évaluation de l`effet antimycobactérien de plantes du centre
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271 Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 2007, 146, 271-288 ÉVALUATION DE L’EFFET ANTIMYCOBACTÉRIEN DE PLANTES DU CENTRE-NORD DU MAROC(*) Hakima SQALLI ( 1 ) , Asmae EL OUARTI ( 1 ) , Abd eslam ENNABILI ( 2 ) , S aad IBNSOUDA ( 1 ) , Abdellah FARAH ( 2 ) , Abdellati f HAGGOUD ( 1 ) , Abdellah HOUARI ( 1 ) , Moh ammed IRAQUI ( 1 ) Trente-six espèces de plantes correspondant à vingt-deux familles de la région Centre-Nord du Maroc ont été testées pour leur activité antimycobactérienne. Des extraits aqueux et éthanoliques de chaque plante ont été testés contre la croissance des mycobactéries : M. aurum, M. smegmatis, M. kansasii, M. bovis et M. vaccae. Quatorze espèces se sont révélées inhibitrices : Juniperus oxycedrus, Pistacia lentiscus et Ruta montana déjà citées dans des travaux antérieurs, et Populus alba, Cistus albidus, C. monspeliensis, C. salviifolius, Pistacia atlantica, Tamarix africana, Rubia peregrina, Thymus pallidus, Vitex agnus-castus, Verbascum sinuatum et Dittrichia viscosa. (*) (1) (2) Manuscrit reçu le 27 mars 2007. Laboratoire de Biotechnologie Microbienne, Faculté des Sciences et Techniques de Fès, Université Sidi Mohammed Ben Abdellah, BP 2202, Fès, Maroc. [email protected], [email protected] o m , [email protected], [email protected], [email protected] Institut National des Plantes Médicinales et Aromatiques, Université Sidi Mohammed Ben Abdellah, BP 159 Taounate Principale, Maroc. [email protected], [email protected] 272 INTRODUCTION La tuberculose, due à plusieurs espèces de mycobactéries et particulièrement à Mycobacterium tuberculosis, demeure de nos jours incontestablement une maladie sociale préoccupante. L’amélioration de l’hygiène et la découverte de traitements efficaces (streptomycine, éthambutol, isoniazide, pyrazinamide et rifampicine), ainsi que la découverte de vaccins antituberculeux ont permis de réduire l’incidence de cette maladie, surtout dans les pays développés. On a pensé un moment que ce fléau était vaincu [25]. Cependant, au début des années 90, on a observé une augmentation de l’incidence de cette maladie à l’échelle mondiale suite à la mobilité croissante, aux migrations d’origine économique et politique et aux déficiences des programmes de lutte, de nombreux patients ne recevant pas un traitement adéquat. Cela a favorisé l’apparition problématique de mycobactéries multirésistantes aux antituberculeux [25 ]. En outre, les patients immunodéprimés, surtout ceux infectés par le VIH, sont particulièrement menacés [36]. En 1990, l’OMS [59] estimait qu’un tiers de la population mondiale était infecté par le bacille de Koch, 8 millions de cas de tuberculose étaient déclarés dont 95 % dans les pays en voie de développement, et 3 millions de décès sont survenus du fait de cette maladie. Les prévisions vont dans le sens d’une détérioration de la situation. Ainsi, toujours selon l’OMS, en 2005, la situation s’est aggravée : le nombre annuel de nouveaux cas de tuberculose dépassait les 10 millions et le nombre de décès a atteint 3,5 millions. La tuberculose prédomine dans le tiers monde, particulièrement dans certaines régions d’Afrique et d’Asie, où l’épidémie du SIDA continue à se développer [70-71]. Les prévisions de l’OMS estiment que pour la période 2000-2020, un milliard de personnes seront nouvellement infectées par Mycobacterium tuberculosis, 200 millions développeront la maladie et 35 millions mourront de tuberculose si aucune amélioration n'est apportée dans le traitement et le contrôle de cette infection [46 ]. Pour mieux contrôler les infections mycobactériennes et diminuer la fréquence des souches multirésistantes, il est donc urgent de mettre en évidence de nouveaux agents antimycobactériens efficaces [43]. 