19).
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Diverses épreuves sérologiques peuvent être utilisées, mais l’immunodiffusion en gélose (IDG), la FC, l’IFI et la
méthode immuno-enzymatique (ELISA), (dans l’ordre de sensibilité croissante), sont les épreuves les plus
appropriées pour les échanges internationaux et les autres applications. Ces épreuves réclament des antigènes
et antisérums de référence. L’antigène peut être préparé à partir de la souche Lausanne ou d’une souche
antigéniquement rattachée, produites sur lapins ou culture de cellules.
•
Préparation des réactifs de référence (IDG, FC et IFI)
•
Préparation de l’antigène
Des lésions myxomateuses sont prélevées sur lapins, 6 à 7 jours après inoculation, puis homogénéisées en
tampon véronal à la dilution de 1/5. L’antigène est le surnageant obtenu après centrifugation (1 500 g
pendant 5 à 10 min). Une activité anti-complémentaire éventuelle est supprimée par addition de 0,6 % de
chloroforme. Le liquide antigénique peut être stocké à –30 °C ou –70 °C ou utilisé directement en FC après
titrage à l’aide d’un antisérum de référence.
L’antigène peut être préparé à partir de culture sur cellules de lignée RK-13. Les cellules RK-13 (cellules de
rein de lapin CCL-37) sont cultivées 48 h avant inoculation dans du milieu de Eagle modifié Dulbecco
(DMEM, Gibco) contenant 10 % de sérum de veau fœtal, de la pénicilline et de la streptomycine. Les
cellules sont incubées à 37 °C avec une atmosphère à 5 % de CO2. Les cellules sont infectées avec la
souche de VM à un taux d’infection de 1-5. Après une incubation de 2 h à 37 °C, l’inoculum est retiré et les
cellules sont cultivées pendant 48 h dans du milieu DMEM avec 5 % de sérum de veau fœtal (incubation :
37 °C, 5 % de CO2). Le tapis cellulaire est récolté 48 h après infection, quand l’ECP est clairement visible
(80 %), puis centrifugé (1 000 g). Le liquide surnageant est recueilli. Le culot cellulaire est
congelé-décongelé 3 fois pour récupérer tout le virus et la suspension virale est clarifiée à 1 000 g. Le
surnageant est ajouté au précédent. L’ensemble des surnageants constitue l’antigène qui est stocké à
-20 °C ou -70 °C pour être conservé. Il est titré en cultures cellulaires avant son utilisation.
•
Titrage de l’antigène de référence par la fixation du complément
i)
Inactiver un antisérum de référence pendant 30 min au bain-marie à 56 °C. Il n’existe pas de sérum de
référence international, mais des sérums de référence interne au laboratoire doivent être préparés et
titrés selon une échelle appropriée, en utilisant la FC ou l’ELISA. Après cela, la méthode suivante est
utilisée pour normaliser les lots d’antigène.
ii)
Faire des dilutions en série, de raison deux, du sérum de référence en tampon
calcium/magnésium/véronal (CMV) (BIOMERIEUX, réf. 72171), pH 7,2, de 1/2 à 1/4096, dans une
plaque de micro-titrage à 96 puits à fond rond, une dilution par range (colonne) et 25 μl par puits.
iii)
Utilisant des tubes, faire des dilutions de raison deux de l’antigène en tampon CMV de 1/10 à 1/1280.
iv)
Ajouter 25 μl par puits de la même dilution du premier antigène à chaque puits de la première ligne de
la plaque ; de manière similaire, ajouter les dilutions suivantes de l’antigène dans les puits des lignes
suivantes afin d’obtenir un titrage en échiquier de l’antigène et de l’anticorps.
v)
Ajouter 25 μl (6 unités H50 [50 % d’hémolyse]) de complément par puits.
vi)
Incuber la plaque couverte d’un film de plastique, pendant 1 h à 37 °C ou 14 h à 4 °C.
vii)
Ajouter 50 μl par puits du système hémolytique (2,5 % de globules rouges [GR] de mouton et un
volume égal de sérum anti-GR de mouton, les deux dilués dans du CMV (pour avoir la dilution de
travail optimale, suivre les recommandations du fabricant, sinon déterminer individuellement cette
dilution pour chaque lot de sérum utilisé).
viii) Couvrir de nouveau la plaque et incuber pendant 30 min à 37 °C.
ix)
•
Lire la plus haute dilution de l’antigène donnant une hémolyse complète (H100) avec la plus haute
dilution du sérum de référence. Il y a 1 unité antigénique (AgU) dans 25 μl de cette dilution de
l’antigène.
