atelier de formation en biologie moleculaire et

ATELIER DE FORMATION EN BIOLOGIE
MOLECULAIRE ET GENETIQUE VEGETALE
Dakar (Sénégal), du 19 au 28 novembre 2012
RAPPORT FINAL
1er Atelier LAPSE 2012
Sommaire
I. Contexte scientifique………………………………………………………………2
II. Objectifs…………………………………………………………………………..3
III. Résumé du contenu de la formation……………………………………………...3
IV. Bénéficiaires de la formation et procédure d’admission………………………....4
V. Organisation de l’atelier…………………………………………………………...4
VI. Déroulement détaillé de l’atelier de formation…………………………………...6
1. Conférences plénières…………………………………………………………...6
2. Travaux Dirigés de Bioinformatique……………………………………………8
3. Présentation par les étudiants de leur projet de recherche………………………8
4. Travaux pratiques de Biologie Moléculaire et Génétique végétale…………......8
A. TP N° 1 : Analyse de l’expression et clonage d’un gène…………………....9
B. TP N° 2 : Génétique de la biodiversité ……………………………………..12
VII. Soutien financier et appui logistique………………………………………….....16
VIII. Conclusions……………………………………………………………………..18
Annexe 1 : Programme de l’atelier
Annexe 2 : Liste des étudiants participant à l’atelier de formation
Annexe 3 : Questionnaire de satisfaction des étudiants
Annexe 4 : Conférence débat de Michel Morange au Centre Culturel Français et au Lycée
Jean-Mermoz.
-1-
1er Atelier LAPSE 2012
I. Contexte scientifique
L'augmentation de la pression démographique sur les ressources naturelles des
pays sahéliens, la déforestation et la surexploitation des terres cultivées ont fragilisé les
sols facilitant ainsi les processus d'érosion hydrique et éolienne (réduction de la fertilité
chimique et biologique). Ainsi, l’agriculture en Afrique de l’Ouest doit relever de
nombreux défis pour être capable de nourrir une population croissante tout en faisant face
à une situation de dégradation de l'environnement (dégradation des sols, diminution de la
biodiversité ...).
Dans un contexte général centré sur la réhabilitation des écosystèmes dégradés et
la sécurité alimentaire en Afrique de l’Ouest, des approches intégrant la biologie
moléculaire et la génétique peuvent permettre de caractériser les gènes clés contrôlant de
nombreux processus biologiques. De plus, nous assistons depuis plusieurs années à une
augmentation exponentielle des données de génomiques rendues public (nombreuses
espèces séquencées, transcriptomes…). L’utilisation coordonnée de la génétique, de la
génomique et de la physiologie moléculaire peut faciliter et accélérer l’identification
et la caractérisation des gènes qui confèrent aux végétaux des propriétés
intéressantes comme la tolérance aux stress hydrique et salin ou l’amélioration de leur
résistance aux pathogènes.
Suite à plusieurs discussions avec nos partenaires, nous constatons qu’il existe
actuellement peu ou pas d’offre de formation en génomique et en génétique végétale en
Afrique de l’Ouest. Ces deux disciplines présentent pourtant un énorme potentiel
d’application en amélioration des plantes. Au cours de l’année universitaire 2010/2011,
un module de génomique végétale destiné aux étudiants du Master BioVeM a été créé.
Des travaux pratiques ont notamment été organisés au centre de recherche de Bel Air en
partenariat avec l’UCAD et le LCM. Ce module a permis de créer une base solide pour
développer en 2012 une Ecole Thématique en Biologie Moléculaire et en Génétique
ouverte à de jeunes chercheurs d’Afrique de l’Ouest.
Ce projet de formation s’inscrit dans le cadre des activités développées par l’IRD
en partenariat avec l’UCAD et l’ISRA via le Programme Prioritaire Régional « Sociétés
rurales, environnement et climat en Afrique de l'Ouest (SREC) ». Cet atelier s’intègre au
volet formation du projet de Laboratoire Mixte International (LMI) «Laboratoire d’étude
de l’Adaptation des Plantes et microorganismes associés aux Stress Environnementaux »
créé en 2012. Cet atelier s’inscrit pleinement dans les activités du LMI LAPSE,
au regard :

de l’importance scientifique et stratégique de la thématique

de nos missions fondamentales : l’atelier s’adresse aux étudiants en y associant les
formateurs ce qui en fait son originalité.
Quatre unités de recherche ont été directement impliquées dans l’organisation de cet
atelier :

L’UMR DIADE (Institut de Recherche pour le Développement / Université
Montpellier II - France)
-2-
1er Atelier LAPSE 2012

L’Unité de Recherche commune en Culture In vitro de l’ISRA (URCI, Dakar Sénégal)

Le Laboratoire Campus de Biotechnologies Végétales de l’UCAD (LCBV,
Dakar - Sénégal)

Le Laboratoire Commun de Microbiologie de l’IRD, l’ISRA et l’UCAD (LCM,
Dakar - Sénégal)
II. Objectifs
Créé en 2012, le LMI LAPSE a pour vocation de soutenir et d’organiser chaque
année un atelier de formation régional. L’objectif de ces ateliers vise au renforcement et à
l’élargissement des champs disciplinaires notamment dans les domaines de la biologie
végétale et microbienne.
