Polymères à empreintes moléculaires, intérêt et

TECHNOLOGIE APPLIQUÉE
Delphine DERRIEN1 et Sami BAYOUDH1
Polymères à empreintes moléculaires,
intérêt et applications pour l’analyse
RÉSUMÉ
Les polymères à empreintes moléculaires sont des matériaux de synthèse obtenus par polymérisation
de monomères autour d’une molécule patron. Après élimination de cette molécule, le polymère obtenu
contient des cavités, des empreintes, possédant des sites de reconnaissance spécifiques. Il en résulte
la possibilité pour ces polymères de pouvoir reconnaître une molécule ou une famille de molécules
analogues dans des mélanges complexes. Cette propriété de reconnaissance rend les polymères à
empreintes moléculaires particulièrement intéressants pour différents types d’applications dans le
domaine de l’analyse, la préparation des échantillons, la préparation de phases stationnaires pour la
chromatographie et les séparations électrophorétiques, la mise au point de tests d’affinité et de capteurs.
Cet article constitue une introduction succincte à la technologie des polymères à empreintes moléculaires
ainsi qu’à son utilisation dans les domaines de la préparation d’échantillon et du développement de tests
ou de capteurs.
MOTS-CLÉS
Polymères à empreintes moléculaires, sélectivité, synthèse, extraction sur phase solide, analyse in vitro,
capteur, reconnaissance moléculaire
I - Introduction
SSupports
pppo
Détecter des concentrations d’analyte de plus en
plus faibles dans des milieux parfois très complexes est devenue une nécessité dans de nombreux
domaines et requiert des techniques d’analyses
fiables et spécifiques. Ces exigences ont imposé
l’intégration d’une étape de traitement de l’échantillon dans les protocoles d’analyse.
L’extraction sur phase solide (ou Solid Phase Extraction, SPE) constitue la technique la plus couramment utilisée de nos jours. De nombreux
supports ont été développés ces dernières années
mais la majorité d’entre eux conduisent à la co-extraction de composés issus de l’échantillon. Une
solution permettant de remédier à ce manque de
sélectivité consiste à utiliser des supports sélectifs basés sur un mécanisme de reconnaissance
moléculaire comme les polymères à empreintes
moléculaires, plus communément appelés MIPs
(Molecularly Imprinted Polymers). A l’instar de
systèmes naturels (enzyme-substrat, anticorpsantigène) ces matériaux de synthèse sont susceptibles de réagir avec des molécules cibles suivant le
modèle clé-serrure.
L’efficacité et les performances de ces polymères
comme support d’extraction en phase solide ont
été démontrées et ces matériaux font également
l’objet de nombreuses études dans le cadre du
développement de tests analytiques (similaires
aux tests ELISA) et de capteurs. On notera, enfin,
que les propriétés des MIPs en font également des
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Polyintell – 15, rue de la Carue – 76000 Rouen
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SPECTRA ANALYSE n° 260 • Janvier - Février - Mars 2008
matériaux d’intérêt pour des domaines d’applications dépassant le champ de la chimie analytique,
comme, par exemples, la catalyse ou la délivrance
de principe actif.
II - Principe
Décrite très simplement, l’élaboration des MIPs
consiste à créer un matériau polymérique qui
contient les empreintes d’une molécule d’intérêt (figure 1A). Ces matériaux sont obtenus par
impression ou moulage à l’échelle moléculaire.
En d’autres termes, ils sont obtenus par polymérisation de monomères autour d’une molécule
patron en présence d’un agent de réticulation et
d’un amorceur de polymérisation. Après l’élimination de la molécule patron, on obtient un
polymère poreux contenant ses empreintes, à
savoir des cavités possédant des sites de reconnaissance spécifique de cette molécule (figure 1B).
