Travail réalisé par Mélanie Stettler Laboratoire AMS

Transcription

Travail réalisé par Mélanie Stettler
Sous la direction du Dr. Raphaël Coquoz
Novembre 2007-Avril 2008
Laboratoire AMS
Département de Génétique
Place de la Navigation 10
1006 Lausanne
Mars 2008
SOMMAIRE
Le virus du Papillome humain, encore bien inconnu pour bon nombre de citoyens,
s’avère être assez redoutable puisqu’il n’épargne que très peu de personnes; sa
transmission par voie sexuelle est même relativement commune.
Il est la principale cause du cancer du col de l’utérus (environ 99% des cas sont dus
aux HPV de type haut risque), ainsi que de son précurseur, la néoplasie
intraépithéliale cervicale (CIN).
Actuellement, le frottis cervico-vaginal est un outil indispensable dans le cadre de la
prévention de ces deux pathologies. La détection de la présence du virus HPV luimême est possible grâce aux analyses de biologie moléculaire, avec diverses
stratégies de mise en évidence. Dans le cadre de mon travail de diplôme, il a été
question du kit LINEAR ARRAY HPV Genotyping test (Roche) qui permet la mise en
évidence des 37 génotypes HPV les plus fréquents.
Ce test combine 4 procédés (extraction, amplification, hybridation et détection), sur
lesquels j’ai testé des modifications (raccourcissement de la détection, volume PCR
réduit, extraction JetQuick,…) susceptibles de raccourcir la durée du protocole ou
d'en simplifier la pratique: chaque modification testée isolément révélait un résultat
satisfaisant par rapport à celui obtenu avec le protocole standard. Or, une fois ces
changements regroupés, les résultats ne s'avéraient plus aussi bons. Pour atteindre
l'objectif de simplification du protocole, des essais plus étendus seraient donc
nécessaires.
Un autre point de mon travail fut l’adaptation du kit en real-time PCR sur le RotorGene qui ne s’est malheureusement pas avéré aussi concluant qu’espéré : les
courbes de fusion obtenues grâce au programme de la Melt Curve permettent de
détecter le caractère positif des échantillons au stade de la PCR déjà. Toutefois, des
investigations plus poussées seraient là aussi nécessaires pour garantir que la Melt
Curve permet de trier les échantillons positifs et négatifs avec la même sensibilité
que l’hybridation sur LINEAR ARRAY.
Nous avons néanmoins pu établir la robustesse du kit Roche par rapport à plusieurs
points importants, ainsi que débroussailler quelques pistes vers un protocole simplifié
et personnalisé.
Mots-clés : Réaction de polymérase en chaîne en temps réel, marqueur vert
fluorescent des acides nucléiques (Syto 9), Virus du papillome humain, test de
génotypage, hybridation sur bandelettes en nylon.
Stettler Mélanie
47ème TAB ES
Travail de diplôme:
Introduction d'un test de génotypage HPV
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Mars 2008
SUMMARY
The Human Papilloma Virus, still unknown for many citizens, is very fearsome as he
spares only few people: his sexual transmission is really common.
It’s the main cause of cervical cancer (about 99% of the cases due to HPV high risk
types) and of cervical intraepithelial neoplasia (his precursor).
Cervical sample screening is presently the main tool for the prevention of these two
pathogeneses. We can also detect the virus itself with the help of several molecular
biology analysis.
Within the context of my diplom, we tested the LINEAR ARRAY HPV Genotyping test
(Roche), which detects 37 frequent anogenital genotypes
This test is a combination of 4 processes (extraction, amplification, hybridization and
detection), that I tried to modify (detection shortening, reduced PCR volume,
JetQuick extraction and so one) with the aim of simplifying or shorthening the
protocol. Each modification alone tested gave a satisfying result.
Nevertheless, by combining all these modifications, the results weren’t as good as
with single modifications alone.
To reach our objective (simplifying Roche’s protocol), other wider attempts should be
necessary.
As second aim I tried to adapt this genotyping test to real-time PCR, on the
RotorGene. Unfortunately this part of my work hasn’t been as conclusive as
expected: the melt curves, which we get with a Melt Curve program, allowed us to
detect HPV positive samples already at the level of the PCR. However more
investigations should be necessary to conclude to the Melt curve capacity to sort
negative and positive samples with the same sensitivity as LINEAR ARAY
Hybridization.
We could nevertheless establish the robustness of the LINEAR ARRAY HPV
Genotyping test in relation to some parameters and do the spadework on some
tracks to a simpler and personal protocol.
Keywords : Real-time Polymerase Chain Reaction, green-fluorescent nucleic acid
stain (Syto 9) Human Papilloma Virus, genotyping test, hybridization on nylon strips.
Stettler Mélanie
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1 TABLE DES MATIERES
1
2
TABLE DES MATIERES ................................................................................................. 4
INTRODUCTION.............................................................................................................. 6
2.1
Virus du Papillome humain (HPV) ............................................................................ 6
2.1.1
Description et caractéristiques ........................................................................... 6
2.1.2
Classification...................................................................................................... 6
2.1.3
Mode de transmission......................................................................................... 7
2.1.4
Biologie virale .................................................................................................... 7
2.1.5
Pathologies ....................................................................................................... 10
2.1.6
Facteurs de risques ........................................................................................... 15
2.1.7
Diagnostic de l’infection à HPV et des lésions associées ................................ 15
2.1.8
Traitements, Screening et Prévention............................................................... 16
2.2
Biologie Moléculaire................................................................................................ 20
2.2.1
L’ADN ............................................................................................................. 20
2.2.2
L’extraction d’ADN ......................................................................................... 21
2.2.3
La Polymerase Chain Reaction (PCR) ............................................................. 21
2.2.4
L’hybridation des acides nucléiques ................................................................ 22
2.2.5
La migration sur gel d’agarose......................................................................... 23
3
BUTS................................................................................................................................ 24
4 DEVELOPPEMENTS ..................................................................................................... 25
4.1
Matériel et méthodes ................................................................................................ 25
4.1.1
LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test ....................................................... 25
4.1.2
Kit d'extraction Jet Quick (JQ)......................................................................... 30
4.1.3
RotorGene ........................................................................................................ 31
4.1.4
Syto 9 : Green fluorescent nucleic acid stain ................................................... 32
4.1.5
Thermocycler T3000 ........................................................................................ 32
4.1.6
Protocole Roche LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test............................ 33
4.1.7
Préparation du Digest Buffer concentré 5x:..................................................... 33
4.1.8
Extraction JetQuick (protocole de base) .......................................................... 33
4.1.9
Protocole de précipitation................................................................................. 34
4.1.10
Gel d'agarose 3.5%........................................................................................... 34
4.1.11
PCR de quantification du contrôle interne ....................................................... 35
4.1.12
Real-time PCR et Melt Curve HPV sur RotorGene:........................................ 36
4.1.13
Matériel biologique: ......................................................................................... 38
4.1.14
Etablissement du nombre de copies d’HPV dans les échantillons utilisés : .... 39
4.2
Résultats ................................................................................................................... 39
4.2.1
Choix du volume de la PCR :........................................................................... 39
4.2.2
Raccourcissement des étapes de détection et tests de robustesse: ................... 41
4.2.3
Introduction de l’extraction JetQuick à la place d’Amplilute :........................ 44
4.2.4
Survie de l'Ampérase :...................................................................................... 49
4.2.5
Adaptation du protocole Roche en real-time PCR : ......................................... 50
4.2.6
Evaluation globale méthode Roche-méthode modifiée : ................................. 56
4.2.7
Comparaison LINEAR ARRAY HPV Genotyping test avec la Méthode
Hybrid Capture 2 (HC2) de Digène: ................................................................................ 58
4.2.8
Comparaison LINEAR ARRAY HPV Genotyping test avec le test INNOLiPA HPV Genotyping V2 de Innogenetics pratiqué chez MCL: ................................... 61
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5
6
7
8
9
4.3
Discussion ................................................................................................................ 62
4.3.1
Choix du volume de la PCR :........................................................................... 62
4.3.2
Raccourcissement de l’étape de détection et tests de robustesse: .................... 63
4.3.3
Introduction de l’extraction JetQuick à la place d’Amplilute :........................ 64
4.3.4
Survie de l'Ampérase :...................................................................................... 65
4.3.5
Adaptation du protocole Roche en real-time PCR : ......................................... 66
4.3.6
Evaluation globale méthode Roche-méthode modifiée : ................................. 67
4.3.7
Comparaison LINEAR ARRAY HPV Genotyping test avec la Méthode
Hybrid Capture 2 (HC2) de Digène: ................................................................................ 67
4.3.8
Comparaison LINEAR ARRAY HPV Genotyping test avec le test INNOLiPA HPV Genotyping V2 de Innogenetics, pratiquée chez MCL: ................................ 68
CONCLUSION ................................................................................................................ 70
5.1
Conclusion générale ................................................................................................. 70
5.2
Conclusion personnelle ............................................................................................ 71
BIBLIOGRAPHIE ........................................................................................................... 72
REMERCIEMENTS ........................................................................................................ 74
ANNEXES ....................................................................................................................... 75
8.1
Annexe I : Liste des Figures..................................................................................... 75
8.2
Annexe II : Version d’hybridation et de détection avec un bain-marie
insuffisamment rempli.......................................................................................................... 76
8.3
Annexe III : Comparaison établie quant à l’avancée du séchage............................. 77
8.4
Annexe IV : Variabilité inter- et intrasérielle rendement extraction JQ-Amplilute. 78
8.5
Annexe V: Protocole LINEAR ARRAY HPV Genotyping test .............................. 79
LEXIQUE....................................................................................................................... 107
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2 INTRODUCTION
2.1 Virus du Papillome humain (HPV)
2.1.1 Description et caractéristiques
Le Human Papilloma Virus est un virus d’environ
55 nm de diamètre, non-enveloppé et de forme
icosaédrique.
Il est doté d’une structure protéique d’origine virale,
dénommée capside, qui entoure son matériel
génétique :
un
ADN
bicaténaire 1
circulaire,
2
d'approximativement 8000 nucléotides , codant pour
plusieurs gènes différents, issus de trois régions
distinctes.
Le détail de ces régions sera présenté dans le
chapitre concernant la biologie virale.
Figure 1 : HPV en microscopie
électronique
A ce jour, on dénombre plus d'une centaine de génotypes 3 HPV différents, tous
désignés par un nombre attribué en fonction de leur ordre chronologique de
découverte, ainsi qu'à peu près 40 types capables d’infecter la muqueuse génitale
humaine.
2.1.2 Classification
Il existe plusieurs manières de classifier ces virus :
a) Classification classique :
Règne : Virus
Groupe : Groupe I (dsDNA)
Famille : Papillomaviridiae
Genre : Papillomavirus
Espèce : virus du papillome humain (VPH)
Types : ex. : HPV-1, 2, 4,7…
b) Classification basée sur le génotype et l’analyse phylogénétique 4 :
« Leur classification, basée sur le génotype et l’analyse phylogénétique,
permet de les différencier en fonction de leur tropisme (cutanés ou muqueux),
de leur propriété biologique et de leur potentiel oncogénique (bas risque et
haut risque) » (Monsonego, 2006, p.4)
c) Classification selon le pouvoir cancérigène :
Les Humans Papilloma Viruses, du point du vue pouvoir cancérigène, sont
subdivisés en deux catégories, les HPV de haut risque B (ex.: 16,18, 31, 33,
35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68,…) et les HPV de bas risque A (6,11, 26, 40,
42, 53, 54, 55, 61, 62, 64, 66, 67, 69, 70, 71, 72, 73,…).
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2.1.3 Mode de transmission
Il existe 4 modes de transmission pour ce virus:
a) Transmission sexuelle:
C'est le principal mode de contraction du virus HPV et aussi un des plus
communs: on estime que «pas loin de 75% des femmes seraient exposées»
(Koutsky, 1997, p.3-8) au virus à un moment donné de leur existence.
C’est la principale voie de transmission des condylomes 5 génitaux.
b) Transmission par contact direct:
Elle s’effectue à travers des abrasions cutanées : la verrue vulgaire, par exemple
est transmissible par grattage.
c) Transmission par contact indirect :
C’est la principale voie de propagation des verrues plantaires, qui sont transmises
par contact avec des objets ou surfaces contaminés, comme par exemple le sol
de la piscine. Il faut savoir que le virus du papillome humain s’introduit plus
aisément dans un épiderme gorgé d’eau.
d) Transmission périnatale:
Au moment de l’accouchement, une mère porteuse du virus HPV peut contaminer
son enfant, induisant ainsi le développement de condylomes laryngés.
2.1.4 Biologie virale
Bien qu’il existe plus de 100 génotypes connus pour ce virus, il semblerait qu’il y ait
une organisation génétique commune : sur un des deux brins d’ADN, on dénombre
une dizaine de cadres de lectures 6 qui sont groupés en trois régions principales :
- la région E (early) : elle code pour 8 protéines non structurales, à savoir :
• E1 : protéine responsable de la réplication de l’ADN viral.
• E2 : protéine responsable de la régulation de la transcription.
• E3 : cette protéine n’a pas de fonction connue.
• E4 : protéine responsable de la maturation des virions.
• E5 : protéine responsable de la stimulation de la prolifération cellulaire.
• E6 : protéine oncogène favorisant la dégradation de la protéine p53.
• E7 : protéine oncogène favorisant la dégradation de la protéine de
susceptibilité au rétinoblastome (pRb).
• E8 : cette protéine n’a pas de fonction connue.
La réplication virale est contrôlée par E1 liée à E2, formant ainsi un
hétérodimère 7 qui se fixera au site de réplication virale ori.
La protéine E2, sous forme d’homodimère 8, bloque l’expression des gènes
E6/E7 9, dont les protéines correspondantes, de même que E5, sont
impliquées dans les mécanismes de transformation et immortalisation
cellulaire.
-
la région L (late) : elle code pour les protéines de la capside L1 (protéine
majeure) et L2 (protéine mineure).
Stettler Mélanie
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Les protéines L1 ont la capacité de s’auto-assembler de manière à former des
particules virales vides, semblables à des capsides, et appelées Virus like
particules ; elles sont fortement immunogènes 10. Les protéines L2, quant à
elles, ont le pouvoir de positionner correctement l’ADN viral au sein de la
capside, après s’être liées à lui.
-
la
région
LCR
(non
codante) : c’est une région
très variable de 400 à 1000
nucléotides, située entre les
cadres de lectures L1 et
E6/E7. « Elle contient un
site ori (site d’origine de
réplication
virale),
les
11
des gènes
promoteurs
précoces et des séquences
de
régulation
de
la
réplication
et
de
la
transcription. »
(Monsonego, 2006, p.4)
Figure 2 : Génome HPV
1. Infection par HPV et cycle viral :
En présence de microlésions, le virus va pouvoir pénétrer dans la peau et atteindre
les cellules basales de l’épithélium, dans lesquelles il va s’installer par un
phénomène d’endocytose 12.
« Le transport cytosolique 13 des particules virales emprunte alors les réseaux de
microtubules et des filaments d’actine pour se diriger vers le noyau » (Monsonego,
2006, p.7), dans lequel elles seront transloquées, après démantèlement de la
capside virale.
En ce qui concerne HPV, il est important de souligner que son cycle viral est
composé de deux phases : la non-productive et la productive.
-
Phase non- productive : elle se déroule dans son ensemble, au niveau des
cellules basales de l’épithélium qui conservent de grandes propriétés de
division.
Sous le contrôle des protéines E1 et E2, l’ADN viral est répliqué, sous forme
épisomale 14, de manière à atteindre 50-100 copies par noyau. Il faut préciser
que ce nombre de copies sera également maintenu dans les cellules filles,
« dont l’arrêt du cycle cellulaire et la différentiation, normalement observés lors
de l’ascension des cellules dans l’épithélium, sont retardés par l’infection »
(Monsonego, 2006, p.7)
Après division cellulaire, une des cellules filles reste au niveau de cet
épithélium (stratum basale), tandis que l’autre migre au stratum spinasum et
entreprend sa différenciation.
Lors de cette phase, seules les régions précoces sont exprimées.
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Figure 3 : Localisation des différentes étapes du cycle viral
-
Phase productive : au niveau des cellules du stratum granulosum, le génome
viral continue à être amplifié, grâce à l’expression des gènes viraux.
Dans la partie la plus superficielle, le stratum corneum, les gènes tardifs (L1 et
L2) sont exprimés, induisant ainsi la synthèse des protéines de la capside
ainsi que le relarguage des particules virales.
Enfin, les virions 15 matures et infectieux issus de cette réplication, sont
relargués au cours du processus de desquamation 16.
Cette phase productive, « étroitement dépendante du processus de
différenciation des cellules épithéliales, ne se déroule que dans les couches
les plus superficielles de l’épithélium » (Monsonego, 2006, p.8)
La réplication des HPV entraîne un effet cytopathogène 17 :
l’analyse d’un frottis gynécologique révèle la présence de
koïlocytes, « cellules vacuolisées à gros noyaux »
(Monsonego, 2006, p.8) pratiquement typiques d’une
infection à HPV.
Halo périnucléaire= zone de nécrose cytoplasmique
Figure 4 : koïlocytes
(frottis conventionnelcoloration de
Papanicolaougrossisement 200x)
2. Carcinogenèse :
Lors d’infections par le virus du Papillome Humain, certains sujets développent des
lésions purement virales, appelées condylomes plans ou lésions cervicales de bas
grade, dans lesquelles le virus parvient à maturation, mais sans pour autant arriver à
intégrer le génome de son hôte. Dans différentes couches de l’épithélium
malpighien 18, on notera tout de même l’expression des gènes L1 et L2, codant pour
la synthèse de la capside, de même que la présence d’une toute petite quantité de
protéines E6 et E7, produites de manière à pouvoir être contrôlées (rôle de E2) et à
être reconnues antigéniquement.
Ces lésions, témoins d’une dysplasie 19 légère au niveau du col utérin, peuvent se
transformer en lésions de haut grade (dysplasie sévère ou carcinome 20 in situ),
laissant place à l’expression des gènes viraux E6-E7, normalement réprimés par E1Stettler Mélanie
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E2 grâce à un contrôle intra- et intercellulaire, comme vu précédemment, lors de la
réplication virale.
En cas de dysplasie sévère, le virus ne parvient cette fois-ci pas à maturation (état
épisomal immature) et l’ADN viral reste toujours extrachromosomique. Toutefois, ce
type-ci de dysplasie peut aisément être considéré comme une lésion à risque, étant
donné que le virus HPV, par une succession d’événements, arrive à intégrer son
génome à celui de l’hôte, phénomène qui est toujours associé à la cancérisation :
Pour commencer, on assiste à une augmentation de la synthèse des protéines E6E7, puisque le contrôle de la transcription des gènes correspondants est perturbé.
De plus, un dysfonctionnement au niveau de l'immunité naturelle (complexe Majeur
d'Histocompatibilité), contribue également à cette synthèse massive.
Ces deux protéines virales pourront alors aisément accomplir leur rôle :
-
-
E6 ira se lier à la protéine p53, de manière à bloquer l’activité de cette
dernière; on relèvera alors une résistance à l’apoptose 21 et une instabilité
chromosomique augmentée.
E7 fixera la protéine Rb, permettant ainsi une immortalisation cellulaire.
Ce blocage de la fonction suppressive de la transformation, par inhibition de p53 et
Rb, permettra finalement à l’ADN des HPV à risque de pénétrer à l’intérieur du
génome de l’hôte.
Cette intégration doit donc sérieusement être prise en considération, étant donné
qu’elle augmente le risque de transformation et de cancer.
Pour conclure ce chapitre sur la carcinogenèse, il faut, selon Joseph Monsonego
(2006), retenir que :
« le processus de transformation des cancers du col utérin positifs pour HPV
requiert l’expression de gènes viraux spécifiques et que celle-ci n’est
habituellement observée qu’après une longue période, suggérant des interactions
biologiques complexes et individuelles entre l’ADN viral et le génome cellulaire. »
(p.28)
2.1.5 Pathologies
Tous les types de virus du papillome humain stimulent la multiplication de l’épithélium
qu’ils infectent, permettant ainsi la formation de lésions prolifératives. Cependant, il
est important de souligner que seul un sous-ensemble de ces génotypes
sexuellement transmissibles, dits HPV à haut risque, est lié à la dysplasie cervicale
sérieuse et au cancer du col de l’utérus. Les HPV bas risque, quant à eux, sont
souvent associés aux lésions intra-épithéliales bénignes ou aux condylomes.
En-dehors de ces HPV infectant les muqueuses, il existe une catégorie de génotypes
viraux qui s’attaque préférentiellement à la peau.
Il est donc primordial de distinguer les pathologies dues à chacun de ces types, étant
donné que leur signification et leur évolution n’est de loin pas la même.
1. Pathologies dues aux HPV de type bas risque :
Il s’agit là de tumeurs bénignes des muqueuses malpighiennes, communément
appelées « papillomes ».
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Nous verrons que pour une de ces manifestations cliniques, l’origine peut être aussi
bien une infection par un HPV type bas risque que par un HPV haut risque.
a) Papillomatose du larynx
Il s’agit là de condylomes laryngés touchant les nourrissons ayant été infectés par
des HPV maternels (surtout les génotypes 6 et 11), au moment de
l’accouchement.
Ces verrues sont extrêmement difficiles à traiter (plusieurs séances de laser sous
anesthésie) et peuvent engendrer des problèmes respiratoires aigus.
Selon le site de l’Office Fédérale de la Santé Publique (OFSP), (31 juillet 2007) la
fréquence de cette pathologie est de « 4,7/100'000 naissances ».
b) Les condylomes ano-génitaux acuminés ou « crêtes de coq »
Ils sont décrits comme de grosses papules 22 de taille
variable et de couleur rouge, gris-brun ou blanche.