Ce premier atelier a ciblé deux domaines essentiels de la biologie des plantes: la
physiologie moléculaire et la génétique des populations chez les plantes. Cet atelier a eu
également pour ambition de rassembler les jeunes chercheurs d’Afrique de l’Ouest
pour initier de nouvelles collaborations. Les objectifs spécifiques de cette formation ont
été les suivants:





rassembler
autour
d’une
thématique
commune
des
chercheurs,
enseignants‐chercheurs et étudiants en thèse, du Sénégal et de la sous‐région,
transférer des connaissances scientifiques et techniques en biologie moléculaire et
en génétique des populations en s’appuyant sur l’expertise des chercheurs et
enseignants‐chercheurs des quatre institutions impliquées : IRD, université de
Montpellier, UCAD et ISRA,
discuter les utilisations potentielles de ces techniques pour la sélection végétale en
général et pour les projets de recherche des étudiants impliqués en particulier.
promouvoir la recherche pour le développement
encourager une dynamique régionale autour de cette thématique dont l’objectif est
de créer un réseau pour faciliter le partage d’information
III. Résumé du contenu de la formation
L’atelier s’est décomposé en :




Une journée de conférences plénières ouvertes au public portant sur des thèmes
de recherches classés prioritaires par l’IRD et nos partenaires. Ces présentations
ont été réalisées par des chercheurs et enseignant-chercheurs français ou
sénégalais spécialistes reconnus dans leur sujet (voir page 7-8).
½ journée de formation en bio-informatique (détail page 9).
½ journée consacrée à la présentation des activités de recherche des étudiants
(détail page 9)
Six jours de travaux pratiques de biologie moléculaires et de génétique des
populations (détail page 10-16).
-3-
1er Atelier LAPSE 2012
Par ailleurs, en partenariat avec le Ministère de l’éducation Sénégalais, l’Institut
français de Dakar et le Lycée Français de Mermoz deux conférences suivies d’un débat
ont été présentées par Michel Morange (Professeur à l’ENS, voir annexe 4).
IV. Bénéficiaires de la formation et procédure d’admission
Suite à l’appel à candidature via le site internet de l’IRD (http://senegal.ird.fr/larecherche/projets-de-recherche/environnement-et-ressources/premier-atelier-deformation-en-biologie-moleculaire-et-genetique-vegetale-destinee-aux-jeunes-chercheursd-afrique-de-l-ouest), cinquante et un candidats originaires d’Afrique de l’Ouest et
Centrale ont déposé un dossier constitué d’une fiche de candidature, accompagnée d’un
curriculum vitae, d’un résumé de leur travaux de recherche et d’une lettre de motivation.
Un comité scientifique (voir page 5) composé de membres de l’UCAD, de l’ISRA
et de l’IRD a été chargé d’évaluer les différents dossiers de candidature des étudiants.
Chaque dossier a été confié à deux membres différents du comité. Puis une réunion a été
organisée pour établir les listes principale et complémentaire des candidats. Plusieurs
critères ont été retenus pour attribuer une note sur 20 points, notamment la formation
suivie et la situation professionnelle.
Ainsi vingt quatre étudiants en master II ou en thèse, originaires de neuf pays
différents d'Afrique de l’Ouest et Centrale, ont ainsi suivi cette formation (voir Annexe 2).
V. Organisation de l’atelier
La réussite de cet atelier de formation repose en grande partie grâce à l’action
coordonnée de plusieurs comités composés par des chercheurs, enseignants-chercheurs et
techniciens issus des trois organismes associés dans ce projet de formation. Les deux
premières journées se sont déroulées au campus de l’UCAD II, puis la formation pratique
a eu lieu au centre de recherche de Bel Air au sein des laboratoires URCI et LCM.
Coordinateurs Dr. Antony Champion :
UMR 232 DIADE, Institut de Recherche pour le Développement (IRD)
Laboratoire Commun de Microbiologie IRD/ISRA/UCAD
Centre de Recherche de Bel-Air BP 1386 CP 18524 Dakar Sénégal
[email protected]
Dr. Diaga Diouf :
Université UCAD, Laboratoire Campus de Biotechnologies Végétales
Département Biologie Végétale, Faculté des Sciences et Techniques
B.P.5005, Dakar Sénégal
[email protected]
Comité d’organisation Dr. Diaga Diouf
Dr. Ndjido Kane
Dr. Antony Champion
UCAD
ISRA
IRD
-4-
1er Atelier LAPSE 2012
Comité Scientifique Pr. Amadou Bâ
Dr. Antony Champion
Dr. Diaga Diouf
Dr. Diegane Diouf
Dr. Aboubacry Kane
Dr. Laurent Laplaze
Dr. N. Yacine B. Ndour
Pr. Ibrahima Ndoye
Dr. Saliou Fall
Dr. Djibril Sane
Dr. Mame Ourèye SY
IRD (LSTM/LCM)
IRD (DIADE/LCM)
UCAD (LCBV)
UCAD (LCM)
UCAD (LCM)
IRD (DIADE/LCM)
ISRA (URCI)
UCAD (LCM)
ISRA (LCM)
UCAD (LCBV)
UCAD (LCBV
Equipe Pédagogique IRD, Sénégal
Dr. Barnaud Adeline
Maïmouna Cissoko
Kristelle Gray
Jésaëlle Piquet
Dr. Tania Wade
(DIADE/URCI)
(LCM)
(DIADE/LCM)
(DIADE/URCI)
(LCM)
ISRA, Sénégal
Dr. Ndjido Kane
(URCI)
UCAD, Sénégal
Dr. Abdala Diedhiou
Dr Diaga Diouf
LCM
LCBV
IRD, Montpellier – France
Dr. Yves Vigouroux
Dr. Valérie Hocher
Julien Lavenus
Leila Zekraoui
Christine Tranchant
DIADE
DIADE
DIADE
DIADE
DIADE
Equipe Logistique IRD, Sénégal
Francis do Régo
Anna Konte
Jean Bakhoum
Paul Tendeng
Mathieu Faye
LCM
LCM
LCM
LCM
LCM
ISRA, Sénégal
Marie-Claire Dasilva
LCM
UCAD, Sénégal
Maurice Sagna
LCBV
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1er Atelier LAPSE 2012
VI. Déroulement détaillé de l’atelier de formation
1. Conférences plénières
Le 19 novembre 2012, s’est tenu au Campus UCAD II de l’Université Cheikh
Anta Diop à Dakar, l’ouverture de l’atelier sous la présidence de Mr Serigne Amadou
Ndiaye Doyen de la Faculté des sciences et Techniques et en présence de Mr Georges De
Noni Représentant de l’IRD, de Mr Alioune Fall Directeur Scientifique de l’ISRA, de Mr
Ibrahima Ndoye Co-directeur du LMI LAPSE et de Mr Eric Coignard Attaché de
Coopération de l’Ambassade. Environ 90 personnes étaient présentes pour cette journée
conférencière.
