SOUCHE DE CANDIDA GUILLIERMONDII ISOLÉE DE LA

51
Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 2007, 146, 51-62
SOUCHE DE CANDIDA GUILLIERMONDII
ISOLÉE DE LA SAUMURE DE CAROTTES
PRODUCTRICE D’UNE ß-FRUCTOFURANOSIDASE
EXTRACELLULAIRE (*)
Latifa BOUSMAHA (1), Laarousi ELMOUALDI (1),
Mohammed OUHSSINE (1), Mohamed EL YACHIOUI (1)
Douze souches de levures ont été isolées de la saumure de
carottes en fermentation spontanée. L’une d’entre elles a été
sélectionnée et correspond à Candida guilliermondii. Elle
synthétise une ß-fructofuranosidase extracellulaire, avec une
activité maximale de 1538 µM.l -1.min-1 au bout de 24 h de culture
à 30°C et à pH 5,2 en présence de 5 g/l de saccharose.
INTRODUCTION
Les enzymes saccharolytiques sont utilisées dans l’industrie
alimentaire pour hydrolyser le saccharose en glucose et fructose plus
solubles ce qui permet en confiserie de faire des bonbons dont la partie
centrale reste liquide. L’invertase sert également à fabriquer du miel
artificiel [17].
(*)
(1)
Manuscrit reçu le 06 janvier 2006.
Laboratoire de Biotechnologie, Environnement et Qualité, UFR Amélioration et
Transformation microbienne et végétale, Université Ibn Tofaïl, Faculté des
Sciences, BP 133, 14000 Kénitra, Maroc. [email protected],
[email protected], [email protected], [email protected]
52
L’invertase est produite par une large variété de microorganismes
Il existe des invertases endo et exocellulaires [7 - 8].
L’invertase endocellulaire est obtenue à partir de la levure de bière
(Saccharomyces cerevisiae, S. carlsbergensis) par lyse des cellules en
présence de toluène [17]. Les levures peuvent être utilisées en conjugaison
avec des bactéries lactiques [21] en fermentation végétale. L’hydrolyse du
saccharose peut être réalisée par des bactéries lactiques [5], l’acide lactique
produit ayant l’avantage d’inhiber les germes indésirables.
[3,7,9-11,19,23-24].
L’hydrolyse du saccharose est complexe car de nombreuses
variables conditionnent la productivité : température, pH, agitation, etc. [20].
Le présent travail a pour but l’isolement et la purification à partir de
carottes en fermentation d’une souche de levure saccharolytique possédant
un pouvoir acidifiant et une activité ß-fructofuranosidase élevés et
l’optimisation de ses conditions de prolifération et de production
enzymatique en vue d’une application ultérieure en fermentation contrôlée
des carottes.
MATÉRIEL ET MÉTHODES
Isolement et purification des souches
Des fermentations spontanées sont réalisées par immersion de
carottes bien triées et épluchées dans des saumures à différentes
concentrations de chlorure de sodium (5, 10, 15 et 30 %) pour l’isolement
de levures. Comme toute fermentation végétale, la présence de bactéries
lactiques a été notée.
Les levures ont été isolées sur milieu PDA (Potato Dextrose Agar) à
partir de la saumure des carottes.
Les levures isolées sont purifiées par quatre cycles successifs de
repiquage sur milieu PDA. La pureté des levures est vérifiée au microscope.
La conservation est réalisée sur milieu PDA gélosé incliné en tubes à 4°C
avec un repiquage tous les mois.
Sélection et détermination des souches
Le pouvoir acidifiant des levures purifiées est estimé par mesure du
pH final après incubation 48 h à 30°C dans un milieu semi-synthétique
53
liquide (3 g glucose, 3 g extrait de levure, 1 g (NH4)2SO4, 1 g MgSO 4, 1 g
KH2PO4, q.s.p. 1 l eau distillée) à pH de 5,88 obtenu par addition de NaOH
et d’HCl.
Un milieu de culture synthétique (3 g saccharose, 1 g (NH4)2SO4, 1 g
MgSO4, 1 g KH2PO4, q.s.p. 1 l eau distillée) solide (15 g/l d’agar) stérilisé
15 min à 120°C est utilisé pour la sélection de souches saccharolytiques afin
de favoriser l’utilisation de la source de carbone (saccharose) par les levures
en absence d’extrait de levure. Deux levures ont pu croître sur ce milieu
synthétique.
