Bactériocines des bactéries lactiques

Transcription

Université d’ORAN
Faculté des Sciences
Département de Biotechnologie
Thèse de MAGISTER
en Biotechnologie
Option : Ecosystèmes microbiens complexes
Présentée par
Zahia BENMOUNA
Intitulée
Bactériocines des bactéries lactiques :
étude biochimique et génétique.
Devant le Jury :
Président :
Examinateurs :
Rapporteur :
Pr. H. ZADI- KARAM
Pr. N-E. KARAM
Dr. S. ROUDJ
Dr. Z. BOUCHERIT
Dr. F. DALACHE
Soutenue le :
Université d’Oran
Université de Tlemcen
Université de Mostaganem
/
/ 2012
REMERCIEMENTS
Je tiens à remercier sincèrement, en premier lieu le Professeur Zadi-Karam Halima et le
Professeur Karam Nour-Eddine de m’avoir accueillie dans leur laboratoire, pour leur
gentillesse, leur professionnalisme et de m’avoir donnée l’opportunité de réaliser mon
mémoire de Magister dans les conditions les plus favorables.
Toute ma gratitude va à Madame Dalache Fatiha, ma directrice de mémoire pour les qualités
d’un encadrant perfectionniste dans son travail. Aussi, je la remercie pour sa rigueur, pour
son enthousiasme, pour sa patience, pour sa présence. Oui, c’est votre présence qui m’a
donné le courage, et les solutions pour tous les problèmes scientifiques, grâce à vous madame,
j’ai appris beaucoup de choses. Je ne vous remercierai jamais assez de m’avoir soutenue
quand ça n’allait pas si bien, de m’avoir poussée pour que je donne le meilleur de moi même.
C’est un immense plaisir d’avoir travaillé avec vous.
Un Merci spécial s’adresse au Professeur Karam Nour-Eddine, pour son aide considérable et
ses conseils précieux, pour être toujours présent pour répondre à mes besoins durant la
réalisation de ce mémoire. Je le remercie aussi pour l’honneur immense qu’il me fait en
examinant mon travail, ces remarques seront pertinentes au cours de la soutenance.
Je tiens à remercier encore une fois Professeur Zadi-Karam Halima d’être toujours prête à
répondre à mes questions, pour vos précieux conseils, Pour votre disponibilité, pour votre
rigueur scientifique, et de l’honneur que vous me faite en présidant le jury de soutenance.
Puisse l’expression de ma profonde gratitude atteindre, Madame Boucherit Zahia pour l’e
grand honneur qu’elle me fait en acceptant de juger mon modeste travail.
Je remercie particulièrement Madame Roudj Salima, pour ses précieux conseils, sa rigueur
scientifique et d’avoir accepté d’examiner ce travail.
Je remercie également les enseignants et les enseignantes, qui appartiennent au Laboratoire
de Biologie des Microorganismes et Biotechnologie.
Un merci chaleureux s’adresse à Amina et Ilhem d’avoir été des amies proches et d’être
toujours là pour moi. Aussi à mes camarades de Magister.
En fin, un Merci spécial s’adresse aux techniciennes du Laboratoire de Biologie des
Microorganismes et Biotechnologie, à Ilhem, Khalida, Khadidja et Atika, sans oublier
Djoher, de leur aide et soutien moral.
i
DEDICACE
C’est grâce à Dieu « ‫» هللا‬, le tout puissant qui m’a donné le courage et la volonté pour
achever ce modeste travail que je dédie :
A mon très cher Papa et ma très chère Maman, pour leurs sacrifices, leur soutien moral, de
leur tendresse, de leurs encouragements tout au long de mes études et durant ce mémoire, ils
m’ont offert tout pour que je réussisse, je ne les remercierai jamais assez pour tout ce qu’ils
m’ont fait, j’espère qu’ils sont fiers de moi.
A mes très Chères sœurs Dalel , Wassila, et surtout Amel, et à mon cher Frère Hamouda, qui
m’ont donné l’aide, l’amour et le courage de surmonter toutes les épreuves.
A mes deux beaux frères : Bachir et Belkheir.
A mon très cher oncle et sa femme, qui constituent pour moi un modèle de réussite.
Je dédie aussi ce mémoire à ma très chère tante TATA Salima et son mari Hbibi, pour leurs
encouragements si tendres.
ii
SOMMAIRE
ABREVIATIONS
LISTE DES FIGURES
LISTE DES TABLEAUX
i
ii
iii
Introduction Générale
1
1. Etude bibliographique
4
1.1. Les bactéries lactiques
1.2. Propriétés technologiques des bactéries lactiques
1.3. Les agents inhibiteurs produits par des bactéries lactiques
1.3.1 Les acides organiques
1.3.2 Le peroxyde d’hydrogène
1.3.3 La reutérine
1.3.4 La production de bactériocine
1.4. Les bactériocines
1.4.1 Définition des bactériocines
1.4.2 Classification des bactériocines
1.4.3 Biosynthèse et régulation de la production des bactériocines
1.4.4 Le mécanisme d’action des bactériocines
1.5. Caractéristiques et applications industriels des bactériocines
1.6 Optimisation de production de bactériocine
5
8
10
10
10
10
11
11
11
12
14
18
20
27
2. Matériel et méthodes
31
2.1 Matériel
2.1. 1 Souches bactériennes
2.1. 2 Milieux de culture
2. 2 Méthodes
2.2. 1 Vérification de la pureté des souches et leur appartenance au groupe lactique
2.2. 2 Conservation des souches
2.2. 3 Mise en évidence des interactions négatives
 Méthode directe : Fleming et al. (1975)
 Méthode indirecte : Schillinger et Lücke (1989)
2.2.4 Production d’agents inhibiteurs dans différents milieux
2.2.5 Caractérisation des agents inhibiteurs
2.2.5.1 Inhibition par production des acides organiques
2.2.5.2 Détermination des inhibitions dues à la production du peroxyde
d’hydrogène ou des bactériocines
2.2.6 Optimisation de la production et/ou l’activité d’une bactériocine
2.2.6.1 Effet de la composition du milieu sur la production de bactériocine
 Effet de la source d’azote
 Effet de la source de carbone
 Effet de la source de potassium
2.2.6.2 Effet de la température d’incubation
2.2.6.3 Effet du pH sur la diffusion de la bactériocine
2.2.7 Production de bactériocine en présence de lait
31
31
31
32
32
32
33
33
33
34
34
34
35
35
36
36
37
37
37
38
38
iii
2.2.8 Caractérisation physico-chimique de la bactériocine
 Effet du pH
 Effet de la température
2.2.9 Estimation de la quantité de bactériocine produite
2.2.10 Cinétique de croissance et de production de bactériocine
2.2.11 Effet de différents détergents sur l’activité de la bactériocine
2.2.12 Purification partielle de la bactériocine
2.2.12.1 Précipitation au sulfate d’ammonium
2.2.12.2 Dessalement
2.2.12.3 Estimation du Poids Moléculaire par tricine SDS PAGE
39
39
39
40
40
41
41
41
42
43
3. Résultats et Discussion
46
3.1. Confirmation de la pureté et l’appartenance des souches aux groupes lactiques
3.2 Mise en évidence des bactéries inhibitrices
3.2.1 La méthode de Fleming et al 1975
3.2.2 Mise en évidence des inhibitions par la méthode de Schillinger et Lücke (1989)
3.3 Production et stabilité des agents inhibiteurs dans différents milieux
3.4 Caractérisation des agents inhibiteurs
3.4.1 Inhibitions dues à la production d’acide organique
3.4.2 Inhibitions dues à la production de peroxyde d’hydrogène et de bactériocine
3.5 Optimisation de la production et/ou l’activité de la bactériocine par CHM9
3.5.1 L’effet de la composition du MRS sur la croissance
bactérienne et la production de bactériocine
 Effet de la source d’azote
 Effet de la source de carbone
 Effet de la source de potassium
3.5.2 L’effet de la température d’incubation
3.5.3 L’effet du pH sur la diffusion de la bactériocine CHM9
3.6 Production de la bactériocine CHM9 en présence de lait
3.7 Propriétés physico-chimiques de la bactériocine
 L’effet du pH
 L’effet de la température
3.8 Estimation de la quantité de bactériocine
3.9 Cinétique de croissance et de production de bactériocine
3.10 Effet de quelques détergents sur l’activité de la bactériocine
3.11 Purification partielle de la bactériocine
3.11.1 Concentration de la bactériocine par le sulfate d’ammonium
3.11.2 Dessalement
3.11.3 Estimation du poids moléculaire de la bactériocine par
électrophorèse tricine SDS-PAGE
46
47
47
50
53
55
56
59
61
4. Conclusion et Perspectives
98
61
61
64
67
69
71
75
77
77
79
80
81
86
88
88
91
94
5. Annexe 1
102
6. Annexe 2
105
7. Références bibliographiques
107
iv
ABREVIATIONS
ABC : ATP binding Cassette
ADN : Acide Désoxyribonucléique
ARNr : Acide Ribonucléique ribosomique.
ATB : Antibiotique
AU/ml : Unité arbitraire / millilitre.
CAT : Catalase
DO : Densité optique
EV : Extrait de viande
EY : Extrait de levure
G+C : Guanine+Cytosine.
GSP : Generally Section Pathway
h : Heure
H2O2 : Peroxyde d’hydrogène
K2HPO4 : Hydrogénophosphate dipotassique
KDa : Kilo Dalton
KH2PO4 : Dihydrogenophosphate potassique
M : Mole / litre
Mb : Méga base
min : Minute
Na2HPO4 : Hydrogénophosphate disodique
NaCl : Chlorure de sodium
NaH2PO4 : Dihydrogénophosphate monosodique
nm : Nanomètre
nTp : Non tamponné
PAGE : Poly Acrylamide Gel Electrophoresis
PEP : Pepsine
pH : Potentiel d’hydrogène
PRO : Pronase E
rpm: tours par minute
SDS : Sodium Dodécyl Sulfate
Tp : Tamponné
Tris : Triaminoméhane.
TRY : Trypsine
Try : Tryptone
v
LISTE DES FIGURES
Figure 1: L’arbre phylogénétique des bactéries lactiques.
6
Figure 2 : Régulation de la production, modifications posttraductionnelles et auto-immunité de la nisine.
16
Figure 3 : ABC-transporteur avec le domaine protéasique.
16
Figure 4: Schéma de la biosynthèse de la production des bactériocines de la
sous classe IIa, montrant: la régulation, la synthèse, le transport et l’immunité.
18
Figure 5 : Mécanisme d’action par la formation de pores des lantibiotiques.
19
Figure 6 : Schéma du mode d’action des bactériocines de la classe IIa.
20
Figure 7 : Les facteurs influençant la production et l’activité de la bactériocine.
24
Figures 8 : Différents domaines des applications des bactériocines
des bactéries lactiques.
26
Figure 9 : Les interactions inhibitrices inter-bactériennes.
47
Figure 10 : L’effet inhibiteur des surnageants de culture des Leuconostocs
contre CHM19.
50
Figure 11 : L’effet de l’addition du lait dans le MRSY sur la production
de l’agent inhibiteur contre H2.3.
54
Figure 12 : L’effet du milieu non tamponné et tamponné sur l’effet inhibiteur des
leuconostocs et des lactobacilles.
57
Figure 13 : L’effet des enzymes protéolytiques et de la catalase sur l’activité
des agents inhibiteurs.
59
Figure 14 : L’effet de différentes sources d’azote sur la production de la
bactériocine par CHM9 testée contre H2.3.
62
Figure 15 : L’effet de différentes sources de carbone sur la production de
la bactériocine par CHM9.
65
Figure 16 : L’effet de différentes sources de carbone sur la croissance
bactérienne et la production de bactériocine par CHM9.
65
Figure 17 : L’effet de différentes sources de potassium sur la production
de bactériocine par CHM9 contre H2.3.
68
Figure 18 : L’effet de la source de potassium sur la croissance bactérienne
et la production de bactériocine de la CHM9.
68
Figure 19 : L’effet de la température d’incubation sur la production
de la bactériocine CHM9.
70
vi
Figure 20 : Effet de la température d’incubation sur la croissance
bactérienne et la production de bactériocine par CHM9.
70
Figure 21 : L’effet du pH du milieu sur la diffusion de la bactériocine.
72
Figure 22 : L’effet du pH de la gélose sur la diffusion de la bactériocine
produite par CHM9.
74
Figure 23 : L’effet de la présence du lait dans trois milieux différents (MRS, MRSY et
MRSm) sur la production de la bactériocine CHM9.
76
Figure 24 : L’effet des pH acides ou basiques sur l’activité de la
bactériocine CHM9 contre H2.3.
77
Figure 25 : L’effet de différentes températures sur l’activité de la
bactériocine CHM9 contre H2.3.
79
Figure 26 : Les cinétiques de production de la bactériocine dans quatre
milieux différents.
82
Figure 27 : Cinétiques de croissance bactérienne et de production de la bactériocine par
CHM9 dans quatre milieux différents.
82
Figure 28 : Concentration des surnageants de culture par le sulfate d’ammonium.
89
Figure 29 : Chromatogramme représentant la DO à 280nm des fractions obtenues par la
chromatographie et graphe de l’effet inhibiteur des fractions.
92
Figure 30 : L’effet inhibiteur des fractions obtenues par la chromatographie.
92
Figure 31: Tricine SDS PAGE de différents échantillons.
95
vii
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1 : Quelques applications des bactéries lactiques.
9
Tableau 2 : La classification de quelques bactériocines des bactéries lactiques.
14
Tableau 3 : Facteurs influençant l’activité de la bactériocine dans l’aliment.
22
Tableau 4 : Les bactéries lactiques productrices de bactériocines et les
aliments fermentés associés.
25
Tableau 5 : l’utilisation probiotique des bactériocines des classe I et II.
26
Tableau 6 : Milieux de culture non conventionnels pour l’étude de la
croissance et de la production de bactériocines de différentes bactéries lactiques.
29
Tableau 7 : les différentes souches utilisées, leur origine et identification.
31
Tableau 8 : Quantité de sulfate d’ammonium ajoutée pour les saturations désirées.
42
Tableau 9 : Caractérisation macroscopique et microscopique des souches.
46
Tableau 10 : Les interactions inhibitrices inter-bactériennes.
103
Tableau 11 : Inhibitions par les surnageants de culture des Leuconostocs.
51
Tableau 12 : La production de l’agent inhibiteur par les 24 souches dans
différents milieux.
104
Tableau 13 : Les inhibitions dues à la production d’acides organiques.
58
Tableau 14 : Inhibitions dues au peroxyde d’hydrogène et aux bactériocines.
60
Tableau 15 : Effet des différentes sources d’azote sur la croissance bactérienne et
la production de la bactériocine par CHM9.
62
Tableau 16 : L’effet du pH de la gélose sur la diffusion de la bactériocine produite
par les souches CHM9, CHM18 et CHBK310.
72
Tableau 17 : L’effet du pH du milieu sur la diffusion de la bactériocine
produite par CHM9.
74
Tableau 18 : L’effet de différentes conditions sur la production de
bactériocine chez CHM9.
76
Tableau 19 : L’effet du pH sur l’activité de la bactériocine CHM9.
78
Tableau 20 : L’effet des températures sur l’activité de la bactériocine CHM9.
79
Tableau 21 : L’effet de différents détergents sur l’activité de la bactériocine
CHM9.
86
Tableau 22 : La concentration par le sulfate d’ammonium de surnageants de
culture de la CHM9.
Tableau 23 : Préparation des gels à 16, 10 et 4% d’acrylamide
107
viii
Les bactéries lactiques ont été, depuis longtemps, un outil de conservation et de
transformation des aliments, en dépit de l’ignorance de ces potentiels technologiques. Elles
étaient présentes dans de nombreux écosystèmes microbiens, car elles ont la particularité de
prédominer dans des environnements assez riches tels que le lait et ces dérivés, les végétaux
et dans les cavités humaines et animales.
Les aliments constituent un environnement, dans lequel plusieurs bactéries peuvent
cohabiter. Certains de ces microorganismes provoquent seulement des altérations des produits
alimentaires alors que d’autres, comme listeria, causent des maladies aux consommateurs.
D’où l’importance de les éliminer. Les antibiotiques présentent depuis quelques décennies un
excellent moyen pour faire barrage à tous ces microorganismes nocifs. Cependant, ils
présentent le grand danger de l’apparition de multirésistances chez ces derniers.
Plusieurs industriels ont cherché le bon moyen afin d’éradiquer les microorganismes
d’altération, et cela par conservation à basse température et/ou l’addition de conservateurs
chimiques. Cependant, plusieurs microorganismes peuvent plus ou moins, résister à ces
conditions. De plus les conservateurs chimiques montrent de plus en plus, leur pouvoir
cancérigène à fortes doses ce qui constitue un problème grave en santé publique.
La présence des bactéries lactiques dans différents écosystèmes, peut assurer, d’une
part, le bon déroulement des étapes de production d’un aliment fermenté, ses qualités
organoleptiques, et d’autres part, sa conservation naturelle (ou bioconservation), en réduisant
ou éliminant l’addition des conservateurs chimiques et en les remplaçant par d’autres qui sont
naturels.
La bioconservation des aliments, est due aux pouvoirs antagonistes des bactéries
lactiques. En effet, elles ont la particularité de synthétiser des substances inhibitrices,
principalement les acides organiques (acide lactique et acide acétique), le peroxyde
d’hydrogène (H2O2) et les bactériocines. Ces dernières ont fait l’objet de nombreuses études
et la nisine (E234) est l’une des rares bactériocines, qui sont utilisées en agroalimentaire,
Page 2
comme bioconservateur. Ces substances sont aussi utilisées comme produits pharmaceutiques
(contre certaines mammites) et parapharmaceutiques, en effet, leur champs d’utilisation
s’élargit de plus en plus, chaque jour, vus leur diversité, leur caractéristiques physicochimiques et leur spectre d’action. De plus elles peuvent être synthétisées par tous les genres
de bactéries lactiques.
C’est dans cette optique que s’insère notre travail dont les objectifs sont les suivants :

Faire un criblage des interactions inhibitrices entre les bactéries lactiques des
genres Lactobacillus et Leuconostoc.

Détecter la ou les bactérie(s) bactériocinogène(s).

Optimiser les conditions de production de bactériocine.

Caractériser physico-chimiquement la bactériocine la plus performante.

Faire une purification partielle, afin de déterminer son poids moléculaire.
Page 3
« Ce que l’on conçoit bien, s’énonce clairement, et
les mots pour le dire arrivent aisément »
Boileau
LBMB
Etudes Bibliographique
1. Etude bibliographique
1.1 Les bactéries lactiques
Les bactéries lactiques sont, un groupe de bactéries hétérogènes, à Gram positif, non
sporulantes, catalase négatives avec de rares souches possédant des activités pseudocatalasiques, aéro-tolérantes, tolérantes à l’acidité, organotrophes, d’une forme qui varie des
coques aux bacilles et leur produit majeur du métabolisme est l’acide lactique, qui est produit
à partir de glucose, d’où leur désignation. Leur ADN chromosomique est caractérisé par le
pourcentage de G+C≤55%.
La division cellulaire chez les bactéries lactiques se fait dans un seul sens, à
l’exception du genre Pediococcus, dont la division se fait dans les deux sens. Elles sont très
exigeantes du point de vue nutritionnel et ont besoin de facteurs de croissance tels que les
vitamines.
Ces microorganismes peuvent être homofermentaires, dans ce cas, ils synthétisent
l’acide lactique comme produit principal de leur métabolisme (85%). Les bactéries
hétérofermetaires, produisent en plus de l’acide lactique, de l’acide acétique, de l’éthanol et
du CO2.

