Analyse microbiologique des vins et des moûts

Transcription

RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES – OIV
METHOD OIV-MA-AS4-01
Méthode Type IV
Analyse microbiologique des vins et des moûts :
detection, differenciation et denombrement des microorganismes
(OIV-Oeno 206-2010)
L'analyse microbiologique a pour but de suivre les fermentations alcoolique
et/ou malolactique et de déceler les risques d'altérations microbiennes, ce
qui permet de détecter toute anomalie, non seulement dans le produit fini,
mais aussi pendant les différentes phases de sa fabrication.
Remarque :
Toutes les manipulations doivent être faites selon les conditions aseptiques
usuelles dans les travaux de microbiologie, en utilisant du matériel stérilisé,
à proximité de la flamme d'un bec Bunsen ou dans une chambre à flux
laminaire et en passant à la flamme les orifices des pipettes, tubes, flacons,
etc. Avant d'effectuer l'analyse microbiologique, il est nécessaire d'effectuer
correctement le prélèvement de l'échantillon à analyser.
Champ d'application :
L'analyse microbiologique peut être appliquée aux vins, moûts, mistelles et
à tous produits similaires, même lorsque ceux-ci sont altérés par une activité
microbienne. Ces méthodes sont aussi adaptées à l'analyse des préparations
industrielles de microorganismes sélectionnés, levures LSA et bactéries
lactiques.
Techniques d'analyse microbiologique :
1.
2.
3.
4.
Réactifs et produits
Installations et équipement
Échantillonnage
Essais de tenue
4.1 objectif
4.2 principe
4.3 mode opératoire
4.3.1 essai de tenue à l'air
4.3.2 essai de tenue à l'étuve
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5.
Techniques de microscopie pour la détection, différenciation des
micro-organismes et dénombrement direct des levures
5.1. Examen microscopique des liquides ou des dépôts
5.2. Coloration de Gram pour la différentiation des bactéries isolées à partir
de colonies (voir paragraphe 6)
5.3. Recherche de la catalase pour la différentiation des bactéries isolées à
partir de colonies(voir paragraphe 6)
5.4. Dénombrement des cellules de levure – hémocytométrie
5.5. Dénombrement des cellules de levure – Coloration au bleu de
méthylène
6. Dénombrement des micro-organismes par culture
6.1 Détection, différenciation et dénombrement des micro-organismes
(numération sur plaque)
6.2. Culture en milieu liquide - "nombre le plus probable" (NPP).
1. RÉACTIFS ET PRODUITS
Équipement et appareillage courants de laboratoire, comme indiqué dans
ISO 7218:2007 - Microbiologie des denrées alimentaires et aliments pour
animaux - Règles générales relatives aux analyses microbiologiques.
Le matériel suivant est recommandé :
- Matériel et verrerie de laboratoire courants, stériles (stérilisés ou stériles
prêts à l'emploi).
- Tubes (16x160 mm ou similaires) contenant 9 ml d'eau peptonée stérile
(tryptone : 1 g/l) ou d'autres diluants à utiliser pour les dilutions
d'échantillons en série.
- Éthanol pour passer à la flamme les étaleurs et les brucelles.
- Solution de peroxyde d'hydrogène à 3 %.
- Micropipette à bouts stériles : 1 ml et 0,2 ml.
- Tiges de verre coudées en L ou de forme triangulaire (crosses de hockey)
ou étaleurs en plastique.
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- Brucelles en acier inoxydable, à bords plats.
- Membrane de porosité 0,2 et 0,45 µm en ester de cellulose stérile (ou
équivalent), d'un diamètre de 47 ou 50 mm, si possible avec une grille
imprimée sur la surface, en conditionnement individuel.
- Éprouvettes stériles.
- Pipettes stériles de 10 ml.
2. INSTALLATIONS ET ÉQUIPEMENT
Équipement et appareillage courants de laboratoire, comme indiqué dans
ISO 7218:2007 - Microbiologie des denrées alimentaires et aliments pour
animaux - Règles générales relatives aux analyses microbiologiques.
Le matériel suivant est recommandé :
- Hotte microbiologique ou hotte à flux laminaire. En l'absence de ce
dispositif, travailler à proximité (moins de 50 centimètres) d'un brûleur à
gaz.
- Balance, d'une précision de ± 0,01 g.
- Autoclave.
- Incubateur, réglable de 25°C à 37°C.
- pH-mètre, présentant une précision de ± 0,1 unité pH et un seuil de
mesure minimum de ± 0,01 unité pH.
- Réfrigérateur(s), réglé(s) à 5 ± 3 °C, et congélateur(s) dont la température
devra
être
inférieure
à
-18°C et de préférence égale à -24 ± 2 °C.
- Bain thermostatique, réglé à 45 ± 1 °C
- Four à micro-ondes.
- Microscope optique.
- Brûleur à gaz.
- Dispositif de comptage de colonies.
- Équipement de culture en atmosphère modifiée (fiole scellée dans
laquelle l'anaérobiose peut avoir lieu).
- Appareillage de filtrage avec des filtres de diamètre 47 mm ou 50 mm
(en cas de filtration sur membrane).
- Agitateur vortex ou équivalent ;
- Etuve pour la sterilisation à sec ;
- Centrifugeuse ;
- Pompe à vécue.
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3. ÉCHANTILLONNAGE
L'échantillon doit reproduire la microbiologie de la masse totale de moût ou
de vin à analyser.Dans la mesure du possible, la masse doit être
homogénéisée avant échantillonnage, afin de remettre en suspension les
micro-organismes qui tendent à se déposer au fond du récipient. Lorsqu'une
homogénéisation n'est pas souhaitée, les échantillons doivent être prélevés
là où les micro-organismes sont susceptibles (ou suspectés) d'être présents
(c.-à-d. en cas de recherche de levures au fond des réservoirs ou fûts), mais
dans ce cas les résultats ne sont pas quantitatifs. Avant de prélever un
échantillon provenant d'un robinet, ce dernier doit être passé à la flamme, et
2 à 3 litres de liquide doivent être évacués. L'échantillon doit être placé dans
un récipient stérile
L'échantillon doit être maintenu au frais et analysé le plus rapidement
possible.
Les quantités suivantes d'échantillons sont nécessaires pour l'examen
microbiologique :
Moût, ou moût en fermentation ou vin stocké : pas moins de 250 ml ;
Vin mis en bouteille ou emballé :
pas moins d'une unité,
quelle que soit la capacité ;
4. ESSAIS DE TENUE
4.1 Objectif
Ces essais ont pour but de déceler à l'avance les risques d'altérations
microbiennes.
4.2 Principe
Cette technique est basée sur les modifications organoleptiques et d'aspect
(troubles, voiles, dépôts, couleurs inhabituelles) présentées par le vin quand
il est soumis à certaines conditions d'aération et de température pouvant
induire une activité microbiologique. La nature de l'altération devra être
confirmée par examen microscopique.
4.3 Mode opératoire
4.3.1 Essais de tenue à l'air
Un échantillon de 50 ml de vin après filtration sur papier filtre grossier
stérile est placé dans un Erlenmeyer stérile de 150 ml bouché avec du coton
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et laissé à température ambiante pendant au moins 3 jours. La limpidité, la
couleur, la présence éventuelle d'un trouble, d'un dépôt, d'un voile sont
examinées au cours de cette période. Un examen microscopique est réalisé
en cas de trouble, dépôt, voile ou changement de couleur.
4.3.2 Essais de tenue à l'étuve
Un échantillon de vin de 100 ml après filtration sur papier filtre grossier
stérile est placé dans un Erlenmeyer stérile de 300 ml, bouché avec du
coton, mis dans une étuve à 30 ° C et examiné après au moins 72 h. Des
altérations organoleptiques ou visuelles peuvent être l'indice d'un
développement microbien. Un examen microscopique doit alors être
effectué.
5. TECHNIQUES MICROSCOPIQUES POUR LA DETECTION, LA
DIFFERENCIATION DES MICRO-ORGANISMES ET LE
DENOMBREMENT DIRECT DES LEVURES
5.1 Examen microscopique des liquides ou des dépôts
Objectif :
L'examen microscopique à l'état frais a pour but de déceler et de
différencier, par leur taille et leur forme, les levures des bactéries
éventuellement présentes. L'observation microscopique ne permet pas de
distinguer les micro-organismes vivants de ceux qui sont morts.
Remarque :
Une estimation des levures vivantes peut être effectuée à l'aide d'une
coloration appropriée (voir plus loin).
Principe :
Cette technique repose sur le grossissement au microscope permettant
d'observer des micro-organismes dont la taille est de l'ordre du micron.
Mode opératoire :
L'examen au microscope peut être effectué directement sur le liquide ou sur
le dépôt.
L'observation directe sur le liquide n'est intéressante que quand la
population est suffisamment élevée (plus de 5 x 10 5 cellules/ml).
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Quand le vin présente une population inférieure de micro-organismes, il est
nécessaire de concentrer l'échantillon. Environ 10 ml de vin homogénéisé
sont donc centrifugés à 3000-5000 tr/mn pendant 5 à 15 minutes. Après
décantation du liquide surnageant, le dépôt est remis en suspension dans le
liquide restant au fond du tube de centrifugation.