Titrage des particules infectieuses du virus Myxoma en cultures cellulaires
i)
Diluer le virus de 10-1 à 10-5 dans du DMEM avec antibiotiques et 2 % de sérum de veau fœtal.
ii)
Infecter un tapis confluent de cellules RK-13 (P6 – plaques Falcon) trois exemplaires avec 200 µl des
dilutions en série intéressantes et incuber à 37 °C pendant 2 h dans une atmosphère à 5 % de C02.
iii)
Retirer l’inoculum et ajouter dans chaque puits 2 ml de DMEM avec 5 % de sérum de veau fœtal.
iv)
Incuber à 37 °C en atmosphère à 5 % de CO2 pendant 2 jours.
v)
Retirer le milieu liquide et le remplacer par un milieu solide avec 1 % d’agarose LMP et 2 % de sérum
de veau fœtal.
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•
vi)
Incuber à nouveau 1 à 2 jours ; les plages sont alors comptées sans coloration pour chaque dilution
(une coloration est possible en ajoutant du rouge neutre dans le milieu solide).
vii)
Le titre est donné en unités formant plages (UFP) par ml.
Préparation et titrage du sérum positif de référence
Pour l’anti-sérum de référence, un lapin adulte, à sérologie négative, est vacciné avec une souche atténuée
de VM ou avec le virus du fibrome de Shope. Après 3 à 4 semaines, ce lapin est inoculé par voie
3
intradermique avec une souche virulente de VM (souche Lausanne ou apparentée) (5 × 10 UFP). Le
sérum, obtenu 3 semaines plus tard, est titré en FC ou en ELISA. Si le titre atteint ou dépasse 1/640 ou
1/1000 respectivement pour la FC et l’ELISA, l’animal est saigné et son sérum stocké à –20 °C.
a)
Test de fixation du complément
Les tests de FC (19) sont effectués en tubes ou en plaque de micro-titrage (6) par les méthodes
conventionnelles, en retenant 100 % ou 50 % d’hémolyse. C’est, à l’heure actuelle, la méthode de
référence.
i)
Titrer le complément en tubes à hémolyse, en présence de 1 AgU, afin de déterminer l’unité H50.
ii)
Inactiver le sérum à tester et les sérums témoins positif et négatif au bain-marie pendant 30 min à
56 °C.
iii)
Faire des dilutions de raison deux, du sérum à tester et des sérums témoins, en CMV, de 1/4 à 1/1024,
en utilisant une plaque micro-titrage à 96 puits à fond rond, à raison de 25 μl par puits. Utiliser le
premier puits pour la dilution 1/4 initiale et le second comme témoin sérum (contrôle du pouvoir anticomplémentaire à la dilution du 1/4). Préparer les puits contrôles de l’antigène (sans sérum), du
complément et des GRs (voir ci-dessous) (2 puits pour chacun).
iv)
Ajouter 1 AgU d’antigène du VM dans 25 μl par puits (à l’exception des puits témoins du sérum, du
complément et des GRs), puis, ajouter 6 H50 de complément dans 25 μl par puits (à l’exception du
témoin GRs).
v)
Incuber les plaques recouvertes d’un film plastique, pendant 14 h (durant la nuit) à 4 °C.
vi)
Ajouter 50 μl de système hémolytique par puits.
vii)
Couvrir à nouveau les plaques et incuber pendant 30 min à 37 °C.
viii) Préparer une échelle de témoins d’hémolyse H100, H75, H50, H25 à partir des témoins complément
(H100) en tampon CMV.
b)
ix)
Lire, après centrifugation (1 000 g pendant 10 min) ou sédimentation passive à 4 °C. Le titre des
sérums testés est exprimé par la plus haute dilution du sérum donnant au moins 50 % d’inhibition de
l’hémolyse.
x)
Un sérum négatif doit donner une inhibition de l’hémolyse < 50 %, à la dilution du 1/4.
