Projet PICS

PICS France Brésil
Projet de recherche conjoint entre le CNRS et l’Université Fédérale de Paraiba
Titre du projet:
Impact des stress biotiques (pathogènes, algues toxiques) sur la physiologie de deux espèces
d'huîtres du genre Crassostrea (mollusques, bivalves), C. gigas (zone tempérée) et
C.gasar/rhizophorae (zone tropicale) dans un contexte de changement global
Titre du projet (anglais):
Impact of biotic stressors (pathogens, harmful algal blooms) on physiology of two Crassostrea
oyster species (bivalve molluscs): C. gigas (temperate zone) and C. gasar (tropical zone) in the
context of global change
Résumé du projet de collaboration internationale:
Le changement climatique global prédit s’accompagnerait dans les années à venir de variations
thermiques des eaux de surface océaniques suffisantes, en vitesse et en intensité, pour affecter
directement l’équilibre physiologique des organismes marins. En effet, la température est l’un des
facteurs clés de la régulation des fonctions physiologiques majeures (croissance, reproduction,
réponse au stress) des organismes homéothermes sessiles tels que les huîtres. De plus, ces
changements climatiques vont également modifier l’environnement abiotique de ces organismes et
modifier indirectement leur physiologie. En particulier, l’augmentation de la prolifération de
microalgues toxiques et des pathogènes a été classée comme l'une des préoccupations croissantes
pouvant contribuer à accentuer la présence et le développement de maladies chez de nombreuses
espèces marines.
Dans ce contexte, ce projet vise à étudier, en deux zones climatiques contrastées de l’océan
Atlantique les réponses physiologiques de Crassostrea gigas (zone tempérée) et Crassostrea gasar
(zone tropicale) en réponse à des stress biotiques, tels que pathogènes ou efflorescences toxiques, en
relation avec les changements globaux prédits.
Résumé du projet de collaboration internationale (anglais):
Global climate change predicted by weather patterns would be accompanied in the coming decades
of consequential changes in ocean temperatures, which could affect the physiological balance of
many marine organisms, including oysters, for which temperature plays a key role in regulating
many physiological processes. Thus, in oysters, Crassostrea gigas (temperate zone) and C. gasar
(tropical zone), an increase in the average temperature of seawater should change the physiological
responses to different biotic stresses. Moreover, harmful algal blooms and pathogens are included in
a list of concerns about changes in marine ecosystems that are increasing the impacts of diseases
and parasites on important resource species and the food webs that support them. Our research
project is part of the problem. It aims to explore, in temperate and tropical zones, physiological
responses of oysters exposed to biotic stressors, such as pathogens and harmful algae, related to
global climate changes.
Responsable français du projet:
Hélène Hégaret, CR CNRS, UMR 6539, IUEM-UBO
Place Nicolas Copernic,
29280 Plouzané
France
Partenaires français:
Philippe Soudant (DR CNRS, UMR 6539, IUEM-UBO)
Caroline Fabioux (MCF UBO, UMR 6539, IUEM-UBO)
Arnaud Huvet (CR IFREMER, UMR 6539, IFREMER)
Responsable brésilien du projet:
Patricia Mirella da Silva, MCF, UFPB
Universidade Federal da Paraiba (UFPB)
Centro de Ciências Exatas e da Natureza,
Departamento de Biologia Molecular,
Jardim Universitário s/n
Bairro Castelo Branco
EP 58051-900 – João Pessoa, PB,
Brasil
Partenaires brésiliens
Luis Fernando Marques dos Santos (MCF, UFPB)
Rogério Tubino Vianna (MCF, UFSC)
Gleyci Moser (MCF, UERJ)
Rafael Diego da Rosa (Post-doc, USP).
Programme scientifique du projet de collaboration internationale
Le changement climatique global prédit par différents modèles météorologiques s’accompagnerait
dans les décennies à venir de variations conséquentes de la température des océans, en particulier
dans les zones littorales. Ces modifications thermiques pourraient affecter l’équilibre physiologique
de nombreux organismes marins, notamment des invertébrés sessiles tels que les huîtres, pour
lesquels la température joue un rôle primordial dans la régulation de nombreux processus
physiologiques. Ainsi, chez les huîtres, Crassostrea gigas (en zone tempérée) et Crassostrea gasar
(=brasiliana, en zone tropicale), une augmentation de la température moyenne des eaux marines
pourrait se répercuter sur des fonctions physiologiques majeures telles que la reproduction, la
croissance ou encore la réponse au stress.
Chez les mollusques bivalves, les infections dues à des parasites ou des pathogènes, ainsi que les
efflorescences de phytoplancton toxique sont, après les perturbations physico-chimiques
(température, salinité, oxygène dissous etc.), les stress impactant le plus les réponses physiologiques.
Les bactéries pathogènes et certains parasites protozoaires sont souvent cités comme des facteurs
limitant la production aquacole de bivalves (Lauckner, 1983; Lees, 2000; OIE, 2006). De même, les
microalgues nuisibles et toxiques sont de plus en plus reconnues comme étant à l’origine de
nombreuses perturbations physiologiques dans les populations de bivalves (Shumway et Cucci,
1987; Shumway, 1990 et Landsberg, 2002). En outre, une augmentation inquiétante de la fréquence
des efflorescences de microalgues toxiques et des maladies dues à des pathogènes a été enregistrée
ces dernières décennies à travers le monde (Harvell et al., 1999). Cette recrudescence de stress
biotiques contribue à perturber l’équilibre physiologique des populations de nombreuses espèces
marines et pourrait aboutir à des bouleversements de l’écosystème entier. Il apparaît donc essentiel
d’observer, d’analyser et de comprendre l’effet de ces microorganismes sur la physiologie des
organismes marins.