273 Le règne végétal est une source inépuisable de nouveaux agents antituberculeux. Des plantes médicinales et aromatiques pourraient permettre le traitement ou la prévention de maladies chroniques et/ou graves, et résoudre le problème de la résistance bactérienne vis-à-vis des agents antibactériens actuels. Les recherches sur les activités antimycobactériennes, le mode d’action et la composition chimique des plantes connaissent un regain d’intérêt [43]. C’est dans ce cadre que s’inscrit le présent travail. Nous avons testé l’aptitude d’extraits de diverses plantes marocaines à inhiber la croissance de mycobactéries. MATÉRIEL ET MÉTHODES Matériel végétal En 2005, diverses parties de 36 espèces de plantes ont été collectées (Tableau I). 31 ont été récoltées entre 150 et 425 m dans la région de Bellota, faisant partie du site d’intérêt biologique et écologique de Brikcha/Chefchaouen. Thymus pallidus provient de la région de Boufekrane/Meknès et les quatre espèces restantes d’un herboriste de Fès : Rubia peregrina, Origanum majorana, Anacyclus pyrethrum et Matricaria recutita. Ces échantillons ont été séchés à l’ombre et à l’air libre puis broyés. Des spécimens ont été conservés à l’herbier de l’Institut national des Plantes médicinales et aromatiques à Mezraoua-Taounate (Maroc). Ces espèces correspondent à 22 familles : une de Gymnospermes (Cupressaceae), 5 de Monocotylédones et 16 de Dicotylédones. Préparation des extraits Différents extraits aqueux ou éthanoliques ont été préparés à raison de 15 g de poudre pour 100 ml d’eau ou d’éthanol : Infusion : la poudre est infusée 24 heures dans l’eau, puis filtrée ; Décoction : la poudre mélangée à l’eau bouillante est portée à ébullition pendant quinze minutes, puis filtrée ; 274 Extraction à l’éthanol : la poudre est macérée 24 heures dans l’éthanol absolu à l’ombre. Après filtration, le solvant est évaporé à sec et sous vide au rotavapor à 37°C. L’extrait est ensuite repris dans 5 ml d’eau distillée stérile. La filtration des différents extraits est assurée par filtration sous vide avec une pompe à eau et un filtre Millipore de porosité 0,45 µm. Le pH de chaque extrait est neutralisé en cas de besoin. Ces extraits sont incorporés dans le milieu de culture Sauton [6,48] à base de 160 mg de matière sèche/ml, concentration relativement élevée. En effet, l’utilisation de concentrations plus faibles pourrait rendre impossible la mise en évidence de l’effet antimycobactérien dans les extraits des plantes dont le principe actif est présent en très faible quantité. De plus, plusieurs travaux antérieurs ont utilisé la matière sèche à des concentrations supérieures ou égales à 100 mg/ml [4,14,45]. Mycobactéries testées Les mycobactéries utilisées sont : - Mycobacterium aurum A+, mycobactérie non pathogène à temps de génération d’environ 6 h, espèce modèle qui peut être utilisée pour évaluer l’effet des substances actives sur la croissance de M. tuberculosis [11] - Mycobacterium smegmatis MC2 155, mycobactérie atypique non pathogène et à temps de génération d’environ 3 h - Mycobacterium kansasii ATCC 12478, mycobactérie atypique causant des infections opportunistes - Mycobacterium bovis BCG IPP - Mycobacterium vaccae ATCC 1548314. Ces mycobactéries ont été aimablement fournies par Dr. S. David (Centro de Tuberculose e Micobactérias, Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge Delegação do Porto, Portugal). Elles ont été cultivées sur le milieu Sauton à 37°C [6,48]. Screening de l’activité antimycobactérienne Les titres des différentes cultures mycobactériennes sont environ 106 UFC/ml. Des aliquotes de 100 µl de ces cultures ont été étalées sur les boites renfermant 15 ml de milieu Sauton préparées avec les extraits de 275 plantes et non contaminées après préincubation 24 h à 37°C. Les boites