VaccZyme™ Human Anti-Haemophilus influenzae type b Enzyme

Transcription

CONTENTS
Page No.
1
Intended Use
2
Background
3
Principle of the Assay
4
Precautions
5
Sample Collection and Storage
6
Materials
7
Assay Method
8
Results and Quality Control
VaccZyme™
Human Anti-Haemophilus influenzae type b
Enzyme Immunoassay Kit
For in-vitro diagnostic use
Product code: MK016
Product manufactured by:
The Binding Site Group Ltd, PO Box 11712, Birmingham, B14 4ZB, U.K.
Telephone: +44 (0)121 436 1000
Fax: +44 (0)121 430 7061
e-mail: [email protected]
VaccZyme™ is a trademark of The Binding Site Group Ltd.
FDA (USA) Information
Analyte Name
Anti-Haemophilus type b
Complexity Cat.
High
1
INTENDED USE
9
Protective Levels
This assay is designed for the in-vitro measurement of specific IgG antibodies against
Haemophilus influenzae type b (Hib) capsular polysaccharide, present in human
serum.
10
Performance Characteristics
Sufficient materials are supplied to allow a maximum of 41 samples to be tested in
duplicate, with a calibration curve and two controls.
11
References
2
BACKGROUND
Hib is an encapsulated Gram negative bacterium which can cause a range of
conditions including; meningitis, septicaemia, cellulitis, epiglottitis, pneumonia and
septic arthritis1. Hib infections are common in children under five years of age where
it is the major cause of bacterial meningitis1-3.
Serum anti-HIB antibodies protect against the organism in–vivo, and protective
levels have been established for unvaccinated and vaccinated individuals by radio
antigen binding assays (RABA)4-6. Measurement of anti-Hib antibodies by EIA have
been shown to correlate to RABA7,8, and allow selective quantitation of the IgG
isotype. This is important since protective antibodies belong to the IgG class,
although occasionally immune sera with high antibody levels by RABA have been
shown to contain predominantly IgM and IgA antibodies by ELISA9.
Patients with repeated bacterial infections should be investigated for
immunodeficiency and the inability to respond to specific polysaccharide antigens
(review10). A patient’s specific antibody response may be evaluated by the
serological determination of their IgG anti-Hib antibody levels pre- and postvaccination using this quantitative enzyme immunoassay.
3
PRINCIPLE OF THE ASSAY
Microwells are pre-coated with the Hib capsular polysaccharide antigen conjugated
to human serum albumin. The calibrators, controls and diluted patient samples are
added to the wells and antibodies recognising the Hib antigen bind during the first
incubation. After washing the wells to remove all unbound proteins, purified
peroxidase labelled rabbit anti-human IgG ( chain specific) conjugate is added. The
conjugate binds to the captured human antibody and the excess unbound conjugate
is removed by a further wash step. The bound conjugate is visualised with 3,3’,5,5’
tetramethylbenzidine (TMB) substrate which gives a blue reaction product, the
intensity of which is proportional to the concentration of antibody in the sample.
Phosphoric acid is added to each well to stop the reaction. This produces a yellow
end point colour, which is read at 450nm.
4
4.1
PRECAUTIONS
WARNING
All donors of human serum supplied in this kit have been serum tested and found
negative for hepatitis B surface antigen (HBsAg) and antibodies to human
immunodeficiency virus (HIV1 and HIV2) and hepatitis C virus. The assays used were
either approved by the FDA (USA) or cleared for in vitro diagnostic use in the EU
(Directive 98/79/EC, Annex II); however these tests cannot guarantee the absence of
infective agents. Proper handling and disposal methods should be established as for
all potentially infective material, including (but not limited to) users wearing suitable
protective equipment and clothing at all times. Only personnel fully trained in such
methods should be permitted to perform these procedures.
This product contains sodium azide and ProClin 300 and must be handled with
caution; suitable gloves and other protective clothing should be worn at all
times when handling this product. Do not ingest or allow contact with the skin
(particularly broken skin or open wounds) or mucous membranes. If contact
does occur wash with a large volume of water and seek urgent medical advice.
Explosive metal azides may be formed on prolonged contact of sodium azide
with lead and copper plumbing; on disposal of reagent, flush with a large
volume of water to prevent azide build up.
The buffers and serum supplied in this kit contain various enzyme inhibitors as listed
below. These are hazardous and should be handled with care.
INHIBITOR
Kathon
Sodium Azide
Proclin™ 300
Bromonitrodioxane
Methylisothiazone
CONCENTRATION
0.02%
0.099%
0.045%
0.002%
0.002%
Proclin™ is a trademark of Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA
Kathon is an irritant and may cause sensitisation by skin contact. The stop solution
contains 3M phosphoric acid which is an irritant. Avoid contact with skin and eyes.
Reagent spills should be cleaned up appropriately, observing local and environmental
regulations.
Insert Code E016, Version: 28th October 2010, Page 1 of 12
4.2
CAUTION
This product should only be used by appropriately trained personnel. Strict adherence
to the protocol is recommended. Any deviation may affect assay performance, and
the results obtained. Pay attention to specific ‘Notes’ and warnings throughout these
Instructions for Use.
Reagents from different batch numbers of kits are NOT interchangeable. If large
numbers of tests are performed care should be taken to ensure that all reagents are
from the SAME batch. All strips must be taken from the same foil pouch. Substitution
of any component may lead to incorrect results.
To avoid reagent contamination, only use new or clean plastic / glassware. Never
return unused reagents to the bottles.
Do not leave reagent bottles uncapped; any resulting evaporation or contamination
will lead to inconsistent results.
TMB substrate must not be exposed to light or water.
Microbially contaminated, haemolysed or lipaemic serum and specimens containing
particulate matter should not be used.
Inaccurate sample dilution cannot be checked, as kit controls are ready to use. The
use of calibrated pipettes and appropriate internal QC samples is recommended.
When using automated assay systems, sample dilutors and other automated
equipment, follow the manufacturer’s instructions carefully. Particular attention
should be given to the setup of the equipment and installation and connection to
external services. All settings for automatic washers and readers must be followed
carefully and equipment must be maintained and serviced according to the
manufacturer’s instructions.
4.3
STORAGE AND STABILITY
The kit should be stored at 2-8°C and should not be frozen. Inappropriate storage
temperatures will affect the results. Wash buffer diluted into a clean container can
be stored at 2-8°C for a maximum of 4 weeks. The expiry date of the kit is shown on
the outer label.
5
SAMPLE COLLECTION AND STORAGE
Blood samples should be collected by venepuncture allowed to clot naturally and
the serum separated. The serum may be stored at 2-8°C for up to 48 hours prior to
assay, or for prolonged storage kept undiluted at -20°C or below. Repeated thawing
and freezing should be avoided. Serum samples should not be heat-inactivated, as
this may give false positive results.
6
MATERIALS
6.1
MATERIALS SUPPLIED
6.1.1
6.1.2
6.1.3
Instruction Leaflet: Giving full assay details.
QC Certificate: Indicating the expected performance of the batch.
Haemophilus B Coated Wells: 12 break-apart 8 well strips coated with Hib
antigen. Each plate is packaged in a re-sealable foil bag containing two
desiccant pouches.
Type III Sample Diluent: 2 bottles containing 50mL of buffer for sample
dilution. Coloured yellow, ready to use.
Type III Wash Buffer: 1 bottle containing 50mL of a 20-fold concentrated
buffer for washing the wells.
Haemophilus B Calibrator: 5 bottles each containing 1.2mL of diluted
human serum, with the following concentrations of anti-HIB antibody: 9, 3,
1, 0.33, 0.11mg/L. Ready to use.
Haemophilus B High Control: 1 bottle containing 1.2mL of diluted human
serum. The expected value is given on the QC certificate. Ready to use.
Haemophilus B Low Control: 1 bottle containing 1.2mL of diluted human
serum. The expected value is given on the QC certificate. Ready to use.
Haemophilus B Conjugate: 1 bottle containing 12mL of purified peroxidase
labelled antibody to human IgG. Coloured red, ready to use.
TMB Substrate: 1 bottle containing 14mL of TMB substrate. Ready to use.
Stop Solution: 1 bottle containing 14mL of 3M phosphoric acid. Ready to
use.
6.1.4
6.1.5
6.1.6
6.1.7
6.1.8
6.1.9
6.1.10
6.1.11
6.2
ADDITIONAL MATERIALS AND EQUIPMENT - not supplied
6.2.1
Automatic microplate plate washer: This is recommended, however, plate
washing can be performed manually.
Plate reader: Capable of measuring optical densities at 450nm referenced
on air.
Distilled or deionised water: This should be of the highest quality available.
Calibrated micropipettes: for dispensing 1000, 100 & 10μL.
Multichannel pipette: Recommended for dispensing 100μL volumes of
conjugate, substrate and stop solution.
Glass/plastic tubes: For sample dilution
6.2.2
6.2.3
6.2.4
6.2.5
6.2.6
7
7.1
ASSAY METHOD
PRE-ASSAY STEPS
1. Bring the kit to room temperature
The kit is designed for room temperature operation (20-24°C).
Remove the kit from storage and stand at room temperature for approximately 60
minutes. Wells must not be removed from the foil bag until they have reached room
temperature.
Note: The kits may be maintained at room temperature for up to 1 week.
2. Kit components
Gently mix each kit component before use.
3. Wash buffer dilution
Add 50mL of the wash buffer concentrate to 950mL of distilled water (1 in 20
dilution) into a clean container and mix. Smaller volumes can be diluted as
appropriate.
Note: Diluted wash buffer can be stored at 2-8°C for up to 4 weeks, therefore only
dilute the appropriate amount. If the buffer shows any sign of microbial
contamination or turns cloudy, discard and prepare a fresh solution.
4. Sample dilution
Dilute 10μL of each sample with 1000μL of sample diluent (1:100) and mix well.
Smaller volumes can be diluted as appropriate.
Note: Diluted sample must be used within 8 hours.
5. Strip and frame handling
Place the required number of wells in the strip holder. Position from well A1, filling
columns from left to right across the plate. When handling the plate, squeeze the
long edges of the frame to prevent the wells falling out.
Note: Return unused wells to the foil bag immediately with the two desiccant
pouches and re-seal tightly to minimise exposure to moisture.
Take care not to puncture or tear the foil bag, see below.
WARNING: Exposure of wells to moisture or contamination by dust or other
particulate matter will result in antigen degradation, leading to poor assay
precision and potentially false results.
7.2
ASSAY METHOD
Maintain the same dispensing sequence throughout the assay.
1. Sample addition
Dispense 100μL of each calibrator, control and diluted (1:100) sample into the
appropriate wells of the plate provided.
Note: Samples should be added as quickly as possible to the plate to minimise
assay drift, and the timer started after the addition of the last sample.
Incubate at room temperature for 30 minutes.
2. Washing
The washing procedure is critical and requires special attention. An improperly
washed plate will give inaccurate results, with poor precision and high backgrounds.
After incubation remove the plate and wash wells 3 times with 250-350μL wash
buffer per well. Wash the plate either by using an automatic plate washer or
manually as indicated below. After the final automated wash, invert the plate and tap
the wells dry on absorbent paper.
Plates can be washed manually as follows:
a. Flick out the contents of the plate into a sink.
b. Tap the wells dry on absorbent paper.
c. Fill each well with 250-350μL of wash buffer using a multichannel pipette.
d. Gently shake the plate on a flat surface.
e. Repeat a-d twice.
f.
Repeat a. and b.
3. Conjugate addition
Dispense 100μL of conjugate into each well, blot the top of the wells with a tissue to
remove any splashes.
Note: To avoid contamination, never return excess conjugate to the reagent bottle.
Incubate at room temperature for 30 minutes.
4. Washing
Repeat step 2.
5. Substrate (TMB) addition
Dispense 100μL of TMB substrate into each well, blot the top of the wells with a
tissue to remove any splashes.
Note: To avoid contamination never return excess TMB to the reagent bottle.
Incubate at room temperature in the dark for 30 minutes.
6. Stopping
Dispense 100μL of stop solution into each well. This causes a change in colour from
blue to yellow.
7. Optical density measurement
Read the optical density (OD) of each well at 450nm on a microplate reader, within
30 minutes of stopping the reaction.
8
RESULTS AND QUALITY CONTROL
1. Quality control
In order for an assay to be valid, all the following criteria must be met:

Calibrators and controls must be included in each run.