Les parasites et les pathogènes peuvent avoir des effets délétères voire létaux sur les bivalves. Ainsi,
les parasites protozoaires peuvent affecter les hémocytes des bivalves, comme par exemple
l'infection directe des hémocytes de l’huître plate Ostrea edulis par plusieurs cellules de Bonamia
ostreae résultant finalement en une lyse des hémocytes (da Silva et Villalba 2004, CochennecLaureau et al, 2003). De même, l’herpès virus OsHV-1 ou ses variants est (sont) fortement
impliqué(s) dans les phénomènes de surmortalité estivale observés depuis quelques années chez les
huitres C. gigas en France (Cochennec et al. 2011). De plus, des efflorescences de phytoplancton
toxique ont aussi des effets délétères sur les bivalves, provoquant des modifications
comportementales, des lésions tissulaires, des modifications des réponses immunitaires, souvent
associées à une immuno-dépression, ou encore une activation du système anti-oxydant (Hégaret et
al. 2005 a and b, 2007a, 2011, Haberkorn et al. 2010, Fabioux et al. in prep). Enfin, des études
récentes ont mis en évidence un effet combiné et synergique d’une exposition à une microalgue
toxique chez des bivalves contaminés par des pathogènes (Hégaret et al. 2007b, 2009, 2010; da
Silva et al. 2008, Lassudrie et al. in prep). Par exemple, l’intensité d’infection de palourdes R.
philippinarum par le pathogène Perkinsus olseni a diminué lors d’une exposition à des
efflorescences naturelles de dinoflagellés toxiques du genre Karenia sp. Ces dinoflagellés toxiques
avaient en effet un effet négatif direct sur le protozoaire, provoquant sa mort in vitro. De plus, les
palourdes exposées à l’algue toxique, mais fortement infectées par le Perkinsus olseni ont montrée
une stimulation des réponses immunitaires. En conséquence, les études sur les changements
physiologiques induits par les pathogènes ou/et les microalgues toxiques pourront fournir des
indices sur l'importance de ces facteurs de stress sur la biologie des populations et ainsi sur la
production d’espèces de bivalves d’importance commerciale dans un contexte de changement
global. Notre projet de recherche s’intègre dans cette problématique.
Etat de l’art
Les récentes prévisions climatiques annoncent un réchauffement moyen de la température de
surface du globe entre 1.1 et 6.4°C d'ici à la fin du siècle (IPCC 2007). Une étude hydrologique
dans le bassin de Marennes-Oléron a déjà mis en évidence une augmentation proche de 2°C de l'eau
de mer sur 18 ans (Soletchnik et al., 1999). Néanmoins, Il y a encore peu d'information sur la façon
dont les organismes marins répondent à ces changements drastiques de leur habitat. Cependant, de
nombreuses études ont démontré que la température est l’un des principaux facteurs de régulation
des processus physiologiques pour les espèces marines ectothermes, notamment la reproduction
(Lubet, 1981; Jalabert, 2005). Ainsi, il a été clairement établi chez l'huître creuse Crassostrea gigas
que sa cinétique de maturation gonadique était étroitement dépendante de la température de son
milieu. En effet, son cycle reproductif complet a pu être réduit à 6 mois au lieu de 12, en imposant
un cycle artificiel de température deux fois plus rapide que le cycle naturel (Fabioux et al. 2005). Ce
résultat s'explique notamment par le fait que les invertébrés, dont les bivalves, nécessitent un certain
nombre de degré-jour (chaleur accumulée) pour réaliser leur gamétogenèse (Mann, 1979). Ainsi,
toute modification même faible de la température ambiante de leur milieu pourra avoir des
conséquences sur la quantité totale de chaleur accumulée par ces animaux et ainsi affecter leur
cinétique de reproduction. L'investissement reproducteur (nombre de gamètes produits) est lui
contrôlé par la disponibilité trophique (Pouvreau et al., 2006). Lorsque l'apport de nourriture est
important, la gonade d'une huître peut représenter jusqu'à 70% du poids total de chair de l'animal
(Enríquez-Díaz, et al., 2009). Ainsi, une augmentation des efflorescences phytoplanctoniques en
lien avec les modifications des régimes thermiques s’accompagnerait d’un investissement
reproducteur accru pour Crassostrea. Cet investissement dans la reproduction a un coût qui peut se
répercuter sur d’autres fonctions physiologiques de l’organisme, comme la croissance voir la survie
(Ernande, et al., 2004). Le coût de la reproduction peut également se traduire par une résistance
moindre au stress ou une immunité moins performante (Harshman and Zera, 2007). Ainsi, il a par
exemple été démontré que la reproduction jouait un rôle majeur dans le déterminisme des mortalités
estivales de l’huître creuse C. gigas en France (Samain et McCombie, 2007).
Depuis quelques années le déclenchement de ces évènements de mortalités massives est également
expliqué par la présence d’un agent pathogène, l’herpès virus OsHV-1, en association avec d’autres
facteurs de stress (Cochennec et al. 2011). Ce virus est en particulier très présent en Rade de Brest,
où sa prévalence et sa densité chez les huitres C. gigas peuvent atteindre des niveaux assez élevés
dans les tissues.