Ces cavités se révèlent donc complémentaires au
niveau spatial et fonctionnel de la molécule patron et le matériau produit est doté de propriétés
de reconnaissance moléculaire. La création de
l’empreinte d’une molécule d’intérêt, comme par
exemple, un pesticide, un stéroïde ou une toxine,
dans un polymère organique permet l’obtention
d’un support pouvant capter spécifiquement cette
molécule. Le choix des composants du matériau,
monomères et agents de réticulation, est orienté de façon à créer des interactions spécifiques
Technologie appliquée
Polymères à empreintes moléculaires, intérêts et application pour l’analyse
© POLYINTELL
avec la molécule cible, telles que des interactions
électrostatiques, des liaisons hydrogènes ou encore des interactions hydrophobes, susceptibles de
permettre un piégeage sélectif de celle-ci dans un
milieu complexe (plasma, urine, lait, eau...).
A)
1. Composition chimique et mise en forme
2. Cibles
L’utilisation des MIPs se révèle particulièrement
efficace lorsque les analytes cibles sont de petites
molécules organiques (masse inférieure à 2000
daltons) fonctionnalisées afin de permettre l’établissement des interactions spécifiques.
3. Intérêts
Le phénomène de reconnaissance moléculaire
est, de fait, omniprésent en chimie ou en biologie.
Dans ce dernier domaine, il est au cœur des réactions biologiques spécifiques comme, par exemple, la réaction anticorps-antigène qui implique la
reconnaissance et l’adsorption sélectives d’un antigène par un anticorps.
Des produits mettant en œuvre des anticorps sont
disponibles sur le marché pour des applications
d’extraction et de détection spécifiques. Toutefois, leur développement et leur utilisation se
heurtent à plusieurs difficultés. Le développement
Molécule d’intérêt
Matériau à empreinte
B)
Formation du moule
Assemblage des monomères
Figure 1
Polymères à empreinte, A) concept B) fabrication d’une empreinte.
© POLYINTELL
Les monomères et les agents de réticulation utilisés pour préparer ces matériaux sont des composés chimiques classiques du domaine des polymères de type acryliques, méthacryliques, vinyliques
et styréniques. D’autres monomères plus spécifiques peuvent également être synthétisés afin d’optimiser les interactions du polymère avec la molécule cible. Les réactifs utilisés et le protocole de
synthèse mis en œuvre sont déterminants vis-à-vis
de la nature des empreintes du MIP. Le type d’interaction entre la molécule patron et les monomères
permet de différencier plusieurs voies de synthèse :
non covalente, la plus largement utilisée, covalente
et semi-covalente.
Plusieurs méthodes de synthèse peuvent être mises
en œuvre pour préparer les MIPs : polymérisation
en masse, polymérisation par précipitation, polymérisation en suspension et polymérisation en
émulsion. Chacune de ces méthodes possède des
caractéristiques propres en termes de simplicité/
complexité de synthèse, de rendement, de coûts
de forme de matériaux obtenus (particules de taille
irrégulière, microbilles, nanobilles) (image 1). La
polymérisation en masse constitue aujourd’hui la
voie la plus utilisée. D’une réalisation relativement
simple, elle permet l’obtention d’un polymère monolithique qui devra notamment être broyé et tamisé avant son utilisation. Enfin, on doit également
signaler la possibilité de réaliser in-situ la synthèse
de polymère, cette alternative présente un intérêt
certain dès lors que les MIPs sont mis en oeuvre au
sein de systèmes miniaturisés.
Image 1
Cliché de billes de polymères à empreinte obtenu en microscopie électronique à balayage.
d’anticorps spécifiques pour un large éventail de
molécules constitue un processus long et coûteux.
Il est particulièrement complexe voire parfois impossible quand les cibles sont des molécules organiques de petites tailles. Autre point, le périmètre
d’utilisation de ces produits se trouve limité par
le fait qu’ils nécessitent des conditions de mise
en œuvre très douces (système aqueux, température ambiante). Si les MIPs présentent au niveau
de leur sélectivité des propriétés comparables aux
récepteurs biologiques, ils constituent par opposition des matériaux de synthèse chimique et se
caractérisent de ce fait par :
• des coûts de développement et de production
beaucoup plus faibles ;
• une plus grande stabilité ;
• la possibilité d’être utilisés dans des solvants variés ;
• une très bonne affinité pour de petites molécules
organiques ;
• une capacité plus importante (1).