Ces verrues génitales sont souvent nombreuses et
tendent à former des couches.
Selon l'OFSP « plus de 90% d’entre elles sont dues
aux HPV 6 et 11 », dont le contact infectant engendre
déjà des lésions 2 à 8 mois après.
Ils affectent aussi bien les hommes que les femmes,
avec un pic de prévalence aux alentours de 25 ans.
Figure 5
« Le site le plus souvent concerné chez la femme est la vulve dans son territoire
cutané ou muqueux. L’extension au périnée 23 et à la région périanale est
habituelle » (Monsonego, 2006, p.37). Quant à l’homme, les condylomes se
forment généralement sur le prépuce.
Les crêtes de coq peuvent disparaître spontanément, mais il existe également
des traitements visant à leur élimination : cryothérapie 24, laser, cautérisation 25,…
Dans de rares cas, on peut observer des condylomes acuminés géants, signe de
la tumeur de Buschke-Löwenstein, commentée ultérieurement.
c) Les condylomes plans ano-génitaux
Tout d’abord, il convient de distinguer les condylomes plans externes des
organes génitaux externes, des condylomes plans du col de l’utérus ; ce sont sur
ces derniers que nous allons nous concentrer.
Les condylomes plans, appelés aussi dysplasie légère ou néoplasie 26
intraépithéliale cervicale de degré 1 (CIN 1=Cervical intraepithlial neoplasia), sont
des lésions kératinisées 27 légèrement surélevées pouvant coloniser l’ensemble
des muqueuses ano-génitales. Lorsqu’ils atteignent le col utérin il y a un risque
non négligeable d’évolution vers un cancer, en passant auparavant par les
différents stades de dysplasies (traités plus loin).
Elles sont souvent invisibles à l’œil nu, mais il est possible de les reconnaître en
colposcopie 28 : elles deviennent blanches après application d’une solution d’acide
acétique 5%.
Les condylomes plans peuvent être provoqués aussi bien par un HPV bas risque
qu’un haut risque (notamment 16 et 18).
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Une particularité cytologique accompagne ces lésions planes: il s’agit de
koïlocytes, « cellules à large halo clair cytoplasmique (koïlos = creux en grec)
cernant deux noyaux qui contiennent des particules virales visibles en
microscopie électronique » (Huraux, J.-M., 2001).
d) Maladie de Buschke-Löwenstein
Les virus HPV de type 6 et 11 sont à l’origine de cette tumeur se développant au
niveau génital et périanal.
Elle est plus fréquente chez les hommes et les immunodéprimés 29 et induit une
volumineuse lésion bourgeonnante (condylome acuminé géant)
2. Pathologies dues aux HPV de type haut risque :
a) Dysplasies de la muqueuse ano-génitale ou néoplasies intra-épithéliales
cervicales
Pour commencer, il faut préciser qu’il existe diverses classifications de ces
lésions :
Les différentes classifications des lésions épidermoïdes du col utérin
et les correspondances
O.M.S.
Richart
Bethesda
Dysplasie légère
Condylome
CIN I avec Koïlocytose
Lésion épidermoïde intraépithéliale de bas grade
(LSIL)
Dysplasie moyenne
CIN II avec ou
Koïlocytose
CIN III avec ou
Koïlocytose
Dysplasie sévère
Carcinome in situ (CIS)
Carcinome épidermoïde Carcinome
invasif
invasif
sans
Lésion épidermoïde intraépithéliale de haut grade
sans (HSIL)
épidermoïde Carcinome
invasif
épidermoïde
Figure 6
L’OMS fut le premier organisme à classifier ces lésions, suivi peu après par
Richart qui proposa une séparation en CIN 1, CIN 2 et CIN 3. Cette deuxième
terminologie, largement utilisée, ne semblerait plus être la mieux appropriée, car
actuellement, il existe deux types de lésions bien distinctes :
-
-
la dysplasie légère, CIN 1 ou condylome plan : «productive de particules
virales infectantes et plus volontiers liées aux types viraux HPV à bas risque,
le plus souvent ADN-diploïdes 30, de densité cellulaire et à activité mitotique 31
faible en histologie, peu évolutive » (Monsonego, 2006, p.94).
la dysplasie moyenne ou sévère, CIN 2/3 ou carcinome in situ : « peu ou pas
productive de particules virales infectantes, plus souvent liée aux types HPV à
risque, plus souvent ADN-aneuploïde 32, de densité cellulaire élevée, avec une
activité mitotique intense en histologie et est évolutive » (Monsonego, 2006,
p.94).
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Cette distinction donna naissance à la classification de Bethesda : distinction
lésion épidermoïde intraépithéliale de bas grade (LSIL) - lésion épidermoïde
intraépithéliale de haut grade (HSIL).
D’après Joseph Monsonego, il est également possible d’établir la genèse de la
lésion cervicale : tout commence par une simple métaplasie 33 malpighienne due à
une infection par HPV. Dans le cas où cette formation proliférative reste
asymptomatique ou si elle n’est pas éliminée naturellement, il y a des risques
qu’elle engendre une CIN 1 de bas grade, considérée avant tout comme une
lésion bénigne «avec un potentiel d’évolution vers une lésion de haut grade ou un
cancer in situ très limité » (Monsonego, 2006, p.24) . Seule une minorité de cette
catégorie de dysplasie va devenir une CIN 2 de haut grade.
Vient ensuite l’évolution des CIN 2 en
CIN 3 de haut grade (dysplasie sévère
ou carcinome in situ), stade auquel on
remarque des lésions tumorales non
infiltrantes sans rupture de la membrane
basale.
La dernière étape de cette genèse
s’avère être le cancer infiltrant
(adénocarcinome 34 du col, carcinome
épidermoïde microinvasif ou invasif).
Ces différentes dysplasies peuvent être
mises en évidence par le frottis Pap.,
présenté dans le chapitre 2.1.7
Figure 7
D’après Joe Glickman, Jr., M.D. & Health Science Report™ (1996-2008), on
apprend qu’« en général, dans 70% des cas les lésions dysplasiques non traitées
régressent à la normale dans les 24 mois. »
En cas de lésions sévères ou modérées, on peut tout de même avoir recours à
des traitements, tels la cryothérapie, la conisation 35, etc., qui ne garantissent
cependant pas une élimination complète du virus.
b) Cancer du col de l’utérus
C’est la deuxième forme de cancer la plus fréquente chez la femme, après le
cancer du sein. Selon l’OFSP (31 juillet 2007), « à l’heure actuelle, la Suisse
compte environ 1 500 femmes atteintes d’un cancer invasif du col de l’utérus.
Quelque 300 nouveaux cas sont diagnostiqués chaque année ».
L’apparition de cellules anormales au niveau du col utérin, engendrée par une
infection avec un HPV haut risque (surtout les types 16 et 18), peut évoluer vers
un cancer, si ces cellules ne sont pas détectées à un stade précoce : « ce
processus de cancérisation prend une dizaine d’années » (Pagliusi&Aguado,
2004, p. 569-578), même s’il existe des cas où le cancer se déclare bien plus vite.
On distingue deux principaux types de cancer touchant le col utérin : il s’agit de
l’adénocarcinome (se développant à partir du revêtement glandulaire du col) et du
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Mars 2008
carcinome épidermoïde (qui trouve son point de départ dans le revêtement
épithélial du col).
L’unique façon de déceler cette pathologie reste le frottis cervico-vaginal, effectué
à intervalles réguliers.
En cas d’anomalies au frottis, diverses stratégies sont proposées: test de
diagnostic HPV, colposcopie, biopsie du col utérin… Elles seront brièvement
présentées dans le chapitre consacré au diagnostic.
Dans le but de contrer ce cancer, il faut savoir qu’il existe de multiples traitements
relativement lourds pour la patients, tels que l’hystérectomie 36, la radiothérapie, la
chimiothérapie…
c) Cancer de la vulve et du vagin
Dans les deux cas, un HPV oncogène 37 est en cause.
En ce qui concerne le cancer de la vulve, celui-ci peut être précédé d’une
néoplasie intra-épithéliale vulvaire (VIN). Il faut savoir qu’il touche
préférentiellement les jeunes femmes et peut, s’il n’est pas traité à temps, se
métamorphoser en cancer invasif.
Les cas répertoriés de cancer vaginal sont relativement rares.
d) Cancer de l’anus
Selon l’OFSP (31 juillet 2007), « 80-90% des cancers de l’anus sont dus à une
infection par un HPV oncogène ». Généralement, les tumeurs sont retirées
chirurgicalement, mais si elles s'avèrent massives, un traitement de
chimiothérapie ou radiothérapie est recommandé.
On a également observés des cas de néoplasies intra-épithéliales anales (AIN),
mais leur genèse est mal connue.
3. Pathologies dues aux HPV cutanés :
Il existe de nombreux génotypes HPV à tropisme cutané, mais les principaux restent
les types 1, 2, 4, 5 et 8.
a) Les verrues cutanées
Il s’agit de tumeurs bénignes de la peau se présentant sous la
forme de petites excroissances, dues à une prolifération
importante des cellules du derme. Elles peuvent avoir plusieurs
aspects morphologiques et ont pour origine, principalement une
infection par les HPV de type 1, 2 et 4.
Leur localisation s’observe surtout au niveau des pieds (verrues
plantaires ou vulgaires) et aussi sur les mains, coudes (verrues
palmaires).
Figure 8: Verrues
du gros orteil
Ces excroissances ont la capacité de disparaître spontanément, mais parfois des
traitements s’avèrent nécessaires : cryothérapie avec de l’azote liquide à -196°C,
électrocoagulation 38 au bistouri électrique, traitement kératolytique 39…
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Mars 2008
b) L’épidermodysplasie verruciforme ou syndrome de Lutz-Lewandowsky
Il s’agit d’une génodermatose 40 autosomale 41 rare et
récessive (il faut que les deux parents transmettent
l’anomalie à leur enfant pour que ce syndrome
apparaisse).
Les patients atteints sont infectés par les HPV 5 et 8.
Cette pathologie, marquée par des verrues cutanées
planes recouvrant mains, visage, parfois thorax, est
souvent compliquée par une transformation maligne :
Figure 9
« Un tiers des patients vont avoir une transformation maligne des lésions, en
particulier dans les zones exposées au soleil, sous forme de cancer intraépithélial ou même de carcinome invasif, métastatique 42 » (Huraux, J.-M., 2001).
2.1.6 Facteurs de risques
Les hommes ont autant de risques que les femmes de contracter un HPV, mais il
faut savoir que ces dernières subissent plus souvent une transformation maligne
consécutive à ce genre d’infection.
Il existe cependant plusieurs facteurs de risques, dont certains pouvant jouer en
faveur d’une infection par le virus du papillome humain et, également d’autres qui
conditionnent l’apparition de dysplasies.
Les personnes ayant des rapports sexuels précoces avec un nombre important de
partenaires sont des cibles idéales pour ce type de virus ; le risque de contracter une
infection est d’ailleurs multiplié.
Le tabagisme, comme dans beaucoup de cas favorise l’évolution des lésions en
cancer : selon Joe Glickman, Jr., M.D. & Health Science Report™ (1996-2008), il
«contribue à l’accumulation de toxiques dans la glaire cervicale, notamment de
nicotine et de cotinine. Cela conduit à la faiblesse du système immunitaire et permet
le développement de dysplasie et la formation de cellules précancéreuses. »
De plus, les déficits immunitaires comme par exemple l’immunodépression
congénitale 43, les transplantations, un traitement par immuno-suppressseurs, ou
encore HIV favorisent une infection par HPV. En ce qui concerne le sida, il faut savoir
qu’en cas de co-infection, l’évolution vers un cancer sera d’autant plus favorisée.
Les grossesses ainsi qu’une utilisation prolongée de contraceptifs semblent
également jouer un rôle déterminant en cas d’infection par le Human Papilloma virus.
2.1.7 Diagnostic de l’infection à HPV et des lésions associées
a) Le frottis Pap (d’après le Dr.George Papanicolaou) :
Il s’agit de l’examen de première ligne dans le cadre du screening des
précurseurs du cancer du col utérin. Ce test cytologique a toutefois le défaut
de laisser un certain pourcentage de résultats incertains, à savoir les ASC-US
(Atypical squamous cells undetermined significance). Ces anomalies de
signification indéterminée, touchant les cellules épithéliales, pourront mieux
être investiguées grâce à la colposcopie ou un test HPV.
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Mars 2008
Ce frottis est LE test de dépistage du cancer du col de l'utérus, il nous
renseigne sur les différents grades de lésion, c'est la raison pour laquelle il ne
peut en aucun cas être remplacé par le test HPV. De surcroît, des notions de
coûts doivent également être prises en considération; en effet, un frottis classé
négatif ne coûte que la modique somme de 28 CHF, alors que la typisation
HPV s'élève actuellement à 90 CHF.
b) Le test HPV :
Cette typisation est pratiqué dans le cas de frottis ASC-US.
Il existe de nombreuses techniques visant à mettre en évidence l’ADN viral,
mais on sait qu’actuellement la mieux établie (le Gold Standard) s’avère être
le kit Hybrid Capture de Digène qui procède par hybridation avec deux
cocktails de sondes 44 (haut risque et bas risque), puis capture et détection des
hybrides ADN HPV/sonde.
Toute une série de kits basés sur la PCR, plus sensibles, sont apparus sur le
marché, avec pour la plupart d’entre eux la capacité à identifier les génotypes
présents.
c) La colposcopie :
Cette méthode, examen décisif pour toute mise en œuvre d’une intervention
invasive, consiste en une inspection approfondie du vagin ainsi que du col
utérin, au moyen d’un colposcope à loupe binoculaire.
Elle peut également être pratiquée simplement pour décider de la proximité du
prochain test de screening. Dans ce cas-là, étant donné qu’il s’agit d’un geste
fastidieux et relativement invasif, il est possible de lui préférer plutôt le test
HPV.
Selon Joseph Monsonego, une colposcopie est recommandée dans les
situations suivantes:
Frottis anormal, Frottis normal mais typisation positive, persistants à 12-18
mois d'intervalle, Suivi des patients, Frottis anormal/colposcopie normale,
Diagnostic histologique de CIN 1, Après traitement de CIN 2/3, Condylomes
acuminés génitaux externes, Partenaires avec lésions génitales à HPV,
Leucorrhées 45 ou métrorragies 46 provoquées persistantes.
Le colposcope est également indispensable lors de la réalisation des
conisations et de la cryothérapie,
2.1.8 Traitements, Screening et Prévention
1. Traitements :
Il n’existe pas de traitements visant à éliminer les virus HPV ; seule la destruction des
lésions qui ne se sont pas résorbées d'elles-mêmes, peut être envisagée, grâce à
différentes méthodes : cryothérapie, laser, conisation,...
2. Screening :
En Suisse, les gynécologues et laboratoires de cytologie possèdent une stratégie
médicale relativement claire, en ce qui concerne la gestion des infections HPV:
Dès le début d'une activité sexuelle, il est recommandé d'effectuer un screening
annuel chez un gynécologue, au moyen du frottis Pap.
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Le but de ce screening, dont le rythme est variable d’un pays à l’autre, est de déceler
l’apparition de nouvelles dysplasies cervicales, voire aussi de lésions omises lors
d’un précédant contrôle. De plus il s’avère important dans la mise en évidence des
cas de rechutes.
Ces prélèvements de col utérin sont acheminés dans des laboratoires de
cytopathologie, en vue d'une analyse microscopique: toutes les anomalies décelées
sont alors signalées.
Parfois, le frottis est directement accompagné d'une demande de typisation HPV
(Digène): il s'agit de prélèvements effectués chez des adolescentes souhaitant se
faire vacciner contre le virus du papillome humain. Pour ce fait, il est indispensable
de confirmer l'absence de particules virales HPV, sinon le vaccin n'est pas efficace.
C'est la raison pour laquelle, les cellules prélevées et mises sur la lame, sont
analysées microscopiquement par deux personnes différentes.
De plus, une typisation HPV est effectuée dans tous les cas, même si la lecture au
microscope ne révèle aucune lésion précancéreuse.
Voici les différents résultats possibles lors du screening :
Frottis négatif (absence de lésions précancéreuse):
La patiente en question continue à se faire dépister
annuellement.
Cellule d’environ 8μm à noyau arrondi ainsi que chromatine régulière
et assez condensée. Cytoplasme possédant de fines granulations
Figure 10 : Amas de cellules
intermédiaires de l’exocol
(coloration de Papanicolaugrossissement 400x)
Frottis type LSIL:
Face à ce type de lésions, dit de bas
grade, il est recommandé d'effectuer une
typisation HPV, afin de voir si le virus en
cause est oncogène (HPV B) ou non
(HPV A).
Cellule malpighienne à noyau dyscaryotique
(gros, irrégulier et parfois hyperchromatique)
Figure 11 : Lésion de bas grade (frottis
conventionnelcoloration de Papanicolaugrossissement 200x)
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ÎTypisation révélant un HPV A: les lésions engendrées par un HPV bas risque se
résorbent toutes seules. Il est recommandé que la patiente continue à se faire
dépister annuellement.
ÎTypisation révélant un HPV B: face à une lésion causée par un virus à caractère
oncogène, il est recommandé de recourir au laser ou à la cryothérapie, en vue de
l'élimination de ces lésions qui sont susceptibles d'évoluer vers un stade plus
avancé, voire un cancer.
Plutôt que de devoir subir un traitement, certaines patientes (HPV B positives) sont
parfois plus volontiers soumises à des dépistages plus réguliers, dans le but de
suivre l'évolution de la lésion ; et seulement après le médecin conseillera un
traitement adapté.
Frottis type HSIL:
En présence d'une lésion de
haut grade, une biopsie (au
moyen du colposcope) est
entreprise dans le but de
confirmer le résultat. En cas de
confirmation, la patiente subit
d'office une conisation. A la
suite de cette intervention
relativement invasive, il faudra
que les trois frottis Pap.
suivants (pratiqués dans un laps
de temps plus restreint),
s'avèrent négatifs, pour pouvoir
revenir à un unique contrôle
annuel chez le gynécologue.
Figure 12 : Lésion de haut grade (frottis conventionnelcoloration de Papanicolau- grossissement 200x)
Cellule à noyau volumineux, hyperchromatique
mais non homogène. Membrane nucléaire
irrégulière
Frottis type ASC-US:
Il s'agit de frottis présentant des atypies cellulaires
d'origine
indéterminée
pour
lesquels
on
recommande la typisation HPV, dont le résultat
guidera dans la prise en charge de la patiente (cf.
frottis LSIL).
Cellule possédant un gros noyau à chromatine et
membrane nucléaire irrégulières
Figure 13 : ASC-US (frottis
conventionnelcoloration de
Papanicolau- grossissement 200x)
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3. Prévention :
a) Préservatif
Celui-ci ne confère pas une protection absolue contre ce virus, étant donné que la
transmission peut également avoir lieu par un contact direct, peau contre peau. Il
permet toutefois de réduire les risques d’infection.
b) Vaccination
Actuellement, deux vaccins prophylactiques 47 sont disponibles sur le marché :
-Gardasil (MSD) : existant depuis 2006, il cible les HPV de type 6, 11, 16 et
18. Il est constitué de protéines L1 de la capside, « lesquelles ont été
fabriquées sur des cellules de levures par un procédé de génie génétique »
(Office Fédérale de la santé Publique, 18 février 2008).
-Cervavix (GSK) : disponible depuis 2007, il cible seulement les génotypes 16
et 18.
Selon l’OFSP (juillet 2007), on apprend que de son étroite collaboration avec la
Commission fédérale pour les vaccinations (CFV), les recommandations de
vaccination suivantes, ont pu être élaborées :
•
Vaccination de base recommandée pour les adolescentes : les candidates
cibles s’avèrent être les jeunes filles de 11 à 14 ans, auxquelles trois
injections i.m. 48 sont administrées (à 0, 2 et 6 mois).
Si aucune vaccination n’a été effectuée avant le quinzième anniversaire,
s’offre alors la possibilité du vaccin de rattrapage (entre 15 et 19 ans),
cependant d’efficacité moindre.
•
Vaccination complémentaire conseillée après l’adolescence : Celle-ci est
administrée au cas par cas, selon l’anamnèse sexuelle de la patiente en
question : le vaccin est déconseillé si la personne a déjà eu des rapports
sexuels. De plus, il existe « une limite d’âge selon les conditions
d’enregistrement du vaccin (26 ans actuellement) » (OFSP, juillet 2007).
•
Il n’y a aucunes recommandations concernant la vaccination des garçons.
En ce qui concerne son remboursement, il est établi, selon l’OFSP (26
novembre 2007) que « dès le 1er janvier 2008, les coûts de la vaccination
seront pris en charge à condition que celle-ci soit effectuée dans le cadre de
programmes organisés par les cantons ». Cette nouvelle est relativement
réjouissante, étant donné que les frais de vaccination s’élèvent à « env.
700CHF » (OFSP, juillet 2007).
Pour toutes personnes de plus de 19 ans ou se faisant vacciner en-dehors de
ces programmes, les frais sont à leur charge. De plus, « la vaccination est
exemptée de la franchise, ce qui doit assurer une couverture vaccinale
élevée » (OFSP, 26 novembre 2007).
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2.2 Biologie Moléculaire
Mon travail de diplôme s’insère dans le cadre du domaine de la biologie moléculaire,
c’est la raison pour laquelle, il me paraissait indispensable d'introduire quelques
notions fondamentales intervenants tout au long de mon travail.
Voici les quelques termes que j’ai jugés utile d’approfondir :
2.2.1 L’ADN
L’acide désoxyribonucléique est constitué d’un pentose (sucre) : le désoxyribose,
d’acide phosphorique ainsi que des quatre bases nucléiques : adénine, guanine,
cytosine et thymine.