témoins contiennent du milieu Sauton dépourvu d’extrait de plante. Les boites ainsi préparées ont été incubées à 37°C. La lecture des résultats a été faite quotidiennement durant six jours pour les mycobactéries à croissance rapide (M. smegmatis, M. aurum et M. vaccae). Pour M. kansasii et M. bovis, les résultats sont notés après 7 et 21 jours d’incubation. Le screening de l’activité antimycobactérienne a été également réalisé par la méthode de diffusion. Des disques de papier Whatman de 6 mm de diamètre ont été stérilisés, puis posés sur des boites préalablement inoculées par les souches mycobactériennes. Les disques ont été imprégnés ensuite avec l’extrait éthanolique à raison de 160 mg de matière sèche / disque. Le témoin correspond à un disque imprégné d’eau distillée. Les conditions de culture et les titres bactériens utilisés sont identiques aux précédents. RÉSULTATS Sur les 36 espèces végétales testées pour leur activité contre la croissance des cinq espèces de mycobactéries, 22 sont dénuées d’effet. Parmi les 14 autres ayant montré une activité, 13 sont récoltées et une provenait de chez l’herboriste (Tableau I). L’activité se traduit par l’inhibition totale de la croissance des bactéries sur les milieux de culture contenant les différents extraits à 160 mg/ml (Tableau I). La méthode de diffusion en milieu gélosé confirme ces résultats. Les espèces végétales non actives n’ont montré la formation d’aucune auréole d’inhibition ; par contre, les extraits des espèces actives ont abouti à l’apparition d’un halo d’inhibition. Les espèces inhibitrices correspondent aux Cupressacées (Juniperus oxycedrus) , Salicacées (Populus alba), Cistacées (Cistus albidus, C. monspeliensis et C. salviifolius), Anacardiacées (Pistacia atlantica et P. lentiscus), Rutacées (Ruta montana), Tamaricacées (Tamarix africana), Rubiacées (Rubia peregrina), Lamiacées (Thymus pallidus, Vitex agnuscastus), Scrofulariacées (Verbascum sinuatum) et Astéracées (Dittrichia viscosa). 276 Tableau I : Effet antimycobactérien des extraits de plantes du Centre-Nord marocain. Famille Espèce Partie utilisée Nbre essais Effet antimycobactérien I D E Juniperus oxycedrus♣ F 4 Asparagus stipularis♣ F 2 + + + Cyperus longus♣ PA 3 + + + Scirpoides holoschoenus♣ PA 3 + + + Charybdis maritima♣ Hyacinthaceae B 2 + + + Phragmites australis♣ Poaceae PA 2 + + + Ruscus hypophyllum♣ Ruscaceae F 2 + + + Viburnum tinus♣ Adoxaceae F 2 + + + Pistacia atlantica♣ Anacardiaceae F 4 Pistacia lentiscus♣ RF 2 Visnaga ammoides♣ Apiaceae RF 2 + + + Asteraceae Anacyclus pyrethrum PS 2 + + + Dittrichia viscosa♣ F 2 Matricaria recutita RF 2 + + + Sonchus oleraceus♣ RF 3 + + + Cistus albidus♣ Cistaceae F 2 Cistus monspeliensis♣ RF 2 Cistus salviifolius♣ F 2 Sedum sediforme♣ Crassulaceae BF 2 + + + Dipsacus fullonum♣ Dipsacaceae F 2 + + + Centaurium erythraea♣ Gentianaceae F 2 + + + Lavandula stoechas♣ Lamiaceae F 2 + + + Origanum majorana F 3 + + + Teucrium fruticans♣ F 3 + + + Thymus pallidus F 4 Calamintha nepeta♣ RF 2 + + + Vitex agnus-castus ♣ RF 3 Clematis cirrhosa♣ Ranunculaceae T 2 + + + Clematis flammula♣ F 2 + + + Clematis vitalba♣ PA 2 + + + Rubiaceae Rubia peregrina PS 3 Ruta montana♣ Rutaceae F 2 Populus alba♣ Salicaceae F 3 Salix pedicellata♣ PA 2 + + + Scrophulariaceae Verbascum sinuatum♣ F 2 Tamarix africana♣ Tamaricaceae F 4 ♣ : Plante récoltée dans la région de Bellota/Chefchaouen B = bulbe, F = feuilles, RF = rameaux feuillés, PA = parties aériennes, PS = parties souterraines, T = tiges I : infusé, D : décocté, E : extrait éthanolique ; la concentration de matière sèche est de 160 mg/ml de milieu de culture - : Inhibition totale de la croissance des cinq mycobactéries testées + : Croissance des cinq mycobactéries testées. Cupressaceae Asparagaceae Cyperaceae 277 DISCUSSION ET CONCLUSION Sur les 36 plantes marocaines