Biochimie des Protéines

Biochimie des Protéines
Licence STS BiologieBiochimie UEO26 L3
Vincent Vedel
Chap. 5 : Purification des protéines
5.1 Les différentes étapes de la purification
5.2 Planification
5.3 Essai
5.3.1 Critères
5.3.2 Détecter la présence de protéines
5.3.3 Détecter la présence d’une protéine particulière
5.3.4 Essai d’activité enzymatique
5.4 Source de matériel
5.5 Extraction
5.5.1 Généralités
5.5.2 Tampon
5.6 Séparation et enrichissement
5.6.1 Précipitation au sulfate d‘ammonium
5.6.2 Dialyse
5.6.3 Sédimentation
5.6.4 Filtration sur gel
5.6.5 Echanges d’ions
5.6.6 Interactions hydrophobes
5.6.7 Chromatographie d’affinité
5.6.7 HPLC
5.1 Les différentes étapes.
Les paramètres
Paramètre
Technique
Taille
Filtration sur gel
Solubilité
Précipitation séquentielle au sulfate d'ammonium
Charge
Chromatographie d'échange d'ions
Densité
Centrifugation sur gradient; ultracentrifugation
Hydrophobicité
Chromatographie en phase inverse
Marqueur ajouté
Chromatographie d'affinité
5.1 Les différentes étapes.
exemple
Etape
Quantité de votre
protéine (unités
arbitraires)
Proportion de votre
protéine
matériel brut
4000
1 : 2 000 000
1
1000
1: 500 000
2
500
1: 100 000
3
200
1: 1 000
4
10
1: 100
5
5
1: 2
5.3 Essais
5.3.1 Les critères
Sensibilité
Parce que la protéine risque d'être très diluée à certaines
étapes, particulièrement les premières.
Spécificité
Nous cherchons une aiguille dans une grosse boîte
d'aiguilles, et comme rien ne ressemble plus à l'une
d'entre elles que sa voisine, il vaut mieux que nous
sachions vraiment reconnaître la nôtre.
Disponibilité des réactifs
Si votre protéine n'est qu'un des facteurs impliqués dans
une réaction in vitro requérant huit autres protéines
purifiées, mieux vaut déjà avoir ces derniers si vous
comptez utiliser un essai réactionnel. Sinon, optez pour un
essai que vous pouvez vraiment effectuer.
Coût
Ce facteur se présente souvent.
Temps requis
Plus votre purification est rapide et mieux ce sera. Votre
essai devrait donc vous permettre d'obtenir rapidement
une idée de ce qui se passe avec votre purification; si vous
pouvez l'effectuer à chaque étape PENDANT la
purification, encore mieux.
5.3 Essais
5.3.2 Présence de protéines
5.3 Essais
5.3.2 Présence de protéines
5.3 Essais
Electrofocalisation et gel 2D
5.3 Essais
Western blot et Dot blot
5.3 Essais
Essai d’activité enzymatique: méthode couplée
5.6 Séparation et enrichissement
5.6.3 Filtration sur membrane
5.6 Séparation et enrichissement
5.6.4 Sédimentation
5.6 Séparation et enrichissement
5.6.5 Filtration sur gel
5.6 Séparation et enrichissement
5.6.6 Echange d’ions
5.6 Séparation et enrichissement
5.6.7 Interactions hydrophobes
5.6 Séparation et enrichissement
5.6.8 Chromatographie
5.6 Séparation et enrichissement
5.6.8 Chromatographie