The values obtained for the controls should be in the ranges specified on the
QC Certificate.

The curve shape should be similar to the calibration curve, shown on the QC
Certificate.
If the above criteria are not met, the assay is invalid and the test should be
repeated.
2. Calculate mean optical densities
For each calibrator, control and sample calculate the mean OD of the duplicate
readings. The percentage coefficient of variation (%CV) for each duplicate OD
should be less than 15%.
3. Plot calibration curve
The calibration curve can be plotted either automatically or manually as follows by
plotting the anti-Hib IgG antibody concentration on the log scale against the OD on
the linear scale for each calibrator:
Automatic - use appropriately validated software, and the curve fit that best fits
the data.

Manual - using log/linear graph paper, draw a smooth curve through the points
(not a straight line or point to point).
4. Treatment of anomalous points
If any one point does not lie on the curve, it can be removed. If the absence of this
point means that the curve has a shape dissimilar to that of the sample calibration
curve, or more than one point appears to be anomalous, then the assay should be
repeated.
5. Calculation of the control values
Read the level of the anti-Hib IgG antibody in the controls directly from the calibration
curve. The values should fall within the ranges given on the QC Certificate.
6. Calculation of antibody levels in diluted samples
Read the level of the anti-Hib IgG antibody in the diluted samples directly from the
calibration curve.
Note: The calibrator values have been adjusted by a factor of 100 to account for a
1:100 sample dilution. No further correction is required.
7. Assay calibration
The assay is calibrated against the standard from the Centre for Biologics
Evaluation and Research, US Food and Drug Administration: Lot 1983.
8. Limitations
This kit is used to aid diagnosis only. A positive result must be confirmed by clinical
findings and other serological tests. The results obtained from this assay are not
diagnostic proof of disease. Each laboratory must establish its own paediatric / adult
protective normal ranges.
9
PROTECTIVE LEVELS
As a guide, an anti-Hib antibody concentration of 0.15mg/L is generally accepted as
the minimum level required for protection, at a given time, however it does not
confer long term protection. On this basis, a study from Finland suggested that the
optimum protective level is 1.0mg/L post immunisation4.
Note: As the immune response to the Hib vaccine is age related1,6, paediatric
protective levels should be established by each laboratory.
10
PERFORMANCE CHARACTERISTICS
10.1 PRECISION
The intra-assay precision was measured using 20 replicates of six samples within
the range of the calibration curve. The mean and % C.V. for each sample are given
below:
INTRA-ASSAY PRECISION
Concentration (mg/L)
0.22
1.03
1.18
1.99
4.08
5.46
n=20
Sample 1
Sample 2
Sample 3
Sample 4
Sample 5
Sample 6
% C.V.
7.1
3.0
3.2
5.8
6.0
3.3
The inter-assay precision was measured using six samples tested in duplicate six
times over three days. The mean and % CV for each sample are given below:
INTER-ASSAY PRECISION
0.25
1.04
1.28
2.17
4.26
5.83
n=6
Sample 1
Sample 2
Sample 3
Sample 4
Sample 5
Sample 6
11
REFERENCES
1.
Cochi S C and Broome C V. et al. Vaccine prevention of Haemophilus
influenzae type b disease: past, present and future. Pediatric Infectious
Disease. 1986; 5 (1): 12-19.
2. Murphy T V. et al. Prospective Surveillance of Haemophilus influenzae Type b
Disease in Dallas County, Texas, and in Minnesota. Pediatrics. 1978; 79(2):
173-180.
3. Granoff D M. and Squires J E. Hemophilus Meningitis: New Developments in
Epidemiology, Treatment and Prophylaxis. Seminars in Neurology. 1982; 2(2):
151-165.
4. Peltola H. et al. Prevention of Haemophilus Influenzae type B bacteremic
infections with the capsular polysaccharide vaccine. New England Journal of
Medicine. 1984; 310: 1561-1566.
5. Robbins J B. et al. Quantitative measurement of ‘Natural’ and Immunizationinduced Haemophilus influenzae type b Capsular Polysaccharide Antibodies.
Pediatric Research. 1973; 7: 103-110.
6. Hazelwood M. et al. The acquisition of anti-pneumococcal capsular
polysaccharide Haemophilus influenzae type b and tetanus toxoid antibodies,
with age, in the UK. Clin Exp Immunol. 1993; 93: 1-8.
7. Phipps D C. et al. An ELISA employing a Haemophilus influenzae type b
oligosaccharide-human serum albumin conjugate correlates with the
radioantigen binding assay. J Immunol Methods. 1990; 135: 121-128.
8. Madore DV et al. Interlaboratory Study Evaluating Quantitation of Antibodies to
Haemophilus influenzae Type b Polysaccharide by Enzyme-Linked
Immunosorbant Assay. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 1996;
3(1): 84-88.
9. Barra A. et al. Measurement of anti-Haemophilus influenzae type b capsular
polysaccharide antibodies by ELISA. J Immunol Methods. 1988; 115: 111-117.
10. Berger M. Immunoglobulin G subclass determination in diagnosis and
management of antibody deficiency syndromes. The Journal of Pediatrics,
1987:2:325-328.
11. Schauer U. et al. Levels of antibody specific to Tetanus toxoid, Haemophilus
influenzae type b and Pneumococcal Capsular Polysaccharide in healthy
children and adults. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, Mar 2003:
202-207.
% C.V.
12.7
8.3
9.2
9.9
9.1
7.6
10.2 ANALYTICAL SENSITIVITY
Assay sensitivity of 0.11mg/L was confirmed by assaying two samples in multiple
replicates with values 1.2 and 2.0 times the lowest calibrator point (0.11mg/L).
Statistical analysis by the Student’s t test, confirmed that these samples were
significantly different from each other (p<0.0001).
10.3 MEASURING RANGE
The measuring range of the assay is 0.11-9mg/L.
Note: The accuracy of the curve is limited by the sensitivity/precision below
0.33mg/L.
10.4 TYPICAL VALUES
Anti-Hib IgG antibody levels were measured in serum from 100 normal adult blood
donors (of unknown vaccination and immune status). The results displayed below,
are provided for illustration only, and should not be used to calculate a normal
range.
40
Number of Samples
35
30
25
20
15
10
5
0
<0.11
0.11 - 0.33
0.34 -1
1.1 - 3
3.1 - 9
>9
Anti-HIB mg/L
Normal ranges have been established using the Binding Site Hib kit (MK016). See
reference 11.
10.5 ASSAY LINEARITY
Linearity was tested across the calibration range using 3 test samples, the
regression co-efficient R2 was greater than 0.9969 when comparing the actual to the
expected values in mg/L, with the mean recovery of 80.8%.
10.6 PROZONE STUDIES
No prozone was observed when serial dilutions of three samples containing 28.6,
50.4 and 74.7 mg/L of anti-Hib IgG antibody were assayed.
10.7 INTERFERING SUBSTANCES
Various serum types were assayed to test the possible effect of interfering
substances using an Interference Check A plus kit (Kokusai, Japan).
Substance
Bilirubin F (Free)
Bilirubin C (Conjugate)
Haemolysed Haemoglobin
Chyle
Rheumatoid Factor
Concentration
19.1mg/dL
19.6mg/dL
484mg/dL
2130 Units
113.8 IU/mL
No interference was observed with free or conjugated bilirubin, haemoglobin, lipid or
rheumatoid factor.
INHALT
VaccZyme Anti-Haemophilus influenzae
Typ b (Human) Enzym-Immunoassay-Kit
Seite
1
Verwendungszweck
2
Einführung
3
Testprinzip
4
Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen
5
Probenentnahme und –vorbereitung
6
Materialien
7
Testdurchführung
8
Ergebnisse und Qualitätskontrolle
9
Schutzgrenze
10
Leistungsdaten
11
Referenzen
Zur in-vitro Diagnostik
Bestell-Nr.: MK016
Hergestellt von:
The Binding Site Group Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, UK.
www.bindingsite.co.uk
Vertrieb in Deutschland und Österreich durch:
The Binding Site GmbH, Robert-Bosch-Straße 2A
D-68723 Schwetzingen, Deutschland
Telefon: +49 (0) 6202 92 62 0
Fax: +49 (0) 6202 92 62 222
VaccZyme™ ist ein Warenzeichen von The Binding Site Group Ltd.,
Birmingham, UK
1
VERWENDUNGSZWECK
Dieser Kit dient zum in-vitro-Nachweis von spezifischen IgG Antikörpern gegen
Haemophilus influenzae Typ b (Hib) Kapsel-Polysaccharid in humanem Serum.
Der Kit enthält ausreichend Material, um maximal 41 Proben in Doppelbestimmung
sowie eine Kalibrationskurve und 2 Kontrollen zu messen.
2
EINFÜHRUNG
Haemophilus influenzae Typ b (Hib) ist ein kapselbildendes gram-negatives Bakterium,
welches Meningitis, Septikämie, Cellulitis, Epiglottitis, Pneumonie und septische
Arthritis auslösen kann.1 Hib-Infektionen kommen am häufigsten bei Kindern unter
fünf Jahren vor, wobei sie die häufigste Ursache für bakterielle Meningitis sind.1-3
Serum-Antikörper gegen das Hib-Kapsel-Polysaccharid schützen gegen diesen
Organismus in vivo; die schützende Antikörperkonzentration wurde durch einen
"radio antigen binding assay" (RABA) in nicht-geimpften und geimpften Individuen
ermittelt.4-6 Die Messung von Antikörpern gegen Hib-Kapsel-Polysaccharid durch
"Enzyme Immunoassay" (ELISA) korreliert mit RABA7-8 und ermöglicht die selektive
Quantifizierung des IgG-Isotyps. Dies ist wichtig, da der schützende Antikörper
überwiegend zur Immunglobulin G (IgG) Klasse gehört. Allerdings findet man bei
einigen Seren, die im RABA einen hohen Titer aufweisen, im ELISA überwiegend
IgM- und IgA-Antikörper.9
Patienten mit rezidivierenden bakteriellen Infektionen sollten auf das Vorliegen
eines Immundefekts, und auf die Fähigkeit, auf spezifische Polysaccharid-Antigene
zu reagieren, untersucht werden (Übersicht 10). Die spezifische Antikörper-Reaktion
eines Patienten kann durch die serologische Bestimmung der IgG-Anti-HibAntikörper vor und nach der Impfung mit diesem quantitativen Enzym-Immunoassay
ermittelt werden.
3
TESTPRINZIP
Die Wells (Vertiefungen) der Mikrotiterplatten sind mit dem Hib-KapselPolysaccharid-Antigen, das an Albumin gekoppelt wurde, beschichtet. Die
Kalibratoren, Kontrollen und zu testende Proben werden in den Wells inkubiert, so
dass die Anti-Hib-Antikörper während der ersten Inkubation an das immobilisierte
Antigen binden können. Nach dem Waschen der Wells - zum Entfernen des
ungebundenen Proteins - gibt man das mit Peroxidase markierte Kaninchen AntiHuman-IgG-Konjugat (spezifisch für die -Kette) hinzu. Nach einer weiteren
Inkubation und einem weiteren Waschvorgang - um das ungebundene Konjugat zu
entfernen - wird das gebundene Konjugat mit Hilfe von 3,3',5,5' Tetramethylbenzidin (TMB) sichtbar gemacht. TMB ergibt ein blaues
Reaktionsprodukt, dessen Intensität proportional zur Antikörper-Konzentration der
Probe ist. Phosphorsäure wird in jedes Well pipettiert, um die Reaktion zu stoppen.
Das daraus resultierende gelbe Reaktionsprodukt wird bei 450 nm gemessen.
4
4.1
WARNUNGEN UND VORSICHTSMAßNAHMEN
WARNUNGEN
Jede Einzelspende von humanem Serum wurde untersucht und bezüglich
Antikörper gegen das Human-Immunschwäche-Virus (HIV 1 & 2), das Hepatitis-CVirus und gegen das Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAG) als negativ
befunden. Die hierfür verwendeten Tests sind entweder von der FDA (USA)
