Etude des Fonctions du Virus de la Stomatite V6siculaire Alt6r6es

J. gen. Virol. (I97I), x 3 , 4 4 9 - 4 5 3
449
Printed in Great Britain
Etude des F o n c t i o n s du Virus d e l a
Stomatite V6siculaire Alt6r6es par une M u t a t i o n Thermosensible:
M i s e en Evidence d e l a Prot6ine Structurale
Affect6e par la M u t a t i o n t s 23
Par F L O R E N C E
LAFAY
Institut de Microbiologie et Laboratoire de Biologie Experimentale,
Facult~ des Sciences, 9I-Orsay, France
(Accepted z7 July I97 0
SOMMAIRE
L'analyse des prot6ines extraites des virions d'une souche thermosensible, ts 23,
du virus de la stomatite v6siculaire a 6t6 faite sur gel de polyacrylamide. Elle a permis par un double marquage des virions, associ6/t un changement de temp6rature,
de mettre en 6vidence, pour ce clone, une prot6ine affect6e par la mutation. C'est la
plus 16g~re des prot6ines structurales du virion; elle correspond /~ la prot6ine
d'enveloppe S.
INTRODUCTION
Dans le cadre d'&udes g6n&iques sur le virus de la stomatite v6siculaire (Flamand, I969,
I97O), nous avons entrepris l'6tude de l'expression de la mutation pour les divers groupes de
compl6mentation. Les propri&6s physiologiques d'un mutant, ts 23, synth&isant son A R N
/~ temp6rature non permissive (Lafay, I969), ont 6t6 particuli~rement 6tudi6es. Une pr&
c6dente publication montre que cette mutation s'exprime en particulier au niveau de
l'enveloppe virale, et qu'elle affecte probablement une des prot~ines structurales (Lafay &
Berkaloff, I969). Nous savons que l'arr& de la maturation de ts 23 est imm6diat lorsque, au
cours du cycle viral, on passe de 3°0 (temp6rature permissive) ~t 39-5 ° (temp6rature non
permissive). I1 y a cependant encore des syntheses prot6iques/~ 39-5°, car le microscope
61ectronique montre l'accumulation de nucl6ocapsides /~ temp6rature non permissive
(Deutsch, I97o). La reprise de la maturation est tr~s rapide lorsque l'on passe de la temp6rature non permissive/t la temp6rature permissive. N6anmoins la reprise de la maturation
n6cessite de nouvelles syntheses prot6iques (Lafay & Berkaloff, ~969). II semble donc possible
d'identifier la prot6ine structurale affectde par la mutation ts 23. La technique utilis6e consiste/t effectuer un double marquage des virions: un traceur est prdsent pendant la p6riode
non permissive et un autre pendant la p6riode permissive.
METHODES
La souche virale initiale est de s6rotype INDIANA;les cellules sont des fibroblastes de poulet
cultiv6s en milieu de Porterfield (I96O). Le mode d'obtention des mutants, les techniques de
multiplication, de clonage et de titrage ont 6t6 ant6rieurement d&rits (Flamand, x969,
I97o).
Obtention de virions radioactifs. Les milieux utilis6s pour le marquage radioactif sont les
suivants: (a) Marquage 14C: milieu de Porterfield 0960) appauvri en hydrolysat de lactalbumine (0"25 g./1.) sans s&um de veau et contenant 4/zc/ml. d'hydrolysat de chlorelles
Downloaded from www.microbiologyresearch.org by
IP: 78.47.27.170
On: Sat, 11 Feb 2017 10:36:36
450
F. LAFAY
(5o mc/mg.). (b) Marquage 3H:milieu essentiel minimum de Eagle sans leucine, auquel sont
ajout6s 5 #c/ml. de 3H [leucine] (3o 5. 40 c/ininole; C.E.A. France).
