Lactic (enzymatic),Citric(chemical),Citric(enzymatic)

RECUEIL INTERNATIONAL DES METHODES D’ANALYSES – OIV
Acide lactique – Méthode enzymatique
Méthode OIV-MA-AS313-07
Méthode Type II
Acide lactique
Méthode enzymatique
1. Principe de méthode
En présence de nicotinamide-adénine-dinucléotide (NAD) l'acide lactique total
(Llactate et D-lactate) est oxydé en pyruvate dans une réaction catalysée par la
Llactate déshydrogénase (L-LDH) et la D-lactate déshydrogénase (D-LDH).
L'équilibre de la réaction est en faveur du lactate. L'élimination du pyruvate du
milieu réactionnel déplace l'équilibre de la réaction dans le sens de la formation de
pyruvate.
En présence de L-glutamate, le pyruvate est transformé en L-alanine, réaction
catalysée par la glutamate-pyruvate-transaminase (GPT).
L-LDH
(1)
L-lactate + NAD+
(2)
D-lactate + NAD+
+
pyruvate + NADH + H
L-LDH
pyruvate + NADH + H+
L-LDH
(3)
Pyruvate + L-glutamate
L-alanine + -cétoglutarate
La formation de NADH, mesurée par l'augmentation de l'absorbance à la longueur
d'onde de 340 nm, est proportionnelle à la quantité de lactate présente.
Remarque : L'acide L-lactique peut être déterminé individuellement par
application des réactions (1) et (3). L'acide D-lactique peut être déterminé
individuellement par application des réactions (2) et (3).
2. Appareillage
2.1. Spectrophotomètre permettant d'effectuer les mesures à 340 nm, maximum
d'absorption du NADH.
À défaut, photomètre à spectre discontinu permettant d'effectuer les mesures à
334 nm ou à 365 nm.
2.2. Cuves de verre de 1 cm de trajet optique ou cuves à usage unique.
2.3. Micropipettes permettant de prélever des volumes compris entre 0,02 et 2 ml.
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3. Réactifs
Eau bidistillée
3.1. Solution tampon pH 10 (glycylglycine 0,6 mole/l ; L-glutamate 0,1 mole/l).
Dissoudre 4,75 g de glycylglycine, 0,88 g d'acide L-glutamique dans environ
50 ml d'eau bidistillée ; ajuster le pH à 10 avec quelques millilitres de solution
d'hydroxyde de sodium 10 M et porter à 60 ml avec de l'eau bidistillée.
La solution reste stable pendant au moins 12 semaines à + 4 °C.
-3
3.2. Solution de nicotinamide-adénine-dinucléotide (NAD) environ 40 × 10 M ;
dissoudre 900 mg de NAD dans 30 ml d'eau bidistillée. La solution reste
stable pendant au moins 4 semaines à + 4 °C.
3.3. Suspension de glutamate-pyruvate-transaminase (GPT) à 20 mg/ml. La
suspension est stable pendant au moins un an à + 4 °C.
3.4. Suspension de L-lactate-déshydrogénase (L-LDH) à 5 mg/ml. La suspension
est stable pendant au moins un an à + 4 °C.
3.5. Suspension de D-lactate-déshydrogénase (D-LDH) à 5 mg/ml. La suspension
est stable pendant au moins un an à + 4 °C.
Il est recommandé de procéder, préalablement au dosage, à la vérification de
l'activité de l'enzyme.
Remarque : L'ensemble des réactifs nécessaires pour le dosage est disponible
dans le commerce.
4. Préparation de l'échantillon
Le dosage du lactate s'effectue généralement directement sur le vin sans
décoloration préalable et sans dilution si la concentration en acide lactique est
inférieure à 100 mg/l. Si la concentration du vin en acide lactique est comprise
entre :
100 mg/l et 1 g/l diluer 1/10 avec de l'eau bidistillée ;
1 g/l et 2,5 g/l diluer 1/25 avec de l'eau bidistillée ;
2,5 g/l et 5 g/l diluer 1/50 avec de l'eau bidistillée.
5. Mode opératoire
Remarques préliminaires :
Eviter de toucher avec les doigts la partie de la verrerie qui entre en contact avec le
milieu réactionnel, ceci pouvant être une cause d’apport d’acide L-lactique qui
fausserait le résultat.
La solution tampon doit être ramenée à 20-25 °C avant de procéder au dosage.
5.1. Dosage de l'acide lactique total
Le spectrophotomètre étant réglé sur la longueur d'onde 340 nm, les mesures
d'absorbance se font dans les cuves de 1 cm de trajet optique, l'absorbance zéro
étant réglée par rapport à l'air (pas de cuve sur le trajet optique) ou par rapport
à l'eau.