La levure L2 a été retenue pour la suite du travail. Son identification
est réalisée par galerie API 20C AUX (bioMérieux). Les autres levures ont
été cultivées sur milieu à l’acétate (acétate de sodium 4 g/l, extrait de levure
0,1 g/l) solide (20 g/l agar) 1 à 3 semaines à 30°C pour la détermination des
genres.
Localisation de l’activité fructofuranosidase
Les cultures sur milieu semi-synthétique liquide avec 3 g de
saccharose sont arrêtées après 24 h d’incubation à 30°C. Après
centrifugation 20 min à 12000 g, on obtient le milieu de culture et un culot
contenant les cellules. Une partie des cellules est remise en suspension dans
un tampon phosphate (0,1 M, pH 5) puis lysée par sonication. Une nouvelle
centrifugation à 12000 g aboutit à une fraction soluble et une partie
insoluble.
Le dosage de l’activité enzymatique est effectué pour chaque
fraction selon la méthode de Somogyi [22 ] et Nelson [14 ] : le milieu
réactionnel contient 0,1 ml de chaque fraction (le culot après trois lavages
par le tampon phosphate est suspendu à nouveau dans le tampon), 0,25 ml
de saccharose 0,1 M et 0,15 ml de tampon phosphate. Le milieu réactionnel
est incubé 10 min dans un bain marie à 40°C. La réaction est arrêtée par
addition du réactif de Somogy puis chauffage 15 min dans un bain-marie à
100°C [25] pour précipiter les sucres réducteurs. Un ml de réactif de Nelson,
révélateur colorimétrique, est ajouté après refroidissement et l’absorbance
de chaque échantillon est lue à 540 nm par comparaison avec son témoin
sans saccharose. La quantité de sucres réducteurs est déterminée par rapport
à une courbe étalon et l’activité enzymatique est exprimée en µM.l -1min-1.
54
Optimisation de la croissance cellulaire et de la production enzymatique
Par la suite, un milieu semi-synthétique liquide (5 g saccharose, 3 g
extrait de levure, 1 g (NH4)2SO4, 1 g MgSO4, 1 g KH2PO4, q.s.p. 1 l eau
distillée) est utilisé pour la mise en évidence des conditions optimales de
croissance de la levure et de biosynthèse de l’enzyme. L’incubation est
réalisée 24 h à 30°C à pH 5,2 par défaut. Diverses conditions ont été
testées :
- concentration de saccharose (0,5, 1, 3, 5, 7 et 10 g/l) ;
- source carbonée à 5 g/l (glucose, fructose, lactose, maltose, mannitol)
en absence de saccharose en plus d’un essai contenant le saccharose
à 5 g/l ;
- pH (3, 4, 5, 7 et 9), l’activité enzymatique étant contrôlée à 24 heures
et le pH et la biomasse (absorbance à 600 nm) à 24 et 48 h ;
- source azotée inorganique à 1 g/l (NH4Cl, NaNO3,, (NH4)2SO4) ou
organique à 3 g/l (peptone) ;
- température (20, 30 et 45°C) avec suivi de la croissance et de la
production d’enzyme.
RÉSULTATS
Isolement et purification des souches
Les souches appartiennent aux genres Candida, Debaryomyces et
Saccharomyces.
Parmi les douze levures isolées, le plus faible pH est obtenu avec L2,
qui correspond à Candida guilliermondii. Elle est capable d’abaisser le pH
de 5,88 à 3,8 après 48 h d’incubation dans le milieu synthétique et présente
une bonne croissance sur milieu synthétique solide avec 3 g/l de saccharose.
55
Tableau I :
Pouvoir acidifiant de douze souches de levures isolées de la saumure de
carottes après incubation 48 h à 30°C dans un milieu semi-synthétique
liquide et croissance sur un milieu synthétique solide.
Milieu synthétique
liquide
3 g/l glucose
3 g/l extrait de levure
Souche
Détermination
L1
Milieu synthétique
solide
3 g/l saccharose
0 g/l extrait de levure
pH initial
pH à 48 h
croissance (+)
non-développement (-)
Saccharomyces cerevisiae
5,88
4,00
+
L2
Candida guilliermondii
5,88
3,8
+
L3
Candida sp.
5,88
4,60
-
L4
Debaryomyces sp.
5,88
5,50
-
L5
Candida sp.
5,88
4,50
-
L6
Candida sp.
5,88
4,20
-
L7
Debaryomyces sp.
5,88
5,10
-
L8
Candida sp.
5,88
4,60
-
L9
Candida sp.
5,88
4,50
-
L10
Debaryomyces sp.