Ecologie des bactéries lactiques
En général, les bactéries lactiques cohabitent dans des environnements riches en
nutriments. Comme les végétaux décomposés, les fruits, les produits laitiers, les poissons et
les viandes fermentés, les betteraves, les pommes de terre, et les cavités humaines et animales
(la bouche, les organes génitaux, les voies intestinales et respiratoires) Dellaglio et al. (1994).
Certaines espèces sont utilisées comme ferments, de plus leur pouvoir acidifiant
prévient la contamination des aliments par les microorganismes pathogènes ou d’altération,
(Hammes et al., 1991). D’autres espèces sont utilisées comme probiotiques, conférant un
potentiel bénéfique à l’écosystème intestinal humain et animal (Tannock, 2005).

Classification des bactéries lactiques
La classification des bactéries lactiques repose principalement sur leur morphologie
(bacilles ou coques), mais aussi sur les critères phénotypiques suivants (Axelsson, 2004) :
Page 5
LBMB
 Le mode de fermentation du glucose.
 La croissance à différentes température (de 15 à 45°C).
 La nature de l’acide lactique (D, L ou DL).
 La tolérance ou l’intolérance aux fortes concentrations en sel (6,5%, 18%NaCl).
 La tolérance à l’acidité (des pH relativement bas), au milieu alcalin ou à l’éthanol.
 La tolérance aux sels biliaires.
 L’hydrolyse de l’arginine, la formation de l’acétoïne.
 La production des polysaccharides extracellulaires,…etc.
Orla-Jengen (1919), est le premier, qui a proposé une classification des bactéries
lactiques. Une autre classification a été donnée par Kandler et Weiss, (1986), en divisant les
bactéries lactiques en trois groupes distincts : homofermentaires strictes, hétérofermetaires
facultatives et hétérofermentaires strictes.
A partir de 1990, une classification qui se base sur le séquençage de l’ARNr 16S a été
proposée, ce dernier a permis d’organiser les genres des bactéries lactiques dans un arbre
phylogénétique (Figure 1).
Figure 1: L’arbre phylogénétique des bactéries lactiques (Axelsson, 2004)
Les bactéries lactiques peuvent se diviser en deux groupes, selon le pourcentage
G+C% dans leur génome :
Page 6
LBMB

Les actinomycetes dont le G+C>50%, ce groupe renferme les genres : Atopobium,
Bifidobacterium, Corynebacterium, et Propionibacterium.

La branche des clostridiums, qui regroupe les bactéries dont le G+C< 50%, ce
groupe rassemble les principaux genres des bactéries lactiques : Carnobacterium,
Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus et Streptococcus.
Les bactéries lactiques constituent les genres : Lactobacillus, Lactococcus,
Carnobacterium, Enterococcus, Lactosphaera, Leuconostoc, Melissococcus, Oenococcus,
Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus et Weissella. D’autres genres ont
récemment, été inclus dans le groupe des bactéries lactiques, il s’agit de : Aerococcus,
Microbacterium, Propionibacterium et Bifidobacterium (Carr et al., 2002).

Caractéristiques des principaux genres :
Les bactéries lactiques sont un groupe hétérogène, chaque genre possède ses propres
caractéristiques, qui le différencient des autres, phénotypiquement et génotypiquement. Nous
présentons ci-dessous les caractéristiques des principaux genres lactiques: Lactobacillus,
Leuconostoc.
Genre Lactobacillus : parmi les genres les plus utilisés en agroalimentaire et la
nutrition humaine, selon la collection Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen and
Zellkulturen (DSMZ, 2008), ce genre renferme 174 espèces (les sous-espèces sont incluses).
Il contribue aux flaveurs des produits fermentés par la production de diacetyle principalement
(Kandler et Weiss, 1986). Ces bactéries sont de forme bacillaire ou cocobacillaire et ont
tendance à former des chaînettes. Elles sont des acidophiles, leur pH maximum de croissance
est de 7,2. Certaines espèces sont mésophiles, mais d’autres sont thermophiles comme
l’espèce Lactobacillus jensenii (Hammes et Vogel, 1995).
Genre Leuconostoc : sont hétérofermentaires stricts, ils produisent la forme D
lactate à partir de glucose et dégradent l’arginine. La forme des cellules varie de sphérique à
lenticulaire et sont associées en paires ou en chaînettes. Ils sont non protéolytiques et certaines
espèces possèdent l’activité caséinolytique. Les leuconostocs jouent un rôle important, dans la
qualité organoleptique et la texture des aliments. ils ont la particularité de résister aux
antibiotiques (30µg/ml de vancomycine), par conséquent ils peuvent prédominer dans un
environnement en présence de cet antibiotique (Mathot et al., 1994). Selon la collection
DSMZ (2008), ce genre renferme 24 espèces.
Page 7
LBMB

Génétique des bactéries lactiques
Le génome des bactéries lactiques varie d’une espèce à une autre, (Morelli et al.,
2004). Makarova et al. (2006) ont décrit le génome de 20 souches lactiques.
Le poids moléculaire moyen des bactéries lactiques varie de 0,04 Mb (Lactobacillus
rhamnosus HN001) à 3,34 Mb (Lactobacillus plantarum WCFS1) Azcarate-Peril et
Klaenhammer (2010). Le faible poids moléculaire des bactéries lactiques explique toutes les
exigences de ces bactéries.
Les plasmides des bactéries lactiques expriment différentes fonctions, telles que la
fermentation des sources de carbones, les activités protéinases, la production de bactériocine,
les mécanismes de résistances aux antibiotiques et les mécanismes de défense contre les
phages (Morelli et al., 2004).
1.2 Propriétés technologiques des bactéries lactiques
Les bactéries lactiques sont productrices de substances organiques. Grâce à leur
métabolisme, elles contribuent à l’arôme et confèrent des qualités organoleptiques (flaveur et
texture) spécifiques aux aliments (Caplice et Fitzgerald, 1999), tout en assurant la sécurité
alimentaire et en augmentant la durée de vie des aliments. Elles contribuent à la fermentation
des aliments par production d’acide lactique à partir d’une source de carbone (glucose). Elles
ont la propriété de dominer des environnements riches, et maîtrisent le développement
d’autres microorganismes.
De plus, elles ont été reconnues comme GRAS (Generally Recognized as Safe). En
effet, des études ont démontré le bienfait des bactéries lactiques sur la santé humaine et
animale, en tant que probiotiques (Food Agriculture Organization, 2006). D’autres travaux
ont démontré, que certaines bactéries lactiques sont capables de produire des vitamines du
groupe B : comme la biosynthèse, de l’acide folique par les ferments de yaourt, de la vitamine
B2 (riboflavine) par certaines bactéries lactiques, et la cobalamine (B12) qui est produite par
la souche de Lactobacillus reuteri CRL1098. Ainsi, les bactéries lactiques sont les meilleures
candidates pour enrichir les aliments en vitamines (Leblanc et al., 2010).
Le pouvoir antimicrobien de ces microorganismes, est l’une des propriétés
technologiques les plus recherchées en industrie alimentaire. Ces activités antimicrobiennes
sont essentielles à l’innocuité et à la conservation des aliments fermentés, (Klaenhammer et
Page 8
LBMB
al., 1994). L’acide lactique et les bactériocines sont les produits antimicrobiens les plus
utilisés, en industrie agroalimentaire pour la conservation des aliments. En effet, certains
industriels, ajoutent une source de carbone (le glucose) durant la fermentation, aux ferments
lactiques pour stimuler la production de l’acide lactique, qui provoque une diminution du pH
de l’environnement et inhibe la prolifération des microorganismes d’altération dans les
saucisses fermentés (Bover-Cid et al., 2001).
La nisine est la bactériocine la mieux caractérisée et la plus utilisée comme
bioconservateur (Galvez et al., 2007). Les bactériocines permettent d’éviter l’ajout de certains
composés chimiques pour la conservation des aliments.
Pour tous ces avantages, la plupart des bactéries lactiques ont fait l’objet de plusieurs
applications, le tableau 1 récapitule quelques applications des bactéries lactiques.
Tableau 1 : Quelques applications des bactéries lactiques. (Zhu et al., 2009)
Souches lactiques
applications
Références
Lactobacillus acidophilus NCFM
Probiotique
Altermann et al. (2005)
Lactobacillus brevis ATCC 367
Ferment des ensilages, levain,
fermentation de la bière
Probiotique, fermentation du lait, la
flaveur des fromages
Probiotique, fermentation du lait,
flaveur du fromage
Dubchak et al. (2006a)
Lactobacillus casei ATCC 334
Lactobacillus casei BL23
Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus ATCC BAA-365
Lactobacillus helveticus DPC 4571
Lactobacillus reuteri F275
Lactobacillus sakei subsp. sakei 23
K
Lactococcus lactis subsp. cremoris
MG1363
Leuconostoc citreum KM20
Leuconostoc mesenteroïdes subsp.
mesenteroïdes ATCC 8293
Streptococcus thermophilus LMG
18311
Kandler and Weiss (1986)
fermentation du yaourt
Tamime and Robinson (1999)
Industrie fromagère
Callanan et al. (2008)
Probiotique
Pridmore et al. (2004)
Conservation des aliments, tels que le lait,
la viande et les végétaux, probiotique
Probiotique
Kleerebezem et al. (2003)
Lactobacillus johnsonii NCC 533
Lactobacillus plantarum WCFS1
Dubchak et al. (2006b)
Conservation des aliments, fermentation
de la viande
La fermentation des aliments laitiers, une
souche modèle
fermentation du Kimchi
Fermentation d’aliments : choucroute, des
légumes, production de dextrane
Fermentation du fromage et du yaourt
Morita et al. (2008)
Chaillou et al. (2005)
Wegmann et al. (2007)
Kim et al. (2008)
Dubchak et al. (2006c)
Bolotin et al. (2004)
Les bactéries lactiques sont capables de synthétiser une grande variété d’agents
inhibiteurs dont les cibles peuvent être différentes. Cependant, l’acide lactique et les
bactériocines restent les principaux.
Page 9
LBMB
1.3 Les agents inhibiteurs produits par les bactéries lactiques
La production des antimicrobiens par les bactéries lactiques, est connue depuis
longtemps. Les acides organiques, le peroxyde d’hydrogène et d’autres molécules
antimicrobiennes sont les principaux agents inhibiteurs produits par ces microorganismes. Ces
agents inhibiteurs diffèrent par leur cible mais aussi par leur nature et leur structure.
1.3.1 Les acides organiques
Ils sont produits par catabolisme des sources de carbone. L’acide lactique est le seul
acide issu de la glycolyse par la voie homofermentaire, alors que la voie hétérofermentaire
génère en plus de l’acide lactique, de l’acide acétique. Ces acides traversent la membrane
cytoplasmique et diminue le pH du milieu intracellulaire, ce qui provoque l’inhibition des
fonctions cellulaires (Kashet, 1987). Plusieurs microorganismes d’altération des aliments sont
connus pour leur sensibilité aux changements de pH intracellulaire. De plus, les bactéries
lactiques semblent être compétitives en conditions acides, causant l’inhibition d’autres
bactéries (Klaenhammer et al., 1994). Cependant si l’acidité du milieu dépasse les seuils
acceptés par la souche, des cas d’auto-inhibitions peuvent être observées, en effet au cours de
la fermentation d’une bactérie lactique, l’administration en continue de glucose, provoque la
production en continue des acides organiques, par conséquent, une diminution progressive du
pH du milieu et si celui-ci n’est pas contrôlé, la bactérie peut s’auto-inhiber (Grattepanche,
2005).
1.3.2 Le peroxyde d’hydrogène
Les bactéries lactiques ne possèdent pas généralement de catalase. L’accumulation de
peroxyde d’hydrogène par l’action des oxydases (Daeschel, 1989), est une cause de l’activité
antimicrobienne, en particulier des lactobacilles. Le H2O2 peut être auto-inhibiteur dans le cas,
ou l’activité peroxydasique n’est pas importante (Price et Lee, 1970).
1.3.3 La production d’antibiotique
La reutérine est parmi les ATB des bactéries lactiques, la plus caractérisée et purifiée,
produit par certaines souche de Lactobacillus reuteri, lorsque le glycerol est utilisé comme
source de carbone (Stackengrand et Tenber, (1988); Talarico et al., 1990). Cet ATB bloque la
synthèse de l’ADN (Talarico et Dobrogosz, 1989), ce qui explique son large spectre d’action.
Page 10
LBMB
1.3.4 La production de bactériocine
Klaenhammer (1988), suggère que 99% des bactéries peuvent produire au moins une
bactériocine. Pour des raisons de sécurité alimentaire, plusieurs bactéries n’ont pas fait l’objet
d’études, pour la production de bactériocines. Les bactériocines des bactéries lactiques sont
les plus abordées dans la recherche. Ces substances protéiques, sont des toxines à spectre
d’action plus ou moins large (Riley et Wertz, 2002). Ces molécules constituent la deuxième
cause de l’effet inhibiteur des bactéries lactiques, après celle causée par les acides organiques.
Le chapitre suivant est consacrée aux bactériocines des bactéries lactiques, à leur
classification, leur biosynthèse et sa régulation, l’immunité des bactéries productrices, leur
mode d’action, d’une part. Et d’autre part, il fera l’objet de l’optimisation de leur production
et leur application dans différents domaines.
1.4 Les bactériocines
Le terme «bactériocine» est employé pour la première fois par Jacob et al, (1953) pour
les peptides à spécificité importante, produits par certaines souches et actifs contre les souches
de la même espèce. La première bactériocine, nommé la colicine était produite par
Escherichia coli S (Gratia, 1925). Depuis, l’étude des bactériocines s’est élargie. Rogers et
Whitter (1928), furent les premiers à étudier les inhibiteurs des bactéries lactiques, et plus
spécialement des lactocoques.
1.4.1 Définition des bactériocines
D’après Klaenhammer (1988), les bactériocines sont des substances de nature
totalement ou partiellement protéique, à activité bactéricide envers les espèces proches de la
souche productrice. Elles sont synthétisées par voie ribosomale, sous forme de peptides
inactifs, et deviennent actives en milieu extracellulaire ; dans la plupart des cas, elles sont
codées par des gènes plasmidiques. Ces substances antagonistes se différencient entre elles
par : leurs poids moléculaires, leurs propriétés biochimiques, leur spectre et leur mode
d’action (Klaenhammer, 1988). Elles sont actives contre les bactéries à Gram positif,
néanmoins, certains auteurs ont observé que certaines bactériocines exercent aussi un effet
inhibiteur contre les bactéries Gram négatives (Todorov et al., 2005). Les bactériocines
produites par les bactéries lactiques sont généralement cationiques, hydrophobiques ou
amphiphiliques, composées de 20 à 60 acides aminés (Nes et Holo, 2000).
Page 11
LBMB
1.4.2 Classification des bactériocines
La classification des bactériocines repose sur les critères qui les différencient.
Klaenhammer (1993), propose une classification des bactériocines en 4 classes distinctes :
 Classe I : appelée aussi «classe des lantibiotiques», elle renferme les bactériocines
post-traductionellement modifiées, caractérisées par une taille moléculaire < à 5 KDa, stables
à la chaleur, elles contiennent des acides aminés inhabituels tels que la lanthionine.
Cette classe est subdivisée en deux types, selon leur structure et leur mode d’action :
Le type A, regroupe les lantibiotiques linéaires, avec une charge nettement positive, leur
mode d’action se manifeste par la formation de pores sur la membrane de l’hôte.
Le type B, constitue les lantibiotiques globulaires, possédant une charge négative, ou ne
contenant pas de charge, elles attaquent des enzymes spécifiques et les inhibent (Mc Auliffe et
al., 2001).
La nisine, est une bactériocine du type A des lantibiotiques, un peptide de 34 acides aminés,
de poids moléculaire de 3,5 KDa et thermorésistante. Découverte par hasard en 1928, elle a
été appelée «une substance inhibitrice du Groupe N (streptococci) » en 1947. Sa structure a été
élucidée en 1971. Elle est active à des pH bas (Luc et Hansen, 1990). En 1983, la nisine est
ajoutée dans la liste des additifs alimentaires (E234), elle est reconnue comme GRAS par
FDA (Food and Drug Administration). Elle est produite par des souches de Lactococcus lactis
subsp lactis. Depuis, d’autres variantes (A, Z, Q, U et U2) ont été isolées (Lubelski et al.,
2008 ; de Aruaz et al., 2009).
 Classe II : renferme les bactériocines, dont le poids moléculaire n’excède pas les 10
KDa, thermorésistantes, et qui ne possèdent pas des acides amines inhabituels, elles ne
subissent pas de modifications post-traductionnelles. Cette classe est subdivisée en 3 sous
classes :
Sous classe IIa : ces bactériocines font partie de la famille des pédiocines, qui
présentent une partie N terminale conservée, à activité anti-Listeria. Grâce à cette qualité,
plusieurs chercheurs se sont intéressés à l’isolement des bactériocines qui appartiennent à
cette sous classe. La mésentéricine Y105 est une bactériocine de la classe IIa et elle
contient 37 acides aminés (Hechard et al, 1992).
Page 12
LBMB
Sous classe IIb : regroupe les bactériocines contenant deux peptides, l’activité de ces
peptides permet de distinguer deux types : le type E (Enhancing), ou un des deux peptides
sert à stimuler l’activité de l’autre peptide et le type S (Synergy) ou les activités des deux
peptides sont complémentaires. La lactacine F produite par Lactobacillus johnsonii est
une bactériocine de la sous classe IIb (Allison et al, 1994).
Sous classe IIc : elle contient d’autres bactériocines qui ne peuvent pas être classées
dans les sous classes IIa et IIb. L’acidocine B est une bactériocine de cette sous classe,
produite par Lactobacillus acidophilus (Leer et al, 1995).
 Classe III : cette classe rassemble les bactériocines de poids moléculaire supérieur à
30 KDa, sensibles à la chaleur, ce qui limite leur utilisation possible dans l’industrie
agroalimentaire. La helveticine J, une bactériocine de cette classe, est produite par
Lactobacillus helveticus A (Joerger et Klaenhammer, 1990).
 Classe IV : Klaenhammer (1993), a regroupé dans cette classe les bactériocines qui
possèdent une ou plusieurs molécules de nature non protéique, mais lipidiques et/ou
glucidiques, ces dernières sont nécessaires à leur activité. L’activité de la plantaricine S
est affectée par les enzymes lipolytiques et glycolytiques (Jimenez-Diaz et al., 1993).
Plusieurs classifications ont été proposées par d’autres chercheurs. Après celle
proposée par Klaenhammer (1993), la classification de Nes et al. (1996) qui a éliminé la
classe IV, car aucune bactériocine de ce type n’a été purifiée, ni chimiquement caractérisée.
La classification la plus récente, est proposée par Heng et Tagg, (2006), elle regroupe
quatre classes : classe I pour les lantibiotiques, Classe II : peptides non modifiés, Classe III :
protéines et la classe IV pour les peptides cycliques. La classification des bactériocines
permet d’établir une relation entre la fonction et la structure de ces molécules, pour une
application possible. Le mode d’action de la plupart des bactériocines se manifeste par
l’adsorption à la membrane de l’hôte et la formation des pores, ce qui provoque la mort
cellulaire (Bauer and Dicks, 2005; Cotter et al,. 2005; Drider et al., 2006),
Le tableau suivant, cite quelques bactériocines produites par différentes souches avec
leur classification basée sur celle proposée par Klaenhammer (1993).
Page 13
LBMB
Tableau 2 : La classification de quelques bactériocines des bactéries lactiques. Chen et
Hoover, (2003).
bactériocine
Classe I- lantibiotique
type A
nisine
lactocine S
Classe I- lantibiotiques
type B
cinnamycine
ancovenine
Classe IIa
pediocine PA-1/AcH
lactococcine MMFII
Classe IIb
lactococcine G
plantaricine EF
Classe IIc
acidocine B
Classe III
helveticine J
helveticin V-1829
souche productrice
Lactococcus lactis
Lactobacillus sake
Streptomyces cinnamoneus
Streptomyces sp.
Pediococcus acidilactici
Lactococcus lactis
Références
Hurst, (1981)
Mortvedt et al, (1991)
Sahl et Bierbaum, (1998)
Henderson et al. (1992);
Motlagh et al. (1992)
Ferchichi et al. (2001)
Lactococcus lactis
Lactobacillus plantarum
Nissen-Meyer et al.(1992)
Anderssen et al. (1998)
Lactobacillus acidophilus
Leer et al. (1995)
Lactobacillus heleveticus
Lactobacillus helveticus
Joerger et Klaenhammer, (1986)
Vaughan et al. (1992)
Dans la partie suivante, nous allons aborder la biosynthèse et la régulation de la
production des bactériocines.
1.4.3 Biosynthèse et régulation de la production des bactériocines
Le mécanisme de biosynthèse des bactériocines et sa régulation fait appel à un
système complexe, en effet, la biosynthèse dépend d’un ensemble de gènes de structure, qui
codent pour le peptide et son transport ainsi que l’immunité de la bactérie productrice. Cet
Opéron transcrit un prépeptide (non actif), qui sera actif en milieu extracellulaire ; la cellule
doit s’immuniser contre sa propre bactériocine.
La production des bactériocines de classe I et II est détaillée ci-dessous :
Page 14
LBMB
La biosynthèse des lantibiotiques :
La nisine est le lantibiotique la plus caractérisé et étudié. Pour cela, nous allons
détailler sa biosynthèse. En général, la biosynthèse de la nisine, comme celle des autres
bactériocines de cette classe, se déroule en trois étapes (figure 2) : la formation des acides
aminés inhabituels (les modifications post traductionnelles), l’organisation en structure
cyclique de la prénisine et le clivage et le transport vers l’extérieur. Ces derniers sont assurés
par le système de transport (le transporteur ABC dépendant).
La nisine étant la bactériocine la plus utilisée en industrie agroalimentaire, nous avons choisi
de présenter sa biosynthèse en détaille.
Le gène de structure est appelé Nis, il code pour un prépeptide de 23 à 30 acides
aminés, qui sera clivé à l’extérieur de la cellule. Mais avant, il subira des modifications posttraductionnelles : les serines et les thréonines seront déshydratés par une déshydratase,
formant ainsi des acides aminés inhabituels (déhydroalanines et déhydrobutyrines). Ces
derniers établiront une structure cyclique, par des ponts thioéther, avec les cystéines proches,
à l’aide d’une cyclase codée par les gènes NisB et NisC ou le gène NisM.
Le transport du prépeptide est assuré par le gène de structure, qui sera clivé par une
protéase NisP ou par le domaine protéasique (figure 3) du système transporteur ABC, le NisT
(Mc Auliffe et al., 2001).