testées, 14 possèdent une activité antimycobactérienne. Les principes actifs sont solubles dans l’eau et l’éthanol et leur activité ne disparait pas après traitement des extraits 15 min à 100°C. Les résultats ont été comparés avec ceux de la littérature traitant de l’activité antimycobactérienne d’une centaine d’espèces végétales appartenant aux familles testées (Tableau II). Juniperus oxycedrus [16 ], Pistacia lentiscus [47 ] et Ruta montana [47 ] ont déjà été signalées comme renfermant un ou plusieurs principes actifs antimycobactériens. Ces auteurs ont utilisé les mêmes parties de la plante, sauf Pistacia lentiscus pour laquelle nous avons testé les rameaux feuillés au lieu des feuilles. Populus alba, Pistacia atlantica et l’espèce endémique Thymus pallidus ont un potentiel inhibiteur de la croissance des mycobactéries. Aux Astéracées antimycobactériennes déjà signalées [5,9,14,20,24,3031,37,41,43,56,61,64-65,68-69], on peut ajouter Dittrichia viscosa. Cette espèce est utilisée en médecine traditionnelle marocaine dans le traitement de la tuberculose et des affections pulmonaires [8]. Nous ajoutons Tamarix africana aux Tamaricacées, Rubia peregrina aux Rubiacées, Vitex agnus-castus aux Lamiacées et Verbascum sinuatum aux Scrofulariacées. Le genre Cistus, avec ses trois espèces inhibitrices, apparait très prometteur. Les genres Cyperus [39 ], Clematis [43 ] et Salix [43] présentent des espèces antimycobactériennes, mais les plantes marocaines examinées dans ce travail se sont révélées inactives. Il en est de même pour les genres Lavandula [43], Origanum [1 7 , 4 9 ] et Teucrium [43 ] de la famille des Lamiacées. 278 Tableau II : Principales espèces reportées comme antimycobactériennes appartenant aux familles testées. Famille, ordre Présent travail Cupressaceae Juniperus oxycedrus♦ Asparagales Asparagus stipularis Charybdis maritima Ruscus hypophyllum Cyperaceae Cyperus longus Scirpoides holoschoenus Phragmites australis Pistacia atlantica♦ Pistacia lentiscus♦ Poaceae Anacardiaceae Apiaceae Visnaga ammoides Asteraceae Anacyclus pyrethrum Dittrichia viscosa♦ Matricaria recutita Sonchus oleraceus Autres travaux Chamaecyparis nootkatensis [12] Juniperus communis [24,42-43] Juniperus excelsa [43,67] Juniperus oxycedrus [16] Juniperus procera [40, 43] Allium cepa [22] Allium sativum [15,42,50-51] Allium schoenoprasum [22] Aloe chinensis [43] Aloe succotrina [43] Aloe vera [19] Chlorophytum inornatum [44] Pancratium maritimum [72] Cyperus articulatus [39] Avena sativa [35] Mangifera indica [43] Pistacia lentiscus [47] Pistacia terebinthus [17] Schinus molle [69] Spondias mombin [13] Angelica pancini [57] Azorella madreporica [43] Centella asiatica [43] Ducrosia anethifolia [57] Ferula communis [40, 43] Glehnia littoris [43] Heracleum maximum [43] Lomatium dissectum [43] Peucedanum ostruthium [54] Pimpinella aurea [62] Pimpinella corymbosa [62] Pimpinella isaurica [62] Achillea millefolium [9] Achillea wilhelmsii [68] Arctotis auriculata [52] Arnica montana [43] Artemisia ludoviciana [24] Artemisia monosperma [56] Balzoamorhiza sagittata [43] Bidens pilosa [43] Borrichia frutescens [43] Calendula suffruticosa [68] Camchaya calcarea [69] 279 Cistaceae Crassulaceae Dipsacales Gentianaceae Lamiaceae Cistus albidus♦ Cistus monspeliensis♦ Cistus salviifolius♦ Sedum sediforme Dipsacus fullonum Viburnum tinus Centaurium erythraea Calamintha nepeta Lavandula stoechas Origanum majorana Thymus pallidus♦ Teucrium fruticans Vitex agnus-castus♦ Chaenactis douglasi [43] Chromolaena odorata [60] Chrysoma pauciflosculosa [43] Chrysanthum sinense [43] Chrysanthemum morifolium [5] Chrysanthemum segetum [43] Erigeron philadelphicus [43] Erigeron strigosus [43] Euthamia leptocephala [43] Flourensia cernua [37] Haplopappus sonorensis [41] Helichrysum crispum [52] Helichrysum melanacme [30-31] Inula helenium [43] Nidorella anomala [31] Rudbeckia subtomentosa [43] Santolina chamaecyparissus [43] Saussurea lappa [43] Senecio chionophilus [20] Solidago arguta [43] Solidago canadensis [43] Solidago rugosa [43] Sphagneticola trilobata [64] Spilanthes mauritiana [43] Tanacetum argyrophyllum [68] Tridax procumbens [65] Vernonia amygdalina [14] --- --Lonicera japonica [43] Valeriana laxiflora [21] Canscora decussata [43] Swertia purpurascens [43] Swertia randaiensis [29] Ajuga remota [10] Hyssopus officinalis [42] Lantana hispida [24] Lavandula angustifolia [43] Leucas volkensii [43] Mentha piperita [42,55] Origanum sp. [49] Origanum vulgare [17] Orthosiphon labiatus [23] Rosmarinus officinalis [17,32] Salvia aethiopis [68] Salvia africana-lutea [23] Salvia forskahlei [68] 280 Ranunculaceae Clematis cirrhosa Clematis flammula Clematis vitalba Rubiaceae Rubia peregrina♦ Rutaceae Ruta montana♦ Salicaceae Scrophulariaceae Populus alba♦ Salix pedicellata Verbascum sinuatum♦ Tamaricaceae Tamarix africana♦ Salvia hypargeia [43] Salvia kronenburgii [68] Salvia macrochlamys [63] Salvia miltiorrhiza [33] Salvia multicaulis [43] Salvia officinalis [43] Salvia przewalskii [33] Stachys sylvatica [68] Tetradenia riparia [43] Teucrium chamaedrys [42-43] Thymus eigii [66] Thymus revolutus [28] Thymus vulgaris [31] Actaea spicata [43] Clematis integrifolia [43] Clematis virginiana [43] Coptis coinensia [43] Hydrastis canadensis [43] Nigella sativa [42] Morinda citrifolia [53] Neonauclea sessilifolia [26] Pentas longiflora [43] Prismatomeris fragrans [27] Amyris elemifera [43] Aegle marmelos [42] Clausena excavata [61] Coleonema album [18] Commiphora mukul [42] Evodia elleryana [7] Evodia rutaecarpa [2] Galipea officinalis [43] Lunasia amara [3] Micromelum hirsutum [34] Pilocarpus racemosus [43] Ruta montana [47] Tetradium daniellii [1] Triphasia trifolia [43] Populus tremuloides [43] Salix caprea [43] Leucophyllum frutescens [38] Scrophularia deserti [58] Verbascum thapsus [42] --- ♦ : Espèces examinées dans le présent travail et se révélant antimycobactériennes. 281 Parmi les Asparagales, les Gentianacées et les Apiacées citées dans plusieurs travaux [15,19,22,29,40,42-44,50-51,54,57,62,72], nous n’avons pas trouvé de nouvelles espèces possédant une activité antimycobactérienne. Les Poacées, Crassulacées et Dipsacales testées n’ont pas permis de trouver in vitro de propriétés antimycobactériennes. La toxicité et l’effet in vivo des plantes dont les extraits sont capables de bloquer la croissance mycobactérienne mériterait d’être étudiée. Les principes des extraits non toxiques et actifs in vivo pourraient ensuite être purifiés et identifiés. RÉFÉRENCES 1- 2- 3- 4- 5- 6- Adams (M.), Ettl (S.), Kunert (O.), Wube (A.A.), Haslinger (E.), Bucar (F.), Bauer (R.) - Antimycobacterial activity of geranylated furocoumarins from Tetradium daniellii. - Planta Med., 2006, 72(12), 1132-1135. Adams (M.), Wube (A.A.), Bucar (F.), Bauer (R.), Kunert (O.), Haslinger (E.) - Quinolone alkaloids from Evodia rutaecarpa: a potent new group of antimycobacterial compounds. - Int. J. Antimicrob. Agents, 2005, 26(3), 262-264. 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The aqueous and ethanolic extracts were tested against the mycobacteria M. aurum, M. smegmatis, M. kansasii, M. bovis and M. vaccae. Thus, 14 plants were able to inhibit the growth of mycobacteria. Besides Juniperus oxycedrus, Pistacia lentiscus, and Ruta montana, 11 species (Populus alba, Cistus albidus, C. monspeliensis, C. salviifolius, Pistacia atlantica, Tamarix africana, Rubia peregrina, Thymus pallidus, Vitex agnus-castus, Verbascum sinuatum and Dittrichia viscosa) are reported here for the first time as having antimycobacterial activity. Key-words: antimycobacterial properties, Cistus, Mycobacterium __________