Au Brésil, la présence d’un protozoaire du genre Perkinsus (P. beihaiensis-like), a été récemment
observée au Nord Est pour la première fois chez les huîtres de mangrove C. rhizophorae (Sabry et
al. 2009) et encore plus récemment Perkinsus sp. a été détecté infectant une autre espèce d’huître de
mangrove C. gasar (da Silva et al. in prep.) alors qu’il est reconnu que la pathologie provoquée par
Perkinsus spp., la perkinsose, peut en effet lourdement impacter la production aquacole de bivalves
dans différents continents (Choi & Park 2010 ; Villalba et al. 2004, Villalba et al. 2011). En
revanche, la répartition géographique de Perkinsus sp. est pour l’instant limitée à la côte Nord Est
du Brésil, où les huîtres de mangrove sont beaucoup pêchées. Il apparait pour l’instant absent dans
le sud du Brésil, où s’effectue la grande majorité de la production aquacole d’huîtres creuses C.
gigas au Brésil. De plus, la détermination de l’espèce de Perkinsus responsable de cette infection
reste pour l’instant inconnue.
La perkinsose peut ainsi provoquer la mort de certaines espèces de bivalves, comme les
huîtres C. virginica infectées par P. marinus. A l’inverse, les palourdes japonaises R. philippinarum
parasitées par P. olseni ne sont pas victimes de fortes mortalités, mais leur infection s’accompagne
d’un affaiblissement physiologique (Dang et al., 2010). Chez la palourde japonaise, une forte
intensité d’infection par P. olseni peut perturber la maturation de la gonade (Uddin et al. 2010). De
plus, les palourdes infectées par P. olseni semblent être aussi plus sensibles à une exposition à une
efflorescence de phytoplancton toxique (Hégaret et al. 2007), ce qui laisse une fois encore supposer
un affaiblissement physiologique. Des huitres C. gigas, exposées à une microalgue toxique du genre
Alexandrium, producteur de PSP montre une production d’espèces réactives de l’oxygène accrue
(Haberkorn et al. 2010). Les mêmes auteurs ont aussi montré que plus l’accumulation de toxines est
forte chez les huîtres C. gigas et plus l’activité métabolique, représentée par l’activité valvaire est
élevée (Haberkorn et al. 2011). La mesure de certains indicateurs de l’activité métabolique peut
donc permettre d’évaluer l’impact d’efflorescences de phytoplancton toxique et/ou de pathogènes,
combinés ou non, sur la physiologie de ces deux espèces huîtres.
Les efflorescences de phytoplancton toxique sont de plus en plus fréquentes en intensité et
leur répartition géographique ne cesse d’augmenter (Hallegraeff, 2003). Récemment, une
efflorescence d’Alexandrium tamiya- vanichii a été observée (isolée et actuellement disponible en
culture) dans la Baie de Bahia, au Nord Est, alors qu’une infection par Perkinsus a déjà été observée
chez les huîtres C. gasar de cette baie. De plus, des efflorescences toxiques d’Alexandrium spp.,
producteurs de toxines paralysantes ont été observées à différentes latitudes de la côte brésilienne.
Des efflorescences d’A. minutum et d’A. catenella, tous deux producteurs de toxines paralysantes
sont aussi observées de façon récurrente sur les côtes bretonnes et méditerranéennes respectivement,
où sont cultivées les huîtres C. gigas, et où ont pu être observées des mortalités estivales. Plusieurs
souches d’A. minutum et d’A. catenella dont certaines isolées en France ainsi qu’A. tamiya- vanichii,
A. minutum ou encore A. fraterculus, isolées d’efflorescences au Brésil, respectivement à Bahia, Rio
et Santa Catarina sont donc actuellement disponible en culture.
Lorsque les bivalves sont face à des agents toxiques, nocifs ou des pathogènes, leur premier
mécanisme de défense réside en leur système immunitaire, (Cheng, 1996). Les mollusques bivalves
possèdent un système immunitaire exclusivement de type inné, à médiation cellulaire et humorale
(Vargas-Albores et Barracco, 2001; Barracco and da Silva, 2008; Song et al., 2010). Le système à
médiation cellulaire est porté par les hémocytes. Les réponses cellulaires les plus importantes sont
la phagocytose et l’encapsulation de corps étrangers, mais les hémocytes jouent aussi un rôle
essentiel dans l’inflammation, la réparation des tissus endommagés, et également dans la nutrition,
la formation et la réparation de la coquille (Cheng 1981). Les hémocytes sont aussi impliqués dans
la production de nombreuses molécules comme les microbicides, enzymes hydrolytiques, les
espèces réactives de l'oxygène et de l'azote, agglutinines/lectines et des peptides antimicrobiens
(Vargas-Albores et Barracco, 2001; Barracco and da Silva, 2008; Song et al., 2010). Chez l'huître C.
gigas, pour laquelle les bases de données génomiques sont maintenant bien renseignées, plusieurs
protéines liées aux mécanismes de défense ont été caractérisées par approche moléculaire parmi
lesquelles les défensines, qui sont des peptides antimicrobiens avec une puissante activité anti
bactérienne et antifongique, la BPI, une protéine bactéricide augmentant la perméabilité de la
membrane bactérienne, la CgIL17, une protéine semblable à l'interleukine-17 des vertébrés, le Tolllike recepteur, les lectines et galectines qui ont une activité similaire à celle des opsonines toutes les
deux induites chez les hémocytes par les bactéries et les Hsp70, famille de protéines de choc
thermique, dont l’expression est aussi associée à différents facteurs de stress, telles certaines
infections (Tirard et al. 1995, Gueguen et al 2006, Gonzalez et al 2007, Roberts et al. 2008, Zhang
et Zhang 2011, Schmitt et al. 2012, Yamaura et al. 2008). En revanche, aucune de ces protéines de
l'immunité et du stress n’ont été décrites chez les huîtres indigènes du Brésil pour lesquelles peu de
données génomiques sont disponibles à l’heure actuelle.