La régulation de la production se fait par le système « Quorum sensing »
(Kleerebezem, 2004), qui possède deux composantes, une histidine kinase NisK, et un
régulateur de réponse NisR. La première composante phosphoryle la deuxième, sous l’effet
d’un stimulus extérieur. Le régulateur de réponse phosphorylé, stimule l’expression de
l’Opéron. Le stimulus extérieur est la nisine elle-même, on parle d’une autorégulation
(Kleerebezem, 2004).

L’immunité de la souche productrice est assurée par quatre gènes NisI, NisF, NisE et
NisG. Stein et al. (2003), ont suggéré que le NisI est une lipoprotéine, qui en interagissant
avec la nisine, empêche cette dernière à former des pores, alors que le NisF, NisE et NisG
(transporteur ABC) exportent les nisines, qui ne sont pas liées avec la lipoprotéine.
Page 15
LBMB
Figure 2 : Régulation de la production, modifications post-traductionnelles et auto-immunité
de la nisine, (Patton et al., 2005)
NisA : prépeptide
NisB : déshydtratase
NisC : cyclase
NisT : l’ABC transporteur
NisP : la protéase
NisK : l’histidine kinase
NisR : le régulateur de réponse
NisI : la lipoprotéine d’immunité
NisG, NisE et NisF : l’ABC transporteur.
Figure 3 : ABC-transporteur avec le domaine protéasique, (Patton et al., 2005)
ABC : cassette ATP dépendante
La biosynthèse des bactériocines de classe II :
Les bactériocines de cette classe, sont synthétisées sous forme d’un prépeptide, ce
prépeptide ne contient pas des acides aminés inhabituels, il n’est pas biologiquement actif. Il
sera transporté à l’extérieur après le clivage de son peptide leader et la formation des ponts
disulfure (Ennahar et al., 2000 ; Drider et al., 2006). Les bactériocines de la sous classe IIa
ont intéressé de nombreux chercheurs, du fait de leurs propriétés physico-chimiques et leur
activité anti-Listeria. Pour cela, nous allons détailler la biosynthèse de la sous classe IIa.
L’entérocine P produite par Enterococcus faecium P13 est une bactériocine appartenant à la
classe IIa (Cintas et al., 1997).
Page 16
LBMB
Certaines bactériocines de cette sous classe sont sécrétées par une voie appelée « la voie
sec-dependent » (Keyser et al., 2003). La sécrétion de la bactériocine se fait par une
translocation du peptide à travers un pore formé par plusieurs protéines, le peptide leader
est une séquence spécifique des protéines synthétisées par cette voie, il sera clivé lors de
l’exportation à l’extérieur.

Une autre voie de biosynthèse, généralement utilisée par les bactériocines de la
classe IIa fait appelle au système GSP : voie générale de sécrétion (figure 4), contenant
deux protéines distinctes : ABC transporteur et une protéine accessoire, La protéine
accessoire est ancrée vers la membrane extérieure de la cellule, alors que le ABC
transporteur est ancré dans la membrane vers l’intérieur de la cellule.

La régulation de la biosynthèse des bactériocines de la classe IIa, fait appelle à un
système « Quorum sensing » à 3 composantes : une protéine d’induction, une histidine
kinase et un régulateur de réponse, ces protéines sont co-transcrites.

La protéine d’induction est le prépeptide contenant un peptide leader de type double
glycine (GG), il sera clivé lors de son transport par le système ABC, le peptide leader
interagit avec l’histidine kinase et active le régulateur de réponse afin de stimuler les
gènes de structure, on parle d’une auto-induction (Drider et al., 2006).

L’immunité de la souche productrice de la bactériocine de classe IIa, se manifeste
par une immunité dite « immunité croisée ». Elle est plus spécifique par rapport à
l’immunité des souches de bactériocines de classe I. En effet, il n’existe pas de similarité
entre les protéines d’immunité de la classe IIa et les bactéries productrices de ces
bactériocines sont partiellement protégées contre les autres bactériocines de classe IIa.
Ceci indique que les protéines d’immunité n’appartiennent pas forcément au même gène
de structure (Quadri et al., 1994). Ces protéines sont composées de 88 à 114 acides
aminés, et sont ancrées dans la membrane cytoplasmique. Les protéines d’immunité
interagissent avec une protéine membranaire, en empêchant l’insertion de la bactériocine
(indirectement), afin de former les pores.
Page 17
LBMB
Figure 4: Schéma de la biosynthèse de la production des bactériocines de la sous classe IIa,
montrant: la régulation, la synthèse, le transport et l’immunité (Ennahar et al., 2000).
La biosynthèse des bactériocines varie d’une classe à une autre, sa complexité dépend
de la composition chimique de cette molécule. La biosynthèse des bactériocines de classe III
est plus complexe, ces bactériocines ont une structure tridimensionnelle d’une protéine à
poids moléculaire, qui peut atteindre les 30 KDa. La biosynthèse des bactériocines de la
classe IV nécessite la liaison des composés lipidique ou des composés glucidique au
prépeptide pour sa fonction biologique.
Dans cette partie, nous avons vu la machinerie de biosynthèse des bactériocines les
plus étudiées, qui incluent la production du prépeptide, son transport au milieu extracellulaire,
son activation par clivage du peptide leader et l’immunité de la souche productrice. Nous
avons choisi deux classes des bactériocines, qui ont été largement étudiées. Il s’agit de la
classe I, dont la nisine fait partie et de la classe IIa, pour la propriété anti-Listeria.
1.4.4 Le mécanisme d’action des bactériocines
Il varie d’une classe à une autre, en général, les bactériocines interagissent avec la
membrane cytoplasmique de la cellule hôte. Le mode d’action des bactériocines, peut être
bactéricide ou bactériostatique, déterminés respectivement par la mort cellulaire ou
Page 18
LBMB
l’extension de la phase logarithmique, de la cellule sensible. Nous présenterons dans ce
chapitre le mécanisme d’action des bactériocines de classe I et de classe II :
 Les lantibiotiques :
Ils interagissent soit par des interactions électrostatiques, soit par liaison au précurseur
du peptidoglycane, le lipide II (un récepteur spécifique), cette liaison va permettre la
formation des pores. Le maintien de ces derniers, au niveau membranaire, empêche la
régénération de la paroi cellulaire (Dortu et Thonart, 2009) (figure 5). La formation des pores
cause l’efflux des petits composés intracellulaires, comme les ions et les acides aminés. Cet
efflux provoque le déséquilibre de la force proton motrice, de part et d’autre de la membrane,
l’arrêt des fonctions cellulaire et la mort de la cellule (Patton et al., 2005).
Figure 5 : Mécanisme d’action par la formation de pores des lantibiotiques.
(Breukink et de Kruijff, 2006)
(1) : le rapprochement du lantibiotique de la membrane plasmique de l’hôte.
(2) : l’adsorption du lantibiotique au lipide II.
(3) : la formation du pore.
(4) : la structure complexe du pore formée par 8 molécules de nisine et 4 lipides II, générant un pore (2nm).
 Les bactériocines de classe II
L’action des bactériocines de la classe II se fait généralement, par l’adsorption à la
membrane, son insertion et la formation des pores.
Page 19
LBMB
La sous classe IIa est, largement, étudiée, pour son efficacité contre Listeria. Son
action commence par des liaisons électrostatiques entre la bactériocine et la membrane.
La nature cationique des bactériocines de cette sous classe et la nature hydrophile de la
partie N terminale, se conjuguent avec la partie anionique (tête du phospholipide). Dans
un 2ème temps, des interactions hydrophobes se produisent entre la partie amphiphile des
chaines acyl lipidiques (la queue du phospholipide) et la partie C terminale de la
bactériocine (hydrophobe).
Il a été démontré que la formation des pores, nécessite l’intervention de plusieurs
molécules de bactériocines qui s’agrègent (figure 6). Contrairement aux lantibiotiques, la
perte de l’ATP n’est pas due à son efflux (la taille des pores est relativement faible), mais
est due à sa consommation excessive pour régénérer la force proton motrice et/ou à
l’incapacité de la cellule à produire l’ATP suite à l’efflux des phosphates.
Positionnement de la bactériocine
(1) Reconnaissance d’un récepteur
Spécifique
(La sensibilisation
des cellules)
Réorganisation et insertion
Agrégation
(2) Interaction électrostatique
Non Spécifique
(Des cellules
susceptibles)
(3) Interaction hydrophobique
(4) La formation d’un pore
Efflux et perte des composantes
intracellulaire
Augmentation de la liaison à ce site
Réorganisation et
insertion
Figure 6 : Schéma du mode d’action des bactériocines de la classe IIa (Ennahar et al., 2000).
1.5 Caractéristiques et applications industriels des bactériocines
Les bactériocines offrent de multiples avantages pour une utilisation saine, dans
différents domaines. Cependant le domaine d’utilisation le plus exploité, est la
bioconservation.
Page 20
LBMB
 Caractéristiques des bactériocines des bactéries lactiques
Grâce aux caractéristiques des bactériocines des bactéries lactiques, plusieurs
avantages ont été décrits. Gàlvez et al. (2007) ont noté les propriétés suivantes, elles :

Sont des substances, qui ne présentent, aucun danger.

Ne sont pas toxiques pour les cellules eucaryotes.

Sont inactivées par des protéases digestives, et n’influent pas significativement sur
la flore intestinale.

Sont tolérantes à des pH acides ou basiques et à des températures élevées.

Possèdent un spectre d’action plus ou moins large, contre des bactéries
pathogènes et/ou d’altérations.

Montrent un mode d’action bactéricide en agissant sur la membrane
cytoplasmique.

Sont codées par des gènes souvent plasmidiques, permettant leurs manipulations
génétiques.
 Applications industriels des bactériocines
Les bactériocines sont utilisées comme bioconservateurs sous une forme purifiée ou
partiellement purifiée.
Beaucoup d’études ont montré que la bactériocine semi-purifiée est plus efficace in
vitro que la bactériocine purifiée, néanmoins, les préparations partiellement purifiées peuvent
contenir d’autres métabolites (acide lactique) et d’autres composés comme les protéines
(Gàlvez et al., 2007).
Le domaine agroalimentaire : Les produits altérés par les microorganismes
pathogènes et d’altération, constituent une perte économique considérable. L’amélioration de
la conservation et de la qualité du produit fini, est un défi majeur des industriels
agroalimentaires. L’application des bactériocines comme bioconservateurs permet d’offrir les
bénéfices suivants (Thomas et al., 2000) :
Page 21
LBMB

Une extension de la durée de vie des aliments.

Une protection durant les traitements thermiques.

Une diminution des risques de contamination par les bactéries pathogènes durant
la chaine de production.

Une diminution de la perte économique causée par les microorganismes
d’altération.

La réduction de l’ajout des conservateurs chimiques.

La mise au point de nouveaux aliments avec moins d’acide et de sels, et contenant
plus d’eau.

Une meilleure préservation des aliments et qu’ils soient riches en vitamines et en
qualités organoleptiques.

Satisfaire l’industriel et le consommateur.
Pour cela, l’aliment peut être supplémenté par une préparation de bactériocines (ex
situ), ou par l’ajout directement de la souche productrice qui sera mise dans les conditions qui
lui permettront de produire la bactériocine (In situ) (Schillinger et al., 1996 ; Stiles, 1996).
Dans l’application ex situ, la bactérie productrice est cultivée (dans un fermenteur industriel)
dans un milieu contenant du lait ou du lactosérum. La bactériocine peut être additionnée sous
forme purifiée ou semi-purifiée. Cependant plusieurs facteurs peuvent influencer l’efficacité
de la bactériocine dans les aliments (tableau 3).
Tableau 3 : Facteurs influençant l’activité de la bactériocine dans l’aliment (Gàlvez et al.,
2007).
influence sur l’activité de la bactériocine
Facteurs


L’aliment





La flore de l’aliment




Les bactéries
indésirables




Conditions de la fabrication de l’aliment.
Température de stockage.
pH de l’aliment, et sa variation.
Inactivation par les enzymes de l’aliment.
Interaction avec les ingrédients de l’aliment.
Instabilité durant la durée de vie de l’aliment.
Diversité des microorganismes.
La charge microbienne.
Sensibilité à la bactériocine.
Interaction avec la flore de l’aliment.
La charge microbienne.
Sensibilité de la bactériocine.
Etat physiologique.
Protection par les barrières physico-chimiques (biofilms).
Développement de la résistance.
Page 22
LBMB
La technologie de préparation de la bactériocine sous forme immobilisée, dans des
microsomes, permet un bon rendement. Ces microsomes sont des réservoirs, qui assurent la
diffusion, au fur et à mesure du concentré de la bactériocine. Ils permettent de protéger les
bactériocines contre les protéases et les inactivations dues aux interactions avec l’aliment.
L’immobilisation de la bactériocine 32Y produite par Lactobacillus curvatus dans un film de
polyéthylène, la rend plus active contre Listeria monocytogenes (Mauriello et al., 2004).
L’application directement de la souche productrice de bactériocine dans l’aliment,
offre plus d’avantages par rapport, à son emploi ex situ du point de vue de son efficacité et du
coût. Pour cela, beaucoup d’auteurs ont étudié la sélection et le développement des bactéries
bactériocinogènes pour une application alimentaire (Ross et al., 2000 ; Leroy et al., 2006). La
souche bactériocinogène peut être utilisée dans un ferment, en coculture ou comme culture
protectrice pour les aliments non fermentés.
La bactérie bactériocinogène utilisée en tant que ferment, doit être capable de réaliser
la fermentation des aliments et de produire la bactériocine.
L’utilisation de la bactérie bactériocinogène en coculture ne doit pas influencer la
physiologie du ferment.
L’ajout d’une culture protectrice, de bactéries bactériocinogènes permet d’inhiber les
microorganismes pathogènes et d’altération, durant la conservation des aliments non
fermentés. Cette culture peut se développer et produire la bactériocine, durant le stockage de
l’aliment à basse température et/ou durant les conditions de traitements thermiques (Holzapfel
et al., 1995).
En plus, des facteurs qui influencent l’activité de la bactériocine, d’autres affectent sa
production (Gàlvez et al., 2007), (figure 7) :

Une perte spontanée de l’effet inhibiteur de la bactérie.

Une infection par des bactériophages.

