trichomonose

CHAPITRE 2.4.17.
TRICHOMONOSE
1
RÉSUMÉ
La trichomonose génitale bovine est due à Tritrichomonas fœtus, un protozoaire flagellé parasite.
Elle est connue dans le monde entier et a présenté, autrefois, une importance économique majeure
comme cause d’avortement et d’infertilité, en particulier en élevage bovin laitier. L’usage répandu
de l’insémination artificielle dans plusieurs régions du monde a contribué à réduire la prévalence de
la maladie. La trichomonose est cependant encore élevée dans les troupeaux où l’insémination
artificielle n’est pas utilisée.
La transmission de la maladie a lieu essentiellement lors du coït, mais une transmission mécanique
par les instruments d’insémination ou au cours de l’examen gynécologique peut avoir lieu. Le
parasite peut survivre dans le sperme total ou dilué, conservé à 5 °C. Les taureaux sont les
réservoirs principaux de la maladie dans le sens où ils tendent à être porteurs à long terme, alors
que beaucoup de vaches éliminent l’infection spontanément. Pour ces raisons, les prélèvements
sur taureaux sont utilisés de préférence pour le diagnostic et le contrôle de la maladie dans les
troupeaux.
Identification de l’agent pathogène : Tritrichomonas fœtus est un flagellé, protozoaire piriforme
parasite, de 8 à 18 µm de longueur et 4 à 9 µm de largeur approximativement, avec 3 flagelles
antérieurs et un flagelle postérieur, bordant une membrane ondulante. Les organismes se
déplacent avec un mouvement saccadé et onduleux. Ils sont visibles dans des épreuves sur culture
d’échantillon préputial de taureau infecté et dans les lavages vaginaux ou le mucus cervico-vaginal
de vache infectée, ou parfois dans les fœtus avortés. Tritrichomonas fœtus peut être cultivé in vitro,
et peut être vu sur une lame sertie humide ou colorée. La méthode de diagnostic de référence pour
les taureaux associe la récolte, l’examen et la mise en culture appropriés de smegma du prépuce
et du pénis. Le smegma peut être prélevé par des méthodes variées incluant le lavage préputial ou
le raclage de la cavité préputiale et du gland du pénis au niveau du fornix avec une pipette à
insémination sèche. Un certain nombre de milieux de culture in vitro existent qui peuvent être
2
préparés au laboratoire, mais une épreuve de culture sur le terrain disponible dans le commerce
permettant la croissance des trichomonas et l’examen microscopique direct est largement utilisée
dans certaines parties du monde.
Épreuves de substitution : la trichomonose bovine peut aussi être détectée par amplification par
réaction d’amplification en chaîne par polymérase (PCR). Dans le passé, une épreuve
d’agglutination utilisant du mucus prélevé au niveau du col utérin et un antigène préparé à partir
d’organismes de culture ont été utilisés comme épreuve sur troupeau. De même, une épreuve
intradermique utilisant un précipité d’acide trichloracétique du parasite a été utilisée dans les
troupeaux.
Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique :
un vaccin à partir de cellules entières tuées partiellement efficace est disponible commercialement
soit sous forme monovalente, soit faisant partie d’un vaccin polyvalent contenant Campylobacter et
3
Leptospira .
1
2
3
880
Nomenclature des maladies parasitaires: voir la note dans le chapitre 2.4.18., « Trypanosomoses (transmises par la
mouche tsé-tsé) ».
lnPouch™ TF Test, BioMed Diagnostics, White City, Oregon, États-Unis d’Amérique.
Trich Guard ou Trich Guard V5-L, Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, Iowa, États-Unis d’Amérique.
Manuel terrestre de l’OIE 2008
Chapitre 2.4.17. — Trichomonose
A. INTRODUCTION
La trichomonose génitale bovine est causée par un protozoaire flagellé parasite, Tritrichomonas fœtus. Les hôtes
naturels de T. fœtus sont les bovidés (Bos taurus, B. indicus). Des espèces non-pathogènes de trichomonas se
rencontrent dans l’intestin des bovins ; T. suis du porc est morphologiquement, sérologiquement et, par les
analyses moléculaires modernes, génétiquement semblable à T. fœtus (15, 49). Une caractérisation génétique
complémentaire est indispensable pour déterminer le statut taxonomique des souches isolées de bovins ou de
porcs.
