Génétique Genetics

Génétique
Electrophorèse
Genetics
Electrophoresis
Ref :
117 055
Français – p 1
English – p 7
Version : 7007
Kit ADN de phage digéré
Digested phage DNA KIT
Génétique
Kit ADN de phage digéré
Ref :
117 055
1 Description
Ce kit comporte un même ADN digéré par deux enzymes de restriction
différentes et le produit de densification, ce qui permet de préparer son
électrophorèse. Il permet de pratiquer au moins 20 dépôts pour chacun des
ADN.
L’ADN utilisé est celui de bactériophage lambda digéré par une enzyme de
restriction (soit ECO RI, soit HIND III). Cet ADN est d’une taille de 49 Kb (1 Kb
= 1000 pb paires de bases), sa digestion fournit un nombre restreint de
fragments de restriction.
Taille des fragments en pb obtenus après digestion :
• Par Hind III : 23130 9416 6557 4361 2322 2027 564 125
• Par Eco RI : 21226 7421 5804 5643 4878 3530.
Placés dans un gel d’agarose et soumis à un champ électrique, les fragments
d’ADN de tailles différents migrent plus ou moins rapidement suivant leur
masse moléculaire. La charge relative des fragments étant la même, c’est
l’effet de tamisage exercé par le gel qui influe sur la migration. La vitesse de
migration diminue plus la taille des fragments (exprimée en pb ou en Kb) est
importante.
2 Composition
Ce kit comporte les produits suivants :
• Un tube eppendorf de 13 μg ADN de phage digéré par l’enzyme ECO
RI (tube A),
• Un tube eppendorf de 13 μg ADN de phage digéré par l’enzyme HIND
III (tube B),
• Un tube eppendorf de 0,5 mL de solution de charge (tube C),
• Un tube d’eau distillée (tube D),
• Deux tubes eppendorf vides.
3 Matériel complémentaire
Ce matériel est indiqué pour une électrophorèse.
- Matériel d’électrophorèse en gel d’agarose :
- Ensemble complet électrophorèse élèves (cuve et alimentation) : réf :
591 034
Ou cuve électrophorèse ADN : réf. 591 031
et alimentation pour gel d’ADN (100 V ; 50 mA) : réf. 281 287 ou réf.
281 267
- Une cuve à électrophorèse et son support (réf : 591 031),
- Matériel consommable pour préparer un gel d’agarose, réaliser la migration
et la coloration : agarose, tampon TBE, colorant de révélation des fragments
d’ADN (le kit électrophorèse gel d’agarose réf : 105 253)
- Une cuvette pour colorer puis rincer le gel,
- De l’eau distillée
- Au moins une micropipette à volume variable (5 à 50 μL) et ses cônes
adaptés.
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Kit ADN de phage digéré
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117 055
4 Conservation et précautions d'utilisation
Dès réception, placer les tubes d’ADN au congélateur sauf si l’utilisation est
immédiate (vous pouvez placer tout le kit au congélateur si il ne doit pas être
utilisé tout de suite).
Les 2 tubes eppendorf supplémentaires permettent de faire la manipulation en
plusieurs fois ou en deux postes ou alors de conserver une partie des produits
pour ne pas tout donner d'un coup à une classe, ce qui risquerait de
"contaminer" l'ensemble du produit.
Le gel d’électrophorèse est glissant et fragile. Il peut se déchirer si il est plié, il
faut donc veiller à toujours le maintenir quand il est sur son support en le
bloquant au niveau des côtés ouverts.
Les gels formés par avance se conservent dans du tampon TBE (solution de
travail diluée).
Pour ce qui est de la cuve à électrophorèse :
- Effectuer toutes les opérations afférentes à des transferts de liquides, à des
endroits éloignés de l’alimentation. Eviter toute projection d’eau sur le boîtier
d’alimentation.
- Optimiser l’utilisation de la longueur des cordons d’alimentation de la cuve en
éloignant au maximum la cuve de l’alimentation, notamment lorsque celle-ci
est sous tension.
- Bien essuyer la surface externe de la cuve avant de procéder à son
raccordement à l’alimentation.
