Première étape de détermination structurale de polysaccharides

Détermination structurale de polysaccharides
I- Clivage de la liaison osidique
II- Réactions chimiques pour détermination structurale
III- Identification et analyse des monosaccharides
IV- Détermination de la série d’un ose
V- Modes d’enchaînement et établissement des séquences
VI- déterminer l’anomérie par RMN
I- Clivage de la liaison osidique
Première étape de détermination structurale de polysaccharides
clivage puis caractérisation des monosaccharides
-
nature de l’ose (aldose, cétose, osamine, uronique…)
- stéréochimie D ou L et du type de configuration ( gluco, galacto, manno…)
Hydrolyse acide classique:
HCl ou H2SO4
0.5 à 4 M
T°100 à 110°C
TFA: CF3COOH
1 à 4 heures
Cas des pyranosides
Protonation de l’oxygène glycosidique , formation d’une entité pyranoxonium et libération du résidu
aglycone.
Cet ion est de conformation ½ chaise et subit une attaque nucléophile par H2O.
Cas des furanosides
Mécanisme différent de type SN2 proposé: protonation de l’oxygène glycosidique et attaque
nucléophile par H2O
Equilibre conformationnel α/β pyranose et α/β furanose toutes les formes peuvent être présentes
dans des proportions dépendant du solvant et de leur stéréochimie
Cinétiques d’hydrolyse
- anomérie: (anomère β s’hydrolyse mieux car l’état protoné est plus stable)
- nature du cycle: un furanose s’hydrolyse mieux qu’un pyranose car sa conformation
est voisine de l’état transitoire pyranoxonium
Pour les pyranosides, la conformation pyranoxonium de type ½ chaise, implique des rotations
autour des liaisons C2-C3 et C4-C5
5
5
4
4
3
2
Ces rotations sont
3
2
facilitées selon la position axiale ou équatoriales des substituants.
Hydrolyse des desoxysucres en position 2, 3 ou 6 plus rapide (rotations facilitées)
Ces différences de sensibilité à l’hydrolyse sont mises à profit pour obtenir des
oligosaccharides à partir de polymères s’il y a des furanosides ou des desoxysucres.
Exemple: pour établir la structure du Lipo arabino mannane ou LAM
Le lipoarabinomannane (LAM): une molécule
immunomodulatrice des mycobactéries
Hydrolyse douce, clive après les furanoses
Mannane
*
?
n
HO
HO
HO
m
HO
HO
HO
P
**
Coiffes
Mannosyles
OH
O
O
O
0-2
HO O-arabinan
MannoseOcaps
O
OH
Arabinane
Détermination structurale: prérequis à l’étude du mode d’action d’une biomolécule
Hydrolyse acide d’un glycoside aminé en position 2
-Résistance à l’ hydrolyse acide car protonation du NH2 et plus d’hydrolyse
de la liaison glycosidique
-Il faut dériver la fonction –NH2 puis hydrolyser
-Peracétylation (anhydride acétique, pyridine) et saponification
→ NH-CO-CH3
Mécanisme vu en cours
Attention: on identifie un ose N acétylé (initialement aminé)
Méthodes de clivage plus spécifiques
acide acétique dilué 1% 110°C 90 ’
spécifique des acides ulosoniques (fragiles)
exemple LPS bactérien Campylobacter jejuni
Kdo : D-Glycero-D-manno-octulosonique
Neu Ac : 5- acetamido-3,5-didesoxy-D-Glycero-D-galacto-nonulosonique
Méthodes de clivage plus spécifiques
Hydrolyses enzymatiques : dans certains cas uniquement
Exoglycosidases sélectives au niveau de l ’anomérie et du type de
liaison : l ’ose est en position terminale non réductrice, exemples
N-Ac neuraminidase
α et β -D-galactosidases
α et β -D-mannosidases
α−L-fucosidase
Endoglycosidases sélectives
II- Réactions chimiques utiles pour la détermination
structurale
Réactivité des hydroxyles
Estérifications :
O
OH
+
ose
HOOC
C R
O
R
Ex: acétylation
Acide ou anhydride
ester
Acido et alcalino labiles
O
OH
+
P
O
H 3PO4
O-
O-
ose
Ester-phosphate
Ethérification :
OH
ose
+
HO
R
alcool
O
R
Très résistant acides et bases
ether
Ex: méthylation et triméthylsilylation
coupure périodique (TP)
5 HIO4 consommés
5 HCOOH
1 HCHO
Clivage par l’acide périodique des diols contigus avec libération :
d’acide formique à partir des alcools secondaires et aldéhydes
d’aldéhyde formique (formol) à partir d’alcools secondaires.