Objectif
Le but de ce projet PICS sera donc de développer et mettre en commun des connaissances et
outils permettant d’étudier et comparer en zones tempérée (C. gigas) et tropicale (C. gasar),
les réponses physiologiques à différents niveaux d’intégration (comportemental, tissulaire,
cellulaire et moléculaire), suite à des stress biotiques (pathogènes et microalgues toxiques),
seuls ou combinés, en relation avec les changements de température des eaux côtières prédits
pour les années à venir.
Objectifs spécifiques
1. Evaluer l’impact de la présence d’un pathogène sur la réponse physiologique de
deux espèces d’huîtres en zones tempérée et tropicale
2. Evaluer l’impact de la présence d’une efflorescence toxique sur la réponse
physiologique de deux espèces d’huîtres en zones tempérée et tropicale
3. Evaluer l’impact combiné de la présence d’une efflorescence toxique et de
pathogène sur la réponse physiologique de deux espèces d’huîtres en zones
tempérée et tropicale
4. Evaluer l’impact de la reproduction sur les différentes questions précédentes
Pour répondre à ces différents objectifs spécifiques, nous nous appuierons sur une démarche
scientifique intégrative qui étudiera les grandes fonctions physiologiques au niveau de l’individu,
des tissus, de la cellule et de la molécule.
Matériel et méthodes
1. Matériel biologique
Les huitres Crassostrea gigas, seront collectées en France en Rade de Brest, où la présence
d’herpes virus OsHV-1 a été détectée. Des huitres naïves seront aussi obtenues à l’écloserie
d’IFREMER à Argenton. Ces expériences et collectes seront associées à des expériences effectuées
en collaboration avec IFREMER dans le cadre de la thèse de Malwenn Lassudrie, co-encadrée par
Philippe Soudant, Caroline Fabioux et Hélène Hégaret, tous trois impliqués dans cet échange.
Les huîtres Crassostrea gasar seront collectées sur un gisement naturel, situé dans l'estuaire de
Mamanguape, dans l’état de Paraíba, Nord Est du Brésil, où une prévalence non négligeable de
Perkinsus sp. a été détectée.
Pour tester l’impact d’efflorescences de microalgues toxiques productrices de PSTs, l’espèce
Alexandrium minutum Halim (1960), souche AM89BM, isolée en Baie de Morlaix, ainsi que
l’espèce Alexandrium tamiya- vanichii Balech, isolée en Baie de Bahia seront utilisées. Ces espèces
efflorent respectivement sur les côtes bretonnes de façon régulière et dans le Nord Est du Brésil.
Les cultures d’algues toxiques seront effectuées en flasques de culture, puis ballons de culture pour
les plus gros volumes. Les cultures seront maintenues, à une température de 16°C, une photopériode
12:12 et une intensité lumineuse est comprise entre 100 et 120 µmol m-2 s-1. Les microalgues seront
cultivées en milieu de culture f/2 (Guillard, 1975).
2. Mise en place des expérimentations
Des huîtres naturellement infectées seront collectées à différentes périodes de l’année pour
évaluer l’impact de la reproduction sur les réponses physiologiques des huîtres à différents stress
biotiques.
L’effet du protozoaire Perkinsus sp. et de l’herpes virus OsHV-1 sur les huîtres C. gasar et C.
gigas respectivement, pourra ainsi être évalué tout au long de l’année.
L’effet des efflorescences de phytoplancton toxique sera d’abord évalué in vitro directement
sur les hémocytes d’huîtres. Les analyses in vitro apparaissent comme un bon proxy des expositions
in vivo (Hégaret et al. 2011). Les huîtres non contaminées par les pathogènes (détection a
posteriori) seront sélectionnées pour évaluer l’impact des efflorescences de phytoplancton toxique
seules. L’hémolymphe des huîtres sera prélevée et incubée avec les cultures d’algues toxiques à des
concentrations observées en milieu naturel. Après 4 heures d’incubation (Hégaret et al 2011), les
hémocytes seront analysés selon les méthodes décrites dans le paragraphe 4.
L’effet combiné des deux stress biotiques, algues toxiques et pathogènes, pourra être évalué tout
d’abord in vitro, en comparant, les réponses hémocytaires suite à des expositions in vitro avec des
algues toxiques, des huîtres contaminées ou non par les pathogènes. Des expositions in vitro
combinant exposition à des algues toxiques et du Perkinsus en culture pourront aussi être
envisagées sur les huîtres C. gasar, des cultures de Perkinsus étant en effet disponibles.
Dans un deuxième temps, des expériences in vivo seront mises en place, lorsque les algues
toxiques auront un effet sur la réponse hémocytaire in vitro, seules ou en combinaison avec le
pathogène.
