évaluation de l`effet antimycobactérien de plantes du centre

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évaluation de l`effet antimycobactérien de plantes du centre
271
Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 2007, 146, 271-288
ÉVALUATION DE L’EFFET
ANTIMYCOBACTÉRIEN DE PLANTES DU
CENTRE-NORD DU MAROC(*)
Hakima SQALLI ( 1 ) , Asmae EL OUARTI ( 1 ) ,
Abd eslam ENNABILI ( 2 ) , S aad IBNSOUDA ( 1 ) , Abdellah
FARAH ( 2 ) , Abdellati f HAGGOUD ( 1 ) , Abdellah HOUARI ( 1 ) ,
Moh ammed IRAQUI ( 1 )
Trente-six espèces de plantes correspondant à vingt-deux
familles de la région Centre-Nord du Maroc ont été testées pour
leur activité antimycobactérienne. Des extraits aqueux et
éthanoliques de chaque plante ont été testés contre la croissance
des mycobactéries : M. aurum, M. smegmatis, M. kansasii,
M. bovis et M. vaccae. Quatorze espèces se sont révélées
inhibitrices : Juniperus oxycedrus, Pistacia lentiscus et Ruta
montana déjà citées dans des travaux antérieurs, et Populus alba,
Cistus albidus, C. monspeliensis, C. salviifolius, Pistacia atlantica,
Tamarix africana, Rubia peregrina, Thymus pallidus, Vitex
agnus-castus, Verbascum sinuatum et Dittrichia viscosa.
(*)
(1)
(2)
Manuscrit reçu le 27 mars 2007.
Laboratoire de Biotechnologie Microbienne, Faculté des Sciences et Techniques
de Fès, Université Sidi Mohammed Ben Abdellah, BP 2202, Fès, Maroc.
[email protected], [email protected] o m ,
[email protected],
[email protected], [email protected]
Institut National des Plantes Médicinales et Aromatiques, Université Sidi
Mohammed Ben Abdellah, BP 159 Taounate Principale, Maroc.
[email protected], [email protected]
272
INTRODUCTION
La tuberculose, due à plusieurs espèces de mycobactéries et
particulièrement à Mycobacterium tuberculosis, demeure de nos jours
incontestablement une maladie sociale préoccupante.
L’amélioration de l’hygiène et la découverte de traitements efficaces
(streptomycine, éthambutol, isoniazide, pyrazinamide et rifampicine), ainsi
que la découverte de vaccins antituberculeux ont permis de réduire
l’incidence de cette maladie, surtout dans les pays développés. On a pensé
un moment que ce fléau était vaincu [25].
Cependant, au début des années 90, on a observé une augmentation
de l’incidence de cette maladie à l’échelle mondiale suite à la mobilité
croissante, aux migrations d’origine économique et politique et aux
déficiences des programmes de lutte, de nombreux patients ne recevant pas
un traitement adéquat. Cela a favorisé l’apparition problématique de
mycobactéries multirésistantes aux antituberculeux [25 ]. En outre, les
patients immunodéprimés, surtout ceux infectés par le VIH, sont
particulièrement menacés [36].
En 1990, l’OMS [59] estimait qu’un tiers de la population mondiale
était infecté par le bacille de Koch, 8 millions de cas de tuberculose étaient
déclarés dont 95 % dans les pays en voie de développement, et 3 millions de
décès sont survenus du fait de cette maladie. Les prévisions vont dans le
sens d’une détérioration de la situation. Ainsi, toujours selon l’OMS, en
2005, la situation s’est aggravée : le nombre annuel de nouveaux cas de
tuberculose dépassait les 10 millions et le nombre de décès a atteint 3,5
millions. La tuberculose prédomine dans le tiers monde, particulièrement
dans certaines régions d’Afrique et d’Asie, où l’épidémie du SIDA continue
à se développer [70-71].
Les prévisions de l’OMS estiment que pour la période 2000-2020, un
milliard de personnes seront nouvellement infectées par Mycobacterium
tuberculosis, 200 millions développeront la maladie et 35 millions mourront
de tuberculose si aucune amélioration n'est apportée dans le traitement et le
contrôle de cette infection [46 ]. Pour mieux contrôler les infections
mycobactériennes et diminuer la fréquence des souches multirésistantes, il
est donc urgent de mettre en évidence de nouveaux agents
antimycobactériens efficaces [43].
273
Le règne végétal est une source inépuisable de nouveaux agents
antituberculeux. Des plantes médicinales et aromatiques pourraient
permettre le traitement ou la prévention de maladies chroniques et/ou
graves, et résoudre le problème de la résistance bactérienne vis-à-vis des
agents antibactériens actuels. Les recherches sur les activités
antimycobactériennes, le mode d’action et la composition chimique des
plantes connaissent un regain d’intérêt [43].