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TECHNOLOGIE APPLIQUÉE
Les MIPs ne sont pas affectés par les changements
de milieu (passage en solvant organique), les variations de température (stérilisation) et de pH,
autant de conditions incompatibles avec des supports mettant en œuvre des ligands d’origine biologique. Par ailleurs, la stabilité de ces matériaux
et la reproductibilité des résultats obtenus permettent d’envisager des utilisations très diversifiées :
extractions et séparations analytiques, séparation à échelle semi-préparative ou préparative en
milieu industriel ou encore détection spécifique
(capteur,…).
4. Limites
Comme évoqué précédemment, l’impression moléculaire nécessite l’emploi de la molécule d’intérêt. Or, la mise en œuvre à grande échelle de molécules cibles peut être problématique dès lors que
celles-ci sont peu disponibles, onéreuses ou très
toxiques. Dans ces cas, l’utilisation d’un analogue
structuralement proche de la molécule cible, peu
coûteux, non toxique et potentiellement recyclable
constitue souvent une alternative envisageable (2).
Autre difficulté, l’extraction peut se heurter au relargage (ou « bleeding ») de la molécule empreinte. Ce phénomène est lié au fait que cette molécule
est encore présente dans les cavités du polymère
malgré les étapes de lavage appliquées à celui-ci. Il
se révèle particulièrement problématique lors de
l’analyse de composés présents à l’état de traces.
La synthèse du polymère avec utilisation d’un analogue constitue là encore une solution.
Les molécules peu fonctionnalisées sont difficilement imprimables et l’obtention d’un MIP d’une
cible dont le poids moléculaire est supérieur à
2000 daltons peut être complexe à obtenir.
III - Applications
1. Des domaines d’application variés
© POLYINTELL
2. Utilisation des MIPs
en extraction sur phase solide
Les MIPs sont majoritairement utilisés pour la préparation de cartouche SPE ou de plaques SPE 96
puits pour la préparation d’échantillon. Ils peuvent
également être mis en œuvre comme support dans
des colonnes d’HPLC ou dans des pré-colonnes
placées sur la valve d’injection pour réaliser des enrichissements et des purifications de matrice complexe avant passage sur des colonnes classiques.
Les MIPs s’utilisent de façon similaire à une phase
SPE classique avec l’enchaînement des étapes de
conditionnement, de chargement de l’échantillon,
de lavage pour éliminer les interférents puis d’élution durant laquelle les analytes d’intérêt sont extraits de la phase SPE (figure 2). La sélectivité de l’extraction est liée aux conditions
de réalisation de ces différentes
1
2
3
étapes, ainsi les solvants mis en
œuvre doivent être choisis afin
d’exploiter de façon optimale
les propriétés de reconnaissance du MIP. L’utilisation des
MIPs pour l’extraction en phase
solide a fait l’objet de travaux
de comparaison avec d’autres
MIP
méthodes d’extraction reposant
sur l’extraction liquide-liquide
Cible
Autres composés
ou l’utilisation d’autres phases
d’extraction, C18 ou Oasis HLB
Figure 2
(10, 11).
MIP pour l’extraction en phase solide (SPE). 1 : chargement, 2 : lavage, 3 : extraction.