Les huîtres naturellement infectées par leur pathogène seront ainsi exposées pendant plusieurs
jours à des microalgues toxiques, à des concentrations rencontrées dans le milieu naturel, dans le
but de miner l’efflorescence naturelle de phytoplancton toxique.
Pour tester l’impact sur la reproduction, des analyses seront aussi effectuées sur les gamètes des
individus adultes exposés in vivo à des Alexandrium sp. (contenu en ATP, activité métabolique) La
comparaison entre les deux espèces pourra ainsi mettre en évidence des différences entre des huîtres
de zone tempérée et de zone tropicale et ainsi permettre de mieux comprendre les potentiels impacts
des changements globaux à long terme.
3. Détection des pathogènes et mesure de l’accumulation toxinique
La détection de Perkinsus sp. chez les huitres C. gasar sera effectuée par la méthode
sensible d'incubation de branchies de chaque bivalve dans du thioglycolate de Ray selon la méthode
de Ray (1966), dans le but de déterminer la prévalence et l’intensité d’infection.
Un travail d’identification de l’espèce de Perkinsus infectant les huitres C. gasar en milieu
tropical sera aussi mis en place dans le but d’évaluer les espèces de Perkinsus présentes dans les
huîtres de mangrove C. gasar du Nord Est du Brésil, en particulier en vue de déterminer l’effet in
vitro des différentes espèces sur les hémocytes, cellules immunitaires de bivalves. Pour déterminer
l’espèce ou les espèces de Perkinsus présentes, des procédures d’isolement de Perkinsus sp. à partir
des tissus des huîtres seront mises en place, pour favoriser une prolifération in vitro, ce qui
permettra d’obtenir suffisamment de matériel génétique (i.e. ADN) du parasite. Les procédures de
l'isolement de Perkinsus sp. seront adaptées d’après Dungan et al. (2007) et Casas et al. (2002a).
Afin de déterminer l’espèce de Perkinsus, les isolats de Perkinsus sp. seront utilisés pour
effectuer un séquençage de l’ARN ribosomal sur les régions ITS (Casas et al. 2002b), LSU et les
gènes d'actine (Moss et al. 2008).
Chez C. gigas, la détection et la quantification de l’herpes virus OsHV-1 sera effectuée
individuellement par la technique de PCR quantitative en temps réel ciblant la région C de l’ADN
viral suivant la technique décrite dans Pépin et al. (2008). L’ADN total sera extrait à partir d’un
morceau de manteau de chaque huître, préalablement conservé dans l’azote liquide. Cette
quantification permettra de déterminer la prévalence et l’intensité d’infection.
L’accumulation de toxines paralysantes sera évaluée à l’aide kits ELISA.
4. Mesures physiologiques
a. Histologie et reproduction
Une coupe transversale de la masse viscérale des huîtres, contenant tous les organes de chaque
bivalve sera effectuée et préparée pour une analyse histologique classique afin de réaliser une
analyse histo-pathologique des symptômes provoqués par les pathogènes et/ou les microalgues
toxiques. La détermination des stades de gamétogenèse sera également effectuée à partir de ces
coupes histologiques selon Fabioux et al. (2005) pour C. gigas et par analogie chez l’huitre C. gasar.
Cette approche permettra ainsi de comparer des bivalves à différents stades de reproduction, non
infectés et infectés à différentes intensités par les pathogènes, soumis à des efflorescences de
phytoplancton toxiques.
b. Mesure de la réponse immunitaire
Les mécanismes de défense cellulaires des bivalves, essentiels dans la réponse aux parasites et aux
pathogènes opportunistes, seront évalués par cytométrie en flux; le nombre et les types
hémocytaires selon Soudant et al (2004), les capacités de phagocytose et d’adhésion selon Hégaret
et al (2007). Les mécanismes de défense humoraux (titres d’agglutination et d’hémolyse) seront
mesurés selon Barracco et al. (1999) et Haberkorn et al. (2010).
Un premier projet de collaboration bilatérale CNRS-CNPq est déjà en cours (2010-2012) qui vise à
évaluer les dommages histopathologiques dus à la présence et l'intensité de l'infection à Perkinsus
sp. et les réponses hémocytaires des huîtres infectées par Perkinsus sp. Ce projet nous a déjà permis
de mettre au point sur C. gasar des méthodes d’analyses des réponses cellulaires déjà existantes sur
C. gigas. Ces mesures physiologiques seront donc utilisées lors de ce projet de coopération.
Une approche moléculaire ciblant certaines protéines immunitaires sera aussi développée pour
détecter et analyser les réponses hémocytaires mises en jeu lors de l’infection par un pathogène
et/ou une exposition à une algue toxique. L'expression des gènes codant pour des protéines liées au
système immunitaire sera mesurée par PCR relative en temps réel, à partir de l’ARNm extrait à
partir de l'hémolymphe prélevée sur chaque individu. Dans un premier temps, l’analyse sera
développée chez C. gigas pour des gènes immunitaires disponibles dans les banques de données
génomiques puis en hétérologue chez C. gasar. Des couples d’amorces développés chez C. gigas
seront testés chez C. gasar. Des gènes candidats seront par exemple ceux codant des protéines de
reconnaissance des peptidoglicanes (PGRP), des lectines de type C, des galectines, des Toll-like
recepteurs, ou encore des interleukine-17 (revue de Sont et al. 2010; Zhang et Zhang, 2011).
