Cours protéines PCEM1 part 3 sur 3 oct 2010 pour PDF

IV.
Propriétés
Physico-Chimiques
des Protéines
• Dénaturation
• Solubilité
• Masse moléculaire
• Propriétés électriques
IV. Propriétés physico-chimiques
IV.1. Dénaturation
Définition : Perte d’activité biologique
d'une protéine due à une altération de
sa conformation native.
Agents dénaturants : tous les facteurs
capables d’entraîner la rupture des
liaisons hydrogènes et hydrophobes.
La dénaturation n’altère pas la structure
primaire de la protéine : les liaisons
peptidiques sont conservées.
Si les modifications structurales sont
discrètes, la dénaturation peut être
réversible.
Si la protéine est incapable de reprendre la
conformation native la dénaturation est
irréversible.
Critères de dénaturation :
• perte d’activité biologique,
• insolubilisation de la protéine due à
l’agrégation en amas,
• élévation de la viscosité des
solutions protéiques.
IV.1 Dénaturation
Agents dénaturants variés.
Action par mécanismes physiques, chimiques
ou mixtes.
* Agents physiques
- élévation de la température : rompt les
liaisons hydrogène (cuisson,
stérilisation, …)
- radiations UV: photolyse des ponts
disulfures
(radiations ionisantes)
- pH extrêmes : rupture de liaisons
électrostatiques et hydrogène
(précipitation par les acides)
IV.1 Dénaturation
* Agents chimiques
- solvants organiques
(CCl4)
- réactifs rompant les ponts disulfures
- réversiblement (réducteurs : BME,
DTT)
- irréversiblement
(oxydants : chlorates)
- urée, chlorure de guanidinium.
petites molécules en solution concentrée
=> dénaturation réversible
(formation de liaisons H)
- détergents : dissociation des structures
IIIR et IVR (effet réversible
sans précipitation),
IV.1 Dénaturation
(agent chaotropique)
UREE
Urée
:
Liaison
peptidique :
2HN
- CO - NH2
--- CO - NH ---
Par son analogie de structure avec la liaison
peptidique, l’urée interfère avec les liaisons
hydrogènes mettant en jeu cette liaison :
- liaisons H intra-protéiques (str. II et III),
-
inter-protéiques.
N.B. : dénaturation réversible (par dialyse)
IV.1 Dénaturation
DÉTERGENTS
Les détergents sont des molécules amphiphiles,
dotées :
- d'une partie hydrophile
(chargée ou non),
- d'une partie hydrophobe.
La partie hydrophobe est constituée d’une chaîne
hydrogéno-carbonée plus ou moins longue.
Les détergents agissent en se liant aux parties
hydrophobes des polypeptides d'une part (portion
apolaire) et en interagissant avec la phase aqueuse
d'autre part (portion polaire).
IV.1 Dénaturation
DÉTERGENTS
Les détergents sont des molécules amphiphiles,
dotées :
- d'une partie hydrophile
(chargée ou non),
- d'une partie hydrophobe.
La partie hydrophobe est constituée d’une chaîne
hydrogéno-carbonée plus ou moins longue.
Les détergents agissent en se liant aux parties
hydrophobes des polypeptides d'une part (portion
apolaire) et en interagissant avec la phase aqueuse
d'autre part (portion polaire).
IV.1 Dénaturation
DÉTERGENTS
Les structures hydrophiles des
détergents peuvent être non ioniques,
anioniques, cationiques ou zwitterioniques.
* Détergent non ionique : Triton X-100
particulièrement peu dénaturant.
Intérêt : préserver l’activité des protéines.
Pôle
hydrophobe
Pôle
hydrophile
IV.1 Dénaturation
DÉTERGENTS
* Détergent anionique :
Dodécyl-sulfate de sodium (SDS)
Assez dénaturant.
11
(dentifrice,
shampoing)
* Détergent cationique :
Bromure de cétrylméthylammonium (CTAB)
* Détergent zwiterrionique :
Sulfobétaïne
Très peu dénaturant
IV. Propriétés physico-chimiques
IV.2. Solubilité
La solubilité des protéines dans leur solvant
naturel, solution saline isotonique,
dépend de leur structure IIIR.