C’est dans ce cadre que s’inscrit le présent travail. Nous avons testé
l’aptitude d’extraits de diverses plantes marocaines à inhiber la croissance
de mycobactéries.
MATÉRIEL ET MÉTHODES
Matériel végétal
En 2005, diverses parties de 36 espèces de plantes ont été collectées
(Tableau I). 31 ont été récoltées entre 150 et 425 m dans la région de
Bellota, faisant partie du site d’intérêt biologique et écologique de
Brikcha/Chefchaouen. Thymus pallidus provient de la région de
Boufekrane/Meknès et les quatre espèces restantes d’un herboriste de Fès :
Rubia peregrina, Origanum majorana, Anacyclus pyrethrum et Matricaria
recutita. Ces échantillons ont été séchés à l’ombre et à l’air libre puis
broyés. Des spécimens ont été conservés à l’herbier de l’Institut national des
Plantes médicinales et aromatiques à Mezraoua-Taounate (Maroc).
Ces espèces correspondent à 22 familles : une de Gymnospermes
(Cupressaceae), 5 de Monocotylédones et 16 de Dicotylédones.
Préparation des extraits
Différents extraits aqueux ou éthanoliques ont été préparés à raison
de 15 g de poudre pour 100 ml d’eau ou d’éthanol :
Infusion : la poudre est infusée 24 heures dans l’eau, puis filtrée ;
Décoction : la poudre mélangée à l’eau bouillante est portée à
ébullition pendant quinze minutes, puis filtrée ;
274
Extraction à l’éthanol : la poudre est macérée 24 heures dans
l’éthanol absolu à l’ombre. Après filtration, le solvant est évaporé à
sec et sous vide au rotavapor à 37°C. L’extrait est ensuite repris dans
5 ml d’eau distillée stérile.
La filtration des différents extraits est assurée par filtration sous vide
avec une pompe à eau et un filtre Millipore de porosité 0,45 µm. Le pH de
chaque extrait est neutralisé en cas de besoin. Ces extraits sont incorporés
dans le milieu de culture Sauton [6,48] à base de 160 mg de matière
sèche/ml, concentration relativement élevée. En effet, l’utilisation de
concentrations plus faibles pourrait rendre impossible la mise en évidence
de l’effet antimycobactérien dans les extraits des plantes dont le principe
actif est présent en très faible quantité. De plus, plusieurs travaux antérieurs
ont utilisé la matière sèche à des concentrations supérieures ou égales à
100 mg/ml [4,14,45].
Mycobactéries testées
Les mycobactéries utilisées sont :
- Mycobacterium aurum A+, mycobactérie non pathogène à temps de
génération d’environ 6 h, espèce modèle qui peut être utilisée pour
évaluer l’effet des substances actives sur la croissance de
M. tuberculosis [11]
- Mycobacterium smegmatis MC2 155, mycobactérie atypique non
pathogène et à temps de génération d’environ 3 h
- Mycobacterium kansasii ATCC 12478, mycobactérie atypique
causant des infections opportunistes
- Mycobacterium bovis BCG IPP
- Mycobacterium vaccae ATCC 1548314.
Ces mycobactéries ont été aimablement fournies par Dr. S. David
(Centro de Tuberculose e Micobactérias, Instituto Nacional de Saúde Dr.
Ricardo Jorge Delegação do Porto, Portugal).
Elles ont été cultivées sur le milieu Sauton à 37°C [6,48].
Screening de l’activité antimycobactérienne
Les titres des différentes cultures mycobactériennes sont environ 106
UFC/ml. Des aliquotes de 100 µl de ces cultures ont été étalées sur les
boites renfermant 15 ml de milieu Sauton préparées avec les extraits de
275
plantes et non contaminées après préincubation 24 h à 37°C. Les boites
témoins contiennent du milieu Sauton dépourvu d’extrait de plante. Les
boites ainsi préparées ont été incubées à 37°C. La lecture des résultats a été
faite quotidiennement durant six jours pour les mycobactéries à croissance
rapide (M. smegmatis, M. aurum et M. vaccae). Pour M. kansasii et
M. bovis, les résultats sont notés après 7 et 21 jours d’incubation.
Le screening de l’activité antimycobactérienne a été également
réalisé par la méthode de diffusion. Des disques de papier Whatman de
6 mm de diamètre ont été stérilisés, puis posés sur des boites préalablement
inoculées par les souches mycobactériennes. Les disques ont été imprégnés
ensuite avec l’extrait éthanolique à raison de 160 mg de matière
sèche / disque. Le témoin correspond à un disque imprégné d’eau distillée.