Deux r6coltes de virions doubleinent marqu6s sont compar6es. Preinibre r6colte: la
multiplicit6 d'infection est de 5 5. Io u.f.p./cellule. L'adsorption se fait 5. 4 °, puis les cellules
sont Inaintenues 5. 3°0 durant tout le cycle. Elles sont mise en pr6sence de 14C soit durant les
6 preini~res heures, soit de la troisi~ine/~ la sixi~me heure du cycle. Le surnageant est
61imin6, les boites sont lavdes deux fois avec du liquide physiologique tampon6 au tris, puis
recouvertes de milieu contenant du tritium pendant les douze heures suivantes. Ce sont les
virions contenus dans ce surnageant et qui ont donc 6t6 lib6r6s entre la sixi~me et la dixhuiti6me heure du cycle, qui sont analys6s. Deuxi6me r6colte: l'infection se fait dans les
mames conditions, puis les boites sont maintenues/t 3°° durant trois heures en milieu froid;
elles sont ensuite transf6rdes/t 39.5 ° pendant trois heures en pr6sence de 1~C; apr6s lavage
eUes sont ramendes 5. 300 durant douze heures en pr6sence de 3H. Ce sont les virions prdsents
dans le surnageant en fin d'expdrience qui sont analysds.
Purification des virions et solubilisation des protOines virales. Une simple concentrationpurification par deux cycles de centrifugation/t 3o,ooo tours/min. (Rotor 40, Spinco) pendant une heure est suffisante pour ce type d'expdrience. On obtient un culot de virions contenant lO9/~ IO1° u.f.p, qui est repris darts o.2 ml. de tampon phosphate o.1 M. La dissociation
des protdines structurales est r6alis~e en ajoutant 5. la suspension virale lO ~ (v/v) d'acide
ac6tique glacial, I ~o de sodium dodecyl sulphate (p/v) et de l'ur6e 0"5 M (Maizel, 196o;
Wagner, Schnaitman & Snyder, I969a). Les gels, de dix centim6tres de long, sont/t 5
d'acrylamide (Pleuger). L'dlectrophor6se dure entre 5 et 6 hr (23 v e t 8 /t IO mA par gel).
Apr6s fixation/t l'acide sulfosalicylique et coloration au bleu de Cooinassie, la ddcoloration
par l'acide ac6tique 7 ~ se fait en presence de rdsine Dowex IX 2 qui adsorbe le colorant non
fix6 au gel et diffusant dans l'acide ac6tique.
Analyse de la radioactivitd. Les gels sont d6coup6s en disques d'environ I mm. d'6paisseur.
Ces disques sont dessdchds en pr6sence de 0"5 ml. de pip6ridine/~ IO ~ (v/v) pendant une
nuit 5. 6o °, puis r6hydrat6s par 0"5 Inl. d'eau, afin de dissocier les mailles du gel; la radioactivit6 est ainsi lib6r6e dans l'eau. Dix ml. de scintillant hydrophile de Bray (196o) sont
alors ajout6s. Les comptages sont effectu6s sur un coinpteur Intertechnique SL 4o, et les
r6sultats sont exprim6s en d6sint6grations/min.
RESULTATS
Piusieurs auteurs (Wagner et aL I969a; Kang & Prevec, 1969; Cartwright, Talbot &
Brown, 197o; Burge & Huang, 197o) ont d6crit un profil caract6ristique de la migration en
gel de polyacrylainide des prot6ines structurales du virus de la stomatite v6siculaire. Nous
avons retrouv6 ce profil avec la souche sauvage ~ 39.5 ° coinine ~ 3°o et avec la souche ts 23
5. 3°o (Fig. I). Nous avons r6solu d'adopter la m~me nomenclature que Wagner, Snyder &
Yamazaki (197o). On observe trois pics principaux: le plus important est le pic N form6 par
la prot6ine de la nucl6ocapside (Cartwright et al. 197o; Wagner et al. 1969b). Les deux
autres pics G e t S sont d'importance ~quivalente; ils correspondent aux prot6ines de l'enveloppe. On observe 6galement un pic mineur L repr6sentant vraiseinblableinent des agr6gats.
Sa radioactivit6 est souvent tr~s faible et nous n'en avons pas tenu compte, &ant donn6 sa
nature complexe. Des exp6riences pr61ilninaires, coinportant l'analyse de gels Inarqu6s avec
un seul isotope, ont montr6 des profils pr6sentant la m~me importance relative des trois pies,
quelle que soit la p6riode de marquage durant le cycle viral. De m~me, pour une p6riode de
marquage identique, le fait que le support du traceur soit l'hydrolysat de chlorelles ou bien
Downloaded from www.microbiologyresearch.org by
IP: 78.47.27.170
On: Sat, 11 Feb 2017 10:36:36
Protdine du V S V affectde par une mutation ts
45I
u n i q u e m e n t la leucine, ne modifie pas l ' i m p o r t a n c e relative des trois pics principaux.