Épreuve d’immunofluorescence indirecte
L’épreuve d’IFI (11) est réalisée sur culture de cellules d’embryon de poulet ou de cellules RK-13 obtenue
en plaque de microtitrage à puits à fond plat : la suspension cellulaire (4 × 104 cellules dans du milieu), est
distribuée dans tous les puits et une couche confluente de cellules est produite en 24 h. Le milieu est alors
éliminé et 100 μl de suspension virale (taux de multiplicité de 0,05) sont ajoutés dans chaque puits. Après
2 h d’incubation, 100 μl de MEM contenant 2 % de sérum de veau est ajouté. Après 48 h d’incubation, les
plaques sont lavées avec du PBS et fixées à l’acétone contenant 50 % d’éthanol, pendant 30 min à –20 °C
ou au paraformaldéhyde (4 % dans du PBS) à température ambiante. Les plaques sont ensuite séchées à
37 °C pendant 15 min. Les plaques peuvent dès lors être stockées à –30 °C ou –70 °C pendant 3 mois. Les
sérums sont soumis à l’épreuve d’IFI utilisant des IgG anti-lapin conjugués à de l’isothiocyanate de
fluorescéine. Les résultats peuvent être exprimés de façon qualitative avec des sérums dilués au 1/20, ou
de façon quantitative en utilisant des dilutions sériées des sérums.
c)
Épreuve immuno-enzymatique (ELISA)
Un test ELISA récemment développé (10) utilise un virus myxomateux semi-purifié (souche française
T1 hyper virulente, antigéniquement rattachée à la souche Lausanne) produite en cellules RK-13. Le virus
est récolté sous la forme d’une suspension de cellules 48 h après infection, puis centrifugé. Le culot
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cellulaire est homogénéisé en TL20 (20 mM Tris, pH 8,6, 150 mM de NaCl et EDTA 1 mM), rompues au
broyeur de Poter et centrifugé à 1 200 g à 4 °C, pendant 10 min.
Le surnageant est déposé sur un volume égal d’un coussin de sucrose à 36 % en TL20 et centrifugé à
200 000 g pendant 2 h dans un rotor SW 41 à 4 °C. Le culot est repris dans 4 à 12 ml de TL20 et de
nouveau déposé sur un coussin de sucrose à 36 %.
Le nouveau culot est repris dans 0,5 à 1 ml de TL20 et quantifié par la méthode de Bradford (réaction
colorimétrique avec le bleu brillant de Comassie) (3) ou par spectrophotométrie (les protéines virales
représentent environ 3/5 des protéines totales). La préparation peut être stockée à –30 °C avant utilisation.
i)
Sensibiliser les plaques ELISA (Falcon) pendant 16 h (une nuit à 37 °C) avec 1 μg par puits, de
protéines virales dans 100 μl de PBS, pH 7,6, en laissant une colonne comme blanc (c’est à dire
traitée avec le seul PBS). À noter que les différents lots d’antigène présentent une activité variable et
doivent être titrés contre des sérums de référence afin de sélectionner l’antigène donnant la plus haute
densité optique (DO).
ii)
Après 3 lavages en PBS, bloquer les sites de liaison encore libres par une incubation pendant 1 h à
37 °C en présence de gélatine en PBS (25 mg/ml).
iii)
Laver la plaque 3 fois en PBS (0,01 % Tween 20), et ajouter 100 μl de dilutions sériées, de raison
deux, du sérum en PBS-Tween. Ajouter des sérums témoins négatif et positif dans chaque plaque.
iv)
Après 60 min d’incubation à 37 °C et 3 lavages en PBS-Tween, ajouter 100 μl d’une dilution en
PBS-Tween d’un sérum de chèvre anti-IgG de lapin (préalablement titré) conjugué à de la
phosphatase alcaline, pendant 1 h à 37 °C.
v)
Après 4 lavages en PBS-Tween (ou plus si le lavage est effectué avec seulement du PBS), ajouter en
tant que substrat, 100 μl de p-nitrophényl phosphate disodique à la concentration de 1 mg/ml dans
10 % de diéthanolamine.
vi)
Après 12 min à l’obscurité, à température ambiante, la réaction enzymatique est arrêtée par adjonction
de 50 μl d’une solution 2 N de NaOH.
vii)
Lire les Densités Optiques (DO) à l’aide d’un spectrophotomètre, à 405 nm de longueur d’onde.
viii) Exprimer le titre du sérum testé par l’inverse de la plus haute dilution pour laquelle la DO est 3 fois
supérieure à celle enregistrée avec le sérum témoin négatif à la même dilution.
La mise en évidence des anticorps spécifiques du virus myxomateux par ELISA s’est révélée une méthode
hautement sensible et spécifique pour les études cinétiques lors d’infection expérimentale (3). L’évaluation
du test a montré sa grande valeur dans le cadre du diagnostic au sein de populations de lapins (10).