Tritrichomonas fœtus est pyriforme, de 8 à 18 µm de longueur et de 4 à 9 µm de largeur, avec 3 flagelles
antérieurs et un postérieur, ainsi qu’une membrane ondulante. Les parasites vivants se déplacent avec un
mouvement saccadé, ondulant, et peuvent être détectés au microscope optique. La microscopie en contraste de
phase en lumière noire ou d’autres méthodes doivent être utilisées pour observer les détails nécessaires à son
identification. Des descriptions morphologiques détaillées, incluant des études en microscopie électronique, ont
été publiées par Warton et Honigberg (52). Il est important de différencier T. fœtus des autres protozoaires
flagellés contaminants qui pourraient être présents dans des échantillons de l’appareil reproducteur des bovins
(4, 7, 38, 50). En contraste de phase, le nombre de flagelles observés est une caractéristique importante qui peut
aider à différencier T. fœtus de certains flagellés de bovins qui peuvent apparaître semblables. Une technique par
coloration a été décrite qui peut être utilisée pour observer plus clairement la morphologie et faciliter
l’identification définitive (30).
Tritrichomonas fœtus se multiplie par division binaire longitudinale et une reproduction sexuée n’est pas décrite.
Des stades du parasite résistants dans l’environnement n’ont pas été observés.
Dans quelques études anciennes, 3 sérotypes ont été reconnus, basés sur l’agglutination (47) : la souche
« belfast » serait prédominante en Europe, en Afrique et aux USA (23) ; la souche « brisbane » en Australie (13) ;
et la souche « manley », qui a été rapportée seulement dans quelques foyers (47). Des travaux complémentaires
doivent être réalisés dans le domaine de la comparaison des caractéristiques de croissance, de la variation
génétique et antigénique d’isolats de T. fœtus issus de différentes zones avant que les termes de « souches » et
de « sérotype » puissent être établis et utilisés en toute confiance.
Tritrichomonas fœtus peut être cultivé in vitro, de préférence en milieu de Diamond (11), de Clausen (23) ou en
milieu Trichomonas, qui est disponible dans le commerce (45). Une épreuve de terrain disponible dans le
commerce qui tient compte de la croissance des trichomonas et de l’examen microscopique direct sans aspiration
TM
du milieu inoculé a été développé aux USA (46, 51) (InPouch TF, voir note de bas de page n°2).
La transmission de l’infection se fait lors du coït, d’une insémination artificielle, ou d’un examen gynécologique
des vaches. Le site d’infection des taureaux est primitivement la cavité préputiale (1, 40), et les manifestations
cliniques qui en découlent sont faibles ou absentes. Pour les taureaux âgés de plus de 3 à 4 ans, la guérison
spontanée a rarement lieu et ils deviennent une source permanente d’infection dans le troupeau. Chez les
taureaux de moins de 3 à 4 ans, l’infection peut être transitoire.
Tritrichomonas fœtus est présent en faible nombre dans la cavité préputiale des taureaux, avec une certaine
concentration dans le fornix et autour du gland du pénis (24). Le taureau infecté de façon chronique ne présente
pas de lésion macroscopique. Chez la vache infectée, la lésion initiale est une vaginite, qui peut être suivie par
une invasion du col utérin et de l’utérus si la vache devient gestante. Diverses séquelles peuvent en résulter,
incluant une inflammation du placenta qui peut conduire à un avortement précoce (1 à 16 semaines), un
écoulement utérin et un pyomètre. Dans certains cas, malgré l’infection, la gestation ne se termine pas par un
avortement et un veau normal naît à terme. À l’échelle d’un troupeau, les vaches après infection peuvent
présenter des cycles oestriens irréguliers, des écoulements utérins, des pyomètres ou des avortements précoces
(1, 18, 47). Les vaches récupèrent habituellement et deviennent généralement immunes, au moins pour la saison
de reproduction suivant l’infection et l’avortement (1, 18, 49).