« Le sucre et le phosphate constituent en quelque sorte le « squelette » de la
molécule d’ADN » (Jaunin, 2004, p.3), alors que les bases s’avèreraient plutôt être
les éléments porteurs de l’information, étant donné qu’un code (ACTG) est formé à
partir de ceux-ci.
Figure 14 : structure et orientation de l’ADN
Cette macromolécule stockeuse de
l’information se présente, chez
l’Homme, sous la forme d’un double
brin (ADN bicaténaire) hélicoïdal.
Cette double hélice est rendue
possible, grâce à l’appariement des
bases entre-elles (A avec T et C avec
G).
Il est également important de signaler
que les deux brins d’ADN sont
toujours liés entre eux dans une
position anti-parallèle : cela signifie
que le brin du dessus sera orienté
dans la direction 5Æ3’, alors que le
brin du dessous sera, quant à lui,
toujours dans le sens inverse du
premier, donc 3’Æ5’.
La cellule est capable de contenir la totalité de
l’ADN, notamment grâce à une technique tout à
fait habile d’empaquetage : l'ADN est enroulé
dans des nucléosomes 49 qui, à leur tour
s’enrouleront sur eux-mêmes, créant ainsi une
fibre de chromatine. Cette fibre s’organisera ellemême en boucles, de manière à former une
partie
condensée
d’un
chromosome
métaphasique.
En ce qui concerne les virus, une capside
entoure une molécule d'ADN ou d’ARN 50. Chez
les virus à ADN, on distingue ceux à ADN simple
brin de ceux à ADN double brin (forme
prédominante).
Stettler Mélanie
47ème TAB ES
Figure 15: organisation du chromosome
20
Mars 2008
Les acides nucléiques peuvent être linéaires ou circulaires. Dans notre cas, comme
déjà cité précédemment, le virus du papillome humain présente une molécule d’ADN
bicaténaire et non-enveloppée, d’environ 8000 nucléotides.
2.2.2 L’extraction d’ADN
Afin de pouvoir utiliser l’ADN dans le cadre d’analyses moléculaires, il est
indispensable de pouvoir l’isoler des cellules, dans lesquelles il est stocké.
Actuellement, il existe différentes méthodes d’extraction d’ADN, se présentant
généralement sous la forme de kits, contenant des réactifs prêts à l’emploi et
permettant une isolation rapide et efficace.
Malgré cette grande diversité, les extractions suivent en principe toujours un schéma
identique, à savoir : la lyse cellulaire, l’élimination des protéines, et pour la plupart,
capture spécifique de l'ADN sur une membrane de silice.
Deux kits, dont vous trouverez de plus amples informations dans le chapitre Matériel
et Méthodes, seront utilisés dans le cadre des analyses propres à mon travail de
diplôme, il s’agit de l’Amplilute Liquid Media Extraction Kit (Roche), ainsi que du kit
d’extraction JetQuick (Genomed).
2.2.3 La Polymerase Chain Reaction (PCR)
Il s’agit d’une technique d’amplification d’une séquence cible d’ADN. Divers éléments
sont nécessaires, afin de mener à bien sa réalisation :
- deux amorces : petites séquences d’ADN, d’environ 20 paires de base (pb),
chacune complémentaire à un des deux brins d’ADN et situées aux extrémités
de la région à amplifier.
- la polymérase : enzyme, qui en se positionnant sur les amorces, va induire
leur élongation, contribuant ainsi à la formation d’un brin d’ADN
complémentaire à celui de départ.
- les désoxynucléotides : il s’agit d’un mélange des quatre nucléotides (A, T, C,
G) employés par la polymérase, dans le but de synthétiser les brins
complémentaires.
On distingue trois étapes pendant une
réaction PCR :
- la dénaturation : pendant cette étape
réalisée à une température de 95°C,
les deux brins d’ADN sont séparés.
- l’hybridation : entre 45 et 65°C, les
amorces se lient au brin d’ADN matrice
complémentaire.
- l’élongation : aux alentours de 72°C la
polymérase
va
s’accrocher
aux
amorces et les allonger.
Les fragments nouvellement synthétisés
serviront à leur tour de modèle dans cette
réaction d’amplification.
Figure 16: la réaction de polymérase en chaîne
Stettler Mélanie
47ème TAB ES
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Mars 2008
Une fois la PCR terminée, il est possible d’effectuer une analyse des amplifiats, donc
des produits amplifiés. En ce qui me concerne, il s’agira d’électrophorèses en gel
d’agarose ainsi que de multiples hybridations.
Outre ces amplifications conventionnelles, il existe également les PCR en temps
réel qui permettent de suivre visuellement la formation des produits PCR, dont la
détection peut être effectuée ainsi: émission de fluorescence par une substance se
fixant sur l'ADN (ex.: le SYBR GREEN, SYTO 9,…) ou utilisation de sondes
spécifiques portant des fluorophores (ex.: sondes Taqman, sondes Fret,…).
L'amplitude du signal de fluorescence, correspondant à chaque produit PCR, est
mesurée par un détecteur, lequel est lié à un ordinateur qui est destiné à présenter
l'évolution du signal au cours de la PCR.
Cet outil permet d’une part la quantification de séquences d'ADN cible et d’autre part,
nous évite d’avoir recours à des analyses complémentaires, comme la migration sur
gel. Dans notre cas, nous allons avoir recours à la molécule fluorescente Syto 9.
2.2.4 L’hybridation des acides nucléiques
Cette technique consiste à associer deux chaînes d’acides nucléiques
monocaténaires (ADN/ADN, ADN/ARN, ARN/ARN) possédant une séquence
complémentaire de nucléotides.
Les réactions d’hybridation sont plus ou moins spécifiques selon la stringence 51, qui
« est déterminée par la concentration saline et par la température des solutions de
lavage » (Jaunin, 2004, p.66).
Dans ce travail de diplôme, une hybridation d'acides nucléiques intervient dans le kit
Hybrid Capture 2 (HC2 HPV DNA test) de Digène, avec lequel nous pouvons
seulement déceler les patients positifs aux HPV ainsi que la nature générique du
virus (bas ou haut risque) ; aucunes informations quant au génotype HPV ne peut
être obtenue. Ce test que nous utilisons actuellement en routine, est basé sur une
hybridation de sondes ARN avec de l’ADN HPV, suivi d’une étape de capture des
hybrides ADN-ARN sur une microplaque tapissée d’anticorps anti-hybrides. Le
dernier point est la réaction de détection, grâce à un second anticorps anti-hybride,
marqué à la phosphatase alcaline (PAL).
Le rôle de la PAL est d'hydrolyser 52 un substrat, permettant ainsi l'obtention d'un
produit luminescent.
A l’heure actuelle, le kit Digène s’avère être le test HPV « étalon », de référence,
auquel toutes les nouvelles méthodes d’analyses vont être comparées, en terme de
technique et d’efficacité médicale.
Une hybridation intervient également à l'étape de détection du kit Roche LINEAR
ARRAY HPV Genotyping Test: des amplifiats biotinylés 53 obtenus suite à la PCR
vont être hybridés à une sonde d'ADN complémentaire, permettant ainsi la mise en
évidence des séquences complémentaires de nucléotides. Ce procédé est largement
détaillé dans le chapitre Matériel et Méthodes.
Cette technique est d’autant plus utile qu’elle va nous informer sur le génotype exact
présent chez notre patient, d’où l’intérêt d’introduire ce test en routine.
Stettler Mélanie
47ème TAB ES
22
Mars 2008
La justification de l’introduction du kit Roche, médicalement parlant ainsi qu’en tant
que remplaçant de kit Digène sera commentée dans le chapitre 4.3.7
2.2.5 La migration sur gel d’agarose
C'est un procédé permettant l'analyse des amplifiats issus d'une réaction de
polymérase en chaîne : grâce à un marqueur de taille (ADN de plasmide 54 ou de
bactériophage λ 55, fragmenté par des enzymes de restriction bien déterminées afin
d’obtenir des fragments de poids moléculaire connu) (Jaunin, 2005, p.19), il est alors
possible d’effectuer une détermination de la taille des fragments d’ADN inconnus.
Cette technique d’électrophorèse sous-marine permet le
déplacement de l’ADN, (chargé négativement), situé dans
les puits du gel depuis la cathode (-), jusqu’à l’anode (+),
grâce à un champ électrique.
Cette migration s’effectue dans un gel d’agarose,
constituant un large réseau de mailles qui ralentiront les
plus grands fragments d’ADN. Les petits acides
nucléiques, quant à eux, migreront plus vite et plus
facilement, se retrouvant ainsi dans la partie inférieure du
gel.
Figure 17 : cuve
d’électrophorèse
La visualisation de ces fragments est rendue possible en incorporant du bromure
d’éthidium lors de la confection du gel : ce colorant, fluorescent aux rayons
ultraviolets, a la possibilité de s’intercaler entre les deux brins d’ADN, les mettant
ainsi en évidence.
Puits du marqueur
de taille
ADN de haut poids
moléculaire
ADN de bas poids
moléculaire
Figure 18 : fragments d’ADN vus sous UV.
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3 BUTS
Le but principal de mon travail de diplôme est l’intégration aux analyses de routine de
laboratoire, du test de Génotypage LINEAR ARRAY HPV, qui viendra ainsi compléter
les prestations déjà offertes, quant à la mise en évidence d'HPV (méthode Digène
disponible chez AMS).
Mon travail comporte trois sous-buts sur lesquels je m’appuierai, afin de mener à
bien l’introduction de ce test chez AMS :
1. Dans un premier temps, je vais tester la robustesse du kit LINEAR ARRAY HPV
Genotyping Test, conçu par la firme pharmaceutique Roche et destiné au
génotypage des HPV, et cela grâce à diverses modifications que je vais introduire
tout au long de leur protocole initial :
• Variation de la température du bain-marie lors de l’étape de détection
• Variation de la quantité d’eau du bain-marie, destinée à assurer une
hybridation correcte
• Evaluation de la survie de l’Ampérase contenue dans le Master Mix
Parallèlement, je vais essayer de simplifier le protocole Roche en effectuant les tests
suivants :
• Raccourcissement des étapes de lavage lors de l’hybridation/détection sur
bandelettes
• Raccourcissement des étapes de séchages de la bandelette Roche
• Remplacement de l’extraction Amplilute au profit d’une technique d’isolation
déjà utilisée au laboratoire
Tous ces essais nous permettront de voir si le fait de changer les conditions de
réalisation de cette analyse, affecterait de quelconque manière les résultats. Si ce
n’est pas le cas, ces changements seront à même de rendre ce protocole plus simple
et rapide.
2. Puis, je vais essayer d'adapter ce test de génotypage en real-time PCR, afin
d'obtenir plus rapidement des résultats : cet outil permettant de visualiser la
formation des produits PCR, un échantillon ne présentant aucune courbe
d’amplification pourra donc être rendu négatif dans un délai plus court, étant donné
qu’une hybridation n’aura plus lieu d’être.
A noter qu’en cas de résultat positif, le LINEAR ARRAY Detection Kit de Roche serait
tout de même utilisé, afin d’identifier le ou les génotypes présents.
Cette adaptation en PCR en temps réel implique l’intégration du fluorochrome Syto 9
dans le PCR mix, ainsi que l’emploi du programme de la Melt Curve, à la fin de
l'étape d'amplification par PCR.
3. En dernier lieu, j'ambitionne de pouvoir rédiger mon propre protocole
« Génotypage HPV » incluant toutes les modifications concluantes testées aux
étapes 1 et 2, de manière à ce qu'il soit susceptible d’être introduit parmi les
analyses de routine du laboratoire.
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4 DEVELOPPEMENTS
4.1 Matériel et méthodes
4.1.1 LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test
1. Domaine d'application:
Le Linear Array HPV Genotyping Test, élaboré par Roche, est un test qualitatif in
vitro destiné à détecter le Human Papilloma Virus dans des spécimens cliniques
et à identifier les génotypes présents.
2. Principes de la procédure:
Figure 19: Vue d'ensemble du kit LINEAR ARRAY HPV Genotyping test
Ce test est fondé sur quatre étapes principales:
¾ la préparation des spécimens grâce au kit d'extraction,
¾ l'amplification par PCR de l'ADN HPV cible ainsi que de l’ADN du gène
humain ß-globine 56, au moyen d'amorces spécifiques.
¾ l'hybridation des amplifiats à des sondes oligonucléotides 57 présentes sur
des bandelettes en nylon.
¾ la détection par coloration, des produits amplifiés liés aux différentes
sondes.
Il faut préciser que l’ADN du gène humain ß-globine joue le rôle de contrôle
interne pour ce test de génotypage : sa présence sur la bandelette de nylon, lors
de la détection finale, témoigne de la bonne réussite de l’extraction et de
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l’amplification de chaque spécimen, nous autorisant ainsi à rendre toute la série
de résultats.
Ces 4 procédés seront repris séparément ci-dessous, dans les différents
chapitres de présentation de cette technique. La composition exacte de chaque
solution est disponible dans le protocole Roche.
Avec le kit Roche, la limite théorique d’une molécule nécessaire à la détection,
n’est pas obtenue: les limites de détection pour les 37 génotypes du panel
s’échelonnent entre 53 et 300’000copies/ml ; les différents types viraux ne
possèdent donc pas tous la même limite de sensibilité.
La méthode Roche reste toutefois plus sensible que le kit Digène. Prenons par
exemple le génotype 16 : la technique Roche requiert 195 copie/ml de virus pour
obtenir un résultat positif à la détection, alors que 100'000 copie/ml sont
nécessaires pour détecter le même type, avec Digène.
3. Les différents coffrets:
Afin de mener à bien ce test de génotypage HPV, différents coffrets et
accessoires fournis par Roche, s'avèrent nécessaires:
Ï AMPLILUTE LIQUID MEDIA EXTRACTION KIT
Réf: 03750540 190
Lot: 127147889
Date de péremption: 2008/08
a) Composition du kit:
Ce kit prévu pour 50 tests contient:
REACTIF
QUANTITE
CAR (Porteur ARN)
1x310 μg
PK (Protéinase K)
1x1.25 ml
AVE (Tampon d'élution)
4x2 ml
AW2 (Tampon de nettoyage 2)
1x13 ml
ATL (Tampon de lyse de tissu)
1x10 ml
1x33 ml
AL (Tampon de lyse)
EXT (diluants de colonne, 3ml)
VC (VacConnectors)
ELT (Tubes d'élution, 1.5ml)
CLM (Colones QIAamp Min Elute)
INDICATIONS
-Resuspendre dans 310 μl AVE Æ
aliquoté et stocker à -20°C pendant
2mois
-Stocker pendant 2 mois entre 28°C
-Ajouter 20ml d'éthanol absolu
50 pcs
50 pcs
50 pcs
50 pcs
b) Principe:
Ce kit vise à extraire l’ADN des spécimens cellulaires cervicaux, dans des
conditions spécifiques de dénaturation et à des températures élevées.
On distingue différentes étapes dans cette procédure :
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Il y a tout d’abord deux étapes de lyse cellulaire consécutives, grâce à la
Protéinase K, à un agent chaotropique 58 et à un détergent.
S’ensuit alors une étape d’isolation et de purification de l’ADN sur une
colonne MinElute, possédant une membrane de silice à forte affinité pour
l’ADN chargé négativement. Les conditions de sel et du pH nous
garantissent la non rétention des protéines et d’éventuels inhibiteurs.
A noter que dans mon cas, en ce qui concerne les étapes d’extraction, je
procèderai par centrifugation (1 min. à Vmax 59) et non par aspiration.
Pour terminer, une étape d’élution (grâce au réactif AVE) permet de
récupérer l’ADN jusque là retenu sur la colonne.
Ï LINEAR ARRAY HPV GENOTYPING TEST
Réf: 04391853 190
Lot: J12244
REACTIF
QUANTITE
HPV MMX (Master Mix LINEAR
ARRAY HPV)
4x0.58 ml
HPV Mg2+ (Solution de magnésium
LINEAR ARRAY HPV)
INDICATIONS
-Stocker entre 2-8°C
4x0.125 ml
HPV (+) C (contrôle positif LINEAR
ARRAY HPV)
4x0.5 ml
HPV (-) C (contrôle négatif LINEAR
ARRAY HPV)
4x0.5 ml
HPV Strip (lame de génotypes
LINEAR ARRAY HPV)
4x12 tests
b) Principe:
Le contenu de ce kit permet d’amplifier l’ADN HPV et l’ADN du gène ßglobine, par une réaction PCR.
Un des éléments-clé du LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test est
incontestablement le Master Mix (MMX) contenant tout ce qui est
nécessaire, afin de mener à bien les réactions PCR. Voici un bref aperçu
des éléments incorporés au MMX:
- La Polymérase ADN AmpliTaq Gold : après avoir été activée par la
chaleur en début de PCR, celle-ci, lorsqu’elle est mise en présence de
magnésium (Mg2+) et des désoxynucléotides (dNTP), s’accroche aux
amorces et les agrandit de manière à former une molécule ADN à double
brin.
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-L’enzyme AmpErase (uracil-N-glycosylase) : à la première étape de la
PCR, elle coupe l’ADN contenant de la désoxyuridine (dUTP) ainsi que des
résidus de la désoxyuridine.
La désoxyuridine n’est présente que dans les amplifiats, non pas dans
l’ADN naturel : l’utilisation de cette enzyme permet d’éviter toute
contamination de notre extrait avec des amplifiats antérieurs, susceptibles
d’être encore présents au moment de l’amplification.
L’AmpErase devient inactive au-delà de 55°C ; cela signifie qu’il n’y a
aucun risque que les amplifiats de l’ADN cible soient détruits, étant donné
que cette réaction s’effectue à 72°C. De plus, l’ajout d’un dénaturant en fin
de PCR, détruit l’AmpErase résiduelle du tube réactionnel, nous
garantissant donc la conservation de notre amplifiat.
-Les amorces
biotinylées : elles
délimitent une
séquence de
nucléotides
d’environ 450bp, au
sein de la région
polymorphe L1 du
génome HPV.
Figure 20: Emplacement de l'amorce sur la séquence cible
Il y a également une paire d’amorces biotinylées supplémentaires, dont le
but est l’amplification de la séquence cible (environ 268bp) du gène
humain de la ß-globine.
Hormis le Master Mix, nous noterons également la présence du C- et C+,
destinés à valider nos séries d'analyses.
La réaction PCR, dans son ensemble, est détaillée dans le chapitre
« Introduction » et, en ce qui concerne le programme, dans « Matériel et
Méthodes ».
Ï 24-WELL TRAY WITH LID
Réf:03140725 001
Les bandelettes de nylon sont déposées dans
cette plaque à 24 puits, en vue des étapes
d'hybridation et de détection.
Figure 21: Plaque à 24 puits
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Ï LINEAR ARRAY DETECTION KIT
Réf: 03378179 190
Lot: J12016
REACTIF
QUANTITE
INDICATIONS
DN (solution de dénaturation)
2x12 ml
-Stable 3 mois entre 2-25°C
SDS (SDS concentré)
4x27 ml
SSPE (SSPE concentré)
2x160 ml
SA-HRP (Conjugué de
Streptavidine-peroxydase de
raifort)
2x2 ml
-Stable 1mois entre 2-8°C
CIT (Citrate concentré)
2x36 ml
SUB A (Substrat A)
3x160 ml
SUB B (Substrat B)
3x40 ml
b) Principe:
Ce kit est conçu pour pratiquer des hybridations et des détections.
-La réaction d’hybridation :
Après dénaturation des amplifiats, les brins d’ADN monocaténaires
obtenus sont transférés dans les puits du 24-Well Tray with Lid contenant
les bandelettes en nylon.
Chaque bandelette est recouverte de 37 sondes HPV, chacune dotée
d'une séquence d'ADN complémentaire, correspondant à autant de
génotypes HPV différents. De surcroît, deux sondes supplémentaires (low
et high) sont destinées à la mise en évidence de l’ADN du gène de la ßglobine.
La bandelette (Linear Array HPV)
contient également une sonde à
réaction croisée, capable de
s’hybrider avec les génotypes 33,
35, 52 et 58: il s'agit d'une bande
aspécifique.
L’amplimère
biotinylé
sera
hybridé
à
la
sonde
d’oligonucléotides,
seulement
dans le cas où sa séquence est
complémentaire à celle de la
sonde.
Figure 22: Principe d'hybridation
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-La réaction de détection:
Figure 23: Principe de détection
Après l’hybridation, s’ensuit plusieurs étapes de nettoyage de la bandelette
grâce à un tampon de lavage, dans le but d’éliminer tout amplicon non lié.
On ajoute alors le conjugué 60 de Streptavidine-peroxydase de raifort qui va
aller se lier aux amplicons biotinylés (affinité streptavidine-biotine) hybridés
aux sondes. Après lavage et donc élimination de toute substance non
reliée, un substrat 61 contenant du peroxyde d’hydrogène et du 3,3',5,5'tetramethylbenzidine (TMB) est additionné à chaque bandelette : grâce au
peroxyde d’hydrogène, le conjugué de Streptavidine-peroxydase de raifort
catalyse l’oxydation de la TMB pour former un complexe de couleur bleue,
qui apparaît aux endroits où une hybridation s’est produite.
Il est alors possible
d’opérer
une
interprétation visuelle
du
résultat,
en
comparant les lignes
bleues apparues sur la
bandelette, avec le
Guide de référence du
test
de
génotypes
LINEAR ARRAY HPV
(en alignant la ligne de
référence (REF) du
guide avec celle de la
bandelette)
Figure 24: Lecture du résultat
4.1.2 Kit d'extraction Jet Quick (JQ)
1. Domaine d’application :
Le kit d’extraction JQ, élaboré par la firme Genomed, est destiné à isoler l’ADN
contenu dans divers types d’échantillons (sang complet, frottis gynécologiques,
urine, salive,…), ainsi qu’à éliminer toutes substances interférentes, présentes
dans l’échantillon en question.