Les conditions de culture et les titres bactériens utilisés sont identiques aux
précédents.
RÉSULTATS
Sur les 36 espèces végétales testées pour leur activité contre la
croissance des cinq espèces de mycobactéries, 22 sont dénuées d’effet.
Parmi les 14 autres ayant montré une activité, 13 sont récoltées et une
provenait de chez l’herboriste (Tableau I). L’activité se traduit par
l’inhibition totale de la croissance des bactéries sur les milieux de culture
contenant les différents extraits à 160 mg/ml (Tableau I). La méthode de
diffusion en milieu gélosé confirme ces résultats. Les espèces végétales non
actives n’ont montré la formation d’aucune auréole d’inhibition ; par contre,
les extraits des espèces actives ont abouti à l’apparition d’un halo
d’inhibition.
Les espèces inhibitrices correspondent aux Cupressacées (Juniperus
oxycedrus) , Salicacées (Populus alba), Cistacées (Cistus albidus,
C. monspeliensis et C. salviifolius), Anacardiacées (Pistacia atlantica et
P. lentiscus), Rutacées (Ruta montana), Tamaricacées (Tamarix africana),
Rubiacées (Rubia peregrina), Lamiacées (Thymus pallidus, Vitex agnuscastus), Scrofulariacées (Verbascum sinuatum) et Astéracées (Dittrichia
viscosa).
276
Tableau I : Effet antimycobactérien des extraits de plantes du
Centre-Nord marocain.
Famille
Espèce
Partie
utilisée
Nbre
essais
Effet antimycobactérien
I
D
E
Juniperus oxycedrus♣
F
4
Asparagus stipularis♣
F
2
+
+
+
Cyperus longus♣
PA
3
+
+
+
Scirpoides holoschoenus♣
PA
3
+
+
+
Charybdis maritima♣
Hyacinthaceae
B
2
+
+
+
Phragmites australis♣
Poaceae
PA
2
+
+
+
Ruscus hypophyllum♣
Ruscaceae
F
2
+
+
+
Viburnum tinus♣
Adoxaceae
F
2
+
+
+
Pistacia atlantica♣
Anacardiaceae
F
4
Pistacia lentiscus♣
RF
2
Visnaga ammoides♣
Apiaceae
RF
2
+
+
+
Asteraceae
Anacyclus pyrethrum
PS
2
+
+
+
Dittrichia viscosa♣
F
2
Matricaria recutita
RF
2
+
+
+
Sonchus oleraceus♣
RF
3
+
+
+
Cistus albidus♣
Cistaceae
F
2
Cistus monspeliensis♣
RF
2
Cistus salviifolius♣
F
2
Sedum sediforme♣
Crassulaceae
BF
2
+
+
+
Dipsacus fullonum♣
Dipsacaceae
F
2
+
+
+
Centaurium erythraea♣
Gentianaceae
F
2
+
+
+
Lavandula stoechas♣
Lamiaceae
F
2
+
+
+
Origanum majorana
F
3
+
+
+
Teucrium fruticans♣
F
3
+
+
+
Thymus pallidus
F
4
Calamintha nepeta♣
RF
2
+
+
+
Vitex agnus-castus ♣
RF
3
Clematis cirrhosa♣
Ranunculaceae
T
2
+
+
+
Clematis flammula♣
F
2
+
+
+
Clematis vitalba♣
PA
2
+
+
+
Rubiaceae
Rubia peregrina
PS
3
Ruta montana♣
Rutaceae
F
2
Populus alba♣
Salicaceae
F
3
Salix pedicellata♣
PA
2
+
+
+
Scrophulariaceae Verbascum sinuatum♣
F
2
Tamarix africana♣
Tamaricaceae
F
4
♣
: Plante récoltée dans la région de Bellota/Chefchaouen
B = bulbe, F = feuilles, RF = rameaux feuillés, PA = parties aériennes, PS = parties
souterraines, T = tiges
I : infusé, D : décocté, E : extrait éthanolique ; la concentration de matière sèche est de
160 mg/ml de milieu de culture
- : Inhibition totale de la croissance des cinq mycobactéries testées
+ : Croissance des cinq mycobactéries testées.
Cupressaceae
Asparagaceae
Cyperaceae
277
DISCUSSION ET CONCLUSION
Sur les 36 plantes marocaines testées, 14 possèdent une activité
antimycobactérienne. Les principes actifs sont solubles dans l’eau et
l’éthanol et leur activité ne disparait pas après traitement des extraits 15 min
à 100°C.