B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC
1.
Identification de l’agent pathogène
a)
Identification de l’agent par examen direct ou culture (épreuve prescrite pour les échanges
internationaux)
Un diagnostic provisoire de la trichomonose comme source de désordres de la reproduction dans un
troupeau est basé sur l’histoire clinique, les signes d’avortement précoce, les retours répétés en chaleur, ou
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Chapitre 2.4.17. — Trichomonose
les cycles oestriens irréguliers. La confirmation de l’infection dépend de la mise en évidence des parasites
dans les fluides placentaires, les contenus stomacaux du fœtus avorté, les lavages utérins, les écoulements
de pyomètres, le mucus vaginal ou le smegma préputial. Dans les troupeaux infectés, les matériaux les plus
fiables pour le diagnostic sont les produits soit de lavages soit de raclage préputial ou vaginal (14, 29, 34,
36, 46).
Le nombre d’organismes varie dans différentes situations. Ils sont nombreux dans le fœtus avorté, dans
l’utérus plusieurs jours après l’avortement, et chez les vaches infestées récemment, ils sont abondants dans
le mucus vaginal 12 à 20 jours après infection. Chez les taureaux infectés, T. fœtus est présent sur la
muqueuse du prépuce et du pénis, apparemment sans envahir les tissus sous-muqueux. Il est
généralement recommandé de laisser passer au moins une semaine après la dernière saillie avant de
prélever un échantillon préputial.
•
Collecte d’échantillon
Un certain nombre de techniques de collecte d’échantillons préputiaux chez les taureaux ou d’échantillons
vaginaux chez les vaches ont été décrits. Il est important d’éviter la contamination fécale, car celle-ci peut
introduire des protozoaires intestinaux qui pourraient être confondus avec T. fœtus (50). La contamination
des échantillons devrait être minimisée par le retrait de matériel accessoire et des poils souillés du pourtour
de l’orifice préputial ou de la vulve ; cependant, un décapage de la zone, en particulier avec des
désinfectants, est à éviter, car il peut réduire la sensibilité du diagnostic. Les échantillons peuvent être
collectés chez les taureaux par raclage de la muqueuse préputiale ou pénienne avec une pipette à
insémination artificielle (36, 46) ou une brosse métallique (35, 36), par lavage préputial (46) ou par lavage
du vagin artificiel après collecte de sperme (23). La dernière technique n’est pas recommandée car sa
sensibilité peut être plus faible (23). Les échantillons chez les vaches sont collectés par lavage du vagin, ou
par raclage du col avec une pipette pour insémination artificielle ou une brosse métallique (29, 32).
Si les échantillons doivent être soumis à un laboratoire et ne peuvent pas être délivrés dans les 24 h, un
milieu de transport, avec de préférence des antibiotiques, doit être utilisé (par exemple un bouillon
thioglycollate avec antibiotiques [6, 51], la poche plastique pour culture de terrain, le milieu de Winter, une
solution saline tamponnée avec du sérum de bovin fœtal à 5 %, ou du lait écrémé, avec ou sans
antibiotiques [42]). Durant le transport, les organismes devraient être protégés contre l’exposition à la
lumière et les températures extrêmes, température qui devrait rester supérieure à 5 °C et inférieure à 38 °C
(6).