Il s’agit du kit le plus utilisé pour les analyses de routine, chez AMS.
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2. Principe de la procédure :
Le principe de ce kit d’isolation s’avère être le même qu’Amplilute :
Il y a tout d’abord une lyse cellulaire, grâce à la Protéinase K et au Buffer 62 K1,
qui possède des propriétés de détergent.
S’ensuit alors une étape d’isolation et de purification de l’ADN sur les
« JETQUICK micro-spin column », possédant une membrane de silice à forte
affinité pour l’ADN chargé négativement.
Pour terminer, une élution avec le T1E0.01 permet de récupérer notre ADN, qu’il
sera également possible de concentrer grâce à une précipitation.
Précipitation :
Elle s’effectue sur l’éluat, grâce au rajout de glycogène GlycoBlue, NH4Ac 63 10M
et d’éthanol glacial 100%, suivi d’une étape de centrifugation.
Finalement, le culot, préalablement lavé par de l’éthanol puis de l’éther, sera
redissous grâce à de l’eau distillée additionnée de BSA 64 (= BSA à 1.6mg/ml),
dans le but de protéger contre d’éventuels inhibiteurs.
3. Composition du kit :
Fournisseur: Genomed
Lot:440250
REACTIF
Protéinase K (20mg/ml)
QUANTITE
Buffer K1
INDICATIONS
-Reconstituer avec 1.1ml d’eau
distillée et stocker à -20°C.
-Stocker à TA
JETQUICK micro-spin column
JETQUICK tube collecteur
Tampon de lavage KX
-Reconstituer avec de l’éthanol
-Stocker à TA
-Reconstituer avec de l’éthanol
-Stocker à TA
Tampon de lavage K2
4.1.3 RotorGene
Le RotorGeneTM, conçu par Corbett Research, est
utilisé dans le cadre de la quantification en temps
réel de l’ADN. Il contient un rotor de 36 ou 72 puits
placé au centre d’une chambre thermique,
propulsant de l’air.
Figure 25: RotorGeneTM
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Cette technologie offre une excellente précision, reproduction et répétabilité, grâce
au maintien d’une uniformité de température (+/- 0.01°C), pendant toute la durée des
analyses. Cet appareil, destiné à l'analyse quantitative en temps réel requiert des
molécules fluorescentes (SYBRTM Green, Sondes doublement marquées, Syto9,
etc.…).
Le RotorGeneTM offre également l’option de la MeltCurve Analysis, programme
consistant à mesurer la fluorescence pendant le chauffage progressif des amplicons.
La séparation des brins complémentaires par la chaleur est accompagnée d'une
baisse de fluorescence. Ce changement est notamment visible grâce à une courbe
de fusion (melt curve), qui nous renseigne sur la température de fusion (melting
temperature) de chaque amplicon.
4.1.4 Syto 9 : Green fluorescent nucleic acid stain
Référence : S34854
Lot: 32440W
Fournisseur : Invitrogen (Molecular Probes)
Concentration: 5 mM solution in DMSO 65
Le Syto 9, mis au point par la firme Molecular Probes, est une substance
fluorescente pouvant marquer indifféremment de l’ADN et de l’ARN, aussi bien dans
les cellules eucaryotes vivantes que mortes. Il a été spécialement conçu pour
révéler la présence d’acides nucléiques, grâce à une émission de fluorescence verte,
qui n'est obtenue que lorsque le colorant s'intercale entre deux chaînes d'acides
nucléiques hybridés: plus il y aura d'amplicons, plus la fluorescence augmentera lors
du déroulement de la réaction polymérase en chaîne.
Il faut toutefois préciser que, même en cas d’absence ADN double brin, le Syto 9
émet tout de même une petite quantité de fluorescence, appelée fluorescence
intrinsèque, dont l’intensité est cependant bien inférieure à celle obtenue en
présence d’ADN ou d’ARN.
Dans le cadre du travail de diplôme, nous allons utiliser ce Syto 9 pour essayer
d’appliquer la détection des HPV en real-time PCR.
4.1.5 Thermocycler T3000
Le thermocycler T3000, conçu par la firme Biometra, est
utilisé dans le cadre de l’amplification des acides
nucléiques. Cet appareil doté de trois compartiments,
dans lesquels il est possible d’effectuer diverses PCR,
est équipé de la dernière technologie Peltier, permettant
la réalisation d’excellents taux de chauffage et de
refroidissements.
Figure 26: Thermocycler T3000
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4.1.6 Protocole Roche LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test
Le détail du protocole se trouve dans les annexes.
Ce protocole a été rigoureusement suivi, hormis les quelques petites modifications
pratiques que j’y ai apportées, pour des raisons d'équipement non disponible:
-
Extraction :
- Utilisation de la centrifugation (1 min. à Vmax) au lieu du distributeur à vide
QIAvac 24 préconisé par le fabricant, pour toutes les étapes d’isolation et de
purification sur colonne.
- Lavage de la colonne avec 500 μl d’AW2 et d’éthanol absolu. Nous avons
remarqué, qu'après centrifugation des colonnes lors des étapes de lavage, les
750 μl préconisés que nous récupérions dans le tube collecteur, entraient en
contact avec le fond de la membrane de silice C'est donc pour des raisons
évidentes de prévention de contamination que nous avons décidé de travailler
avec un volume réduit de solutions, à savoir 500μl.
4.1.7 Préparation du Digest Buffer concentré 5x:
1. Préparation pour 100ml:
• 5ml de Tris-HCL 66 1M (pH 8)
• 10ml d'EDTA 67 0.5M (pH 8)
• 10ml d'NaCl 68 5M
• 25ml d'SDS 69 10%
• 50ml d'eau distillée
A aliquoter et conserver au frigo
4.1.8 Extraction JetQuick (protocole de base)
1. Si l'échantillon est constitué d'un liquide (-> 200 μl), passer au point 2. S'il s'agit
d'une suspension de cellules, centrifuger les cellules (10000 rpm 70 ; 5’), jeter le
surnageant et ajouter 200 μl H2O. S'il s'agit d'une trace, ajouter également 200 μl
H2O.
2. Ajouter 20 μl Protéinase K (du kit) et 200 μl Buffer K1. Mélanger et incuber 10' à
58°C.
3. Ajouter 200 μl EtOH 71 et immédiatement bien mélanger ; déposer le tout sur la
colonne, elle-même placée sur un tube collecteur. Centrifuger 1’, 10'000 rpm.
4. Jeter le tube collecteur et son contenu, et replacer la colonne sur un nouveau
tube collecteur. Ajouter 500 μl Buffer KX reconstitué. Centrifuger 1’, 10'000 rpm.
tube collecteur. Ajouter 500 μl Buffer K2 reconstitué. Centrifuger 1’, 10'000 rpm
tube collecteur Centrifuger encore une fois 1' à Vmax pour éliminer les derniers
restes de liquide de lavage.
7. Placer la colonne sur le tube collecteur final. Ajouter 200 μl T1E0.01 (Tris-HCl
1mM pH8, EDTA 0.01mM) préchauffé à 58°C et incuber 2' à RT 72. Puis
centrifuger 2' à 10'000 rpm. On obtient environ 200 μl d'extrait d'ADN.
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4.1.9 Protocole de précipitation
a) Matériel utilisé :
• Glycogène 10mg/ml :
n°article : 50571
Fournisseur : Fluka
• GlycoBlue :
n°article : 9516
Fournisseur : Ambion
• NH4Ac 10M :
n°article : 09688
Fournisseur : Fluka
• BSA non acéthylée 50mg/ml : n°article : 2616
Fournisseur : Ambion
b) Procédure :
1. Aux 200 μl d’éluat obtenu, ajouter 10 μl glycogène/GlycoBlue et 50 μl NH4Ac
10 M, puis vortexer.
A noter que le glycogène/GlycoBlue s’obtient de la manière suivante :
glycogène 10mg/ml additionné de 100 μl de GlycoBlue/ml.
2. Rajouter 650 μl éthanol 100% glacial (sortant du congélateur) et vortexer.
3. Centrifuger 8 min. Vmax (14680rpm).
4. Jeter le surnageant.
5. Laver le culot obtenu avec 500 μl EtOH 70%, puis 500 μl Ether (ajouter en
rinçant les parois).
6. Laisser évaporer l'éther en laissant les tubes ouverts pendant quelques
secondes.
7. Dissoudre le culot dans 20 μl BSA 1.6 mg/ml.
Ce protocole permet de concentrer un extrait d'un facteur 10.
4.1.10 Gel d'agarose 3.5%
• Agarose de haute résolution : n°article : AGAR0050
Fournisseur : MP Biomedicals
• TBE 5 x :
n°article :GEPTBE01-08
Fournisseur : Eurobio (Chemie Brunschwig)
• Ethidium Bromide 10mg/ml : n°article : E-1510
Fournisseur : Sigma
• Blue/Orange 6x loading Dye : n°article :G1881
Fournisseur : Promega
• 50 bp ladder :
n°article : MD1631
b) Confection :
1. Ajouter 1.6 g d'agarose haute résolution à 45 ml de tampon d'électrode TBE
0.5X.
2. Placer le tout au four à micro-ondes jusqu'à dissolution de la poudre
d'agarose.
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3. Laisser refroidir un peu et ajouter 4 μl d'Ethidium bromide (EtBr) 1mg/ml.
4. Couler le gel et attendre qu'il se solidifie.
5. Déposer le gel dans une cuve d'électrophorèse remplie de tampon TBE 0.5X.
b) Chargement des puits du gel:
1. Mélanger 4 μl de Gel Loading Buffer (Blue/Orange 6x loading Dye) à 16 μl
d'amplifiat.
2. Charger 8 μl de ce mélange dans un des puits du gel.
3. Dans le premier puit, déposer 5 μl du Ladder 50bp, un marqueur de taille.
4. Laisser migrer une heure à 100volts.
5. Lire le résultat sous une lampe UV.
4.1.11 PCR de quantification du contrôle interne
• AbsoluteQPCR mix : n°article : AB-1132
Fournisseur : Abgène (Axonlab)
• AmpliTaq Gold :
n°article : N808-0249
Fournisseur : ABI
• Mélange amorces-sondes :
Amorce Galt mouse-F à 100 μM : TGGCGCAGACAAGGA
Amorce Galt mouse-R à 100μM : CAAAGATTCAAGGCCCTGATG
Galt mouse-sonde à 25 μM : Cy5-ACGGCAGCCATTGCTTGACTGTGACBHQ2
b) Procédure
1. Préparation du Master Mix (MMX souris) pour N échantillons:
N x 10 μl Absolute QPCR mix + N x 5 μl mélange amorces-sondes + N x 1U
AmpliTaq Gold.
A noter que le mélange amorces-sondes, pour une réaction, est préparé de la
manière suivante:
0.04 μl de Galt mouse-F à 100 μM + 0.04 μl de Galt mouse-R à 100 μM + 0.04
μl de Galt mouse-sonde à 25 μM + 4.88 μl d'eau distillée.
Les concentrations recommandées pour la PCR sont donc les suivantes: les
deux amorces à 0.2 μM et la sonde à 50nM.
2. Ajouter 15 μl de MMX souris dans des microtubes de 0.2ml.
3. A l'aide de pointes à filtres, ajouter 5 μl d'extraits d'échantillons. Le volume
total de la réaction PCR sera finalement de 20 μl.
4. Mettre en route le programme sur le RotorGene:
Hold : 95°C/15' (cette durée peut varier selon le PCR mix utilisé)
5 cycles:
95ºC/15" ; 60ºC/60",
40 cycles: 90ºC/15" ; 60ºC/60", avec acquisition sur canaux FAM, JOE et
Cy5
(durée: env. 2h)
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4.1.12 Real-time PCR et Melt Curve HPV sur RotorGene:
a) Préparation des échantillons :
1. Préparer du Master mix pour N échantillons :
N x 21 μl HPV MMX (Master Mix LINEAR ARRAY HPV) + N x 5 μl HPV Mg2+
(Solution de magnesium LINEAR ARRAY HPV).
2. Préparer des microtubes de 0.1 ml adéquats pour le Rotor-Gene et y ajouter
25 μl de Master Mix + 25 μl d’échantillon + 1 μl de Syto9.
Le volume final de la réaction real-time PCR sera de 51 μl.
b) Programme de la PCR en temps réel selon le protocole de base Roche:
1. Hold
: 50°C/2’
L’ampérase détruit les potentiels
amplicons contaminants, provenant
d’anciennes réactions PCR.
2. Hold
: 95°C/9’
Inactivation de l’ampérase et activation
de la polymérase.
3. 40 cycles
: 95°C/30’’ ; 55°C/1’ ;
72°C/1’
Il y a tout d’abord une étape de
dénaturation à 95°C, suivi de l’hybridation des amorces à 55°C. La
dernière étape du cycle est l’élongation
des amorces grâce à la polymérase. La
lecture de la fluorescence s’effectue à
la fin de chaque cycle ; celle-ci est
détectée dans le canal FAM/SYBR.
4. Hold
: 72°C/5’
L’appareil se stabilise à 72°C
empêchant que d’éventuels résidus
d’ampérase
ne
détruisent
les
amplicons nouvellement synthétisés.
5. Hold
: 72°C/Indéfiniment
Cf. étape 4
c) Melt Curve :
Après l’étape 4 de la PCR (Hold à 72°C/5’), il est possible d’ajouter un
programme de Melt Curve, nous permettant d’obtenir le point de fusion des
différents éléments présents dans le tube (aussi ADN HPV cible, ADN ßglobine,…).
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Voici les paramètres employés pour la réalisation de la Melt Curve:
1. Manual calibration: à la fin de la PCR, la fluorescence est supérieure à
100Fl (unités de fluorescence): cette énorme émission est due à la présence
de nombreux amplicons, dans lesquels le Syto 9 vient s’intercaler.
Pendant le programme de Melt Curve, la fluorescence va diminuer :
l'augmentation de la température jusqu'à 95°C engendrera une dénaturation
des amplicons, libérant ainsi le Syto 9, qui émettra de moins en moins, jusqu’à
une disparition complète de fluorescence, signe de la séparation complète des
doubles brins.
Chaque type de molécule possède une température de fusion qui lui est
propre et à laquelle elle se trouve à raison de 50% sous forme bicaténaire et
50% sous forme monocaténaire. Une fois cette température atteinte, un
épaulement sera visible sur la courbe.
Afin de pouvoir plus facilement apprécier ces différentes courbes, il est
important d’établir une calibration avant le début de la Melt Curve : nous allons
essayer d’ajuster la fluorescence des échantillons en-dessous de 100Fl, et
seulement à ce moment-là débutera le programme de la Melt.
2. Ramp from 70degrees to 95degrees: à la fin de la PCR, le Rotor-Gene reste à
72°C. Nous allons donc le faire descendre à 70°C et remonter jusqu’à 95°C :
c’est durant cet intervalle de 25°C qu’il va établir sa courbe de fusion.
3. Rising by 0.2 degree(s) each step: l'appareil mesure la fluorescence chaque
0.2 degrés, de 70°C jusqu'à 95°C.
4. wait for 30 seconds on first step: au premier cycle, le Rotor-Gene reste
pendant 30 secondes à 70°C avant de continuer à augmenter sa température.
5. wait for 5 seconds for each step afterwards: à partir de 70,2°C et chaque
0,2°C de plus, il se stabilisera pendant 5 secondes, avant de continuer de la
sorte jusqu’à atteindre les 95°C.
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4.1.13 Matériel biologique:
a) ADN de souris : MOUSE GENOMIC DNA / G309A
Référence : 16467101
Concentration : 184.1 μg/ml
Cet ADN a été utilisé comme contrôle de rendement des extractions. Afin de
traduire la concentration de cette préparation en copies/ml, nous avons considéré
que les deux copies d’ADN d’une cellule de souris pesaient ensemble 6pg.
Nous avons détecté cet ADN grâce à un mélange d’amorces-sonde Galt
(fragment de gène de la galactose-1-phosphate uridyl transférase) :
• Séquence de l’amorce Galt-F à 100 μM : TGGCGCAGACAAGGA
• Séquence de l’amorce Galt-R à 100 μM : CAAAGATTCAAGGCCCTGATG
• Sonde Galt à 25 μM : Cy5-ACGGCAGCCATTGCTTGACTGTGAC-BHQ2
b) Echantillons de patient :
Pour chacune des étapes consacrées à l'élaboration de
ce travail de diplôme, nous avons choisis de travailler
avec des suspensions cellulaires, issues de frottis
gynécologiques: il s'agit de cellules ou amas cellulaires,
récoltés et placés dans un milieu liquide Surepath, lors
du prélèvement gynécologique.
Figure 27 : Milieu liquide
Surepath
Les cellules ont été récupérées grâce à un gradient de
concentration (séparant les polynucléaires des cellules
épithéliales), ainsi qu’à une succession d’étapes de
centrifugation. Finalement, elles ont été suspendues dans
de l'eau, puis nous ont été transmises dans des tubes
coniques.
Il faut également signaler que chacune de ces
suspensions a été préalablement analysée avec la
méthode Digène, suite à une demande médicale.
c) Contrôles:
Nous avons également utilisé deux contrôles, un négatif et un positif (pour le
génotype HPV 16), fournis dans le kit Roche.
Afin de mener à bien tous nos essais, nous aurions aimé connaître la
concentration exacte en HPV du contrôle positif. Malheureusement, nous n’avons
pas pu obtenir cette information. Cependant, nous avons l'intime conviction que
celle-ci se trouve proche de la limite de détection, à savoir 195copies/ml (niveau
d’inclusivité du génotype 16, selon Roche), puisque nous avons été confronté à
Stettler Mélanie
47ème TAB ES
38
Mars 2008
des situations, dans lesquels, le C+, après une faible dilution, ne révélait plus
aucunes bandes, lors de la détection finale.
4.1.14 Etablissement du nombre de copies d’HPV dans les échantillons
utilisés :
Pour obtenir cette information, nous nous sommes basés sur le degré de positivité du
patient, obtenu suite à l’analyse Digène, ainsi que sur les 5000 copies virales qui
correspondent au seuil de détection d’Hybrid Capture 2.
En multipliant ces deux valeurs, nous définissons le nombre de copies virales
présentes dans le puits réactionnel Digène, à savoir 75μl, lors de la lecture
luminométrique. Ce résultat doit être multiplié par un facteur de 1.5, étant donné que
l’échantillon fut dilué 1.5 fois (200μl d’échantillon + 100μl de dénaturant), au début de
l’analyse Digène : si nous n’effectuons pas cette multiplication, le nombre de copies
en ressort faussé (diminué par rapport à la réalité).
Une fois cet ajustement effectué, il est alors possible de calculer combien de copies
d’ADN HPV se trouvent dans un millilitre.
Exemple de calcul : patient positif en Digène (278.6 fois le seuil)
Î 5000 copies (seuil détection Digène) x 278.6 (positivité patient) = 1'393'000
copies/75μl
Î1'393'000 copies/75μl x 1.5 (facteur de dilution) = 2'089'500 copies/75μl
ÎCes 2'089'500 copies/75μl correspondent à 27'860'000 copies/ml
A noter que le seuil de sensibilité de 5000 copies par réaction correspond à 100'000
copies/ml.
4.2 Résultats
4.2.1 Choix du volume de la PCR :
La toute première modification apportée au protocole initial de Roche s’avère être le
choix du volume de la PCR. En effet, vu les coûts élevés qu’engendre le kit
d’amplification, il serait bénéfique d’effectuer ces analyses avec un volume réduit de
réactif, par rapport à ce que préconise le fabricant.
Cette diminution de volume, va de pair avec notre ambition de trier les échantillons
positifs et négatifs, au moyen d’une PCR en temps réel (cf. 4.2.5) : si nous
parvenons à adapter le kit Roche en real-time PCR, la détection sur bandelette ne
sera plus effectuée en cas d’HPV négatifs. Le stock de PCR mix (si l’on travaille
selon les recommandations Roche) sera donc plus rapidement consommé que les
bandelettes; ces deux éléments étant livrés dans le même kit, cela occasionnera des
dépenses supplémentaires et inutiles.
Il faudra cependant s’assurer que ce changement n’engendre aucunes
conséquences sur la performance de la PCR, et par conséquent sur les résultats
obtenus suite à la détection (bandes de génotypes plus faibles voire absentes).
Stettler Mélanie
47ème TAB ES
39
Mars 2008
Afin de mettre en évidence les potentiels problèmes issus de ce changement, trois
échantillons ont été choisis en vue d’une analyse comparative volume PCR normalvolume PCR réduit : le C+ du kit Roche, le C- du kit Roche ainsi qu'un échantillon de
patient (frottis de col utérin) positif avec la méthode Hybrid Capture 2 de Digène mais
dilué 400 fois, de manière à se rapprocher de la limite de détection Roche fixée à
7000copies/ml.
En diluant cet échantillon de manière à se rapprocher de la limite de sensibilité, nous
l’appauvrissons en nombre de copies virales. Si, avec un échantillon pauvre en HPV,
aucun changement n’est visible sur le résultat après la détection finale, nous
pouvons donc en déduire qu’un prélèvement riche en virus ne posera aucun
problème non plus.
Il faut également signaler que nous avons choisis le seuil de « 7000 copies/ml »,
pour les raisons suivantes : cette limite de détection correspond à celle de l’HPV 56
(avec la méthode Roche), génotype relativement fréquent. De surcroît, il s’agit d’un
des génotypes nécessitant la présence d’un des plus grand nombre de particules
virales, afin d’être décelé.