! Ne fonctionne que si les deux OH contigus sont libres!
Mécanisme vu en cours
Oses : Oxydation periodique
CH2OH
CH2OH
O
H
CH2OH
C
O
OH
O
O
HO
O
OH
HO CH
OH
OH
HC OH
O
HO
HC
HC OH
OH
OH
OH
H2C OH
Consommation de 5 HIO4
Production de 3 HCOOH et 1 HCHO et autres composés en C3 ou C2:
D- glyceraldéhyde, glyoxal et CHO-CH(OH)-CHO
Réactivité de la fonction carbonyle
Mécanisme de la réduction par NaBH4 ou NaBD4
Formation d’alditols
Mécanisme d’oxydation des aldoses par les halogènes (eau de brome)
Traitement basique:
Oses assez stables en milieu acide pH 3 -4, moins stables en milieu basique
réaction de β élimination en milieu basique
mécanisme vu en cours
Applications pour détermination de structure :
Cas des enchaînement 1 → 3 avec ose en position réductrice
Cas des liaisons β 1 → 4 avec les acides uroniques (assez fréquent)
III- Identification et analyse des monosaccharides
Aisée si témoins: CCM, HPLC, GC
GC: rendre les dérivés volatiles
peracétates (-O-CO-CH3) mécanisme vu en cours
triméthylsilylés (-O-SiMe3) mécanisme vu en cours
HPLC ou GC:
monosaccharides identifiés sous leurs différentes conformations
α/β pyranose et α/β furanose (mutarotation)
Rappel mutarotation après hydrolyse, les 4 formes peuvent exister
Chromatogramme GC d’un mélange de mono- et disaccharides TMS
Plusieurs pics /ose
disaccharides
aldohexoses
Glc Man Gal
Pentoses
ou desoxyhexoses
●
Fuc
●
●
●
●
●
●
Réduction en alditols après l’hydrolyse
intérêt: alditols donnent un seul pic et profil chromatographique
mais: certains alditols peuvent provenir de deux oses différents
(ex: D-gulose et D-glucose donnent le même alditol)
Mécanisme de la réduction par NaBH4 ou NaBD4 vu en cours
Chromatogramme GC d’un mélange de monosaccharides
Dérivés en acétates d’alditols
GC après hydrolyse, réduction et acétylation
Intérêt: 1 seul pic /ose
Étude d’un glycolipide isolé de Fasciola hepatica (douve du foie mouton)
IV- Détermination de la série D ou L d’un ose
Rappel:
Les énantiomères ont les mêmes propriétés physico-chimiques sauf leur activité optique
- Quand on a hydrolysé un polysaccharide mélange de monosaccharides
- Impossible mesurer Pouvoir rotatoire (sauf quelques cas de polysaccharides simples)
- Solution: Créer des DIASTEREOISOMERES qui eux sont séparables
par chromatographie phase gazeuse par exemple
Synthétiser un glycoside d’un alcool chiral
analyse en GC de dérivés osidiques d’alcool chiraux (2-R ou 2-S butanol)
Principe: on connaît la nature de l’ose mais pas sa série (ex: le glucose)
on fait l’ oside de butyle avec du D-Glc
*
O-CH-CH2-CH3
CH3
D-Glc + 2-R-butanol
composé DR
D-Glc + 2-S-butanol
composé DS
DR=LS
2 diastéréoisomères séparés
en GC
LR=DS
X-Glc + 2-R-butanol
Les 4 combinaisons ont des comportements chromatographiques identiques 2 à 2
V- Modes d’enchaînement et établissement des séquences
Combinaisons d’analyses chimiques, SM et RMN
Méthode des Acétates d’alditols partiellement méthylés
(mécanismes détaillés en cours sur l’exemple d’un disaccharide
β-Dgalp1
3glucopyranose)
1- réaction de perméthylation (Hakomori)
NaH, DMSO
ROH
ICH3
RO-
R-OCH3 (étheroxyde)
2- hydrolyse
3- réduction (NaBH4 ou NaBD4)
4- acétylation
β-Dgalp1
3 glucopyranose
Trouver les différents composés issus des traitements suivants
sur ce disaccharide:
1- Hydrolyse acide
2- Hydrolyse acide et action de NaBH4
3- Oxydation puis hydrolyse
4- NaBH4 puis hydrolyse acide
5- Formation des acétates d’alditols et analyse GC
6- formation des acétates d’alditols partiellement méthylés (GC/MS)
Problèmes:
- La réaction de perméthylation doit être totale sinon erreurs
d’interprétation
- Ambiguïté quand acétate en 4 et 5 :
Quelle est la position glycosylée (4 ou 5)?