Pour réaliser l'observation au microscope, une goutte de l'échantillon de
liquide ou du dépôt homogénéisé est déposée sur une lame de verre propre à
l'aide d'une pipette Pasteur ou d'une anse stérilisée. Recouvrir avec une
lamelle et placer la lame sur la platine du microscope. L'observation
s'effectue en champ clair ou, de préférence à contraste de phase, ce qui
permet de mieux observer les détails des micro-organismes. Un
grossissement optique de 400 x à 1000 x est généralement utilisé.
5.2. Coloration de Gram pour la différentiation des bactéries isolées à
partir de colonies (voir paragraphe 6)
Objectif :
La coloration de Gram a pour but de différencier les bactéries lactiques
(Gram positif) des bactéries acétiques (Gram négatif) et d'observer
également leur morphologie.
Remarque :
Il convient de garder à l'esprit que la coloration de Gram ne suffit pas à
conclure car d'autres bactéries peuvent être présentes en plus des bactéries
lactiques et acétiques.
Principe :
Cette coloration est basée sur la différence de structure et de composition
chimique des parois cellulaires. des bactéries à Gram positif et à Gram
négatif Dans les bactéries à Gram négatif, la paroi riche en lipides a une
quantité très réduite de peptidoglycane. Ceci permet la pénétration de
l'alcool et l’élimination du complexe violet de gentiane-iode en laissant la
cellule incolore, laquelle sera ensuite recolorée en rouge par la safranine. Au
contraire, la paroi cellulaire des bactéries à Gram positif contient une grande
quantité de peptidoglycane et une faible concentration de lipides. Ainsi,
l'épaisse paroi de peptidoglycane et la déshydratation produite par l'alcool
ne permettent pas l’élimination de la coloration violette ou bleue foncée du
complexe violet de gentiane-iode.
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La coloration de Gram perd sa signification si elle est réalisée sur une
culture trop âgée. Ainsi, la bactérie doit être dans une phase de croissance
exponentielle de 24 à 48 heures. La coloration de Gram est réalisée après
isolement de colonies et mise en culture liquide.
Solutions :
L'eau utilisée doit être distillée.
1. Solution de violet de gentiane
Préparation : peser 2 g de violet de gentiane (ou cristal violet), introduire
dans un Erlenmeyer de 100 ml et dissoudre dans 20 ml d'alcool à 95 % vol.
Dissoudre 0,8 g d'oxalate d'ammonium dans 80 ml d'eau distillée. Mélanger
les deux solutions et utiliser seulement après 24 heures. Filtrer sur papier au
moment de l'emploi. Maintenir à l'abri de la lumière dans un flacon foncé.
2. Solution de Lugol
Préparation : dissoudre 2 g d'iodure de potassium dans une quantité
minimale d'eau (4 à 5 ml) et, dans cette solution saturée, dissoudre 1 g
d'iode. Compléter le volume à 300 ml avec de l'eau distillée. Maintenir à
l'abri de la lumière dans un flacon foncé.
3. Solution de safranine :
Préparation : peser 0,5 g de safranine dans un Erlenmeyer de 100 ml,
dissoudre avec 10 ml d'alcool à 95 % vol. et ajouter 90 ml d'eau. Agiter.
Maintenir à l'abri de la lumière dans un flacon foncé.
Mode opératoire :
Préparation du frottis
Faire un repiquage des bactéries en milieu liquide ou solide. Recueillir les
bactéries des cultures jeunes dans le dépôt (après centrifugation de la culture
liquide) ou directement dans le milieu solide avec une anse ou un fil et
mélanger dans une goutte d'eau stérilisée.
Faire un frottis sur une lame en étalant une goutte de la suspension
microbienne. Laisser sécher le frottis. Procéder ensuite à la fixation en
passant rapidement la lame 3 fois sur la flamme d'un bec Bunsen ou par une
technique équivalente.
Après refroidissement, effectuer la coloration.
Coloration
Verser sur le frottis fixé quelques gouttes de solution de violet de gentiane.
Laisser agir pendant 2 minutes et laver avec de l'eau.
Verser 1 à 2 gouttes de la solution de lugol. Laisser agir pendant 30
secondes. Laver avec de l'eau et sécher sur papier filtre.
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Verser l'alcool à 95 % vol., laisser agir pendant 15 secondes. Rincer avec de
l'eau et sécher sur papier filtre.
Verser quelques gouttes de solution de safranine, laisser agir pendant 10
secondes. Laver avec de l'eau et sécher sur papier filtre.
Déposer sur le frottis coloré une goutte d'huile d'immersion.
Observer au microscope avec l'objectif à immersion en champ clair.
Résultats :
Les bactéries lactiques restent colorées en violet ou bleu foncé (Grampositif). Les bactéries acétiques sont colorées en rouge (Gram-négatif).
5.3 Recherche de la catalase pour la différentiation des bactéries isolées
à partir de colonies (voir paragraphe 6)
Objectif :
Cette recherche a pour but de faire la distinction entre les bactéries acétiques
et les bactéries lactiques. Les levures et les bactéries acétiques ont une
réaction positive. Les bactéries lactiques donnent une réponse négative.
Remarque :
Il convient de garder à l'esprit que la recherche de la catalase ne suffit pas
car d'autres bactéries peuvent être présentes en plus des bactéries lactiques
et acétiques.
Principe :
La recherche de la catalase est basée sur la propriété qu'ont les microorganismes aérobies de décomposer le peroxyde d'hydrogène avec libération
d'oxygène :
2H2O2
catalase
2H2O + O2
Réactif :
Solution de peroxyde d'hydrogène à 12 volumes (3%)
Préparation : mesurer 10 ml de peroxyde d'hydrogène à 30 volumes dans
une fiole jaugée de 100 ml et compléter avec de l'eau distillée récemment
bouillie. Agiter et conserver au réfrigérateur dans un flacon foncé. La
solution doit être fraîchement préparée.
Mode opératoire :
Déposer une goutte de peroxyde d'hydrogène à 3 volumes sur une lame et
ajouter un petit échantillon d'une colonie jeune. S'il y a libération de gaz, on
peut en déduire que la culture possède l’activité catalase. Il est parfois
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difficile d'observer directement le dégagement gazeux, notamment avec les
colonies de bactéries ; il est donc conseillé de faire l'observation au
microscope (objectif 10 x).
5.4. Dénombrement des cellules de levure – hémocytométrie
5.4.1 Champ d'application
Détermination de la concentration en cellules de levure dans les moûts ou
vins en fermentation, et les LSA (levure sèche active). Une concentration
cellulaire élevée est nécessaire : au moins 5×106 cellules/ml. Les moûts et
vins en fermentation peuvent faire l'objet d'une numération directe, la levure
sèche active (LSA) doit être diluée 1000 ou 10000 fois. Les moûts ou vins
contenant peu de cellules doivent être centrifugés (3000 g, 5 minutes) et le
sédiment remis en suspension dans un volume connu.,
5.4.2 Principe
Une goutte de suspension de cellules de levure est déposée à la surface d'une
lame comportant une cellule de comptage. La cellule de comptage a un
volume défini et est subdivisée en carrés à la surface de la lame. La
numération est réalisée sous microscope en champ clair. Le contraste de
phase n'est pas indiqué si des cellules sont colorées.
5.4.3 Réactifs et produits
Hémocytomètre, double cellule, de préférence à pinces : Bürker,
Thoma, Malassez, Neubauer.
Lamelle couvre-objets pour hémocytomètre : les lamelles couvreobjets ordinaires (largeur 0,17 mm) ne conviennent pas pour cette
utilisation, car elles sont souples et ne garantissent pas une largeur de cellule
constante.
Pipettes à bouts fins, d'un volume de 1 et 10 ml.
Fiole jaugée, 100 ml.
Bécher, 250 ml.
5.4.4 Installations et équipement
Microscope avec éclairage à fond clair : grossissement 250-500 x.
Contraste de phase contre-indiqué.
Barre magnétique et agitateur.
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Des hémocytomètres sont disponibles avec différentes cellules de comptage
: Thoma, Malassez, Bürker, Neubauer. Confirmer le type et le volume de la
cellule de comptage à utiliser. Les cellules de Bürker, Thoma et Neubauer
ont une profondeur de 0,1 mm , la cellule de Malassez 0,2 mm.
La cellule de Thoma possède un grand carré central (1 mm2), ce qui fait que
son volume est de 0,1 mm3 (10 -4 ml). Ce grand carré est subdivisé en 16
carrés, eux mêmes subdivisés en 16 petits carrés. Les petits carrés ont 0,05
mm de côté et une profondeur de 0,1 mm, de sorte que le volume de chaque
petit carré est de 0,00025 mm3 (25 x 10-8 ml). Il est également possible de
compter dans les carrés moyens. Chaque carré moyen a 16 petits carreaux
de 0,2 mm de côté, et d'un volume de 0,004 mm3 soit 4 x 10-6 ml.
La cellule de Bürker contient 9 grands carrés de 1 mm² de côté, divisés en
16 carrés moyens de 0,2 mm de côté par des doubles lignes espacées de
0,05mm. La surface de chacun de ces carrés moyens est de 0,04 mm² et le
volume de 0,004mm3. Les petits carrés formés par les double lignes ont une
surface de 0,025mm²..
Les grands, moyens et petits carrés des cellules de Neubauer, de Thoma et
de Bürker sont de même taille. Les carrés moyens des cellules de Bürker ne
contiennent pas d'autres lignes à l'intérieur ; ce sont donc probablement les
plus faciles à compter.