Antagonismes des autres bactéries contre la souche bactériocinogène.
 La bactérie productrice de bactériocine n’accomplit pas les propriétés désirées du
ferment.
 Difficultés des manipulations génétiques et du transfert du caractère
bactériocinogène dans les starters souhaités.
 La faible capacité de la souche à produire la bactériocine dans la matrice de
l’aliment.
Page 23
LBMB
Structure de l’aliment
et la capacité tampon.
Composition de
l’aliment (nutriments,
ingrédients, additifs).
Procédure de production.
La souche bactériocinogène
 La capacité à s’implanter et à proliférer
 Adaptation à l’environnement de l’aliment.
 Sensibilité aux facteurs environnementaux
(conservateurs, phages, bactériocines).
 Production de bactériocine (induction, taux
de production, stabilité du caractère).
 Stabilité de la bactériocine
La bactériocine
Activité dans l’aliment.
Interactions avec d’autres barrières.
Stabilité du spectre antimicrobien.
Facteurs physicochimiques (pH,
T°C, aw, temps…).
Charge microbienne.
Etat physiologique.
Interactions microbiennes.
Diversité microbienne.
Figure 7 : Les facteurs influençant la production et l’activité de la bactériocine, (Gàlvez,
2007).
L’application des bactéries productrices de bactériocines comme ferments, se fait sur
la base de leur potentiel technologique de réaliser une fermentation. Lactobacillus plantarum
LPCO10 a été inoculée pour l’optimisation de la fermentation des olives vertes (Leal-Sanchez
et al., 2003), cette souche a prédominé la flore des olives et a montré son activité
bactériocinogène.
D’autres qualités peuvent être intéressantes, telles que le potentiel probiotique, la
qualité nutritionnelle et la réduction des additifs chimiques (Settanni et Corsetti, 2008).
Plusieurs applications ont été réalisées dans ce domaine (tableau 4).
Dans le domaine médical : L’utilisation de bactériocines purifiées sous forme
d’antibiotiques peptidiques dans le domaine thérapeutique, est une application prometteuse.
En effet, les antibiotiques montrent de plus en plus leurs limites, vis-à-vis des phénomènes de
résistances, qui ne cessent d’augmenter. Pour cela, l’utilisation des peptides antimicrobiens à
la place de ces ATB, est une alternative prometteuse (Papagianni, 2003).
La nisine a fait l’objet d’une étude dans de nombreuses applications, notamment dans
le domaine pharmaceutique, comme nutraceutiques (un aliment qui présente des propriétés
curatives ou préventives d’une maladie) et cosmétique (Luquet et Corrieu, 2005 ; Colas et al.,
2007). Aranha et al. (2004), ont suggéré le développement d’une alternative contre les
infections vaginales en utilisant la nisine. En médecine, la nisine peut être utilisée pour les
dermatites (Valenta et al., 1996), comme agent thérapeutique dans le traitement des ulcères et
Page 24
LBMB
les infections des colons pour les patients immuno-déficients (Dubois, 1995 ; Kim et al.,
2003).
Tableau 4 : Les bactéries lactiques productrices de bactériocines et les aliments fermentés
associés (Settanni et Corsetti, 2008).
Souche productrice
Bactériocine
Source
Sorgho (blé
égyptien)
Références
Hartnett et al.
(2002)
Enterococcus feacalis T33
Bactériocine T33 et 4
Enterocine 900
Olives noirs
Frank et al. (1996)
Amylovorine L471
Liqueur de maïs
frais
Plantaricine S et T
Olives verts
De Vuyst et al.
(1996)
Jiminez-Diaz et al.
(1993)
Bactériocine KF66
Jus de
pamplemousse
Lactobacillus plantarum 423
Plantaricine 423
Bière de Sorgho
ST194BZ
Lactococcus lactis subsp
cremoris R
Lactococcus lactis BH5
lactis M30
Lactococcus lactis KF30 et
KF31
lactis LJH80 et NCK400
Bactériocines ST194BZ(a)
et ST194BZ(b)
Boza
Lactococcine R
Radis
Lactacine BH5
kimchi
Germes de
haricots
Enterococcus faecium
BFE900
Lactobacillus amylovorus
DCE 471
LPCO10
KF66
Nisine Z
Kelly et al. (1996)
Van Reenen et al.
(1998)
Todorov et dicks,
(2005)
Yildirim et
Johnson, (1998)
Hur et al. (2000)
Cai et al. (1997)
Lactacine 3147
orge
Settanni et al.
(2005)
Nisine
Choucroute
Harris et al. (1992)
Un nouveau domaine médical est en pleine expansion, il s’agit de l’utilisation de la
bactériocine comme une conception rationnelle de médicaments. Arnusch et al. (2008) ont
conçu un hybride nisine-vancomycine, ce dernier est très actif contre les entérocoques
résistants à la vancomycine.
Les différents domaines d’application des bactériocines des bactéries lactiques sont
récapitulés dans la figure 8.
Une application probiotique des bactériocines est envisageable (tableau 5), notamment
pour le système intestinal, pour la cavité buccale, respiratoire et génitale. Comme la
bactériocine de la souche Lactobacillus pentosus et L. jensenii 5L08, qui inhibent la
croissance de Candida albicans, agent des infections vaginales (Aroutcheva et al., 2001;
Kaewsrichan et al. 2006).
Page 25
LBMB
Tableau 5 : l’utilisation probiotique des bactériocines des classe I et II (Gillor et al., 2008).
Bactériocines
classe I
ABP-118
Bovamine™
Souches
productrices
Lactobacillus
salivarius
UCC118
Lactobacillus
acidophilus
Propionibacterium
freudenreichii
L. acidophilus LB
UN
class II
Pediocine
Pediococcus
acidilactici
Enterocine
Enterococcus
faecium EK13
Souches sensibles
Listeria
monocytogenes
Utilisation probiotique
Prévention des infections
gastriques.
E. coli O157:H7
du colon.
H. pylori, H. felis
préventions des infections
gastriques humaines.
Enterococcus,
L. monocytogenes,
Klebsiella,
Pseudomonas,
Shigella
Salmonella
dusseldorf SA13,
E. coli,
Clostridia sp.
préventions des infections
gastriques humaines.
Références
Corr et al.
(2007)
Brashears et
al.(2003a);
Brashears et al.
(2003b)
Coconnier et al.
(1998);
Michetti et al.
(1999)
Speelmans et
al. (2006)
Réduire les infections des
cailles japonèses (poultry)
Laukova et al.
(2003)
gastriques (lapins)
Laukova et al.
(2006)
Médecine
humaine
Transformation
des aliments
Médecine
vétérinaire
Application des
bactériocines des bactéries
lactiques
Conception
rationnelle de
médicaments
Ingrédients
alimentaires
Figure 8 : Différents domaines des applications des bactériocines des bactéries lactiques
(Leblanc, 2010).
Dans d’autres domaines : toujours pour lutter contre les microorganismes d’altération.
Par exemple dans la fabrication du bioéthanol, qui se fait dans des conditions non stérile,
grâce à des microorganismes qui convertissent la source de carbone en éthanol. Cependant, la
présence de contaminants peut dévier le métabolisme désiré. L’utilisation des antibiotiques
n’a pas donné de bons résultats, face aux problèmes des biofilms et de résistance des bactéries
Page 26
LBMB
d’altération (les bactéries acétiques). Plusieurs études ont adoptées l’utilisation des
bactériocines pour lutter contre ces microorganismes (Muthaiyan et al., 2010).
Dans cette partie, nous avons évoqué les différentes applications des bactériocines des
bactéries lactiques. Elles sont utilisées pour lutter contre le développement des
microorganismes d’altération et/ou pathogènes. Cependant, ces applications peuvent
nécessiter des étapes d’optimisation de production. C'est-à-dire, mettre la souche
bactériocinogène dans les conditions optimales, qui lui permettent une production plus
intéressante de bactériocine.
1.6 Optimisation de la production de bactériocine
La production des bactériocines par les bactéries lactiques a été étudiée par de
nombreux chercheurs. Il est connu, que la production de bactériocines par les bactéries
lactiques, peut être influencée par le pH, la composition du milieu de culture, la température
d’incubation, la taille de l’inoculum, la densité cellulaire et
d’autres facteurs
environnementaux (Eijsink et al., 2002 ; Strompfovà et Laukovà, 2007). Ces facteurs peuvent
influencer
fortement
la
synthèse
de
la
bactériocine.
Pour
plusieurs
bactéries
bactériocinogènes, différentes optimisations ont été décrites. Les optimisations mentionnées
dans la littérature, peuvent être réalisées selon trois axes :

Les conditions de stress peuvent stimuler la production de bactériocine.

L’optimisation de chaque ingrédient du milieu de croissance des bactéries lactiques.

L’ajout d’un milieu riche dans le milieu de croissance de la bactérie
bactériocinogène (notamment, l’ajout du lait).
Ces trois axes, ont été largement discutés par de nombreux auteurs. Les bactéries
productrices de bactériocines ne répondent pas de la même manière, vis-à-vis d’une même
méthode d’optimisation.
Pour le premier cas, de nombreuses bactéries lactiques ont été mises dans des
conditions de stress afin de stimuler la production de la bactériocine. Des travaux ont
démontré, que les stress influencent la croissance bactérienne, mais, stimulent souvent la
production de bactériocine. La production de la bactériocine par Lactobacillus pentosus B96
est stimulée à 22°C d’incubation (Delgardo et al., 2005). Une forte aération (oxygénation ≥
1ml/min), ne permet pas une bonne croissance, mais stimule la production de l’amylovorine L
par Lactobacillus amylovorus DCE (Neysens et De Vuyst, 2005). Une production maximale
de la bactériocine synthétisée par Lactobacillus animalis C060203, est stimulée en présence
Page 27
LBMB
d’EDTA (1%) et de 0,5% de SDS (Chen et Yanagida, 2006). Dans d’autre cas, le stress est
réalisé en inoculant en coculture, une souche dite « inductrice » avec la souche productrice de
bactériocine, Ruiz-Barda et al, (2009) ont stimulé la production de bactériocine par
Lactobacillus plantarum NC8, en l’inoculant en coculture avec une souche « inductrice »
comme Enterococcus faecium 6T1a-20 et Pediococcus pentosaceus FBB63. L’alcool, les
détergents, le sel (conditions de stress pour la croissance bactérienne) à fortes concentrations,
peuvent stimuler la production de bactériocine, 5 à 10 g/l de sel dans le milieu de culture de la
bactérie, Lactobacillus acidophilus IBB 801 stimule la production de l’acidophiline 801
(Zamfir et Grosu-Tudor, 2009).
D’autres chercheurs ont stimulé la production de la bactériocine en modifiant et/ou
augmentant la concentration des ingrédients du milieu de culture. Ces auteurs ont observé
qu’une bonne croissance bactérienne permet une bonne production de bactériocine. Pour la
plus part des cas, les sources de carbone, d’azote, de potassium, l’utilisation de milieux
tamponnés et de vitamines, et autres éléments, ont stimulé la croissance bactérienne, et par
conséquent, la production de bactériocines. Le tableau 6 résume des exemples d’optimisation
des milieux de culture réalisés, pour stimuler la croissance bactérienne et la production de
bactériocine.
Pour d’autres cas, la stimulation de la production de bactériocine était dans un milieu
de culture riche en éléments, notamment le lait, le lactosérum, jus de datte…etc. Certains
travaux, citent que l’emploi du lait, dans un milieu de culture, stimule fortement la production
de bactériocine. Zhang et al. (2010) ont obtenu la plus grande activité inhibitrice de la
bactériocine produite par Lactobacillus fermentum F6 dans 10% de lait écrémé reconstitué.
Alors que, Faustino Jozala et al. (2004) ont optimisé la production de la nisine par
Lactococcus lactis dans du MRS et du M17 additionnés de 25% de lait.
Page 28
LBMB
Tableau 6 : Milieux de culture non conventionnels pour l’étude de la croissance et de la
production de bactériocines de différentes bactéries lactiques. (Juàrez Tomàs, et al., 2010).
Milieu de
culture
TGE
(Trypticase,
Glucose,
Extrait de
levure)
Composition (g/l)
Optimisation
Trypticase :10; glucose :10;
extrait de levure : 10; MgSO4 :
0,05; MnSO4 : 0,05; Tween80 : 2
pH :6,5–6,8
Pour la pediocine AcH par les
souches de Pediococcus
acidilactici et la nisine par
Lactococcus lactis W8.
Référence
Biswas et
al. (1991)
Mitra et
al. (2005)
Pour la nisine produite par les
souches Lactococcus lactis
subsp. Lactis, la leuconocine
Lcm1 par Leuconostoc carnosum
et sakacine A par Lactobacillus
sakei LB 706.
Yang et
al. (1992)
Yang et
Ray,
(1994)
Extrait de levure : 10; glucose,
Pour la plantaricine C
sucrose ou fructose :5;
Le milieu BRFS MgSO4_7H2O : 0,05; MnSO4 :
synthétisée par Lactobacillus
0,005; (NH4)2HPO4 :2,5;
plantarum LL441
Tween80 :1.
Pour la sakacine P par
Tryptone:10; extrait de levure:10;
Milieu
Lactobacillus sakei CCUG
glucose: 30; MgSO4_7H2O: 0,02;
MnSO4_H2O: 0,05; KH2PO4: 2,7;
complexe
42687
Tween 80: 1.
Soybean peptone : 4,5; extrait de
Pour la nisine produite par
levure :10; sucrose : 10;
Milieu optimisé MgSO _7H O : 0,2; KH PO :28,42
Lactococcus
lactis ATCC 11454
4
2
2
4
NaCl : 2; pH :6,8
Tryptone:10; extrait de levure: 12;
Milieu de
Pour l’amylovorine L471 de
Lab Lemco:5; maltose: 10;
fructose: 10;
cysteine/HCl: 0,5;
culture à base
Lactobacillus amylovorus
MgSO4_7H2O: 0,2; MnSO4_H2O:
de levain
DCE 471
0,05; KH2PO4: 2; Tween80: 1.
Tryptone : 5; extrait de levure: 10;
Pour la production de la nisine
sucrose: 26,8; MgSO4_7H2O : 0,2;
Milieu optimisé
K2HPO4 : 19,1; NaCl: 8,1; acide
par Lactococcus lactis Lac2.
ascorbique : 0,5; Tween80: 3;
pH: 6,5
Les valeurs des ingrédients sont mentionnées en g/l, pour le tween80 en ml/l.
Bruno
Barcena et
al. (1998)
TGE tamponné
La même composition que le milieu
TGE, mais additionné de citrate de
sodium : 5; acétate de sodium : 5;
KH2PO4 : 0,5
Moretro et
al. (2000)
Li et al.
(2002)
Leroy et
al. (2006)
Zhoo,
(2008)
Page 29
« Un problème sans solution, est un problème mal posé »
Albert Einstein
LBMB
Matériel & Méthodes
2. Matériel et Méthodes
2.1 Matériel
2.1.1 Souches bactériennes
Nous avons utilisé 25 souches lactiques pour la réalisation de cette étude. Ces souches
ont été isolées de différents biotopes et identifiées au Laboratoire de Biologie des
Microorganismes et Biotechnologie (LBMB) à l’Université d’Oran (voir le tableau n°7).
Tableau 7 : les différentes souches utilisées, leur origine et identification.
Souches
Origines
identification
LVK11, LVK30, LVK31, LVK32
Lait de vache (El-Kerma)
(Karam, 1995)
Lactobacillus sp.
Lactobacillus brevis
CHTD27
CHTD29
Lait de chamelle cru (Tindouf)
(Belkheir, 2004)
Lactobacillus
cellobiosus
BH14
Lait de chamelle (Illizi)
(Bounoua, 2005)
Lactobacillus
plantarum
CHBK 309, CHBK310, CHBK311,
CHBK312, CHBK314, CHBK315,
CHBK326, CHBK327.
Lait de chamelle (Bechar)
(Kalbaza, 2010)
Leuconostoc
mesenteroides subsp
dextranicum.
CHM9, CHM18, CHM19
Lait de chamelle (Mauritanie)
(Cheikh, 2008)
Lactobacillus sp.
Blé fermenté (Relizane)
(Bouziani et Sebbaha, 2006)
Lactococcus lactis
H2.3
2.1.2 Milieux de culture
Le milieu de culture, utilisé pour toutes les souches lors de la réalisation de cette étude
est le milieu MRS (Man, Rogosa et Sharpe, 1960).
Le milieu Mayeux grâce auquel la vérification de l’identité des souches appartenant au
genre Leuconostoc et plus précisément à l’espèce
Leuconostoc mesenteroïdes subsp
dextranicum, a été utilisé car il permet la visualisation de la production de dextranes.
Page 31
LBMB
La composition des deux milieux est présentée en annexe 2.
2.2 Méthodes
2.2.1 Vérification de la pureté des souches et leur appartenance au groupe lactique
La pureté des souches est vérifiée par un triple repiquage successif d’une colonie
ensemencée par la méthode d’épuisement de charge (méthode des quadrants).
Par la suite, un examen macroscopique est effectué en décrivant la couleur, l’aspect et
la forme des colonies.
Un examen microscopique après coloration de Gram d’une colonie (voir annexe 2), a
été réalisé afin de déterminer la forme des cellules, leur mode d’association et le type Gram.
Les bactéries lactiques sont Gram positives.
L’appartenance des souches au groupe lactique est aussi vérifiée par le test de
l’activité catalasique, en déposant une goutte de peroxyde d’hydrogène (H 2O2) sur une
colonie, l’effervescence de la suspension indique que la bactérie est catalase positive,
l’absence de réaction montre qu’elle est catalase négative.
Généralement, les bactéries lactiques sont à catalase négative.
2.2.2 Conservation des souches
La conservation des souches peut être de courte ou de longue durée :
 Une conservation de courte durée se fait par ensemencement d’une colonie sur une
gélose solide inclinée, après incubation à 30 °C pendant 24 h, les géloses sont conservées à
4°C pour quelques semaines (Font de Valdez, 2001).
 Une conservation de longue durée, quelques années (Font de Valdez, 2001), est faite
par un ensemencement d’une colonie soit dans un milieu liquide additionné de glycérol (v/v)
à 40%, soit dans du lait écrémé (10%). Après incubation, on conserve les cultures à -20 °C.
Page 32
LBMB
2.2.3 Mise en évidence des interactions négatives
Deux types de méthodes sont utilisés, direct qui repose sur un contact cellulaire et
indirect qui consiste à tester des surnageants de cultures sur des cellules bactériennes.

Méthode directe : Fleming et al. (1975)
Les souches à tester pour leur pouvoir inhibiteur sont ensemencées en touches (à l’aide
d’un inoculateur multipoint) sur la surface du milieu MRS solide. Après une pré-incubation à
30 °C pendant 18 h, on coule 7 ml de gélose molle MRS préensemencée avec 500 µl d’une
culture bactérienne jeune (indicatrice du pouvoir inhibiteur).
Après une incubation de 24h, on mesure le diamètre des halos clairs apparus autour des
souches ensemencées en touches.
Par ce test, toutes nos souches ont été testées comme inhibitrices et comme indicatrices, sauf
H2.3, elle est utilisée seulement comme indicatrice.

Méthode indirecte : Méthode de diffusion en puits : Schillinger et Lücke (1989)
Cette méthode permet de détecter les inhibitions dues à des agents inhibiteurs sécrétés
dans le milieu de culture des souches inhibitrices. En effet, elle permet de tester les
surnageants de culture.
Cette méthode consiste à couler 7 ml de MRS gélose molle en surfusion contenant 500
µl d’une jeune culture de la bactérie indicatrice, sur une gélose solide stérile, après
solidification, des puits sont creusés à l’aide d’une cloche de Durham stérile. Un volume de
surnageant est mis dans ces puits, après diffusion pendant une nuit à 4°C, on incube à 30°C
pendant 24h.
Pour l’obtention des surnageants :
On ensemence le milieu MRS liquide à 5% d’inoculum de la bactérie inhibitrice après
incubation à 30°C pendant 18 à 20h, le surnageant est récupéré par 2 centrifugations des
cultures à 5000 rpm pendant 15 min.
Des zones claires autours des puits indiquent que le surnagent contient des substances
inhibitrices.
Page 33
LBMB
Cette méthode a été testée avec les surnageants des souches ayant montré un pouvoir
inhibiteur par la méthode de Fleming et al. (1975). Les souches indicatrices ont aussi été
déterminées grâce à la même méthode.
2.2.4 Production d’agents inhibiteurs dans différents milieux
Pour obtenir une meilleure répétabilité et reproductibilité des résultats, nous avons
réalisé des tests dans du MRS additionné de lait et d’extrait de levure.
Ce test a été réalisé selon la méthode de Schillinger et Lücke (1989). Les surnageants testés
ont été obtenus par culture des souches inhibitrices dans les milieux suivants :

MRS + 2,5% d’extrait de levure : MRSY (Benkeroum, 2000).

MRSY tamponné : MRSY Tp (le tampon Na2/K), 0,2 M, pH7,0 est utilisé, (voir
annexe 2).

MRSY + 25 % de lait écrémé (10%) (Faustino Jozala et al., 2004).