Normalement, notre échantillon aurait du être dilué 4000x, de manière à arriver à ces
7000copies, mais nous avons décidé de le diluer uniquement 400x, de manière à
nous laisser une marge de sécurité : en effet nous n’aimerions pas qu’une trop forte
dilution négativise notre résultat.
Procédure:
Une extraction Amplilute, selon le protocole initial de Roche, a été entreprise sur chacun des 3
échantillons, puis une PCR HPV (thermocycler T3000) a été lancée avec une série de tube contenant
deux volumes réactionnels différents, mais possédant chacun une concentration en ADN identique. A
noter que le C- n’a été testé que de la manière standard : son rôle était d’écarter l’hypothèse d’une
contamination lors de l’extraction.
Composition de cette série PCR :
Tube 1 : 50 μl de Master Mix (MMX) + 50 μl de C+ kit Roche
Tube 2 : 50 μl de MMX + 50 μl d’éch. de patient dilué
Tube 3 : 50 μl de MMX + 50 μl de C- kit Roche
Tube 4 : 25 μl de MMX + 25 μl de C+ kit Roche
Tube 5 : 25 μl de MMX + 25 μl d’éch. de patient dilué
selon les
recommandations
du fabricant
notre modification
Les amplifiats obtenus ont ensuite été hybridés et détectés selon le protocole Roche.
Une lecture a été effectuée au moyen du Guide de référence du test de génotypes LINEAR ARRAY
HPV.
Résultat obtenu:
ß -globine
low+high
ÄBandelette 3 (C-)
Stettler Mélanie
47ème TAB ES
: aucunes bandes visibles Ä OK c’est ce qu’on
attendait.
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Mars 2008
ÄBandelette 1et 4 (C+)
: présence des deux bandes du contrôle interne de
la ß-globine ainsi que de la bande du génotype 16
Ä OK c’est ce qu’on attendait.
ÄBandelettes 2 et 5 (patient)
: présence des deux bandes du contrôle interne de
la ß-globine, des bandes témoignant d’une
infection avec les génotypes 18, 35, 39, 61 ainsi
que de la bande aspécifique 52/33/35/58.
Les résultats nous montrent clairement que nous pouvons aussi bien effectuer une
PCR à volume réduit qu'une amplification selon les recommandations du fabricant.
De plus cette série peut être validée grâce au bon fonctionnement des contrôles
Roche.
Dorénavant, l’utilisation des 100 μl de volume PCR sera abandonnée au profit d’un
volume de 50 μl, en ce qui concerne les tests de robustesse et de simplification.
4.2.2 Raccourcissement des étapes de détection et tests de robustesse:
En se référant au protocole de base de la firme Roche, nous avons constaté que
l’étape d’hybridation/détection était relativement longue, du fait des nombreuses et
longues périodes d’incubation.
Notre but était donc de diminuer un certain nombre de ces temps, de manière à
accélérer l’obtention des résultats, mais tout en veillant à ce que ces derniers restent
identiques à ceux obtenus avec la version standard du protocole.
Plusieurs étapes s’avéraient susceptibles d’être modifiées, mais comme il n’est pas
possible de tout tester, mon choix s’est porté sur les points suivants, à savoir deux
versions raccourcies des temps d’incubation en présence du tampon de lavage
(étapes 18, 23 et 25 du protocole Roche avec des temps d’incubation diminués d’un
facteur 3 puis avec aucun temps d’incubation du tout), ainsi qu’une version
raccourcie de séchage, voire éventuellement un séchage au micro-ondes (étape 33
du protocole Roche).
En parallèle, nous en avons également profité pour tester la robustesse de
l’hybridation par rapport au paramètre de la température : Roche préconise une
hybridation à 53°C+/- 2°C, mais les résultats sont-ils déjà catastrophiques à 50°C ?
De plus, la robustesse de l’hybridation par rapport à la quantité d’eau contenue dans
le bain-marie méritait également d’être évaluée: en effet Roche recommande que
l’eau du bain soit en contact avec environ 0.5cm du « 24-Well Tray with Lid », à partir
du fond de ce tray. Or nous voulions savoir si le fait de diminuer cette quantité d’eau,
influençait le résultat final.
Pour ce fait, nous avons travaillé sur un frottis de col très positif (4'149'850 copies
d’ADN HPV haut risque dans le puit réactionnel selon la méthode Digène), de
manière à maximiser nos chances de voir des hybridations non-spécifiques.
Procédure:
A partir de cet échantillon, nous avons effectué une extraction Amplilute selon le protocole Roche, qui
nous a permis de récupérer 120 μl d'éluat. A partir de cet extrait nous avons lancé trois PCR HPV sur
le thermocycler T3000, de manière à obtenir suffisamment d'amplifiats pour tester des versions
raccourcies de l'étape de détection:
Stettler Mélanie
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Mars 2008
Tube 1 : 25 μl de MMX + 25 μl d'extrait de patient.
Les amplifiats obtenus ont été combinés et finalement six réactions d’hybridation/détection différentes
ont été effectuées: la première fut considérée comme la version standard, point de comparaison avec
les autres :
A la fin de chacune des hybridations/détections (sauf pour la version VI au micro-ondes), une photo
de la bandelette a été prise aux temps 0min, 15min, 30min, 45min et 60min, afin de mettre en
évidence l’avancée du séchage.
I.
Version standard d’hybridation et de détection :
Procédure:
Effectuée selon les indications figurant dans le protocole Roche.
Résultat obtenu :
Présence des bandes de la ß-globine ainsi que des bandes génotypes 18 et
31.
II.
Version d’hybridation et de détection avec les temps d’incubation diminués
d’un facteur 3, en présence des tampons de lavage:
Procédure:
Cf. protocole Roche, hormis pour 3 étapes :
-Etape 18 : 5 min d’incubation à 53°C avec le tampon de lavage rigoureux de travail (au lieu
de 15 min).
-Etape 23 : 3 min d’incubation à température ambiante (TA), sur le shaker orbital (au lieu de
10 min), en présence du tampon de lavage ambiant de travail.
-Etape 25 : idem que l’étape 23
Résultat obtenu :
Présence des bandes de la ß-globine, ainsi que des bandes génotypes 18 et
31. Fond de la bandelette légèrement plus bleuté que la version standard.
III.
Version d’hybridation et de détection avec aucuns temps d’incubation, en
présence des tampons de lavage:
Procédure:
Cf. protocole Roche, hormis pour 3 étapes :
Stettler Mélanie
47ème TAB ES
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Mars 2008
-Etape 18 :
-Etape 23 :
-Etape 25 :
Ajouter 4ml de tampon de lavage rigoureux de travail, agiter la plaque à 24
puits, aspirer le liquide et répéter cette étape encore une fois (au lieu des 15
min à 53°C).
Ajouter 4ml de tampon de lavage ambiant de travail, agiter la plaque à 24 puits,
aspirer le liquide et répéter cette étape encore une fois (au lieu des 10 min sur
le shaker orbital).
idem que l’étape 23
Résultat obtenu :
31. Fond de la bandelette plus bleuté que la version standard, mais pas plus
que la version II.
IV.
Version d’hybridation et de détection avec le bain-marie à une température de
50°C
Procédure:
Pour cette version, mes modifications sont les suivantes :
-Etape 3 : préchauffage du bain-marie à agitation, à 50°C au lieu de 53°C.
Le tampon d’hybridation et le tampon de lavage rigoureux de travail se retrouvent également à
cette température.
Résultat obtenu :
31. Intensité des bandes semblable à celle obtenue avec les bandes de la
version standard. Absence de bandes aspécifiques.
V.
Version d’hybridation et de détection avec un bain-marie insuffisamment
rempli.
Procédure:
Lors de cet essai, l’eau contenue dans mon bain-marie est en quantité moindre par rapport à
ce que préconise le fabricant. Il n’y a pas 0.5cm d’eau à la surface de la plaque métallique sur
laquelle repose la plaque à 24 puits: l’eau s’arrête sous la plaque de manière à juste pouvoir
la chauffer (une image beaucoup plus explicite du bain-marie se trouve parmi les annexes
p.76).
Résultat obtenu :
Présence des bandes de ß-globine, ainsi que des bandes génotypes 18 et 31.
Intensité des bandes pareille qu’avec la version standard. Absence de bandes
aspécifiques.
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VI.
Version d’hybridation et de détection avec séchage de la bandelette au four à
micro-ondes
Procédure:
Pour ce dernier point, la seule modification apportée au protocole Roche a été à l’étape 33 :
55’’ au micro-ondes à chaleur moyenne, au lieu de minimum une heure de séchage à
température ambiante.
Résultat obtenu :
Présence des bandes de ß-globine, ainsi que des bandes génotypes 18 et 31.
De plus, par rapport à la version standard, on remarque qu’il y a nettement
moins de bruit de fond, comme en témoigne la clarté du fond de la bandelette.
En ce qui concerne l’option qui visait à raccourcir le temps de séchage, nous avons
effectué une série de comparaison avant de pratiquer le séchage au four microondes:
Procédure:
A la fin de chacune des hybridations/détections (sauf pour la version VI au micro-ondes), une photo
de la bandelette a été prise aux temps 0min, 15min, 30min, 45min et 60min, afin de mettre en
évidence l’avancée du séchage.
Résultat obtenu :
Tout de suite après la détection, le fond de la bandelette paraît légèrement plus
bleuté qu’après 60min. Cependant, le résultat reste identique.
Les photos prises dans le cadre de cet exercice sont répertoriées dans les annexes.
4.2.3 Introduction de l’extraction JetQuick à la place d’Amplilute :
Etant donné que le laboratoire bénéficie déjà de plusieurs méthodes d’extraction
différentes, nous voulions, pour des raisons pratiques, remplacer celle du protocole
de base, par une déjà très fréquemment utilisée au laboratoire : l’isolation JetQuick
(JQ).
Afin de savoir si cette autre méthode produit des résultats aussi satisfaisants qu’avec
Amplilute, nous avons effectué différents tests.
a) Simple-double digestion:
Avant de démarrer la comparaison version Amplilute-version JQ, nous nous sommes
demandé, s’il fallait également introduire une deuxième digestion dans la version
standard JQ, afin de travailler dans des conditions se rapprochant le plus possible du
protocole Amplilute (double digestion). Nous cherchions à savoir si, avec la méthode
standard, nous obtenions un produit de digestion plus limpide : en effet, il n’est pas
erroné de penser qu’un échantillon présentant encore un trouble après digestion,
emprisonne probablement encore des virions au cœur de ce matériel biologique ; la
totalité de l’ADN viral n’a alors pas été extraite.
Stettler Mélanie
47ème TAB ES
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Mars 2008
Avec cet essai nous cherchions donc à mesurer la clarté du liquide après une et
parallèlement deux digestions. Pour ce fait, un prélèvement de col utérin très trouble,
donc riche en matériel biologique s’avérait être le type d’échantillon idéal.
Procédure:
A partir de cet échantillon, nous avons effectué une seule digestion et parallèlement une double lyse :
-Préparation de la version JQ à une digestion : je traite mon échantillon avec le K1 et la Protéinase K,
selon le protocole de base JQ.
- Préparation de la version JQ avec une double digestion : je traite d’abord mon échantillon avec du
Digest Buffer additionné de Protéinase K (30 min. à 58°c) puis, je rajoute 200 μl de Buffer K1 avant
d’incuber une seconde fois à 58°C pendant 10 min.
Résultats obtenus :
Dans les deux cas, nous notons une similitude au niveau de la clarté des liquides,
qui nous amène à conclure que les deux versions sont satisfaisantes. Nous allons
tout de même privilégier celle à une digestion, ce qui représente un gain de temps.
b) Mise en évidence du rendement de l'extraction:
Dans un second temps, nous cherchions à savoir si le rendement d'extraction de ces
deux techniques d'isolation était similaire. Le dopage d'un échantillon avec de l'ADN
de souris (de manière à en avoir 1000 copies dans le tube destiné à la PCR)
semblait le meilleur moyen, étant donné que cet ADN peut être quantifié grâce à la
« PCR de quantification du contrôle interne » : en routine, lorsque nous avons
certaines demandes d'analyses, l'ADN de souris ajouté aux échantillons nous sert
déjà de contrôle interne, dans plusieurs autres protocoles.
Le RotorGene permet de quantifier cet ADN; si nous le retrouvons, c'est signe que la
PCR ainsi que l’extraction ont correctement fonctionnés.
C’est la raison pour laquelle nous avons opté pour cette stratégie basée sur l’emploi
de l’ADN de souris en tant que contrôle interne.
Procédure:
Préparation des tubes en vue de l'extraction:
-Extraction JQ: 200 μl de K1+ 200 μl d'échantillon + 20 μl de Protéinase K + 5 μl d'ADN de souris
(40'000copies)
-Extraction Amplilute: 80 μl d'ATL+ 250 μl d'échantillon + 20 μl de Protéinase K + 3 μl d'ADN de souris
(24'000copies)
Ces deux extractions sont effectuées selon leurs protocoles de base respectifs.
Ensuite nous avons effectués une PCR en temps réel selon le « programme de quantification du
contrôle interne » du RotorGene, pour quantifier l’ADN de souris extrait.
Remarque : les nombres de copies d’ADN de souris ajoutés au départ ne sont pas identiques. Cette
différence s’explique par le fait que les deux techniques d’extraction n’emploient pas les mêmes
quantités de solution d’élution en fin d’extraction : afin de respecter les proportions, nous avons
effectués des calculs qui nous définit les quantité d’ADN à rajouter, de manière à obtenir 1000 copies
d’ADN dans 5 μl d’extrait.
Tube 1 : 15 μl de MMX souris + 5 μl d'extrait selon JQ
Tube 2 : 15 μl de MMX souris + 5 μl d'extrait selon Amplilute
Stettler Mélanie
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Mars 2008
Tube 3 :15 μl de MMX souris + 1 μl d'ADN de souris (=1000copies) + 4 μl d'eau distillée. Ce tube joue
le rôle de référence.
Il faut préciser qu’en cas de rendement d’extraction de 100%, 1000 copies d’ADN se retrouvent dans
les 5μl d'extrait du tube PCR
NB : la composition du MMX souris se trouve sous le chapitre Matériel et Méthodes 4.1.11.
Résultat obtenu:
¨pour l'échantillon extrait selon JQ, j'obtiens 314 copies d'ADN au lieu de 1000.
¨pour l'échantillon extrait selon Amplilute, je totalise 465 copies au lieu de 1000.
Ce résultat à lui seul n'était pas suffisant pour évaluer le rendement de ces deux
méthodes d'isolation: il existe un phénomène de variabilité inter- et intrasériel qui
engendre des variations de résultats, pour un même échantillon.
Nous voulions donc savoir si cette différence était reproductible ou pas.
Procédure:
Une deuxième série de PCR, avec les mêmes extraits, a également été programmée sur le RotorGene (toujours même programme PCR), de manière à pouvoir tester la variabilité inter- et
intrasérielle.
Composition de cette deuxième série PCR :
Tube 1 : 15 μl de MMX souris + 5 μl d'extrait selon JQ (A)
Tube 2 : 15 μl de MMX souris + 5 μl d'extrait selon JQ (B)
Tube 3 : 15 μl de MMX souris + 5 μl d'extrait selon Amplilute (A)
Tube 4 : 15 μl de MMX souris + 5 μl d'extrait selon Amplilute (B)
Tube 5 :15μl de MMX souris + 1μl d'ADN de souris (=1000copies) + 4μl d'eau distillée. Tube de
référence A.
Tube 6 : 15μl de MMX souris + 1μl d'ADN de souris (=1000copies) + 4μl d'eau distillée. Tube de
référence B.
Tube 7 : 15μl de MMX souris + 1μl d'ADN de souris (=1000copies) + 4μl d'eau distillée. Tube de
référence C.
NB : la composition du MMX souris se trouve sous le chapitre Matériel et Méthodes 4.1.11.
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Comme pour la première série d’extraits, en cas de rendement d’extraction de 100%, 1000 copies
d’ADN de souris se retrouvent dans les tubes 1 à 4 destinés à la PCR.
Les résultats ont été interprétés de trois manières différentes: à chaque fois, un nouveau tube de
référence jouait le rôle de standard.
Résultats obtenus:
Echantillons
Tube standard=Réf. A
Tube standard=Réf. B
Tube standard=Réf. C
extrait JQ A
extrait JQ B
extrait Amplilute A
extrait Amplilute B
référence A
référence B
282 copies ADN souris
référence C
(Les graphiques et tableaux correspondants se trouvent dans les annexes p.78)
Nous avons remarqué que les résultats concernant le rendement de l'extraction
étaient légèrement différents par rapport à ceux obtenus dans la première série.
Toutefois ces variations ne sont pas extrêmes:
-
Avec l'extraction JQ, le nombre de copies d'ADN obtenus varie entre 218 et
367.
Avec l'extraction Amplilute, le nombre de copies d'ADN varie entre 365 et 588.
Le rendement d’extraction JQ est satisfaisant : il faut savoir que nous avions décidé
de tolérer un rendement d’ADN jusqu’à deus fois moins bon avec JQ. Dans nos
essais, nous obtenons toujours un peu moins de copies, mais jamais moins que la
moitié, par rapport à Amplilute.
c) Comparaison JQ-Amplilute sur les bandelettes en nylon
Après avoir répondu à nos interrogations concernant l'étape de digestion ainsi que
du rendement de l'extraction, nous avons finalement pu établir une comparaison
entre les deux versions d'extraction, afin de voir si le résultat final, après détection,
était similaire, voire proche.
Pour ce fait, nous avons travaillé sur deux échantillons riches en matériel biologique
et faiblement positifs en ADN HPV, lesquels ont encore été dilués, de manière à ce
qu'ils soient proches de la limite de détection avec la méthode Digène, à savoir aux
alentours de 5000 copies de DNA/réaction:
En sélectionnant des échantillons troubles, nous parvenons d’autant mieux à évaluer
la capacité que possèdent chacune des deux techniques d’isolations à libérer le virus
du matériel biologique, ainsi qu’à le récupérer dans l’extrait final.
De surcroît, les dilutions permettent de travailler dans des conditions proches de la
limite de détection, nous permettant ainsi de tester la robustesse des deux kits, face
à une quantité infime de virions ainsi que de répondre à la question suivante: obtienton toujours un résultat cohérent ?
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Procédure:
Les deux échantillons ont d’abord été dilué de manière à ce qu’on obtienne 5000 copies d’HPV/
réaction :
- Echantillon 1: patiente positive pour le type haut risque avec 5500 copies de DNA dans le puits
réactionnel lors de l'analyse avec la méthode Digène.
¨ dilution 22X: 40μl d'éch. + 840μl eau distillée
- Echantillon 2: patiente positive pour le type haut risque avec 7650 copies de DNA dans le puits
réactionnel lors de l'analyse avec la méthode Digène.
¨ dilution 30X: 30μl d'éch. + 870μl eau distillée
S’en est suivi une isolation selon la méthode JQ, puis selon Amplilute (à noter que lors de l'étape
finale du protocole Roche, nous avons élué avec 250μl d'AVE et non pas 120μl. Nous avons opté
pour ce changement à cause des raisons suivantes : les 200μl d’éch. extraits selon JQ sont
également élués dans 200 μl, alors que les 250μl utilisés, avec Roche, se retrouvent dans un volume
final de 120μl, signe de concentration, donc de bandes plus fortes lors de la détection. Pour les deux
techniques d’isolation, nous allons donc éluer avec la même quantité que ce qui a été pris au départ).
Les quatre extraits obtenus ont été amplifiés sur le thermocycler T3000, d'après les indications du
fabricant. Finalement une détection (cf. Protocole Roche) a été entreprise.
Résultats obtenus:
¨Bandelette 3 (échantillon n°1 extrait selon JetQuick): les deux bandes de ß-globine
sont très faiblement présentes (contrôle interne OK). Patiente diagnostiquée négative
pour les 37 génotypes HPV proposés par Roche.
¨Bandelette 4 (échantillon n°1 extrait selon Amplilute) : présence des deux bandes
de ß-globine (contrôle interne OK), ainsi que de la bande aspécifique des génotypes
52/33/35/58.
¨Bandelette 5 (échantillon n°2 extrait selon JetQuick): présence des deux bandes
de ß-globine (contrôle interne OK), ainsi que du génotype 40.
¨Bandelette 6 (échantillon n°2 extrait selon Amplilute): présence des deux bandes
de ß-globine (contrôle interne OK), ainsi que du génotype 40 (plus intense qu'avec
JQ).
La technique JQ a apparemment révélé plus de faiblesses que l'isolation Amplilute.
Nous avons donc testé la version JQ avec une précipitation à la fin de l'isolation
d) Comparaison JQ (avec une étape de précipitation)-Amplilute sur les
bandelettes en nylon
Etant donné que nous avons obtenus des résultats médiocres avec la version
standard d'extraction JQ, nous avons tout de même effectué un dernier essai sur
Stettler Mélanie
47ème TAB ES
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Mars 2008
l’échantillon n°1 qui ne nous a pas donné entière satisfaction, en incluant une
précipitation à la fin de l'extraction JQ, dans le but d'obtenir des résultats meilleurs,
voire équivalents à ceux fournis avec Amplilute.
Procédure:
Nous procédons de la même manière que pour le point précédant (comparaison JQ-Amplilute sur les
bandelettes en nylon), en rajoutant uniquement une précipitation à la fin de l’extraction JQ (cf.
protocole précipitation).
Résultats obtenus:
¨Bandelette 1 (échantillon n°1 extrait selon JetQuick avec précipitation sur l'éluat):
présence des deux bandes de ß-globine (contrôle interne OK mais relativement
faible), ainsi que de la bande aspécifique des génotypes 52/33/35/58.