Pour les enquêtes épidémiologiques, l’IFI et l’ELISA indirecte peuvent aussi être réalisées en utilisant du
sang séché sur papier buvard ou papier filtre. Des disques sont découpés à l’aide d’un emporte pièce de
bureau et deux disques sont placés dans chaque puits auquel on ajoute 100 μl de PBS pour extraire le
sérum. La dilution du produit extrait est d’environ 1/20 et celle-ci peut être utilisée dans un autre puits pour le
test (11). Des prélèvements de sang récoltés en tubes capillaires revêtus d’anticoagulant peuvent être
utilisés pour l’ELISA. Le prélèvement est rincé dans la solution de dilution pour obtenir la dilution requise
(17).
d)
Test d’immunodiffusion en gélose
Le test d’immunodiffusion en gélose (IDG) (22) est qualitatif et peut révéler l’antigène ou l’anticorps. La
gélose est préparée comme décrit ci-dessus (Section B.1) et 6 ml sont versés dans une boite de Petri de
10 cm de diamètre. Deux bandes de papier filtre contenant, l’une l’antigène et l’autre le sérum de référence,
et des disques imprégnés à l’aide des sérums à tester, sont disposés sur la surface de la gélose (les
disques alignés entre les deux bandes). Les plaques de gélose sont incubées en atmosphère humide à
37 °C et lues après 24 à 48 h. Trois lignes de précipitation doivent apparaître. Si les sérums testés
contiennent l’anticorps spécifique du VM, au moins une des trois lignes est infléchie vers la bande contenant
l’antigène ; sinon elle reste droite. Si les sérums renferment de l’antigène du VM, au moins une ligne est
infléchie vers la bande contenant le sérum de référence. Le test peut aussi être réalisé de façon plus
conventionnelle en plaçant les réactifs liquides dans des puits creusés dans la gélose.
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Manuel terrestre de l’OIE 2008
Chapitre 2.6.1. — Myxomatose
C. SPÉCIFICATIONS APPLICABLES AUX VACCINS
ET AUX PRODUITS BIOLOGIQUES À USAGE DIAGNOSTIQUE
Deux types de vaccin à virus vivant sont utilisés contre la myxomatose : un vaccin hétérologue préparé avec le
virus du fibrome de Shope (9, 13, 21), et un vaccin homologue préparé avec une souche atténuée de virus
myxomateux (1, 12, 20, 23, 25). Ils sont injectés par voie sous-cutanée ou intradermique.
Récemment, un nouveau virus myxomateux recombinant exprimant une protéine de capside du virus de la
maladie hémorragique du lapin (RHDV, Rabbit Haemorrhagic Disease Virus) et conférant une double protection
contre la myxomatose et le RHDV (3) a été développé, mais il n’est pas encore commercialisé.
Les lignes directrices pour la fabrication de vaccins vétérinaires sont exposées dans le Chapitre 1.1.8.,
« Principes de fabrication des vaccins à usage vétérinaire ». Les lignes directrices exposées ici et dans le
Chapitre 1.1.8. sont de nature générale et peuvent être complétées par des exigences nationales et régionales.
Un lot de semence primaire du virus doit être défini et utilisé selon le système lot-semence. Son origine,
l’historique des passages qu’elle a subi et ses caractéristiques doivent être enregistrés et conservés.
1.
Gestion des semences virales
a)
Caractéristiques de la semence virale
Les virus utilisés sont le virus du fibrome de Shope ou le virus myxomateux. Les souches du virus du
fibrome de Shope sont habituellement la souche originale Shope OA (1932), la souche Boerlage ou des
souches étroitement apparentées. Les souches de virus myxomateux sont modifiées par passages sur œufs
embryonnés de poulet, cellules de rein de lapin à température décroissante ou sur cellules d’embryon de
poulet. Les souches ont, en général, subi plusieurs clonages.
b)
Méthode de culture
Les souches de virus du fibrome de Shope sont maintenues par passage sur lapins exempts d’organismes
pathogènes spécifiques (EOPS) ou sur des lapins non vaccinés issus d’un élevage reconnu sans
myxomatose. La peau du dos de lapins adultes en bonne santé est rasée, puis on inocule en différents
points une suspension à 1 % de matériel virulent. Les fibromes sont pleinement développés en 8 à 10 jours.
Les lapins sont alors sacrifiés et les tumeurs prélevées aseptiquement puis homogénéisées en eau distillée.
La suspension est stockée à –30 °C ou –70 °C avec 50 % de glycérine tamponnée ou diluée à 5 % en
solution protéinée (albumine bovine). La production du virus du fibrome de Shope peut être aussi réalisée
en lignée cellulaire de derme de lapin.