- Ne mettre le dispositif sous tension que lorsque tous les branchements sont
effectués, la cuve fermée et les précautions citées précédemment
respectées. La cuve dispose d’un dispositif de sécurité mécanique interdisant
l’accès à l’intérieur de la cuve lorsqu’elle se trouve sous tension. Le retrait du
couvercle de la cuve provoque un arrêt immédiat de l’alimentation des
électrodes.
5 Montage et installation
Replacer le gel sur le support en U, puits ouverts sur le dessus dans le cas ou
il aurait été préparé à l’avance.
Placer l’ensemble, gel sur son support, dans le fond de cuve à électrophorèse,
Remplir avec environ 300 mL de tampon TBE dilué 10 fois (solution de travail
préparée avec le kit gel d’agarose), en veillant à ce que le niveau vienne au
maximum affleurer le niveau supérieur du gel, il ne faut en aucun cas le
recouvrir !
Les puits devront se trouver du côté de la cathode (borne négative).
6 Utilisation - Mise en œuvre
6.1 Préparation de l'ADN
Etapes à réaliser pour les deux échantillons d’ADN, tube A et tube B.
Avant la séance, décongeler l'ADN. Placer le tube eppendorf et le contenant
environ 3 minutes sous l'eau chaude, puis le plonger dans l'eau glacée
pendant deux minutes. Cela permet, par chocs thermiques, de séparer les
fragments qui auraient pu s'associer à nouveau et d'autre part d'éviter la
nouvelle formation de « bouts collés ».
Dans le tube eppendorf, diluer la solution mère d'ADN en ajoutant, à l’aide
d’une micropipette, 148 µL d’eau distillée prélevée dans le tube D. A ce stade
la solution d’ADN peut être fractionnée pour en conserver une partie.
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Kit ADN de phage digéré
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Remarque :
L’ADN non utilisé doit être replacé le plus tôt possible à – 15°C (même s’il
s’agit d’un échantillon densifié).
Le produit supporte aisément une succession de plusieurs alternances de
congélation / décongélation sans perdre ses propriétés. Mais il faut réduire au
minimum la durée de décongélation pendant laquelle une dégradation
occasionnelle par des micro-organismes est possible.
Réaliser ensuite la densification de l'ADN :
A l'ADN préparé précédemment, ajouter une solution de charge pour densifier
l'échantillon et permettre son dépôt dans les puits du gel immergé. Cette
solution contient en plus un indicateur de migration, le bleu de bromophénol
(BBP) qui migre à une vitesse voisine d'un fragment d'ADN double brin de 300
paires de bases (pb), soit plus vite que tous les fragments (sauf un) de
restriction impliqués dans ce TP.
A l’aide de la micropipette, ajouter à la solution d’ADN obtenue dans l’étape
précédente, 37 µL de la solution de charge colorée contenue dans le tube C.
Bien mélanger l'ensemble. A ce stade la solution d’ADN peut également être
fragmentée en fonction de l’utilisation qui en sera faite. Si le volume de
solution d’ADN à densifier est moins important il est nécessaire de respecter
les proportions suivantes : 1 volume (20 %) de solution de charge pour 4
volumes (80 %) de solution d'ADN.
6.2 Dépôt de l’ADN
Déposer dans chaque puits du gel d’agarose, à l’aide de la micropipette, 5 μL
de solution d’ADN densifié.
Prendre appui sur le coude pour ne pas bouger et verser au fond de chaque
puits sans le perforer.
Ranger immédiatement au congélateur l’ADN, même densifié, non utilisé.
Remarque :
Selon les modèles de cuves et de puits, la quantité de solution d’ADN à
déposer dans un puits varie entre 5 et 8 μL. Les quantités fournies dans le kit
permettent d’effectuer au moins 20 dépôts par type d’ADN.
Suggestion : Pour une exploitation ultérieure de l’électrophorèse, il est
important de relever (à l’aide d’un schéma par exemple) ce qui a été déposé
dans chacun des puits.
6.3 Migration électrophorétique
Pour les caractéristiques techniques de la cuve à électrophorèse et de
l’alimentation, se reporter à leurs notices respectives.
Fermer la cuve à l'aide de son couvercle.
Respecter la correspondance des couleurs entre les cordons de la cuve et les
douilles de l’alimentation.
Rappel : les puits doivent être du côté de la cathode.
Régler la tension de votre alimentation sur 100 V pour toute la durée de
l’électrophorèse. Mettre l’alimentation sous tension. La migration démarre.