zugelassen oder für den Gebrauch in der in vitro Diagnostik in der EU freigegeben
(Directive 98/79/EC, Annex II). Es gibt aber zur Zeit keine absolut sicheren
Testmethoden zum Auschluss dieser und anderer Infektionsträger. Umgangs- und
Entsorgungsmethoden sollten denen für potentiell infektiösem Material entsprechen
(inklusive dem Tragen entsprechender Schutzkleidung). Der Test sollte nur von
entsprechend geschultem Personal durchgeführt werden.
Dieses Produkt enthält Natriumazid und ProClin 300 und muss mit den entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen behandelt werden. Das Tragen von
Handschuhen und anderer Schutzkleidung wird während des Umgangs mit
diesem Produkt empfohlen. Verschlucken sowie Kontakt mit Haut (v.a. bei
Verletzungen) oder Schleimhäuten vermeiden. Nach Kontakt Hautstelle mit
viel Wasser abspülen und ärztlichen Rat einholen. Natriumazid kann mit Bleioder Kupferrohren explosive Metallazide bilden. Nach der Entsorgung mit
ausreichender Menge Wasser, nachspülen um Azidablagerungen zu vermeiden.
Alle Puffer und Seren im Kit enthalten die unten aufgelisteten Enzym-Inhibitoren als
Konservierungsmittel. Diese Substanzen sind als Gefahrstoffe anzusehen und
müssen mit Vorsicht gehandhabt werden.
INHIBITOR
Kathon
Natriumazid
ProClin™ 300
Bromonitrodioxan
Methylisothiazon
KONZENTRATION
0,02%
0,099%
0,045%
0,002%
0,002%
ProClin™ ist ein Warenzeichen der Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA
Kathon wirkt reizend und kann bei Hautkontakt zu einer Sensibilisierung führen. Die
Stopp-Lösung enthält 3M Phosphorsäure, die Reizungen auslösen kann. Vermeiden
Sie den Kontakt mit Haut und Augen. Verschüttete Reagenzien entsprechend
beseitigen, dabei sind ökologische und gesetzliche Bestimmungen zu beachten.
4.2
VORSICHTSMASSNAHMEN
Dieser Test sollte nur von entsprechend geschultem Laborpersonal durchgeführt
werden. Testdurchführung strikt nach Arbeitsanleitung. Jegliche Abweichung kann
die Testqualität und Ergebnisse beeinflussen. Beachten Sie die spezifischen
‚Hinweise' und Warnungen in dieser Arbeitsanleitung.
Reagenzien unterschiedlicher Chargen dürfen NICHT untereinander gemischt oder
gemeinsam verwendet werden. Bei großem Testdurchsatz muss darauf geachtet
werden, dass alle Reagenzien der GLEICHEN Charge entstammen. Alle
Mikrotiterstreifen müssen aus demselben Folienbeutel entnommen werden. Der
Austausch einer Testkomponente kann inkorrekte Ergebnisse zur Folge haben.
Zur Vermeidung von Kontaminationen der Reagenzien immer saubere Plastik- oder
Glasgefäße verwenden. Niemals unbenutztes Reagenz in die Flaschen
zurückgeben.
Reagenzienflaschen nicht für längere Zeit offen stehenlassen. Die daraus
resultierende Verdunstung oder Verunreinigung führt zu widersprüchlichen Ergebnissen.
TMB darf weder mit Licht noch mit Wasser in Berührung kommen.
Die Verwendung mikrobiell oder mit Partikeln verunreinigter, hämolytischer oder
lipämischer Seren vermeiden.
Falsche Probenverdünnungen können nicht erkannt werden, da die Kit-Kontrollen
gebrauchsfertig sind. Es wird empfohlen, kalibrierte Pipetten und geeignete interne
Kontrollen zu verwenden.
Bei der Verwendung von automatisierten Testsystemen, Probenverdünnern und
anderem automatisierten Zubehör, sind die Anweisungen des Herstellers sorgfältig
zu befolgen. Besondere Sorgfalt gilt der Aufstellung und Installation der Geräte und
der Verbindung zu externen Systemen. Alle Einstellungen, die die automatisierten
Wasch- und Lesegeräte betreffen, müssen sorgsam befolgt werden. Die Geräte
müssen den Herstellerangaben entsprechend instand gehalten und gewartet werden.
7
TESTDURCHFÜHRUNG
7.1
TESTVORBEREITUNG
1.
Kit auf Raumtemperatur erwärmen
Die optimale Temperatur für die Testdurchführung liegt bei 20-24°C. Den Kit nach
Entnahme aus dem Kühlschrank ca. 60 Minuten bei Raumtemperatur erwärmen
lassen. Die Wells bis zum tatsächlichen Gebrauch in der Folie belassen!
Hinweis: Der Kit kann bis zu 1 Woche bei Raumtemperatur gelagert werden.
2.
Kit-Komponenten
Jede Kit-Komponente vor Gebrauch kurz schütteln.
3.
Waschpuffer verdünnen
Dazu 50mL Waschpuffer-Konzentrat und 950mL destilliertes Wasser (1/20Verdünnung) in ein sauberes Gefäß geben und mischen. Bei Bedarf können auch
kleinere Mengen verdünnt werden.
Hinweis: Der verdünnte Puffer ist bei 2-8°C bis zu 4 Wochen haltbar; deshalb nur
die benötigte Menge verdünnen. Den Waschpuffer verwerfen, falls er Anzeichen für
eine mikrobielle Kontamination zeigt oder trübe wird. In diesem Fall eine frische
Verdünnung herstellen.
4.
Verdünnung der Proben
10μL jeder Probe mit 1000μL Probendiluens verdünnen (1:100) und gut mischen.
Hinweis: Die verdünnten Proben müssen innerhalb von 8 h gemessen werden.
5.
Umgang mit Streifen und Rahmen
Die benötigte Anzahl Wells aus dem Folienbeutel entnehmen und in den Rahmen
setzen. Dabei von Position A1 ausgehend die Spalten von links nach rechts
auffüllen. Achten Sie darauf, die langen Seiten des Rahmens zusammenzudrücken,
damit die Wells nicht herausfallen können.
Hinweis: Um die Kontaktzeit mit der Luftfeuchtigkeit zu minimieren, die nicht
verwendeten Wells sofort in den wiederverschließbaren Folienbeutel mit dem
Trockenmittel geben und gut verschließen.
Darauf achten, dass der Folienbeutel nicht beschädigt wird.
ACHTUNG: Kontakt mit Feuchtigkeit oder Verunreinigung durch Staub oder
andere Partikel kann einen Antigen-Abbau verursachen. Daraus resultiert eine
schlechte Präzision und potentiell falsche Ergebnisse.
7.2
TESTDURCHFÜHRUNG
Alle Reagenzien in der gleichen Reihenfolge pipettieren.
4.3
LAGERUNG UND STABILITÄT
Den Kit bei 2-8°C lagern, nicht einfrieren. Lagerung bei falscher Temperatur
beeinflusst die Ergebnisse. Der verdünnte Waschpuffer ist in einem sauberen Gefäß
bei 2-8°C bis maximal 4 Wochen haltbar. Die Haltbarkeit des Kits wird auf dem
Außenetikett angegeben.
5
PROBENENTNAHME UND -VORBEREITUNG
Blutproben über Venenpunktur sammeln und auf natürliche Weise gerinnen lassen.
Serum vom Gerinnsel trennen. Die Seren können bei 2-8°C bis zu 48 Stunden vor
dem Test gelagert werden. Für eine längere Lagerung wird empfohlen, die Seren
unverdünnt bei mindestens -20°C einzufrieren. Wiederholtes Einfrieren und
Auftauen der Proben vermeiden. Serumproben nicht hitzeinaktivieren, dies kann zu
falsch-positiven Ergebnissen führen.
6
MATERIALIEN
6.1
GELIEFERTE MATERIALIEN
6.1.1
6.1.2
6.1.3
Arbeitsanleitung: mit genauen Angaben zur Testdurchführung.
QC-Zertifikat: mit Angaben zu Kontroll-Sollwerten, ideale Kalibrationskurve.
Haemophilus B Coated Wells (Haemophilus B Antigen beschichtete
Mikrotiterstreifen): 12 Mikrotiterstreifen mit 8 vereinzelbaren Wells, die mit
Hib-Antigen beschichtet sind. Sie sind in einem wiederverschließbaren
Folienbeutel, der ein Trockenmittel enthält, verpackt.
Type III Sample Diluent (Probendiluens TypIII): 2 Flaschen mit je 50mL
gebrauchsfertigem Puffer zur Probenverdünnung. Farbcodierung: gelb.
Type III Wash Buffer (Waschpuffer Typ III): 1 Flasche mit 50mL eines 20fach konzentrierten Puffers zum Waschen der Wells.
Haemophilus B Calibrator (Haemophilus B Kalibratoren): 5 Flaschen mit je
1,2mL gebrauchsfertig verdünntem Humanserum der folgenden
Konzentrationen an Anti-Haemophilus B-Antikörper enthält: 9; 3; 1; 0,33;
0,11mg/L.
Haemophilus B High Control (Haemophilus B Hohe Kontrolle): 1 Flasche
mit 1,2mL verdünntem Humanserum. Der Sollwert ist auf dem QCZertifikat angegeben. Gebrauchsfertig.
Haemophilus B Low Control (Haemophilus B Niedrige Kontrolle): 1
Flasche mit 1,2mL verdünntem Humanserum. Der Sollwert ist auf dem
QC-Zertifikat angegeben. Gebrauchsfertig.
Haemophilus B Conjugate (Haemophilus B-Konjugat): 1 Flasche mit 12mL
gereinigtem, Peroxidase-markiertem Antikörper gegen Human-IgG. Farbcodierung:rot. Gebrauchsfertig.
TMB Substrate (TMB-Substrat): 1 Flasche mit 14mL TMB-Lösung.
Gebrauchsfertig.
Stop Solution (Stopp-Lösung): 1 Flasche mit 14mL 3M Phosphorsäure.
Gebrauchsfertig.
6.1.4
6.1.5
6.1.6
6.1.7
6.1.8
6.1.9
6.1.10
6.1.11
6.2
Benötigte, nicht im Kit enthaltene Materialien
6.2.1
Automatisches Mikrotiterplatten-Waschgerät: ist empfehlenswert, aber die
Platten können auch manuell gewaschen werden.
Mikrotiterplatten-Reader: Messung der optischen Dichte in den Wells bei
450nm.
Destilliertes Wasser: Es sollte von höchster Qualität und frei von Metallionen
sein.
Kalibrierte Mikropipetten: Zum Pipettieren von 1000, 100 & 10μL.
Mehrkanal-Pipette: Zum Pipettieren von Volumina von 100mL von
Konjugat, TMB-Substrat und Stopp-Lösung.
Glas- oder Plastikgefäße: Zur Probenverdünnung.
6.2.2
6.2.3
6.2.4
6.2.5
6.2.6
1.
Pipettieren der Kontrollen, Kalibratoren und Proben und Inkubation
100μL von jedem Kalibrator, jeder Kontrolle und jeder verdünnten (1:100) Probe in
das dafür laut Plattenschema vorgesehene Well pipettieren.
Hinweis: Die Proben müssen so schnell wie möglich pipettiert werden, um eine Drift
des Assays zu minimieren. Die Inkubationszeit läuft ab Zugabe der letzten Probe.
30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
2.
Waschen der Platte
Sorgfältiges Waschen der Wells ist wichtig für eine hohe Präzision und genaue
Testergebnisse.
Bei nicht korrekt gewaschenen Wells können ungenaue Ergebnisse mit schlechter
Präzision und hohem Hintergrund auftreten. Nach der Inkubation die Wells dreimal
mit 250-350μL Waschpuffer waschen. Das Waschen kann mit einem automatischen
Platten-Waschgerät oder manuell erfolgen. Nach dem letzten Waschschritt die Wells
durch leichtes Klopfen auf eine absorbierende Unterlage (z.B. Papiertücher) trocknen.
Manuelles Waschen:
a. Den Inhalt der Wells in den Ausguss schütten, dabei die langen Seiten des
Rahmens zusammendrücken.
b. Die Wells auf einer absorbierenden Unterlage (z.B. Papiertücher) leicht
ausklopfen.
c. 250-350µL Waschpuffer in der Arbeitskonzentration in die Wells pipettieren.
d. Die Mikrotiterplatte auf einer flachen Unterlage stehend leicht schütteln.
e. Zweimaliges Wiederholen der Schritte a bis d.
f.
Die Wells wie unter a und b entleeren.
3.
Pipettieren des Konjugats und Inkubation
100μL Konjugat in jedes Well pipettieren. Die Ränder der Wells mit Filterpapier
abtrocknen,um Spritzer zu entfernen.
Hinweis: Um Verunreinigungen zu vermeiden, niemals überschüssiges Konjugat in
die Konjugat-Flasche zurückgeben.
30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
4.
Waschen der Platte
Siehe Abschnitt 2.
5.
Pipettieren von Substrat (TMB)
Nach dem Waschen 100μL TMB in jedes Well pipettieren. Die Ränder der Wells mit
Filterpapier abtrocknen, um Spritzer zu entfernen.
Hinweis: Um Verunreinigungen zu vermeiden, niemals überschüssiges TMB in die
TMB-Flasche zurückgeben.
30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
6.
Reaktionsende
100μL Stopp-Lösung in jedes Well pipettieren. Die Farbe schlägt von blau nach gelb um.
7.
Farbmessung
Die optische Dichte (OD) bei 450nm in jedem Well mit einem MikrotiterplattenReader innerhalb von 30 Minuten nach Zugabe der Stopp-Lösung bestimmen.
8
ERGEBNISSE UND QUALITÄTSKONTROLLE
1.
Qualitätskontrolle
Nur, wenn alle nachfolgend aufgeführten Kriterien erfüllt sind, ist der Test gültig. Ist
dies nicht der Fall, ist der Test ungültig und muss wiederholt werden.