5.4.5 Méthodes d'examen
La cellule de comptage et la lamelle couvre-objets doivent être propres et
sèches avant utilisation. Il peut être nécessaire de frotter la surface
quadrillée, car des cellules sales ont une incidence sur le volume de
l'échantillon. Nettoyer à l'eau déminéralisée, ou à l'éthanol, et sécher avec un
papier doux.
En cas de numération de levure floculante, le milieu de suspension doit être
de l'acide sulfurique à 0,5 %, afin d'éviter la floculation, mais ceci interdit la
possibilité de coloration au bleu de méthylène et le comptage des cellules
viables et des cellules mortes. La remise en suspension peut être effectuée
par sonication.
Déposer l'échantillon sur la lame à l'aide d'une pipette à bout fin, en suivant
l'un des deux modes opératoires énoncés ci-dessous.
Mode opératoire 1
Bien mélanger la suspension de levure. Si des dilutions sont nécessaires,
procéder par dilutions décimales, comme d'habitude. En cas de coloration au
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bleu de méthylène, effectuer la coloration sur l'échantillon le plus dilué en
mélangeant 1 ml d'échantillon avec 1 ml de solution de bleu de méthylène.
Agiter en permanence la suspension de levure. Prélever un échantillon avec
une pipette à bout fin, évacuer 4-5 gouttes de suspension et déposer une
petite goutte de suspension de levure (diluée au besoin) sur chacune des
deux zones quadrillées de la lame. Recouvrir avec la lamelle couvre-objets
dans les 20 secondes qui suivent et presser fermement avec les pinces. La
zone de numération doit être complètement remplie, mais aucun liquide ne
doit s'écouler dans la rigole.
Mode opératoire 2
Disposer la lamelle couvre-objets rigide de sorte que les deux cellules de
comptage soient également couvertes. Utiliser les pinces pour presser la
lamelle couvre-objets sur le support jusqu'à ce qu'une irisation apparaisse
(anneaux de Newton). En l'absence de pinces, ne pas déplacer la lamelle
couvre-objets en remplissant la cellule.
Agiter en permanence la suspension de levure. Prélever un échantillon avec
une pipette à bout fin, évacuer 4-5 gouttes de suspension et laisser une petite
goutte d'échantillon couler entre l'hémocytomètre et la lamelle couvreobjets. Procéder de même dans l'autre partie de la lamelle. La zone de
numération doit être complètement remplie, mais aucun liquide ne doit
s'écouler dans la rigole.
Laisser la lame préparée reposer pendant trois minutes, de façon à ce que les
cellules de levure se déposent, et la placer sous le microscope.
Compter 10 carrés moyens dans chaque zone quadrillée. Des procédures
normalisées doivent être définies, afin d'éviter de compter deux fois le
même carré. Les cellules en contact avec ou reposant sur les lignes de
délimitation supérieure ou droite ne sont pas prises en compte, celles en
contact avec ou reposant sur les lignes de délimitation inférieure ou gauche
sont comptées. Les cellules de levure en bourgeonnement sont comptées
comme une seule cellule si la taille du bourgeon est inférieure à la moitié de
celle de la cellule mère, dans le cas contraire les deux cellules sont
comptées.
Pour obtenir une numération précise des cellules, il est recommandé de
compter en moyenne au minimum un total de 200 à 500 cellules de levure.
L'écart de numération entre les deux côtés de la lame doit être inférieur à
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10 %. Si une dilution est utilisée, le facteur de dilution doit être intégré dans
le calcul.
5.4.6 Expression des résultats
C étant le nombre moyen de cellules comptées dans un carré moyen de
0,2mm de côté, la population T totale dans l'échantillon est :
Exprimée en cellules/ml
T = C X 0,25 x 106 x facteur de dilution
C étant le nombre moyen de cellules comptées dans un petit carré de
0,05mm de côté, la population T totale dans l'échantillon est :
Exprimée en cellules/ml
T = C X 4 x106 x facteur de dilution
5.4.7 Références
European Brewery Convention. Analytica Microbiologica – EBC.
Fachverlag Hans Carl, 2001
5.5 Dénombrement des cellules de levure – Coloration de cellules de
levure au bleu de méthylène
Cette méthode permet une estimation rapide du pourcentage de cellules
viables (non colorées), car les cellules mortes sont colorées en bleu. La
méthode est applicable à tous les échantillons contenant des levures, excepté
aux moûts contenant plus de 100 g de sucre par litre.
Les bactéries sont trop petites et leur coloration n'est pas visible avec cette
méthode.
Remarque : il faut bien focalisé les cellules en differents profodeurs, pour
bien visualiser leur coloration avec le bleu de méthylène.
5.5.2 Principe
Le bleu de méthylène est transformé en son dérivé incolore par l’activité
réductrice des cellules de levure viables. Les cellules de levure mortes
seront colorées en bleu.
La viabilité est calculée à partir du rapport entre le nombre de cellules
viables et le nombre de cellules total. La méthode surestime la viabilité
"réelle" lorsque les cellules viables représentent moins de 80 % du nombre
de cellules total, car elle ne distingue pas les cellules "vivantes" des cellules
aptes à se reproduire (Cellules viables mais non cultivables).
Si la concentration en sucre est supérieure à 100 g/l, la plupart des cellules
sont bleu clair, cette méthode est donc déconseillée.
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Dans le cas d'un vin à faible pH et fortement tamponné, le colorant ne peut
pas opérer correctement. Dans ce cas, la numération doit être appliquée au
moins à la première dilution décimale.
Solution A : Bleu de méthylène, en solution dans de l'eau distillée, 0,1 g/500
ml.
Solution B : KH2PO4, en solution dans de l'eau distillée, 13,6 g/500 ml.
Solution C : Na2HPO4 x 12 H2O, en solution dans de l'eau distillée, 2,4
g/100 ml
Solution D : 498,75 ml de solution B + 1,25 ml de solution C.
Solution E : Mélanger les 500 ml de solution D aux 500 ml de solution A
pour obtenir la solution tamponnée finale de bleu de méthylène d'un pH
approximatif de 4,6.
Microscope, avec grossissements de 250-500 x. Le contraste de phase est
contre-indiqué.
Lames de microscope et lamelles couvre-objets, ou hémocytomètre (cellule
de Thoma, de Bürker ou de Neubauer).
Tube à essai et agitateur.
Pipettes à bout fin.
5.5.5 Méthodes d'examen
Détermination de la viabilité
Diluer la suspension de levure avec la solution de bleu de méthylène dans
un tube à essais jusqu'à ce que la suspension comporte approximativement
100 cellules de levure dans un champ microscopique. Déposer une petite
goutte de suspension bien mélangée sur une lame de microscope et la
recouvrir d'une lamelle couvre-objets. Examiner au microscope sous un
grossissement de 400 x, dans les 10 minutes suivant la mise en contact avec
le colorant.
Compter un total de 400 cellules, en notant le nombre de cellules mortes,
cassées, ratatinées et plasmolysées. Les cellules de levure en
bourgeonnement sont comptées comme une seule cellule si la taille du
bourgeon est inférieure à la moitié de celle de la cellule mère. Si la taille du
bourgeon est égale ou supérieure à la moitié de celle de la cellule mère, les
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deux cellules sont comptées. Les cellules de couleur bleu clair doivent être
considérées vivantes.
Si T est le nombre total de cellules et C le nombre de cellules colorées en
T C
bleu, alors le pourcentage des cellules viables est
x100
T
5.5.7 Références
European Brewery Convention. Analytica Microbiologica – EBC.
Fachverlag Hans Carl, 2001
6. DENOMBREMENT DES MICRO-ORGANISMES PAR CULTURE
Objectif :
Le dénombrement des micro-organismes par culture a pour but d'évaluer le
niveau de contamination de l'échantillon, c'est-à-dire d'estimer la quantité de
micro-organismes cultivables. Selon les milieux de culture utilisés et les
conditions de culture, quatre types de micro-organismes peuvent être
dénombrés : levures, bactéries lactiques et bactéries acétiques et
moisissures.
Principe :
Le dénombrement par culture est basé sur le fait que les micro-organismes
vivants sont capables de se multiplier en milieu nutritif et conditions
d’incubation appropriés pour former des colonies sur le milieu solidifié par
de la gélose, ou un trouble dans le milieu liquide. Sur milieu gélosé une
cellule produit par multiplication un amas de cellules visible à l’œil nu
appelé colonie.
6.1 Détection, différenciation et dénombrement des micro-organismes
(numération sur plaque).
Cette norme formule des recommandations générales pour le dénombrement
des levures, moisissures et bactéries lactiques et bactéries acétiques viables
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dans les moûts, les moûts concentrés, les moûts partiellement fermentés, les
vins (vins mousseux y compris) pendant leur élaboration et après la mise en
bouteilles, par comptage des colonies cultivées sur un milieu solide après une
incubation appropriée. Le but de l'analyse microbiologique est de contrôler le
processus de vinification et d'éviter l'altération microbienne des moûts ou des
vins.
6.1. 2 Termes et définitions
Les termes "plaque" et "boîte de Petri" sont employés comme synonymes.
UFC = Unités formant colonies.