Les propriétés des MIPs, dues à leurs synthèses spécifiques, permettent d’envisager leur utilisation dans
une vaste gamme d’applications : extraction de molécules de matrices complexes (milieux biologiques,
sols,…), concentration des échantillons pour analy-
32
ser des traces voire des ultra-traces, kit diagnostique
et capteur. Dans le domaine environnemental, les
MIPs ont, à titre d’exemple, déjà été employés afin
de mesurer la présence de polluant dans le sol ou
dans l’eau (3). Pour ce qui est du secteur pharmaceutique, la sélectivité de cette phase permet d’extraire
des principes actifs et leurs métabolites de matrices
complexes comme le sang, le plasma ou l’urine et
de concentrer les analytes présents à l’état de traces
(4). On notera que les MIPs permettent également
la réalisation de séparations chirales utiles lors de la
purification d’un principe actif. Ils font aussi l’objet
d’utilisation pour la détection de principes actifs en
purifiant l’échantillon et en concentrant les analytes
et leurs métabolites présents en faibles concentrations (5, 6). L’analyse en agroalimentaire constitue
un autre terrain d’application des MIPs avec, par
exemple, la détection ou l’extraction de molécules
variées comme des toxines présentes à l’état de traces ou des additifs (7, 8). L’utilisation des MIPs dans
des systèmes miniaturisés constitue actuellement
un domaine en plein développement, les avantages
associés à ce type de format reposent sur la capacité
d’analyser très rapidement, de très petits volumes
d’échantillon et de réduire les seuils de détection.
La mise au point d’un système microfluidique dédié
à la détection de la morphine a été récemment décrite, celui-ci associe l’utilisation de MIPs avec une
détection électrochimique (9).
SPECTRA ANALYSE n° 260 • Janvier - Février - Mars 2008
Technologie appliquée
Polymères à empreintes moléculaires, intérêts et application pour l’analyse
Molécules d’intérêt (Référence)
Phénylurée (12)
Organophosphoré (11)
Dopamine (13)
Caféine (14)
Théophylline (15)
Matrice
Maïs
Eau, sol
Urine
Plasma, cola
Thé vert
Tableau I
Références d’utilisation de MIPs en SPE.
2000
mAU
1000
4-OH-Tam
Tam
0
0
5
10
15
20
Temps (min)
Figure 3
Analyses d’une urine avec traitement MIP (en bleu) et traitement classique HLB (en rose).
© POLYINTELL
Les analyses chromatographiques réalisées après
des prétraitements impliquant des MIPs se
caractérisent par une meilleure ligne de base
ainsi que par de meilleurs taux de recouvrements, améliorant notablement la limite de détection du produit analysé. Le Tableau I donne
quelques exemples d’utilisation des MIPs pour
une application SPE. On citera également, à
titre d’exemple, l’extraction quantitative d’une
molécule dopante, le tamoxifène (Tam) et son
principal métabolite, le 4 hydroxy tamoxifène
(4-OH Tam) (16) (ce travail est le fruit d’une
collaboration entre l’Institut de Chimie Organique et Analytique, Université d’Orléans ;
l’Agence Française de Lutte contre le Dopage,
département des analyses, Chatenay-Malabry
et la société POLYINTELL). La Figure 3 illustre
l’intérêt d’un polymère à empreinte moléculaire
pour la préparation de l’échantillon comparativement à l’utilisation d’un support HLB. L’utilisation du MIP permet l’élimination des pics
interférents et ainsi l’analyse quantitative du
métabolite et du Tamoxifène, ce qui n’est pas le
cas pour le support HLB pour lequel le pic du
métabolite sort dans un massif d’interférents.
3. Mise en œuvre des MIPs dans le domaine
des tests d’affinité et des capteurs
Les propriétés de reconnaissance hautement spécifiques des MIPs permettent de les utiliser pour
mettre au point des essais in vitro, comparables
au test ELISA ou encore des capteurs chimiques et des biocapteurs. Ce type d’applications
fait aujourd’hui l’objet de travaux de recherche et
développement. Des MIPs ont été mis en oeuvre
dans des tests d’affinité fondés sur des méthodes
par compétition ou par déplacement (8, 17, 18).
La Figure 4 illustre le principe d’un test par déplacement, un marqueur (agent fluorescent ou colorant) présent dans les cavités du polymère est
déplacé par l’analyte d’intérêt. Le déplacement du
marqueur, ou son absence, révèle la présence ou
l’absence de l’analyte dans l’échantillon testé. Les
MIPs peuvent dans certains cas se substituer aux
anticorps dans des tests immunologiques et leurs
utilisations dans ce domaine ouvrent de nouvelles
perpectives, par exemple lorsqu’il est impossible
de générer des anticorps spécifiques d’un antigène particulier. Ce type de tests pourra trouver
des applications tant dans le secteur du diagnostic biologique que dans les domaines de l’analyse
environnementale, de la sécurité alimentaire et
du contrôle de qualité.