Suite à l’ouverture, cinq conférences ont été données :
- Pr. Michel Morange (ENS, France)
La place des génomes dans la compréhension du vivant.
Le XXe siècle aura été, selon les mots de la philosophe Evelyn Fox Keller, le
siècle du gène, depuis la redécouverte des lois de Mendel en 1900 jusqu’à l’achèvement
du séquençage du génome humain à la fin des années 1990.
Je rappellerai dans la première partie pourquoi les gènes et les génomes ont pris
progressivement cette place centrale dans l’explication des phénomènes du vivant. Dans
la seconde, je montrerai comment, en s’appuyant sur cette connaissance des génomes, les
travaux actuels visent à atteindre une description plus intégrée des phénomènes du vivant,
et à mieux prendre en compte la longue histoire qui a donné aux organismes leurs
caractéristiques actuelles.
- Dr. Valérie Hocher (IRD, France)
La transcriptomique : des plantes modèles aux plantes tropicales.
Le séquençage de génomes entiers de plus en plus complexes a conduit tout
naturellement à s’intéresser aux produits de ces gènes, les ARNm. Ainsi, le transcriptome
est l'ensemble des ARNm issu de l'expression d'une partie du génome d'un tissu cellulaire
ou d'un type de cellule. La caractérisation et la quantification du transcriptome dans un
tissu donné et dans des conditions données permettent d'identifier les gènes actifs, de
déterminer les mécanismes de régulation d'expression des gènes et de définir les réseaux
d'expression des gènes. Une des techniques les plus utilisées pour mesurer simultanément
le niveau d'expression d'un grand nombre de types différents d'ARN messager est celle de
la puce à ADN. Cependant, l'avènement récent des nouvelles techniques de séquençage
haut débit est en cours de révolutionner notre approche de la transcriptomique. En effet,
l'utilisation de plus en plus fréquente des techniques de RNA Seq permet d'obtenir de
résultats de plus en plus performant et leur coût devenant de plus en plus bas permet leur
application à des espèces autres que les espèces modèles.
Cette présentation fera le point sur les techniques de séquençage haut débit applicables à
l'analyse du transcriptome et sera illustrée par quelques exemples d’analyse du
transcriptome chez les plantes tropicales.
- Dr. Baboucarr Manneh (AfricaRice, Sénégal)
Amélioration végétale du riz pour la tolérance aux stresses abiotiques
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1er Atelier LAPSE 2012
- Pr Diaga Diouf (UCAD, Sénégal)
Analyse du complexe Phaseolus-Vigna à l’aide des outils de la génomique et de la
bioinformatique
Les genres Phaseolus et Vigna appartiennent tous à la famille des Fabaceae, tribu
des Phaseoleae. Dans ces genres 5 et 25 espèces cultivées qui jouent un rôle économique
majeur ont été répertoriées respectivement chez Phaseolus et Vigna d’où la nécessité de
réaliser des études taxonomiques. De nos jours, les études basées sur la morphologie ou la
restriction de l’ADN chloroplastique n’ont pas donné de résultats satisfaisant au point de
vue systématique pour séparer les deux genres. Pour pallier cela, nous avons réalisé une
étude basée sur le séquençage des ITS 1 et 2 de l’ADN nucléaire et les régions TrnL-F de
l’ADN chloroplastique. Nos résultats montrent un regroupement des Vigna asiatiques
avec un bootstrap élevé tandis que la forme cultivée Vigna unguiculata ssp unguiculata se
regroupe avec son putatif géniteur sauvage Vigna unguiculata ssp dekindtiana. Par contre
les espèces appartenant au sous genre Sigmoïdotropis s’incrustent dans le groupe des
Phaseolus. Ces résultats ont été confirmés par l’analyse des données obtenus avec les ITS
seuls, TrnL-F seul ou en combinaison ce qui laisse supposé que la systématique du genre
Phaseolus mérite d’être revisitée.
- Pr Ibrahima NDOYE (UCAD, Sénégal)
Valorisation de la technologie de l’inoculation par des microorganismes symbiotiques
L’inoculation (apport en masse au niveau de la plante) de micro-organismes
symbiotiques (rhizobiums et champignons mycorhiziens sélectionnés), technique simple,
peu coûteuse et respectueuse de l’environnement, fait partie des innovations
technologiques qui pourraient permettre de contribuer à la sécurité alimentaire des
populations rurales par l’augmentation des rendements des cultures et des niveaux de
production. Ces deux types de symbiotes permettent aux plantes qui en bénéficient de
s'approvisionner en éléments nutritifs (N et P) très souvent limitant dans les sols des
régions arides et semi-arides, et une meilleure survie en conditions de stress (déficit
pluviométrique, salinité, attaque par des parasites, notamment).