6.1. 3 Méthode
Le nombre de micro-organismes viables présents dans des moûts ou des
vins est déterminé en étalant un petit volume connu d'échantillon à la
surface d'un milieu de culture ou en l’ajoutant selon la méthode de
incorporation (voir 6.1.7.4), et en laissant incuber les plaques le temps
nécessaire, dans les conditions les plus favorables à la croissance. Chaque
cellule, ou groupe de cellules, se divise et se rassemble en un groupe qui
devient visible en tant que colonie. Le nombre de colonies présentes à la
surface d'une plaque est une indication du nombre de cellules présentes dans
l'échantillon original. Les résultats sont par conséquent exprimés en UFC. Si
le nombre de cellules dans un échantillon est censé être élevé, des dilutions
décimales en série sont réalisées afin d'obtenir un nombre de colonie
compris entre 10 et 300 par plaque. Si le nombre d'UFC dans un échantillon
est censé être bas, elles sont collectées sur un filtre stérile de 0,45 à 0,88 µm
pour les levures et 0, 22 à 0,45 µm pour les bactéries, qui est ensuite placé
dans la boîte de Petri sur la surface du milieu de culture.
La plage de mesure de cette méthode va de < 1 UFC/ (volume analysé) à 109
UFC/ml ou 1010 UFC/g dans l'échantillon original.
Ceux indiqués au paragraphe 1 de la résolution, plus :
Tubes (16x160 mm ou équivalents), contenant 9 ml d'eau peptonée
stérile (Tryptone : 1 g/l) ou d'autres diluants à utiliser pour la dilution des
échantillons ( Annexe 4). Le nombre indicatif de tubes nécessaires pour les
échantillons suivants est précisé ci-dessous :
OIV-MA-AS4-01 : 2010
15
Moûts non fermentés :
4 / échantillon.
Moûts de fermentation :
7 / échantillon.
Vins stockés :
2 / échantillon.
Micropipette à bouts stériles : 1 ml et 0,2 ml.
Tiges de verre coudées en L ou de forme triangulaire (tiges de
Digralsky)) ou étaleurs en plastique.
Boîtes de Petri de 90 mm de diamètre (avec 15-20 ml de milieu de culture) (56
cm2) pour la technique sur plaques, et de 90 mm ou 60 mm (avec 6-8 ml de
milieu de culture) pour la technique de filtration sur membrane, remplies 1824 h à l'avance avec 15-20 ml de milieu de culture (simple ou en dupliqué
boîtes sont nécessaires pour chaque échantillon testé) :
Pour le comptage des levures et moisissures, utiliser : YM, YEPD, gélose
nutritive WL, gélose à levure ou gélose TGY (trypticase-glucose-extrait de
levure) ou équivalant si validé. Plaques de gélose de lysine et de gélose
différentielle WL (annexe 1) ou équivalant si validé en cas de recherche de
levures non Saccharomyces. (Annexe 5 milieux de culture)
Pour le comptage des bactéries acétiques, utiliser : Gélose GYC, milieu
G2 ou Kneifel (Annexe 5 milieux de culture) ou équivalant si validé
Pour le comptage des bactéries lactiques, utiliser : MRS additionné de
20 % de jus de tomate (ou de pomme ou de raisin), ou gélose ATB (bouillon
de tomate acide) modifiée (milieu pour Oenococcus oeni), ou bouillon de jus
de tomate (TJB) plus gélose, ou milieu Lafon-Lafourcade, milieu 104 ou
gélose MTB (Annexe 5 milieux de culture) ou équivalant si validé
Pour le comptage des champignons filamenteux, utiliser de la gélose
Czapek-Dox modifiée, de la gélose DRBC (dichloran-rose Bengalechloramphénicol) ou de la MEA additionnée de tétracycline (100 mg/l) et de
streptomycine (100 mg/ l) (Annexe 5 milieux de culture) ou équivalant si
validé
Il convient d'ajouter des antibiotiques pour effectuer un comptage
sélectif, étant donné que tous les micro-organismes sont présents ensemble
dans le vin. (Voir Annexe I milieux de culture)
Comme indiqué au paragraphe 2 de la résolution.
6.1. 6 Échantillonnage
Comme indiqué au paragraphe 3 de la résolution
OIV-MA-AS4-01 : 2010
16
Les quantités suivantes d'échantillons sont exigées pour la numération sur
plaques :
Moût ou moût en fermentation ou vin stocké :
pas moins de 250 ml ;
Vin en bouteille ou conditionné :
pas moins d'une unité, quelle que soit
la capacité ;
6.1. 7 Méthodes d'examen
6.1.7.1 Conditions préalables requises
Tous les produits et équipements utilisés au cours des essais doivent être
stériles, et des conditions aseptiques doivent être maintenues tout au long des
opérations.
La hotte à flux laminaire doit être mise en marche 5 minutes avant de
commencer le travail, afin d'avoir un flux d'air stérile et stable.
6.1.7.2 Stérilisation
Les milieux de culture doivent être stérilisés en autoclave à 121°C pendant
au moins 15 minutes (20 minutes pour de grands volumes). Le matériel et la
verrerie stériles à usage unique doivent être ouverts et utilisés sous la hotte à
flux laminaire. Les brucelles et les étaleurs doivent être plongés dans
l'éthanol et flambés avant utilisation. Les entonnoirs en acier inoxydable
doivent être flambés avec de l'éthanol après chaque utilisation. Les
entonnoirs en verre et en polycarbonate doivent en revanche être passés à
l'autoclave avant utilisation, leur nombre doit par conséquent être égal à
celui des échantillons à tester.
6.1.7.3 Dilution des échantillons (Annexe 1)
Un ml d'échantillon est introduit à la pipette dans un tube contenant 9 ml d'eau
peptonée stérile. Le tube est mis en agitation pendant 20 secondes au moyen
d'un agitateur vortex. C'est la première dilution (décimale), dont 1 ml est
transféré dans le tube suivant de 9 ml d'eau peptonée stérile, ce qui constitue la
deuxième dilution. Après 20 secondes d'agitation, l'opération est répétée autant
de fois que nécessaire.
Le nombre indicatif de dilutions en série nécessaires pour les échantillons
suivants est indiqué ci-dessous :
Moûts non fermentés :
4
dilutions décimales.
Moûts de fermentation :
7
OIV-MA-AS4-01 : 2010
17
Vins non-filtrés pendant le vieillissement (comptage des levures)
2
Vins non filtrés pendant le vieillissement (comptage des bactéries lactiques) 6
Vins
filtrés
ou
vins
conditionnés
(mis
en
bouteille)
Auc
une dilution.
Moûts concentrés
Diluer 10 ml dans 100 ml d'eau peptonée
(ou 100 ml dans 1000 ml).
Les vins en bouteille ou filtrés, et les moûts concentrés après dilution dans de
l'eau peptonée stérile, sont analysés selon la technique de filtration sur
membrane.
6.1.7.4 Préparation des plaques
Les dilutions en série nécessaires sont préparées en fonction du nombre
d'échantillons à étaler sur des plaques. De multiples dilutions en série peuvent
être préparées, si un grand nombre d'échantillons doivent être étalés sur des
plaques, mais toute dilution devra être utilisée dans un délai de 20 minutes.
Inoculer chaque plaque avec 0,1 ou 0,2 ml des trois dilutions les plus faibles
ayant été préparées, en procédant comme indiqué ci-dessous :
Moûts non fermentés
dilutions -2 ; -3 ; -4.
Moûts de fermentation
dilutions -5 ; -6 ; -7.
Vins non filtrés pendant le vieillissement
dilutions 0 ; -1 ; -2.
Dans le doute, inoculer un nombre plus élevé de dilutions, jamais un nombre
inférieur.
Dans des conditions aseptiques (de préférence sous une hotte à flux laminaire),
avec une tige de verre coudée stérile (tige de Digralsky) ou à usage unique,
étaler l'échantillon à la surface des milieux de culture avant absorption du
liquide (généralement en 1-2 minutes). Utiliser une nouvelle " tige de
Digralsky " pour chaque plaque ou procéder en allant de l'échantillon le plus
dilué jusqu'au moins dilué. Laisser les plaques quelques minutes sous le flux
d'air stérile, jusqu'à ce que le liquide soit absorbé.
OIV-MA-AS4-01 : 2010
18
Note 1 : Le fait d'utiliser 0,2 ml au lieu de 0,1 ml, comme fréquemment
indiqué, facilite l'étalement et prolonge le délai d'utilisation. Ces éléments
doivent être pris en compte dans les calculs.
Note 2 : Pour le dénombrement des levures, le développement bactérien est
inhibé en ajoutant 50 mg/l de chloramphénicol (ou équivalant si validé) au
milieu de croissance, après passage dans l'autoclave, et le développement
des moisissures en ajoutant 150mg/l de diphényle (ou équivalant si validé).
Note 3 : Pour le dénombrement des bactéries lactiques, le développement
des levures est inhibé en ajoutant de la natamycine (pimaricine) (0,1 g/l)
(ou équivalant si validé) et le développement des bactéries acétiques par
incubation anaérobie.
Note 4 : Pour le dénombrement des bactéries acétiques, le développement
des levures est inhibé en ajoutant de la natamycine (pimaricine) (0,1 g/l)
(ou équivalant si validé) et celui des bactéries lactiques par ajout de
pénicilline
(12,5
mg/l)
(ou
équivalant
si
validé).
L'ajout d'antibiotiques est effectué après la stérilisation en autoclave.
Pour une recherche spécifique de levures non Saccharomyces, inoculer,
comme indiqué précédemment, trois plaques de gélose de lysine et trois
plaques de gélose différentielle WL avec les dilutions appropriées
- Méthode de incorporation (méthode alternative).