Présence >> Coloration
Témoin :
Absence >> Pas de changement
Figure 4
Schéma du principe de fonctionnement du test par déplacement à base de MIP.
La sélectivité, la robustesse et la possibilité de les
synthétiser à des coûts relativement bas, font des
MIPs des matériaux attractifs pour le développement de capteurs. Les MIPs constituent l’élément de reconnaissance au sein de ces systèmes .
Un transducteur permet de traduire le signal
chimique ou physique résultant de l’adsorption
de l’analyte sur le MIP en un signal facilement
quantifiable (microgravimétrie, résonance
plasmonique de surface, microcalorimétrie,
SPECTRA ANALYSE n° 260 • Janvier - Février - Mars 2008
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TECHNOLOGIE APPLIQUÉE
fluorescence ou activité électrochimique).
Belmont et al. ont décrit récemment le développement d’un capteur basé sur l’utilisation d’un
film de MIPs déposé sur un transducteur de verre
(19). Ce capteur permet la détection de l’atrazine à
des concentrations de l’ordre de 1,7 ppm, la quantification du signal est effectuée par spectroscopie
d’interférence réflectrométrique. Toujours dans le
domaine environnemental, une équipe de l’université de l’Université de Cranfield au Royaume-Uni a
développé un capteur destiné à la détection d’une
cyanotoxine, la microcystine-LR. Le MIP utilisé
par cette équipe a été mis en œuvre à la fois pour
préparer une cartouche SPE et l’élément de reconnaissance d’un capteur piézoélectrique (20). Selon
une approche similaire basée sur l’utilisation d’un
MIP pour l’extraction puis la détection, une équipe
indienne a décrit l’année dernière la mise au point
d’un outil diagnostique dédié à la quantification de
la créatine dans le sérum (diagnostic des syndromes
de déficience en créatine) (21).
IV - Conclusion
La synthèse de MIPs ciblant des molécules de faible
masse moléculaire est aujourd’hui mature. Le développement de MIPs pour les macromolécules constitue quant à lui un domaine en pleine investigation.
Concernant les applications, celles qui sont liées à la
préparation des échantillons par SPE présentent un
intérêt reconnu dans des domaines variés (pharmacie,
environnement, agroalimentaire).
Des phases sont aujourd’hui commercialisées. L’utilisation des MIPs comme phases stationnaires en
HPLC analytique nécessite encore des améliorations.
En effet, le manque d’homogénéité des sites ainsi
qu’un faible transfert de masse entraînant un phénomène de traînée des pics confèrent aux MIPs de faibles
performances chromatographiques pour les applications analytiques. Enfin d’autres champs d’applications, tels que le développement de capteurs ou la
mise au point d’outils de découverte de médicaments
sont aujourd’hui en phase d’émergence.
BIBLIOGRAPHIE
(1) CHAPUIS F., PICHON V., HENNION MC, Molecularly imprinted
polymers: developments and applications of new selective solid-phase extraction materials, LC-GC Europe, 2004, 17, 408-417.
(2) Brevet FR, n° 0552032, 4 juillet 2005, POLYINTELL
(3) TARLEY CRT, KUBOTA LT, Molecularly imprinted solid phase
extraction of cathecol from aqueous effluents for its selective
determination by differential pulse voltammetry, Analytica Chimica Acta, 2005, 548, 11-19.
(4) CHAPUIS F., MULLOT JU, PICHON V., TUFFAL G., HENNION MC,
Molecularly imprinted polymers for the clean-up of a basic drug
from environmental and biological samples, Journal of Chromatography A, 2006, 1135, 127-134.
13 SUEDEE R., SEECHAMNANTURAKIT V., CANYUK B., OVAT
LARNPORN C., MARTIN GP. Temperature sensitive dopamineimprinted (N,N-methylene-bis-acrylamide cross-linked) polymer and its potential application to the selective extraction of
adrenergic drugs from urine, Journal of chromatography A, 2006,
1114, 239-249.