5,88
5,50
-
L11
Debaryomyces sp.
5,88
5,00
-
L12
Candida sp.
5,88
4,80
-
Localisation de l’activité enzymatique
L’activité enzymatique se trouve essentiellement dans le milieu de
culture (Tableau II).
56
Tableau II :
Localisation de l’activité ß-fructofuranosidase après culture de la
souche L2 de Candida guilliermondii 24 h à 30°C dans un milieu
semi-synthétique liquide avec 3 g/l de saccharose.
Activité enzymatique (µM.l-1.min-1)
Fraction
Suspension à 1200 g
1035
Culot à 12000 g
24
Fraction soluble après sonication du culot
60
Fraction insoluble après sonication du culot
97
Optimisation de la croissance cellulaire et de la production enzymatique
L’activité enzymatique augmente avec la concentration en
saccharose pour atteindre un maximum à 5 g/l (Tableau III).
Tableau III :
Influence de la concentration en saccharose sur la croissance cellulaire
et l’activité ß-fructofuranosidase de la souche L2 de Candida
guilliermondii après 24 h à 30°C dans milieu semi-synthétique liquide.
Saccharose
(g/l)
A24 h
A48 h
pH
initial
pH
à 24 h
pH
à 48 h
Activité
enzymatique
à 24 h
(µM.l -1.min-1)
600
nm
600
nm
0,5
1,10
1,80
5,69
4,53
± 1,16
3,48
± 2,21
96
1
0,97
2,08
5,71
4,55
± 1,16
3,39
± 2,32
998
3
0,87
2,09
5,73
4,18
± 1,55
3,20
± 2,53
1341
5
0,96
2,15
5,81
4,53
± 1,28
3,41
± 2,40
1538
7
0,78
2,04
5,67
4,29
± 1,38
3,51
± 2,16
1490
10
0,94
1,60
5,64
4,41
± 1,23
4,11
± 1,53
979
57
L’activité enzymatique est presque nulle pour les sucres simples
(Tableau IV).
Tableau IV :
Influence de la nature de la source carbonée sur la souche L2 de
Candida guilliermondii sur milieu semi-synthétique liquide à 30°C.
Source carbonée
A24 h
Activité enzymatique
(µM.l-1.min-1) à 24 h
Monosaccharides
Glucose
2,1
30
Fructose
1,7
28
Saccharose
0,9
1351
Lactose
1,6
76
Maltose
1,6
87
1,3
54
Disaccharides
Polyol
Mannitol
Le pH optimal de production de l’enzyme est 5,2 (Tableau V).
Tableau V :
Influence du pH sur la souche L2 de Candida guilliermondii sur milieu
semi-synthétique liquide à 30°C.
pH
initial
pH
à 24 h
pH
à 48 h
A24 h
A48 h
Activité enzymatique
600 nm
600 nm
(µM.l-1.min-1) à 24 h
3,2
3,20
3,08
0,79
1,60
722
4
4,05
3,71
0,80
1,55
946
5,2
4,01
3,02
1,10
1,75
1188
7
4,65
4,45
1,09
1,40
890
9
5,28
5,07
0,91
1,30
528
58
On obtient une bonne croissance avec une activité enzymatique
élevée en présence de (NH4)2SO4 (Tableau VI). L’optimum de croissance et
le maximum d’activité sont obtenus à 30°C.
Tableau VI :
Influence de la source azotée et de la température sur la souche L2 de
Candida guilliermondii sur milieu semi-synthétique liquide.
A24 h 600 nm
Activité enzymatique
(µM.l-1.min-1)
NH4Cl
1,7
960
NaNO3
1,5
760
(NH4)2SO4
1,9
1280
peptone
1,8
860
20°C
0,8
710
30°C
1,7
1215
45°C
0,14
Source d’azote
Température
77
DISCUSSION ET CONCLUSION
Plusieurs espèces de levures appartenant à trois genres différents ont
été isolées des carottes en fermentation. En effet, les levures se succèdent
selon leur ordre d’acidotolérance et d’adaptation au cours de la fermentation
des carottes.
Parmi les vingt souches isolées de la saumure de carottes, seules
deux souches ont pu proliférer en milieu synthétique à base de saccharose et
dépourvu d’extrait de levure. Il s’agit de Saccharomyces cerevisiae et
Candida guilliermondii.
L’activité enzymatique se trouve essentiellement dans le milieu de
culture ce qui suggère que la ß-fructofuranosidase élaborée est
essentiellement extracellulaire.