Préparer et stériliser 15 ml de milieu dans des tubes, et maintenir les tubes
dans un bain d'eau (ou équivalant si validé) à 471 °C.
Verser 1 ml d'échantillon ou de dilution dans une boîte de Petri vide.
Ajouter 15 ml de milieu de culture et remuer doucement la boîte de Petri, afin
d'obtenir une répartition homogène des micro-organismes dans la masse du
milieu.
Laisser refroidir et se solidifier en plaçant les boîtes de Petri sur une surface
horizontale fraîche (le temps de solidification de la gélose ne devra pas
excéder 10 minutes).
OIV-MA-AS4-01 : 2010
19
6.1.7.5 Dénombrement avec concentration par filtration sur membrane
La porosité de la membrane doit être de 0,45 ou 0,8 µm pour le dénombrement
des levures ; 0,2 ou 0,45 µm pour celui des bactéries. La surface de la
membrane doit de préférence être quadrillée, afin de faciliter le dénombrement
des colonies.
Les plaques, sur lesquelles sont placées les membranes, peuvent contenir un
milieu nutritif gélosé ou un tampon, dans lequel le milieu sec est dispersé et
qui doit être imbibé d'eau stérile juste avant utilisation. Certains fournisseurs
proposent des plaques stériles contenant un tampon stérile, sur lequel sont
versés juste avant utilisation 2 ml de milieu liquide stérile à usage unique.
Assembler le matériel de filtration de manière aseptique, et relier au système
qui permettra de faire le vide.
Plonger les brucelles dans l'éthanol et les flamber : une fois la flamme éteinte,
attendre quelques secondes et mettre la membrane, avec les brucelles, sur son
support dans l'unité de filtration.
Avant d'ouvrir la bouteille, bien l’agiter, renverser le goulot et le plonger dans
l'éthanol (1-2 cm), puis flamber pour le stériliser.
Prélever trois volumes de chaque échantillon : 10 ml avec une pipette stérile
de 10 ml, 100 ml avec une éprouvette cylindrique stérile de 100 ml, et le reste
directement de la bouteille si applicable. Pour filtrer, verser le vin dans
l'entonnoir, puis activer le vide.
Lorsque la quantité de vin désirée a été filtrée, casser le vide, flamber les
brucelles, ouvrir l'entonnoir, maintenir la membrane avec les brucelles, placer
sa face opposée sur le milieu solide d'une plaque et la faire adhérer à la surface
du milieu en évitant que des bulles ne se forment en-dessous.
6.1.7.6 Incubation des échantillons
Incuber les plaques à l'envers, en conditions aérobies, pour les levures ou
pour les bactéries acétiques, pendant 4 jours à 25 ± 2°C. Si la température
est inférieure à 23°C, prolonger l'incubation d'un jour, si elle est inférieure à
20°C prolonger de trois jours supplémentaires. La température maximale ne
doit pas excéder 28°C.
En cas de comptage portant sur des levures Brettanomyces (ou Dekkera),
doubler le temps d'incubation.
En cas de comptage de BL (bactéries lactiques), mettre les plaques dans une
fiole ou un sac anaérobies, et incuber les plaques à l'envers pendant 10 jours
à 30 ± 2°C. Si la température est inférieure à 28°C prolonger l'incubation
OIV-MA-AS4-01 : 2010
20
d'un jour ; si elle est inférieure à 25°C, prolonger de trois jours
supplémentaires. La température maximale ne doit pas excéder 33°C.
6.1. 8 Expression des résultats
6.1.8.1 Dénombrement des colonies de levure et bactéries :
Compter les colonies développées en 4 jours pour les levures et les bactéries
acétiques (8 jours pour les levures Brettanomyces/Dekkera), et 10 jours pour
les bactéries lactiques au besoin à l'aide d'un compteur de colonies, en ignorant
la morphologie différente des colonies en cas de comptage total des levures, ou
en la prenant en compte s'il y a lieu.
Les milieux et les conditions d’incubation sont suffisamment spécifiques pour
que les colonies visibles à l’œil nu permettent le comptage des différents types
de micro-organismes.
6.1.8.2 Calcul des résultats.
Les résultats les plus fiables proviennent du comptage de plaques contenant de
10 à 300 colonies (ISO 7218:2007 - Microbiologie des denrées alimentaires et
aliments pour animaux - Règles générales relatives aux analyses
microbiologiques).
Calculer le nombre N de micro-organismes présents dans l'échantillon d'essai
sous forme de moyenne pondérée de deux dilutions décimales successives, en
utilisant l'équation suivante :
N
C
V  1,1 d
où :
C
est la somme des colonies comptées sur les deux boîtes conservées
après deux dilutions décimales successives, dont une au moins contient au
minimum 10 colonies.
V est le volume d'inoculum placé dans chaque boîte, en millilitres.
d est la dilution correspondant à la première dilution retenue [d = 1 quand le
produit liquide non dilué (échantillon d'essai) est retenu].
En d'autres termes, si les plaques de deux dilutions décimales consécutives
contiennent 10-300 colonies, calculer le nombre d'UFC/ml pour chaque
OIV-MA-AS4-01 : 2010
21
dilution, et ensuite la moyenne des deux valeurs : c'est la valeur d'UFC/ml de
l'échantillon. Si une valeur est supérieure au double de l'autre, garder la valeur
inférieure comme UFC/ml.
Arrondir les résultats au deuxième chiffre significatif seulement au moment de
la conversion en UFC/ml, et rapporter les résultats sous la forme d'un nombre
compris entre 1,0 et 9,9 multipliés par la puissance 10 appropriée (ISO
7218:2007 - Microbiologie des denrées alimentaires et aliments pour animaux
- Règles générales relatives aux analyses microbiologiques).
Si les échantillons ont été inoculés en double, et si une ou deux plaques
inoculées avec la même dilution contiennent des colonies, calculer le nombre
moyen de colonies et multiplier par l'inverse du facteur de dilution, pour
obtenir le nombre d'UFC/ml.
Si aucune plaque ne contient 10-300 colonies, et que toutes les plaques
contiennent plus de 300 colonies, compter celles comportant le moins de
colonies. Si elles contiennent moins de 10 colonies/cm², compter 12 carrés de
1 cm2 et multiplier la moyenne par 56 (la surface d'une plaque de 90 mm de
diamètre) ; si les colonies sont plus denses, compter 4 carrés de 1 cm2 et
multiplier la moyenne par 56. Exprimer les résultats en tant que "Valeur
UFC/ml estimée". Dans la mesure du possible, ne pas rapporter les résultats
sous la forme TNTC [too numerous to count (trop nombreux pour être
comptés)].
Si les seules plaques présentant des colonies contiennent moins de 10 colonies,
mais au moins 4, calculer le résultat comme indiqué dans le cas général, et le
rapporter en tant que "Valeur UFC/ml estimée".
Si le total est compris entre 3 et 1, la précision du résultat est trop faible, et le
résultat sera rapporté sous la forme "(les micro-organismes recherchés) sont
présents mais en quantité inférieure à 4 × d UFC/ml".
Si les plaques de toutes les dilutions d'un échantillon ne présentent aucune
colonie, rapporter le résultat sous la forme "moins de 1/d UFC/ml", mais tenir
compte de la présence éventuelle d'inhibiteurs dans l'échantillon.
En cas d'application de la technique de filtration sur membrane, exprimer les
résultats par rapport à la quantité de liquide filtrée, par exemple UFC/bouteille,
UFC/100 ml ou UFC/10 ml.
OIV-MA-AS4-01 : 2010
22
6.1.9 Incertitude de la mesure
6.1.9.1 Critères de contrôle des résultats.
Pour chaque lot de milieu, une plaque est utilisée comme témoin de stérilité
après stérilisation. Une plaque, par milieu de culture utilisé lors des tests, est
laissée ouverte sous la hotte à flux laminaire tout au long des opérations afin
de contrôler la stérilité de l'environnement de travail. Cette plaque sera
incubée comme les plaques inoculées.
Périodiquement, un échantillon est inoculé en double, et le Kp expérimental
est calculé au moyen de l'équation suivante :
Kp 
| C1  C 2 |
C1  C 2
dans laquelle C1 et C2 sont les résultats des deux comptages.
Si Kp < 1,96 ≈ 2,0 les résultats sont acceptables : la moyenne des deux
comptages peut être utilisée comme résultat.
Si 2,0<Kp ≤ 2,576 ≈ 2,6 la différence des deux comptages est critique et
doit être soigneusement évaluée avant d'accepter les résultats comme
moyenne des deux comptages.
Si Kp > 2,6 la différence des deux comptages est anormale. Le résultat est
rejeté et le test doit être répété. Dans ces circonstances, le responsable du
laboratoire doit examiner tous les résultats obtenus après les derniers
résultats acceptables.
6.1.9.2 Incertitude de la mesure
Si le nombre de colonies comptées sur la plaque pouvant l'être est inférieur à
10, le résultat est acceptable, mais la population des colonies est considérée
conforme à la loi de Poisson. Le niveau de confiance de 95 %, et par
conséquent l'incertitude de la mesure du comptage estimatif réalisé sur une
seule boîte de Petri, est rapporté dans le tableau suivant.