E n utilisant s i m u l t a n 4 m e n t les deux traceurs dans le m~me milieu, nous avons trouv6
des rapports ZH/~C tr6s voisins p o u r les trois pics: o'94 p o u r G, I q 3 p o u r N e t o.95
p o u r S.
Les r6sultats des diverses exp6riences utilisant u n double marquage, sont pr4sent6s dans le
T a b l e a u L Celui-ci permet de comparer les rapports des quantit6s totales de aH et de ~ C
pr6sentes dans chaque pic. P o u r faciliter la comparaison, ce r a p p o r t est a r b i t r a i r e m e n t
consid&6 c o m m e 6gal/t ~ p o u r le pic N. O n constate que[quelles[que~soient les conditions, o n
T a b l e a u L Valeurs comparatives du rapport 3H/14C des pics G e t S,
celui-ci dtant ramend gt I pour le pie N
No. exp. Souche
I
z
3
4
5
o/~ 3hr
~ - - ~ - - ~
Temp.
Marq.
+
+
+
+
23
23
23
6
7
3°o
300
3°0
30°
300
3/~ 6hr
,
~4C
Non
Non
Non
Non
~4C
Non
3 °0
3°o
Temp.
Marq.
Valeur
du pic S
Valeur
du pic G
3°°
30°
~C
~4C
~4C
14C
~4C
a4C
~4C
I '39
i '44
1.8z
I "5z
4"75
I'44
3'43
I'I 5
I' 15
I.z5
0"94
0-88
' - - - - ,
4 °0
40°
40°
30 °
40°
I'l l
I '07
De 6 hr/~ i8 hr le cycle se deroule toujours en presence de tritium et ~t 30°.
$ ,,.,.~_~'' N ' ' 1/6~~
5,.: x~8
o 75 G
4.~
X
'= 100
E
X
°.--
--
,-:
'
'
N
~
'
'
=
~-6
SO
-~
25
~
9
10
20
30
Fractions
Fig. I
40
3E,-~.o
5 ×
-w
,~4
G
= 2
'
10
1~
20
30
40
Fractions
Fig. z
Fig. I. Electrophor~se des protdines du virus de la stomatite vesiculaire synthetisees/i 300 de o hr h
6 hr en presence de 14C(© - - - O) et de 6 hr/t 18 hr en presence de 3H (0
0). La denomination
des pics est celle de Wagner et al. (I969b).
Fig. 2. Electrophorese des proteines du virus de la stomatite vesiculaire synthetisees ~t 39.5° de 3 hr
/t 6 hr en presence de 14C (O - - - O) et de 6 hr/t ~8 hr 5, 30° en presence de 3H (@
0).
obtient 6galement des valeurs voisines de ] p o u r le pic G. La valeur m o y e n n e et son erreur,
calculees h partir des resultats des experiences I /t 7, est de ~'o7+ 0"3. P o u r le pic S les
valeurs sont 16gerement supdrieures/t I lorsque, en presence de a4C, les cellules sont incubees
3o°; des valeurs identiques sont obtenues avec les souches sauvages et ts 23 (experiences I,
2 et 6); la valeur m o y e n n e des rapports est 1-42 + o.I2. Lorsque le m a r q u a g e p r & o c e a lieu/t
39.5 °, les resultats obtenus avec les souches sauvages et ts 23 sont significativement diff&ents:
I ' 6 7 + 0"65 p o u r la souche sauvage (experiences 3 et 4) et 4"t + 0-8 p o u r ts 23 (experiences
5 et 7). Les profils formes par les experiences 6 et 7 sont representes p a r les Fig. I e t 2.