VI- déterminer l’anomérie par RMN
RMN résonance magnétique nucléaire
Méthode d’analyse basée sur les propriétés magnétiques des noyaux
atomiques.
On applique un champ magnétique externe à une molécule, les noyaux
passent d’un niveau fondamental à un niveau excité: phénomène de
résonance.
RMN du proton 1H
- Dans une molécule, les protons ont un environnement
chimique différent, ils auront différentes fréquences de
résonance.
- L’écart entre différents signaux est le déplacement
chimique δ
- Les surfaces des signaux sont proportionnelles au
nombre de protons sur un spectre RMN.
- La constante de couplage J dépend du nombre et de la
nature des liaisons et des angles dièdres entre le noyaux
Retrouver la structure de la molécule ou du mélange
exemple de spectre de RMN
Champ faible
Champ fort
Aire sous les pics proportionnelle au nombre de protons
ppm
δ = ∆ν/ν
∆ν ν x 106
Environnement chimique
différent
J constante de couplage dépend du nombre et des angles de liaison
entre les noyaux
Noyaux étudiés par RMN:
1H
13
99,98%, très sensible
C
abondance 1,1% moins sensible
expériences plus longues
15N
0,34%, très utilisé pour étude des protéines
après enrichissement isotopique
31P,19F
100%
L’interprétation du spectre apporte des informations
sur la structure de la molécule ou du mélange
Application à la RMN des monosaccharides
Les H 1 des oses apparaissent à champ faible car liés à 2 oxygènes
entre 4.5 et 5.5 ppm.
Anomère α : δ 5 - 5.5 ppm
Anomère β : δ 4.5 - 4.9 ppm
H 2,3,4,5 des cycles entre 3,5 et 4,5 ppm
H6, 6’ vers 3.5 ppm
Déplacements chimiques des protons anomériques du
glucose (anomère α et β)
2
2
2
2
1
1
1
1
Karplus: relation entre la valeur de J et l’angle dièdre ω
cyclohexane
Mesure de l’angle dièdre entre H1 et H2 pour déterminer l’anomérie
2
2
1
1
J axial-axial 8 à 12 Hz
J axial-équatorial 3 à 5 Hz
J équatorial-équatorial 1 à 3 Hz
si H2 axial: cas du glc, gal, GlcN, fucose …
2 possibilités, J H1 eq- H 2ax anomère α
J H1 ax- H2 ax anomère β
cas particulier du mannose: H2 équatorial
J ax - eq proche J eq - eq impossible de
trancher
Déplacements chimiques des protons anomériques du
glucose (anomère α et β)
RMN 13C souvent nécessaire pour confirmer
Déplacements chimiques des Carbones anomériques:
C1 α pyranoses 98 à 102 ppm
C1 β pyranose 103 à 106 ppm
C2,3,4,5 vers 70-75 ppm
C6 vers 60 ppm
Pour C2,3,4,5 glycosylés, déplacement vers 8O ppm
C6 vers 70 ppm
Exemple de détermination structurale d’un polysaccharide
bactérien complexe: l’arabinogalactane de M. tuberculosis