OIV-MA-AS4-01 : 2010
23
Nombre
colonies
de Limite de confiance au niveau Pourcentage d'erreur de la limite
95 %
*
Inférieure
Supérieure
Inférieure
Supérieure
1
<1
6
-97
457
2
<1
7
-88
261
3
<1
9
-79
192
4
1
10
-73
156
5
2
12
-68
133
6
2
13
-63
118
7
3
14
-60
106
8
3
16
-57
97
9
4
17
-54
90
10
5
18
-52
84
11
6
20
-50
79
12
6
21
-48
75
13
7
22
-47
71
14
8
24
-45
68
15
8
25
-44
65
ère
* Par rapport au dénombrement des micro-organismes (1 colonne)
Si le nombre de colonies est > 10, la limite de confiance à un seuil de
probabilité p est calculée au moyen de l'équation suivante :
C = Ci  Kp √Ci,
dans laquelle Ci est le nombre de colonies de la plaque, et Kp est le facteur
de couverture. Généralement, le facteur de couverture est 2 ou 1,96. La
valeur de C est calculée à partir de chaque plaque et multipliée par le
nombre de dilutions ainsi que par le résultat du comptage.
6.2. Culture en milieu liquide - "nombre le plus probable" (NPP)
6.2.1 Objectif
Cette technique a pour but d'évaluer le nombre de micro-organismes viables
dans les vins ayant des teneurs élevées en particules solides en suspension
et/ou des indices élevés de colmatage.
OIV-MA-AS4-01 : 2010
24
6.2.2 Principe
Cette technique est basée sur l'estimation du nombre de micro-organismes
viables en milieu liquide, en partant du principe d'une répartition normale
dans l'échantillon.
6.2.3 Diluants et milieux de culture liquides (Annexes 4 et 5)
6.2.4 Mode opératoire
Plusieurs solutions quantitatives et successives sont préparées et, après
incubation, une certaine proportion d'essais ne donneront lieu à aucun
développement (essais négatifs), tandis que d'autres commenceront à se
développer (essais positifs). Si l'échantillon et les dilutions sont homogènes
et si le nombre de dilutions est suffisamment élevé, il est possible de faire
un traitement statistique des résultats en utilisant des tables appropriées
(tables reposant sur les calculs de probabilité de
McCrady) et d'extrapoler ce résultat à l'échantillon initial.
6.2.5 Préparation des dilutions
En partant d'un échantillon de vin homogénéisé, préparer une série de
dilutions décimales (1/10) dans le diluant.
Prélever 1 ml de vin et ajouter à 9 ml de diluant dans le premier tube.
Homogénéiser. Prélever 1 ml de cette dilution pour l'ajouter à 9 ml de
diluant dans le deuxième tube. Continuer ce protocole de dilution jusqu'à la
dernière dilution requise, selon la population microbienne présumée, en
utilisant des pipettes
stériles pour chaque dilution. Les dilutions doivent être réalisées jusqu'à
extinction, c'est-à-dire l'absence de développement dans les dilutions les
plus faibles (annexe 2).
6.2.6 Préparation des inoculations
Inoculer 1 ml de vin et 1 ml de chacune des dilutions homogénéisées lors de
leur préparation, dans trois tubes avec le milieu de culture approprié (annexe
5). Bien mélanger.
Incuber les tubes inoculés dans l'étuve à 25 °C, pour les levures (pendant 3 à
10 jours), en aérobiose et, pour les bactéries lactiques, en anaérobiose ou
microaérophilie (pendant 8 à 10 jours), en faisant des observations
périodiques jusqu'au dernier jour d'incubation.
OIV-MA-AS4-01 : 2010
25
6.2.7 Résultats
Sont considérés positifs tous les tubes qui présentent un développement
microbien se traduisant par la formation d'un sédiment blanchâtre, plus ou
moins évident et/ou par un trouble plus ou moins accentué. Les résultats
doivent être confirmés par observation au microscope. Préciser la durée
d'incubation.
La lecture des tubes se fait en notant le nombre de tubes positifs ou négatifs
de chaque combinaison de trois tubes (de chaque dilution). Par exemple, "31-0" signifie : trois tubes positifs dans la dilution 100 (vin), un dans la
dilution 10-1 et zéro dans la dilution 10-2.
Pour un nombre de dilutions supérieur à trois, seuls trois de ces résultats
sont significatifs. Pour sélectionner les résultats à adopter dans la
détermination du "NPP", il est nécessaire de déterminer le "nombre
caractéristique" conformément aux exemples figurant dans le tableau
suivant :
Tableau
Nombre de tubes positifs pour chaque
Nombre caractéristique
dilution
10
10
10
10
3-1-0
Exemp 10
le
a
3
3
3
1
0
3-2-0
a
3
3
2
0
0
3-2-1
a
3
2
1
0
0
3-0-1
a
3
0
1
0
0
3-2-3
b
3
2
2
1
0
3-2-3
b
3
2
1
1
0
3-2-2
c
2
2
2
2
0
2-2-2
d
0
1
0
0
0
0-1-0
Exemple a : prendre la plus grande dilution pour laquelle tous les tubes sont
positifs et les deux suivantes.
Exemple b : si un résultat positif est noté pour une dilution plus grande que la
dernière ainsi choisie, il faut l’ajouter à celle-ci.
Exemple c : si aucune dilution ne fournit trois tubes positifs, prendre les
dilutions correspondantes aux trois derniers tubes positifs.
Exemple d : cas ou le nombre de tubes positifs est très réduit, choisir le
nombre caractéristique de façon à ce que la dilution positive
occupe le rang des dizaines
Adapté de Bourgeois, C.M. et Malcoste, R. in : Bourgeois, C.M. et Leveau, J.Y. (1991).
OIV-MA-AS4-01 : 2010
26
Calcul du nombre le plus probable (NPP)
Le NPP est déterminé à l'aide du Tableau A (Annexe 3) reposant sur les
calculs de probabilités de McCrady, en tenant compte du nombre
caractéristique obtenu et de la dilution effectuée. Si la série de dilutions est
100, 10-1, 10-2, la lecture est directe. Si la série de dilutions est 101, 100, 10-1,
la lecture correspond à 0,1 fois cette valeur. Si la série de dilutions est 10-1,
10-2, 10-3, la lecture correspond à dix fois cette valeur.
Remarque :
S'il est nécessaire d'augmenter le niveau de détection, une concentration de
vin de 101 peut être utilisée. Pour obtenir cette concentration de microorganismes dans 1 ml, centrifuger 10 ml de vin et prélever 1 ml de dépôt
(après avoir enlevé 9 ml du liquide surnageant) à inoculer selon la procédure
décrite précédemment.
La teneur en micro-organismes du vin doit être présentée en germes par
millilitre, en notation scientifique à une décimale. Si la teneur est inférieure
à 1,0 cellule par millilitre, le résultat doit être présenté sous la forme "< 1,0
cellule par ml".
(voir les annexes en pages suivantes)
7. Bibliographie
ISO 4833:2003. Microbiology of food and animal feeding stuffs –
Horizontal medium for the enumeration of microorganisms – Colony count
technique at 30°C.
ISO 7218:2007 - Microbiology of food and animal feeding stuff General rules for microbiological examinations.
ISO 7667:1983. Microbiology - Standard layout for methods of
microbiological examination.
Pallman, C., J. B. Brown, T. L. Olineka, L. Cocolin, D. A. Mills and
L. F. Bisson. 2001. Use of WL medium to profile native flora fermentations.
American Journal of Enology and Viticulture 52:198-203 ;
A. Cavazza, M. S. Grando, C. Zini, 1992. Rilevazione della flora
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Methods of Analysis, 15th edition, 1, 425-497, Association of Analytical
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nº 910, Paris.
BOURGEOIS, C.M. et LEVEAU, J.Y. (1991). Techniques d'analyse
et de contrôle dans les industries agro alimentaires, 2ème édition, 3. Le
Contrôle Microbiologique Lavoisier, Tec. & Doc., APRIA Ed. Paris.
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LAFON-LAFOURCADE, S. et al. (1980). Quelques observations
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MAUGENET, J. (1962). Les Acétobacter du cidre. Identification de
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PLARIDIS et LAFON-LAFOURCADE, S. (1983). Contrôle
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RIBÉREAU-GAYON, J. et PEYNAUD, E. (2004). Traité
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partie, Doc. Travail du groupe d'experts "Microbiologie du Vin" de l'O.I.V.,
13ème session, Paris.
OIV-MA-AS4-01 : 2010
28
Annexe 1
Préparation des dilutions et inoculations
OIV-MA-AS4-01 : 2010
29
Annexe 2
Préparation des dilutions et inoculations
Dilution
Échantillon
Dilution obtenue
Inoculation des boîtes
Échantillon
Quantité d'échantillon
OIV-MA-AS4-01 : 2010
30
Annexe 3
TABLEAU A
"Nombre le plus probable" (NPP) pour 1 ml d'échantillon en utilisant 3
tubes
contenant 1 ml, 0,1 ml et 0,01 ml
Tubes positifs
Tubes positifs
Tubes positifs
1
0,1 0,01 NPP 1
0,1 0,01 NPP 1
0.1 0,01 NPP
ml ml ml 1 ml ml ml ml 1 ml ml
ml ml 1 ml
0
0
0
0,0
2
0
2
2,0
1
1
1
7,5
0
0
1
0,3
2
1
0
1,5
3
1
2
11,5
0
1
0
0,3
2
1
1
2,0
3
1
3
16,0
0
1
1
0,6
2
1
2
3,0
3
2
0
9,5
0
2
0
0,6
2
2
0
2,0
3
2
1
15,0
1
0
0
0,4
2
2
1
3,0
3
2
2
20,0
1
0
1
0,7
2
2
2
3,5
3
2
3
30,0
1
0
2
1,1
2
2
3
4,0
3
3
0
25,0
1
1
0
0,7
2
3
0
3,0
3
3
1
45,0
1
1
1
1,1
2
3
1
3,5
3
3
2 110,0
1
2
0
1,1
2
3
2
4,0
3
3
3 >140,
0
1
2
1
1,5
3
0
0
2,5
1
3
0
1,6
3
0
1
4,0
2
0
0
0,9
3
0
2
6,5
2
0
1
1,4
3
1
0
4,5
Adapté de “ Standard Methods for the Examination of Water and Waste
Water ” (1976)
OIV-MA-AS4-01 : 2010
31
Annexe 4
Diluants :
Les diluants sont indiqués à titre d'exemple. L'eau à utiliser doit être
distillée, bidistillée ou désionisée, sans traces de métaux, d'inhibiteurs ou
d'autres substances antimicrobiennes.