59
L’optimisation des paramètres de croissance de la souche L2 de
Candida guilliermondii a permis d’atteindre une activité enzymatique de
1538 µM.l -1.min-1.
Au-delà de 5 g/l, le saccharose devient inhibiteur de la croissance et
de l’apparition de l’activité saccharolytique en accord avec d’autres auteurs
[2,12]. Les récepteurs enzymatiques pourraient être saturés. Pour une
concentration inférieure, les levures se développent moins car moins de
substrat est mis à leur disposition.
À la différence du saccharose, l’activité enzymatique est presque
nulle pour les sucres simples. On en conclut qu’il s’agit d’une enzyme
induite.
Le pH optimal de production de l’enzyme de 5,2 est en accord avec
les données de la littérature. Les levures croissent dans une large gamme de
pH allant de 2,4 à 5,8 avec une valeur optimale vers 4 à 5 [15] et l’optimum
de production de l’enzyme est trouvé vers pH 4,5 - 5 [1,4,26].
La souche Candida guilliermondii apprécie le sulfate d’ammonium
et moins les autres sources d’azote. Toutes les levures ne sont pas aptes à
utiliser les sources d’azote minéral. Ainsi, Candida utilis assimile les
nitrates alors que Saccharomyces cerevisiae en est incapable. Les acides
aminés obtenus par dégradation de la peptone sont utilisés en fonction des
capacités de désamination des levures.
Chaque microorganisme exige une température déterminée pour sa
croissance optimale. Les enzymes sont extrêmement sensibles aux
conditions environnementales, en particulier à la température et au pH [16].
Des températures trop élevées provoquent la dénaturation de l’enzyme [2].
L’invertase est dénaturée à -7°C et à 45°C [13 ] chez Saccharomyces.
Candida guilliermondii présente un optimum de croissance et de production
de fructofuranosidase à 30°C et peut être considéré comme une levure
mésophile.
La présence de fructofuranosidase chez C. guilliermondii pourrait
trouver des applications en biotechnologie alimentaire. La souche L2 fait
d’ailleurs l’objet d’essais de fermentation contrôlée des carottes en
association avec des bactéries lactiques [6].
60
RÉFÉRENCES
1-
23-
4-
5-
6-
7-
8-
9-
Abrahão-Neto (J.), Infanti (P.), Vitolo (M.) - Influence of pH,
temperature and dissolved oxygen concentration on the production of
glucose 6-phosphate dehydrogenase and invertase by Saccharomyces
cerevisiae. - Braz. J. Chem. Eng, 1997, 1 4 (1), 89-94.
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0104-66321
997000100008&lng=en&nrm=iso
Aiba (S.), Humphrey (A.E.), Millis (N.F.) - Biochemical engineering.
New York: Academic Press, 1965, 333 p.
Bahrim (G.), Gheteu (M.) - Improvement of Aspergillus niger
invertase production in stationary fermentative system. – Roum.
Biotechnol. Lett., 2004, 9(6), 1933-1938.
Bergamasco (R.), Bassetti (F.J.), de Moraes (F.F.), Zanin (G.M.) Characterization of free and immobilized invertase regarding activity
and energy of activation. - Braz. J. Chem. Eng., 2000, 17(4-7),
873-880. http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S01
04 - 66322000000400051&lng=en&nrm=iso
Bonestroo (M.H.), Kusters (B.J.), De Wit (J.C.), Rombouts (F.M.) Glucose and sucrose fermenting capacity of homofermentative lactic
acid bacteria used as starters in fermented salads. - Int. J. Food.
Microbiol., 1992, 15(3-4), 365-376.
Bousmaha (L.), Ouhssine (M.), El Yachioui (M.) - Fermentation des
carottes par inoculation microbienne et amélioration du procédé
traditionnel. In Ahami (A.O.T.), Santé, Éducation & Environnement.
Digi Edition, 2006, p. 147-179.
Carlson (M.), Botstein (D.) - Two differentially regulated mRNAS
with different 5’ ends encode secreted with intracellular forms of yeast
invertase. - Cell, 1982, 28(1), 145-154.
Chu (F.K.), Takase (K.), Guarino (D.), Maley (F.) - Diverse properties
of external and internal forms of yeast invertase derived from the
same gene. - Biochemistry, 1985, 24(22), 6125-6132.
Costaglioli (P.), Meilhoc (E.), Jonatova (I.), Klein (R.D.), Masson
(J.M.) - Secretion of invertase from Schwanniomyces occidentalis. Biotechnol. Lett., 19(7), 1997, 623-627.