Kalibratoren und Kontrollen müssen bei jedem Testansatz mitgeführt werden.

Das Ergebnis der Kontrollen muss in dem angegebenen Wertebereich (siehe
QC-Zertifikat) liegen.

Die berechnete Kalibrationskurve sollte der auf dem QC-Zertifikat abgebildeten
Kalibrationskurve ähnlich sein.
2.
Berechnung der mittleren optischen Dichte
Für jeden Kalibrator und jede Kontrolle und Probe die mittlere optischen Dichte (OD)
der Doppelbestimmungen berechnen. Der Variationskoeffizient (%VK) der Doppelbestimmungen sollte jeweils unter 15% liegen.
40
35
30
Anzahl
3.
Erstellen der Kalibrationskurve
Die Kalibrationskurve kann entweder automatisch oder manuell erstellt werden.
Dazu wird die Anti-Hib-Antikörper-Konzentration auf der logarithmischen Skala
gegen die OD-Werte auf der linearen Skala für jeden Kalibrator aufgetragen.

Automatisch: Geeignete, validierte Software verwenden. Kalkulationsmodus
verwenden, der am besten zu den Daten passt.

Manuell: Halblogarithmisches Millimeterpapier verwenden, eine Ausgleichskurve durch die Punkte legen (keine Gerade oder Punkt-zu-Punkt-Verbindung).
25
20
15
10
5
0
<0.11
4.
Umgang mit abweichenden Kalibrationspunkten
Liegt ein Messpunkt nicht auf der Kalibrationskurve, so kann er weggelassen
werden. Der Test sollte wiederholt werden, wenn die daraus resultierende
Kalibrationskurve deutlich von der im QC-Zertifikat angegebenen Kurvenform
abweicht oder, wenn mehrere Kalibrationspunkte zu starke Abweichungen aufweisen.
5.
Berechnung der Antikörper-Konzentrationen in den Kontrollen
Die Anti-Hib-Antikörper-Konzentrationen der Kontrollen können direkt aus der
Kalibrationskurve abgelesen werden. Die Kontrollwerte müssen in den im QCZertifikat angegebenen Bereich fallen.
6.
Berechnung der Antikörperkonzentrationen in den Proben
Die Anti-Hib-Antikörper-Konzentrationen der Proben können direkt aus der
Kalibrationskurve abgelesen werden.
Hinweis: Die Standardprobenverdünnung von 1:100 ist in der Kalibrationskurve
bereits berücksichtigt. Es sind keine weiteren Korrekturen nötig.
7.
Kalibration des Tests
Der Test ist gegen eine Referenzpräparation des Centre for Biologics Evaluation
and Research, US Food and Drug Administration, Lot 1983, kalibriert.
SCHUTZGRENZE
LEISTUNGSDATEN
10.1
PRÄZISION
Die Intra-Assay-Präzision wurde mit 6 Proben, deren Konzentrationen innerhalb der
Kalibrationskurve liegen, durch jeweils 20-fache Messung bestimmt. Die Variationskoeffizienten (%VK) jeder Probe sind nachfolgend angegeben:
n = 20
Probe 1
Probe 2
Probe 3
Probe 4
Probe 5
Probe 6
INTRA-ASSAY-PRÄZISION
Mittlere Konzentration (mg/L)
0,22
1,03
1,18
1,99
4,08
5,46
% VK
7,1
3,0
3,2
5,8
6,0
3,3
Die Inter-Assay-Präzision wurde mit 6 Proben, deren Konzentrationen innerhalb der
Kalibrationskurve liegen, durch jeweils 6-fache Doppelbestimmung an drei
verschiedenen Tagen bestimmt. Die Variationskoeffizienten (%VK) jeder Probe sind
nachfolgend angegeben:
n=6
Probe 1
Probe 2
Probe 3
Probe 4
Probe 5
Probe 6
INTER-ASSAY-PRÄZISION
Mittlere Konzentration (mg/L)
0,25
1,04
1,28
2,17
4,26
5,83
1.1 - 3
3.1 - 9
>9
Eine Normalverteilung wurde unter Verwendung des Binding Site Kits (MK016)
generiert, siehe auch Referenz 11.
10.5 LINEARITÄT
Die Linearität des Tests wurde mithilfe von 3 Serumproben über den gesamten
Messbereich überprüft. Beim Vergleich der gemmessenen mit den berechneten
Konzentration wurde ein Korrelationskoeffizient R 2 größer als 0,9969 und eine
mittlere Wiederfindung von 80,8% gefunden.
10.6 PROZONENEFFEKT
Drei Seren, mit Anti-Hib-Antikörperkonzentrationen von 28,6, 50,4 und 74,7mg/L,
wurden in einer seriellen Verdünnungsreihe getestet. Es wurde kein Prozoneneffekt
festgestellt.
10.7 INTERFERIERENDE SUBSTANZEN
Der Kit wurde mit verschiedenen Serumtypen (Interference Check A plus Kit von
Kokusai, Japan) auf mögliche Effekte von interferierenden Substanzen getestet.
Substanz
Konzentration
Bilirubin F (Frei)
19,1mg/dL
Bilirubin C (Konjugiert)
19,6mg/dL
Hämolysiertes Hämoglobin
Chylus
Rheumafaktor
484mg/dL
2130 Einheiten
113,8 IU/mL
Freies und konjugiertes Bilirubin, Hämoglobin, Lipide oder Rheumafaktoren zeigen
keinerlei Beeinflussung des Tests.
Es ist allgemein akzeptiert, dass eine Anti-Hib-Antikörperkonzentration von
mindestens 0,15mg/L benötigt wird, um einen Impfschutz zu haben, der aber nicht
als Langzeitschutz ausreicht. Auf dieser Basis schlägt eine finnische Studie vor,
dass der optimale Immunschutz bei einer Anti-Hib-Antikörperkonzentration von
größer als 1,0mg/L liegt4.
Anmerkung: Da die Immunantwort auf den Hib-Impfstoff altersabhängig1,6 ist,
sollten die pädiatrischen Normalwerte in jedem Labor selbst bestimmt werden.
10
0.34 -1
Anti-HIB mg/L
8.
Grenzen des Tests
Dieser Testkit dient nur zur Unterstützung der Diagnose. Ein positives Ergebnis
muss durch den klinischen Befund und andere serologische Untersuchungen
bestätigt werden. Die Testergebnisse können nicht als diagnostischer Beweis für
das Vorliegen bzw. Nichtvorliegen einer Krankheit verwendet werden. Jedes Labor
sollte eine eigene Schutzgrenze für Normalwerte bei Kindern bzw. Erwachsenen
ermitteln.
9
0.11 - 0.33
% VK
12,7
8,3
9,2
9,9
9,1
7,6
11
REFERENZEN
1.
influenzae type B disease: past, present and future. Pediatric Infectious
Disease. 1986; 5 (1): 12-19.
173-180.
151-165.
Medicine. 1984; 310: 1561-1566.
3(1): 84-88.
1987:2:325-328.
202-207.
10.2
ANALYTISCHE SENSITIVITÄT DES TESTS
Die Sensitivität des Tests wurde anhand der Mehrfachbestimmung von 2 Proben,
deren Konzentration das 1,2- bzw. 2,0-fache des niedrigsten Kalibrators (0,11mg/L)
betrug, bestätigt. Die statistische Analyse mit dem ‚Student’s t Test’ zeigt, dass sich
diese Proben signifikant voneinander unterscheiden (p<0,0001).
10.3
MESSBEREICH
Der Messbereich dieses Tests liegt zwischen 0,11-9,0mg/L.
Anmerkung: Die Genauigkeit der Kalibrationskurve ist durch die Sensitivität/Präzision unterhalb von 0,33mg/L limitiert.
10.4
TYPISCHE WERTE
Von 100 erwachsenen, gesunden Blutspendern wurde die Anti-Hib-IgGAntikörperkonzentration im Serum gemessen. Die unten aufgeführten Ergebnisse
dienen nur zur Orientierung und sollten nicht zur Normalbereichbestimmung
verwendet werden.
Coffret ELISA VaccZymeTM
Anti-Haemophilus influenzae de type b
CONTENU
Page No.
Pour un usage en diagnostic in vitro
1
Indications
2
Présentation générale
3
Principe
4
Précautions
5
Echantillons
6
Matériel
7
Procédure
8
Résultats et contrôle de qualité
Ce test est utilisé pour mesurer in-vitro les anticorps IgG spécifiques dirigés contre
le polysaccharide capsulaire Haemophilus influenzae de type b (HIB) présents dans
le sérum humain.
9
Taux de protection
Ce coffret permet de tester 41 échantillons en double ou 89 échantillons en simple
avec une courbe de calibration en 5 points et 2 contrôles.
10
Performances
Référence : MK016
Produit fabrique en Angleterre par la société:
The Binding Site Group Ltd., PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, UK
Distribués en France par la société :
The Binding Site France, 14 rue des Glairaux, BP226, 38522 St Egrève Cedex
Téléphone : 04.38.02.19.19
Fax : 04.38.02.19.20
e-mail : [email protected]
VaccZyme™ est une marque de The Binding Site Group Ltd. UK.
11
1
2
INDICATIONS
PRESENTATION GENERALE
HIB est une bactérie encapsulée à Gram négatif qui peut être en cause dans les
pathologies suivantes : méningites, septicémies, abcès, épiglottites, pneumonies et
arthrites septiques (référence 1). Les infections à HIB sont communes chez des
enfants de moins de 5 ans et sont la cause majeure des méningites bactériennes
(références 1 à 3).
Les anticorps sériques anti-HIB protègent l’organisme in vivo et des taux protecteurs
ont été établis pour les individus vaccinés et non vaccinés par des tests radioimmunologiques (RABA) (références 4 à 6). Les mesures des anticorps anti-HIB en
ELISA corrèlent avec les mesures RABA (références 7 et 8), et permettent la
quantification sélective de l’isotype IgG. Ceci est important car les anticorps
protecteurs appartiennent à la classe IgG bien qu’occasionnellement, des sérums
immuns avec des taux élevés par les mesures RABA contiennent de façon
prédominante des anticorps IgM et IgA en ELISA (référence 9).
Chez des patients ayant des infections bactériennes répétées, une immunodéficience
et par conséquent une incapacité à répondre aux antigènes polysaccharides
spécifiques devraient être recherchées (référence 10). Une réponse en anticorps
d’un patient peut être évaluée par la détermination sérologique du taux d’anticorps
IgG anti-HIB avant et après immunisation en utilisant cette technique ELISA.
Bibliographie
3
PRINCIPE DU TEST
Les micropuits sont recouverts de l’antigène polysaccharide capsulaire HIB conjugué
à de l’albumine sérique humaine. Les calibrateurs, les contrôles et les échantillons de
patients dilués sont ajoutés aux puits. Les anticorps reconnaissant l’antigène HIB se
lient durant la première incubation.
Après le lavage des puits pour enlever toutes les protéines non liées, un conjugué de
lapin purifié anti-IgG humaines (spécifique de la chaîne ) et marqué à la péroxydase
est ajouté. Le conjugué se lie aux anticorps humains capturés et le conjugué non lié
est éliminé par une étape de lavage. Le conjugué lié est visualisé avec du substrat
3,3’,5,5’ tétraméthylbenzidine (TMB) qui donne un produit de réaction bleu. L’intensité
de celui-ci est proportionnelle à la concentration en anticorps de l’échantillon. L’acide
phosphorique est ajouté dans chaque puits pour arrêter la réaction. Ceci produit une
coloration jaune qui est lue à 450 nm.
4
PRECAUTIONS
4.1 ATTENTION
Tous les sérums humains fournis dans ce coffret ont été testés et trouvés négatifs
pour l’antigène de surface de l’hépatite B (Ag HBs), pour le virus de l’hépatite C et
pour les anticorps anti-virus de l’immunodéficience humaine (HIV1 and HIV2). Les
tests utilisés ont soit été approuvés par la FDA (USA) soit acceptés pour un usage
en diagnostic in-vitro par l’union européenne (Directive 98/79/EC, Annexe II);
néanmoins ces tests ne peuvent garantir l’absence d’agents infectieux Tous les
échantillons doivent donc être manipulés comme des produits potentiellement
infectieux. Seul un personnel qualifié dans la manipulation d’échantillons
potentiellement infectieux est autorisé à utiliser ce coffret.
Ce produit contient de l’azide de sodium et ProClin 300 et doit être manipulé