Cette biotechnologie issue de la recherche n’est malheureusement pas pratiquée en
Afrique de l’Ouest. Plusieurs paramètres sont en cause (1) manque de connaissances des
acteurs de la recherche de la dynamique organisationnelle des organisations de
producteurs et inversement des utilisateurs potentiels (2) absence de diffusion de cette
technologie, et (3) informations encore insuffisantes sur le comportement des microorganismes dans le sol.
L’objectif est donc de contribuer à lever les contraintes évoquées à travers une
utilisation par les organisations paysannes des microorganismes sur la base de la
promotion d’un itinéraire technique respectueux de l’environnement et un partenariat
entre structures de recherche (Laboratoires de Microbiologie) et Organisations des
Producteurs agricoles en Afrique de l’Ouest.
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1er Atelier LAPSE 2012
2. Travaux Dirigés de Bioinformatique
Photo 1 : Travaux Dirigés de Bioinformatique
Ce TD a été organisé au centre
de mesure de l’UCAD. Une
salle équipée de 25 ordinateurs
connectés à internet a été mise à
disposition des étudiants. Une
bioinformaticienne
(Chistine
Tranchant) de l’unité DIADE
soutenue par un professeur de
l’UCAD et une chercheuse de
l’IRD ont accompagné les
étudiants dans leurs travaux
Le programme de ce TD fut le suivant :
Cours :
- Introduction à la bioinformatique appliquée à la génomique végétale
- Utilisation des ressources bioinformatiques disponibles sous le web et des banques de
séquences publiques (NCBI)
TD: NCBI, Genome browsers
- Recherche de séquences dans les banques de données publiques
- Visualisation des annotations d’un génome (Genome Browser)
- Recherche d'homologie (blast)
-Recherche de marqueurs de type SSR et définition des amorces (TRF, primer3)
3. Présentation par les étudiants de leur projet de recherche
Photo2 : Session poster des étudiants
Les étudiants ont présenté leurs
travaux de recherche au cours d’une
session poster à l’UCADII de
l’Université de Dakar. Ces échanges
scientifiques ont permis aux étudiants
et aux formateurs de mieux se
connaître et de cerner les besoins des
étudiants en matière de Biologie
Moléculaire
et
de
Génétique
Végétale.
4. Travaux pratiques de Biologie Moléculaire et Génétique végétale
Les 24 étudiants ont été séparés en deux groupes de douze pour suivre durant trois
jours soit les TP de Biologie Moléculaire soit les TP de Génétique Végétale puis les
étudiants ont alterné entre les TP. Les TP de biologie moléculaire ont été suivis au sein du
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1er Atelier LAPSE 2012
laboratoire LCM et les TP de Génétique des plantes ont été organisés au laboratoire de
l’URCI du centre de recherche de Bel Air.
Responsable du TP Biologie Moléculaire : Dr. Valérie Hocher
Maïmouna Cissoko, Dr. Tania Wade, Julien Lavenus et Krystelle Gray
Responsable du TP Génétique Végétale : Dr. Ndjido Kane
Leila Zeikraoui, Dr.Adeline Barnaud et Jesaelle Piquet
Photo 3 et 4 : TP de biologie moléculaire et génétique végétale.
A. TP N° 1 : Analyse de l’expression et clonage d’un gène
Objectifs:
Pour connaitre la fonction d’un gène, il est fondamental de connaître son niveau
d’expression. Il peut être différent en fonction des organes, ou bien dans différents types
cellulaires, ou même dans certains compartiments cellulaires d’une même cellule. Son
niveau d’expression peut être modifié en cas de mutation, mais également par des facteurs
environnementaux. Ce niveau d'expression se mesure de différentes manières qui ont été
rappelées dans le cours N°1.
Le clonage moléculaire, est un ensemble de techniques d'isolation et de
reproduction de gènes, ou de fragment de gène, ou d’un cDNA. Une fois purifié, le gène,
est introduit (cloné) dans un vecteur de clonage (plasmide). Cela permet de le conserver
mais aussi de le multiplier en introduisant le vecteur contenant le gène dans une bactérie
ou un autre unicellulaire simple. Ces organismes ayant, en effet, la propriété de se
multiplier rapidement, par simple division cellulaire, ils vont être à l'origine d'un clone de
cellules contenant toutes une copie de ce gène.
Ce gène pourra, selon les besoins, être amplifié en vue d’un séquençage ou
exprimé en vue de la production de la protéine associée à ce gène.Différentes stratégies de
clonages existent et dépendent du gène que l’on souhaite cloner, du matériel disponible
(banque d'ADNc, ARN, ADN génomque,...). Ceci a été expliqué dans le cours N°2.
Dans ce TP, nous avons proposé de mesurer l'expression du gène par une approche
de RT-PCR semi-quantitative. Le clonage de ce gène a ensuite été réalisé. Ce gène code
pour une enzyme de la famille des protéinases à sérine identifié dans l'espèce C. glauca.
Pour réaliser ce clonage, l'ARN de racines mycorhizées et de racine non infecté de C.
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1er Atelier LAPSE 2012
glauca a été extrait suivi par une reverse transcription pour obtenir de l'ADN
complémentaire. C'est à partir de ce matériel que les étudiants ont réalisé le clonage.
Cours 1 : « Analyse de l’expression des gènes : utilisations de la PCR quantitative »,
Valérie Hocher
Cours 2 : « Stratégies de clonage de gènes », Julien Lavenus
Résumé des expériences réalisées au cours des TP de Biologie Moléculaire :
1) Expression du gène CgCL1917
Vous avez réalisé une PCRsemi
quantitative
pour
comparer l'expression du
gène CgCL1917 entre des
racines
et
des
racines
mycorhizées.
Voici le gel obtenu après la
PCR semi-quantitative.
Interpréter les résultats.
