Développement d`un procédé à micro

Développement d’un procédé à micro-échelle
adapté à l’acylation enzymatique de peptides
Eric HUSSON, Xavier FRAMBOISIER, Catherine HUMEAU, Ivan MARC,
Jean-Marc COMMENGE, Laurent FALK, Isabelle CHEVALOT
LRGP (UPR CNRS 3349)
Cinétique d’acylation enzymatique du
6-amino-1-hexanol en mini-réacteur agité
OH
N-acylation
O-acylation
6-amino-1-hexanol
Lipase B de
C.antarctica
Substrats (M)
De nombreux travaux rapportent l’intérêt et le développement de microréacteurs pour la mise en œuvre de catalyses chimiques. L’utilisation de
microsystèmes (dimension comprise entre quelques micromètres et
quelques millimètres) permet une intensification du procédé, notamment
en améliorant les transferts de matière et d’énergie. Cependant, dans le
domaine de la biocatalyse, les études sont encore peu nombreuses :
récemment, des microréacteurs enzymatiques ont été décrits, par
exemple, pour cribler des enzymes, étudier des caractéristiques
cinétiques réactionnelles, ou encore, pour l’analyse de molécules dans
le but de permettre le séquençage de protéines par « peptide mapping »
H2N
+ Acide oléique
Acide oléique
O
H2N
O
O-oléyl aminohexanol
Enjeux scientifiques et technologiques
O
R
O
O-oléyl aminohexanol
Axe Procédés
O
Un montage expérimental innovant avec un microréacteur à lit fixe
(volume total de 500 µL) en présence d’enzymes immobilisées sur
supports a été mis en place; pour cela, un microréacteur en lit fixe a été
dimensionné et réalisé suivant le schéma suivant :
N,O-dioléyl aminohexanol
R
H
N
En plus d’être une voie prometteuse d’intensification des procédés de
biocatalyse, la mise en œuvre de mini- et micro-réacteurs permet de
générer des modèles cinétiques de façon efficace et rapide en limitant la
quantité de substrats nécessaires, lesquels peuvent être des réactifs
coûteux et disponibles en faible quantité (tels que les peptides à activité
biologique). Il s’agira d’étudier une réaction-modèle avec des substrats
simples afin d’évaluer les effets de la miniaturisation sur les
performances de la réaction catalysée avec une enzyme immobilisée :
la lipase B de Candida antarctica.
6-amino-1-hexanol
R
Produits (M)
Contexte socio-économique
N,O-dioléyl aminohexanol
Temps (h)
Résultats
Une étude préliminaire a été consacrée à l’acylation enzymatique d’une
molécule modèle, le 6-amino-1- hexanol dans un mini-réacteur agité de
5 mL et a permis de démontrer la capacité de la lipase B de Candida
antarctica immobilisée à catalyser l’acylation de ce substrat dans
différents milieux réactionnels. La mise en œuvre de cette réaction en
solvants organiques (2-méthyl-2-butanol) a conduit à la formation du
produit diacylé avec un rendement de 85 % montrant l’absence de
chimio-sélectivité de cette réaction.
L’étude s’est ensuite focalisée sur l’acylation de dipeptides tels que la
Lys-Ser,HCl. L’étude de l’acylation catalysée par la lipase B de Candida
antarctica immobilisée a montré une sélectivité exclusive en faveur de
l’acylation de la fonction amine en position ε de la lysine. Les cinétiques
ont été déterminées dans différents milieux réactionnels. Ces conditions
seront utilisées lors de la mise en œuvre du micro-réacteur en lit fixe.
Différentes pompes (pompe HPLC, pompe péristaltique) ont été
comparées pour la précision et la constance des débits. Finalement une
micro-pompe gérotor qui est une micro-pompe volumétrique rotative
(HNP Mikrosysteme GmbH) a pu être acquise, permettant de délivrer
des débits homogènes et constants de l’ordre de 10 à 100 µL/min.
Approche méthodologique
•
•
•
•
Détermination des conditions réactionnelles en mini-réacteur agité
pour l’acylation enzymatique d’une molécule modèle, le 6-amino-1hexanol. Evaluation des performances de cette réaction et de la
chimio- et régio-sélectivité enzymatique,
Validation de ces conditions opératoires sur des dipeptides de type
Lys-Ser, Ala-His
Dimensionnement d’un micro-réacteur en lit fixe et mise en place
d’un dispositif expérimental pour réaliser des synthèses avec
recyclage des substrats : comparaison de divers types de micropompes adaptés pour de faibles débits. Choix d’une micropompe.
Comparaison des performances d’acylation en réacteurs agités et en
micro-réacteur en lit fixe. Développement de modèles cinétiques à
micro-échelle.
Bilan – Perspectives de développement
Les travaux préliminaires en mini-réacteurs agités ont été valorisés
dans le cadre de congrès et de publications:
* Husson E., Garcia-Matilla V., Humeau C., Chevalot I., Fournier F., Marc I.
(2010). Enzyme and Microbial Technology, 46, 338–346
* Husson E., Humeau C., Harscoat C, Framboisier X, Paris C, Dubreucq E, Marc
I, Chevalot I. (2011). Process Biochemistry, 46, 945-952
* Naudot M, Ferrari F, Martins E, Aymes A, Kapel R, Humeau C, Delaunay S,
Chevalot I (2011). Amino acids acylation in aqueous medium using amino acylase
from Streptomyces ambofaciens. Biotrans 10th International Symposium on
Biocatalysis and Biotransformations October 2 – 6 2011, Giardini Naxos, Sicile
Des travaux sont en cours sur la mise en œuvre de réactions
enzymatiques dans le micro-réacteur en mode continu, recyclé.
Un contrat a pu être mis en place en 2012 avec la société SEPPIC
pour une durée de 6 mois dans le cadre d’un master 2 recherche pour
développer plus particulièrement des procédés d’acylation enzymatique
de certains acides aminés.
Ateliers Scientifiques - 10 mai 2012