avec précaution; des gants appropriés et d’autres vêtements de protection
doivent être portés lors de toutes manipulation. Ne pas ingérer ou avoir de
contact avec la peau (spécialement sur les zones abîmées) ou des muqueuses.
S’il y a contact, laver abondamment avec de l’eau et demander un avis médical.
Des azides de métaux explosifs peuvent se former par contact prolongé entre
de l’azide de sodium et les tuyauteries en plomb et cuivre; pour éliminer les
réactifs, rincer avec un large volume d’eau pour prévenir tout dégât.
Les tampons et sérums fournis dans ce coffret contiennent plusieurs inhibiteurs
d’enzymes listés ci-dessous. Ils sont dangereux et doivent manipulés avec précaution.
INHIBITEURS
Kathon
Azide de sodium
ProClin™ 300
Bromonitrodioxane
Methylisothiazone
CONCENTRATION
0,02%
0,099%
0,045%
0,002%
0,002%
ProClin™ est une marque déposée par Rohm et Haas Corp. Philadelphie, PA
th
Insert Code E016, Version: 28 October 2010, Page 7 of 12
Le kathon est un irritant et peut induire une sensibilisation en cas de contact avec la
peau. La solution stop contient de l’acide phosphorique 3M qui est irritant. Eviter tout
contact avec la peau et les yeux. Les éclaboussures de réactifs doivent être nettoyées
de façon appropriée en observant les réglementations locales et environnementales.
4.2
PRECAUTIONS
Ces réactifs doivent être utilisés par un personnel entraîné de façon appropriée.
Il est recommandé de suivre scrupuleusement le protocole. Toute déviation peut
affecter les performances et les résultats obtenus. Faire attention aux ‘Notes’
spécifiques dans les instructions d’utilisation.
Les réactifs des coffrets ayant des numéros de lots différents ne sont pas
interchangeables. Toutes les barrettes utilisées doivent être issues du même
sachet aluminium. Si de grandes séries de tests doivent être réalisées, vérifier que
tous les réactifs aient le MÊME numéro de lot.
Afin d’éviter la contamination des réactifs, utiliser uniquement des récipients en
plastique ou en verre neufs ou propres. Ne jamais remettre les réactifs non utilisés
dans les flacons d’origine.
Ne jamais laisser les flacons non bouchés. Une évaporation ou une contamination
peut induire des résultats incorrects.
Le substrat TMB ne doit pas exposé à la lumière ou à l’eau.
Les sérums hémolysés, lipidiques ou contaminés par des bactéries ou des
particules de matière ne doivent pas être utilisés.
Une mauvaise dilution des échantillons ne peut pas être vérifiée car les contrôles
sont fournis prêts à l’emploi. L’utilisation de pipettes calibrées et d’échantillons
appropriés de contrôles de qualité internes est recommandée.
Lorsque vous utilisez des systèmes d’analyses automatisés, diluteurs
d’échantillons et autres équipements automatisés, suivez les instructions du
fabricant avec soin. Une attention particulière devra être accordée à l'installation de
l'équipement et à la connexion à des services externes. Tous les paramètres pour
les laveurs et lecteurs automatisés doivent être suivis attentivement et les
équipements doivent être maintenus et entretenus selon les instructions du
fabricant.
4.3 STOCKAGE ET STABILITE
Le coffret doit être stocké à 2-8°C et ne doit pas être congelé. Des conditions de
stockage non appropriées affecteraient les résultats. Le tampon de lavage dilué
dans un récipient propre peut être stocké à 2-8°C pendant 4 semaines. La date de
péremption du coffret est indiquée sur l’étiquette extérieure.
5
ECHANTILLONS
Les échantillons de sang doivent être collectés par ponction veineuse. Laisser
coaguler naturellement et séparer le sérum. Le sérum peut être stocké 48 heures à
2-8°C avant le test ou pour un stockage prolongé conservé non dilué à -20°C ou à
une température inférieure. Les congélations et décongélations répétées doivent
être évitées. Les sérums ne doivent pas être inactivés par la chaleur ce qui peut
induire des résultats faux-positifs.
6
MATERIEL
6.1
MATERIEL FOURNI
6.1.1
6.1.2
Une fiche technique : donnant tous les détails de la technique.
Un certificat de contrôle de qualité: indiquant les performances attendues
du lot.
Haemophilus B Coated Wells (Puits recouverts d’Haemophilus B) : 12
barrettes de 8 puits sécables avec de l’antigène HIB. La plaque est
emballée dans un sachet réutilisable contenant 2 dessicateurs.
Type III Sample Diluent (Diluant échantillon de type III) : 2 flacons de
50mL de tampon de dilution des échantillons. Il est coloré en jaune et prêt
à l’emploi.
Type III Wash Buffer (Tampon de lavage de type III) : 1 flacon de 50mL de
tampon concentré 20 fois pour le lavage des puits.
Haemophilus B Calibrator (Calibrateurs Haemophilus) : 5 flacons de
1,2mL de sérum humain dilué avec les concentrations suivantes en
anticorps anti-HIB: 9; 3; 1; 0,33 et 0,11 mg/L. Ils sont prêts à l’emploi.
Haemophilus B High Control (Contrôle haut Haemophilus B) : 1 flacon de
1,2mL de sérum humain dilué. La valeur attendue est donnée sur le
certificat de contrôle de qualité. Il est prêt à l’emploi.
Haemophilus B Low Control (Contrôle bas Haemophilus B) : 1 flacon de
1,2mL de sérum humain dilué. La valeur attendue est donnée sur le
certificat de contrôle de qualité. Il est prêt à l’emploi.
Haemophilus B Conjugate (Conjugué Haemophilus B) : 1 flacon de 12mL
d’anticorps purifiés anti-IgG humaines et conjugués à la péroxydase. Il est
coloré en rouge et est prêt à l’emploi.
TMB Substrate (Substrat TMB) : 1 flacon de 14mL de substrat TMB. Il est
prêt à l’emploi.
Stop Solution (Solution d’arrêt) : 1 flacon de 14mL d’acide phosphorique
3M. Elle est prête à l’emploi.
6.1.3
6.1.4
6.1.5
6.1.6
6.1.7
6.1.8
6.1.9
6.1.10
6.1.11
6.2
MATERIEL NECESSAIRE ET NON FOURNI
6.2.1
Laveur automatique de microplaques : il est recommandé mais le lavage
peut se faire manuellement.
Lecteur de plaques : capable de mesurer des densités optiques de
450nm en référence à l’air.
Eau distillée ou désionisée : elle doit être de bonne qualité.
Micropipettes calibrées : pour des dépots de 1000, 100 et 10µL.
Pipette multicanaux : recommandée pour des dépôts de 100µL de
conjugué, de substrat et de solution d’arrêt.
Tubes en plastique ou en verre : pour la dilution des échantillons.
6.2.2
6.2.3
6.2.4
6.2.5
6.2.6
7
7.1
PROCEDURE
ETAPES PREALABLES
1. Ramener le coffret à température ambiante.
Le coffret fonctionne à température ambiante (20-24°C).Sortir le coffret du
réfrigérateur et le laisser à température ambiante approximativement 60 minutes.
Les puits ne doivent pas être sortis de leur emballage avant qu’ils ne soient à
température ambiante.
Note : Les coffrets peuvent être maintenus à température ambiante 1 semaine.
2. Composants du coffret
Mélanger doucement chaque composant du coffret avant utilisation.
3. Dilution du tampon de lavage
Ajouter 50mL de tampon de lavage concentré à 950mL d’eau distillée (dilution:1/20)
et mélanger. De plus petits volumes peuvent être dilués.
Note : le tampon dilué peut être stocké à 2-8°C pendant 4 semaines. Il est
recommandé de ne diluer que la quantité nécessaire pour la manipulation. Si le
tampon montre des signes de contamination microbienne ou devient trouble, jetezle et repréparez une solution.
4. Dilution des échantillons
Diluer 10μL de chaque échantillon avec 1000μL de diluant échantillon (1:100) et
mélanger bien.
Note : Les échantillons dilués doivent être utilisés dans les 8 heures.
5. Manipulation de la plaque
Placer le nombre requis de puits dans le cadre. Remplir les colonnes de gauche à
droite à partir du puits A1. Lors de la manipulation de la plaque, maintenir les bords
du cadre afin d’éviter que les puits ne tombent.
Note : Remettre immédiatement les puits non utilisés dans leur emballage afin de
minimiser l’exposition des puits à l’humidité.
Faire attention de ne pas percer ou déchirer l’emballage.
ATTENTION: L’exposition des puits à l’humidité ou leur contamination par la
poussière ou par d’autres particules de matière induit une dégradation de
l’antigène conduisant à une mauvaise précision ou à des résultats faux.
7.2
PROCEDURE
Maintenir la même séquence de dépôt tout le long du test.
1. Dépôt de l’échantillon
Déposer 100μL de chaque calibrateur, contrôle et échantillon dilué (1:100) dans les
puits appropriés de la plaque.
Note : Les échantillons doivent être déposés sur la plaque aussi rapidement que
possible afin de minimiser les écarts, et le chronomètre doit être déclenché après
l’addition du dernier échantillon.
Incuber à température ambiante pendant 30 minutes.
2. Lavage
La procédure de lavage est importante et requiert une attention spéciale. Un lavage
imparfait peut induire de mauvais résultats avec une mauvaise précision et du bruit
de fond.
Après incubation, laver 3 fois les puits avec 250 à 350μL de tampon de lavage par
puits. Laver la plaque avec un laveur automatique de plaque ou manuellement
comme indiqué ci-dessous. Après le lavage final automatique, retourner la plaque et
taper les puits sur du papier absorbant.
Les plaques peuvent être lavées manuellement comme suit :
a. Renverser le contenu de la plaque dans un récipient.
b. Taper les puits sur du papier absorbant.
c. Remplir chaque puits avec 250 à 350μL de tampon de lavage en utilisant une
pipette multi-canaux.
d. Agiter doucement la plaque sur une surface plate.
e. Répéter les étapes a à d 2 fois.
f.
Répéter a et b.
3. Addition du conjugué
Déposer 100μL de conjugué par puits, nettoyer le haut des puits avec un tissu pour
enlever les éclaboussures.
Note: Afin d’éviter les contaminations, ne jamais remettre le conjugué en excès
dans le flacon d’origine.
Incuber à température ambiante pendant 30 minutes.
4. Lavage
Répéter l’étape 2.
5. Addition du substrat (TMB)
Déposer 100μL de substrat TMB dans chaque puits, nettoyer le haut des puits avec
un tissu pour enlever les éclaboussures.
Note: Afin d’éviter les contaminations, ne jamais remettre l’excés de TMB dans le
flacon d’origine.
Incuber à température ambiante pendant 30 minutes à l’obscurité.
6. Arrêt
Déposer 100μL de solution d’arrêt dans chaque puits. Ceci induit un changement de
couleur du bleu au jaune.
7. Mesure de la densité optique
Lire la densité optique (DO) de chaque puits à 450nm à l’aide d’un lecteur de
microplaques dans les 30 minutes suivant l’arrêt de la réaction.
8
RESULTATS ET CONTROLE DE QUALITE
1. Contrôle de qualité
Pour valider le test, tous les critères suivants doivent être respectés :

