LA P.C.R. Polymerase Chain Reaction

Licence d’Informatique Année 2001-2002
Option: Introduction à la biologie moléculaire
LA P.C.R.
Polymerase Chain Reaction
"chercher une aiguille dans une meule de foin" ?
Chercher à repérer un gène particulier dans un génome
entier, qui en contient jusqu'à des centaines de milliers, c'est un peu
comme chercher une aiguille dans une meule de foin...
La technique de PCR permet de réaliser cet exploit en
multipliant spécifiquement le segment d'ADN d'intérêt (aussi
appelé ADN cible).
Objectif :
amplifier in vitro
une séquence
choisie de l'ADN
en tirant parti du
mode
normal de synthèse
de l'ADN in vivo.
Description de la PCR
- Chaque brin de l'ADN sert de matrice pour la synthèse du brin
complémentaire
- Si on répète le processus itérativement (réaction en chaîne +à chaque cycle,
le nombre de molécules double), après 20 cycles on obtient 106fois le
nombre d'exemplaires du fragment désiré (cad une quantité de l'ordre du
microG.pour une quantité initiale de l'ordre du picoG. !!).
- In vitro : la synthèse de mol.ADN se fait toujours à partir d'une amorce
("primer"). Cette amorce est une courte chaîne nucléotidique (oligonucléotide)
nécessaire à l'accrochage de la polymérase. Donc le choix d'un couple
d'amorces va déterminer les extrémités de la séquence synthétisée.
- procédé révolutionnaire : permet d'obtenir, pour la première fois, sans
clônage une amplification considérable d'un fragment donné d'ADN. Gain en
sensibilité et en temps.
Répétition de cycles comprenant :
- la dénaturation :tous les brins d'ADN sont dissociés par la
chaleur.
- l'hybridation des amorces sur un fragment d'ADN.
- l'extension : synthèse des brins à partir des amorces
hybridées
Tout se fait dans un seul tube ; seule la température varie
grâce à l'emploi de polymérase thermostable(Taq pol.).
- Attention au choix des amorces oligonucléotidiques,de la
température, durée des étapes.
- PCR amplifie toujours de l'ADN génomique ou ADN clôné
au préalable.
- Pour amplifier un fragment à partir d'ARN, +1étape avec la
réverse transcriptase.
Utilisations, très nombreuses.
- analytiques : analyse qualitative de la présence, taille ou
séquence de fragment d'ARN ou ADN. Analyse quantitative plus
difficile.
*aide au clônage en s'affranchissant des limites imposées par les
enzymes de restriction
*alternative à l'emploi de banques génomique ou d'ADNc.
- technologiques
*création de mutants grâce à l'utilisation d'oligonucléotides
dégénérés
Licence d’Informatique Année 2001-2002
Option: Introduction à la biologie moléculaire
Séquençage de l’ADN
Définition
Le séquençage de l’ADN, est la détermination de la
succession des nucléotides le composant, c’est
aujourd'hui une technique de routine pour les
laboratoires de biologie. Cette technique utilise les
connaissances qui ont été acquises depuis une
trentaine d'années sur les mécanismes de la
réplication de l'ADN.
Le séquençage
Les techniques de séquençage utilisent des enzymes
particulères : les ADN polymérases. Ces enzymes sont
capables de synthétiser un brin complémentaire d'ADN, à
partir d'un brin matrice
Le séquençage
Ces réactions se font par ajout de désoxyribonucléotides (dNTP :
désoxyNucléotide TriPhosphate). On utilise pour le séquençage des
nucléotides légèrement différents : les didésoxyribonucléotides (ddNTP).
Les ddNTP diffèrent des dNTP par l'absence d'un groupement OH en
position 3’. En effet, lorsqu'une ADN polymérase utilise un ddNTP au lieu
d'un dNTP, elle n'est plus capable de rajouter le moindre nucléotide à sa
suite : la synthèse du brin d'ADN s'arrète...
deux types de nucléotides triphosphates
Le séquençage
une ADN polymérase synthétise le brin complémentaire de l'ADN à
séquencer. Dans le milieu de réaction se trouvent des dNTP en grand
nombre, et une faible proportion d' u n ddNTP (à Adénine, o u Guanine,
o u Thymine, o u Cytosine). A un moment totalement aléatoire, un
ddNTP sera ajouté à la chaîne en cours de synthèse par l'ADN
polymérase. Cette synthèse s'arrêtera donc à cet endroit.