Les résultats ont été comparés avec ceux de la littérature traitant de
l’activité antimycobactérienne d’une centaine d’espèces végétales
appartenant aux familles testées (Tableau II).
Juniperus oxycedrus [16 ], Pistacia lentiscus [47 ] et Ruta montana
[47 ] ont déjà été signalées comme renfermant un ou plusieurs principes
actifs antimycobactériens. Ces auteurs ont utilisé les mêmes parties de la
plante, sauf Pistacia lentiscus pour laquelle nous avons testé les rameaux
feuillés au lieu des feuilles.
Populus alba, Pistacia atlantica et l’espèce endémique Thymus
pallidus ont un potentiel inhibiteur de la croissance des mycobactéries.
Aux Astéracées antimycobactériennes déjà signalées [5,9,14,20,24,3031,37,41,43,56,61,64-65,68-69], on peut ajouter Dittrichia viscosa. Cette espèce
est utilisée en médecine traditionnelle marocaine dans le traitement de la
tuberculose et des affections pulmonaires [8].
Nous ajoutons Tamarix africana aux Tamaricacées, Rubia peregrina
aux Rubiacées, Vitex agnus-castus aux Lamiacées et Verbascum sinuatum
aux Scrofulariacées.
Le genre Cistus, avec ses trois espèces inhibitrices, apparait très
prometteur.
Les genres Cyperus [39 ], Clematis [43 ] et Salix [43] présentent des
espèces antimycobactériennes, mais les plantes marocaines examinées dans
ce travail se sont révélées inactives. Il en est de même pour les genres
Lavandula [43], Origanum [1 7 , 4 9 ] et Teucrium [43 ] de la famille des
Lamiacées.
278
Tableau II :
Principales espèces reportées comme antimycobactériennes
appartenant aux familles testées.
Famille, ordre
Présent travail
Cupressaceae
Juniperus oxycedrus♦
Asparagales
Asparagus stipularis
Charybdis maritima
Ruscus hypophyllum
Cyperaceae
Cyperus longus
Scirpoides holoschoenus
Phragmites australis
Pistacia atlantica♦
Pistacia lentiscus♦
Poaceae
Anacardiaceae
Apiaceae
Visnaga ammoides
Asteraceae
Anacyclus pyrethrum
Dittrichia viscosa♦
Matricaria recutita
Sonchus oleraceus
Autres travaux
Chamaecyparis nootkatensis [12]
Juniperus communis [24,42-43]
Juniperus excelsa [43,67]
Juniperus oxycedrus [16]
Juniperus procera [40, 43]
Allium cepa [22]
Allium sativum [15,42,50-51]
Allium schoenoprasum [22]
Aloe chinensis [43]
Aloe succotrina [43]
Aloe vera [19]
Chlorophytum inornatum [44]
Pancratium maritimum [72]
Cyperus articulatus [39]
Avena sativa [35]
Mangifera indica [43]
Pistacia lentiscus [47]
Pistacia terebinthus [17]
Schinus molle [69]
Spondias mombin [13]
Angelica pancini [57]
Azorella madreporica [43]
Centella asiatica [43]
Ducrosia anethifolia [57]
Ferula communis [40, 43]
Glehnia littoris [43]
Heracleum maximum [43]
Lomatium dissectum [43]
Peucedanum ostruthium [54]
Pimpinella aurea [62]
Pimpinella corymbosa [62]
Pimpinella isaurica [62]
Achillea millefolium [9]
Achillea wilhelmsii [68]
Arctotis auriculata [52]
Arnica montana [43]
Artemisia ludoviciana [24]
Artemisia monosperma [56]
Balzoamorhiza sagittata [43]
Bidens pilosa [43]
Borrichia frutescens [43]
Calendula suffruticosa [68]
Camchaya calcarea [69]
279
Cistaceae
Crassulaceae
Dipsacales
Gentianaceae
Lamiaceae
Cistus albidus♦
Cistus monspeliensis♦
Cistus salviifolius♦
Sedum sediforme
Dipsacus fullonum
Viburnum tinus
Centaurium erythraea
Calamintha nepeta
Lavandula stoechas
Origanum majorana
Thymus pallidus♦
Teucrium fruticans
Vitex agnus-castus♦
Chaenactis douglasi [43]
Chromolaena odorata [60]
Chrysoma pauciflosculosa [43]
Chrysanthum sinense [43]
Chrysanthemum morifolium [5]
Chrysanthemum segetum [43]
Erigeron philadelphicus [43]
Erigeron strigosus [43]
Euthamia leptocephala [43]
Flourensia cernua [37]
Haplopappus sonorensis [41]