Les calibrateurs et les contrôles doivent être inclus dans chaque série de tests.

Les valeurs obtenues pour les contrôles doivent être dans les gammes
spécifiées dans le certificat de contrôle de qualité.

La forme de la courbe doit être similaire à la courbe de calibration fournie dans
le certificat de contrôle qualité.
Si les critères ci-dessus ne sont pas respectés, le test est invalide et doit être
répété.
2. Calculer les densités optiques moyennes (pour des tests réalisés en
double)
Pour chaque calibrateur, contrôle et échantillon, calculer la moyenne des DO du
duplicat. Le coefficient de variation (CV en %) pour chaque duplicat doit être
inférieur à 15%.
3. Courbe de calibration
La courbe de calibration peut être tracée de façon automatique ou manuellement en
appliquant la concentration d’anticorps IgG anti-HIB sur une échelle logarithmique
versus les densités optiques sur une échelle linéaire pour chaque calibrateur.

Automatique – Utiliser un logiciel validé approprié et une courbe qui suit les
données.

Manuelle – Utiliser du papier graphique log/lineaire, tracer une courbe qui
passe par les points (pas une droite ni une courbe point à point).
4. Traitement des points anormaux
Si un point ne passe pas par la courbe, il peut être enlevé. Si en l’absence de ce
point, la forme de la courbe est différente de celle du certificat de contrôle de qualité
ou si plus d’un point apparaît anormal, alors le test doit être répété.
10.5 LINEARITE DE L’ANALYSE
La linérarité a été testée contre la gamme de calibration en utilisant 3 échantillons
tests. Le coefficient de régression R2 était supérieur à 0,9969 en comparant le réel
aux valeurs prévues en mg/L, avec un recoupement moyen de 80,8%.
5. Calcul de la valeur du contrôle
Lire la concentration d’anticorps anti-HIB IgG dans les contrôles directement à partir
de la courbe de calibration. Les valeurs doivent être dans les gammes données sur
le certificat de contrôle de qualité.
10.6 ETUDE DE PROZONE
Aucun phénomène de prozone n’a été observé avec des séries de dilutions de trois
échantillons contenant 28,6, 50,4 et 74,7mg/mL d’anticorps anti-HIB IgG.
6. Calcul du taux d’anticorps dans les échantillons dilués
Lire le taux d’anticorps anti-HIB IgG dans les échantillons dilués directement à partir
de la courbe de calibration.
Note : Les valeurs des calibrateurs ont été ajustées d’un facteur de 100 pour tenir
compte de la dilution au 1:100 des échantillons. Aucune autre correction n’est
nécessaire.
10.7 SUBSTANCES INTERFERENTES
Différents types de sérums ont été analysés pour tester le possible effet de
substances interférentes en utilisant un coffret « Interference check A plus »
(Kokusai, Japon).
Substance
Bilirubine F (libre)
Bilirubine C (conjuguée)
Hémoglobine hémolysée
Chyle
Facteur rhumatoïde
7. Calibration du test
Le test est calibré par rapport à un standard provenant du Centre d'Evaluation et de
Recherche Biologiques, Etats-Unis, FDA : Lot 1983.
8. Limites
Ce coffret peut être utilisé pour aider au diagnostic. Un résultat positif doit être
confirmé par la clinique et d’autres tests sérologiques. Les résultats obtenus à partir
de ce test ne sont pas une preuve diagnostique d’une maladie. Chaque laboratoire
doit établir ses propres gammes pédiatriques et adultes de protection.
Aucune interférence n’a été observée avec la bilirubine libre ou conjuguée,
l’hémoglobine, les lipides et le facteur rhumatoïde.
11
9
REFERENCES
TAUX DE PROTECTION
A titre indicatif, une concentration en anticorps anti-HIB de 0,15mg/L est
généralement acceptée comme le taux minimum requis pour une protection, à un
temps donné, cependant ce taux ne confert pas une protection à long terme. Sur
cette base, une étude finlandaise suggère que le taux optimal de protection est
1,0mg/L après immunisation (réf. 4).
Note : Comme la réponse immunitaire au vaccin HIB est dépendante de l’âge (réf. 1
et 6), les taux de protection pédiatriques doivent être établis pour chaque
laboratoire.
10
Concentration
19,1mg/dL
19,6mg/dL
484mg/dL
2130 unités
113,8 UI/mL
PERFORMANCES
10.1 PRECISION
La précision intra-essai a été mesurée en utilisant 20 réplicats de 6 échantillons
dans la gamme de la courbe de calibration. La moyenne et le coefficient de variation
(CV en %) pour chaque échantillon sont donnés ci-dessous :
PRECISION INTRA-ESSAI
0,22
1,03
1,18
1,99
4,08
5,46
n=20
Echantillon 1
Echantillon 2
Echantillon 3
Echantillon 4
Echantillon 5
Echantillon 6
C.V. en %
7,1
3,0
3,2
5,8
6,0
3,3
La précision inter-essai a été mesurée en utilisant 6 échantillons testés 6 fois en
duplicats pendant trois jours. La moyenne et le coefficient de variation (CV en %)
pour chaque échantillon sont donnés ci-dessous :
PRECISION INTER-ESSAI
0,25
1,04
1,28
2,17
4,26
5,83
n=6
Echantillon 1
Echantillon 2
Echantillon 3
Echantillon 4
Echantillon 5
Echantillon 6
C.V. en %
12,7
8.3
9.2
9,9
9,1
7,6
1.
Disease. 1986; 5 (1): 12-19.
173-180.
151-165.
Medicine. 1984; 310: 1561-1566.
3(1): 84-88.
1987:2:325-328.
202-207.
10.2 SENSIBILITE ANALYTIQUE
La sensibilité de 0,11mg/L a été confirmée en testant 2 échantillons par de multiples
réplicats avec des valeurs de 1,2 et 2,0 fois la valeur du plus petit point de
calibration (0,11mg/mL). L’analyse statistique par le test de t de Student a confimé
que ces échantillons étaient significativement différents l’un de l’autre (p<0,0001).
10.3 GAMME DE MESURE
La gamme de mesure du test est 0,11 à 9mg/L.
Note : La fiabilité de la courbe est limitée par la sensibilité/précision en-dessous de
0,33mg/L.
10.4 VALEURS TYPIQUES
Les taux d’anticorps IgG anti-HIB ont été mesurés dans le sérum de 100 donneurs
de sang adultes sains (de vaccination et de statut immunitaire inconnus). Les
résultats illustrés ci-dessous ne doivent pas être utilisés pour calculer une gamme
normale.
Nombre d'ec hantillons
40
35
30
25
20
15
10
5
0
<0.11
0.11 - 0.33
0.34 -1
1.1 - 3
3.1 - 9
>9
Anti-HIB mg/L
Les valeurs normales ont été établies en utilisant le coffret Binding Site (ref.
MK016). Cf. Référence 11.
VaccZyme
Anti Haemophilus influenzae humano
tipo b Kit EIA
Contenido
Página
Spanish
1
Propósito
2
Introducción
3
Principio del método
4
Precauciones
5
Obtención y conservación de las muestras
6
Materiales
7
Metodología
8
Resultados y control de calidad
9
Nivel de protección
El propósito de este kit es la determinación in-vitro de anticuerpos IgG específicos a
Haemophilus influenzae tipo b (Hib) polisacárido capsular, presente en suero humano.
10
Caracteristicas de rendimiento
El kit contiene suficiente material para realizar máximo 41 tests en duplicado u 89
tests simples junto con una curva de calibración y 2 controles.
11
Referencias
Para uso diagnóstico in-vitro
Código producto: MK016
Fabricado por:
The Binding Site Group Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K.
The Binding Site Spain S.L.U.,
C/ Balmes 243 4º 3ª, 08006 Barcelona
Teléfono 902027750
Fax: 902027752
web: www.bindingsite.es
VaccZyme™ es una marca de The Binding Site Group Ltd., Birmingham, UK
1
2
PROPÓSITO
INTRODUCCIÓN
El Hib es una bacteria gram negativa encapsulada que puede provocar: meningitis,
septicemia, celulitis, epiglotitis, neumonía y artritis septica1. Infecciones de Hib son
comunes en niños menores de 5 años siendo la principal causa de meningitis
bacteriana 1-3.
Anticuerpos-suero contra el polisacárido capsular Hib protegen este organismo in
vivo; se han podido establecer niveles de anticuerpos protectores por medio de un
"radio antigen binding assay" (RABA) en individuos vacunados y no-vacunados4-6.
La cuantificación de anticuerpos contra Hib polisacárido capsular por medio de un
test (ELISA) "Enzyme Immunoassay" muestra una correlación con RABA 7-8 y
permite una cuantificación selectiva del isótopo IgG. Esto es importante dado que
los anticuerpos protectores pertenecen generalmente a la clase de inmunoglobulina
G (IgG). Aunque ocasionalmente con ELISA se encuentren, en algunos sueros con
un titulo elevado de RABA, mayormente anticuerpos IgM y IgA9.
Pacientes con infecciones recurrentes deberán ser investigados a un posible
defecto inmunológico y consecuentemente la incapacidad de responder a los
antígenos polisacárido específicos (informe10). La respuesta de reacción a
anticuerpos específicos de un paciente deber ser evaluada serologicamente por
medio de la cuantificación por ELISA de los niveles de anticuerpos IgG anti-Hib
antes y después de la vacunación.
3
PRINCIPIO DEL MÉTODO
Los micropocillos están impregnados con antígeno Hib polisacárido capsular
conjugado a albúmina de suero humano. Los calibradores, controles y muestras de
paciente diluidas son aplicados a los pocillos y los anticuerpos reconociendo el
antígeno de Hib se fijan en la primera incubación. Tras el lavado de los pocillos
para eliminar todas las proteínas no fijadas, se añade IgG purificada de conejo antihumano marcada con peroxidasa. El conjugado se fija al anticuerpo humano
capturado y el exceso de conjugado no fijado se elimina mediante un segundo
lavado. El conjugado fijado se visualiza con tetrametilobenzidina 3,3’, 5,5’ (TMB)
dando un color azul. La intensidad es proporcional a la concentración de
anticuerpos en la muestra. Para parar la reacción se añade a cada pocillo ácido
fosfórico. Esto produce un color amarillo a punto final, legible a 450nm.
4
4.1
PRECAUCIONES
ADVERTENCIA
Los sueros humanos suministrados en el kit han sido sometidos a screening para
donantes, resultando negativos a la presencia del antígeno de superficie de la
hepatitis B y a la presencia de los anticuerpos de la ante los virus HIV1, HIV2 y
HCV. Las técnicas usadas están aprobadas por la FDA (USA) o para el diagnóstico
in vitro por la UE (Directiva 98/79/EC, Anexo II). Sin embargo los sobredichos
ensayos no garantizan la ausencia de agentes infecciosos. Por lo tanto, deben
tratarse los reactivos como potencialmente infecciosos. Tanto la manipulación como
los métodos de eliminación de desechos deberán realizarse conforme a la
normativa de materiales infecciosos y solo personal adecuadamente instruido
deberá efectuar el test.
Los componentes del kit contienen azida sódica y ProClin 300 y debe ser