(14) THEODORIDIS G., MANESIOTIS P., Selective solid-phase extracton sorbent for caffeine made by molecular imprinting, Journal of Chromatography A, 2002, 948, 163-169.
(5) ZURUTUZA A., BAYOUDH S., CORMACK PAG, DAMBIES L.,
DEERE J., BISCHOFF R., SHERRINGTON DC, Molecularly imprinted solid phase extraction of cocaine metabolites from aqueous
sample, Analytica Chimica Acta, 2005, 542, 14-19.
(15) WANG D., PYO HONG S., HO ROW K., Solid extraction of
caffeine and theophylline from green tea by molecularly imprinted polymer, Korean J. Chem. Eng., 2004, 21(4), 853-857.
(6) ARIFFIN MM, MILLER EI, CORMACK PAG, ANDERSON RA, Molecularly imprinted solid-phase extraction of diazepam and its
metabolites from hair samples, Analytical chemistry, 2007, 79,
256-262.
(16) CLAUDE B., MORIN P., LAFOSSE M., PASCAUD J., CEAURRIZ
J DE, BAYOUDH S. NARAGHI K., Extraction quantitative sur un
polymère à empreintes moléculaires d’une molécule dopante
dans l’urine d’un sportif, Communication par poster présentée
lors du Congrès AFSEP 2007.
(7) BRÜGGEMANN O., VISNJEVSKI A., BURCH R., PATEL P., Selective
extraction of antioxidants with molecularly imprinted polymer,
Analytica Chimica Acta, 2004, 504, 81-88.
(17) GREENE NT, SHIMIZU KD, Colorimetric molecularly imprinted polymer sensor array using dye displacement, J. Am. Chem.
Soc., 2005, 127, 5695-5700.
(8) NAVARROVILLOSLADA F., URRACA JL, MORENOBONDI
MC, ORELLANA G., Zearalenone sensing with molecularly imprinted polymers and tailored fluorescent probes, Sensors and
actuators B, 2007, 121, 67-73.
(18) Brevet POLYINTELL, déposé.
(9) WENG CH, YEH WM, HO KC, LEE GB, A microfluidic system utilizing molecularly imprinted polymer films for amperometric detection of morphine, Sensors and Actuators B, 2007,121, 576-582.
(10) BAGGIANI C., ANFOSSI L., GIOVANNOLI C., Solid phase extraction of food contaminant using molecularly imprinted polymers, Analytica chimica acta, 2007, 591, 29-39.
(11) ZHU X., YANG J., SU Q., CAI J., GAO Y., Selective solid-phase
extraction using molecularly imprinted polymer for the analysis
of polar organophosphorus pesticides in water and soil samples,
Journal of chromatography A, 2005, 1092, 161-169.
34
(12) TAMAYO FG, CASILLAS JL, MARTINESTEBAN A., Evaluation
of new selective molecularly imprinted polymers prepared by
precipitation polymerisation for the extraction of phenylurea
herbicides, Journal of chromatography A, 2005, 1069, 173-181.
SPECTRA ANALYSE n° 260 • Janvier - Février - Mars 2008
(19) BELMONT AS, JAEGER S., KNOPP D., NIESSNER R., GAUGLITZ
G., HAUPT K., Molecularly imprinted polymer films for reflectometric interference spectroscopic sensors, Biosensors and Bioelectronics, 2007, 22, 3267-3272.
(20) CHIANELLA I., PILETSKY SA, TOTHILL IE, CHEN B., TURNER
APF, MIP-based solid phase extraction cartridges combined with
MIP-based sensors for the detection of microcystin-LR, Biosensors and Bioelectronics, 2003, 18, 119-127.
(21) SHARMA PS, DHANA LAKSHMI D., PRASAD BB, Molecularly
imprinted solid-phase extraction combined with molecularly
imprinted polymer-sensor: a diagnostic tool applicable to creatine deficiency syndrome, Biomedical Chromatography, 2007, 21,
976-986.