c. Mesure des activités métaboliques
L’évolution à cout terme de plusieurs indicateurs du métabolisme énergétique sera mesurée par
cytométrie en flux dans les hémocytes circulants. Ces indicateurs, seront notamment le potentiel
membranaire mitochondrial et le contenu en ATP, actuellement utilisés chez les huîtres C. gigas
seront adaptés à l’huître C. gasar
Plusieurs enzymes digestives (amylase, cellulase, laminarinase, proteases) seront évaluées par
spectrophotométrie. La mesure de l’amylase sera réalisée selon Haberkorn et al (2010). Les autres
activités enzymatiques digestives seront adaptées des méthodes décrites par Albentosa et Moyano
(2008) avant leurs applications aux expérimentations.
d. Equilibre redox
Une mesure de la balance redox sera effectuée en mesurant d’une part la production d’espèces
réactives de l’oxygène au niveau cellulaire dans les hémocytes circulants selon Lambert et al (2003)
et d’autre part l’expression des gènes codant pour les principales enzymes antioxydantes par PCR
en temps réel et l’activité de ces enzymes par spectrométrie. Une analyse de la peroxydation
lipidique, dommages causés aux lipides membranaires lors d’un stress oxydant, sera analysée par
spectrométrie par la mesure des MDA.
5. Mesure de l’activité métabolique et du contenu en ATP des gamètes
Des mesures de la quantité d’ATP et de l’activité métabolique des spermatozoïdes seront effectuées,
suite au stripping d’huîtres males en période de maturité sexuelle (Haberkorn et al., 2010b). Le
potentiel membranaire mitochondrial et la production d'espèce réactive de l'oxygène seront mesurés
en utilisant respectivement les sondes fluorescentes JC-1 et DCFH-DA couplées à une analyse par
cytométrie en flux selon Le Goïc et al. (en préparation).
Valeur ajoutée de la coopération et interdisciplinarité
La première valeur ajoutée de cette coopération est d’abord scientifique. En effet, c’est une
opportunité unique de pouvoir étudier et comparer deux espèces de Crassostrea (huîtres)
biologiquement proches mais d'affinités climatiques différentes (tempérée pour C. gigas ; tropicale
pour C. gasar).
Pour les deux espèces, le fonctionnement biologique commence à être bien maîtrisé d’un point de
vue zootechnique chez les deux partenaires. Cela facilitera la mise en place des expérimentations
proposées dans des conditions biologiquement pertinentes.
L’autre valeur ajoutée évidente de cette coopération est l’interdisciplinarité effective qu’elle va
générer en exploitant les compétences scientifiques et les capacités techniques des équipes associées.
En effet, l'équipe française se compose de spécialistes de la reproduction des bivalves et du stress
oxydant (C. Fabioux, UMR6539), de la biochimie des bivalves (P. Soudant, UMR6539) de la
biologie cellulaire des bivalves (H. Hégaret, UMR6539), de génétique et biologie moléculaire
appliquées à la physiologie (A. Huvet, Ifremer). L'équipe brésilienne, quant à elle, se compose de
spécialistes de pathologie et immunologie des bivalves (P.M. da Silva, UFPB, Joao Pessoa), de
spécialiste en biologie cellulaire, et du rôle biologique de le superfamille de protéines du complexe
ABC (L.F. Marques, UFPB, Joao Pessoa), un spécialiste en taxonomie et phylogénie moléculaire
des parasites aquatiques (R.T. Vianna, UFSC, Curitibanos), un spécialiste en biochimie et biologie
moléculaire, sur les techniques de transcriptomique dans l'expression des gènes des invertébrés à
grande échelle (R. Rosa, USP, Sao Paulo), ainsi qu’une spécialiste en isolement, culture et
physiologie du phytoplancton (G. Moser, UERJ, Rio).
D’un point de vu conceptuel et méthodologique, cette approche s’appuie sur une démarche
résolument interdisciplinaire alliant des spécialistes en pathologie, en biochimie, en biologie
cellulaire, phylogénie moléculaire et biologie moléculaire et en physiologie. La pluridisciplinarité
de ce groupe franco-brésilien de recherche permettra de développer un programme structuré afin de
pouvoir appréhender, dans le contexte d’un futur réchauffement climatique, les challenges
physiologiques et métaboliques auxquels seront confrontés les huîtres et sans doute d’autres
organismes marins. Ce projet devrait également permettre d’explorer de nouvelles relations
physiologiques, biochimiques et moléculaires suite à des infections seules ou combinées par des
pathogènes ou des efflorescences de phytoplancton toxique chez ces animaux.
Ce projet va aussi permettre de développer des collaborations entre des établissements brésiliens et
notre laboratoire CNRS de Brest (LEMAR, IUEM) ce qui parait à l’heure actuelle être une forte
priorité de la France. En effet, ce projet a été mis en place suite de la visite de la délégation
brestoise à Rio de Janeiro visant à développer des collaborations durables entre les universités de
Rio et du Brésil avec l’université de Brest, le LEMAR et ainsi le CNRS. La mise en place de projets
de doctorats sandwich, mais aussi de «chercheurs visiteurs » que propose actuellement le
programme de financement brésilien « Science sans frontières » sont bien évidemment envisagés en
parallèle de ce PICS, qui nous aidera à mettre en place ces projets et répondre à ces appels d’offre,
qui permettront de consolider encore une fois ces collaborations naissantes.