Corrigé:
On cherche à quantifier et comparer le niveau d'expression du gène CgCL917 entre
racines mycorhizées et racines non mycorhizées.
Pour cela on a réalisé une PCR avec des amorces spécifiques du gène que nous
souhaitons analyser (CL1917) sur de l'ADNc obtenu à partir de racine Myc+
(Mycorhizées) et Myc- (Non mycorhizées).
Pour vérifier que ce que nous verrons est bien du à une différence entre échantillons et
pas à un problème de manipulation, on réalise en parallèle une PCR avec des amorces
Ubiquitine sur chacun des échantillons. L'Ubiquitine est un gène de ménage et doit
s'exprimer de la même façon entre les 2 échantillons.
A la fin de la PCR, on fait migrer le produit obtenu sur gel d'Agarose 1,5% (Photo).
On observe le même profil pour Ubi entre les 2 échantillons. Ceci est normal et montre
qu’il n’y a pas eu d’erreur de pipetage.
Pour CL1917, on observe un profil différent entre Myc+ et Myc-. On observe la présence
d'une bande amplifiée à 150 pb dans les Myc+. Cette amplification n'est pas visible avec
Myc-.
On a donc bien expression différentielle de CL1917 entre les Myc+ et les Myc-.
Une PCR semi-quantitative permet donc de visualiser des différences de niveau
d’expression de gènes entre différentes conditions biologiques.
Remarque: dans notre cas nous avons fait 35 cycles de PCR car nous savions que ce gène
n'était pas du tout exprimé dans Myc-.
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1er Atelier LAPSE 2012
Dans le cas où nous aurions voulu étudier l’expression d’un gène exprimé dans les deux conditions mais à
des niveaux différents, il aurait fallu diminuer le nombre de cycles de PCR pour éviter d'atteindre le
"plateau de PCR" (fin de PCR quand les réactifs s'épuisent).
2) Vous avez réalisé le clonage du gène CgCL1917.
Voici la photo du gel obtenu après
migration des produits issus de la PCR
sur colonie.
Que voyez vous sur ce gel? Expliquer.
La bande obtenue dans les puits 1,2,3,4
à une taille de 440 pb. Est ce normal,
pourquoi?
Corrigé:
Suite à la première PCR, on a purifié le
fragment de gène amplifié correspondant à
CL1917. On a effectué le clonage de ce
fragment dans un plasmide. Puis on a
transformé des bactéries compétentes afin d'intégrer le plasmide dedans et ainsi pouvoir
le répliquer et en obtenir une grande quantité.
A l'issue de la transformation on a repéré les colonies qui ont poussé. Pour être sûr que
ces colonies contiennent le fragment, on réalise une PCR sur colonie en utilisant des
amorces placées dans le plasmide (Voir carte, amorces M13). Ainsi on amplifie le
fragment (150pb) + une partie du vecteur soit au total 440pb.
On fait migrer le produit de PCR et on observe (photo) que les colonies 1 à 4 présentent
toutes une bande amplifiée à 440pb ce qui est donc attendu. La transformation a donc
bien marché, et chacune des 4 colonies testées possèdent un plasmide ayant intégré le
fragment.
3) Digestion du plasmide
Voici le résultat de la digestion par
EcoR1 du plasmide contenant l'insert.
Que pouvez vous dire de cette
expérience?
Quelle est votre conclusion par
rapport au clonage que vous avez
réalisé.
Corrigé:
Après
la
vérification,
de
la
transformation, on a réalisé une culture bactérienne de 3 mL pour pouvoir propager le
plasmide. Le plasmide a ensuite été purifié par MiniPrep. On a obtenu une grande
quantité de plasmide. On souhaite vérifier la présence de l'insert, on a donc réalisé une
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1er Atelier LAPSE 2012
digestion du plasmide avec une enzyme de restriction (ECORI). Cette enzyme reconnait
des sites de restrictions spécifiques placés de part et d'autre du fragment inséré (Voir
carte du plasmide). A l'issue de la digestion on observe 2 bandes : une de grande taille
qui correspond au plasmide et une de taille environ 200 pb qui correspond à notre insert
(150pb) plus les quelques bases allant jusqu'au site de restriction.
En conclusion, ce clonage a bien fonctionné puisque nous avons obtenu des plasmides
avec l'insert et des colonies de bactérie ayant intégré le plasmide contenant l'insert.
B. TP N° 2 : Génétique de la biodiversité
La diversité génétique se réfère à la variation des gènes au sein des espèces, c'està-dire la variation héritable dans et entre les populations d’organismes. Des nouvelles
variations génétiques se créent continuellement dans les individus par des mutations
chromosomiques ou géniques, qui se propagent par recombinaison chez les organismes à
reproduction sexuée. La variation génétique est aussi influencée par la sélection. Les
conséquences de ces phénomènes sont des changements dans les fréquences de gènes et
d’allèles qui jouent sur l’évolution des populations. Des situations semblables peuvent se
produire par sélection artificielle comme l’amélioration des plantes.
Objectif du TP : Mise en évidence de la diversité génétique du mil et QTL
Nous disposons d’échantillons végétaux issus d’un croisement de variétés de mil.
Des QTL ont été identifiés dans la région du gène du Phytochrome C, porté par le
chromosome 2. Un QTL a été mis en évidence sur la longueur des chandelles. Un second
QTL se trouvant dans cette même région, est associé à une floraison précoce.
Un croisement a été réalisé entre une variété de mil cultivée et du mil sauvage. Les
individus issus de ce croisement ont été génotypés sur un certain nombre de loci, Des
individus recombinants ont été identifiés dans la région de PhyC. Ces individus ont été
mis en autofécondation, afin de créer une lignée, permettant la réalisation de mesures
morphologiques à plus grande échelle. Les données morphologiques ont été collectées.
