Evolutions de la cryoconservation

Cryogénie
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Evolutions de la cryoconservation
Roel van den Bosch, Cryogenic Industry Consultant. Version française Labtec Services AG
Histoire
La cryogénie s’est développée au 19ème siècle à partir
d’expériences scientifiques sur la liquéfaction des gaz
permanents. Parmi les gaz permanents connus, l’oxygène
et l’azote, comme principaux constituants de l’air, sont les
plus importants. Pour la liquéfaction des gaz, le chimiste
écossais James Dewar (1842–1923)
a joué un rôle important. C’était lui
qui, en 1892, réalisa la première
bouteille isotherme pour la conservation et le transport de gaz
liquides. Ce genre de bouteilles
sous vide est toujours en usage et
certaines continuent de porter
Récipients Dewar de
le nom de leur inventeur Dewar.
première génération
Cryoconservation
C’est un processus où sont conservés par ex. des cellules ou tissus par refroidissement
à des températures cryogéniques, comme -196°C (point d’ébullition de l’azote liquide).
Sous ces températures, toute vie biologique est éteinte. Si la matière conservée n’est
pas bien protégée contre la formation de glace en dehors des cellules, la déshydratation
ou la formation de glace dans les cellules, elle sera souvent affectée durant le processus
de congélation et/ou de fonte ce qui influe négativement sur sa viabilité.
Les cryoprotecteurs, la congélation progressive et la fonte contrôlée sont des moyens
et mécanismes pour réduire les dommages causés par le gel.
Azote liquide (Liquid Nitrogen LN2)
L’azote liquide est un liquide cryogénique relativement peu coûteux et donc communément utilisé pour différents processus cryogéniques. L’azote gazeux (N2) constitue une
grande partie de l’atmosphère (78.03%). Sous pression atmosphérique, l’azote gazeux (N2)
se condense (se liquéfie) à une température de -196°C et gèle à -210°C. L’azote liquide est
inactif, incolore, noncorrosif, incombustible et extrêmement froid. L’évaporation de très
petites quantités de liquide produit de grandes quantités de gaz.
D’un litre de LN2 résultent 700 litres de N2 gazeux.
Conservation de liquide
Depuis son invention par James Dewar en 1892, ce Dewar continue d’être utilisé pour
une conservation à long terme dans l’azote liquide.
La cryoconservation dans l’azote liquide à une température de -196°C était pendant
des décennies la méthode privilégiée pour la cryoconservation. Bien que l’immersion
de matière dans l’azote liquide et son retrait soit un travail dangereux et désagréable,
c’était néanmoins longtemps la seule méthode disponible pour conserver de la matière
biologique à une température inférieure au point de recristallisation de l’eau (PR).
Ce point avoisine une température d’env. -135°C.
James Dewar 1842 — 1923
Cryogénie
La cryogénie est la science de la production et de la
recherche des conditions de températures basses. Le
terme cryogénie est dé-rivé du mot grec « kryos » (κρύος)
pour gel, glace. Dans la cryogénie comme discipline
scientifique, le terme cryogénique s’applique aux températures qui vont de -100°C jusqu’au zéro absolu (-273°C).
A l’époque, on savait déjà que les cellules restent
viables et inchangées même à long terme quand
on les conserve à une température de -196°C,
soit 60 degrés d’écart du point de recristallisation et donc supérieure à la température
où les cristaux de glace peuvent causer des
dommages irréver-sibles. En outre, la conservation constante à -196°C assurait le meilleur
gradient de température possible, ce qui
prévenait les dommages dus aux variations
de température.
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Conservation dans l’azote liquide
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Contamination croisée et maladies contagieuses
L’azote liquide est, comme tous les liquides, un vecteur potentiel de matières contaminantes. Au cours d’une longue période de cryoconservation, la glace s’accumule dans
les récipients Dewar et cette glace présente éventuellement un risque de contamination
microbienne des échantillons. Elle s’accumule également dans le LN2, audessus d’un
Dewar ouvert, dans l’atmosphère. Cette glace tombe dans l’azote liquide présent dans
le récipient ou la glace se forme sur les surfaces froides du Dewar ou sur le récipient
introduit dans le LN2. Une telle quantité croissante de cristaux de glace inclut d’autres
contaminants tels que bactéries, spores et des particules de saleté dans l’azote liquide.
De plus, il existe le risque que l’azote liquide devienne lui-même le vecteur de contaminations biologiques parmi les échantillons conservés. On a des preuves claires de la transmission de l’hépatite B entre des échantillons congelés de moelle osseuse dans
un récipient d’azote liquide ce qui a causé une infection clinique chez des patients transplantés (Teddar et al. 1995 ; Fountain et al. 1997).