¨Bandelette 2: échantillon n°1 extrait selon Amplilute: Présence des deux bandes de
ß-globine (contrôle interne OK), ainsi que de la bande aspécifique des génotypes
52/33/35/58.
Les bandes JQ demeurent toujours plus faibles que ce que nous espérions. Pour
l'instant, nous gardons l'extraction Amplilute.
4.2.4 Survie de l'Ampérase :
A la fin de chaque amplification, Roche recommande d'ajouter immédiatement 100 μl
de dénaturant aux amplifiats obtenus ou de les laisser à 72°C, afin d'inhiber l'action
de l'Ampérase résiduelle et éviter ainsi la dégradation des brins d'ADN nouvellement
synthétisés. Pour des questions pratiques, nous voulions savoir s'il fallait
obligatoirement procéder de la sorte ou si l'on pouvait se montrer moins rigoureux.
En effet, l'extraction compte déjà de nombreuses périodes d'incubation et la PCR
dure plus de trois heures, il n'est donc pas toujours évident d’intégrer ces deux
techniques parmi les analyses du jour, sachant qu'il faut obligatoirement être présent
le soir pour ajouter le dénaturant. Nous pensions que le fait de ne pas être contraint
d’attendre la fin de cette PCR, nous permettrait de mieux organiser notre journée de
travail ; cette amplification pourrait être débutée à n’importe quel moment. Mais pour
cela nous voulions savoir si l'Ampérase dégradait réellement tous nos amplifiats :
1000 copies d’ADN de souris issus de notre stock ont donc joué les cibles de cette
enzyme.
Procédure:
Nous avons effectué une PCR HPV standard sur cet ADN de souris; celle-ci a été préparée de la
manière suivante:
25 μl de Master Mix + 2.5 μl sondes-amorces Galt + 21.5 μl d'eau distillée + 1 μl d'ADN de souris
(1000copies).
L'amplifiat obtenu a été séparé en trois aliquots de 17 μl, placés respectivement à -20°C, 72°C et à
température ambiante (TA), durant la nuit.
Le lendemain, nous avons effectué une PCR de quantification du contrôle interne sur des dilutions
(dil.) 10'000x et 1'000'000x de ces trois aliquots.
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Préparation des dilutions:
-Dil. 1000 fois: 1 μl de chaque aliquot+ 999 μl d'eau distillée
-Dil. 10'000fois: 100 μl de la dilution 1000fois + 900 μl d'eau distillée
-Dil. 1'000'000 fois: 1 μl de la dilution 1000fois + 999 μl d'eau distillée
Composition de cette série PCR:
Tube1 :5μl dil.10'000x du contenu de l'aliquot placé à -20°C+15μl Master Mix souris
Tube2 :5μl dil.1'000'000x du contenu de l'aliquot placé à -20°C+ 15μl MMX souris
Tube3 :5μl dil.10'000x du contenu de l'aliquot placé à TA+ 15 μl MMX souris
Tube4 :5μl dil.1'000'000x du contenu de l'aliquot placé à TA+ 15 μl MMX souris
Tube5 :5μl dil.10'000x du contenu de l'aliquot placé à 72°C+ 15 μl MMX souris
Tube6 :5μl dil.1'000'000x du contenu de l'aliquot placé à 72°C+ 15 μl MMX souris
Résultat obtenu:
Ech. pris comme
référence
Les 100 copies d’ADN assimilées à l’échantillon n°5 sont fictives : cette valeur a été
insérée au hasard uniquement dans le but de nous permettre d’évaluer les pertes de
copies dues à l’action de l’Ampérase.
Les résultats obtenus sont satisfaisants, apparemment, l'Ampérase ne semble plus
active à la fin de la PCR.
De plus, nous notons également un rapport correct entre les résultats des deux
degrés de dilutions (nous obtenons environs cent fois moins de copies pour les
échantillons dilués 1'000’000x).
4.2.5 Adaptation du protocole Roche en real-time PCR :
La PCR en temps réel permet de suivre visuellement l’amplification des acides
nucléiques au moyen de courbes : il est donc déjà possible de savoir, en fin de PCR,
si un échantillon est positif ou négatif. Nous pensions donc adapter le génotypage
HPV sur le Rotor-Gene de manière à pouvoir rendre les patientes HPV négatives
(absence de courbes d’amplification à l’écran) beaucoup plus rapidement, sans
devoir pratiquer une hybridation.
a) Quels sont les produits détectés avec le Syto 9 ? :
Afin de permettre la réalisation de cette adaptation, nous avons eu recours au Syto
9, qui émet une fluorescence lorsqu’il se retrouve intercalé entre de l’ADN
bicaténaire. Le signal obtenu en real-time PCR n’est rien d’autre que la somme de
toutes les molécules entre lesquelles ce fluorochrome a pu se glisser.
Or, si une molécule de la taille du virus HPV contribuait au signal, il serait important
que nous le sachions. En effet, cela signifierait que sa température de fusion
(analyse Melt Curve) serait proche de celle d’HPV et qu’il serait donc difficile de la
distinguer de ce virus.
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De plus, cette même molécule ne poserait probablement aucun problème, lors de la
détection sur bandelette, étant donné qu’elle ne pourrait s’y hybrider. Nous ne
pourrions alors que difficilement adapter le génotypage HPV en real-time PCR.
Le fait de vouloir savoir quels produits seraient décelables, était donc tout à fait
justifiable.
Pour cela, nous avons décidé d’analyser un amplifiat de C+ (kit Roche) sur gel
d’agarose, de manière à connaître la taille en paires de bases, de chaque élément
contribuant au signal PCR.
Procédure:
Nous avons lancé une PCR HPV sur le Rotor-Gene qui a été préparée de la manière suivante:
25 μl de MMX HPV + 25 μl de C+ du kit Roche + 1 μl de Syto 9 2μM.
Une analyse sur gel d'agarose (selon le protocole de base) a été effectuée avec l'amplifiat obtenu.
Résultat obtenu :
268pb
100pb
50pb
450pb
Les puits n°1 et 2 contiennent respectivement le marqueur
de taille de 50 paires de base (pb) et l'amplifiat C+.
En ce qui concerne le contrôle positif, nous obtenons les
bandes attendues aux alentours de 450 pb (ADN cible HPV)
et 268 pb (ADN ß-globine) ÆOK.
La bande relativement marquée vers 40pb s’avère être les
dimères d’amorces (une amorce comporte généralement
une vingtaine de paires de bases).
Dimères d’amorces (env. 40pb)
Nous ne notons donc aucune bande parasite possédant environ la même taille que
notre ADN cible.
b) Analyse d’échantillons grâce à la PCR en temps réel :
Notre but était de voir s'il y avait possibilité de mettre en évidence l'ADN du virus du
papillome humain, de le distinguer de la ß-globine (notre contrôle interne), voire
éventuellement de différencier les différents génotypes entre-eux. Pour cela nous
avons utilisés le C+ du kit Roche ainsi qu’un extrait d’échantillon de col dilué et positif
pour les génotypes 18 et 66 (3'775'000 copies dans le puits réactionnel Digène).
L’option du C+ nous a paru claire, puisqu’il est possible de l’utiliser sans forcément
devoir recourir, au préalable, à une extraction.
Quant au second échantillon, nous avions déjà de l’extrait congelé en réserve, ayant
servi à de nombreux essais antérieurs, pour la mise au point du programme de la
Melt Curve. Ce dernier a d’ailleurs été dilué plusieurs fois de manière à pouvoir
couvrir la zone de limite de sensibilité: lors de précédents essais de détection sur
bandelettes, nous obtenions un signal avec la dilution 50'000x, mais plus rien avec
celle à 500'000x. La limite de détection se trouvant entre 50'000 et 50’000x, nous
avons décidé de diluer cet échantillon 50'000, 250'000 et 300'000x.
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Procédure :
L’analyse de ces deux échantillons n’a pas été entreprise le même jour ; nous avons d’abord
commencé avec le C+.
Analyse du C+ :
Cet échantillon a directement été amplifié sur le RotorGene selon le programme HPV, suivi de la Melt
Curve ; la PCR fut préparée de la manière suivante :
25 μl de MMX HPV + 25 μl de C+ du kit Roche + 1 μl de Syto 9 2μM.
Analyse du frottis de col utérin positif pour les génotypes HPV 18 et 66:
Trois dilutions différentes (50’000x, 250’000x et 300’000x) ont été effectuées avec l’échantillon en
question.
Préparation des dilutions :
-Dil. 1000 fois: 1 μl d’extrait + 999 μl d'eau distillée
-Dil. 50'000fois: 20 μl de la dilution 1000fois + 980 μl d'eau distillée
-Dil. 250’000 fois: 4 μl de la dilution 1000fois + 996 μl d'eau distillée
-Dil. 300’000 fois: 3 μl de la dilution 1000fois + 997 μl d'eau distillée
Ces trois dilutions ont été amplifiées sur le RotorGene selon le programme HPV, suivi de la Melt
Curve.
Composition de la série PCR :
Tube1 : 5μl de la dil.50'000x +25μl MMX+ 1 μl Syto 9
Résultats obtenus :
-
Avec le C+ du kit Roche:
La valeur Ct 73 s'avère inutile, étant donné que le Syto 9 est aspécifique et se lie avec
toutes les séquences bicaténaires. Ici, nous ne pouvons distinguer l'ADN HPV de
l'ADN ß-globine ou des dimères d’amorces.
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Courbe de fusion :
Dénaturation d'une 1ère molécule
2ème molécule qui se sépare
Température de fusion de la
1ère molécule
Température de fusion de la
2éme molécule
Avant tout, il est important de signaler que la réalisation de ces pics a été rendue
possible, grâce à une analyse mathématique de la courbe de fusion.
Le programme de la Melt Curve appliqué au
C+ a révélé trois pics, correspondants à
autant de températures de fusion différentes:
• Pic 1: 75.75°C Æl'ADN ß-globine (268pb)
• Pic 2: 82.5°C Æl'ADN HPV (450pb)
• Pic 3: 89°C
Æ de l’ADN humain
non amplifié ?
Sur la base de ces résultats nous avons
pensé que la plus petite température de fusion
correspondait au plus petit brin d'ADN (donc la ß-globine), et que la plus grande, à la
plus longue séquence d'ADN.
De plus, si l’on se réfère à l’analyse sur gel d’agarose de l’amplifiat C+ de la page 51,
nous constatons que trois produits de taille différentes contribuent au signal real-time
PCR . La bande la plus intense s’avère être celle de notre ADN cible HPV à 456pb,
qui logiquement correspond au pic le plus prononcé à 82.5°C.
En ce qui concerne l'ADN ß-globine (268pb), une bande beaucoup moins forte est
visible sur le gel et de même, nous obtenons un pic beaucoup moins élevé (75.75°C)
à l’issu du programme de la Melt Curve.
-
Avec un frottis de col utérin dilué (50'000, 250'000 et 300’000x), positif pour
les génotypes HPV 18 et 66:
Le résultat de l’analyse en real-time PCR/Melt Curve de cet échantillon (disponible à
la page 55), nous a permis de consolider notre argumentation concernant l’attribution
d’une température de fusion d’environ 82°C à l’amplicon HPV.
En effet, à la fin du programme Melt Curve, nous observons, pour la dilution 50’000X,
un petit pic à 82.16°C. De même la détection Roche de l’amplifiat provenant de la
même dilution révèle deux faibles bandes (p.55). L’intensité des bandes ainsi que la
hauteur du pic concordent donc bien entre-eux.
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De plus, les deux autres dilutions (250'000 et 300’000x), négatifs après hybridation
sur bandelette, ne laissent paraître aucun pic aux alentours de 82°C, notre
température de fusion supposée d’HPV.
Qui plus est, nous relevons des différences de températures, quant au présupposé
amplicon HPV : le type 16 du C+ sortirait à 82.5°C, alors que manifestement
l’échantillon positif aux génotypes 18 et 66 se verrait plutôt attribuer une température
aux environ de 81.1°C. Il est possible que cette variation s’explique par le fait que
nous sommes face à des virus différents et qu’il serait peut-être bien possible
d’arriver à distinguer les différents génotypes entre-eux, en real-time PCR/Melt curve.
Sur la base des résultats obtenus, nous constatons que l’adaptation en real-time
PCR fonctionne : nous obtenons un signal en utilisant le Syto 9!
De plus, tout nous porte à croire que le pic à 82°C serait la température de fusion de
l’amplicon du HPV, mais il faudra encore entreprendre des essais sur des bases plus
solides.
c) Comparaison
PCR
en
temps
réel
/
PCR
suivie
d'une
hybridation/détection:
Cette adaptation au dépens d’une hybridation ne peut être acceptable que si, pour
un même échantillon, le résultat en real-time PCR n’est pas trop éloigné de celui
obtenu suite à la détection sur bandelette : notre but serait d'être autant, voire plus
sensible que Roche.
Afin d’évaluer le seuil de sensibilité de chacune de ces deux techniques, nous avons
eu recours à un extrait d’échantillon de col positif pour les génotypes 18 et 66
(3'775'000 copies dans le puits réactionnel Digène) et dilué 50’000x, 250’000x et
300’000x, avec lequel nous avons effectué cette comparaison.
Ces facteurs de dilution ont été choisis pour les raisons suivantes : lors d’essais
antérieurs, nous avons réussi à établir que la limite de détection, pour les deux
techniques, se situait entre 250’000x et 500’000x (avec la plus grande dilution nous
n’obtenions aucun signal, alors que l’échantillon dilué 250'000 présentait des bandes
bien visibles).
Procédure :
Nous avons commencé par la préparation des dilutions (cf. 5.2.5 b), avec lesquelles nous avons
effectué une amplification :
Composition série PCR en temps réelle sur le RotorGene :
Programme : HPV et Melt Curve
Une partie des amplifiats obtenus a été utilisée en vue d’une détection sur bandelette en nylon,
conformément au protocole Roche.
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Résultats de la PCR en temps réelle:
Dénaturation d'une
1ère molécule
ADN HPV?
L’échantillon dilué 50’000X est le seul à révéler un pic vers 82°C, température
supposée de l'ADN HPV.
La ß-globine, à laquelle nous avions attribué une température de fusion de 75°C,
n'est détectable dans aucun cas. Les dilutions d’extraits utilisées sont probablement
trop diluées pour contenir de l’ADN génomique humain.
Résultats obtenus avec les amplifiats, suite à la détection:
HPV 66
HPV 18
ÄBandelette 3 (éch. positif pour les types 18 et 66, dilué 50'000x): absence des
deux bandes de ß-globine, due à la dilution. Faible présence des génotypes 18 et 66.
ÄBandelette 4 (éch. positif pour les types 18 et 66, dilué 250'000x) : aucunes
bandes visibles.
ÄBandelette 5 (éch. positif pour les types 18 et 66, dilué 300'000x) : aucunes
bandes visibles.
En ce qui concerne la dilution 50’000x, nous avons relevé la présence de faibles
bandes ainsi que d'un petit pic en real-time, nous laissant supposer que la
combinaison PCR en temps réel- Melt Curve serait presque autant sensible que
Roche.
Cependant, nous ne pouvons nous montrer formels en nous basant uniquement sur
une valeur, même s’il s’agit d’un début tout à fait prometteur pour la suite des
investigations.
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4.2.6 Evaluation globale méthode Roche-méthode modifiée :
En effectuant divers tests de robustesse et de simplification, notre but était
clairement de voir si les résultats en découlant, seraient affectés par ces variations
concernant les conditions de réalisation. Les différents essais énumérés au chapitre
3, ont prodigué d’excellents résultats (cf. chapitres 4.2.1 à 4.2.4). Si bien que nous
avons opté pour une combinaison de toutes ces modifications, afin de créer un
nouveau protocole, que nous avons comparé à la version standard Roche. Cette
comparaison nous permettait de mettre en évidence d’éventuels changements, à la
suite de l’étape de détection.
Cette évaluation a été réalisée au moyen des cinq échantillons suivants :
• C- du kit Roche
• C+ du kit Roche
• Echantillon n°3: HPV B (Haut risque) positif à 50'000copies d'ADN HPV
dans le puits réactionnel de la méthode Digène.
• Echantillon n°4: HPV B positif à 314'700 copies et HPV A (Bas risque)
positif à 85'000copies d'ADN HPV dans le puits réactionnel de la
méthode Digène.
• Echantillon n°5: HPV B positif à 24'500copies d'ADN HPV dans le puits
réactionnel de la méthode Digène.
Procédure:
Nous avons d'abord commencé par une extraction Amplilute (cf.protocole Roche) sur ces cinq
échantillons, chacun des extraits obtenus a été amplifié de deux manières différentes: une fois sur le
thermocycler T3000 et une fois sur le Rotor-Gene (notre modification).
Composition de la série PCR HPV sur le thermocycler T3000 (version standard):
Tube 1 : 50 μl de MMX HPV + 50 μl d'extrait CTube 2 : 50 μl de MMX HPV + 50 μl d'extrait C+
Tube 3 : 50 μl de MMX HPV + 50 μl d'extrait de l'échantillon n°3
Composition de la série PCR sur le Rotor-Gene (version modifiée):
Tube 1 : 25 μl de MMX HPV + 25 μl d'extrait C- + 1 μl de Syto9
Tube 2 : 25 μl de MMX HPV + 25 μl d'extrait C+ + 1 μl de Syto9
Tube 3 : 25μl de MMX HPV + 25 μl d'extrait de l'échantillon n°3+ 1 μl de Syto9
Tube 4 : 25 μl de MMX HPV + 25 μl d'extrait de l'échantillon n°4+ 1 μl de Syto9
Tube 5 : 25 μl de MMX HPV + 25 μl d'extrait de l'échantillon n°5+ 1 μl de Syto9
Programme: PCR HPV suivi du programme Melt Curve.
Après obtention des amplifiats issus de nos deux PCR distinctes, nous avons pratiqué une
hybridation/détection différente pour chaque série:
-Détail de l’hybridation/détection pour la version standard de Roche:
Bandelette 1 : CBandelette 2 : C+
Bandelette 3 : éch. n°3
Nous avons rigoureusement suivi les recommandations du fabricant.
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Mars 2008
-Détail de l’hybridation/détection pour la version modifiée:
Bandelette 6 : CBandelette 7 : C+
Nous avons suivi le protocole de Roche, mais en modifiant les étapes suivantes:
-Etape 13 : 50 μl d’amplimère dénaturé au lieu de 75 μl.
-Etape 18 : Ajouter 4ml de tampon de lavage rigoureux de travail, agiter la vanne à 24 puits, aspirer le
liquide et répéter cette étape encore une fois.
-Etape 23 : Ajouter 4ml de tampon de lavage ambiant de travail, agiter la vanne à 24 puits, aspirer le
liquide et répéter cette étape encore une fois.
-Etape 25 : idem que la 23
-Etape 33 : 55sec. au four micro-onde à chaleur moyenne.
Résultats obtenus:
????????
En observant cette photo, nous notons, quasiment partout, des résultats similaires
entre les deux versions, malgré quelques différences au niveau de l’intensité des
bandes. Seul l’échantillon n°4 (bandelettes 4 et 9) nous pose problème. En effet, le
génotype 42 n’est pas décelé avec la version modifiée.
Ne parvenant pas à expliquer ce résultat, nous avons décidé de retenter plusieurs
fois la même expérience sur cet échantillon (trois fois la version standard et trois fois
la version modifiée), de manière à voir s'il existe une variabilité quelconque au niveau
des résultats ou s'il y a eu une erreur de manipulation de l'échantillon.
Procédure:
Extraction de cet échantillon selon le protocole Amplilute (Roche), puis deux PCR différentes avec
l'extrait obtenu.
Composition de la série PCR HPV sur le thermocycler T3000 (version standard):
Tube 1 : 50 μl de MMX HPV + 50 μl d'extrait de l'échantillon n°4.
Composition de la série PCR sur le Rotor-Gene (version modifiée):
Tube 1 : 25 μl de MMX HPV + 25 μl d'extrait de l'échantillon n°4 + 1 μl de Syto9
Tube 2 : 25 μl de MMX HPV + 25 μl d'extrait de l'échantillon n°4 + 1 μl de Syto9
Tube 3 : 25μl de MMX HPV + 25 μl d'extrait de l'échantillon n°4 + 1 μl de Syto9
Programme: PCR HPV suivi du progamme Melt Curve.
Sur les amplifiats obtenus avec la version standard, nous avons effectué une hybridation/détection
selon le protocole de base, tandis que ceux issus de la PCR sur Rotor-Gene ont été traités selon les
modifications citées précédemment.
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Résultats obtenus:
Génotype 42
ÄBandelettes 1s-2s-3s (éch. n°4 standard) : présence des deux bandes du contrôle
interne de la ß-globine ainsi que du génotype 51, 42, 53, 58, 66, et de la bande
aspécifique. Les bandes semblables sont d'intensité égale.
ÄBandelettes 1m-2m-3m (éch. n°4 modifié) : présence des deux bandes du contrôle
interne de la ß-globine ainsi que du génotype 51, 53, 58, 66, et de la bande
aspécifique 52/33/31/58. Les bandes semblables sont aussi de même intensité, sauf
la bande 53 de la bandelette 2m. Absence dans les trois cas de la bande 42.
Apparemment, la version modifiée fonctionne effectivement moins bien. Pour
l’instant, nous en restons à la version standard du protocole Roche (volume PCR à
100μl sous-entendu).
4.2.7 Comparaison LINEAR ARRAY HPV Genotyping test avec la
Méthode Hybrid Capture 2 (HC2) de Digène:
Concernant la mise en évidence d'HPV, la méthode Hybrid Capture 2 de Digène
permet de distinguer les virus dits à haut risque de ceux appartenant à la catégorie
bas risque.