La solubilité peut être influencée par divers
facteurs. Importance +++ pour l’extraction
et la purification d’une protéine.
-
Température
pH
Constante diélectrique
Force ionique
IV.2. Solubilité
* Influence de la température.
Une élévation modérée (entre 0 et +40°C)
augmente légèrement la solubilité.
MAIS, une élévation plus forte de la
température induit une dénaturation
(précipitation par thermo-coagulation)
S
Θ
IV.2. Solubilité
* Influence du pH : solubilité minimale au point
isoélectrique
(en dehors des pH extrêmes).
Log. solubilité
4
6
8
10
pH
pHi
L’absence de charge électrique supprime
les forces de répulsions inter-moléculaires
=> formation d’agrégats insolubles.
IV.2. Solubilité
* Constante diélectrique du solvant
Détermine l’influence du solvant sur les interactions
électrostatiques inter-protéines.
L'eau est un solvant de forte constante diélectrique.
Les molécules d’eau (dipôles) => diminution des
interactions électrostatiques (mélange)
⇒ diminue la tendance à l’agrégation
(effet solubilisant).
- COO
+
3HN
-
Agrégation
IV.2. Solubilité
* Constante diélectrique du solvant
Détermine l’influence du solvant sur les interactions
électrostatiques inter-protéines.
L'eau est un solvant de forte constante diélectrique.
Les molécules d’eau (dipôles) => diminution des
interactions électrostatiques (mélange)
⇒ diminue la tendance à l’agrégation
(effet solubilisant).
δ+ H
- COO -
δ+ H
δ2O
δ+ H
δ+ H
Agrégation
δ2O + 3HN -
IV.2. Solubilité
* Constante diélectrique du solvant
A l’inverse :
Si on ajoute de l’éthanol ou de l’acétone
(constante diélectrique faible)
=> ⇑ interactions électrostatiques,
=> formation d’agrégats insolubles.
IV.2. Solubilité
* Constante diélectrique du solvant
Les solvants organiques à faible constante
diélectrique et miscibles à l’eau
(éthanol, acétone)
sont d’excellents
agents de précipitation des protéines.
Utilisation à basse température (<5°C) pour
éviter la dénaturation des protéines.
IV.2. Solubilité
* Force ionique
L’effet des sels neutres sur la
solubilité des protéines dépend
de la force ionique µ de la solution,
c.a.d. de la concentration et
de la charge des ions.
Log S/So
µ
a) Force ionique faible => Solubilisation
L’extraction des protéines d’un lysat cellulaire est
favorisée par l’utilisation d’une solution de chlorure de
sodium à faible concentration (0,1 M ; µ = 0,1) plutôt
que d’eau pure.
b) Force ionique élevée => Insolubilisation
(relargage par les sels)
Les fortes concentrations d’ions minéraux diminuent la
disponibilité des molécules d'eau dans la solution,
=> diminution de l’hydratation des protéines et
augmentation des interactions hydrophobes,
=> précipitation
=> application à la purification des protéines.
IV.2. Solubilité
Application du relargage par les sels :
fractionnement de mélanges protéiques
Toutes les protéines ne précipitent pas à la même
force ionique.
=> Fractionnement de mélanges protéiques par
augmentation progressive de la force ionique.
Sels d’ions divalents, très solubles dans l’eau
(sulfate d’ammonium, solution saturée à 0°C = 4 M).
ex. Séparation des protéines du sérum sanguin
en deux fractions :
- globulines, précipitées à 50% de la saturation,
- albumine, restant en solution.
Méthode mixte (Cohn) joue sur pH, constante
diélectrique (éthanol), et force ionique : sépare
fibrinogène, globuline et albumine (fraction V).
IV. Propriétés physico-chimiques
IV.3. Poids et masse moléculaires
Le poids moléculaire ou masse moléculaire
relative (symbole Mr) est sans dimension.
ex. : Albumine
Mr = 67 000
La masse moléculaire (symbole m), doit être
exprimée en daltons (symbole : Da).
ex. : Albumine
m = 67 000 Da (67 kDa)