Vérifier le bon déroulement de votre électrophorèse : de la buée doit
apparaître sur le couvercle dans les cinq premières minutes si le générateur et
la cuve sont bien alimentés.
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Génétique
Kit ADN de phage digéré
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Suivre la migration par l’intermédiaire du BBP, le colorant doit quitter les puits
de dépôts et se déplacer vers l’anode.
Arrêter le générateur quand le BBP a dépassé le milieu de la cuve soit environ
5 cm, ce qui prend 45 min à 1 heure. Pour cela couper l’alimentation,
débrancher la cuve et le cordon secteur.
Suggestion : On peut mesurer la distance parcourue depuis le puits par le
BBP pour une exploitation ultérieure.
6.4 Révélation des fragments D’ADN
Retirer avec précaution l’ensemble support / gel, essuyer le dessous du
plateau et placer le tout dans un bac ou simplement le gel.
Recouvrir le gel avec la solution bleue de colorant de révélation (non fourni,
voir liste de « matériel complémentaire ») et agiter doucement pendant 10
minutes : le gel devient totalement bleu.
Récupérer la solution de colorant et rincer le gel à l’eau déminéralisée.
Décolorer le gel par plusieurs bains successifs dans de l’eau déminéralisée
(eau du robinet à proscrire) : les bandes d’ADN restent colorées et deviennent
de plus en plus visibles.
Le gel révélé peut être conservé ainsi plus de 10 jours dans de l’eau
déminéralisée (placer un couvercle pour limiter l’évaporation).
7 Entretien et diagnostic de panne
L’électrophorèse utilise des tensions élevées, nécessitant un dispositif de
sécurité infaillible. D’autre part, les alimentations fournies par JEULIN sont
toutes équipées de douilles de sécurité. Si, lors de la mise sous tension,
l'alimentation disjoncte, retirer un peu de solution tampon.
La disjonction peut être due à une trop grande conductivité de la solution,
provoquant la mise en marche de la protection en court-circuit. Se reporter à la
notice de l’alimentation pour le rétablissement de la tension.
8 Exemples d'application expérimentale Mode opératoire
Selon le nombre de gels et de cuves dont on dispose, chaque binôme
réalisera sa propre électrophorèse après avoir pratiqué un ou deux dépôts de
chacun des deux ADN, ou bien les dépôts des différents binômes seront
rassemblés sur deux gels (chaque gel permet 10 dépôts soit ceux de 5
binômes). Les électrophorèses obtenues seront exploitées par les élèves
après révélation des fragments d’ADN.
Les deux enzymes de restriction scindent l'ADN en un nombre variable de
fragments visibles sous forme de bandes dont l'épaisseur et la distance de
migration sont fonction de leur masse en paires de bases.
Faire découvrir le mode d’action des enzymes de restriction par l’analyse de
l’électrophorégramme.
Faire comprendre que la vitesse de migration est ici fonction de la taille des
fragments en constatant que les bandes sont d’autant plus colorées et
épaisses qu’elles sont plus proches des puits. En effet, on peut considérer que
le nombre de fragments au niveau de chaque bande est le même. C’est donc
la masse moléculaire de ces fragments qui varie.
Déterminer la taille d’un fragment de restriction. Pour cela il faut utiliser l’ADN
de phage lambda coupé par Hind III comme marqueur de taille (étalon) et
proposer la détermination de la taille d’un fragment d’ADN coupé par Eco RI.
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Génétique
Kit ADN de phage digéré
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On considère que dans les conditions habituelles et dans certaines limites, le
log décimal de la taille (en pb) d’un fragment est inversement proportionnel à
la distance de migration. Il suffit donc, à partir du gel (ou d’une photo
numérisée), de mesurer la distance de migration de chaque bande de l’ADN
étalon. Connaissant la taille des fragments (indiquée dans le chapitre
« Description »), on construit la courbe étalon log (T) = f (d) avec T= taille en
pb et d = distance parcourue en mm. Pour déterminer la taille d’un fragment
inconnu, ici de l’ADN coupé par Eco RI, il faut mesurer d et retrouver T sur la
courbe étalon (partie linéaire de la courbe).
Remarque :
On peut tracer la courbe Log (T) = f (Rf) avec Rf = distance parcourue par la
bande / distance parcourue par le BBP, mais il faut alors mesurer la migration
du BBP avant coloration.