En introduisant le test de génotypage HPV nous voulions nous assurer d'obtenir des
résultats cohérents par rapport à la méthode Digène, à savoir qu'un génotype 18, par
exemple, mis en évidence grâce au kit LINEAR ARRAY HPV Genotyping test donne
également un résultat haut risque avec l’HC2 HPV DNA test.
C’est la raison pour laquelle nous avons établi cette comparaison sur la base de 12
frottis gynécologiques, préalablement analysés avec Hybrid Capture 2.
-4 échantillons faiblement positifs pour le type haut risque (B) et négatifs pour le
génotype bas risque (A):
• Echantillon n°9: HPV B positif à 6250copies d'ADN HPV dans le puits
-4 échantillons négatifs pour le type haut risque (B) et faiblement positifs pour le
• Echantillon n°13: HPV A positif à 22'150copies d'ADN HPV dans le
puits réactionnel de la méthode Digène.
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-4 échantillons faiblement positifs pour les types haut (B) et bas (A) risque:
• Echantillon n°17: HPV B positif à 41'600 copies et HPV A positif à
7150copies d'ADN HPV dans le puits réactionnel de la méthode
Digène.
• Echantillon n°18: HPV B positif à 385'000copies et HPV A positif à
15'650copies d'ADN HPV dans le puits réactionnel de la méthode
Digène.
Digène.
Digène.
Procédure:
Nous avons testé le kit LINEAR ARRAY HPV Genotyping test, selon le protocole de base, sur ces 12
échantillons.
Voici les résultats:
NB : seuls les bandelettes méritant de plus amples explications seront commentées.
Les 4 échantillons faiblement positifs pour le type haut risque (B) et négatifs pour le
ÄBandelette n°9 (éch. n°9): présence des deux bandes du contrôle interne de la ßglobine ainsi que du génotype 73 (bas risque). On s'attendait plutôt à obtenir un
génotype de haut risque, mais selon une étude menée par Stevens et al. (2007), il a
été démontré que le génotype HPV 73 pouvait engendrer des réactions croisées
haut risque, d'où le résultat faiblement positif pour les HPV haut risque
(Digène)ÆOK.
ÄBandelette n°10 (éch. n°10): présence des deux bandes du contrôle interne de la
ß-globine ainsi que des génotypes 59 (haut risque) et 53 (bas risque). La présence
de la bande 53 est contradictoire par rapport au résultat Digène; cependant le kit
Hybrid Capture 2 ne comporte pas de sonde ciblant le type 53ÆOK.
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ß-globine ainsi que du génotype 54 (bas risque). On attendait plutôt un résultat HPV
haut risque, mais selon la même étude de Stevens et al. (2007), le type 54 provoque
des réactions croisées haut risque chez Digène.ÆOK.
ß-globine ainsi que des génotypes 51 et 56 (haut risque), ainsi que 70 et
HPVCP6108 (bas risque). Le kit Hybrid Capture 2 n’offre pas de sondes pour ces
deux génotypes, d'où la négativité des échantillons en HPV bas risque. Une
explication supplémentaire potentielle serait la différence de sensibilité des deux
kitsÆOK, résultat cohérent.
Les 4 échantillons négatifs pour le type haut risque (B) et faiblement positifs pour le
Génotype 84
ß-globine ainsi que des génotypes 84 (faible bande) et HPVCP6108 (bas risque). La
méthode Roche est beaucoup plus sensible face au type 84: en effet ce virus est
déjà décelé à raison de 900 copies virales (cf. annexes: limites de détections Roche
du protocole de base) alors qu'il en faut 100’000 avec Digène; il y a donc de fortes
chances que ce génotype passe inaperçu avec Hybrid Capture 2.
De plus, HPVCP6108 n'appartient pas à la liste des génotypes recherchés par
Digène, donc notre résultat faiblement positif pour les types bas risque est
probablement du à une réaction croisée bas risque provoqué par ce génotype.
ÄBandelette n°14, 15 et 16 (éch. n°14, 15 et 16):ÆOK, résultat cohérent.
Les 4 échantillons faiblement positifs pour les types haut (B) et bas (A) risque:
ß-globine ainsi que des génotypes 51 (haut risque) 53 (bas risque), ainsi que de la
bande non-spécifique 52/33/35/58. Le génotype 53 n'appartient pas au panel Digène;
le résultat faiblement positif pour le type bas risque est probablement du à une
réaction croisée provoqué par le 53 Æ OK.
ß-globine ainsi que des génotypes 53 (bas risque) et 31 (haut risque). En ce qui
concerne le type 53, cf. explications de la bandelette n°17.ÆOK.
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ÄBandelette n°19 (éch. n°19): contrôle interne OK, de même que présence des
génotypes 42 (bas risque) et 16 (haut risque) Ærésultat cohérent.
ÄBandelette n°20 (éch. n°20): présence des deux bandes du contrôle interne.
Malgré l’absence de toutes bandes avec la technique Roche, le fait est que Digène a
trouvé cet échantillon bas et haut risque faiblement positif. Cette positivité pourrait
s’expliquer par une infection causée par un génotype autre que les 37 proposés par
Roche.
Dans l’ensemble, les résultats sont satisfaisants, mais indiquent que le kit Digène
nous donne beaucoup de réactions croisées.
Nous pouvons aisément inclure la technique Roche parmi nos prestations.
4.2.8 Comparaison LINEAR ARRAY HPV Genotyping test avec le test
INNO-LiPA HPV Genotyping V2 de Innogenetics pratiqué chez
MCL:
Actuellement, toute demande de génotypage HPV est sous-traitée au laboratoire
MCL à Niederwangen qui emploie la technique INNO-LiPA HPV Genotyping V2.
Le principe de ce kit est assez similaire à celui proposé par Roche, mais nous
voulions tout de même nous assurer que le LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test
nous donnait des résultats cohérents avec ceux de MCL.
Lors de cette comparaison, trois échantillons génotypés chez MCL ainsi que deux
contrôles, furent utilisés :
• Echantillon n°1: HPV B (Haut risque) positif à 3'775'000copies d'ADN
HPV dans le puits réactionnel de la méthode Digène et ayant été
diagnostiqué positif pour les HPV de type 16 et 66 (chez MCL).
• Echantillon n°2: ayant été diagnostiqué positif pour les HPV de type
53(chez MCL).
• Echantillon n°3: HPV B positif à 482'800copies d'ADN HPV dans le
puits réactionnel de la méthode Digène et ayant été diagnostiqué positif
pour les HPV de type 16 et 31 (chez MCL).
• C+ du kit Roche
• C- du kit Roche
Procédure:
Nous avons effectué une extraction Amplilute, suivi d'une réaction d'amplification sur le thermocycler
T3000.
Composition de cette série PCR:
Tube 4 : 50 μl de MMX HPV + 50 μl d'extrait C+
Tube 5 : 50 μl de MMX HPV + 50 μl d'extrait CProgramme: PCR HPV.
Puis réaction d'hybridation/détection sur les cinq amplifiats obtenus (cf.protocole Roche).
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Résultats obtenus:
¨Bandelette 1 (éch. n°1 diagnostiqué positif chez MCL pour les génotypes 18 et 66):
présence des deux bandes de ß-globine, ainsi que des génotypes 18, 66 et
HPVCP6108, qui n'est pas mis en évidence par le kit INNO-LiPA ÆOK.
¨Bandelette 2 (éch. n°2 diagnostiqué positif chez MCL pour le génotype 53):
contrôle interne OK, ainsi que présence du génotype 53ÆOK
¨Bandelette 3 (éch. n°3 diagnostiqué positif chez MCL pour les génotypes 16 et 31):
présence des deux bandes de ß-globine de même que des génotypes 16, 31, 39 et
54ÆOK pour les deux premiers génotypes, par contre les types 39 et 54 sont
recherchés chez MCL. Il se peut que nous soyons plus sensibles avec la méthode
Roche.
¨Bandelette 5 (C+ du kit Roche): présence des deux bandes de ß-globine ainsi que
du génotype 16ÆOK, c'est ce qu'on attendait.
¨Bandelette 6 (C- du kit Roche): aucunes bandes visiblesÆOK
Les résultats sont satisfaisants et ma série peut être validée grâce aux contrôles
positif et négatif.
4.3 Discussion
4.3.1 Choix du volume de la PCR :
Notre intention était de diminuer de moitié le volume de réaction de PCR, afin
d’économiser les réactifs relativement onéreux du kit.
En effectuant une PCR avec deux volumes différents, nous avons pu constater que
pour un même échantillon, après détection, nous obtenions, non seulement, des
résultats identiques, mais aussi des bandes d’intensité égale et cela aussi bien avec
un volume PCR de 100 μl (comme le veut le fabricant), qu’un volume de 50 μl (notre
modification).
De surcroît, je peux aisément valider ma série, puisque que mes C+ et C- (témoins
d’une extraction, amplification et détection fiables) ont donné les résultats attendus.
Nous pouvons donc en conclure que la PCR HPV à volume réduit n’engendre en rien
des modifications sur le résultat, lors de la détection et que les bandes attendues
apparaissent tout de même, malgré un volume PCR réduit.
Il faut également signaler que cette réduction du volume PCR amène
inéluctablement à l’utilisation d’un volume inférieur d’amplimère (50 μl) à celui
préconisé (75 μl).
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4.3.2 Raccourcissement de l’étape de détection et tests de robustesse:
Notre but était d’effectuer à la fois des tests de robustesse et des essais de
simplification du protocole Roche, de manière à connaître la gravité des
conséquences sur notre résultat final. Nous avons aisément pu répondre à cette
interrogation, après avoir comparé chacune des versions bénéficiant d’une
modification, avec une version standard.
En ce qui concerne les versions II et III, dans lesquels j’ai opté pour un
raccourcissement des temps de lavage, mon principal souci était d’éprouver de la
difficulté au moment de la lecture du résultat.
Il est vrai que les étapes de lavage sont importantes, étant donné qu’elles diminuent
le nombre d’hybridations aspécifiques, qui pourraient potentiellement gêner la lecture
du résultat en intensifiant le fond bleu de la bandelette, lors de l’ajout du substrat de
travail.
Il y aurait alors un risque que de faibles bandes soient masquées par ce fond bleu et
rendues négatives par le technicien en analyses biomédicales : une infection par un
certain génotype HPV pourrait ainsi passer inaperçue…
Les résultats se sont révélés identiques à ceux de la version standard, malgré un
bruit de fond un peu plus élevé qui ne troublait cependant en rien la lecture du
résultat.
La comparaison entre la version standard et la version IV, comprenant une
hybridation à 50°C au lieu de 53°C est aussi relativement satisfaisante.
En testant ce paramètre, je voulais m’assurer que même à des températures
inférieures, l’hybridation se déroulait toujours correctement: le risque encouru en
effectuant une telle modification serait incontestablement une augmentation des
hybridations non-spécifiques (séquence d’ADN imparfaitement complémentaire à
une sonde, mais qui s’y apparie tout de même) qui lors de la détection, révèleraient
un mélange de génotypes, faussant donc totalement le résultat réel.
Il est vrai qu’il y a toujours une part d’hybridations non-spécifiques, mais grâce à des
températures adéquates et généralement élevées, il est possible de contrecarrer ce
phénomène : plus on chauffe, plus les brins bicaténaires tendent à se séparer. Les
amplifiats ne possédant pas une parfaite correspondance avec la sonde à laquelle ils
se sont liés, vont être détachés, tandis que ceux qui sont bien complémentaires,
resteront hybridés. Ces derniers peuvent tout de même être dénaturés, dans le cas
où l’on augmenterait de plus en plus la température.
Pour ma part, je n’ai pas relevé d’hybridations non-spécifiques. J’en conclus donc,
que même si le bain-marie n’est pas tout à fait à la température requise, cela
n’entraînera aucunes conséquences sur le résultat.
Pour ce qu’il en est de la diminution de la quantité d’eau du bain-marie, le résultat est
également réjouissant.
Avec cette version je voulais, comme pour la version IV, m’assurer qu’il n’y avait
aucuns problèmes d’hybridations aspécifiques : en effet, j’ignorais si avec une
quantité moindre d’eau, le tray atteignait tout de même une température décente
pour effectuer des hybridations satisfaisantes.
En la comparant à la version standard, j’ai non seulement remarqué l’absence de
tout bruit de fond, mais aussi que la chaleur seule, dégagée par la plaque métallique,
suffisait à hybrider avec succès.
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Le dernier point de ma comparaison s’avérait être un raccourcissement du temps de
séchage.
Selon Roche, le résultat devait être lu au minimum après une heure de séchage, de
manière à ce que des bandes faiblement visibles ne puissent être rendues positives
directement à la fin de la détection, alors que la patiente est en réalité négative pour
ces génotypes.
En comparant les photos prises aux temps 0’, 15’, 30’, 45’ et 60’, j’ai constaté que
l’intensité des bandes changeait légèrement (s’éclaircissant avec le temps), mais
sans pour autant que quelconque doute puisse planer sur le résultat. Selon moi,
nous pouvons de suite lire le résultat.
Nous voulions également tester le séchage de la bandelette au four micro-ondes, qui
a révélé un résultat plus que satisfaisant : même résultat que pour la version
standard et fond de la bandelette nettement moins bleu.
Comme il ne semble y avoir aucun problème engendré à la suite de mes essais, je
peux donc aisément regrouper toutes ces modifications, afin d’établir ma propre
version d’hybridation/détection:
- Etape 13 : 50 μl d’amplimère dénaturé au lieu de 75 μl (cf. chapitre 4.3.1.).
- Etape 18 : Ajouter 4ml de tampon de lavage rigoureux de travail, agiter la
vanne à 24 puits, aspirer le liquide et répéter cette étape encore une fois
- Etape 23 : Ajouter 4ml de tampon de lavage ambiant de travail, agiter la vanne
à 24 puits, aspirer le liquide et répéter cette étape encore une fois
- Etape 25 : idem que la 23
- Etape 33 : 55sec. au micro-onde à chaleur moyenne.
Avant de clore ce chapitre, il est nécessaire de signaler qu’aucuns contrôles (C+ et
C-) n’ont été inclus dans le cadre de ces modifications. La raison en est simple : un
C- sert à écarter l’hypothèse d’une contamination et un C+ est nécessaire, afin
d’exclure la thèse d’un problème survenu, lors de l’extraction, la PCR ou
l’hybridation/détection.
Dans ce contexte, je cherchais seulement à mettre en évidence des variations ; la
présence de contrôles n’était donc pas utile.
4.3.3 Introduction de l’extraction JetQuick à la place d’Amplilute :
Pour des raisons pratiques nous voulions limiter le nombre de techniques d'isolation,
déjà bien important au sein du laboratoire, en essayant de remplacer l'extraction de
base par une des méthodes les plus utilisées en routine: l'isolation JetQuick, bien
plus rapide que l’extraction Amplilute.
En comparant les résultats obtenus avec ces deux méthodes, nous sommes
parvenus à en tirer des conclusions importantes, quant à l'établissement de notre
propre protocole.
En ce qui concerne l'extraction JQ, je devais m'assurer si une simple digestion avec
de la protéinase K suffisait à éliminer le matériel biologique ou s'il fallait en introduire
une deuxième, étant donné que Roche procède de la sorte et obtient des résultats
tout à fait satisfaisants.
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J'ai pu constater que la version JQ à une seule digestion suffisait à dissoudre le tout
et à rendre le tube limpide, c'est la raison pour laquelle le protocole de base JQ n'a
en aucun cas était doté d'une lyse supplémentaire.
Pour ce qu'il en est de la comparaison du rendement d'extraction des deux
méthodes, nous avons été agréablement surpris. En effet, nous ignorons la
composition exacte des deux types de colonnes utilisées lors de l'isolation et ne
savions pas si les colonnes JQ permettaient de récupérer une quantité d'ADN égale
ou supérieure à Amplilute ou si au contraire, une partie des acides nucléiques restait
prisonniers de la membrane en silice, au moment de l'élution.
Cependant, à la vue des résultats obtenus, nous pouvons aisément observer que,
malgré une faible perte d'acides nucléiques par rapport à Amplilute, l'extraction JQ
est tout à fait satisfaisante.
En tout dernier lieu, nous avons effectué une comparaison finale JQ-Amplilute sur les
bandelettes en nylon, qui dans un premier temps se révélait meilleure avec la
technique de base.
Après un deuxième essai infructueux (ajout d'une étape de précipitation à la fin de
l'isolation JQ), nous avons pris la décision de garder l'extraction Amplilute. En effet,
les bandes obtenues avec JQ s'avéraient relativement plus faibles, et nous
craignions qu'en présence d'infimes copies virales, l'infection HPV passe inaperçue.
De plus, le rendement d’extraction Amplilute (4.2.3 b) était également meilleur.
Nous sommes vraiment surpris du fait que JQ nous confère un tel résultat, car
habituellement, nous effectuons la plupart des isolations de cette manière et nous
avons toujours été satisfaits.
La présence d’inhibiteurs dans les extraits JQ pourrait expliquer les résultats obtenus
avec l’isolation. En effet, le test souris indique que l’on perd un peu plus d’ADN avec
JQ, perte qui aurait du être plus que compensée par la précipitation, sensée
concentrer notre extrait d’un facteur 10.
Cependant, tel ne fut pas le cas : cela nous pousserait donc à croire en la présence
d’inhibiteurs dans l’extrait JQ qui pourraient expliquer à la fois le premier résultat de
comparaison JQ-Amplilute et le résultat obtenu suite à la précipitation. En effet, en
cas d’inhibiteurs, ceux-ci se retrouveraient également concentrés après précipitation.
Il serait intéressant de poursuivre les investigations en tentant d’inclure au protocole
JQ la double digestion (testée p.44) qui avait été abandonnée au profit de la lyse
standard (cf protocole d’isolation JetQuick). Il se peut que de cette manière, les
potentiels inhibiteurs soient éliminés.
4.3.4 Survie de l'Ampérase :
L’ampérase possède la capacité de détruire les dUTP des amplicons nouvellement
synthétisés, à moins d’être mise en présence d’un agent dénaturant ou encore
soumis à des températures supérieures à 55°C.
Cependant, il nous a été permis de remarquer que cette enzyme, dans des
conditions lui étant favorables (températures inférieures à 55°C), n’avait aucune
action néfaste sur nos amplifiats.
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La précaution Roche, quant à la ponctualité du rajout de dénaturant aux amplifiats,
semble donc tout à fait superflue. Les PCR HPV peuvent aisément être démarrées à
toute heure.
4.3.5 Adaptation du protocole Roche en real-time PCR :
Cette adaptation s'est avérée être la partie la plus complexe de mon travail de
diplôme, étant donné que plusieurs paramètres doivent être pris en considération
lorsque l'on décide de travailler avec cet outil.
Tout d'abord il était question de savoir quels étaient les produits détectés grâce au
Syto 9 et par extension, si leur taille pouvait gêner l’interprétation de la courbe de
fusion. Après analyse sur gel d’agarose, nous avons pu constater qu’il y avait bel et
bien plusieurs produits, mais qu’aucun ne semblait posséder une taille similaire à
HPV.
En ce qui concerne l’utilisation de cette molécule fluorescente, il serait intéressant de
déterminer si le Syto 9 ne provoque pas d’interférences lors de la réaction
d’amplification. Nous pourrions déterminer cela en amplifiant deux fois un même
échantillon sur le RotorGene : la première amplification contiendrait du Syto 9 alors
que la deuxième n’en n’inclurait pas. Puis les amplifiats obtenus seraient hybridés
sur bandelette, selon Roche.
Dans un deuxième temps, il a fallu trouver le programme de Melt Curve adéquat, de
manière à ce que les différentes courbes de fusion soient le plus limpide possible.
Cette étape est relativement importante puisqu'il en résultera une analyse
mathématique, établie sur la base de ces courbes et destinée à la formation de pics.
Tout ce travail de mise au point s’est révélé fastidieux, mais nous avons pu en tirer
des conclusions importantes, à savoir qu’il est possible de voir un signal en real-time
PCR et que les pics à 82°C et environ 75°C, sont probablement l’ADN HPV et
respectivement l’ADN ß-globine.
Afin d’être tout à fait formels, nous pourrions analyser de l’ADN humain négatif pour
HPV, selon le programme HPV/ Melt Curve (RotorGene), de manière à n’obtenir que
la température de fusion de la ß-globine ainsi que des dimères d’amorces.
De même nous pourrions également travailler avec des échantillons HPV positifs,
mais dilués de sorte que la ß-globine ne soit plus décelable. Ainsi, nous n’aurions
que la température de fusion d’HPV et des dimères d’amorces.
De plus, il serait également intéressant de tester nos extraits sur un Rotor-Gene plus
performant (Rotor-Gene 6000), de manière à voir si l'interprétation des courbes en
ressort facilitée et s’il est possible de distinguer les génotypes entre eux.
En dernier lieu, nous espérions que le Rotor-Gene se montre autant, voire plus
sensible que l'étape de détection Roche, de sorte que par le futur, l'analyse des
amplifiats sur bandelette n'ait plus lieu d'être.
Les résultats sont extrêmement encourageants, mais il faudrait effectuer d’autres
essais.
Nous restons confiants et pensons que cette adaptation en real-time PCR
s'effectuera probablement dans un futur proche.
Stettler Mélanie
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4.3.6 Evaluation globale méthode Roche-méthode modifiée :
Etant donné que chacune des modifications testées isolément révélait des résultats
encourageants, nous étions confiants au moment de la comparaison finale version
standard-version modifiée. Cependant, les résultats obtenus se sont avérés moins
bons que ceux de la version Roche, après avoir combiné toutes les modifications :
cela nous a vraiment surpris et aussi relativement déçu.
Il est donc tout à fait probable que chaque petit changement ait contribué à la
péjoration du résultat, sans pour autant que cela ne soit visible après détection, et
que seulement la somme de toutes ces modifications rende cela visible.