MRSY Tp + 25 % de lait écrémé.
Nous avons ensemencé à 5% d’inoculum à chaque fois et incubé à 30°C pendant 20h.
La lecture des résultats a consisté à faire la comparaison des effets inhibiteurs des surnageants
de culture obtenus avec les différents milieux. Comme témoin, nous avons utilisé un
surnageant obtenu après culture dans le MRS.
2.2.5 Caractérisation des agents inhibiteurs
Les bactéries lactiques sont capables d’inhiber d’autres bactéries du même groupe ou
d’autres genres par la production d’un grand nombre d’agents inhibiteurs. Parmi lesquels nous
pouvons citer principalement les acides organiques (acide lactique), le peroxyde d’hydrogène
ou les bactériocines.
2.2.5.1 Inhibition par production des acides organiques
La production des acides organiques par les souches lactiques est parmi les causes
majeures d’inhibition des bactéries, pour éliminer l’effet de ces acides sur les bactéries
indicatrices, un milieu tamponné à pH 7 est utilisé.
Nous avons testé l’effet inhibiteur dans du MRS (gélose dure et gélose molle)
tamponné avec Na2/K à 0,2 M, pH7,0 (voir annexe 2) par la méthode de Fleming et al.
(1975). Du MRS non tamponné a été utilisé comme témoin.
Page 34
LBMB
La lecture des résultats consiste à comparer les zones d’inhibition obtenues dans les milieux :
MRS tamponné et MRS non tamponné.
2.2.5.2 Détermination des inhibitions dues à la production du peroxyde d’hydrogène ou
des bactériocines
Le peroxyde d’hydrogène est un agent inhibiteur dont l’effet peut être levé par la
catalase. De la même manière les bactériocines, qui sont des substances protéiques, sont
dégradées par des enzymes protéolytiques (Klaenhammer, 1993). Les bactéries lactiques
secrètent les bactériocines et le peroxyde d’hydrogène dans le milieu extracellulaire d’où
l’intérêt de rechercher ces substances dans les surnageants de culture.
Pour cela nous avons utilisé la méthode de Schillinger et Lücke (1989) afin de tester
des surnageants de culture traités avec différentes enzymes.
Nous avons incubé les surnageants de culture actifs pendant 2 heures, en présence des
enzymes suivantes : pepsine, trypsine, pronase E et la catalase à une concentration finale de 2
mg/ml (Cocolin et al., 2007). Les surnageants de culture ont été traités à 100°C pendant 2 min
(Ivanova et al., 1998), afin d’inactiver les enzymes, puis testés.
Les enzymes ont été préparées dans des solutions tampon :
- Tampon de sodium à 0,1 M Na2/Na, pH7,0, pour les enzymes trypsine, pronase E et la
catalase (voir annexe 2).
- 0,05 M d’acide citrique à pH2,0 (voir annexe 2) pour la pepsine (Xiraphi et al., 2005).
La lecture des résultats consiste à faire la comparaison entre l’effet inhibiteur des
surnageants traités aux enzymes et un surnageant non traité. Une levée d’inhibition en
présence de catalase signifie que l’agent inhibiteur est le peroxyde d’hydrogène alors que dans
le cas des enzymes protéolytiques il s’agit d’un agent protéique c’est à dire une bactériocine.
2.2.6 Optimisation de la production et/ou de l’activité d’une bactériocine
L’effet de chaque constituant du milieu MRS sur la production de bactériocines, a été
étudié par Leroy et De Vuyst (2003), Todorov (2008), ainsi que d’autres chercheurs, qui ont
pu démontrer une très grande différence selon les ingrédients et leurs concentrations.
Page 35
LBMB
L’optimisation de l’effet inhibiteur de la bactériocine consiste à maîtriser les facteurs
qui influencent sa biosynthèse et son activité. Parmi les facteurs étudiés : La composition du
milieu, la température d’incubation de la souche productrice, la diffusion de la bactériocine à
travers la gélose,… etc.
Remarque : La lecture du résultat pour toute l’étude de ces effets consiste à comparer les halos
d’inhibition. Un halo de diamètre plus important qu’un autre reflète une production plus
intéressante de bactériocine dans un milieu bien défini et sera utilisé pour l’étude de l’effet
suivant.
2.2.6.1 Effet de la composition du milieu sur la production de bactériocine
En nous basant sur les références, (Todorov et Dicks, 2004; Todorov, 2008), Nous
nous sommes intéressés aux sources d’azote, de carbone et de potassium.
Cette étude a été réalisée selon la méthode de Schillinger et Lücke (1989) et nous avons
utilisé comme témoin, pour chaque étape, des surnageants obtenus par culture de la souche
productrice de bactériocine en milieu MRS modifié de l’étape précédente. Le milieu qui sera
retenu à la fin de cette optimisation sera constitué par les concentrations optimales des
ingrédients testés.

Effet de la source d’azote
La bactérie bactériocinogène est ensemencée à 5% d’inoculum dans 100 ml de MRS
(témoin) et de MRS dont la source d’azote (c à d la peptone, l’extrait de viande et l’extrait de
levure) a été modifiée. Les modifications que nous avons apportées touchent la nature de la
source d’azote ou sa concentration, en retenant comme concentration maximale et globale
2%.
Le MRS a été modifié comme suit :
MRS1 : contient 2% tryptone.
MRS 2 : contient 2% extrait de levure.
MRS 3 : contient 2% extrait de viande.
MRS 4 : contient 1,5% tryptone + 0,5% extrait de levure.
MRS 5 : contient 1,5% tryptone + 0,5% extrait de viande.
MRS 6 : contient 1% tryptone + 0,5% extrait de levure + 0,5% extrait de viande.
Page 36
LBMB

Effet de la source de carbone
La source d’azote, qui a permis d’obtenir le meilleur effet inhibiteur par rapport au
MRS non modifié, a été maintenue pour ce test.
100 ml, de milieu MRS modifié, sont ensemencés avec 5ml d’une culture jeune. Dans
ce cas le glucose (2%) est remplacé par 2% de chacun des sucres suivants : maltose, lactose,
saccharose ou glycérol. Après incubation à 30°C pendant 20h, les surnageants de ces cultures
sont récupérés par deux centrifugations à 5000 rpm pendant 15 min et testés.

Effet de la source de potassium
Le milieu MRS se compose de 2 g/l (0,2%) de K2HPO4, L’effet de ce sel est important
sur la croissance des bactéries lactiques du genre Lactobacillus par rapport au sulfate de
magnésium et au sulfate de manganèse.
Nous voulons étudier l’effet du KH2PO4 ou du K2HPO4 ou l’effet de la combinaison
de ces deux sels sur la production de bactériocine.
Pour cela, 0,2% de K2HPO4 sont remplacés par 1% de K2HPO4, 2% K2HPO4, 2%
KH2PO4 ou par 1% K2HPO4+1% KH2PO4 (Mollendorff et al., 2009) dans le milieu qui a
donné l’effet inhibiteur le plus grand à l’étape précédente.
Les surnageants testés ont été préparés comme suit :
100 ml de chaque milieu modifié sont ensemencés à 5% d’inoculum de la souche inhibitrice
et incubés à30°C pendant 20 h, puis centrifugés deux fois à 5000 rpm pendant 15 mn.
A ce stade, un milieu adéquat pour une production de bactériocine optimale de la souche
sélectionnée, est constitué.
2.2.6.2 L’effet de la température d’incubation
La température d’incubation peut influencer la production de bactériocine (Krier et al
1998). Le milieu contenant les concentrations optimales en source d’azote, de sucre et de
potassium a été utilisé dans ce test. Des flacons de 100 ml de ce milieu ont été ensemencés à
5% d’inoculum et incubés à différentes températures, à savoir : 25°C, 30°C (témoin), 35°C,
40°C et 45°C pendant 20 h.
Page 37
LBMB
Les surnageants obtenus ont été testés par la méthode de Schillinger et Lücke (1989).
2.2.6.3. Effet du pH sur la diffusion de la bactériocine
La diffusion de la bactériocine dans la gélose est un paramètre important qui doit être
maîtrisé afin de bien quantifier l’effet inhibiteur (Blom et al., 1997). En plus du laps de temps
que dure la diffusion à 4°C, lors de la réalisation de la méthode de Schillinger et Lücke
(1989), le pH de la gélose semble être important. En effet la diffusion de certaines substances
comme les antibiotiques semble meilleure à pH neutre (le milieu Mueller hinton utilisé pour
les antibiogrammes est tamponné à pH7).
Pour cela, nous avons essayé d’optimiser la diffusion de la bactériocine, en comparant
la diffusion à travers le film de gélose solide et molle, tamponnée et non tamponnée (témoin).
La méthode utilisée est celle de Schillinger et Lücke (1989).
2.2.7 Production de bactériocine en présence de lait
Par ce test, nous avons voulu pousser l’optimisation encore plus loin, en réalisant
différentes combinaisons des conditions d’optimisation testées précédemment et qui sont :

L’addition de lait.

L’addition de 2,5% d’extrait de levure.

Optimisation de la composition du MRS.

Le pH du milieu de culture des inhibitrices (non tamponné et tamponné).
Le milieu obtenu des optimisations dûment réalisées est nommé MRSm.
Dans cette étude, nous avons utilisé pour la culture de la souche bactériocinogène du
MRSm additionné de lait. Et ceci pour voir si la présence du lait (à 25%) peut augmenter
l’effet inhibiteur de la bactériocine.
Dans ce but, Les surnageants testés par la méthode de diffusion en puits, sont obtenus
par ensemencement à 5% d’inoculum de la souche bactériocinogène dans les milieux MRS,
MRSY et MRSm, en conditions tamponnées ou pas (témoin) en présence de lait ou pas
(témoin).
Après incubation pendant 20h à 30°C, les surnageants de culture sont récupérés et
testés par la méthode de diffusion en puits.
Page 38
LBMB
La lecture des résultats consiste à comparer les diamètres des halos d’inhibition,
obtenues pour tous les cas testés.
2.2.8 Caractérisation physico-chimique de la bactériocine
Certaines propriétés physico-chimiques des bactériocines permettent de donner une
idée sur leur classification. Il s’agit plus particulièrement de la thermorésistance, en effet, les
bactériocines thermosensibles appartiennent à la classe III alors que les thermorésistantes sont
de la classe I ou II (Dortu et Thonart, 2009).
De ce fait, des surnageants de culture des souches bactériocinogènes ont été traités
pour étudier l’effet de différents paramètres physico-chimiques sur l’activité de la
bactériocine (la température, l’acidité ou la basicité).
Pour tous les tests réalisés dans cette partie nous avons utilisé la méthode de diffusion
en puits.

Effet du pH
Nous avons ajusté le surnageant de culture de la souche bactériocinogène à des pH
acides ou basiques : pH 2, 4, 6, 8, 10 ou 12 en utilisant du HCl ou du NaOH à 3N. Puis pour
les doubles de ces échantillons, nous avons réajusté le pH à 7.
Par la suite, ces surnageants ont été testés. Un surnageant natif (dont le pH intial a été
maintenu) a été utilisé comme témoin.
La lecture des résultats se fait par comparaison, de l’effet inhibiteur des surnageants
dont le pH est réajustés et non réajustés avec celui du surnageant natif.

Effet de la température
Pour l’effet de la chaleur sur l’activité des bactériocines, des surnageants de culture
ont été chauffés à 60, 80 ou 100°C pendant 10, 15 ou 20 min et à 120°C pendant 20 min
(autoclavage).
Ces surnageants et un surnageant non traité à la chaleur (témoin) ont été testés par la
méthode de diffusion en puits.
Page 39
LBMB
La lecture des résultats consiste à faire la comparaison entre ceux obtenus avec les
surnageants traités et le surnageant non traité.
2.2.9 Estimation de la quantité de bactériocine produite
Afin d’estimer avec plus de précision la quantité de bactériocine produite dans le
MRSm tamponné. Nous avons réalisé le test suivant :
La quantification de la bactériocine en unité arbitraire par millilitre de surnageant est
réalisée selon la méthode décrite par Pucci et al. (1988) qui se base sur des dilutions « Critical
Dilution Assay » mais adaptée à la méthode de Lücke et schillinger (1989) selon Yanagida et
al. (2005).
Pour ce test nous avons procédé de la manière suivante :
Des dilutions en cascade au 1:2 par le milieu MRSm tamponné ont été effectuées avec le
surnageant d’une culture de 20h à 30°C de la souche inhibitrice, 100 µl de ces dilutions ont
été testés par la méthode de schillinger et Lücke (1989) en utilisant une gélose molle et une
gélose solide tamponnées.
Après l’étape de diffusion et d’incubation, la bactériocine a été quantifiée comme suit :
Une unité arbitraire est définie comme l’inverse de la plus grande dilution montrant une zone
d’inhibition, soit :
AU/ml = (1000/d)*D (Parente et al., 1994)
Où d est le volume mis dans les puits
D est le facteur de dilution.
2.2.10 Cinétique de croissance et de production de bactériocine
Plusieurs auteurs ont montré une relation entre la croissance, et plus précisément la
biomasse, et la production de bactériocines chez les bactéries lactiques.
La cinétique de production peut nous renseigner sur le type de métabolite qu’est la
bactériocine (métabolite primaire ou secondaire) et aussi sur le temps d’incubation nécessaire
pour une production maximale.
Afin d’établir ces deux cinétiques nous avons procédé de la manière suivante :
Page 40
LBMB
Un volume de 200 ml de chacun des milieux de culture suivants : MRS, MRS Tp, MRSm et
MRSm Tp ont été ensemencés à 5% d’inoculum d’une culture jeune de la souche
bactériocinogène.
Puis toutes les 2 heures, un volume de culture était pris, pour établir la courbe de
croissance de la souche inhibitrice et la courbe de production de la bactériocine selon les
méthodes suivantes :

Nous avons suivi la croissance en mesurant la densité optique à 600 nm.

La production de bactériocine a été évaluée par la méthode de diffusion en puits.
2.2.11 L’effet de différents détergents sur l’activité de la bactériocine
Des volumes égaux de surnageants de culture sont additionnés de 1% de : SDS,
tween20, tween80, urée, NaCl, tritonX100 et de 0,1, 2 et 5 mM d’EDTA. Chacun de ces
volumes et un surnagent non traité (témoin) sont testés par la méthode de diffusion en puits.
En parallèle, et aussi comme témoins, des volumes d’eau distillée stérile contenant les
mêmes concentrations en détergents ont été testés, afin de déterminer l’effet du détergent seul
sur la bactérie indicatrice (Albano et al. ,2007).
2.2.12 Purification partielle de la bactériocine
La purification d’une substance quelconque, synthétisée par une cellule vivante, est
une tache difficile à réaliser, du fait qu’elle se trouve dans un milieu complexe. Ce milieu
contient d’autres éléments qui peuvent êtres nécessaires pour son activité.
Nous avons essayé de purifier notre bactériocine en commençant par une
concentration au sulfate d’ammonium, puis un dessalage en utilisant une colonne de Sephadex
G25, enfin nous avons essayé d’estimer le poids moléculaire de la bactériocine par
électrophorèse Tricine SDS-PAGE (Schägger et Von Jagow., 1987)
2.2.12.1 Précipitation au sulfate d’ammonium
La précipitation au sulfate d’ammonium est la technique la plus utilisée pour la
concentration des protéines destinées à la purification, le sulfate d’ammonium (NH 4)2SO4 est
le sel de choix en le comparant à d’autres sels à effet précipitant, il permet de maintenir la
structure de la protéine donc son activité, de plus il est fortement soluble et pas coûteux
(Burgess, 2009).
Page 41
LBMB
Un litre de surnagent d’une culture de 20 h d’incubation à 30°C est récupéré par une
centrifugation à 5000 rpm pendant 15 min à 4°C. Pour ce surnageant on réalise plusieurs
saturations en série.
Nous avons commencé à 40% de saturation pour cela, le sulfate d’ammonium a été
ajouté peu à peu, après incubation à 4°C pendant 24 à 72 heures, deux centrifugations à 5000
rpm pendant 30 min sont réalisées pour récupérer les protéines qui ont précipité à 40%. Quant
au surnageant, il est testé pour une éventuelle activité inhibitrice résiduelle. Le précipité est
récupéré, dans un volume égal au dixième ou au centième du volume initial de surnageant,
dans un tampon K/Na2, 0,2M à pH7,0. La préparation ainsi obtenue est subdivisée en deux
volumes, un petit volume est testé par la méthode de diffusion en puits et le reste est
reprécipité au sulfate d’ammonium à 50% de saturation, et ainsi de suite pour les saturations
de 60, 70 et 80% selon le tableau ci-dessous (Harris, 1989).
Tableau 8 : Quantité de sulfate d’ammonium ajoutée pour les saturations désirées
Pourcentage de saturation
Quantité de (NH4)2SO4 ajoutée
graduellement dans 100 ml
40%
40-50%
50-60%
60-70%
70-80%
22,9 g
5,9 g
6,1 g
6,3 g
6,6 g
A chaque fois, le surnageant est testé pour l’activité résiduelle par la méthode de diffusion en
puits.
2.2.12.2 Dessalement
La précipitation au sulfate d’ammonium conduit à la présence de sel autour de la
protéine précipitée ce qui peut interférer lors de la réalisation de certaines techniques comme
l’électrophorèse. D’où la nécessité d’éliminer toute trace de ces composés des préparations de
bactériocines.
L’élimination des sels de sulfate d’ammonium peut être faite soit par dialyse contre
l’eau distillée soit par chromatographie de filtration sur gel, en utilisant le Sephadex G25
Nous avons opté pour l’utilisation de la chromatographie avec un gel Sephadex G25
pour l’élimination du sulfate d’ammonium (Jiminez-Diaz et al., 1995) ainsi les molécules (les
protéines) de grand poids moléculaire seront les premières à être éluées par rapport aux
Page 42
LBMB
molécules de sels qui seront retardées et descendront les dernières, c’est une méthode de
dessalement plus rapide que la dialyse par exemple.
Nous avons réalisé ce test dans les conditions suivantes :
- Le volume de l’échantillon appliqué est de 25 à 30% du volume du gel, le débit peut
atteindre jusqu’à 200 ml/h (Scopes, 1994) alors que le volume de récolte est de 3% du
volume de gel.
- L’équilibrage de la colonne se fait par passage de 3 fois le volume du gel en tampon
K/Na2 à 0,05M, pH7,0.
- Le lavage de la colonne se fait par une solution de NaOH à 0,2 M + 0,02% d’azide de
sodium (3 fois le volume du gel).
-
Un volume de 13 ml de l’échantillon résultant de l’étape précédente (saturation au
sulfate d’ammonium) est appliqué à une colonne de 45×1,3 cm.
-
L’élution se fait avec le même tampon (3 fois le volume du gel) avec un débit de
2ml/min et des fractions de 1,5 ml sont collectées.
La densité optique de chaque fraction est mesurée à 280 nm. De l’ensemble des
fractions obtenues (appartenant aux pics) et vue leur nombre, nous n’avons testé pour l’effet
inhibiteur qu’une seule sur deux par la méthode de diffusion en puits. Les fractions montrant
une activité seront regroupées.
2.2.12.3 Estimation du Poids Moléculaire par Tricine SDS-PAGE
Cette électrophorèse est destinée aux protéines de poids moléculaire allant de 1 à 100
KDa et préférentiellement aux protéines de poids moléculaire inférieur à 30 KDa.
Nous avons utilisé un gel constitué de 3 gels de concentrations différentes en
acrylamide : Un gel de séparation à 16%, un gel espaceur à 10% et le gel de concentration à
5% (Schägger, 2006).
60 µl d’échantillon préparé avec un tampon de charge (voir annexe 2) sont déposés dans les
puits du gel d’électrophorèse.
Tous les échantillons à tester ont été déposés en double, dans deux parties du gel.
Les échantillons que nous avons choisis pour l’électrophorèse sont les suivants :