Par exemple, si le milieu réactionnel contient une faible proportion de
didésoxyribonucléotide à Guanine (ddGTP), on obtiendra à la fin des
réactions un ensemble de brins d'ADN de tailles variés, selon l'endroit
où un ddGTP se sera inséré et que la réaction aura ainsi été stoppée
(ce qui correpond, du fait de la complémentarité des bases, à la
présence d'une Cytosine dans le brin d'ADN séquencé). On répète la
même opération avec un milieu contenant du ddATP, un milieu
contenant du ddCTP, et un milieu contenant du ddTTP.
Le séquençage
l'utilisation d'un ddNTP permet d'obtenir un ensemble de fragments d'ADN
de différentes tailles, correspondant a u x e m p lacement d'un nucléotide
donné
Lecture de la séquence
La plus vieille méthode, encore utilisée dans les séquençages "à la main" (voir
au contraire l'automatisation ci-dessous) consiste en une migration de deux à
quatre heures sur gel d'acrylamide. Il faut ensuite pouvoir "voir" les fragments
d'ADN. Pour cela, certains des nucléotides utilisés sont marqués, soit par ajout
d'une molécule fluorescente (sur l'amorce utilisée), soit par utilisation de
nucléotides marqués radioactivement.
On "lit" donc la séquence soit en regardant la fluorescence, soit en exposant un
film photographique au gel (après révélation, des bandes sombres apparaissent
là où se trouvait de l'ADN. Suivant la taille des gels la séquence lue est limitée
de 200 à 750 nucléotides environ. Il faut que les bandes soient suffisamment
espacées pour que leur ordre soit déterminable.
Lecture de la séquence
An Introduction to Genetic Analysis
Point de départ
Une ADN polymérase n'est pas capable de débuter une synthèse d'un
brin d'ADN à partir de rien. Il lui faut partir d'un court fragment d'ADN,
appelé une amorce. Cette amorce est un oligonucléotide de 15 à 25
nucléotides, complémentaire d'une séquence d'ADN connue, située
juste en amont de l'ADN à séquencer :
Pouvez vous me donner l’orientation des brins d’ADN?
Point de départ
3’
5’
5’
3’
L’ADN polymerase synthetise dans le sens 5’ vers 3’.
L'autom a tisation du séquençage
La très grande majorité des séquences réalisées et publiées aujourd'hui
sont réalisées sur des séquenceurs automatiques. Ceux-ci sont
capables de réaliser les réactions de séquence, puis de les lire :
Pour cela, on marque les fragments d'ADN grâce à des marqueurs fluorescents.
Une fois la réaction de séquence terminée, la taille des fragments obtenus est
déterminée par une chromatographie. Le séquenceur détecte la fluorescence
sortant des colonnes de chromatographie, repérant ainsi les fragments d'ADN et
leur taille précise. Les systèmes les plus modernes permettent même de lire les
quatres nucléotides à partir d'une seule colonne de chromatographie.
Le résultat est présenté par la machine sous forme de courbes présentant la
fluorescence détectée, et l'interprétation qui en est faite en terme de nucléotides.
Exemple d’enregistrement obtenu à
partir d’un séquenceur automatique
An Introduction to Genetic Analysis
Les séquenceurs automatiques présentent de nombreux
avantages : l'automatisation et l'utilisation d'une
chromatographie au lieu d'une électrophorèse permet un
gain de temps appréciable. Le coût de revient est bien
moindre (une fois amorti l'investissement dû à l'achat de la
machine). De plus, alors qu'on ne peut guêre espérer lire
plus de 300 nucléotides de manière correcte lors d'un
séquençage "à la main", les séquenceurs permettent de
lire plusieurs centaines de nucléotides avec une très bonne
qualité, jusqu'à 1000 pour les appareils les plus
performants !
La seule limitation à l'utilisation de séquenceurs
automatiques reste leur coût d'achat élevé, qui impose,
concrêtement, la mise en place de services communs de
séquençage dans les instituts de recherche (projet
génopôle).
Références
• Griffiths , Anthony J.F., M iller , Jeffrey H., Suzuki , David,
Lewontin , Richard C., Gelbart , William M., An introduction to
genetic analysis, 7/e, 2000, W .H. Freeman.
Chapitre 12
http://ww w .ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowSection&rid=i
ga
• Lodish, Berk, Zipursky Matsudaira, Baltimore, Darnell,
Molecular Cell Biology
Chapitre 7
http://ww w .ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowTOC&rid=mc
b.TOC