Dosage d`antigènes en phase hétérogène

L’immunoenzymologie
Technique puissante couramment utilisée en recherche et en
diagnostic
Basée sur la très grande spécificité des anticorps pour leurs
antigènes
) Test qualitatif
Détection de protéines après électrophorèse : Western-blot
Détection de protéines sur une coupe histologique
) Test quantitatif
Dosage d’antigènes
Dosage d’anticorps
ELISA (direct, compétitif…)
EMIT
Principe de la réaction
Composé coloré
Spectrophotométrie
complexes
Ag-traceur + Ac
Ag + Ac-traceur
Ac-Ag-traceur
signal
Ag-Ac-traceur
Composé
fluorescent
fluorimétrie
Emission de lumière
substrat
luminescence
1. l’anticorps primaire
Anticorps primaire
Anticorps primaire
Ag
Ag
Ex: Méthode ELISA compétition
Histologie : immunofluorescence directe
Espèces chez qui l’anticorps primaire peut-être obtenu :
souris, lapin, rat, chèvre…
Isotype IgG
2. l’anticorps secondaire
Anticorps secondaire
Ex :
Ag
Immunoglobuline dirigée contre la
partie Fc de l’anticorps I et produit chez
une autre espèce que cet anticorps I
Ac I = IgG lapin
Ac II = IgG de chèvre anti-IgG de lapin
Ag
Ag
Détection du complexe Ag-AcI-AcII
Ac secondaire conjugué
Avantage du système :
amplification du
signal
3. Les composés conjugués
Les enzymes
Enzyme d’oxydoréduction La peroxydase du raifort (« Horseradish peroxydase »,
HRP)
Enzymes hydrolytiques
Les radio-isotopes
Phosphatase alcaline
β-galactosidase
Principalement l’iode-125 et le tritium (H3)
Les fluorophores
Principalement en microscopie (rhodamine, FITC)
4. Le système (strept)avidine-biotine
Avidine: glycoprotéine du blanc d’œuf
(66 000 daltons)
4 sites de liaison pour la biotine
Streptavidine : protéine synthétisée par
Streptomyces avidinii (60 000 daltons)
Biotine : vitamine H
Système d’amplification des signaux
Affinité (strept)avidine-biotine est extrêmement élevée (10-15M) (supérieur à AgAc: 10-13M)
Enz
Enz
B
Av
B
B
Av
B
B
B
+ Substrat
Enz
Ag
Ag
Ag
Ag
Signal
Les différentes méthodes
Détection
Antigène
Phase hétérogène
ELISA compétition
Dosage
Phase homogène
Anticorps
Western blot,
immunohistochimie
Phase hétérogène
Immunométrique
(ELISA sandwich)
EMIT (Enzymes
Dosage
Multiplied
Immunoassay Technique
Dosage
Immunométrique
de type ELISA
Phase hétérogène: l’étape de blocage (saturation)
Les supports physiques utilisés ont une affinité élevée pour les
protéines
Dépôt
d’antigène
Dépôt
d’anticorps
Plaque ELISA
Membrane nitrocellulose
Les protéines adsorbées sur le
support n’occupent qu’une
petite fraction de la surface
Nécessité d’occuper l’espace afin d’éviter des fixations non spécifiques
d’anticorps et/ou d’antigènes
• Sérum Albumine
Ac II
• Lait en poudre
• Collagène
Détergent doux
(tween20)
Ac I
Protéines inertes
Ag
Détection d’antigène: Western-blot
From Molecular Cell Biology by Harvey Lodish et al.
http://www.life.umd.edu/classroom/bsci423/song/Lab12.html
)
)
Détection de protéines
Détermination du poids moléculaire
Etape 1: séparation des protéines
selon leur poids moléculaire
SDS-PAGE : Sodium DodécylsulfatePolyAcrylamide Gel Electrophoresis
Etape 2: Transfert des protéines sur un support solide
(membrane de nitrocellulose)
http://mit.edu/7.02/virtual_lab/PBC/PBC5virtuallab.html
http://employees.csbsju.edu/hjakubowski/classes
/ch331/Techniques/TechElectrophoresis.htm
Etape 3: Incubation avec
les anticorps et révélation
http://www.life.umd.edu/classroom/bsci423/song/Lab12.html
From Molecular Cell Biology by Harvey Lodish et al.