Nous disposons de plusieurs marqueurs microsatellites (microsatellites IRD59 et
PSMP2237), ainsi qu’un SNP (single nucleotide polymorphism), localisé dans le gène de
PhyC, et mise en évidence par la présence d’un site de restriction de l’enzyme Pvu II. IRD
59 présente des allèles de taille de 144 ou 151 pb
PSMP 2237 présente des allèles de taille de 236 ou 257 pb
PhyC présente une taille de 799 pb, et la digestion par Pvu II donne un fragment de
697pb et un de 102 pb chez un des allèles.
A partir des résultats obtenus, nous tenterons de réaliser le profil génétique de ces
individus recombinants, nous les comparerons aux résultats des mesures morphologiques,
et nous tenterons d’affiner la région associée au QTL portant sur la taille des chandelles.
Nous procéderont en premier lieu à l’extraction d’ADN, de plusieurs descendants
de ce croisement, puis nous amplifierons par PCR, deux marqueurs microsatellites
encadrant le gène PhyC.
Parallèlement, nous effectuerons une PCR sur un fragment de séquence du gène PhyC,
contenant le SNP : C/G (ou C/C, CG, GG, GC). Nous réaliserons une digestion
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1er Atelier LAPSE 2012
enzymatique à l’aide de l’enzyme Pvu II, qui coupe lorsque la séquence comporte la
substitution G.
Cours 1 : « L es marqueurs moléculaires »
Cours 2 : « Initiation à la génétique des populations »
Cours 3 : « Gestion de l’agrobiodiversité »
1) Extraction d’ADN végétal.
Chaque étudiant a extrait un échantillon d’un plant de mil. L’échantillon est
broyé dans un mortier, il subit ensuite une phase de lavage des lipides et lipoprotéines
dans du chloroforme, puis après précipitation et lavage à l’éthanol, permettant
l’élimination de la majorité des débris protéiques, l’échantillon est resolubilisé dans du
tampon de conservation.
Les étudiants ont ensuite réalisé un gel d’agarose à 1%, afin de visualiser l’ADN
extrait et quantifier globalement, avant de faire une dilution de travail.
La migration a été écourtée en raison de l’heure tardive de migration, mais on peut voir
que l’ADN extrait présente une bande de haut poids moléculaire. Les extractions ont été
bien réussies dans l’ensemble.
2/ Génotypage des échantillons de mil
Nous avons procédé en premier lieu à l’extraction d’ADN, de plusieurs descendants de ce
croisement, puis nous amplifierons par PCR, deux marqueurs microsatellites encadrant le
gène PhyC.
Parallèlement, nous avons effectué une PCR sur un fragment de séquence du gène PhyC,
contenant le SNP : C/G (ou C/C, CG, GG, GC). Nous réaliserons une digestion
enzymatique à l’aide de l’enzyme Pvu II, qui coupe la séquence lorsqu’elle comporte la
substitution G.
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1er Atelier LAPSE 2012
PCR sur le marquer SSR
Les fragments de PCR ont ensuite été déposés sur gel d’agarose à 2%. Chaque groupe
devait déposer cinq échantillons dans l’ordre : deux extraits par eux, les trois
échantillons fournis (B6C1,B2E4 et B5A10), ainsi qu’un témoin négatif de PCR (sans
ADN).
Les PCR ont fonctionné, mais l’on remarque la présence de bandes parasites sans doute
du fait du changement de thermocycleur.
Les deux bandes du marqueur IRD 59 ne sont pas très distinctes sur la photo.
PCR du fragment de gène PhyC et RFLP
Nous avons amplifié un fragment du gène PhyC d’une longueur de 799 paires de bases.
Nous savons que l’enzyme Pvu II coupe le fragment amplifié de phyC à la base 697
lorsque la substitution C/G existe. Le résultat de la digestion donnera donc des fragments
de taille : 697 et 102 pb en présence de la substitution C/G.
Site de coupure de Pvu II : CAG/CTG
Les résultats des échantillons anonymes fournis aux étudiants, n’ont pas été exploitables.
- 14 -
1er Atelier LAPSE 2012
Ils ont donc travaillé sur les échantillons fournis et dressé le tableau des résultats
obtenus.
Ech : B13B10, B5A10, B6C1
Résultats :
Profils
B13B10
B6C1
B5A10
IRD38
1 (AA)
3 (AB)
2 (BB)
IRD59
1 (AA)
3 (AB)
2 (BB)
PhyC
3 (AB)
3 (AB)
2 (BB)
CTM3
3 (AB)
3 (AB)
2 (BB)
2237
3 (AB)
1 (AA)
3 (AB)
Ces résultats leur ont permis de voir d’une part que les individus présentent un génotype
différent, c'est-à-dire des séquences d’ADN différentes au sein d’une même espèce.
D’autre part, que des événements de recombinaison ont eu lieu dans cette région
chromosomique.Un phénotype est associé à chaque accession, ils ont pu en déduire la
région du QTL.
Cela leur a permis de comprendre l’intérêt de l’utilisation des marqueurs moléculaires,
des RFLP, et de savoir les utiliser.
D’appréhender la diversité génétique, au sein d’une même variété, et la stratégie
permettant d’associer un caractère morphologique à une région chromosomique.
- 15 -
1er Atelier LAPSE 2012
VII. Soutien financier et appui logistique
Cette formation a été soutenue par de nombreux organismes partenaires et
financeurs pour un montant total de 30 825 € (voir Figure 1). Les partenaires ont été les
suivants :
- AIRD-ATS : Agence IRD Atelier Thématique Structurant
- IRD-LMI-LAPSE : Laboratoire Mixte International ««Laboratoire d’étude de
l’Adaptation des Plantes et microorganismes associés aux Stress
Environnementaux ».