•
Culture
Des cultures peuvent être réalisées lorsque les parasites sont trop peu nombreux pour permettre une
détection directe et une identification précise. La culture des organismes est habituellement nécessaire
parce que, dans la plupart des cas, le nombre de parasites n’est pas assez grand pour faire un diagnostic
positif par examen direct. Plusieurs milieux peuvent être utilisés. Le milieu pour trichomonas de Diamond, le
kit de culture disponible dans le commerce, le milieu CPLM (cysteine/peptone/Liver-infusion maltose), le
milieu BGPS (Beef-extract/glucose/peptone serum), le milieu de Clausen (Neopeptone-Lemco-liver extract
glucose) et le milieu Trichomonas d’Oxoid sont les milieux de choix (12, 33, 37, 45). L’inoculation des
échantillons dans le milieu de culture devrait être faite le plus tôt possible après la collecte. Pour les
échantillons récoltés par lavage préputial, il est nécessaire de traiter l’échantillon par centrifugation. Le culot
est alors inoculé dans le milieu de culture. Certains protocoles recommandent l’examen direct de l’inoculum
avant inoculation, mais cela n’augmente pas la sensibilité diagnostique. Il est aussi important de s’assurer
que les milieux de culture sont utilisés avant leur date d’expiration, car de nombreux milieux ne sont pas
stables. La qualité de l’eau utilisée est importante et un antifongique peut être ajouté dans les milieux pour
contrôler la croissance des levures.
La détection initiale des organismes peut être faite par microscopie optique, sur une lame sertie humide
préparée directement à partir de l’échantillon ou de la culture, ou grâce aux cupules plastiques du système
TM
TM
InPouch (système InPouch , voir note de bas de page n°2) en utilisant le clip plastique spécialement
fourni. Les organismes mobiles peuvent être regardés à l’aide d’une variété de microscopes à lumière
classiques en utilisant un grossissement de 100 ou plus. Un microscope inversé peut être utilisé pour
examiner des tubes contenant un milieu de culture. Les milieux de culture devraient être examinés au
microscope périodiquement du jour 1 au jour 7 après inoculation (31). Les organismes peuvent être
identifiés sur la base de traits morphologiques caractéristiques. Les organismes en forme de poire ont
3 flagelles antérieurs et un flagelle postérieur et une membrane ondulante qui s’étend presque jusqu’à
l’extrémité postérieure de la cellule. Ils ont aussi un axostyle qui s’étend habituellement au-delà de
l’extrémité postérieure de la cellule. Pour révéler ces caractères, la microscopie en contraste de phase est
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Manuel terrestre de l’OIE 2008
Chapitre 2.4.17. — Trichomonose
très précieuse, ainsi qu’une procédure récemment développée de coloration rapide (30). Ces deux
techniques sont plus efficaces quand un nombre relativement grand d’organismes est présent, spécialement
dans la technique par coloration.
•
Moyens de culture
•
Milieu de Diamond modifié
La verrerie utilisée pour les cultures devrait être lavée avec de l’eau distillée (en évitant l’usage de
détergents). Le milieu de Diamond modifié consiste en : 2 g de trypticase peptone, 1 g d’extrait de
levures, 0,5 g de maltose, 0,1 g de chlorhydrate de L-cystéine et 0,02 g d’acide L-ascorbique, complété
avec 90 ml d’eau distillée contenant 0,08 g de K2HPO4 et 0,08 g de KH2PO4. Il est ajusté à un pH
compris entre 7,2 et 7,4 avec de l’hydroxyde de sodium ou de l’acide hypochlorique. Après l’ajout de
0,05 g de gélose, le milieu est autoclavé pendant 10 min à 121 °C, refroidi à 49 °C, puis 10 ml de
sérum de bovin inactivé (inactivé par chauffage à 56 °C pendant 30 min), 100 000 unités de pénicilline
C cristalline et 0,1 g de sulfate de streptomycine sont ajoutés de façon aseptique. Le milieu est
stérilement distribué en fractions aliquotes de 10 ml dans des flacons à bouchon à vis stériles de
16 × 125 mm et réfrigérés à 4 °C jusqu’à utilisation. Le milieu devrait être cultivé pendant au moins
7 jours, les échantillons étant examinés tous les jours (1, 31). L’incorporation de gélose dans le milieu
limite largement les organismes contaminants dans la partie supérieure milieu de culture, tandis que
des conditions micro-aérophiles sont maintenues dans le fond où les trichomonas se développent en
plus grand nombre.