Révélation par émission de lumière et
impression de films photographiques :
Electrochemiluminescence (ECL)
Révélation colorimétrique
de bandelettes
Dosage d’antigènes en phase hétérogène
1. Méthode ELISA compétition (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Compétition à l’Ag marqué
Ag recherché de petite taille (hormones, médicaments)
Ac I fixé
E
E
Ag marqué (quantité fixe)
E
c Réalisation d’une courbe
d’étalonnage avec des solutions d’Ag de
concentrations connues
d Dosage avec le sérum du patient.
Détermination de la concentration
d’Ag contenu dans le sérum à l’aide de
la courbe étalon
Intensité signal
Ag à doser (non marqué;
quantité variable)
Courbe
d’étalonnage
1
10
100
1000
[Ag] non marqué ng/ml
Compétition à l’Ac marqué
Eliminés par lavage
Ag à doser
(quantité variable)
Ag fixé
E
E
E
+
E
E
E
E
E
Ac marqué
(quantité fixe)
A l’équilibre de la réaction Ag-Ac, l’anticorps s’est réparti entre l’Ag à
doser et l’Ag fixé
Plus l’Ag à doser est abondant, moins l’Ac marqué peut accéder à la
phase solide
2. Dosage immunométrique de type sandwich
Ag circulant dans le sérum et divalent (ex: Ag bactériens, viraux, parasitaires)
Méthode ELISA sandwich (100 fois plus sensible que ELISA compétition)
+
+
Intensité signal
Ag divalent
recherché
Signal augmente en fonction de la
concentration d’Ag
E
1
10
100
1000
[Ag] pg/ml
E
+
Substrat
Signal
Dosage d’antigènes en phase homogène
Technique EMIT = Enzyme Multiplied Immunoassay Technique
Méthode de recherche d’antigènes de petite taille (drogues, médicaments…) dans
les échantillons biologiques (sang, urine…) – méthode compétitive et automatisable
(couramment utilisée dans les laboratoires de toxicologie)
Ag recherché
Substrat de l’enz
Ac
Ag recherché présent
Enz
+
Ag recherché absent
Signal
Dégradation du substrat
Signal Ò
[Ag] Ò
Site catalytique inaccessible
Signal inchangé
Dosage d’anticorps en phase hétérogène
1. Dosage ELISA à l’antiglobuline marquée (ELISA indirect)
Sérodiagnostics bactériens, viraux, parasitaires – recherche d’anticorps dans le
sérum de patients suite à une infection ou une vaccination
Ag fixé
Ac sérique recherché
+
+
E
Intensité signal
Ac secondaire marqué
E
+
Substrat
1
Signal
10
100
[Ac]
1000
2. Recherche des IgM spécifiques d’un Ag donné
Immunocapture des IgM totales
IgM non spécifique
Ag
E
+
Ag
IgM spécifique
E
Substrat
Signal
Sériodiagnostic du VIH
Protéine d’enveloppe gp120 et
gp41 (précurseur gp160)
14
21
Gène env
Protéine de nucléocapside p24
Gène gag
Protéine de Transcriptase inverse
p32, p55, p65
Gène pol
Cinétique de détection des
marqueurs de l’infection VIH
Le sérodiagnostic de l’infection à VIH
Test ELISA (en première intention)
Western-blot (en confirmation d’une séropositivité VIH)
Test ELISA sandwich
(ELISA de 3ème génération)
Ag VIH
Ac anti-VIH recherché
Test ELISA de 4ème génération
VIDAS® HIV DUO ULTRA (Biomérieux)
Ac antip24 fixé
Ag p24
E
E
Enz
+ substrat
Ac anti-p24
marqué
Ag VIH marqué
E
Enz
Ag VIH
Signal Ò [Ac anti VIH] Ò
(IgG et IgM)
Ac anti-VIH
E
Ag VIH marqué
Western-blot
Mise en évidence des Ac anti-VIH du patient
1. Séparation des protéines virales par SDS-PAGE
2. Transfert sur bandelette de nitrocellulose
3. Incubation avec le sérum du patient
4. Révélation avec un anticorps anti-IgG humain marqué
La présence de bandes révèle l’existence d’anticorps dirigés
contre des Ag du VIH dans le sérum du patient
Positif si reconnaissance de gp160,
gp120 et au moins une protéine pol
(p32, p65 ou p55) ou une protéine
gag (p24 ou p18)
c Bandelette positive
d Bandelette négative