Attirer l’attention des élèves sur l’efficacité de la méthode par l’évaluation des
microquantités d’ADN utilisées et révélées.
Envisager les opérations qui complètent l’électrophorèse lors de la réalisation
d’un Southern blot, par exemple, dans le cadre d’un diagnostic prénatal.
9 Pistes pédagogiques
Cette électrophorèse peut se placer dans le cadre d’une étude des enzymes
de restriction qui sont de véritables ciseaux moléculaires afin de montrer leur
effet sur l’ADN. Elle peut se coupler avec un traitement informatique des
données à l’aide des logiciels tableurs et des logiciels de traitement de
séquences d’ADN (repérage des sites de restriction, construction d’une carte
de restriction…).
La comparaison des deux migrations permet d’envisager la spécificité d’une
enzyme vis-à-vis d’un site de restriction. Pour information le site de restriction
(séquences de bases spécifique de l’ADN) reconnue par Eco RI est GAATTC
et elle coupe entre G et A formant des « bouts collants ». Celui de Hind III est
AAGCTT et elle coupe entre A et A.
L’obtention des « bouts collants » permet une ouverture vers les applications
qui en découlent : ADN recombinants …
L’électrophorèse peut aussi être le moyen d’aborder les utilisations que cette
technique (digestion de l’ADN et séparation des fragments) a rendu possible :
étude des gènes et de leur polymorphisme, empreintes génétiques, tests de
paternité et, associée au Southern blot, le diagnostic génétique.
10 Service après vente
Pour toutes questions sur ce produit, veuillez contacter :
JEULIN - SUPPORT TECHNIQUE
Rue Jacques Monod
BP 1900
27 019 EVREUX CEDEX FRANCE
+33 (0)2 32 29 40 50
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Génétique
Kit ADN de phage digéré
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117 055
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Genetics
Digested phage DNA kit
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1 Description
This kit incorporates the same DNA digested by two different restriction
enzymes and the densification product, which allows preparing its
electrophoresis. It allows carrying out at least 20 deposits for each DNA.
The DNA used is that of the lambda bacteria phage digested by a restriction
enzyme (either ECO RI or HIND III). This DNA is of the size of 49 Kb (1 Kb =
1000 pb base pairs); its digestion supplies a restricted number of restriction
fragments.
Size of fragments in pb obtained after digestion:
• By Hind III : 23130 9416 6557 4361 2322 2027 564 125
• By Eco RI : 21226 7421 5804 5643 4878 3530.
Place in agarose gel and subjected to an electrical field, the DNA fragments of
different sizes migrate more or less quickly depending on their molecular
mass. Since the relative charge of the fragments is the same, it is the filtering
effect of the gel which influences migration. The speed of migration reduces
the larger the size of fragments (expressed as pb or Kb).
2 Composition
This kit incorporates the following products:
• An Eppendorf tube of 13 μg DNA of phage digested by the ECO RI
enzyme (tube A),
• An Eppendorf tube of 13 μg DNA of phage digested by the HIND III
enzyme (tube B),
• An Eppendorf tube of 0.5 mL of charge solution (tube C),
• A tube of distilled water (tube D),
• Two empty Eppendorf tubes.
3 Additional equipment
The equipment is indicated for electrophoresis.
- Electrophoresis equipment in agarose gel:
- Complete electrophoresis set for students (tank and power
supply) P/N : 591 034
or DNA electrophoresis tank: P/N. 591 031
and a power supply for DNA gel (100 V ; 50 mA) : P/N 281 287 or
P/N 281 267
- An electrophoresis tank and its support (P/N 591 031),
- Consumables to prepare the agarose gel, perform migration and dyeing:
agarose, TBE buffer solution, dye for revealing DNA fragments (the agarose
gel electrophoresis kit P/N: 105 253)
- A tank to dye then rinse the gel,
- Distilled water,
- At least one micropipette with variable volume (5 to 50 μL) and its adapted
cones.
4 Preservation and precautions for use
On receipt, place the DNA tubes in the freezer unless they have to be used
immediately (you can place the whole kit in the freezer if it is not to be used
straightaway).
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Genetics
Digested phage DNA kit
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The 2 additional Eppendorf tubes allow performing the operation several times
or at 2 workstations, or preserving a proportion of the products if the whole
session is not to be taught at once to the class, which could “contaminate” the
whole product.