•
Épreuve de culture sur le terrain
Lorsque l’aspect pratique et la sensibilité doivent être combinés, l’épreuve de culture sur le terrain (voir
note de bas de page n°2) peut être utilisée (1, 5, 37, 46, 51). Elle consiste en une poche plastique
transparente souple avec deux parties. La chambre supérieure contient un milieu spécial dans lequel
l’échantillon est introduit. Les échantillons de terrain pour inoculation directe dans la poche de culture
devraient normalement être collectés par la technique de raclage préputial (1, 46). Les échantillons
collectés par lavage préputial nécessitent une centrifugation avec introduction du culot dans la
chambre supérieure. Après mélange, le milieu est introduit de force dans la chambre inférieure et la
poche est alors scellée et incubée à 37 °C. Un examen direct pour rechercher les trichomonas peut
être fait directement à travers la poche plastique (5). Les résultats diagnostiques avec les échantillons
issus de taureaux utilisant soit le milieu de Diamond soit le kit adapté pour le terrain ont montré que les
deux méthodes donnent des résultats comparables mais il y a certains avantages (dans l’aspect
pratique et dans les résultats de l’épreuve) à utiliser le kit (5, 6, 29, 37, 46).
•
Sensibilité et spécificité globales des épreuves de culture et d’identification
Toute estimation de la sensibilité et de la spécificité diagnostiques d’une épreuve de culture et
d’identification sera dépendante de l’efficacité de la collecte de l’échantillon, de sa manipulation et de son
traitement, aussi bien que de la composition et de la qualité du milieu de culture. Chez les taureaux, la
TM
sensibilité du kit de diagnostic InPouch TF a été estimée à 92 % (avec un intervalle de confiance à 95 %
de 84 à 96 %) (36). Les estimations pour les milieux de Diamond et apparentés ont été variables,
éventuellement à cause de variations dans la composition et la préparation, mais s’étendent de 78 à
99 %. Jusqu’à récemment, il a été considéré que la spécificité d’une épreuve de culture est de 100 %, mais
il est probable que c’est une surestimation.
Tout échantillon prélevé sur un taureau connu comme infecté ne donnera pas nécessairement un résultat
de culture positif. Même dans les conditions optimales d’échantillonnage, de transport, de culture et
d’identification, plus d’un échantillon négatif devrait être obtenu avant qu’il soit raisonnable de considérer
l’animal comme non infecté. Pour estimer la probabilité qu’un animal n’est pas infecté, la valeur prédictive
négative devrait être calculée en utilisant une estimation de la sensibilité de l’épreuve de diagnostic et la
probabilité pré-évaluée d’infection de l’animal (36). L’infection des femelles est habituellement éliminée en
90 à 95 jours ; il peut donc être difficile d’isoler les parasites à partir d’animaux à des stades tardifs de leur
infection. Chez des jeunes vaches infestées expérimentalement, en utilisant la méthode de culture
TM
InPouch TF, une sensibilité apparente de 88 % est atteinte au cours d’une période de 10 semaines
post-infection (29).
Le diagnostic d’avortement induit par T. fœtus peut être relativement facile quand le fœtus avorté est
retrouvé, grâce au grand nombre de parasites mis en évidence dans le contenu abomasal du fœtus ou dans
les fluides placentaires. De plus, des techniques immunohistochimiques et les techniques basées sur l’ADN
peuvent être utilisées pour démontrer l’envahissement tissulaire de T. fœtus dans l’avorton.