Downloaded from www.microbiologyresearch.org by
IP: 78.47.27.170
On: Sat, 11 Feb 2017 10:36:36
452
F. LAFAY
DISCUSSION
Les prot6ines sont marqudes au moment de leur synth~se et ce sont les virions libdrds qui
sont analys6s. Des exp6riences de simple marquage ont montr6 que le profil de radioactivit6
est tr~s semblable lorsque le marquage a lieu/t diff&ents moments du cycle ou lorsque l'on
analyse les virions lib6r6s soit pendant, soit apr~s la p6riode de marquage. Toutes les prot6ines sont donc synth6tis6es en proportion sensiblement constante tout au long du cycle
viral. Cependant, l'observation de virions doublement marqu6s permet une analyse beaucoup
plus pr6cise. Avec la souche sauvage on observe toujours un 16g6r d6ficit du traceur pr6coce
dans le pic S (par rapport aux pics G e t N) que ce marquage ait 6t6 effectu6 ~t 3o ° ou ~t 39.5 °
et que le traceur prdcoce ait 6t6 pr6sent de o hr/t 6 hr ou de 3 hr ~ 6 hr. Ce d6ficit se retrouve
avec la souche ts 23 lorsque le marquage pr6coce a 6t6 effectu6/t 3o°. Le premier traceur
marque uniquement les prot6ines synth6tis6es avant son 61imination et non encore incorpor6es dans des virions au moment du changernent de milieu; en effet les virions lib6r6s pendant
cette premiere p6riode sont 61imin6s. Les virions contenant des prot6ines marqu6es par le
traceur tardif sont, par contre, tous rdcup6r6s. La diff6rence entre les rapports 3H/14C peut
donc s'expliquer soit par un faible retard de la synth~se de S, soit par une lib6ration rapide
de la prot6ine S apr& sa synth~se dans la cellule. Wagner et al. (I97O) ont montr6 que le
temps s'6coulant entre la synth~se et la libdration n'est pas le marne pour routes les protdines
du virus de la stomatite vdsiculaire.
Avec la souche ts 23, /t la temp6rature non permissive, le microscope 61ectronique a
montr6 la pr6sence de nucl6ocapsides dans les cellules, ainsi que l'absence de maturation
virale. I1 y a donc des synth&es prot6iques ~t la tempdrature non permissive. Lorsque les
cellules sont remises ~t 3o ° la maturation reprend en utilisant d'une part le pool prdexistant de
prot6ines virales (marqudes au a4C), d'autre part les prot6ines nouvellement synth6tisdes
(marqudes au 3H). Les protdines virales non affect6es par la mutation sont donc marqudes
au 1~C et au ZH. Les r6sultats montrent que, pendant le s6jour ~t 39.5 °, la synth6se de deux
des protdines structurales G e t N n'est pas altdrde.
Nous avons montr6 (Lafay & Berkaloff, I969) que la prot~ine touch6e par la mutation
ts 23, soit n'est pas synth6tis6e/t 39.5 °, soit n'est pas fonctionnelle "2 cette temperature et
ceci d'une mani6re irr6versible: une nouvelle synth6se prot6ique est ndcessaire/t la reprise de
la maturation lorsque l'on passe de 39"5 a 3o°. Ceci doit donc se traduire par un tr6s faible
marquage au 14C de la prot6ine affectde par la mutation. Cette situation est effectivement
r6alis6e pour la prot6ine S. L'absence de radioactivit6 14C n'est pas totale, mais ce marquage
r6siduel s'explique ais6ment par l'absence de chasse lors du changement de milieu. C'est
donc la prot6ine S qui se trouve modifide par la mutation ts 23. Ce rdsultat est en accord
avec ceux de Printz & Wagner 0 9 7 0 , qui ont analys6 ce m~me mutant avec d'autres
techniques.
En utilisant d'autres souches thermosensibles, A R N +, cette technique de double marquage
dolt nous permettre d'&ablir la correspondance entre les diffdrents g6nes viraux identifi6s par
les tests de compl6mentation et les prot6ines structurales du virus de la stomatite v&icularie.
Je suis reconnaissante envers Messieurs les Professeurs Berkaloff, Vigier et Brun pour
l'intdr& qu'ils ont port6/t ce travail, ainsi que pour leurs suggestions et leurs conseils. Je
remercie le personnel technique qui m'a aid6e au cours de ces expdriences.
Ce travail a 6t6 r6alis6 en partie gr~tce aux Conventions D.G.R.S.T. no. 69.oi .699 et
C.E.A. no. I I. 594. II. B6.
Ces exp6riences sont faites en rue de la r6alisation d'une Thhse de Doctorat d'Etat.