des surnageants natifs

des précipités.
Page 43
LBMB
L’électrophorèse a été réalisée à 50V pendant une nuit (l’ajout graduel du voltage permet une
bonne séparation à la fin de l’électrophorèse).
A la fin de l’électrophorèse le gel est divisé en deux parties, dont une sera colorée pour
visualiser les bandes protéiques (bactériocines) et la deuxième partie du gel sera testée pour
l’effet inhibiteur des bandes protéiques en présence de la souche indicatrice.
☞ la partie du gel contenant les marqueurs de taille (lysozyme et nisine à 0,8 mg/ml) est
mise dans une solution de fixation du gel pendant une heure et est colorée par une solution de
coloration au bleu de Coomassie pendant 2 heures et décolorée pendant plus d’une heure,
jusqu’à ce que la décoloration soit complète. Toutes les solutions utilisées sont décrites en
annexe 2.
☞ La deuxième partie du gel est fixée dans une solution de 20% d’isopropanol et 10%
d’acide acétique pendant une heure à deux heures, puis rincée plusieurs fois à l’eau distillée
stérile. On la dépose sur une surface de gélose solide tamponnée, ensuite on coule dessus un
film de gélose molle ensemencé par l’indicatrice (Bhunia et al., 1987). La position de la
bactériocine active est visualisée par une zone d’inhibition, comme décrit par Van Reenen et
al. (1998).
Page 44
« Cherchons comme cherchent ceux qui doivent trouver et trouvons
comme trouvent ceux qui doivent chercher encore. Car il est écrit :
celui qui est arrivé au terme ne fait que commencer.»
Saint Augustin
LBMB
Résultats & Discussions
3. Résultats et Discussion
3.1 Confirmation de la pureté et l’appartenance des souches au groupe lactique
La pureté des souches s’observe par la présence d’un seul type, soit de colonies par
boîte, soit un seul type de cellules en observation microscopique. La réaction négative au
peroxyde d’hydrogène d’une souche, ainsi qu’un type Gram positif permettent de confirmer
son appartenance au groupe lactique.
Toutes les souches sont catalase négatives et de Gram positives. Le tableau 9
récapitule les observations macroscopiques et microscopiques.
Tableau 9 : Caractérisation macroscopique et microscopique des souches.
Les souches
Leuconostoc
mesenteroides
subsp
dextranicum.
Lactobacillus sp
Observations macroscopiques
Colonies rondes à contour
régulier,
de
couleur
MRS
blanchâtre et d’aspect peu
bombé.
Grosses colonies gluantes,
Mayeux envahissantes et
translucides.
LVK11
LVK30
LVK31
LVK32 Colonies rondes à contour
CHM9 régulier,
de
couleur
CHM18 blanchâtre et d’aspect peu
CHM19 bombé.
Lactobacillus
plantarum
BH14
Lactobacillus
brevis
Lactobacillus
cellobiosus
CHTD27
CHTD29
Lactococcus
lactis
H2.3
Grosses colonies à contour
irrégulier, gluantes plus ou
moins plates.
Petites colonies blanchâtres
à contour régulier, à aspect
peu bombé.
Observations microscopiques
Petites cellules de forme
lenticulaire, association en amas
ou en chaînettes.
Cellules de forme cocobacillaire,
isolées
ou
associées
en
diplocoques ou en amas.
Cellules sous forme de bacilles
longs, isolées ou associées en
Chaînettes généralement.
Cellules sous forme de bacilles
courts, isolées ou associées en
diplocoques, en amas ou en
chaînettes.
Petites cellules de forme ronde,
associées en amas.
Ces résultats confirment l’appartenance de toutes les bactéries au groupe lactique.
Page 46
LBMB
3.2 Détection des bactéries inhibitrices
Dans cette partie nous avons réalisé d’une part, une mise en évidence des inhibitions
entre bactéries par contact direct, par la méthode de Fleming et al. (1975), et d’autre part une
analyse de l’effet des surnageants de culture sur des bactéries indicatrices par la méthode de
schillinger et Lücke (1989).
3.2.1 La méthode de Fleming et al. (1975)
Elle permet de réaliser un screening des bactéries antagonistes, cette méthode dite
« directe » permet d’évaluer l’effet antagoniste de souches ensemencées en touches (tests)
contre des souches ensemencées en masse (indicatrices). Chacune des bactéries de notre
échantillon a été testée comme inhibitrice et indicatrice.
Les figures suivantes montrent quelques aspects des résultats observés :
LVK11
CHBK310
3
4
4
3
8
8
7
6
7
6
11
10
14
9
10
11
13
13
16
18
21
5
14
9
LVK11
CHBK315
15
1
5
12
12
2
1
2
17
20
19
22
19
23
24
15
16
18
21
17
20
19
22
19
23
24
Figure 9 : Interactions inhibitrices inter-bactériennes.
1 : CHBK 309, 2 : CHBK310, 3 : CHBK311, 4 : CHBK312, 5 : CHBK314, 6 : CHBK315, 7 : CHBK316, 8 : CHBK318, 9 : CHBK319,
10 : CHBK320, 11 : CHBK323, 12 : CHBK325, 13 : CHBK326, 14 : CHBK327, 15 : CHM9, 16 : CHM18, 17 : CHM19, 18 : LVK11,
19 : LVK30, 20 : LVK31, 21 : LVK32, 22 : CHTD27, 23 : CHTD29, 24 : BH14
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 10 (voir annexe 1).
L’ensemble des résultats observés nous permet de déduire plusieurs remarques :
Page 47
LBMB
Parmi les 532 interactions testées, 484 ont montré des inhibitions, ce qui correspond à
91% du total. Les 9 % restant, correspondent à 48 combinaisons non inhibitrices.
Les deux genres de bactéries lactiques qui constituent notre échantillon n’ont pas eu le
même comportement en effet :
Effet inhibiteur des leuconostocs :
 Le taux des inhibitions, exercées par les leuconostoc, contre les autres bactéries
lactiques est d’environ 77%. Dans un total de 306 combinaisons, 277 sont des
interactions négatives.
 L’effet inhibiteur exercé par les leuconostocs est plus important contre les lactobacilles
(les diamètres ont atteint 1,1 cm) que contre les leuconostocs (diamètre inférieur à 0,8
cm).
 Parmi les inhibiteurs du genre Leuconostoc, 77,42% sont capables d’inhiber des espèces
de Lactobacillus et les halos d’inhibition ont une taille qui varie de 0,6 cm à 1,1 cm.
Parmi les souches ayant présentées les halos les plus grands, nous avons la CHBK318
qui inhibe le lactobacille CHM18 avec un halo de 1,1 cm. Les autres Lactobacilles ne
sont pas inhibés par les leuconostocs.
 Parmi les bactéries qui ont été très peu ou pas du tout inhibées, il y a les souches
CHTD27 et CHTD29. En même temps, ces deux souches ont montré l’effet inhibiteur le
plus grand contre CHM19.
Effet inhibiteur des lactobacilles :
 Les inhibitions exercées par les lactobacilles contre les lactobacilles sont plus
importante par rapport à celle exercées contre les leuconostocs.
 Le taux d’inhibitions des bactéries lactiques par les souches du genre Lactobacillus
représente 91,6%.
 Parmi les Lactobacilles inhibiteurs, 96,2% sont capables d’inhiber des espèces du genre
Leuconostoc. La CHTD27, la CHTD29 et la BH14 inhibent la CHBK312 avec des halos
de 1,4 cm. On note que les souches CHBK312, CHBK315, CHBK316 et CHBK319 ne
sont pas inhibées par CHM19.
 Parmi les souches de leuconostocs indicatrices pour les lactobacilles, la souche
CHBK312 s’avère la plus sensible aux lactobacilles, et parmi les indicatrices
lactobacilles, la CHM19 a été inhibée par tous les lactobacilles en présentant les halos
Page 48
LBMB
d’inhibitions les plus grands. Deux autres souches semblent être de bonnes indicatrices
pour les lactobacilles, il s’agit de LVK30 et LVK31.
Ce résultat n’est pas surprenant, en effet les lactobacilles sont connus pour leur
pouvoir inhibiteur par rapport au Leuconostoc, ceci est noté par plusieurs auteurs. Jensen et
al.,( 2009) ont montré dans leur étude, que les Lactobacilles inhibent la plupart des souches de
leuconostocs utilisées (66,7%) et inhibent peu les espèces de lactobacilles (37%).
Karam et al. (2004), ont observé que les souches de Lactobacillus présentent un grand
effet inhibiteur (82,5%) contre des souches de Lactococcus, utilisées pour leur étude, et que
les lactocoques inhibent peu les lactobacilles (2,3%).
De plus, les lactobacilles sont caractérisés par leur pouvoir acidifiant qui leur permet
de résister à des pH inférieurs à 4. En comparaison, les leuconostocs ne résistent même pas à
des pH inférieurs à 4,5 (Mc Donald et al., 1990, Stiles, 1994). Cette caractéristique fait que
les lactobacilles sont souvent, préférentiellement utilisés comme ferments pour plusieurs
produits fermentés (Cocconcelli et Fontana, 2008).
La méthode de Fleming et al. (1975) permet d’évaluer quantitativement le pouvoir
inhibiteur des souches ensemencées en touches (compétitrices) sur les souches ensemencées
en masse dans la gélose molle. Elle met en évidence les inhibitions dues à la production
d’agents inhibiteurs mais aussi celles qui sont dues à la compétition vis-à-vis des nutriments
ou au contact cellulaire.
L’inhibition causée par le contact est connu chez toutes les cellules des êtres vivants,
cette inhibition n’est due ni à la compétition vis-à-vis des nutriments, ni à la production
d’agents inhibiteurs. L’inhibition par contact cellulaire se fait quand une souche occupe
l’écosystème et ne laisse pousser aucun autre microorganisme.
Todorov et Dicks (2005) ont retenu 9 colonies pour leurs larges zones d’inhibition
parmi 37 colonies montrant des inhibitions, ce même mode de sélection est utilisé par tous les
chercheurs. En se basant sur ce critère de sélection, nous avons retenu pour la suite de notre
travail les souches suivantes :
☞ Comme inhibitrices toutes les souches du genre Leuconostoc, sauf CHBK309 et
CHBK319, car elles présentent le pouvoir inhibiteur le plus faible et comme indicatrices de ce
genre, les souches CHM9, CHM19, LVK11 et H2.3; car leur inhibition par les Leuconostoc
est très importante (les halos d’inhibition ont atteint un diamètre de 1,1 cm).
Page 49
LBMB
☞ Pour le genre Lactobacillus toutes les souches sont retenues comme inhibitrices et
comme indicatrices CHM19, LVK30, LVK31 et CHBK312. Le diamètre de l’inhibition des
lactobacilles exercée sur ces souches a atteint 2,4 cm.
3.2.2 Mise en évidence des inhibitions par la méthode Schillinger et Lücke (1989)
Après avoir détecté les inhibitions par contact direct entre les cellules, nous avons
voulu voir si ces mêmes inhibitions peuvent être observées par utilisation des surnageants de
culture, donc dans le cas d’une absence d’un contact cellulaire entre les souches tests et les
souches indicatrices.
Pour la mise en évidence des agents inhibiteurs, dans les surnageants de culture, par la
méthode de Schillinger et Lücke (1989), nous avons retenu pour chaque genre étudié les
souches ayant présentées le plus grand effet inhibiteur (souches test) et celle qui se sont
avérées les plus sensibles (souches indicatrices) par la méthode de Fleming et al (1975).
Le but de cette méthode, dite « indirecte », est de mettre en évidence l’agent inhibiteur
produit par la bactérie inhibitrice et dont la propriété de diffusion est importante. La diffusion
de l’agent inhibiteur ne laisse pas poussé l’indicatrice tout autour du puits. Le diamètre du
halo peut nous renseigner sur la quantité de l’agent inhibiteur produit et diffusé. Parmi tous
les agents inhibiteurs, les bactériocines sont décrites comme étant des produits très diffusibles
dans les géloses.
Parmi les quatre indicatrices retenues pour les inhibitrices du genre Leuconostoc,
seule la CHM19 était inhibée, la figure 10 et le tableau 11 montrent le résultat obtenu :
1
2
3
5
4
6
7
8
9
Figure 10 : L’effet inhibiteur des surnageants de culture des Leuconostocs contre CHM19.1 :
CHBK 310, 2 : CHBK311, 3 : CHBK312, 4 : CHBK315, 5 : CHBK323, 6 : CHBK325, 7 : CHBK326, 8 : CHBK327, 9 : vide
Page 50
LBMB
Tableau 11 : Inhibitions par les surnageants de culture des Leuconostocs.
S. Indicatrices
S. Inhibitrices
CHBK310
CHBK311
CHBK312
CHBK314
CHBK315
CHBK316
CHBK318
CHBK320
CHBK323
CHBK325
CHBK326
CHBK327
S : souches
LVK11
CHM9
CHM19
H2.3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1,5
2
0
1,2
0
0
0
1,4
1,3
1,1
1,0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Les diamètres des halos d’inhibition sont exprimés en cm.
On peut noter que :
Parmi les leuconostocs testés, seuls 7 sur 12 souches ont montré un grand effet
inhibiteur par leur surnageant de culture contre l’indicatrice CHM19. Ces inhibitions ne sont
pas reproductibles, en effet ces résultats ont été observés seulement dans un essai. Les autres
indicatrices se sont montrées totalement résistantes. Ces inhibitions peuvent être dues
principalement à la production d’acides organiques, de peroxyde d’hydrogène ou de
bactériocines.
Dalache (2006), a noté que le criblage des antagonistes par la méthode de Fleming et
al. (1975), a permet de détecter 53% des inhibitions entre les bactéries lactiques, alors que la
méthode de diffusion en puits n’a permet de visualiser aucune inhibition, et ceci malgré de
nombreuses répétitions. Cet auteur explique ce résultat par la faible quantité d’agents
inhibiteurs produits dans le surnageant de culture. Ce résultat a aussi été observé par
Benmouna (2008), qui a noté que le surnageant de culture des souches inhibitrices n’a donné
aucune inhibition.
Les acides organiques sont connus pour leur grand pouvoir inhibiteur, essentiellement
l’acide lactique, qui est un produit à effet bactéricide et majeur du métabolisme des bactéries
lactiques, contre les bactéries sensibles aux pH bas. Mc Donald et al. (1990) ont constaté que
la production de l’acide lactique par les microorganismes durant la fermentation végétale
permet d’éliminer le développement des souches de Leuconostoc mesenteroïdes.
Page 51
LBMB
Les bactéries lactiques peuvent, dans certaines conditions, accumuler le peroxyde
d’hydrogène (H2O2). Cette substance à effet bactéricide ou bactériostatique, affecte la
membrane lipidique (Haugaard, 1968), en accédant au cytoplasme, il cause des dommages
aux constituants intracellulaires. Falagas et al., 2007, ont démontré que certains lactobacilles
inhibent la croissance des bactéries vaginales par production de peroxyde d’hydrogène.
Concernant les Lactobacilles inhibiteurs, aucune inhibition n’était observée et ceci
après plusieurs essais. Des résultats similaires ont été observés par plusieurs auteurs.
Schillinger et Lücke (1989) ont remarqué que plusieurs inhibitions des souches de
Lactobacillus sake observées par la méthode de Fleming et al (1975), ont disparu lorsqu’ils
ont utilisé la méthode de diffusion en puits ; en effet sur 19 souches inhibitrices, 6 seulement
ont pu inhiber par leurs surnageants de culture. Ces mêmes constatations ont été faites par
Lewus et al. (1991) qui ont pu montrer que ces résultats sont observés, particulièrement,
quand l’agent inhibiteur est une bactériocine. Et ils l’expliquent par les hypothèses suivantes :
Un problème de diffusion de la bactériocine dans la gélose.
L’agrégation des molécules de bactériocines entre elles.
L’hydrolyse des bactériocines par des protéases non spécifique.
Une faible concentration en bactériocines et suggèrent une augmentation du diamètre
des puits creusés pour augmenter le volume et donc la concentration de l’échantillon déposé.
Jensen et al. (2009) ont fait une étude comparative de l’activité antimicrobienne des
souches de Lactobacillus helveticus en utilisant trois méthodes différentes (Fleming et al.,
1975, la méthode de diffusion en puits et la méthode des stries croisées) et ils ont démontré
l’impact de ces dernières sur l’effet inhibiteur de la bactériocine produites par les souches
utilisées, en effet chaque souches a répondu différemment selon la méthode utilisée : par
exemple la souche Lactobacillus helveticus DGCC4439 inhibait toutes les souches
indicatrices (Lb casei, Lactococcus sp et Leuconostoc sp) en utilisant la méthode Fleming et
al. (1975) alors qu’elle inhibait beaucoup moins de souches par la méthode des stries croisées.
Le plus grand problème, auquel nous avons été confrontés, est la non reproductibilité
des résultats, pour cela nous avons décidé d’optimiser la composition du milieu de culture des
souches inhibitrices en nous basant plus particulièrement sur la littérature qui traite de
l’optimisation dans le cas de souches bactériocinogènes.
Page 52
LBMB
3.3 Production et stabilité des agents inhibiteurs dans différents milieux
Dans notre travail, nous nous intéressons plus particulièrement à la production de
bactériocines, pour cela l’optimisation a été basée sur les paramètres qui augmentent la
production ou la stabilité de ces molécules.
L’effet inhibiteur dépend essentiellement de la concentration de l’agent antimicrobien
mais aussi de sa stabilité. Pour cela il nous est nécessaire de trouver le milieu le plus adéquat.
Faustino et al. (2005) ont démontré que l’ajout de 25% de lait au milieu de culture
augmente la production de bactériocines. Le même résultat a été mis en évidence par
Benkeroum et al. (2000) en supplémentant le MRS avec 2,5% d’extrait de levure. Du milieu
tamponné a aussi été utilisé pour mieux visualiser les inhibitions dues à d’autres agents que
les acides organiques. Dans notre cas nous avons testé les deux ingrédients en réalisant les
combinaisons suivantes :
 MRS + 2,5% d’extrait de levure : MRSY.
 MRSY tamponné : MRSY Tp.
 MRSY + 25 % de lait écrémé à 10%.
 MRSY Tp + 25 % de lait écrémé à 10%.
L’effet de l’addition du lait à 25% dans du MRS supplémenté de 2,5% d’extrait de
levure sur la production de l’agent inhibiteur par les 24 souches est reporté dans le tableau 12
présenté en annexe 1.
Nous avons utilisé les souches CHM19 et H2.3 comme indicatrices. La CHM19 a été
retenue grâce aux résultats du test précédent et la H2.3 présente les qualités d’une indicatrice
standard, par l’étude de souches bactériocinogènes, au sein de notre laboratoire.
La figure 11 montre quelques résultats observés :
Page 53
LBMB
1
5
11
10
9
20
14
15
16
6
7
12
2
3
4
8
13
19
18
22
23
24
17
21
25
Figure 11 : L’effet de l’addition du lait dans le MRSY sur la production de l’agent inhibiteur
contre H2.3.
Des surnageants de culture de souche LVK30 cultivée en, 1 : MRSY ; 2 : MRSY Tp ; 3 : MRSY+lait ;
4 : MRSY Tp+lait ;
8: MRSY Tp+lait ;
12 : MRSY Tp+lait;
(13-18) des surnageants de culture des souches sont cultivées en MRSY+lait, 13 : CHBK312 ; 14 : CHBK314 ;
15 : CHBK325; 16 : CHM9 ; 17 : CHM18; 18 : LVK11.
(19-24) des surnageants de culture des souches sont cultivées en MRSY Tp+lait, 19 : CHBK312 ;
20 : CHBK314 ; 21 : CHBK325 ; 22 : CHM9 ; 23 : CHM18; 24 : LVK11.
25 : puits vide.
D’après ces résultats, les remarques suivantes peuvent être faites :
Le milieu MRSY Tp additionné de lait a stimulé la production de l’agent inhibiteur
des souches CHBK310, CHM9 et CHM18, pour lesquelles nous avons enregistré des
diamètres des halos assez larges de 1,8 cm, 1,4 cm et 1.6 cm respectivement contre H2.3. Ces
mêmes souches ont donné de faibles halos d’inhibition contre l’indicatrice CHM19 (0,3, 0,6
et 0,6 cm respectivement), ce qui indique que parmi les deux indicatrices, la H2.3 est la plus
sensible.
L’effet des quatre milieux utilisés sur la production de l’agent inhibiteur chez les
autres souches n’est pas pertinent.
On note aussi que :