Helichrysum crispum [52]
Helichrysum melanacme [30-31]
Inula helenium [43]
Nidorella anomala [31]
Rudbeckia subtomentosa [43]
Santolina chamaecyparissus [43]
Saussurea lappa [43]
Senecio chionophilus [20]
Solidago arguta [43]
Solidago canadensis [43]
Solidago rugosa [43]
Sphagneticola trilobata [64]
Spilanthes mauritiana [43]
Tanacetum argyrophyllum [68]
Tridax procumbens [65]
Vernonia amygdalina [14]
---
--Lonicera japonica [43]
Valeriana laxiflora [21]
Canscora decussata [43]
Swertia purpurascens [43]
Swertia randaiensis [29]
Ajuga remota [10]
Hyssopus officinalis [42]
Lantana hispida [24]
Lavandula angustifolia [43]
Leucas volkensii [43]
Mentha piperita [42,55]
Origanum sp. [49]
Origanum vulgare [17]
Orthosiphon labiatus [23]
Rosmarinus officinalis [17,32]
Salvia aethiopis [68]
Salvia africana-lutea [23]
Salvia forskahlei [68]
280
Ranunculaceae
Clematis cirrhosa
Clematis flammula
Clematis vitalba
Rubiaceae
Rubia peregrina♦
Rutaceae
Ruta montana♦
Salicaceae
Scrophulariaceae
Populus alba♦
Salix pedicellata
Verbascum sinuatum♦
Tamaricaceae
Tamarix africana♦
Salvia hypargeia [43]
Salvia kronenburgii [68]
Salvia macrochlamys [63]
Salvia miltiorrhiza [33]
Salvia multicaulis [43]
Salvia officinalis [43]
Salvia przewalskii [33]
Stachys sylvatica [68]
Tetradenia riparia [43]
Teucrium chamaedrys [42-43]
Thymus eigii [66]
Thymus revolutus [28]
Thymus vulgaris [31]
Actaea spicata [43]
Clematis integrifolia [43]
Clematis virginiana [43]
Coptis coinensia [43]
Hydrastis canadensis [43]
Nigella sativa [42]
Morinda citrifolia [53]
Neonauclea sessilifolia [26]
Pentas longiflora [43]
Prismatomeris fragrans [27]
Amyris elemifera [43]
Aegle marmelos [42]
Clausena excavata [61]
Coleonema album [18]
Commiphora mukul [42]
Evodia elleryana [7]
Evodia rutaecarpa [2]
Galipea officinalis [43]
Lunasia amara [3]
Micromelum hirsutum [34]
Pilocarpus racemosus [43]
Ruta montana [47]
Tetradium daniellii [1]
Triphasia trifolia [43]
Populus tremuloides [43]
Salix caprea [43]
Leucophyllum frutescens [38]
Scrophularia deserti [58]
Verbascum thapsus [42]
---
♦ : Espèces examinées dans le présent travail et se révélant antimycobactériennes.
281
Parmi les Asparagales, les Gentianacées et les Apiacées citées dans
plusieurs travaux [15,19,22,29,40,42-44,50-51,54,57,62,72], nous n’avons pas
trouvé de nouvelles espèces possédant une activité antimycobactérienne.
Les Poacées, Crassulacées et Dipsacales testées n’ont pas permis de
trouver in vitro de propriétés antimycobactériennes.
La toxicité et l’effet in vivo des plantes dont les extraits sont
capables de bloquer la croissance mycobactérienne mériterait d’être étudiée.
Les principes des extraits non toxiques et actifs in vivo pourraient ensuite
être purifiés et identifiés.
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ABSTRACT
Evaluation of antimycobacterial plants originating from centre north
Morocco
Thirty-six plant species belonging to 22 families were collected from
Central North Morocco. The aqueous and ethanolic extracts were tested
against the mycobacteria M. aurum, M. smegmatis, M. kansasii, M. bovis
and M. vaccae. Thus, 14 plants were able to inhibit the growth of
mycobacteria. Besides Juniperus oxycedrus, Pistacia lentiscus, and Ruta
montana, 11 species (Populus alba, Cistus albidus, C. monspeliensis,
C. salviifolius, Pistacia atlantica, Tamarix africana, Rubia peregrina,
Thymus pallidus, Vitex agnus-castus, Verbascum sinuatum and Dittrichia
viscosa) are reported here for the first time as having antimycobacterial
activity.
Key-words: antimycobacterial properties, Cistus, Mycobacterium
__________