- Fondation Agropolis
- Africarice
‐ IRD-UMR DIADE : Unité Mixte de Recherche Diversité Adaptation et
DEveloppement des plantes
- Ambassade de France (Sénégal et Niger)
- PPR-SREC : Programme Prioritaire Régional « Sociétés rurales, environnement
et climat en Afrique de l'Ouest
- WAPP : West Africa Agricultural Productivity Program
- IRD-UMR RPB : Unité Mixte de Recherche Résistance des Plantes aux
Bioagresseurs
Il est également important de noter que cet atelier a bénéficié de l’appui de deux
plateformes technologiques (Biologie Cellulaire et moléculaire et Génétique Moléculaire
Végétale) localisées sur le centre de recherche de Bel Air et soutenues par le LAPSE. De
plus, l’IRD, l’ISRA et l’UCAD ont appuyé l’organisation de cet atelier via l’implication
de personnels techniques et administratifs, d’enseignant-chercheur et de chercheurs.
WAAPP IRD-UMR RPB
2%
2%
AIRD-ATS
31%
Ambassade de France
(Niger)
5%
AIRD-PPR SREC
6%
Ambassade de France
(Sénégal )
7%
Africarice
10%
IRD- LMI LAPSE
16%
IRD-UMR DIADE
8%
FONDATION
AGROPOLIS
13%
Figure 1 : Répartition du soutien financier des différents partenaires
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1er Atelier LAPSE 2012
Une part importante de ce budget a permis de financer le transport des étudiants
originaires d’Afrique de l’Ouest et Centrale (Figure 2). Le poste principal de dépenses
concerne essentiellement les frais de déplacements des étudiants et des intervenants. Ce
poste de dépenses représente 72 % du budget si l’on comptabilise le coût des billets
d’avion, les per diem (indemnités de mission) et le coût d’hébergement. Il est à noter que
chaque étudiants extérieurs à Dakar a bénéficié en plus de la prise en charge de son
transport et de son hébergement, d’une indemnité forfaire pour couvrir les frais non pris
en charge tels que les repas du soir. Les autres dépenses concernent ensuite l’achat de
matériel scientifique pour la réalisation des différents travaux.
2%
7%
6%
BILLETS AVION
FRAIS DE MISSION
8%
47%
EQUIPEMENT/COMMANDES
REPAS
TRANSPORT
12%
DIVERS
HEBERGEMENT
18%
Figure 2 : Répartition des dépenses engagées au cours de l’atelier de formation
- 17 -
1er Atelier LAPSE 2012
VIII. Conclusion
La co-organisation de l’atelier entre l’IRD, l’UCAD et l’ISRA a permis d’une part
de mobiliser de nombreux acteurs de la recherche et de l’enseignement et d’autre part de
mettre à disposition les conditions matérielles nécessaires au bon déroulement de cette
formation régionale. Par exemple, les plateformes technologiques soutenues par le
LAPSE ont joué un rôle essentiel dans l’organisation des travaux pratiques en Biologie
Moléculaire et en Génétique. La vocation régionale de cette formation a été largement
assurée grâce aux financements obtenus par le comité d’organisation mais également
grâce au soutien des organismes de rattachement des étudiants (essentiellement pour le
transport). Des améliorations sont toutefois demandées par les étudiants, notamment pour
faciliter les transports entre les différents sites, même si un bus a été mis à leur disposition
durant toute la durée de l’atelier. Il sera également nécessaire de revoir l’organisation
concernant le logement des étudiants. Un seul lieu d’hébergement devrait faciliter le
transport et la communication des informations entre étudiants et avec les encadrants.
Plus de 50 candidatures ont été reçues et évaluées par le comité scientifique
soulignant l’attractivité de cet atelier. L’atelier a permis de réunir durant dix jours 24
étudiants d’Afrique de l’Ouest et Centrale. Ces étudiants d’horizons différents, ayant suivi
des parcours divers et travaillant sur des thématiques essentielles en Afrique de l’Ouest
comme la réhabilitation des sols dégradés, les interactions plantes-microorganismes et la
sélection variétale adaptée aux stress ont été globalement satisfaits de la formation
proposée (voir annexe 4). Toutefois, les étudiants ont souligné la nécessité d’allonger le
temps consacré aux travaux pratiques jugés trop denses dans le contenu. Des besoins en
formation ont également émergé dans d’autres disciplines comme la Bioinformatique
seulement abordée via des travaux dirigés. C’est pourquoi dans le cadre des formations
proposées par le LMI LAPSE, une priorité sera donnée à la formation dans cette
discipline. Des contacts ont d’ores et déjà été pris entre des Bioinformaticiens de l’IRD et
les responsables d’un Master de Bioinformatique et Biomathématique à l’UCAD. La
création du site web consacrée au LAPSE (http://www.lapse.ird.fr/) va permettre aux
étudiants de s’informer sur les prochaines formations, sur les programmes de recherches
développés au sein du LMI et ainsi maintenir et développer des contacts entre jeunes
chercheurs en Afrique de l’Ouest.