manipulados con precaución; use guantes y vestuario protector adecuado en
todo momento al manipular este producto. No trague ni permita el contacto
con la piel o las mucosas (especilamente si hay heridas). En caso de contacto,
lave con abundante agua y consulte a un médico. Con el plomo y el cobre
pueden formarse azidas metálicas explosivas. Cuando se elimine el reactivo,
lave con mucha agua los recipientes para evitar la acumulación de azida.
Los tampones y sueros suministrados con este kit contienen diferentes inhibidores
enzimáticos según sigue. Son productos peligrosos y se deben manipular con
precaución
INHIBIDOR
Kathon
Azida sódica
ProClin™ 300
Bromodinitrodioxano
Metilisotiazona
CONCENTRACIÓN
0,02%
0,099%
0,045%
0,002%
0,002%
ProClin™ es una marca de Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA
Kathon es un producto irritante y puede producir sensibilización en contacto con la
piel. La solución de parada contiene ácido fosfórico 3M. Es irritante y debe evitarse
el contacto con la piel y ojos. Los métodos de eliminación de desechos deberán
realizarse conforme a la normativa local de materiales infecciosos.
4.2 ADVERTENCIAS
Este producto debe ser utilizado únicamente por personas correctamente entrenadas.
Se recomienda seguir el protocolo de forma estricta. Cualquier desviación puede
afectar a la funcionalidad de este sensible ensayo. Si como consecuencia se obtienen
lecturas de densidades ópticas inferiores, la sensibilidad del ensayo puede quedar
comprometida. Ponga especial atención a los avisos y “Notas” que encontrará en
estas instrucciones de uso.
NO se pueden intercambiar reactivos de distintos lotes. Si se ha de realizar un
elevado número de ensayos, se debe asegurar que todos los reactivos sean del
MISMO lote. Deben tomarse todas las tiras del mismo envoltorio. La sustitución de
cualquier componente puede conducir a resultados erróneos.
Utilice únicamente material plástico o de vidrio limpio. Nunca devuelva reactivos no
utilizados a los viales.
No deje viales de reactivo abiertos; cualquier posible contaminación o evaporación
dará resultados inconsistentes.
El sustrato TMB no debe se expuesto a la luz o al agua.
Muestras hemolizadas, lipémicas, con material particulado o contaminación
microbiana no deben ser utilizadas.
No se puede comprobar una posible dilución de muestra incorrecta ya que los
controles están listos para su uso. Se recomienda la utilización de pipetas calibradas
y muestras CQ internas apropiadas.
Al usar sistemas de ensayo automatizados, diluyentes de muestra y otros equipos
automáticos, siga con atención las instrucciones del fabricante. Se debe tener
especial cuidado con la configuración e instalación del equipo y la conexión a
servicios externos. Se deben seguir con atención todos los parámetros de los
lectores y de los aclaradores automáticos y seguir las instrucciones del fabricante
para el mantenimiento del equipo.
4.3 CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD
El kit debe conservarse a 2-8ºC y no debe congelarse. Temperaturas de
conservación no adecuadas afectarán a los resultados. El tampón de lavado diluido
puede almacenarse en un recipiente limpio a 2-8C por un tiempo máximo de 4
semanas. La fecha de caducidad de este kit se muestra en la etiqueta exterior.
5
OBTENCIÓN Y CONSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS
Las muestras de sangre se han de obtener por punción en vena, dejar que coagule
de modo natural y separar el suero. El suero puede conservarse a 2-8ºC hasta 48
horas, o a -20ºC sin diluir para periodos superiores. Evitar congelaciones y
descongelaciones repetidas. Las muestras de suero no deben ser inactivadas por
calor ya que esto puede ocasionar resultados falsos positivos.
6
6.1
MATERIALES
MATERIALES SUMINISTRADOS
6.1.1
6.1.2
6.1.3
Hoja de Instrucciones: Detallada.
Certificado QC: Indicando los resultados esperados del lote.
Haemophilus B Coated Wells (Pocillos impregnados con Haemophilus B): 12
tiras de 8 pocillos separables impregnados con antígeno Hib. Cada placa
está metida en una bolsa reutilizable conteniendo 2 desecantes.
6.1.4 Type III Sample Diluent (Diluyente muestra tipo III): 2 botellas con 50mL
cada una de tampón para diluir las muestras. De color amarillo. Listo para
usar.
6.1.5 Type III Wash Buffer (Tampón de lavado tipo III): 1 botella con 50mL de
tampón con una concentración 20 veces para el lavado de los pocillos.
6.1.6 Haemophilus B Calibrator (Calibrador Haemophilus B): 5 botellas con 1,2mL
cada una de suero humano diluido con las siguientes concentraciones de
anticuerpo anti-HIB: 9; 3; 1; 0,33; 0,11mg/L. Listo para usar.
6.1.7 Haemophilus B High Control (Control alto Haemophilus B): 1 botella
conteniendo 1,2mL de suero humano diluido. El valor esperado se indica en
el certificado QC. Listo para usar.
6.1.8 Haemophilus B Low Control (Control bajo Haemophilus B): 1 botella
conteniendo 1,2mL de suero humano diluido. El valor esperado se indica en
el certificado QC. Listo para usar.
6.1.9 Haemophilus B Conjugate (Conjugado Haemophilus B): 1 botella
conteniendo 12mL de anticuerpo purificado marcado con peroxidasa anti
IgG humana. De color rojo. Listo para usar.
6.1.10 TMB Substrate (Substrato TMB): 1 botella conteniendo 14mL de substrato
TMB. Listo para usar.
6.1.11 Stop Solution (Solución de parada): 1 botella conteniendo 14mL de ácido
fosfórico 3M. Listo para usar.
6.2
MATERIAL ADICIONAL Y EQUIPO NO SUMINISTRADO
6.2.1
Lavador automático de microplacas: Su uso es recomendable, aunque las
placas pueden lavarse manualmente.
Lector de microplacas: Capaz de medir densidades ópticas a 450nm en
referencia al aire.
Agua destilada o desionizada: Ha de ser de la calidad más alta disponible.
Micropipetas calibradas: Para dispensar 1000, 100 y 10µL.
Pipeta multicanal: Recomendada para dispensar volúmenes de 100µL de
conjugado, solución sustrato y solución de parada.
Tubos de vidrio/plástico: Para dilución de la muestra.
6.2.2
6.2.3
6.2.4
6.2.5
6.2.6
7
METODOLOGÍA
7.1 PASOS PREVIOS
1. Atemperar a temperatura ambiente
El kit está diseñado para trabajar a temperatura ambiente (20-24°C). Sacar el kit de
su embalaje y dejar a temperatura ambiente durante aproximadamente 60 minutos.
Los pocillos no deben sacarse de su embalaje antes de alcanzar la temperatura
ambiente.
Nota: Este kit puede mantenerse a temperatura ambiente hasta 1 semana.
2. Componentes del kit
Mezclar con cuidado cada componente del kit antes de usar.
3. Dilución tampón de lavado
Añadir 50mL del tampón de lavado concentrado a 950mL de agua destilada
(dilución 1 en 20) en un contenedor limpio y mezclar. Se pueden diluir volúmenes
más pequeños según sea adecuado.
Nota: El tampon de lavado diluido debe conservarse a 2-8°C durante un máximo de
4 semanas; diluya, por lo tanto, solamente la cantidad necesaria. Si el tampón
muestra indicios de contaminación microbiana o es turbio, descarte y prepare una
nueva solución.
4. Dilución de muestra
Diluir 10L de cada muestra con 1000L de diluyente (1:100) y mezclar bien. Se
pueden diluir volúmenes más pequeños según sea adecuado.
Nota: Las muestras diluidas tienen que emplearse dentro de 8 horas.
5. Manipulación de las tiras y el marco
Colocar el número necesario de pocillos en el contenedor de tiras. Desde la
posición del pocillo A1 rellenar las columnas de izquierda a derecha. Mientras se
manipula la placa, apretar los cantos largos del marco para evitar que los pocillos
se salgan.
Nota: Devolver inmediatamente a la bolsa los pocillos no utilizados con los
desecantes y cerrar fuertemente con el fin de minimizar la exposición a la humedad.
Tener cuidado de no punzar o rasgar la bolsa.
ADVERTENCIA: La exposición de los pocillos a la humedad o contaminación
por polvo u otras partículas conlleva a una degradación del antígeno llegando
a obtener resultados imprecisos y potencialmente falsos.
7.2 METODOLOGÍA
Mantener la misma secuencia de dispensación durante todo el test.
1. Adición de la muestra
Aplicar 100L de cada de calibrador, control y muestra diluida (1:100) a los pocillos
correspondientes.
Nota: Las muestras deben aplicarse lo más rápido posible para minimizar la deriva del
análisis, y poner en marcha el cronómetro después de la adición de la última muestra.
Incubar 30 minutos a temperatura ambiente.
2. Lavado
El proceso de lavado es crítico y requiere una atención especial. Una placa lavada
impropiamente conlleva a obtener unos resultados inexactos con escasa precisión y
elevados valores de fondo.
Tras la incubación sacar la placa y lavar los pocillos 3 veces con 250-350L de
tampón de lavado por cada pocillo. Lavar la placa con un lavador de placas
automático o manualmente según las siguientes indicaciones. Si se realiza el
lavado automático, invertir la placa al final del lavado y sacudir los pocillos sobre
papel absorbente.
Las placas pueden lavarse manualmente según sigue:
a. Verter el contenido de placa al fregadero.
b. Sacudir los pocillos sobre papel absorbente hasta que se sequen.
c. Echar en cada pocillo 250-350L de tampón de lavado utilizando una pipeta
multicanal.
d. Con cuidado agitar la placa sobre una superficie plana.
e. Repetir a-d dos veces.
f.
Repetir a y b.
3. Adición del conjugado
Pipetear 100L de conjugado a cada pocillo, secar la parte superior del pocillo con
un pañuelo de papel para eliminar salpicaduras.
Nota: Para evitar contaminación, nunca devolver el exceso de conjugado a la botella.
Incubar 30 minutos a temperatura ambiente.
4. Lavado
Repetir punto 2.
5. Adición del substrato (TMB)
Pipetear 100L de substrato TMB en cada pocillo, secar la parte de arriba de los
pocillos con un pañuelo de papel para eliminar salpicaduras.
Nota: Para evitar contaminación, nunca devolver el exceso de TMB a la botella.
Incubar 30 minutos a oscuras y a temperatura ambiente.
6. Parada
Pipetear 100L de la solución de parada en cada pocillo. Esto dará un cambio de
color de azul al amarillo.
7. Medición de la densidad óptica
Leer la densidad óptica (DO) de cada pocillo a 450nm en un lector de microplacas
en los siguientes 30 minutos a la reacción.
8
RESULTADOS Y CONTROL DE CALIDAD
1.
Control de calidad
Para que el test sea válido este debe cumplir con los siguientes criterios:

Cada serie debe incluir los controles positivo y negativo.

Los valores obtenidos deben estar dentro los rangos especificados en el
Certificado QC.

La forma de la curva debe ser similar a la curva de calibración indicada en el
Certificado QC.
Si no se cumpliesen los criterios anteriormente citados, el test no es válido y
se debe repetir.
2.
Cálculo de la medias de las densidades ópticas
Calcular la media de la DO para cada calibrador, control y muestra. El porcentaje
del coeficiente de variación (% CV) para cada DO en duplicado debe ser inferior de
15%.
Cantidad de muestras
40
3. Trazado de la curva de calibración
La curva de calibración puede trazarse automática o manualmente según sigue
trazando la concentración de anticuerpo anti-Hib IgG sobre la escala logarítmica
contra la DO de la escala lineal para cada calibrador:

Automáticamente – Usar un software validado apropiado y la curva será la
más idónea a los datos que correspondan.

Manualmente – Utilizando papel logarítmico dibujar una línea suave a través
de los puntos (no una línea recta o punto a punto).
4. Tratamiento de puntos anómalos
En caso de que alguno de los puntos esté fuera de la línea, este se puede eliminar.
Si la ausencia de este punto significa que la forma de la curva no es similar a la
curva de calibración de la muestra o si más de un punto aparece anómalo, el test
debe repetirse.
5. Cálculo de los valores de control
Leer el nivel de auto anticuerpo anti-Hib IgG de la curva de calibración. Los valores
deben estar dentro de los rangos indicados en el Certificado QC.
6. Cálculo de los niveles de autoanticuerpos en muestras diluidas
Leer el nivel de auto anticuerpo anti-Hib IgG de las muestras diluidas directamente
de la curva de calibración.
Nota: Los valores del calibrador han sido ajustados con un factor 100 considerando
una dilución de muestra del 1:100, por lo tanto no se requiere una posterior
conversión.
9
NIVELES DE PROTECCIÓN
10
CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO
10.1 PRECISIÓN
La precisión intra-ensayo se ha evaluado ensayando seis muestras en 20
replicados que se encontraban dentro del rango de la curva de calibración. Las
concentraciones y el % C.V. de cada muestra se elencan a continuación:
n=20
Muestra 1
Muestra 2
Muestra 3
Muestra 4
Muestra 5
Muestra 6
PRECISIÓN INTRA-ENSAYO
Concentración (mg/L)
0,22
1,03
1,18
1,99
4,08
5,46
% C.V.
7,1
3,0
3.2
5,8
6,0
3,3
La precisión inter-ensayo se evaluado utilizando seis muestras ensayadas en
duplicado seis veces en tres días. La concentración media y el % C.V. para cada
muestra se indica a continuación:
n=6
Muestra 1
Muestra 2
Muestra 3
Muestra 4
Muestra 5
Muestra 6
PRECISIÓN INTER-ENSAYO
Concentración (mg/L)
0,25
1,04
1,28
2,17
4,26
5,83
% C.V.
12,7
8,3
9,2
9,9
9,1
7,6
25
20
15
10
5
<0.11
0.11 0.33
0.34 -1
1.1 - 3
3.1 - 9
>9
Anti-HIB mg/L
Los rangos normales han sido establecidos utilizando el kit Hib de Binding Site
(MK016). Ver referencia 11.
10.5 LINEARIDAD DEL ENSAYO
La linearidad ha sido evaluada utilizando 3 muestras en el ámbito del rango de
calibración; el coeficiente de regresión R2, derivado por la comparación de los
valores realmente obtenidos con los esperados en mg/L, ha sido mayor de 0,9969,
con un valor medio de recuperación igual al 80,8%.
10.6 ESTUDIOS PROZONA
Ningún efecto prozona ha sido observado ensayando diluciones seriales de 3
muestras con concentraciones de 28,6 50,4 y 74,7mg/L de anticuerpos anti-Hib
IgG.
10.7 SUSTANCIAS INTERFENTES
Varios tipos de sueros han sido ensayados para verificar los eventuales efectos de
sustancias interferentes, utilizando el “Interference Check A plus kit” (Kokusai,
Japón).
Sustancia
Bilirrubina F (libre)
Bilirrubina C (conjugada)
Hemoglobina hemolizada
Quilo
Factor reumatoide
Concentración
19,1mg/dL
19,6mg/dL
484mg/dL
2130 Unidades
113,8 IU/mL
No se señalan interferencias con la bilirrubina libre o conjugada, la hemoglobina, los
lípidos o el factor reumatoide.
11
Generalmente, una concentración de anticuerpo anti-Hib de 0,15mg/L se acepta
como nivel mínimo requerido para la protección inmunitaria, de todos modos no
proporciona protección a largo plazo. Sobre esta base, estudios hechos en
Finlandia sugieren que el nivel óptimo de protección después de inmunización es
1,0mg/L4.
Nota: Puesto que la inmunorespuesta a la vacuna de Hib está relacionada con la
edad1,6, cada laboratorio debería establecer sus propios valores de niveles de
protección en pediatría.
30
0
7. Calibración del test
El test esta calibrado contra de referencia de Centre for Biologics Evaluation and
Research, US Food and Drug Administration: Lot 1983.
8. Limitaciones
El kit es para el apoyo en el diagnóstico. Un resultado positivo sugiere determinada
enfermedad que debe confirmarse con otros análisis serológicos y clínicos. Los
resultados obtenidos con este test no es una prueba confirmatoria de presencia o
ausencia de la enfermedad. Cada laboratorio deberá establecer sus propios rangos
normales protectores de niños y adultos.
35
REFERENCIAS
1.
Disease. 1986; 5 (1): 12-19.
173-180.
151-165.
Medicine. 1984; 310: 1561-1566.
3(1): 84-88.
1987:2:325-328.
202-207.
10.2 SENSIBILIDAD ANALÍTICA
La sensibilidad del ensayo de 0,11mg/L ha sido confirmada ensayando dos
muestras en réplicas múltiples con valores de 1,2 y 2,0 veces el calibrador más bajo
(0,11mg/L). El análisis estadístico efectuado con el ‘t test’ de Student, ha
confirmado que estas muestras eran considerablemente diferentes la una de la otra
(p<0,0001).
10.3 RANGO DE MEDICIÓN
El rango de medición es de 0,11-9mg/L.
Nota: La exactitud de la curva está limitada por un cociente sensibilidad/precisión
inferior a 0,33mg/L.
10.4 VALORES TÍPICOS
Los niveles de anticuerpos anti-Hib se obtuvieron de sueros de 100 donantes de
sangre normales adultos (estado de vacunación e inmunización desconocido). Los
siguientes datos solo sirven a título ilustrativo y no deben utilizarse para calcular el
rango normal.

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