Des processus aseptiques appropriés et d’autres règles de laboratoire sont évidemment la base de la protection des échantillons mais on ignore ou sous-estime souvent
l’éventuelle pénétration de l’azote liquide dans les tubes pendant l’immersion. Sous
des conditions irréprochables, les récipients modernes peuvent bien sembler parfaits
et étanches mais le fabricant de ces fioles n’a pas de contrôle sur la manipulation au
niveau du bouchon. C’est aussi la raison pour laquelle la plupart des fabricants de tubes
d’échantillon demandent de ne pas immerger leurs produits dans l’azote liquide.
De ce point de vue, un défaut d’étanchéité est possible même pour les fioles les plus
modernes. Outre la détérioration du plastique de la fiole et du matériel du bouchon due
aux températures cryogéniques, le plus grand risque est lié aux chutes de pression survenant lors du refroidissement des récipients de 200°C. Une quantité de gaz donnée est
déterminée par sa pression, son volume et sa température, selon l’équation : pV = nRT.
Lorsque la température baisse lors de l’immersion dans l’azote liquide, la pression dans
les récipients se réduit
également ce qui cause
une importante différence
de pression avec pour effet
la péné-tration de l’azote
liquide dans les fioles. Ce
sera notamment possible
si le bouchon n’est pas
correctement vissé,
présente un joint déformé
ou est serré trop fort.
Outre le risque de
Tubes d’échantillons et boîtes en polycarbonate
contamination croisée,
pour la conservation à -196°C
la pénétration de l’azote
liquide peut déclencher
une explosion lorsque les récipients arrivent au laboratoire et l’azote atteint vite le point
d’ébullition dans cet environnement.
Remarque : Lors de la transformation de LN2 en N2,
il survient une dilatation x 700.
Lors de la première apparition du VIH/SIDA dans les
années 1980, le risque de contami-nation croisée lié à la
conservation dans l’azote liquide causait de plus en plus
de soucis. Plus tard, ces craintes se sont avérées justifiées
(Bielanski et al. 2000) : en cas d’une contamination de
l’azote liquide par un virus, les embryons conservés dans
des récipients non-scellés dans l’azote peuvent être
infectés par ces virus.
Nous pouvons enfin constater que le VIH/SIDA ainsi
que d’autres maladies contagieuses ont occasionné le
passage de la conservation traditionnelle dans l’azote
liquide vers celle dans la vapeur d’azote.
Conservation « phase vapeur »
La conservation des échantillons dans la vapeur d’azote
liquide élimine le risque de contamination croisée due
à l’azote liquide. Ce type de conservation se fait le plus
souvent dans les mêmes récipients réfrigérants
(type Dewar ou auto-remplissants) que l’on utilise pour la
conservation usuelle dans un liquide. Pour la conservation
en phase vapeur, le niveau de LN2 dans le récipient est
réduit à un tiers et les supports avec les échantillons sont
séparés du liquide au moyen d’une plateforme ou bien on
n’utilise pas les positions tout en bas (se trouvant dans le
liquide) pour la conservation des échantillons.
Conservation en phase vapeur dans un récipient standard
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Conservés dans la vapeur, les échantillons n’entrent
pas en contact avec le LN2, mais à ce grand avantage
s’opposent d’importants inconvénients tels que :
1. Capacité de stockage réduite, car la partie où
se trouve le LN2 ne peut pas être utilisée.
2. La température de la vapeur dépend trop
du niveau de LN2.
3. Il existe la possibilité de grands gradients
de température verticaux.
Lorsque la matière biologique n’est pas conservée à des
températures inférieures au point de recristallisation des
solutions aqueuses (env. -130°C à -140°C ; Mazur, 1970),
la viabilité se détériore au cours d’une conservation à
long terme.
Cela peut être acceptable pour des produits congelés en
grande quantité où une viabilité un peu réduite ne pose
pas de problèmes pratiques, pour des échantillons plus
précieux c’est toutefois problématique.
L’objectif est normalement de conserver les échantillons
à une température bien infé-rieure au point de recristallisation : plus l’écart entre ce point et la température
donnée est grand, plus la conservation est sûre.
Malheureusement, de nombreux systèmes conventionnels
présentent de grands gradients de température où il est
bien possible que des échantillons soient exposés à des
températures supérieures au point de recristallisation.
En outre, certaines matières sont affectées par des
variations de température même entre -130°C et -190°C.
Les hybridomes (cultures cellulaires de cellules hybrides)
sont un exemple connu pour leur sensibilité lors de
variations constantes de température.
Evolutions récentes
-190°C conservation à sec
Toutes les anciennes méthodes de la conservation cryogénique reposent au fond sur
l’invention de James Dewar, donc sur un type de conservation en usage pendant plus
d’un siècle. Entretemps, des progrès ont été faits, par ex. au niveau des cultures
cellulaires. Il suffit de penser aux nouveaux milieux et aux nouvelles techniques de
préparation des échantillons – mais finalement le tout est introduit dans un Dewar à
azote liquide. On a fait de grands efforts pour augmenter la viabilité de la matière conservée mais peu de choses ont changé en ce qui concerne la conservation cryogénique.