Formation par la recherche
Des étudiants en thèse et en master dans les deux pays partenaires seront associés à ce projet et
bénéficieront des échanges scientifiques et méthodologiques qui prendront place au cours de cette
coopération. Dans la mesure du possible, des échanges d’étudiants seront envisagés afin de
compléter leur formation technique notamment.
En effet, des bourses de doctorats sandwich (programme de financement brésilien « Science sans
frontières » et CNPq) seront envisagées en parallèle de ce PICS.
Autres sources de financement
En parallèle de ce PICS, nous envisageons de postuler à des bourses de doctorats sandwich, mais
aussi de «chercheurs visiteurs » que propose actuellement le programme de financement brésilien
« Science sans frontières » sont bien évidemment envisagés en parallèle de ce PICS, qui nous aidera
à mettre en place ces projets et répondre à ces appel d’offre, qui permettront de consolider encore
une fois ces collaborations naissantes.
De plus ce projet PICS s’appuiera aussi sur des projets déjà existants actuellement en cours en
France et au Brésil, ainsi que sur le travail de thèse d’étudiants en doctorat (M. Lassudrie en France,
par exemple), et sur la participation, grâce à des bourses « Science sans frontières », de doctorants
français actuellement en cours de formation, à des expériences communes.
Références
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Observatorio Español de Acuicultura, Madrid., pp. 181-242.
CV du coordinateur francais
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•
Hélène HEGARET, 32 ans
Chargé de recherche CNRS depuis 2009
UMR CNRS-UBO-IRD-Ifremer 6539, IUEM, Plouzané
THEMES DE RECHERCHE DÉVELOPPÉS
Culture et physiologie du phytoplancton
Impact du phytoplancton toxique sur la physiologie des bivalves
Ecologie, physiologie, immunité, et écotoxicologie des bivalves
FORMATION INITIALE
2007 : Doctorat en cotutelle, en Halieutique de l’Ecole Nationale Supérieure Agronomique de Rennes,
France et Ph.D. en Océanographie de l’Université du Connecticut, USA.
2007 : « Master of Sciences » en Océanographie de l’Université du Connecticut, Département de
Sciences de la Mer, USA.
2003 : Diplôme d’agronomie approfondie (DAA) d’agronomie, de l’Ecole Nationale Supérieure
Agronomique de Rennes, spécialisation Halieutique.
RESPONSABILITE & VALORISATION
Responsabilité d’un programme de recherche de la Région Bretagne SAD – « PSEUDOPE » Interactions
de Pseudo-nitzschia spp. avec les procaryotes et eucaryotes unicellulaires sympatriques (2010-2011,
32k€)
Responsabilité d’un programme d’échange CNRS-CNPq, France-Brésil (2011-2012) sur la perkinsiose
chez les bivalves.
Prix et distinctions scientifiques: “Team Member of the Year Award” NOAA, USA, 2007; Carriker
Student Research Grant, NSA 2007 and 2005, “Grants-in-Aid of Research”, Sigma Xi, 2006, Castagna
Research Grant”, NSA, 2006, Lerner Grey, USA 2005; International Pectinid Workshop Poster and
presentation awards, Canada 2007 and Australia 2005; World Aquaculture Society poster award, USA
2007; National Shellfisheries Association presentation and poster awards, USA 2006, 2005 and 2003
23 publications, 1 soumise, 3 en prep (rang A), 1 chapitre de livre, participations orales (35) & posters
(17) à des colloques.
5 PUBLICATIONS LES PLUS SIGNIFICATIVES
1. Hégaret, H., da Silva P. M., Wikfors, G.H., Haberkorn, H., Shumway, S. E., Soudant, P., (2011). In vitro
interactions between several species of harmful algae and haemocytes of bivalve molluscs. Cell Biology
and Toxicology 27 (4) 249-266
2. Hégaret H, Smolowitz RM, Sunila I, Shumway SE, Alix JH, Dixon MS, Wikfors GH. (2010). Combined
effects of a parasite, QPX, and the harmful-alga, Prorocentrum minimum on northern quahogs,
Mercenaria mercenaria. Mar. Environ. Res. 69:337-344.
3. Hégaret, H., da Silva P. M., Sunila, I., Shumway, S. E., Dixon, M.S., Alix, J.H., Wikfors, G.H. and
Soudant, P., (2009). Perkinsosis in the Manila clam Ruditapes philippinarum affects responses to the
harmful-alga, Prorocentrum minimum. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 371:112120.
4. Hégaret, H., da Silva P. M., Wikfors, G.H., Lambert, C., De Bettignies, T., Shumway, S. E., Soudant, P.
(2007). Hemocyte responses of Manila clams, Ruditapes philippinarum, with varying parasite, Perkinsus
olseni, severity to toxic-algal exposures. Aquatic toxicology, 84, 269-279.
5. Hégaret, H., Wikfors, G.H., Soudant, P., Lambert, C., Shumway, S. E., Bérard, J.B., Lassus, P. (2007).
Toxic dinoflagellates (Alexandrium fundyense and A. catenella) have minimal apparent effect on oyster
hemocytes. Marine Biology, 152(2), 441-447.