The electrophoresis gel is slippery and fragile. It can tear if it is folded, so it is
necessary to ensure it is always maintained on its support by blocking it off at
the open ends.
Gels formed in advance can be preserved in TBE buffer solution (diluted
working solution).
Concerning the electrophoresis tank:
- Carry out all operations concerning transfer of liquids well away from power
supplies. Avoid any splashing of water on the power supply unit.
- Take advantage of the length of the tank power cables and move the tank as
far away as possible from the power supply, notably when the power is
switched on.
- Wipe the external surface of the tank carefully before connecting it to the
power supply.
- Do not power-on the equipment until all connections have been made, the
tank is closed and the above-mentioned precautions respected. The tank
has a mechanical safety device which prevents access to the inside of the
tank when it is powered-on. Removal of the tank cover causes an immediate
shut-down of the power supply to the electrodes.
5 Assembly and installation
Replace the gel on the U-shaped support, wells open on the top in the case
where it has been prepared in advance.
Place the assembly, with the gel on its support, in the base of the
electrophoresis tank.
Fill with approximately 300 mL of TBE buffer solution diluted by 10 (working
solution prepared with the agarose gel kit) ensuring the level is as a maximum
just touching the upper surface of the gel; under no circumstances should the
gel be covered over!
The wells must be located on the cathode side (negative terminal).
6 Use - Application
6.1 Preparation of the DNA
Stages to be performed for the two samples of DNA, tube A and tube B.
Before the session, thaw out the DNA. Place the Eppendorf tube and the
container for approximately 3 minutes in warm water, then plunge into icy
water for two minutes. Thanks to the thermal shock, this will separate the
fragments which may have re-combined, and avoid new formations of “sticky
ends”.
In the Eppendorf tube dilute the parent solution of DNA by adding, using a
micropipette, 148 µL of distilled water from tube D. At this stage the solution
of DNA can be divided to preserve a proportion of it.
Remarks:
The unused DNA must be replaced as early as possible at – 15°C (even if it is
a densified sample).
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Digested phage DNA kit
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The product will easily accommodate a series of alternate freezing/thawing
sequences without losing its properties. But the period of thawing should be
reduced to a minimum since occasional damage by micro-organisms is
possible.
Then perform densification of the DNA:
To the DNA prepared previously, add a charge solution to densify the sample
and allow depositing it in the wells of the submersed gel. This solution
contains in addition, the migration indicator, bromophenol blue (BBP) which
migrates at a speed similar to a fragment of double strand 300 base pairs (pb)
DNA, that is quicker than all the restriction fragments (except one) involved in
this TP.
Using the micropipette, add to the DNA solution obtained during the previous
stage, 37 µL of the dyed charge solution contained in tube C. Mix the whole
carefully. At this stage the DNA solution may also be fragmented depending
on the use that will be made of it. If the volume of DNA solution to be
densified is less, it is necessary to comply with the following proportions: 1
volume (20 %) of charge solution for 4 volumes (80 %) of DNA solution.
6.2 Deposit of DNA
In each agarose gel well, deposit using the micropipette, 5 μL of densified
DNA solution.
Use your elbows for support to avoid excess movement, and pour the
substance into the bottom of each well without perforating it.
Place the DNA in the freezer immediately, even that which is densified and not
used.
Remark:
Depending on the model of the tank and the wells, the quantity of DNA to be
deposited in a well varies between 5 and 8 μL. The quantities supplied in the
kit allow at least 20 deposits per type of DNA.
Suggestion: For further analysis of the electrophoresis, it is important to
record (for example in the diagram) what has been deposited in each of the
wells.
6.3 Electrophoretic Migration
For the technical characteristics of the electrophoresis tank and the power
supply, refer to the respective instructions for use.
Close the tank with its cover.
Match the colour of the tank cables and the power supply sockets.
Recall: the wells must be on the cathode side.
Adjust the power supply voltage to 100 V for the entire duration of
electrophoreses. Power on. Migration will begin.
Check satisfactory progress of electrophoresis: mist should appear on the
cover within the first five minutes if the generator and the tank are correctly
supplied with power.
Follow up migration using the BBP, the dye should leave the deposit wells and
move towards the anode.