Le virus myxomateux est produit sur culture de cellules d’embryon de poulet obtenu d’élevages reconnus
exempts d’organismes pathogènes spécifiques, ou sur lignées de cellules sensibles (lignée de cellules
dermiques de lapin). Le virus peut aussi être cultivé sur cellules RK-13.
c)
Validation de la semence candidate comme semence vaccinale
i)
Identité
Les caractéristiques antigéniques spécifiques du virus du fibrome de Shope sont vérifiées en AGID
utilisant des sérums anti-fibrome et anti-myxome.
L’identité du virus myxomateux est confirmée par un test de neutralisation sur cellules RK-13 ou tout
autre lignée cellulaire sensible en utilisant un anti-sérum monospécifique (produit par vaccination de
lapins avec la souche spécifique du virus vaccinal).
ii)
Pureté
Le lot de semence primaire doit être exempt de bactéries, de champignons, de mycoplasmes et de
contamination virale.
iii)
Innocuité
Les échantillons destinés aux essais d’innocuité doivent provenir d’un lot produit selon le protocole de
fabrication. La dose à utiliser contiendra le titre ou l’activité maximum établi(e) par le fabricant (titre
disponible).
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Chapitre 2.6.1. — Myxomatose
Plusieurs tests sont effectués, au stade du lot de semence primaire, afin de démontrer différents
aspects de l’innocuité. L’innocuité à 10 fois la dose normale doit être révélée. De même, il est
nécessaire de rechercher la dissémination du virus parmi les animaux vaccinés, la capacité du virus
vaccin de diffuser de l’animal vacciné vers des animaux contacts et de mettre en évidence une
réversion possible de la virulence de la souche vaccinale lors de passages en série chez le lapin.
La pathogénicité du virus du fibrome de Shope est évaluée par inoculation de lapins avec des dilutions
sériées des surnageants issus de la centrifugation de préparations tumorales. Les aspects
macroscopiques et histopathologiques ainsi que l’évolution des fibromes sont notés périodiquement
sur des lapins EOPS. (De nombreux passages en série sur le lapin peuvent induire une mutation vers
la souche inflammatoire IA, qui produit des lésions sévères beaucoup plus inflammatoires que
néoplasiques).
Le pouvoir pathogène résiduel du virus myxomateux est évalué par inoculations intradermiques chez
des lapins EOPS ou des sujets non vaccinés indemnes de myxomatose. Ces lapins ne doivent pas
développer plus qu’une réaction locale, accompagnée parfois de petites lésions secondaires sur la tête
mais qui disparaissent en quelques jours.
Pour ces deux souches, la température rectale et le poids doivent être enregistrés en tant que
paramètres supplémentaires.
iv)
Efficacité
Différents essais doivent être conduits à partir de lots représentatifs du produit fini contenant le titre ou
l’activité minimum. L’effet protecteur est démontré de la façon suivante :
Au moins 10 lapins adultes reçoivent une dose de vaccin « fibrome », et 3 lapins servent de témoins
non vaccinés. Après 14 jours, tous les lapins sont inoculés par voie intradermique dans la paupière,
3
avec une souche de virus myxomateux (exemple : inoculum de 0,1 ml contenant 10 DI50 [dose
infectieuse médiane]). Durant les 21 jours suivants, les témoins succombent à la myxomatose, et au
moins sept des dix sujets vaccinés doivent ne présenter aucun signe de généralisation de l’infection.
De la même façon, le vaccin « myxome » est évalué chez 10 lapins et 3 sujets contrôles. Après
14 jours, tous les lapins sont éprouvés avec une quantité suffisante d’une souche virulente (exemple :
3
0,1 ml de la souche Lausanne renfermant 10 DI50). Après 21 jours, sept des dix lapins vaccinés
doivent survivre tandis que les témoins doivent avoir succombé à la myxomatose.
Le fabricant aura établi un titre ou une activité minimum tenant compte de la perte d’activité durant la
période de conservation.
2.
Méthode de fabrication
Le virus du fibrome de Shope est produit suite à des inoculations multiples du virus semence dans la peau du dos
d’un certain nombre de lapins. Après homogénéisation du fibrome, le produit peut être conservé congelé ou être
utilisé immédiatement. La production peut aussi être réalisée en lignée cellulaire de derme de lapin. Seul le
second (éventuellement le troisième) passage peut être utilisé si l’on veut éviter une modification du virus. Après
clarification par centrifugation, le surnageant est mélangé à un stabilisant contenant des antibiotiques et réparti en
ampoules ou flacons pour être lyophilisée. Du kaolin peut être ajouté en tant qu’adjuvant (40 mg/ml), dans ce cas
le vaccin sera injecté par voie sous-cutanée.