1. Eau physiologique
Préparation : peser 8,5 g de chlorure de sodium dans une fiole jaugée
de 1000 ml. Après dissolution dans l'eau, ajuster au volume de
référence. Bien mélanger. Filtrer. Répartir 9 ml dans les tubes à essais.
Boucher avec du coton cardé et placer en autoclave pendant 20 mn à
121 °C.
2. Solution de Ringer à 1/4
Préparation : dans une fiole jaugée de 1000 ml, peser 2,250 g de chlorure de
sodium, 0,105 g de chlorure de potassium, 0,120 g de chlorure de calcium
(CaCl2.6H2O), 0,050 g d'hydrogénocarbonate de sodium. Après dissolution
dans de l'eau, ajuster au volume de référence. Bien mélanger. Répartir 9 ml
dans les tubes à essais. Boucher avec du coton cardé et placer en autoclave
pendant 15 mn à 121 °C. (cette solution est disponible dans le commerce)
3. Eau peptonée
Préparation : dans une fiole jaugée de 1000 ml, peser 1g de peptone. Après
dissolution dans l'eau, ajuster au volume de référence. Bien mélanger.
Répartir 9 ml dans les tubes d'essai. Boucher avec du coton cardé et placer
en autoclave pendant 20 mn à 121 °C.
OIV-MA-AS4-01 : 2010
32
Annexe 5
Milieux de culture
Les milieux de culture et les antimicrobiens sont indiqués à titre d'exemple.
L'eau à utiliser doit être distillée, bidistillée ou désionisée, sans traces de
métaux, d'inhibiteurs ou d'autres substances antimicrobiennes.
1. Milieux de culture solides
En l'absence d'indication contraire, le pH de tous les milieux doit être ajusté
entre pH 5,5 et pH 6,0
1 MILIEUX POUR LE DÉNOMBREMENT DES LEVURES
1.1 YM
Glucose
50 g
Peptone
5g
Extrait de levure
3g
Extrait de malt
3g
Agar-agar
20 g
Eau : jusqu'à
1000 ml
Ajouter au besoin 100 mg de chloramphénicol pour inhiber le
développement bactérien et 150 mg de diphényle pour inhiber le
développement des moisissures.
1.2 YEPD
Glucose
20 g
Peptone
20 g
Extrait de levure
10 g
Agar-agar
20 g
Eau : jusqu'à
1000 ml
développement bactérien et 150 mg de diphényle pour inhiber le
développement des moisissures.
OIV-MA-AS4-01 : 2010
33
1.3 Gélose nutritive WL
Glucose
Peptone
Extrait de levure
Phosphate de potassium monobasique (KH2PO4)
Chlorure de potassium (KCl)
Chlorure de calcium (CACL2)
Sulfate de magnésium (MgSO4)
Chlorure ferrique (FeCl3)
Sulfite de manganèse (MnSO4)
Vert de bromocrésol
Gélose bactériologique
Eau : jusqu'à
pH
50 g
5g
4g
0,55 g
0,425 g
0,125 g
0,125 g
0,0025 g
0,0025 g
0,022 g
12 g
1000 ml
5,5
La gélose différentielle est produite en ajoutant 4 mg/l de cycloheximide à la
gélose nutritive WL.
développement bactérien.
1.4 Gélose de lysine ASBC
Solution A :
Base carbonée de levure
2,35 g
Eau : jusqu'à
100 ml
Stériliser par filtration sur membrane.
Solution B :
Lysine-HCl
0,5 g
Agar-agar
4g
Eau : jusqu'à
100 ml
Stériliser pendant 20 mn à 121 °C.
développement bactérien.
OIV-MA-AS4-01 : 2010
34
2 MILIEUX
LACTIQUES
POUR
LE
DÉNOMBREMENT
DES
BACTÉRIES
2.1 M.R.S. + jus de tomate (ou pomme).
Glucose
20 g
Peptone
10 g
Extrait de bœuf
8g
Extrait de levure
4g
Phosphate de potassium, dibasique (KH2PO4)
2g
Acétate de sodium  3H2O
5g
Citrate d'ammonium
2g
Sulfate de magnésium  6H2O
0,2 g
Sulfate de manganèse  4H2O
0,05 g
"Tween 80"
1 ml
Agar-agar
12 g
Jus de tomate (ou jus de pomme ou de raisin)
200 ml
Eau jusqu'à
1000 ml
Ajouter 100 mg/L de natamycine (pimaricine) pour inhiber le
développement des levures, après passage à l'autoclave, juste avant
utilisation.
2.2 Gélose au jus de tomate
Jus de tomate (extrait sec de 400 ml)
20 g
Peptone
10 g
Lait peptonisé
10 g
Agar-agar
14 g
Eau : jusqu'à
1000 ml
pH
6,1
utilisation.
OIV-MA-AS4-01 : 2010
35
2.3 Milieu ATB modifié, ou milieu Oenococcus oeni (anciennement milieu
Leuconostoc oenos).
Solution A :
Glucose
Extrait de levure
Peptone
Sulfate de magnésium
Sulfate de manganèse
Jus de tomate (ou jus de pomme ou de raisin)
Agar-agar
Eau
Stériliser à l'autoclave pendant 20 mn à 121 °C.
Solution B :
Cystéine HCl
Eau : jusqu'à
pH
Stériliser par filtration sur membrane.
Ajouter 100 mg/L de natamycine (pimaricine)
développement des levures, juste avant utilisation.
10 g
5g
10 g
0,2 g
0,050 g
250 ml
12 g
750 ml
1g
100 ml
4,8
pour
inhiber
le
Ajouter 1 ml de la solution B dans 20 ml de solution A au moment de
l'utilisation
2.4 Milieu Lafon-Lafourcade
Glucose
Extrait de levure
Extrait de bœuf
Peptone
Acétate de sodium
Citrate de tri-ammonium
"Tween 80"
Agar-agar
Eau : jusqu'à
pH
OIV-MA-AS4-01 : 2010
20 g
5g
10 g
10 g
5g
2g
0,2 g
0,05 g
1 ml
20 g
1000 ml
5,4
36
utilisation.
2.5 Milieu Dubois (milieu 104)
Jus de tomate
250 ml
Extrait de levure
5g
Peptone
5g
Acide malique
3g
0.05 g
0.05 g
Agar-agar
20 g
Eau : jusqu'à
1000 ml
pH
4,8
utilisation.
2.6 MTb.
Glucose
15 g
Poudre Lab-Lemco (Oxoid)
8g
Caséine hydrolysée
1g
Extrait de levure
5g
Jus de tomate
20 ml
Acétate de sodium
3g
Citrate d'ammonium
2g
Acide malique
6g
Sulfate de magnésium
0,2 g
Sulfate de manganèse
0,035 g
"Tween 80"
1 mg
TC Vitamins Minimal Eagle, 100x (BD-Difco)
10 ml *
pH (avec KOH)
5,0
Eau jusqu'à
1000 ml
* à ajouter après stérilisation.
utilisation.
OIV-MA-AS4-01 : 2010
37
3 MILIEUX POUR LE DÉNOMBREMENT DES BACTÉRIES ACÉTIQUES
3.1 GYC
Glucose
Extrait de levure
Carbonate de calcium (CaCO3)
50 g
10 g
3g
Gélose
25 g
Eau : jusqu'à
1000 ml
développement des levures, et 12,5 mg/L de pénicilline pour éliminer la
croissance des bactéries lactiques, après passage à l'autoclave, juste avant
utilisation.
3.2 Milieu G2
Extrait de levure
1,2 g
Phosphate d'ammonium
2g
Jus de pomme
500 ml
Gélose
20 g
Eau : jusqu'à
1000 ml
pH
5,0
utilisation.
3.3 Milieu Kneifel
Extrait de levure
Éthanol
Gélose
Vert de bromocrésol à 2,2 %
Eau : jusqu'à
30 g
20 ml *
20 g
1mL
1000 ml
* à ajouter après stérilisation.
utilisation.
OIV-MA-AS4-01 : 2010
38
Colonies bleues : Acetobacter, Gluconacetobacter
Colonies vertes : Gluconobacter
4 MILIEUX POUR LE DÉNOMBREMENT DES MOISISSURES
4.1 Czapek-Dox, Modifié
Sucrose
30 g
NaNO3
3g
K2HPO4
1g
MgSO4
0,5 g
KCl
0,5 g
0,01g
FeSO4
Gélose
15 g
pH final (à 25 °C)
7,3 ± 0,2
Ajouter 10 mg/l de cycloheximide pour inhiber le développement des
levures (le développement des levures résistantes au cycloheximide est
généralement plus lent que celui des moisissures).