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Chapitre 2.4.17. — Trichomonose
b)
Réaction d’amplification en chaîne par polymérase
Les techniques de biologie moléculaire qui utilisent la technologie de réaction d’amplification en chaîne par
polymérase (PCR) ont été développées pour l’identification de T. fœtus (7, 17, 26, 39). Le développement
d’une épreuve de diagnostic par PCR offre un certain nombre d’avantages potentiels, incluant une
augmentation de la sensibilité d’analyse, un délai plus court d’obtention des résultats diagnostiques, et le fait
que les organismes dans l’échantillon collecté ne sont pas nécessairement vivants. Un diagnostic par PCR
comprend à la fois une technique spécifique d’extraction de l’ADN et l’amplification de celui-ci à partir
d’amorces spécifiques par les techniques de la PCR. La sensibilité et la spécificité de ce test dépendent du
choix de la technique d’extraction, du choix des conditions de la PCR et du choix des amorces. Des études
antérieures ont démontré que la PCR est capable de détecter un très petit nombre de parasites issus de
culture de laboratoire en l’absence de matériel préputial (17, 26), ainsi que dans du matériel préputial (17,
26, 39). Cependant, dans les échantillons préputiaux, un nombre élevé de parasites est nécessaire pour
donner un résultat PCR positif, cela étant probablement dû à l’inhibition par les composants du smegma
préputial. Plusieurs techniques d’extraction de l’ADN ont été décrites (17, 26, 39) et il est probable que la
sensibilité de l’épreuve de diagnostic sera influencée par l’efficacité de la méthode d’extraction et les
procédures utilisées pour vaincre les inhibiteurs contaminants. La spécificité diagnostique de l’épreuve par
PCR dépend beaucoup de la spécificité des amorces. Un jeu d’amorces (26) a donné des produits non
spécifiques de taille similaire dans approximativement un tiers des échantillons témoins négatifs (16) et ne
devrait pas être utilisé pour le diagnostic. Un jeu d’amorces basé sur la séquence 5,8 de l’ARN ribosomal a
démontré une bonne spécificité diagnostique dans les échantillons issus d’animaux négatifs (TFR3 et TFR4,
17), et sont les amorces les plus fréquemment citées dans la littérature. Cependant ces amorces produisent
des produits d’amplification à partir de certains autres flagellés étroitement apparentés (Tritrichomonas suis,
T. mobilensis et un trichomonas du chat) qui sont indistincts de ceux de T. fœtus (17, 21). Ces espèces ne
peuvent du reste pas être distinguées au microscope et il est possible que certaines de ces espèces soient
synonymes de T. fœtus. Un travail récent a démontré que ces amorces peuvent être utilisées pour faire la
différence entre T. fœtus et des trichomonas autres que T. fœtus parfois trouvés dans les échantillons
préputiaux (4, 7, 38).
La sensibilité et la spécificité de ces épreuves diagnostiques doivent encore être précisée sur un échantillon
adéquate d’animaux positifs et négatifs, bien que la recherche jusqu’à maintenant laisse à penser que la
spécificité est bonne (7, 43). La sensibilité des tests PCR a été estimée égale à celle du kit de culture
InPouchTM TF (7), mais sur très peu d’animaux. Les techniques PCR sont une solution alternative attrayante
à la microscopie du fait de leur plus grande rapidité et qu’elles permettent aussi la détection des organismes
morts. La validation des techniques PCR devrait être poursuivie et de grands échantillons d’animaux connus
comme positifs ou négatifs devraient être testés. Les techniques basées sur l’ADN sont suffisamment
performantes pour être potentiellement utilisées comme test de première intention ou complémentaires (4,
7, 17, 34, 39) et jouer un rôle clé dans la différentiation des protozoaires trichomonas isolés de l’appareil
reproductif des bovins. Selon une étude récente, plusieurs différentes approches sur la base de travaux
précédents qui utilisaient le couple d’amorces (TFR3 et TFR4 ; [17[) ont diagnostiqué spécifiquement
T. fœtus. Pour faire la distinction entre des organismes considérés comme des contaminants fécaux des
organes de la reproduction des bovins, d’une part, et T. fœtus d’autre part (7), une étude utilisait deux
couples d’amorces, un couple amplifiant l’ADN du groupe trichomonas (TFR1 et TFR2 ; [15]) et l’autre
spécifique de T. fœtus (TFR3 et TFR4 ; [17]). Une alternative proposait d’utiliser les amorces génériques
(TFR1 et TFR2 ; [15]) pour amplifier l’ADN puis de différentier les différentes espèces de trichomonas en
utilisant une analyse RFLP (25). Dans une troisième étude, un autre couple d’amorces a été conçu pour
amplifier des amplicons de tailles différentes à partir de protozoaires trichomonas, permettant ainsi de
distinguer différentes espèces (22). Il a été aussi démontré qu’un test PCR peut être utilisé pour détecter
l’ADN de T. fœtus dans des tissus d’endomètre ou de fœtus avortés fixés dans du formol (2).