CV du coordinateur brésilien
CURRICULUM VITAE
1. Professional data/activity
Full name
e-mail
[email protected]
Patricia Mirella da Silva Scardua
Institution
Present position
Universidade Federal da Paraíba
Research scientist
Department
Centro de Ciências Exatas e da Natureza, Departamento de Biologia Molecular
Office address
P.O. box
Cidade Universitária – Campus I
City
State/Province
Country
Zip code
João Pessoa
Paraíba
Brazil
58059-900
Phone number
Extension
Fax number
(+55) 83 32167643
(+55) 83 32167787
7643
2. Academic background
Degree
PhD
Field of knowledge
Marine Biology and Aquaculture
Institution
University of Santiago de Compostela
Degree
Master
Field of knowledge
Aquaculture
Institution
National University of Santa Catarina
Field of knowledge
Biology
Institution
National University of Santa Catarina
Degree
Biology
Start / End date
2001/2005
city
Country
Santiago de Compostela, Spain
Galicia
Start / End date
1997/1999
city
Country
Florianópolis, SC
Brazil
Start / End date
1990/1995
city
Country
Florianópolis, SC
Brazil
3. Research interests
Field of Study
Bivalve immunology
Bivalve-parasite interactions
Bivalve physiology
4. Current position
Research
Development
and Professor and Research scientist
5. Work experience
5.1. Institution
Position
National University of Professor
and
Sergipe
Research Scientist
National University of Postdoc
Santa Catarina
National University of Postdoc
Santa Catarina
LEMAR
Postdoc
Activities
Bivalve pathology, immunology
and aquaculture.Cell Biology
Diagnostic
techniques
for
protozoan parasites of bivalves
Local
Aracajú, Sergipe,
Brazil
Florianópolis,
Santa
Catarina,
Brazil
Bivalve Immunology
Florianópolis,
Santa
Catarina,
Brazil
Bivalve – Perkinsus – harmful Brest, France
algal interactions
6. Scientific, technological and artistic production
number
Start - End date
04/2009 – 09/2010
10/2008 – 03/2009
10/2007 – 09/2008
09/2005 – 08/2006
number
1. scientific articles in national scientific 0
journals
5. papers presented in congresses
55
2. scientific articles in international scientific 20
journals
1
3. articles for scientific divulgement
6. gene sequences published
4
7. books (Chapter)
1
4. advised theses
1
7. Main publications :
20- DA SILVA PM, MAGALHÃES ARM, BARRACCO MA 2012 Pathologies in commercial bivalve species from Santa
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18- HURTADO MA, DA SILVA PM, LE GOIC N, PALACIOS E, SOUDANT P 2011 Effect of acclimatization on hemocyte
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17- HÉGARET H, DA SILVA PM, WIKFORS GH, HABERKORN H, SHUMWAY SE, SOUDANT P 2011 In vitro
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15- SUÁREZ-MORALES E, SCARDUA MP, DA SILVA PM 2010 Occurrence and histopathological effects of Monstrilla sp.
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14- SABRY RC, ROSA RD, MAGALHÃES ARM, BARRACCO MA, GESTEIRA TCV, DA SILVA PM 2009 First report of
a Perkinsus sp. infecting Mangrove oysters Crassostrea rhizophorae of the Brazilian coast. Diseases of Aquatic Organisms
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13- DA SILVA PM, CREMONTE F, SABRY RC, ROSA RD, CANTELLI L, BARRACCO MA 2009 Presence and
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10- DA SILVA PM, COMESANA P, FUENTES J, VILLALBA A, 2008 Variability of immune parameters in European flat
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9- DA SILVA PM, HÉGARET H, LAMBERT C, WIKFORS GH, LE GOÏC N, SHUMWAY SE, SOUDANT P 2008
Immunological responses of the Manila clam (Ruditapes philippinarum) with varying parasite (Perkinsus olseni) burden,
during a long term exposure to the harmful alga, Karenia selliformis and possible interations. Toxicon 51:563-573 DOI:
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8-TRAVERS M-A, DA SILVA PM, LE GOÏC N, MARIE D, DONVAL A, HUCHETTE S, KOKEN M, PAILLARD C 2008
Morphologic, cytometric and functional characterization of abalone (Haliotis tuberculata) haemocytes. Fish and Shellfish
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7- DA SILVA PM, RENAULT T, FUENTES J, VILLALBA A 2008 Herpesvirus infection in families of European flat oysters
Ostrea edulis derived from different populations and cultivated in the Ría de Arousa (Galicia NW Spain). Diseases of
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6- HÉGARET H, DA SILVA PM, WIKFORS GH, LAMBERT C, DE BETTIGNIES T, SHUMWAY SE, SOUDANT P 2007
Hemocyte responses of Manila clams, Ruditapes philippinarum, with varying parasite, Perkinsus olseni severity to toxic
algal exposures. Aquatic Toxicology 87:469-479. DOI: 10.1016/j.aquatox.2007.07.007
5- DA SILVA PM, VILLALBA A, SUNILA I 2006 Branchial lesions associated with abundant apoptotic cells in oysters
Ostrea edulis of Galicia (NW Spain). Diseases of Aquatic Organisms 70:129-137. DOI: 10.3354/dao070129
4- DA SILVA PM, SOUDANT P, CARBALLAL MJ, LAMBERT C, VILLALBA A 2005 Flow cytometric DNA content
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Perna perna mussels from a culture station in Ratones Grande island, Brazil. Journal of Invertebrate Pathology 79:154-156.
DOI: 10.1016/S0022-2011(02)00026-5
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