Le virus myxomateux est produit en cellules d’embryon de poulet (obtenu d’œufs EOPS) ou en lignée cellulaire
sensible, en limitant le nombre de passages à un maximum de 5. Le virus est récolté après 2 à 6 jours. La
suspension virale peut être conservée à –70 °C. Le vaccin est préparé par dilution en proportions spécifiées de la
préparation virale avec un stabilisant pour lyophilisation. Après homogénéisation, le produit est distribué en flacon
de lyophilisation, ces derniers étant scellés sous vide ou en atmosphère d’azote stérile.
Chacun de ces virus peut être aussi produit en cellules RK-13.
3.
Contrôles en cours de fabrication
Le titre de virus du fibrome de Shope est obtenu en calculant la DI50 suite à l’inoculation intradermique de
dilutions sériées du surnageant clarifié, en plusieurs sites (par exemple 5) sur au moins 6 lapins. Une dilution
d’une préparation de référence de virus du fibrome de Shope est aussi inoculée sur chaque lapin pour s’assurer
d’une réponse conforme à l’inoculation. Le titre peut aussi être calculé en lignée cellulaire de lapin. Dans l’un et
l’autre cas, le titre doit être corrélé à l’activité requise par le test d’efficacité, voir Section C.1.c.
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Chapitre 2.6.1. — Myxomatose
L’identité du virus myxomateux est vérifiée en cellules RK. Le titrage de chaque virus peut aussi être réalisé en
cellules RK-13 DICT50.
La recherche de contaminants viraux est effectuée par ensemencement de cellules Vero en couche
monocellulaire confluente. Le vaccin, ajusté à l’équivalent de 20 doses/ml, est neutralisé avec un volume égal de
sérum hyperimmun monospécifique pendant 30 min à 37 °C. Le mélange est filtré à travers une membrane de
0,22 μm et des volumes de 1 ml sont inoculés dans 5 flacons de 25 ml de culture de cellules. Ceux-ci sont gardés
en observation pendant 7 jours. Après récolte, les cellules sont suspendues dans le milieu et soumises à
plusieurs cycles de congélation-décongélation, suivis d’une centrifugation et d’une filtration, puis le filtrat est
inoculé en culture cellulaire fraîche et observé pendant 7 jours. On ne doit relever aucun signe d’ECP et aucune
hémadsorpbtion de globules rouges de poulet.
4.
Contrôles des lots
a)
Stérilité
Les tests de stérilité et d’absence de contaminants biologiques peuvent être trouvés au Chapitre 1.1.9.
b)
Innocuité
Après réhydratation, 10 doses de vaccin fibrome lyophilisé sont injectées par voie sous-cutanée chez
3 lapins sensibles qui sont mis en observation pendant 21 jours. Les réactions locales doivent être légères
sans généralisation ni effet sur l’état de santé général.
Le vaccin Myxome est testé en utilisant 10 doses injectées par voie intradermique dans les oreilles de
3 lapins sensibles maintenus en observation pendant 21 jours. Le myxome primaire doit demeurer limité.
c)
Activité
L’activité du lot est déterminée par mesure du contenu viral. Des dilutions en série du vaccin sont inoculées
en culture de cellules sensibles. Une dose de vaccin doit contenir au moins le titre minimum établi dans la
Section C.1.c.
Si la souche vaccinale n’est pas adaptée aux cultures, un test d’efficacité sera conduit (voir Section C.1.c).
d)
Durée de l’immunité
Plusieurs groupes de 10 lapins sensibles sont vaccinés. Un groupe est éprouvé par infection virulente
(comme dans le test d’efficacité du lot), à 1, 2, 3, etc., mois post-vaccination, pour le virus du fibrome de
Shope, et à 1, 3, 6, et 9 mois, pour le virus myxomateux. La durée de l’immunité est déduite du temps
durant lequel au moins 7 des 10 lapins se révèlent résistants à l’infection.
e)
Stabilité
Les titres du virus vaccin sont déterminés périodiquement jusqu’à 3 mois après le temps de conservation
revendiqué, sur au moins 3 lots de vaccin.
5.
Contrôles du produit fini
a)
Innocuité
Voir Section C.4.b.
b)
Activité
Voir Section C.4.c.
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