En 2000, un fabricant américain de congélateurs pour la conservation cryogénique
(Custom Biogenic Systems) a conçu le premier système pour conservation à sec à -190°C,
au fond la première innovation importante pour la conservation cryogénique depuis les
jours de James Dewar.
Ce nouveau système de conservation utilise le même récipient sous vide que les congélateurs conventionnels mais au lieu de l’azote liquide dans le réservoir, LN2 se trouve dans
les parois de cet appareil. Outre la réduction ainsi obtenue du risque d’une contamination
croisée par le LN2 (absence de LN2 dans le réservoir), on a pu installer une circulation d’air
permettant, en combinant la convection du sol et des parois, d’obtenir une température
très stable d’environ -190°C. Ceci et le fait que tout l’espace intérieur est disponible pour
Une température de conservation constante avec le
plus grand écart avec le point de recristallisation et
un meilleur gradient possible est la solution idéale.
Les congélateurs en phase vapeur conventionnels
n’assurent pas ces conditions idéales. Quelques produits
ont été complétés avec des relais thermiques pour augmenter l’évaporation du LN2 pour réduire la température
vapeur mais ces dispositifs n’augmentent pas seulement
la consommation de LN2 et la formation de glace autour
du couvercle, ils n’atteignent toujours pas la stabilité et
la température requises pour une excellente conservation
à long terme.
Système de conservation au sec à LN2 dans le carter
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la conservation feront de cette méthode le processus
cryogénique préféré.
Ouverture d‘entrée de vapeur
Manteau rempli
d’azote liquide
circulation
de vapeur LN2
Il existe bien sûr aussi des congélateurs mécaniques
pouvant atteindre des températures cryogéniques.
Les fabricants tels que Thermo et Sanyo mettent sur
le marché de tels appareils où aucun contact avec le
liquide ne peut survenir. Ces appareils appartiennent donc
à la catégorie « conservation à sec ». La seule différence
entre ces systèmes mécaniques de conservation à sec
et les appareils non-mécaniques est que la température
la plus basse est de -152°C pour les uns et de -192°C
pour les autres.
Directives européennes
Tous les gouvernements européens ont entamé des
démarches sérieuses au sujet de la contamination croisée
ainsi que la viabilité réduite dues à de grands gradients
de température verticaux pendant la cryoconservation.
Notamment au regard des tissus et cellules humains,
le Conseil de l’Union Européenne a publié la directive
2006/17/CE du Parlement européen du 8 février 2006 sur les standards de qualité et
sécurité relatifs au don, à l’obtention, aux essais, à la conservation, au stockage et à la
distribution de cellules et tissus humains. Le délai de mise en œuvre a expiré en avril
2006.
L’article 20.3 de cette directive prévoit que les institutions ajoutent des prescriptions
spéciales à leurs procédures standard pour prévenir la contamination d’autres tissus
et cellules.
Au cas où des cellules et tissus humains seraient chez vous toujours conservés/
immergés dans l’azote liquide, il serait sans doute grand temps de réfléchir à une
nouvelle stratégie de conservation.
L’article 21.3 de cette directive prévoit que les institutions conçoivent et appliquent
des processus pour éviter toute situation susceptible d’influer négativement sur les
fonctionnalités ou l’intégrité de tissus et de cellules.
Au cas où les tissus et cellules seraient toujours conservés à une température en phase
vapeur éventuellement trop élevée ou à gradient trop grand, nous vous recommandons
d’établir une analyse des risques.
Grâce à leur plage de température d’env. -190°C, les
systèmes de conservation à sec ont sans aucun doute
un grand avenir. Ils offrent les avantages du LN2
(température stable, à 60°C du point de recristallisation)
sans ses inconvénients (contamination croi-sée par le LN2
et la manipulation dangereuse par l’utilisateur).
Conclusions
Pendant 100 ans, la cryoconservation était synonyme
de la conservation dans l’azote liquide. Le nombre
croissant de maladies contagieuses a favorisé la
transition de la conservation en phase liquide vers
la con-servation en phase vapeur. Tandis que le
développement des techniques, milieux et cryoprotecteurs a contribué à améliorer la viabilité, la
transition vers la conservation en phase vapeur aux
grandes variations de température verticales a à son
tour causé une réduction de la viabilité.
En conséquence du problème mentionné ainsi que
d’une analyse des risques en raison des nouvelles
directives européennes, on est en transition vers
de nouveaux systèmes de conservation à -190°C,
appareils cryogéniques spécifiquement conçus pour
le travail sans azote.
Résumé
L’évolution de la cryoconservation est allée de
la conservation en phase liquide à la conservation
en phase vapeur et poursuit son évolution vers la
conservation à sec à -190°C.
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