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Dans les cuves de 1 cm de trajet optique introduire :
Témoin
Dosage
(ml)
(ml)
Solution 3.1. ..........…….….………..............….. 1.00
1.00
Solution 3.2. .........……………...….............….. 0.20
0.20
Eau bidistillée ………………..…...….............. 1.00
0.80
Suspension 3.3. .......……………....….........…... 0.02
0.02
Echantillon ……………………....…….….......... —
0.20
Mélanger à l'aide d'un agitateur de verre ou d'une baguette de matière
synthétique à bout aplati ; après environ 5 minutes, mesurer les absorbances
des solutions témoin et dosage (A1).
Ajouter 0,02 ml de solution 3.4 et 0,05 ml de solution 3.5, homogénéiser,
attendre la fin de la réaction (environ 30 minutes) et mesurer les absorbances
des solutions témoin et dosage (A2).
Déterminer les différences d'absorbances (A2-A1) du témoin et du dosage.
Déduire la différence d'absorbances du témoin de la différence d'absorbance du
dosage.
A = AD – AT
5.2. Dosage de l'acide L-lactique et de l'acide D-lactique
Le dosage de l'acide L-lactique et D-lactique peut être réalisé individuellement
en appliquant le mode opératoire indiqué pour l'acide lactique total, mais en
opérant ainsi après avoir déterminé A1 :
Ajouter 0,02 ml de solution 3.4, homogénéiser, attendre la fin de la réaction
(environ 20 minutes) et mesurer les absorbances des solutions témoin et
dosage (A2).
Ajouter 0,05 ml de solution 3.5, homogénéiser, attendre la fin de la réaction
(environ 30 minutes) et mesurer les absorbances des solutions témoin et
dosage (A3).
Déterminer les différences d'absorbances (A2-A1) pour l'acide L-lactique et
(A3A2) pour l'acide D-lactique dans le cas du témoin et dans le cas du dosage.
Déduire la différence d'absorbance du témoin de la différence d'absorbance du
dosage
A = AD – AT
Remarque : Le temps nécessaire à l'action des enzymes peut varier d'un lot à
l'autre. Il n'est donné ci-dessus qu'à titre indicatif. Il est recommandé de le
déterminer pour chaque lot. Lorsqu'on dose l'acide L-lactique seul, le temps
d'incubation après addition de la L-lactate deshydrogénase peut être ramené à
10 minutes.
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6. Expression des résultats
La concentration en acide lactique est donnée en grammes par litre (g/l) avec
1 décimale.2.5.1. Mode de calcul
6.1. Mode de calcul
La concentration en grammes par litre est calculée par la formule générale :
C
V x PM
x 
 x  x  x 1000
V = volume du test en millilitres (V = 2,24 ml pour l'acide L-lactique,
V = 2,29 ml pour l'acide D-lactique et l'acide lactique total).
ν = volume de l'échantillon en millilitres (ici 0,2 ml)
PM = masse moléculaire de la substance à doser (ici acide DL-lactique = 90,08)
δ = trajet optique de la cuve en centimètres (ici 1 cm)
 = coefficient d'absorption du NADH à 340 nm
-1
-1
(= 6,3 mmole x l x cm ).
6.1.1 Acide lactique total et acide D-lactique
C = 0,164 x A
Si une dilution a été effectuée lors de la préparation de l'échantillon, multiplier
le résultat par le facteur de dilution.
Remarque :
-1
-1
 Mesure à 334 nm :  = 6,2 (mmole x l x cm ).
C = 0,167 x A,
-1
-1
 Mesure à 365 nm :  = 3,4 (mmole x l x cm ).
C = 0,1303 x A,
6.1.2 Acide L-lactique
C = 0,160 x A
Si une dilution a été effectuée lors de la préparation de l'échantillon, multiplier
le résultat par le facteur de dilution.
Remarque :
-1
-1
 Mesure à 334 nm :  = 6,2 (mmole x 1 x cm ).
C = 0,163 x A,
-1
-1
 Mesure à 365 nm :  = 3,4 (mmole x 1 x cm ).
C = 0,297 x A,
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6.2. Répétabilité (r)
r = 0,02 + 0,07 xi
xi = concentration en acide lactique de l'échantillon en g/l.
6.3. Reproductibilité (R)
R = 0,05 + 0,125 xi
xi = concentration en acide lactique de l'échantillon en g/l.
BIBLIOGRAPHIE
HOHORST H.J., in Méthodes d'analyse enzymatique, par BERGMEYER H.U., 2e
éd., p. 1425, Verlag-Chemie Weinheim/Bergstaße, 1970.
GAWEHN K. et BERGMEYER H.U., ibid., p. 1450.
BOEHRINGER, Mannheim, Méthodes d'analyse enzymatique en chimie
alimentaire, documentation technique.
JUNGE Ch., F.V., O.I.V., 1974, no 479.
VAN DEN DRIESSCHE S. et THYS L., F.V., O.I.V., 1982, no 755.
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