Enfin, plusieurs articles ont été consacrés à l’atelier de formation :
- Rapport de synthèse 2012 de la Plateforme Pluridisciplinaire Régionale «Sociétés
rurales, Environnement, Climat en Afrique de l’Ouest », page 11-12
- Newsletter N°7 UMR DIADE, IRD, page 2-3
- Site web du LAPSE (http://www.lapse.ird.fr/vie-du-lmi/1er-atelier-de-formation-enbiologie-moleculaire-et-genetique-vegetale
- 18 -
1er Atelier LAPSE 2012
Annexe 1 : Programme de l’atelier
19/11/2012
20/11/2012
Cérémonie d’ouverture – Conférences plénières
Matin (9h00): Travaux dirigés de Bioinformatique
Après midi : Présentation par les étudiants de leur projet de recherche
Travaux pratiques
21 au 28/11/2012
Groupe 1 (10 étudiants)
Génotypage et analyse génétique
21/11/2012
22/11/2012
23/11/2012
26/11/2012
27/11/2012
28/11/2012
- Extraction ADN
- Vérification et dosage sur gel
Génotypage microsatellite:
- Mise en place PCR
- Lecture sur gel
- Discussion sur la cartographie des
marqueurs
Génotypage d'un gène par PCR et
digestion :
- Mise place PCR
- Digestion enzymatique et lecture sur
gel
- Discussion sur le génotypage et
l'association génotype/phénotype
Clonage et analyse de l’expression
d’un gène d’intérêt
Groupe 2 (10 étudiants)
Clonage et analyses de l’expression d’un
gène d’intérêt
- RT-PCR semi quantitative sur des ADNc
de racines mycorhizées ou non
- analyse sur gel.
- purification du gène d’intérêt,
- ligation dans PGEM-T
- transformation des bactéries
- PCR sur colonies
- Extraction d'ADN plasmidique et
digestion enzymatique
- analyse sur gel
Cartographie et analyse de la diversité
- Extraction ADN
- RT-PCR semi quantitative sur des - Vérification et dosage sur gel
ADNc de racines mycorhizées ou non
- analyse sur gel.
Génotypage microsatellite:
- Mise en place PCR
- Lecture sur gel
- Discussion sur la cartographie des
marqueurs
Génotypage d'un gène par PCR et
- PCR sur colonies
digestion :
- extraction d'ADN plasmidique et
- Mise place PCR
digestion enzymatique
- Digestion enzymatique et lecture sur gel
- analyse sur gel
- Discussion sur le génotypage et
l'association génotype/phénotype
Cérémonie de clôture
- purification du gène d’intérêt,
- ligation dans PGEM-T
- transformation des bactéries
- 19 -
1er Atelier LAPSE 2012
Annexe 2 : Liste des étudiants participant à l’atelier de formation
NOM BOURGOU DIEDHIOU FALL FATONDJI GUEYE IDI GARBA IDI SAIDOU KIKAKEDIMAU NAKWETI KOUAKOU KOUDAMILORO LEYE EL HADJI MENDONÇA PEREIRA NGOM NIASS OUATTARA PRODJINOTO SANTOS SOW TARPAGA TCHOTET TCHOUMI TOVIGNAN WEMBOU WONNI ZOSSOU KOUDERIN PRENOM PROVENANCE SEXE Larbouga Issa Fatoumata Blandine Mallé Nana Mariama Sani Rufin Koffie Augustin Malick Armando Antonio Mariama Ousmane Bassiaka Hermann Landri Gildas Carline Adama W. Vianney James Michel Thierry Esso Nan P Issa Norliette Burkina Faso Sénégal Sénégal Benin Sénégal Niger Niger RDC Cote Ivoire Benin Sénégal Guinée bissau Sénégal Sénégal Burkina Faso Benin Benin Sénégal Burkina Faso Cameroun Benin Togo Burkina Faso Benin M M F F M F M M M M M M F M M M F M M M M M M F ORGANISME RATTACHEMENT INERA UCAD/IRD UCAD AFRICARICE ISRA UAMN UAMN CGEA CNRA AFRICARICE LNRPV /ISRA INPA UCAD UCAD CERAAS UCAD/IRD AFRICARICE EISMV INERA IRAD CERAAS UNIVERSITE LOME INERA/IRD UCAD - 20 -
1er Atelier LAPSE 2012
Annexe 3 : Questionnaire de satisfaction des étudiants
Périmètre de Certification
« Formulaire d’analyse
du questionnaire
Etudiants »
24 Étudiants interrogés
Questions
Identification : FAqe
Date : 26.06.2011
Indice de revision : 1.0
Nombre de pages : 01
Analyse du Questionnaire satisfaction étudiants
20 réponses obtenues
Très
Satisfait
Moyennement Pas
satisfait
satisfait
satisfait
Ne se
pronnonce
pas
Le respect du
9
11
programme et des
objectifs
L’équilibre entre
6
13
1
apports théoriques et
apports pratiques
Le contenu
9
11
pédagogique de la
formation
La clareté des
10
10
explications
Les supports remis
8
3
9
L’accueil,
9
3
6
2
l’organisation et les
équipements sur le lieu
de la formation
La durée de la
4
10
6
formation
Par quel moyen étiezUniversité : Internet : Encadreurs :
vous au courant de
3
12
5
cette formation
Attention : Au moment où ils remplissaient le questionnaire, les étudiants n’avaient pas encore
recu les supports de cours (clé USB).
Conclusion: Pour l’ensemble des étudiants, le programme a été respecté et il ya eu un parfait
équilibre entre les apports théoriques et les apports pratiques. Les explications étaient très claires
également. Certains étudiants auraient également souhaité être formé en Bioinformatique, en QPCR et en phylogénie. La durée de la formation était très courte, vu le contenu du programme,
deux semaines de TP auraient été appropriées. Autant l’accueil et les équipements sur le lieu de
formation ont satisfait la plupart autant l’organisation n’a pas satisfait notamment en ce qui
concerne le transport à Dakar, l’hébergement et la restauration le soir (diner). Des problèmes dans
la communication ont été soulignés.
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1er Atelier LAPSE 2012
Annexe 4 : Conférence débat de Michel Morange au Centre Culturel Français et au
Lycée Jean-Mermoz.
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