Il serait intéressant de voir si le problème se situe plutôt à la détection ou déjà lors de
l’amplification : pour cela il faudrait tester parallèlement deux échantillons selon la
méthode modifiée, mais n’ajouter du Syto 9 que dans un seul des cas.
Malgré cela nous restons optimistes quant à l’introduction de notre propre protocole
HPV. En effet, en ne combinant pas la totalité des modifications envisagées, lors de
nos essais futurs, il se pourrait que nous aboutissions à un résultat satisfaisant.
4.3.7 Comparaison LINEAR ARRAY HPV Genotyping test avec la
Méthode Hybrid Capture 2 (HC2) de Digène:
Les génotypes mis en évidence par les hybridations sur bandelettes en nylon, sont
relativement cohérents avec ceux issus de la capture sur microplaque. Nous
décelons toutefois de légères variations au niveau des types détectés, mais celles-ci
restent néanmoins explicables : premièrement, les deux méthodes ne possèdent pas
le même seuil de sensibilité pour des types HPV identiques. Deuxièmement, les
panels de génotypes proposés diffèrent d’un fabricant à l’autre ; ainsi par exemple, il
n’est pas possible de détecter l’HPV 53 avec la méthode Digène.
Enfin, d’après une récente étude menée par des scientifiques, il s’est avéré que
plusieurs génotypes prodiguaient des réactions croisées avec le test HC2 HPV.
Il faut donc rester relativement vigilant, quant à ces éléments, lors de la comparaison
de ces deux méthodes.
Avant de conclure, il serait également important de souligner que la volonté
d’introduire la méthode Roche ne signifie pas forcément que le kit HC2 HPV DNA
test est moins performant, même si point du vue sensibilité le LINEAR ARRAY HPV
Genotyping test se montre plus sensible, quant à la détection de certains génotypes,
que Digène.
De même, selon le protocole du kit Roche nous remarquons que 37 génotypes HPV
différents sont détectables, donc bien plus de types que ce que Digène affirme
pouvoir mettre en évidence avec son kit. Cependant, il est important de signaler que
nous avons pu constater que Digène, de par ces réactions croisées, permettait de
détecter d’autres génotypes que seulement ceux cités dans le protocole
En se basant sur ces considérations, à savoir que le LINEAR ARRAY HPV
Genotyping test serait doté en partie d’une meilleure sensibilité que Digène et qu’en
théorie il nous permettrait de déceler un plus grand nombreux de génotypes, nous
pourrions en déduire que Roche décèlerait un taux plus élevé de patientes infectées,
toutes alors prises en charge par des professionnels de la santé, occasionnant ainsi
des coûts supplémentaires pour l’Etat.
Stettler Mélanie
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De plus, le recours au génotypage est tout à fait discutable : en effet, de connaître le
type exact d’HPV présent chez une personne, ne va pas changer le suivi de la
patiente en question. La stratégie médicale se basant sur la distinction des virus haut
risque- bas risque, la méthode Digène suffirait donc amplement.
Niveau tarifs, des différences de coûts sont également à prendre en considération :
la position Tarmed du test Digène est à 37.0590, alors que le LINEAR ARRAY HPV
Genotyping test se situe à la position 9124.34.
Quant à la justification du remplacement du kit Digène par celui de Roche, des
études sérieuses seraient nécessaires pour répondre aux questions suivantes : l’une
ou l’autre technique permettrait-elle de sauver plus de vie ? Quel bénéfice obtient-on
sur le plan de la morbidité ? Qu’en est-il des coûts ?
En désirant introduire la technique Roche, nous ne cherchions pas à remplacer les
prestations actuelles, mais à les compléter, puisque de nombreux médecins désirent
connaître le génotype exacte de l’HPV présent chez leur patiente : alors n’est –il pas
normal d’introduire une nouvelle analyse, quand on en a la possibilité, plutôt que de
sous-traiter toutes les demandes ?
4.3.8 Comparaison LINEAR ARRAY HPV Genotyping test avec le test
INNO-LiPA HPV Genotyping V2 de Innogenetics, pratiquée chez
MCL:
Comme déjà cité précédemment, toutes nos demandes de génotypages HPV sont
sous-traitées au laboratoire MCL, ayant recours au test INNO-LiPA HPV Genotyping
v2, dont le principe est similaire à celui mis au point par Roche Diagnostics:
Figure 28: Principe de test INNO-LiPA HPV
Genotyping v2
Amplification d'une partie de la région L1
du génome HPV. Puis l'hybridation des
amplifiats biotinylés avec des sondes
spécifiques
et
complémentaires,
présentes sur une bandelette de
nitrocellulose. Le conjugué streptavidinephosphatase alcaline, ajouté par la suite,
va venir interagir avec la biotine des
amplicons. Finalement une étape
d'incubation avec un chromogène 74
(NBT/BCIP) va former une précipitation
à l'endroit où des amplicons se sont liés
aux sondes correspondantes, révélant
une coloration brune-violette.
Malgré cette grande similitude, point de vue principe, nous voulions tout de même
nous assurer d'obtenir les mêmes résultats que notre laboratoire partenaire.
Dans l’ensemble, les génotypes trouvés sont identiques entre eux, peu importe les
méthodes, mais il semblerait que pour un cas, Roche s’avère plus sensible
qu’Innogenetics. Cela ne signifie pas que le résultat prodigué par MCL est erroné,
Stettler Mélanie
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mais qu’il n’y a tout simplement pas assez de copies du virus présent dans
l’échantillon, pour permettre une détection.
La technique Roche s’avère donc tout à fait satisfaisante.
Stettler Mélanie
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5 CONCLUSION
5.1 Conclusion générale
Le sujet de mon travail de diplôme fut relativement intéressant. En effet, les quatre
procédés (extraction, amplification, hybridation et détection) du LINEAR ARRAY HPV
Genotyping test m’offraient tellement de possibilités, point de vue modifications et
comparaisons, sur la base du protocole standard de la firme Roche, que toutes n’ont
pu être considérées.
Nous nous sommes donc restreints à, selon nous, trois éléments-clés sur lesquels
nous avons concentré toute notre attention en vue d’introduire le test de génotypage
HPV.
Notre intention était de bénéficier d’un test qui nous conférerait un génotype correct,
dans un délai assez court.
Le protocole Roche s’avérant relativement long, nous avons donc tenté de le
raccourcir, voir de le simplifier, grâce à des tests de robustesse et des essais de
simplification. Ceux-ci, malgré de premiers résultats relativement prometteurs, ne se
sont, par la suite, pas avérés aussi bons. En effet, une version modifiée du protocole
Roche, établie sur la combinaison de l’ensemble de ces tests, a révélé des
problèmes de cohérence au niveau des résultats. Nous ne pouvions donc pas nous
permettre de les ignorer.
Bénéficiant d’un appareil destiné à la PCR en temps réel, nous souhaitions
également réussir à y adapter le génotypage, de manière à pouvoir rendre les
échantillons HPV négatifs, dans un délai plus court : l’absence de toute courbe
d’amplification nous permettrait d’outrepasser l’étape de détection sur bandelette et
de directement pouvoir rendre le résultat au médecin.
Les nombreux essais entrepris sur le RotorGene, nous ont permis de voir qu’un
signal HPV était décelable avec l’utilisation du Syto 9 et que nous arrivions à obtenir
une potentielle température de fusion pour l’amplicon HPV. Cependant, ces essais
se sont tout de même montrés insuffisants, étant donné qu’à ce jour, nous ne
pouvons garantir que la Melt Curve permette de trier les échantillons positifs et
négatifs avec autant de sensibilité que l’hybridation Roche.
De futurs essais devront encore être entrepris de manière à pouvoir éclaircir ce point
et nous permettre d’être formels quant à la température de fusion du virus HPV.
Il apparaît donc évident que nous n’avons pas pu rédiger notre propre protocole de
génotypage HPV, mais un grand travail de débroussaillement a déjà été effectué, ce
qui nous guidera inéluctablement, je l’espère, vers un futur protocole personnalisé et
simplifié.
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5.2 Conclusion personnelle
Ce travail de diplôme m’a permis de m’ouvrir à de nouveaux horizons, en effet il n’est
pas commun de pouvoir bénéficier de la chance d’introduire une nouvelle analyse au
sein d’un laboratoire.
Ce thème fut tout à fait enrichissant, étant donné qu’il m’a permis de me familiariser
avec un virus dont je pourrais un jour, malheureusement, également être la cible.
En se prêtant à cette expérience, j’ai pu constater à quel point l’introduction d’une
nouvelle prestation médicale, n’est de loin pas aisée : ainsi il m’apparaît évident que
les personnes consacrant régulièrement de leur temps à ce genre d’activités ont bien
du mérite : cela représente des heures et des heures de réflexion et de patience,
pour ne peut-être même pas aboutir à quelque chose de concret.
La mise sur pied de cette nouvelle analyse n’a de loin pas été facile, surtout quand
les résultats obtenus ne s’avéraient pas être comme on l’espérait.
En ce qui me concerne, j’ai passé de nombreuses heures à effectuer les mêmes
manipulations (hybridations, extractions), souhaitant parfois m’arracher les cheveux
face à des résultats décevants, voire incompréhensibles.
Mes nombreux essais, notamment en real-time PCR, m’ont fourni énormément de
résultats qu’il a fallu dans un premier temps trier : ce ne fut pas une mince affaire, en
effet il faut savoir dans ces cas-là, faire preuve de logique et d’esprit de synthèse.
Je ne cacherai pas que je suis un peu déçu quant au résultat final obtenu. En effet, il
est vrai que lorsque l’on entreprend une tache, nous désirons tous pouvoir la mener
jusqu’au bout : je m’imaginais déjà en train de rédiger mon propre protocole de
génotypage HPV, mais malheureusement il m’aurait fallu du temps en plus pour
effectuer de nouveaux tests, étant donné que les modifications que je comptaient
apporter au protocole de base n’ont, pour l’instant, pas pu être adaptées.
Je garde cependant un excellent souvenir de ce travail de diplôme : cette expérience
m’a permise de gérer mes émotions, d’accepter le fait de ne pouvoir tout faire soimême, et que, par conséquent, le travail de laboratoire est bel et bien avant tout, un
travail de groupe, d’équipe, étant donné que les efforts que j’ai fourni en vue de
l’introduction du test de génotypage HPV serviront à mes collègues, après mon
départ.
Stettler Mélanie
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6 BIBLIOGRAPHIE
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7 REMERCIEMENTS
Je tiens à remercier tout particulièrement le Dr. Raphaël Coquoz, pour sa patience et
pour avoir su me guider tout au long de ce travail de diplôme, sans oublier ses
laborantines qui ont fait preuve de gentillesse et de soutien à mon égard, durant ces
6 mois de stage.
Un grand merci à Mme Nathalie Talliard, cytopathotechnicienne, pour ces
nombreuses explications qui m’ont énormément aidée dans la rédaction de mon
travail.
Je voudrais également remercier M. Daniel Roggli, représentant de la firme Roche,
pour sa disponibilité et toute la gentillesse, dont il a fait preuve pendant, et les mois
suivants notre training à Rotkreuz. Sans oublier la Dresse Martina Wiesgiggl,
responsable du training LINEAR ARRAY HPV Genotyping test, qui m’a
généreusement fourni des informations sur le kit Roche.
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8 ANNEXES
8.1 Annexe I : Liste des Figures
Figure 1: http://fr.wikipedia.org/wiki/Image:Papilloma Virus %28HPV%29 EM.jpg.............. 6
Figure 2: http://cbieme.free.fr .................................................................................................... 8
Figure 3: http://www.france-infectieux.org/virus/ ..................................................................... 9
Figure 4 : http://bioimage.free.fr/cyt_image/limbg.htm............................................................. 9
Figure 5 : http://www.ibcp.fr/rhaser/creze/viro/G4_2005_Papilloma_Epidemio_Patho.html 11
Figure 6 : http://www.aly-abbara.com/echographie/biometrie/scores/systeme_bethesda.html12
Figure 7 : http://www.ibcp.fr/rhaser/creze/viro/G4 2005 Papilloma Epidemio Patho.html .... 13
Figure 8: http://fr.wikipedia.org/wiki/Image:Dornwarzen.jpg................................................. 14
Figure 9 : http://www.ibcp.fr/rhaser/creze/viro/G4 2005 Papilloma Epidemio Patho.html .... 15
Figure 10 : http://bioimage.free.fr/cyt_image/limbg.htm......................................................... 17
Figure 11 : http://bioimage.free.fr/cyt_image/limbg.htm......................................................... 17
Figure 12: http://bioimage.free.fr/cyt_image/limbg.htm.......................................................... 18
Figure 13: http://bioimage.free.fr/cyt_image/limbg.htm.......................................................... 18
Figure 14 : http://www.geneticengineering.org/.../Graphics/DNA.gif .................................... 20
Figure 15 : http://svt.seconde.free/Vocabulaire/chromosome.jpg ........................................... 20
Figure 16 : http://www.france-infectieux.org/virus/ ................................................................ 21
Figure 17 :
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/a/a6/Gel_electrophoresis_apparatus.J
PG/200px-Gel_electrophoresis_apparatus.JPG ....................................................................... 23
Figure 18 :
http://www.hemaquebec.qc.ca/images/contenu/hemaquebec/rd/rd_marysestlouis_img.jpg... 23
Figure 19: Roche Molecular Diagnostics. (Octobre 2006). ..................................................... 25
Figure 23 : Roche Molecular Diagnostics. (Novembre 2007) ................................................. 30
Figure 24 : Roche Molecular Diagnostics. (Novembre 2007) ................................................. 30
Figure 25: http://www.corbettresearch.com.au/shared/rotorgene%203000/product%20info/rg3000web.pdf ...................................................................... 31
Figure 26: http://www.biometra.de/thermocycler-multi.0.html............................................... 32
Figure 27 : http://www.medite.de/typo3temp/pics/b149cc12ac.jpg ........................................ 38
Figure 28 : http://www.microgenbioproducts.com/pdf/Microlab%20Newsletters/MLAB
0.19.pdf..................................................................................................................................... 68
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8.2 Annexe II : Version d’hybridation et de détection avec un bainmarie insuffisamment rempli
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8.3 Annexe III : Comparaison établie quant à l’avancée du séchage
Version I :
0min
15min
Version II :
30min
45min 60min
0min
Version III :
0min
15min
15min
30min
45min
60min
30min
45min
60min
Version IV :
30min
45min
60min
0min
15min
Version V :
15min
30min
45min
60min
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8.4 Annexe IV : Variabilité inter- et intrasérielle rendement
extraction JQ-Amplilute
TUBE STANDARD= N°7 REFERENCE A:
TUBE STANDARD= N°7 REFERENCE B:
TUBE STANDARD= N°7 REFERENCE C:
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8.5 Annexe V: Protocole LINEAR ARRAY HPV Genotyping test
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9 LEXIQUE
1
Bicaténaire: double brin.
Nucléotides: unité de base de l’ADN (une base liée à un désoxyribose ainsi qu’à un groupe phosphate).
3
Génotype: ensemble des gènes contenus dans les cellules d’un organisme et qui constituent son patrimoine
héréditaire.
4
Phylogénétique: branche de la génétique étudiant l'histoire de l'évolution des espèces vivantes par le biais des
modifications de leur ADN.
5
Condylome: tumeur rosée ressemblant à une verrue localisée au niveau de l’anus et des muqueuses génitales.
6
Cadre de lecture: regroupement des nucléotides en codons, de manière à coder les acides aminés d’un
polypeptide.
7
Hétérodimère: complexe de protéines composé de deux sous-unités différentes mais souvent très similaires
point de vue structural.
8
Homodimère: complexe de protéines composé deux de sous-unités identiques.
9
Gène : ensemble de segments d’ADN constituant une unité d’expression qui va aboutir à la formation d’une
protéine.
10
Immunogène : qui est capable d’induire une réaction immunitaire.
11
Promoteur : unité génétique responsable de l’enclenchement de la transcription, il fixe le complexe
d’initiation de la transcription.
12
Endocytose : mécanisme d’internalisation de molécules ou particules, à l’intérieur de la cellule.
13
Cytosolique : qui a trait au cytosol.
14
Episome : molécule d'ADN circulaire et extrachromosomique possédant la capacité de se répliquer de manière
autonomal. Ils possèdent certains gènes codant la synthèse d'enzymes de restriction permettant leur intégration à
l’intérieur des chromosomes cellulaires ou bactériens.
15
Virion : particule infectieuse d’un virus.
16
Desquamation : élimination des couches superficielles cornées de l’épiderme.
17
Cytopathogène : effet nocif sur les cellules.
18
Epithélium malpighien : épithélium pavimenteux stratifié.
19
Dysplasie : anomalie au cours du développement d’un tissu ou d’un organe.
20
Carcinome : tumeur qui se développe à partir d’un tissu épithélial.
21
Apoptose : mort physiologique programmée des cellules dont la durée de vie normale est variable selon les
types cellulaires.
22
Papule : petite lésion cutanée saillante, bien circonscrite et ferme.
23
Périnée : région inférieure du petit bassin où se trouvent les organes génitaux externes masculins et féminins
ainsi que le canal anal.
24
Cryothérapie: traitement par le froid.
25
Cautérisation: destruction de tissus à l’aide de la chaleur ou d’un produit chimique.
26
Néoplasie : tumeur, le plus souvent d’origine cancéreuse.
27
Kératinisé : constitué de kératine, protéine synthétisée et utilisée par de nombreux être vivants en tant
qu’élément de structure. Celle-ci peut se retrouver à la surface de la peau, c’est ce qu’on appelle de la corne.
28
Colposcopie : inspection approfondie du vagin ainsi que du col utérin au moyen d’un colposcope à loupe
binoculaire.
29
Immunodéprimé : état dans lequel on observe une diminution ou suppression des réactions immunitaires
d’un organisme, due à une infection ou un moyen thérapeutique.
30
ADN-diploïde : qui possède une double panoplie de matériel chromosomique.
31
Activité mitotique : activité de division cellulaire, une cellule mère donne deux cellules filles identiques.
32
ADN-aneuploïde : qui ne possède pas une panoplie de matériel chromosomique normale.
33
Métaplasie : transformation d’un tissu différencié en un autre tissu, anormal par sa localisation.
34
Adénocarcinome : tumeur maligne développée à partir d’un tissu épithélial, dont la structure rappelle
grossièrement une glande.
35
Conisation : ablation d’un fragment de forme conique, du tissu du col utérin.
36
Hystérectomie : ablation du col de l’utérus, voire de ses annexes (trompes et ligaments).
37
Oncogène: qui favorise, provoque la formation d’une tumeur.
2
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Electrocoagulation : destruction circonscrite d’un tissu au moyen de la chaleur dégagée d’une électrode ayant
la forme d’une aiguille.
39
Traitement kératolytique : traitement à base d’acide salicylique et d’acide lactique enlevant les couches
mortes de peau par grattage.
40
Génodermatose : affection cutanée due à une anomalie génétique récessive, dominante ou liée à l’X.
41
Autosomal : qui se rapporte aux autosomes, c’est-à-dire les chromosomes du patrimoine génétique, à
l’exception des chromosomes sexuels.
42
Métastatique : qui provoque des foyers de cellules cancéreuses, à distance du cancer dit « primitif ».
43
Congénital : qui existe au moment de la naissance et donc qui provient de la vie intra-utérine.
44
Sonde : séquence d’ADN complémentaire à un brin matrice et marquée de façon à être détectable.
45
Leucorrhée : écoulement non sanglant du vagin.
46
Métrorragie : saignement du vagin en-dehors de la période menstruelle.
47
Prophylactique : qui prévient.
48
i.m. : inta-musculaire
49
Nucléosome : complexe de protéines (histones) autour duquel s’enroule l’ADN.
50
ARN : acide ribonucléique.
51
Stringence : les conditions d’hybridation.
52
Hydrolyser : provoquer par fixation de l’eau, la décomposition d’un élément en d’autres éléments.
53
Biotinylé : marqué à la biotine (=vitamine hydrosoluble possédant une grande affinité pour l’avidine).
54
Plasmide : petite molécule d’ADN circulaire, présente dans les bactéries et portant plusieurs gènes de
résistance aux antibiotiques.
55
Bactériophage : virus qui n’infecte que des bactéries.
56
ß -globine : beta-globine (=une des protéine qui en se liant avec l’hème, contribue é la formation de
l’hémoglobine).
57
Oligonucléotide : courte séquence de nucléotides.
58
Agent chaotropique : substance qui rompt les liaisons intra- et intermoléculaires non-covalentes. Elle apporte
une contribution essentielle dans la dissolution des tissus biologiques, lors de diverses préparations de
laboratoire.
59
Vmax: vitesse maximale.
60
Conjugué : composé organique qui est uni à un autre.
61
Substrat: substance sur laquelle agit une enzyme.
62
Buffer : Tampon (=mélange qu’on rajoute lorsque l’on veut stabiliser le pH d’une solution).
63
NH4Ac : acétate d’ammoniaque.
64
BSA : Bovine serum albumine.
65
DMSO : Dyméthylsufoxyde.
66
HCl : acide chlorhydrique
67
EDTA : l'acide éthylène-diamine-tétraacétique.
68
NaCl : chlorure de sodium.
69
SDS : Sodium Dodecyl Sulfate.
70
rpm : rotations par minutes.
71
ETOH : éthanol.
72
RT : room temperature (=température ambiante).
73
Valeur CT : nombre de cycles nécessaires pour que le nombre de copies fabriquées en cours de PCR,
produisent un signal dépassant un seuil (threshold) arbitrairement choisi.
74
Chromogène : substance qui produit de la couleur.
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Travail réalisé par Mélanie Stettler Laboratoire AMS

Transcription

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