61
10 - Fiedurek (J.), Pielecki (J.), Skowronek (M.) - Direct methods for
selecting mutants with increased production of invertase from
mutagenized cultures of Aspergillus fumigatus. - J. Basic Microbiol.,
2000, 40(2), 111-118.
11 - Kuo (S.C.), Lampen (J.O.) - Osmotic regulation of invertase formation
and secretion by protoplasts of Saccharomyces. - J. Bacteriol., 1971,
106(1), 183-191.
12 - Lehninger (A.L.), Cox (M.M.), Nelson (D.L.) - Principes de
biochimie. Flammarion, « Médecine-Sciences », 1994, 2e éd., 1035 p.
13 - Matulaitite (E.), Avizhenis (V.), Ianulaitene (A.K.), Geguzhene (A.A.)
- [Purification and characterization of beta-fructofuranosidase from
yeast Saccharomyces cerevisiae.] (russe) - Prikl. Biokhim. Mikrobiol.,
1980, 16(4), 528-537.
14- Nelson (N.) - A photometric adaptation of the Somogy method for the
determination of glucose. - J. Biol. Chem., 1944, 153(1), 375-380.
15 - Oteng-Gyang (K.) - Introduction à la microbiologie alimentaire dans
les pays chauds. Paris : Ed. Lavoisier, « Tec. & Doc. », 1984, p. 43-62
(272 p).
16 - Purves (W.K.), Orians (G.H.), Heller (H.C.), Sadava (D.) - Le Monde
du vivant : traité de biologie. Paris : Ed. Flammarion, « MédecineSciences », 2000, 2e ed., 1321 p.
17 - Rivière (J.) - L’exploitation industrielle des micro-organismes. - Cah.
Ing. Agron., 1970, (242), 9-26.
18 - Rivière (J.) - Les applications industrielles de la microbiologie. Paris :
Masson et Cie, 1975, 203 p.
19 - Rubio (M.C.), Navarro (A.R.) - Regulation of invertase synthesis in
Aspergillus niger. - Enzyme Microbial Technol., 2006, 39(4), 601-606.
20 - Santana de Almeida (A.C.), Costa de Araújo (L.), Mendes Costa (A.),
Moraes de Abreu (C.A.), Gomes de Andrade Lima (M.A.), Perez
Fernandez Palha (M. de L.A.) - Sucrose hydrolysis catalyzed by autoimmobilized invertase into intact cells of Cladosporium
cladosporioides. - J. Biotechnol., 2005, 8(1), 54-62. http://www.
ejbiotechnology.info/content/vol8/issue1/full/11/index.html
21 - Schwan (R.F.) - Cocoa fermentations conducted with a defined
microbial cocktail inoculum. - Appl. Environ. Microbiol., 1998, 64(4),
1477-1483.
22 - Somogyi (M.) - Notes on sugar determination. - J. Biol. Chem., 1952,
195, 19-23. http://www.jbc.org/cgi/reprint/195/1/19.pdf
62
23 - Tanzer (J.M.), Brown (A.T.), McInerney (M.F.) - Identification,
preliminary characterization, and evidence for regulation of invertase
in Streptococcus mutans. - J. Bacteriol, 1973, 116(1), 192-202.
24 - Trumbly (R.J.) - Isolation of Saccharomyces cerevisiae mutants
constitutive for invertase synthesis. - J. Bacteriol, 1986. 166(3),
1123-1127.
25 - Vitolo (M.), Borzani (W.) - Measurement of invertase activity of cells
of Saccharomyces cerevisiae. - Anal. Biochem., 1983, 130(2),
469-470.
26 - Vitolo (M.), Duranti (M.A.), Pellegrim (M.B.) - Effect of pH, aeration
and sucrose feeding on invertase activity of intact S. cerevisiae cells
grown in sugarcane blackstrap molasses. - J. Ind. Microbiol., 1995,
15(2), 75-79.
ABSTRACT
A Candida guilliermondii strain isolated from carrot brine produces
extracellular ß-fructofuranosidase
Twelve yeast strains were isolated from carrot brine in spontaneous
fermentation. One of them was selected and was found to belong to Candida
guilliermondii. It synthesized an extracellular ß-fructofuranosidase, with a
maximal activity of 1538 µM.l -1.min-1 at 24 h culture, 30°C and pH 5.2 with
5 g.l-1 sucrose.
Key-words: Candida guilliermondii, carrot, Daucus carota, fermentation,
fructofuranosidase.
__________