un halo d’inhibition de 0,8 cm est observé dans le cas des surnageants de culture des
souches CHBK309 et CHBK311 cultivées, respectivement, dans le MRSY Tp et le MRSY
additionné de lait et testées contre la H2.3. Cocolin et al. (2007) ont observé pour les deux
souches Enterococcus faecium M241 et M249, une production de bactériocines plus
importante, lorsqu’elles sont cultivées dans le lait que dans le MRS et expliquent que le lait
contient des éléments qui stimulent cette production.
Alors que l’addition de lait a permis d’observer des effets inhibiteurs plus grands et
plus stables, l’extrait de levure n’a montré qu’une légère amélioration dans le MRSY
Page 54
LBMB
tamponné. Ce dernier résultat a été observé dans le cas de l’inhibitrice CHBK309 et est du
soit à l’effet tampon du milieu soit à l’augmentation de la production de l’agent inhibiteur.
L’effet du lait sur la production de la nisine par Lactococcus lactis ATCC11454 est
rapporté par Faustino Jozala et al. (2005) qui ont étudié l’effet de l’ajout du lait écrémé au
milieu MRS et M17 et ont démontré que l’ajout de 25% de lait dans ces milieux, donne une
production de bactériocine de 142527,94 contre 21,06 AU/ml et 6,98 AU/ml en milieu MRS
et M17 respectivement.
Chez les autres souches l’effet inhibiteur n’est pas stimulé par les quatre milieux
utilisés. Pour tous ces cas et pour les souches probablement bactériocinogènes, d’autres
optimisations et/ou conditions environnementales sont nécessaires, en effet certaines
conditions de stress stimulent la production de bactériocines. La présence d’éthanol et
d’oxygène stimulent la production de l’amylovorine L471 par Lactobacillus amylovorus
DCE471 (De Vuyst et al., 1996). D’autres chercheurs ont optimisé la production de
bactériocines chez Lactobacillus plantarum LPCO10, Lactobacillus pentosus B96 et
Lactobacillus plantarum KC21 en présence de 2,5 à 3%, 3,77% et 3% de NaCl,
respectivement (Leal-Sanchèz et al., 2002, Delgado et al., 2004, Lim, 2010).
Delgado et al. (2004) suggèrent dans leur étude que la production de bactériocines
dépend probablement des conditions environnementales durant lesquelles la fermentation
naturelle d’olive s’est déroulée et dans leur cas c’était la température et la concentration de
NaCl.
Dans d’autres cas, la production maximale de bactériocine requiert un milieu de
culture complexe, avec un pH et une température d’incubation bien maitrisés (Biswas et al.,
1991, Daba et al., 1993, Krier et al., 1998, Mataragas et al., 2003).
Les optimisations des milieux ou conditions de culture des bactéries inhibitrices
permettent d’amplifier les effets antimicrobiens et surtout de détecter plus facilement les
inhibitions dues à des bactériocines. Vus les résultats obtenus dans ces tests, nous pensons que
dans notre cas certaines inhibitions sont dues à la production de bactériocines, ceci pourra être
confirmé par la caractérisation des agents inhibiteurs.
3.4 Caractérisation des agents inhibiteurs
Les bactéries lactiques inhibent d’autres bactéries principalement, par production des
acides organiques, ou de peroxyde d’hydrogène qui s’avère toxique pour les bactéries ne
possédant pas d’activité catalasique, ou encore par production de bactériocines.
Page 55
LBMB
Pour le test de mise en évidence des inhibitions dues aux acides organiques, la
méthode de Fleming et al. (1975) a été utilisée. Dans le cas des inhibitions dues aux peroxyde
d’hydrogène ou aux bactériocines c’est la méthode de Schillinger et Lücke (1989).
3.4.1 Les inhibitions dues à la production d’acides organiques
Les acides organiques ont une grande aptitude à inhiber les microorganismes surtout
ceux qui sont sensibles aux pH bas.
Pour la mise en évidence des inhibitions par production d’acides organiques, nous
avons retenu comme souche indicatrice la CHM19 pour toutes les souches inhibitrices testées.
Nous avons réalisé ce test en utilisant la méthode de Fleming et al. (1975). Ainsi des
cultures de bactéries tests ont été ensemencées en touches sur une surface de MRS solide non
tamponné d’une part, et d’autre part sur une surface de MRS solide tamponné. Après une préincubation à 30°C pendant 20h, des géloses molles en surfusion, non tamponnées et
tamponnées ont été ensemencées par l’indicatrice CHM19 et coulées à la surface des boîtes
pré-incubées. Après incubation à 30°C pendant 24h, les diamètres des halos d’inhibition ont
été mesurés.
Les résultats obtenus sont montrés dans la figure 12 et récapitulés dans le tableau 13.
Page 56
LBMB
Tp
nTp
2
5
4
3
2
1
1
6
3
5
4
6
9
8
8
7
14
13
12
11
10
16
10
15
17
20
19
19
22
14
16
18
12
11
13
21
19
9
7
15
17
21
20
19
18
22
Figure 12 : L’effet du milieu non tamponné et tamponné sur l’effet inhibiteur des
leuconostocs et des lactobacilles.
1 : CHBK310, 2 : CHBK311, 3 : CHBK312, 4 : CHBK314, 5 : CHBK315, 6 : CHBK316, 7: CHBK318,
8 : CHBK320, 9 : CHBK323, 10 : CHBK325, 11 : CHBK326, 12 : CHBK327, 13 : CHM9, 14 : CHM18, 15 :
CHM19, 16 : LVK11, 17 : LVK30, 18 : LVK31, 19 : LVK32, 20 : CHTD27, 21: CHTD29, 22 : BH14
Page 57
LBMB
Tableau 13 : Les inhibitions dues à la production d’acides organiques.
souches
CHBK310
CHBK311
CHBK312
CHBK314
CHBK315
CHBK316
CHBK318
CHBK320
CHBK323
CHBK325
CHBK326
CHBK327
CHM9
CHM18
CHM19
LVK11
LVK30
LVK31
LVK32
CHTD27
CHTD29
BH14
CHM19
gélose non tamponnée
gélose tamponnée
0,85
0,65
0,9
0,7
0,95
0,8
1,1
0,75
1,1
0,75
0,8
0,75
0,75
0,7
1,2
ND
1,0
ND
0,8
0,75
0,95
0,8
0,9
0,8
0,9
0,9
0,9
0,9
0,6
0,6
0,9
0,9
0,85
0,9
0,8
0,8
0,8
0,6
0,9
0
0,6
0,6
1,9
1,3
Les diamètres des halos d’inhibitions sont mentionnés en cm.
ND : non déterminée
Les observations suivantes ont été faites :
Pour les interactions qui ont gardé le même effet inhibiteur en conditions tamponnées et
non tamponnées, on peut dire qu’il ne s’agit pas d’inhibitions dues aux acides organiques,
mais fort probablement au peroxyde d’hydrogène ou à des bactériocines.
Toutes les interactions antagonistes ont gardé à peu près les mêmes diamètres des halos
d’inhibitions contre CHM19 dans les deux conditions, sauf dans le cas de deux souches, pour
lesquelles les halos d’inhibition ont changé de manière très significative:
 La CHTD27 où l’inhibition en milieu tamponné est complètement absente, alors que
le halo de son pouvoir inhibiteur en milieu non tamponné était de 0,9 cm. L’agent inhibiteur
dans ce cas est très certainement un acide organique. Les lactobacilles sont connus pour leur
pouvoir acidifiant par rapport aux autres bactéries lactiques Stiles (1994).
Page 58
LBMB
 la souche BH14 dont le halo d’inhibition était de 1,9 cm en milieu non tamponné alors
qu’il est de 1,3 cm en milieu tamponné (une diminution de 0,6 cm). Dans ce cas, nous
pouvons dire que l’inhibition est partiellement due à la production d’acides organiques.
3.4.2 Inhibitions dues à la production de peroxyde d’hydrogène et de bactériocines
Nous avons retenu pour ce test seulement les souches dont l’effet inhibiteur en milieu
tamponné n’a pas du tout changé, mais aussi celles qui en même temps ont présenté un effet
inhibiteur assez grand en présence de lait (résultats présentés dans le chapitre§ 3.3)
Pour déterminer la nature chimique de l’agent inhibiteur, l’effet des enzymes
protéolytiques (pronase E, pepsine, trypsine) et de la catalase a été testé sur les surnageants de
culture des souches CHBK310, CHM9 et CHM18. Seule l’indicatrice H2.3 a été utilisée, étant
donné qu’elle est la plus sensible :
 Le traitement des surnageants de culture avec la catalase permet de détecter les
inhibitions dues à la production de peroxyde d’hydrogène.
 Le traitement des surnageants de culture avec les enzymes protéolytiques permet de
détecter les inhibitions dues à la production de bactériocines, sachant que ces dernières, étant
de nature protéique, peuvent présenter des profils de digestion différents.
Les résultats obtenus par ce test sont montrés dans la figure 13 et mentionnés dans le
tableau 14 :
CHM9
+TRY
+PEP
+PRO
CHBK310
+CAT
CHM18
+TRY
+TRY
+TRY
+PEP
+PEP
+PRO
+CAT
+CAT
CHM18+
PEP
CHM18+
PRO
Figure 13 : L’effet des enzymes protéolytiques et de la catalase sur l’activité des agents
inhibiteurs.
TRY : trypsine, PEP : pepsine, PRO : pronase E, CAT : catalase.
Page 59
LBMB
Tableau 14 : Inhibitions dues au peroxyde d’hydrogène et aux bactériocines.
Souches
Les enzymes
CHBK310
CHM9
CHM18
Témoin
Trypsine
Pepsine
Pronase E
Catalase
1,2
0,6
1,0
0
1,1
1,0
0
0,8
0
1,0
0,8
0
0,6
0
0,8
Les diamètres des halos d’inhibitions sont exprimés en cm.
Le traitement des surnageants de culture avec la catalase n’a permis de lever aucune
inhibition. Donc aucune des trois inhibitrices n’inhibe la H2.3 par production de peroxyde
d’hydrogène
Les résultats obtenus par traitement aux enzymes protéolytiques sont les suivants :
 L’agent inhibiteur produit par les trois souches testées est complètement inactivé par
l’action de la pronase E.
 Une inactivation partielle de l’effet inhibiteur produit par la souche CHBK310 a été
obtenue par traitement à la trypsine, en présence de cette enzyme le halo a diminué de 0,4 cm.
 La pepsine n’a levé que très faiblement l’effet inhibiteur des trois inhibitrices. ce
résultat est observé par certains auteurs, l’agent inhibiteur produit par des souches de
Lactococcus lactis subsp lactis est résistant à la pepsine, alors qu’il est sensible à la pronase
(Benkerroum et al., 2000).
Cocolin et al. (2007) ont observé que l’effet inhibiteur se maintient à 50% après
traitement à la pepsine, alors qu’il est aboli par l’action de la trypsine, la protéinase K, la
papaine et la chymotrypsine.
Ces résultats indiquent que l’agent inhibiteur produit par les souches CHM9, CHM18
et CHBK310 n’est pas le peroxyde d’hydrogène, mais est de nature protéique, il s’agit de
bactériocines. Ces bactériocines sont nommées : Bactériocine CHM9, Bactériocine CHM18 et
mésentéricine CHBK310.
L’inactivation de l’agent inhibiteur par les enzymes protéolytiques est observée par de
nombreux chercheurs qui ont démontré qu’il s’agit de bactériocines qui ont été dégradées par
ces enzymes (Klaenhammer, 1993, Floriano et al., 1998, Deraz et al., 2005, Kumar et al.,
2010).
Page 60
LBMB
L’effet de l’agent inhibiteur produit par Lactococcus lactis subsp lactis B14 n’est pas
affecté par la trypsine, la chymotrypsine, alors qu’il est aboli par l’action de la pepsine, la
pronase E et la protéinase K (Ivanova et al., 2000). Dans le cas de la leucocine J produite par
Leuconostoc sp J2, la pepsine, la trypsine, la pronase E et la chymotrypsine ont affecté son
activité mais pas la catalase (Choi et al., 1999).
3.5 Optimisation de la production et/ou l’activité de la bactériocine produite par CHM9
Parmi les trois souches bactériocinogènes, la CHBK310 est écartée à cause de la nonreproductibilité de son effet inhibiteur. Pour les deux autres et pour des raisons pratiques,
nous n’avons retenu que la souche CHM9
Les bactériocines possèdent des
propriétés cationiques, amphiphiliques ou
hydrophobiques capable de se lier à la fois aux lipides et/ou aux protéines du lait, ce qui rend,
par exemple, la nisine difficile à extraire du lait (Rossano et al., 1998). Plusieurs chercheurs
ont rencontré cette contrainte, de séparer la nisine du lait.
Pour cela, une optimisation de production de bactériocine sans addition de lait au
milieu MRS, est favorisée. Ceci peut être réalisé en analysant l’effet de chaque élément de ce
milieu sur la croissance et la production de bactériocine par la souche CHM9 :
L’optimisation que nous avons réalisée touche principalement :

La composition du milieu MRS et notamment la source d’azote, la source de carbone
et la source de potassium.

La température d’incubation de la souche inhibitrice.

La diffusion de la bactériocine dans la gélose.

Dans les deux premiers cas, la croissance bactérienne a été mesurée.
Pour tous les tests nous avons utilisé la méthode de Schillinger et Lücke (1989)
3.5.1 Effet de la composition du MRS sur la croissance bactérienne et la production de
bactériocine

Effet de la source d’azote
Dans ce test, les cultures de la bactérie bactériocinogène ont été réalisées dans du MRS
dont la source d’azote a été modifiée. Les milieux MRS et MRSY Tp sont utilisés comme
Page 61
LBMB
témoins. Dans chaque cas la croissance de la souche et son effet inhibiteur ont été évalués
après 24h et 48h.
Nous avons agit sur la composition de la source d’azote et sur sa concentration, elle est
de 2% dans tous les cas, le milieu MRS contient 2,5 % de source d’azote. Un aspect des
résultats obtenus est montré dans la figure 14.
2
1
MRSY Tp
1
1
1
2
Try
2
1
2
EY
2
EV
Try+EV
h
1
2
Try+EY
2
1
Try+EV
+EY
Figure 14 : L’effet de différentes sources d’azote sur la production de la bactériocine CHM9
testée contre H2.3.
Try : Tryptone
EY : extrait de levure
EV : extrait de viande
1 : 24h
2 : 48h
Le résultat de l’effet des différentes sources d’azote sur la croissance et la production
de bactériocine est montré dans le tableau 15 suivant :
Tableau 15 : Effet des différentes sources d’azote sur la croissance et la production de la bactériocine
par CHM9 :
Sources d’azote
MRS*
MRSY Tp
Try (2%)
EY (2%)
EV (2%)
1% Try+1% EY
1% Try +1% EV
1% Try + 0,5% EY + 0,5% EV
24h d’incubation
Diamètres des
DO
halos
1,327
0,3
1,627
0,8
1,372
0,2
1,573
0,2
1,404
0,45
1,585
0,65
1,427
0,8
1,539
1,0
48h d’incubation
Diamètres des
DO
halos
3,000
0,7
1,539
0,2
2,039
0,25
1,161
0,5
1,821
0,5
1,505
0,8
1,689
1,0
La densité optique est mesurée à 600 nm.
Les halos d’inhibition sont exprimés en cm.
Try : Tryptone.
EY : extrait de levure.
EV : extrait de viande.
*
: la DO de la souche mentionnée est une moyenne, le halo d’inhibition est observé exceptionnellement
pour quelques essais.
De l’ensemble des résultats obtenus on peut déduire les remarques suivantes :
Page 62
LBMB
 Certaines sources d’azote agissent seulement sur la croissance de la souche
bactérienne alors que d’autres seulement sur la production de bactériocine.
 Le milieu MRSY Tp permet une bonne croissance de la souche, mais cette biomasse
ne concorde pas avec une production maximale de bactériocine, par rapport aux autres
milieux modifiés. Dans le cas du MRS, Un halo de 0,3 cm est observé et la croissance est
faible (DO = 1,3). Par contre Biswas et al. (1991), ont constaté que la production de
bactériocine par Pediococcus acidilactici H, dans ce même milieu, est moins importante par
rapport aux autres milieux alors que la croissance est plus importante.
 La croissance de la souche CHM9 dans un milieu contenant 2% de tryptone comme
seule source d’azote, a montré la croissance la plus faible au bout de 24 h (DO = 1,3), comme
celle observée en milieu MRS. Après 48h d’incubation, la DO de la biomasse a atteint 1,5, ce
qui indique que la phase de croissance se poursuit au-delà de 24h d’incubation. Concernant la
production de la bactériocine, elle est très faible ; en effet le halo d’inhibition est seulement de
0,2 cm.
 La DO de la souche en milieu contenant 2% d’extrait de levure comme seule source
d’azote, est assez élevée après 24h, et continue d’augmenter pour atteindre une DO de 2 à 48h
d’incubation , alors que la production de bactériocine reste toujours faible. Des résultats
similaires ont été observés par plusieurs chercheurs qui ont indiqué que l’extrait de levure
permet une bonne croissance. Ce dernier résultat a été observé par De Vuyst et al (1996), en
cultivant Lactobacillus amylovorus DCE 471 dans un MRS contenant 4,4% d’extrait de
levure, alors que la production de bactériocine n’était pas optimale. Mollendorff et al. (2009)
ont indiqué aussi une bonne croissance en présence d’extrait de levure des souches de
Lactobacillus JW3BZ, JW6BZ, JW11BZ et JW15BZ. Lim (2010) a obtenu une croissance
optimale et une production maximale de la bactériocine (12800 AU/ml) synthétisée par
Lactobacillus plantarum KC21 en présence de 0,5% d’extrait de levure. Cette source contient
plus de facteurs de croissance, tels que des vitamines, des acides aminés libres et de petits
peptides (constitués de 2 ou 3 acides aminés) que d’hydrolysats de protéines (Aasen et al.,
2000), ce qui favorise une bonne croissance des bactéries exigeantes telles les bactéries
lactiques. Par contre, Mataragas et al. (2003) n’ont observé aucune influence de l’extrait de
levure de 10 à 15g/l sur la croissance, ni sur la production de bactériocine par Lactobacillus
curvatus L442.
 L’extrait de viande employé comme seule source d’azote en milieu MRS, ne
permet pas une bonne croissance (DO de 1,4) après 24h, cette dernière diminue après 48h
Page 63
LBMB
d’incubation (DO de 1,1). Concernant la production de bactériocine, elle est peu augmentée
(0,5) par rapport aux cas où l’extrait de levure (0,25 cm) ou la tryptone (0,2 cm) sont
employés séparément.
 La combinaison de Try+EY (1%+1%) donne une bonne croissance (DO de 1,5)
après 24h et augmente à 1,8 après 48 h d’incubation, avec une production plus importante
(0,65 cm) par rapport à l’emploi de ces 2 sources séparément.
 La combinaison Try+EV (1%+1%) donne une croissance (DO de 1,4) plus basse
que la combinaison Try+EY (DO de 1,5). A l’inverse la production de bactériocine, est plus
importante en présence de Try+EV (halo d’inhibition de 0,8 cm) qu’en présence de Try + EY
(halo de 0,65 cm). Cette production est égale à celle obtenue en milieu MRSY Tp.
 Enfin la combinaison Try+EY+EV (1%+0,5%+0,5%) donne une bonne croissance de
la souche et une production plus intéressante que les autres milieux. Todorov et Dicks (2005c)
ont obtenu des productions maximales de bactériocines, synthétisées par ST26MS et ST28MS
avec respectivement 12800 AU/ml et 6400 AU/ml, en présence de 2% de Tryptone et de la
combinaison 1%Try+0,5%EY+0,5%EV, alors qu’en milieu MRS la production est de
6500AU/ml. Par ailleurs, Pal et al. (2010) et Todorov et Dicks (2005a) ont indiqué, en
comparaison avec les autres sources d’azote utilisées dans leurs études, que la tryptone à 2%
est la meilleure source d’azote, pour la production de bactériocine par Weissella
paramesenteroides DFR-8 et la ST33LD produite par Lenconostoc mesenteroïdes subsp
mesenteroïdes (12800 AU/ml). Todorov, (2008) a observé une production maximale de
bactériocine produite par Lactobacillus plantarum AMA-K en présence de 2% de tryptone,
1,5%Try+0,5% EY et 1%Try+0,5%EY+0,5%EV, mais il a conclu que la tryptone est la
source d’azote « clé » pour une production maximale de bactériocine. Nous pouvons conclure
que chaque souche peut répondre différemment vis-à-vis d’une source d’azote quelconque
pour sa croissance et la production de sa bactériocine, c’est ce qu’on appelle «l’effet souche».
Par conséquent, pour le test de l’effet de la source de carbone sur la croissance et la
production de bactériocine, nous avons retenu la combinaison de source d’azote qui a donné
la production maximale de bactériocine qui est 1%Try+0,5%EY+0,5%EV.