Downloaded from www.microbiologyresearch.org by
IP: 78.47.27.170
On: Sat, 11 Feb 2017 10:36:36
Protdine du V S V affect~e p a r une m u t a t i o n ts
453
SUMMARY
Structural proteins extracted from a temperature-sensitive mutant of vesicular
s t o m a t i t i s virus w e r e a n a l y s e d by e l e c t r o p h o r e s i s o n p o l y a c r y l a m i d e gel. T h e
m u t a n t strain, ts 23, was R N A +. I n a d o u b l e l a b e l l i n g e x p e r i m e n t m a d e u n d e r
t e m p e r a t u r e shift c o n d i t i o n s t h e s m a l l e r o f the t w o m e m b r a n e p r o t e i n s of" t h e
virus was identified as a m o d i f i e d c o m p o n e n t o f ts 23; c o m p a r e d w i t h c o n t r o l
v a l u e s o n l y this p r o t e i n s h o w e d a r e d u c e d i n c o r p o r a t i o n o f r a d i o a c t i v i t y at t h e
non-permissive temperature.
REFERENCES
BRAY,~. g. (1960). A simple efficient scintillator for counting aqueous solution in a liquid scintillation counter.
Analytical Biochemistry x, 279.
BURGE, B. W. & HUANG, A. S. (I970). Comparison of membrane protein glycopeptides of Sindbis virus and
vesicular stomatitis virus. Journal of Virology 6, t76.
CARTWRIGHT,a., TALBOT,P. & BROWN,V. (I970). The proteins of biologically active subunits of vesicular
stomatitis virus. Journal of General Virology 7, 267.
OEUTSCH, V. (I970). Mise en 6vidence d'une accumulation de nucl6ocapsides infectieuses du virus de la
stomatite v6siculaire dans le cytoplasme des fibroblastes de poulet. Compte rendu hebdomadaire des
sdances de l'Acaddmie des Sciences, Paris 27x, z73.
FLAMAND,g. (I969). Etude des mutants thermosensibles du virus de la stomatite v6siculaire: raise au point
d'un test de compl6mentation. Compte rendu hebdomadaire des sdances de l'Aeaddmie des Sciences, Paris
268, 2305 .
FLAMAND,A. (1970). Etude g6n6tique du virus de la stomatite v6siculaire: classement de mutants thermosensibles spontan6s en groupe de compl6mentation. Journal of General Virology 8, 187.
KANG, C. Y. & PREVEC,L. (1969). Proteins of vesicular stomatitis virus. I. Polyacrylamide gel analysis of viral
antigens. Journal of Virology 3, 404.
LAFAY, F. (t969)- Etude des mutants thermosensibles du virus de la stomatite v6siculaire: classification de
quelques mutants d'apr6s des crit6res de fonctionnement. Compte rendu hebdomadaire des sdances de
l'Acaddmie des Sciences, Paris 268, 2385.
LAFAY, F. & BERKALOFF,A. (1969). Etude des mutants thermosensibles du virus de la stomatite v6siculaire:
mutants de maturation. Compte rendu hebdomadaire des sdanees de l'Acaddmie des Sciences, Paris 269,
lO31.
MAIZEL, S. V. (1960). Acrylamide gel electrophoregrams by mechanical fractionation: radioactive Adenovirus proteins. Science, New York ISX, 988.
PORTERFIELD,J. S. (1960). A simple plaque-inhibition test for the study of arthopod-borne virus. Bulletin of the
World Health Organization 22, 373.
PRINTZ, P. & WAGNER,R. R. (1971). Temperature-sensitive mutants of vesicular stomatitis virus: synthesis
of virus-specific proteins. Journal of Virology 7, 651.
WAGNER, R. R., SCHNAITMAN, T. A. & SNYDER, R. M. (t969a). Structural proteins of vesicular stomatitis virus.
Journal of Virology 3, 395.
WAGNER, R. R., SCHNAITMAN, T. A., SNYDER, R. M. & SCHNAITMAN, C. A. ( I 9 6 9 b ) . P r o t e i n c o m p o s i t i o n o f t h e
structural components of vesicular stomatitis virus. Journal of Virology 3, 6I I.
WAGNER,R. R., SNYDER,R. M. &YAMAZAKI,S. (I970). Proteins of vesicular stomatitis virus: kinetics and cellular
sites of synthesis. Journal of Virology 5, 548.
(Received 26 February I 9 7 I )
3°
V I R 13
Downloaded from www.microbiologyresearch.org by
IP: 78.47.27.170
On: Sat, 11 Feb 2017 10:36:36