2.
Épreuves immunologiques
Plusieurs épreuves immunologiques ont été utilisées dans le passé ou ont été récemment mises au point pour le
diagnostic de la trichomonose bovine. Cependant, leur utilisation est limitée et elles ne sont pas recommandées
pour la détection des infections à T. fœtus chez l’animal individuel. Dans les années 1940, des épreuves
d’agglutination sur mucus et des épreuves de diagnostic intradermique ont été développées mais des problèmes
de sensibilité et de spécificité restreignent leur utilité. D’autres épreuves immunologiques basées sur une
méthode immuno-enzymatique de capture d’antigène sont maintenant en cours de développement (1, 20). Les
techniques immunohistochimiques utilisant des anticorps monoclonaux ont été indiquées pour révéler les
protozoaires T. fœtus dans des tissus fixés dans du formol (43).
a)
Épreuve d’agglutination sur mucus
Une épreuve d’agglutination sur mucus qui détecte environ 60 % des vaches infestées naturellement, avec
des niveaux d’anticorps variant en relation avec le stade de l’oestrus, a été développée dans les années
1940 (28, 41). Les échantillons de mucus sont récoltés dans la région cervicale du vagin, de préférence peu
884
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Chapitre 2.4.17. — Trichomonose
de jours après l’œstrus. Les anticorps apparaissent dans le mucus cervical environ 6 semaines après
l’infection, et persistent pendant plusieurs mois. Les anticorps peuvent aussi être trouvés dans les
sécrétions préputiales (44, 48). L’épreuve d’agglutination sur mucus est plus utile comme épreuve de
troupeau, étant capable de détecter des infections latentes ou récemment éliminée.
Un tube en verre stérile, de 30 cm de longueur, 9 mm de diamètre, et courbé à un angle de
150° approximativement à 9 cm de l’extrémité, ou une pipette pour insémination artificielle devrait être
employé pour prélever l’échantillon cervical. Du mucus contenant du sang ne devrait pas être utilisé et
l’animal devrait être ré-échantillonné. Le sérum contenant des anticorps non spécifiques permettra à
e
l’agglutination d’avoir lieu. Le mucus est dilué au 1/5 avec du soluté physiologique et émulsifié dans un tube
e
e
de Griffith. Des échantillons en double, dilués au 1/10 et 1/20 , sont préparés en pipetant 2 ml de mucus et
2 ml de gélose fondue (à 56 °C au bain-marie) dans les tubes pour la dilution au 1/10e, et 1 ml de mucus,
e
1 ml de soluté physiologique et 2 ml de gélose fondue pour la dilution au 1/20 . Des témoins en double
contenant 2 ml de soluté physiologique et 2 ml de gélose fondue sont aussi préparés. Tous les tubes sont
gardés au bain-marie à 56 °C pendant le mélange puis coulés individuellement dans des boîtes de Petri de
5 cm et mis à refroidir. L’antigène de l’épreuve est préparé en ajoutant lentement une culture de
trichomonas à un mélange 2/1 de soluté physiologique et de bouillon glucosé à 1 % pour atteindre une
concentration approximative de 100 000 organismes/ml (approximativement 6 trichomonas/champ de
microscope au grossissement 400). Ensuite, 1,5 ml d’antigène est ajouté dans chaque boîte de Petri ; les
boîtes sont incubées pendant 1,5 h à 37 °C puis laissées à température ambiante pendant 1,5 h
e
supplémentaire. L’observation d’une agglutination à la dilution de 1/10 est considérée comme positive.