Stop the generator when the BBP has passed the mid-point of the tank, that is
approximately 5 cms, which takes 45 minutes to 1 hour. Switch off the power
supply, unplug the tank and the mains lead.
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Genetics
Digested phage DNA kit
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117 055
Suggestion: The distance travelled from the well by the BBP can be
measured for later analysis
6.4 Revelation of the DNA fragments
Carefully remove the support/gel assembly, dry the underside of the tray and
place the whole or simply the gel in a tank.
Cover the gel with the blue revealing dye (not supplied, see list of “additional
equipment”) and stir gently for 10 minutes: the gel will become totally blue.
Recover the dye and rinse the gel in de-mineralised water.
Decolour the gel by a sequence of baths in demineralised water (tap water
must be avoided): the strips of DNA remain dyed and become increasingly
visible.
The revealed gel can be preserved for 10 days in demineralised water (add a
cover to eliminate evaporation).
7 Maintenance and diagnosing failures
Electrophoresis uses high voltages which require an infallible safety device.
Also, the power supplies provided by JEULIN are all equipped with safety
sockets. If, during powering-on the power supply is cut off, remove a little
buffer solution.
The cut-off may be caused by excessive conductivity of the solution, triggering
of the protective short circuit. Refer to the power supply instructions to restore
the voltage.
8 Examples of application in experiments Procedure
Depending on the number of gels and tanks available, each pair carries out
electrophoresis after one or two deposits of the two DNAs, or the deposits by
the various pairs are assembled on two gels. (Each gel allows 10 deposits,
that is of the 5 pairs). The electrophoresis obtained will be analysed by the
students after revealing of the DNA fragments.
The two restriction enzymes split the DNA into a variable number of fragments
which are visible in the form of strips of which the thickness and distance of
migration depends on their base pairs mass.
Demonstrate the action of restriction enzymes by analysing the
electrophorogram.
Explain the speed of migration depends on the size of fragments and point out
the strips are more heavily dyed and thicker the closer they are to the well. In
fact, it can be considered the number of fragments of each strip is the same.
Hence it is the molecular mass of these fragments which varies.
Identify the size of a restriction fragment. To this use lambda phage DNA cut
with Hind III as the size marker (reference) and suggest determining the size
of the DNA fragment cut by Eco RI.
It can be considered that under normal conditions within certain limits, the
decimal log of the size (in pb) of a fragment is inversely proportional to the
distance of migration. Hence it is sufficient using the gel (or a digital photo) to
measure the migration distance of each strip of reference DNA. Knowing the
size of the fragments (stated in the section “Description”) the log reference
curve (T) = f (d) can be drawn where T= size in pb and d = distance travelled
in mm. To determine the size of an unknown fragment, here DNA cut with Eco
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Genetics
Digested phage DNA kit
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RI, it is necessary to measure d and find T on the reference curve (linear part
of the curve).
Remark:
The curve Log (T) = f (Rf) where Rf = distance travelled by the strips / distance
travelled by the BBP can be traced, but then it is necessary to measure the
BBP migration before dyeing.
Draw the attention of students to the efficacy of the method by evaluating the
micro quantities of DNA used and revealed.
Envisage operations which complement electrophoresis when carrying out a
Southern Blot, for example, in the framework of a pre-natal diagnostic.
9 Teaching suggestions
Electrophoresis can be placed in the context of a study of restriction enzymes
which are true molecular scissors, to indicate their effect on DNA. It can be
combined with computer processing of the data using spreadsheets and DNA
sequence processing software. (Marking of restriction sites, construction of a
restriction map, etc...).
The comparison of the two migrations allows envisaging the specific nature of
an enzyme vis-à-vis a restriction site. For information the restriction site
(sequence of the bases specific to the DNA) recognised by Eco RI is GAATTC
and is cut between G and A forming “sticky ends”. That for Hind III is AAGCTT
and is cut between A and A.
Obtaining “sticky ends” allows an initial discussion of resultant applications:
recombinant DNA.
Electrophoresis can also be a method for discussing the uses the technique
(digestion of DNA and separation of fragments) has made possible: study of
genes and their polymorphism, genetic imprints, paternity tests and associated
with Southern Blot, genetic diagnosis.
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JEULIN - TECHNICAL SUPPORT
Rue Jacques Monod
BP 1900
27 019 EVREUX CEDEX FRANCE
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