Remarque : Ce milieu permet la croissance uniquement des moisissures se
développant en présence de nitrates.
Ajouter de la tétracycline (100 mg/l) et de la streptomycine (100 mg/l) pour
inhiber la croissance des bactéries.
4.2 Gélose dichloran-rose Bengale-chloramphénicol (gélose DRBC)
Glucose
10 g
Peptone
5g
KH2PO4
1g
MgSO4
0,5 g
Rose Bengale
0,025 g
Dichloran (2,6 dichloro-4-nitroaniline)
0,002g
Solution de chloramphénicol (0,1 g/10ml) *
10 ml
Gélose
15 g
5,6 ± 0,2
* À ajouter après stérilisation.
OIV-MA-AS4-01 : 2010
39
4.3 Gélose à l'extrait de malt (MEA)
Glucose
20 g
Extrait de malt
20 g
Peptone
5g
Gélose
15 g
5,5 ± 0,2
Ajouter de la tétracycline (100 mg/l) et de la streptomycine (100 mg/l) pour
inhiber la croissance des bactéries.
2. Milieux de culture liquides
2.1. Pour les levures
Milieu YEPD (extrait de levure, peptone, dextrose) + chloramphénicol
Préparation : Peser 10,0 g d'extrait de levure (Difco ou équivalent), 20 g de
peptone, 20 g de glucose et 100 mg de chloramphénicol. Dissoudre,
compléter le volume avec de l'eau jusqu'à 1000 ml et mélanger.
Verser des portions de 5 ml de ce milieu dans les tubes et placer en
autoclave pendant 15 mn à 121 °C.
2.2. Pour les bactéries lactiques
Milieu MTJ (50 % de milieu MRS "bouillon pour lactobacilles selon Man,
Rogosa et Sharpe"+ 50 % de milieu TJB "bouillon de jus de tomate") +
actidione
Préparation : Peser 27,5 g de MRS "bouillon pour lactobacilles selon Man,
Rogosa et Sharpe" (Difco ou équivalent). Ajouter 500 ml d'eau, porter à
ébullition pour permettre la dissolution totale et ajouter 20,5 g de TJB
"bouillon de jus de tomate" (Difco ou équivalent). Ajouter 50g d'actidione.
Dissoudre avec de l'eau de façon à obtenir 1000 ml de solution après avoir
corrigé le pH à 5,5 avec une solution d'acide chlorhydrique 1N et mélanger.
Verser des parties de 10 ml de ce milieu3) dans les tubes et placer en
autoclave pendant 15 minutes à 121°C.
3) On utilise un volume de 10 ml au lieu de 5 ml comme dans le cas des levures, en raison de la plus
grande sensibilité des bactéries lactiques à l'oxygène.
OIV-MA-AS4-01 : 2010
40
ANNEXE 6 : IDENTIFICATION DE MICRO-ORGANISMES
SPÉCIFIQUES
6.1 Identification de colonies de levure sur gélose nutritive WL.
L'utilisation de ce milieu ne prétend pas constituer une méthode
d'identification des espèces, mais peut offrir aux laboratoires non spécialisés
un moyen rapide et bon marché de prévoir le genre des levures viables et
cultivables. Après incubation de 4 jours, évaluer la morphologie des
colonies comme suit (Pallman, C., J. B. Brown, T. L. Olineka, L. Cocolin,
D. A. Mills et L. F. Bisson. 2001. Use of WL medium to profile native flora
fermentations. American Journal of Enology and Viticulture 52:198-203 ;
A. Cavazza, M. S. Grando, C. Zini, 1992. Rilevazione della flora microbica
di mosti e de vini. Vignevini, 9-1992 17-20) :
Saccharomyces spp. : Se développe bien en 4 jours sur gélose
nutritive WL, en formant des colonies circulaires de couleur crème à
légèrement verdâtre. Les différentes nuances de couleur n'indiquent pas
nécessairement la présence de différentes souches, mais la présence de
légères mutations ; les colonies présentent une protubérance, ont une surface
lisse et mate, et leur consistance est butyreuse. Ne se développe pas sur la
gélose de lysine.
Torulaspora spp. : Les colonies sont semblables à celles de
Saccharomyces spp. Se développe sur la gélose de lysine.
Hanseniaspora spp. (Kloeckera spp.) : Se développe sur la gélose
nutritive WL en 4 jours, donnant des colonies plates, lisses et butyreuses de
couleur vert foncé. Se développe sur la gélose de lysine et sur la gélose
différentielle WL.
Candida stellata : Se développe sur la gélose nutritive WL en 4
jours, donnant des colonies vert pois, lisses et butyreuses qui, avec le temps,
deviennent plus foncées au centre. Se développe sur la gélose de lysine.
Saccharomycodes spp. : Se développe sur la gélose nutritive WL en
4 jours, donnant des colonies convexes, lisses et butyreuses de couleur vert
clair. Se développe sur la gélose de lysine, pas sur la gélose différentielle
WL.
Remarque : Ses cellules, observées au microscope, sont très grandes
(jusqu'à 25 m).
OIV-MA-AS4-01 : 2010
41
Schizosaccharomyces pombe : Se développe sur la gélose nutritive
WL en 4 jours, donnant des colonies lisses, de la taille d'une pointe
d'aiguille et de couleur vert foncé. Se développe sur la gélose de lysine.
Remarque : Ses cellules, observées au microscope sont facilement
identifiables en raison de leur division caractéristique par scission.
Rhodotorula spp. : Se développe sur la gélose nutritive WL en 4
jours, donnant des colonies butyreuses, à la surface lisse et muqueuse, et de
couleur rose foncé. Se développe sur la gélose de lysine.
Metschnikowia spp. : Se développe sur la gélose nutritive WL en 4
jours, donnant de petites colonies claires, lisses et butyreuses. Un pigment
rougeâtre se répand dans le milieu au-dessous des colonies. Se développe
sur la gélose de lysine.
Pichia membranifaciens : Se développe sur la gélose nutritive WL
en 4 jours, donnant des colonies convexes, à la surface grossière et
pulvérulente, et de couleur grisâtre ou bleuâtre. Se développe sur la gélose
de lysine.
Pichia anomala (anciennement Hansenula anomala) : Se développe
sur la gélose nutritive WL en 4 jours, donnant des colonies de couleur crème
ou bleuâtre, nettement bleuâtre après 8 jours. Les colonies circulaires, à la
surface lisse ont une consistance butyreuse mais parfois clairement
muqueuse. Se développe sur la gélose de lysine.
Dekkera spp. ou Brettanomyces spp. : Se développe sur la gélose
nutritive WL en 8 jours, donnant de petites colonies lisses et butyreuses, en
forme de dôme et de couleur crème. Produit une grande quantité d'acide
acétique, nettement perceptible à l'odeur, qui fait virer le milieu au jaune. Se
développe sur la gélose de lysine et sur la gélose différentielle WL. La
croissance sur ce dernier milieu permet de la distinguer de
Zygosaccharomyces bailii.
Remarque : Une confirmation est possible par examen microscopique :
Dekkera possède des cellules de petite taille, dont certaines ont une forme
ogivale caractéristique.
Zygosaccharomyces bailii : Se développe sur la gélose nutritive WL
en 4 jours, donnant de petites colonies lisses et butyreuses, de forme
circulaire et de couleur crème. Se développe sur la gélose de lysine mais pas
sur la gélose différentielle WL. Un halo jaunâtre est souvent présent autour
des jeunes colonies.
Remarque : en cas de développement dans du vin mis en bouteille, produit
des groupes bruns de 0,5 - 1 mm. Ses cellules ne sont pas de forme ogivale.
OIV-MA-AS4-01 : 2010
42
Bactéries acétiques : Se développent sur la gélose nutritive WL, en
donnant des colonies brillantes et intensément vertes, d'une taille allant de
petite à celle d'une pointe d'aiguille, et qui sont fortement positives au test à
la catalase. (Remarque – ce milieu n'est pas approprié à leur comptage).
Bactéries lactiques : Se développent sur la gélose nutritive WL en
10 jours, en donnant des colonies catalase-négatives claires de la taille d'une
pointe d'aiguille. (Remarque – ce milieu n'est pas approprié à leur
comptage).
6.2 Identification des colonies de bactéries lactiques.
Les colonies de BL sont translucides et d'une taille allant de celle d'une
pointe d'aiguille à quelques mm. Elles sont à Gram-positif et catalasenégatives. Oenococcus oeni se développe sous forme de courtes chaînes, les
pédiocoques forment des tétrades et diplocoques, les lactobacilles forment
des bacilles longs ou courts.
6.3 Identification des colonies de bactéries acétiques.
Les colonies de BA sont catalase-positives et à Gram négatif, et sont
fortement acidogènes : ceci se traduit par une zone claire autour de leurs
colonies dans les milieux contenant du carbonate de calcium ou par une
couleur différente si le milieu contient un indicateur de pH. Leurs cellules
sont des coques ou des bacilles, en général légèrement plus grandes que
celles des BL.
OIV-MA-AS4-01 : 2010
43

Analyse microbiologique des vins et des moûts

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