b)
Épreuve intradermique « Tricin »
Une intradermoréaction pour le diagnostic de la trichomonose bovine a été décrite (27). Le site d’injection
est la peau de l’encolure, semblable au site utilisé pour l’épreuve de tuberculination. Une dose de 0,1 ml
d’antigène « Tricin » est injectée par voie intradermique et la réaction est mesurée 30 à 60 min plus tard. La
réaction consiste en une plaque superficielle observée à l’œil nu et montrant une augmentation de plus de
2 mm de l’épaisseur de la peau.
c)
Immunohistochimie sur tissus
Il existe des lésions macroscopiques ou microscopiques sur les fœtus avortés et l’identification des
parasites est nécessaire pour le diagnostic. Une technique immunohistochimique utilisant un anticorps
monoclonal (AcM) pour détecter T. fœtus dans le placenta et les poumons de fœtus issus d’avortement de
bovins, fixés dans du formol et inclus dans de la paraffine, a été rapportée (43). La coloration
immunohistochimique est faite en utilisant un système streptavidine/biotine marqué4 disponible
commercialement et un AcM (34.7C4.4) pour T. fœtus. Dans la procédure, des coupes déparaffinées de
4 µm sont incubées avec l’AcM puis bloquées avec du sérum de chèvre non immun. Après 3 rinçages dans
un tampon, les coupes sont incubées avec une immunoglobuline biotinylée de chèvre anti-souris et
anti-lapin pendant 30 min à 37 °C. À la suite de 3 rinçages supplémentaires dans un tampon, la
streptavidine marquée à la peroxydase est appliquée pendant 30 min à 37 °C, et l’enzyme active est diluée
avec l’AEC à 3 % (3-amino-9-ethylcarbazole) dans du N,N dimethylformamide. Les coupes passent dans
une coloration de contraste avec de l’hématoxyline Gill II pendant 3 min, sont rincées et colorées en bleu
dans un tampon pendant 1 min. Cette méthode a été utilisée pour diagnostiquer les avortements causés par
T. fœtus.
C. SPÉCIFICATIONS APPLICABLES AUX VACCINS
ET AUX PRODUITS BIOLOGIQUES À USAGE DIAGNOSTIQUE
Les vaccins cellulaires entiers pour les vaches ont été présentés comme offrant une protection et sont disponibles
dans le commerce (10) soit comme vaccin « bactérien inactivé » monovalent, soit comme vaccin polyvalent
contenant aussi Campylobacter et Leptospira spp. (Vaccin CL) (Voir note de bas de page n°3). Ces produits se
sont montrés efficaces chez les femelles mais pas chez les taureaux (3). Cela est en contradiction avec des
études plus anciennes en Australie dans lesquelles la protection ou même l’élimination est possible pour les
taureaux recevant des fractions membranaires ou glycoprotéiques de T. fœtus (8, 9). Des anticorps spécifiques
ont été mis en évidence dans du sérum et du mucus vaginal de jeunes vaches inoculées avec un vaccin
contenant T. fœtus (20). Dans cette étude, un vaccin cellulaire entier tué partiellement efficace ne prévient pas
l’infection, mais semble permettre la clearance de l’infection chez les femelles vaccinées avant la période de
gestation où le fœtus présente le plus de risque d’avortement. Des recherches pour des vaccins plus efficaces
qui se servent d’antigènes membranaires de surface issus de T. fœtus sont actuellement réalisées et offrent des
perspectives pour une meilleure efficacité et le développement de vaccin recombinant (10, 19).
4
DAKO Corporation, Carpinteria, California, USA.
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Chapitre 2.4.17. — Trichomonose
Un exemple d’une méthode de production d’un vaccin cellulaire entier est celle qui consiste en la croissance de
T. fœtus (culture VMC-84) dans le milieu de Diamond modifié (10) et la congélation de la culture à –20 °C
pendant 60 min. Après décongélation, une suspension de 5 × 107 organismes/ml dans une solution physiologique
tamponnée au phosphate est ajoutée au vaccin-CL.
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