Effet de la source de carbone
Le glucose est un constituant du milieu MRS, ce sucre simple semble être le plus
utilisé par les bactéries lactiques pour leur croissance. Pour analyser l’effet de la source de
carbone, nous avons remplacé le glucose par différents sucres : le saccharose, le maltose, le
Page 64
LBMB
lactose et le glycerol, le témoin étant le milieu MRS modifié de l’étape précédente avec
glucose. 2% de glucose sont remplacés par 2% de chacun des sucres.
L’effet de la source de carbone sur la croissance de la souche CHM9 et la production
de bactériocine par cette souche, après 24h et 48h d’incubation est montré dans les figures 15,
16a et 16b ci-dessous :
24h
48h
GLU
LAC
GLY
MRSY Tp
+lait
Try+EV
+EY
SAC
MAL
Figure 15 : L’effet des différentes sources de carbone sur la production de la
bactériocine CHM9.
GLU : glucose, LAC : lactose, Gly : glycerol, SAC : saccharose, MAL : maltose.
b: après 48 h d’incubation
a: après 24 h d’incubation
La DO (600nm)
Diamètre du halo d'inhibition (cm)
La DO (600 nm)
2,5
1,2
2,0
1,0
2,5
1,2
2
1,0
0,8
1,5
0,8
1,5
0,6
1,0
0,4
0,5
0,0
Glucose
Saccharose
Maltose
Lactose
Glycerol
MRS*
0,6
1
0,2
0,5
0,0
0
0,4
0,2
0,0
Glucose
Saccharose
Maltose
Lactose
Glycerol
Figure 16 : L’effet des différentes sources de carbone sur la croissance et la production de
bactériocine par CHM9.
*
Comme pour la source d’azote, une bonne croissance ne reflète pas forcément une
bonne production de bactériocine.
Et les remarques suivantes peuvent être faites :
Page 65
LBMB
 La croissance dans les milieux contenant le glucose, le maltose et le lactose est
optimale par rapport aux milieux contenants le saccharose ou le glycérol, comme seule source
de carbone. La production de bactériocine est la plus importante en milieu contenant 2% de
glucose comme seule source de carbone, ceci est reflété par le diamètre du halo d’inhibition
qui est de 1,0 cm. Ce résultat est constaté par plusieurs chercheurs toujours en présence de
20g/l de glucose. En effet, Mataragas et al., 2003 ont observé, une production maximale de
bactériocines produites par Leuconostoc mesenteroides L124 et Lactobacillus curvatus L442.
Ce même résultat a été observé par Pal et al. (2010) dans le cas de
Weissella
paramesenteroides DFR-8.
 En milieu contenant le saccharose comme seule source de carbone, la production de la
bactériocine par la souche CHM9 est intéressante, après 48 h d’incubation avec un halo de 0,9
cm, un halo de 0,6 cm est noté après 24h d’incubation dans ce milieu.
 Le lactose diminue la production de bactériocine de 20% par rapport au glucose, alors
que la croissance est plus importante dans ce milieu après 24h d’incubation (DO de 1,6), mais
elle diminue brusquement après 48h d’incubation (DO de 1,1), ceci est peut être du à la
diminution importante du pH du milieu avec la production importante d’acides en utilisant ce
substrat.
 L’emploi de glycerol dans le milieu MRS modifié en source d’azote ne permet pas ni
une bonne croissance de la souche, ni une bonne production de la bactériocine (faible halo
d’inhibition de 0,4 cm). Ce même résultat a été observé par Todorov (2008) qui a noté une
diminution de la production de la bactériocine AMA-K synthétisée par Lactobacillus
plantarum AMA-K en présence de 2% de glycerol.
 Ces résultats contredisent ceux observés par Todorov et Dicks (2005a) pour lequel
l’emploi de 2% de glucose ou de lactose, diminue la production de bactériocine de 6400
AU/ml par rapport à l’emploi de 2% de maltose qui donne une production maximale de la
bactériocine ST33LD (12800 AU/ml). Dans une autre étude l’emploi de 5 à 10 g/l de
saccharose augmente la synthèse de la bactériocine ST311LD produite par Enterococcus
faecium ST311LD (Todorov et Dicks, 2005b).
Todorov (2008), a constaté une production de 12800 AU/ml dans le MRS contenant
2% de glucose (20 g/l) ou de maltose, et cette production a été doublée en présence de 30 g/l,
alors que l’emploi de lactose comme seule source de carbone dans le milieu, réduit de 75%
(1600 AU/ml)
la production de bactériocine par Lactobacillus plantarum AMA-K. Ces
Page 66
LBMB
résultats sont surprenants d’autant plus que cette souche était isolée à partir du lait fermenté
et prouvent que la production de bactériocine dépend de la combinaison de plusieurs facteurs.
Lim (2010) obtient un maximum de production de bactériocine par Lactobacillus
plantarum KC21 mais en présence de 1,5% de glucose ou 1% de lactose (12800 AU/ml),
alors que 2% de glucose et 2% de lactose, diminuent la production de cette bactériocine à
3200 AU/ml et 2% de maltose diminue la production à 400 AU/ml.
En conclusion, nous pouvons dire que le glucose à 2% constitue la meilleure source de
carbone.

Effet de la source de potassium
L’effet de la source de potassium sur la production de bactériocine a été étudié par
plusieurs auteurs (De Vuyst et Vandamme, 1993 ; Todorov et Dicks, 2005 ; Mollendorff et
al., 2009 ; Lim, 2010).
Le MRS contient 2g/l de K2HPO4, cette concentration indique que les lactobacilles
ont besoin de cette source pour leur développement. Pour l’étude de l’effet de la source de
potassium sur la production de bactériocine, nous nous sommes basés sur les travaux de
Mollendorff et al. (2009).
Pour cela, les 0,2% de K2HPO4 du milieu MRS modifié obtenu des étapes précédentes
ont été substitués par :

1% de K2HPO4,

2% de K2HPO4,

2% de KH2PO4

1% K2HPO4 + 1% KH2PO4.
Tous ces milieux en plus du témoin, qui contient 0,2% de K2HPO4 ont été ensemencés à 5%
d’inoculum de la souche CHM9.
La figure 17 montre le résultat obtenu :
Page 67
LBMB
24h
48h
1
2
3
GLU
Try+EV
+EY
4
5
Figure 17 : L’effet des différentes sources de potassium sur la production de la bactériocine
CHM9 contre H2.3.
1 : 0,2%K2HPO4. 2 : 1% K2HPO4. 3 : 2% K2HPO4. 4 : 2% KH2PO4. 5 : 1%K2HPO4+1% KH2PO4.
Le résultat de l’effet de la source de potassium sur la croissance et la production de la
bactériocine CHM9 après 24h et 48h d’incubation est montré dans les figures 18.a et 18.b
b : après 48h d’incubation
a : après 24h d’incubation
La DO (600 nm)
La DO (600 nm)
2,5
1,4
2,5
1,4
1,2
2
1,2
2
1,0
1,5
0,8
1
0,6
1,0
1,5
0,8
1
0,6
0,4
0,5
0,2
0
0,0
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
MRS*
0,4
0,5
0,2
0
0,0
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
Figure 18 : L’effet de la source de potassium sur la croissance et la production de la
bactériocine CHM9.
(1) : 0,2%K2HPO4. (2) : 1% K2HPO4. (3) : 2% K2HPO4. (4) : 2% KH2PO4. (5) : 1%K2HPO4+1% KH2PO4.
*
Nous pouvons faire les remarques suivantes :
 La croissance de la souche CHM9 est la plus importante en milieu contenant 2% de
K2HPO4 (DO de 1,9). Une DO de 1,8 est enregistrée dans les milieux contenant 1% de
K2HPO4 et 1% de K2HPO4 + 1% de KH2PO4, alors qu’elle est la plus faible en présence de
2% de KH2PO4 (1,6). Une DO de 1,7 est obtenue dans le milieu contenant 0,2% de K2HPO4.
Page 68
LBMB
Concernant la production de bactériocine :
 Les milieux contenant 1% et 2% de K2HPO4 comme source de potassium permettent
une production maximale de la bactériocine, ceci est reflété par le diamètre du halo
d’inhibition qui est de 1,2 cm par rapport à 1,0 cm obtenu dans le milieu contenant 0,2% de
K2HPO4. Ce résultat peut être du au pH du milieu, puisque le K2HPO4 est une base qui permet
de tamponner le milieu à la neutralité. Kim-Hi (2005) a observé que la production de la
micrococcine GO5 par Micrococcus sp GO5 est huit fois plus importante dans un milieu
contenant 2 à 2,5% de K2HPO4 que dans un milieu contenant 0,2% de K2HPO4.
 Cependant le milieu contenant 2% de KH2PO4 comme seule source de potassium n’a
pas permis une production de bactériocine (halo de 0 cm), car le KH2PO4 est un acide et peut
diminuer fortement le pH du milieu ce qui peut provoquer une répression de la production de
bactériocine. Ce résultat ne concorde pas avec les travaux de De Vuyst et Vandamme (1993),
qui ont constaté une production maximale de la nisine produite par Lactococcus lactis subsp
lactis NIZO22186 dans un milieu contenant jusqu’à 5% de KH2PO4 comme seule source de
phosphore. Ces auteurs indiquent que cette source crée des conditions de pH favorables pour
la production de cette bactériocine, mais à 6% de KH2PO4, aucune production n’est observée,
expliquant que cette concentration de KH2PO4 a provoqué une lyse cellulaire.
A ce stade, un milieu que l’on nommera MRSm est constitué. Il s’agit du milieu MRS
dont la source d’azote et la source de potassium sont modifiées. Ces sources sont modifiées
comme suit : 1% Try+0,5% EY+0,5%EV (comme source d’azote) et 2% de K2HPO4 (comme
source de potassium). La source de carbone n’est pas modifiée (2% de glucose).
Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés à la température d’incubation
de la souche bactériocinogène (pour une production maximale) ainsi qu’aux conditions de
diffusion dans la gélose (pour une quantification meilleure).
3.5.2 Effet de la température d’incubation
La température d’incubation est un paramètre qui doit être maîtrisé pour la croissance
et la production de la bactériocine. Ce paramètre a fait l’objet de plusieurs études, qui ont
montré que la température de production des bactériocines est souvent inférieure à la
température optimale de croissance (Krier et al., 1998). Dans notre cas, nous avons testé les
températures (25, 35,40 et 45°C). La culture témoin a été réalisée à 30°C. Les cultures ont été
réalisées, pendant 24h et 48h, dans le milieu MRSm par ensemencement avec 5% d’inoculum
de la souche CHM9.
Page 69
LBMB
L’effet de la température d’incubation sur la croissance de la souche CHM9 et la production
de sa bactériocine après 24h et 48h d’incubation est montré dans les figures 19, 20a et 20b :
24h
48h
25°C
30°C
35°C
GLU
2% K2HPO4
40°C
45°C
Figure 19 : L’effet de la température d’incubation sur la production de la bactériocine CHM9.
a : après 24h d’incubation
b : après 48h d’incubation
La DO (600nm)
la DO (600nm)
2,50
1,4
2,50
1,4
1,2
2,00
1,2
2,00
1
1,50
1,00
1
0,8
1,50
0,8
0,6
1,00
0,6
0,4
0,4
0,50
0,50
0,2
0,2
0,00
0
25°C
30°C (T)
35°C
40°C
45°C
0,00
0
25°C
30°C (T)
35°C
40°C
45°C
Figure 20 : Effet de la température d’incubation sur la croissance bactérienne et la production
de bactériocine par CHM9.
D’après ces résultats, les remarques suivantes peuvent être faites :
 La croissance de la souche CHM9 est quasi identique pour toutes les températures
d’incubation (DO de 1,5 à 1,6).
 La production de la bactériocine semble être identique aux températures 25, 30, 35 et
40°C, en effet des halos d’inhibition de 1,2 à 1,3 sont observés. Cependant, nous notons à la
température 25°C après incubation de 24h ou 48h, que l’effet inhibiteur est à son maximum
(1,3 cm). Certaines bactériocines répondent différemment à ces mêmes températures, exemple
celle décrite par Lim (2010) et produite par Lactobacillus plantarum KC21 qui ne montre
Page 70
LBMB
aucune activité à la température d’incubation 25°C contre Staphylococcus aureus ATCC6538,
mais qui est très active à 30°C,
 Par contre la croissance de la souche bactériocinogène à 45°C,
entraîne une
diminution de l’effet inhibiteur de 77%.
 Ce résultat a été observé par plusieurs chercheurs étudiants l’effet de la température
d’incubation sur la production de bactériocines. en effet Lim (2010) n’a détecté aucune
activité de la bactériocine produite par Lactobacillus plantarum KC21 à 45°C d’incubation.
Pour expliquer ce phénomène Messens et al., 2003 ont suggéré qu’à une température
d’incubation élevée, des protéases sont activées en réponse au stress thermique. Aussi, Juarez
Tomas et al. (2002), ont supposé qu’à des températures supérieures à 44°C, les cellules de
Lactobacillus salivarius CRL1328 ont été incapables de synthétiser ou sécréter des
bactériocines alors que la croissance n’est pas affectée par cette température.
2.5.3 L’effet du pH sur la diffusion de la bactériocine CHM9
Plusieurs auteurs étudient les facteurs intrinsèques du milieu (ou de l’aliment)
influençant l’efficacité de la diffusion de la bactériocine, surtout si elle fait l’objet d’une
application agro-alimentaire. Blom et al. (1997), ont analysé plusieurs facteurs, parmi eux, le
pH du milieu, et ils ont démontré qu’il peut influencer la diffusion de la bactériocine. D’autres
chercheurs lient la diffusion de la bactériocine aux agents tampons du milieu. En effet le
glycéro-phosphate contenu dans le milieu M17, interfère avec les zones d’inhibition causées
par l’agent inhibiteur produit par Pediococcus acidilactici PO2, en comparaison avec d’autres
agents tampons (Hoover et al., 1989).
Dans ce test, nous voulons étudier l’effet du pH neutre de la gélose molle et de la
gélose dure sur la diffusion des bactériocines produites par les souches CHM9, CHM18 et
CHBK310. Ce test a été réalisé selon la méthode de Schillinger et Lücke (1989). Nous avons
cultivé les souches inhibitrices dans différents milieux testés pour l’optimisation et qui sont
les suivants :
☞
MRS, MRS tp, MRSTP+lait.
☞
MRSY + lait, MRSY TP + lait.
☞
0,2% K2HPO4, 1% K2HPO4, 2% K2HPO4.
☞
1% K2HPO4 + 1% KH2PO4.
Les figures 21a et 21b suivantes montrent quelques résultats observés :
Page 71
LBMB
1
1
2
5
9
8
7
6
2
4
3
6
5
9
11
10
4
3
7
8
11
10
Tp
nTp
a : gélose
non
tamponnée
4
5
10
11
b : gélose
tamponnée
4
5
10
11
Figures 21 : L’effet du pH du milieu sur la diffusion de la bactériocine.
4 : surnageant de CHM9 issu de MRS+lait. 5 : surnageant de CHM18 issu de MRSY+lait.
10 : surnageant de CHM9 issu de MRSY Tp+lait. 11 : surnageant de CHM18 issu de MRSY Tp+lait.
Tableau 16 : L’effet du pH de la gélose sur la diffusion de la bactériocine produite par les
souches CHM9, CHM18 et CHBK310
Les
souches
CHM9
CHM18
CHBK310
Les milieux de culture
MRSY + lait
MRSY Tp + lait
0,2% K2HPO4
1% K2HPO4
2% K2HPO4
1% K2HPO4+1%KH2PO4
MRSY + lait
MRSY Tp + lait
MRS
MRS Tp
MRS Tp + lait
H2.3
Gélose Non TP
1,2
1,0
0,8
1,0
1,0
0,8
1,2
1,2
0,6
0,6
1,6
Gélose TP
1,4
1,2
1,0
1,2
1,2
1,0
1,2
1,2
0,8
0,8
1,8
Les diamètres sont mentionnés en cm.
Page 72
LBMB
Pour chaque milieu de culture de la souche bactériocinogène nous avons étudié la
diffusion en conditions tamponnées et non tamponnées. Dans ce cas les géloses dure ou molle
sont tamponnées ou non tamponnées simultanément.
Dans la plupart des cas nous avons observé une légère augmentation des halos
d’inhibition en conditions tamponnées par rapport à celles non tamponnées. L’augmentation
des halos d’inhibition a été observée quelque soit le milieu de culture de la souche
bactériocinogène.
Dans un deuxième temps, nous avons réalisé un autre essai de diffusion dans
différentes conditions, à savoir :
☞ gélose solide nTp / gélose molle nTp.
☞ Gélose solide nTp / gélose molle Tp.
☞ Gélose solide Tp / gélose molle nTp.
☞ Gélose solide Tp / gélose molle Tp.
Ce test a été réalisé avec des surnageants obtenus après culture de la souche bactériocinogène
CHM9 dans des milieux contenant différentes sources de carbone ou d’azote.
Le tableau 17 et les figures 22a, b, c et d suivants montrent les résultats obtenus :
Page 73
LBMB
a
1
1
1
GLU
nTp/
nTp
2
LAC
b
2
GLY
SAC
1
LAC
LAC
2
1
GLY
2
1
SAC
2
1
MAL
2
MAL
GLU
1
nTp/
Tp
T2
1
1
2
T1
T2
c
GLU
2
T1
1
1
2
Tp/
nTp
2
d
1
2
GLU
1
Tp/
Tp
2
MAL
2
1
LAC
v
2
2
GLY
1
2
T2
T1
1
SAC
v
2
MAL
1
1
T1
2
GLY
1
2
T2
2
v
SAC
Figure 22 : L’effet de pH de la gélose sur la diffusion de la bactériocine produire par CHM9.
a : gélose molle nTp/gélose solide nTp. b : gélose molle nTp/gélose solide Tp.
c : gélose molle Tp/gélose solide nTp. d : gélose molle Tp/gélose solide Tp.
1 : surnageant de culture de 24h, 2 : surnageant de culture de 48h,
T1 : surnageant de la souche cultivé dans MRS dont la source d’azote est (Try+EV+EY),
T2 : surnageant de culture de la souche cultivée dans MRSY Tp+lait. v : puit vide
Tableau 17 : L’effet du pH du milieu sur la diffusion de la bactériocine produite par CHM9
échantillon
Glu
Lac
Gly
Sac
Mal
Try+EY+EV
MRSY+lait
24h
48h
24h
48h
24h
48h
24h
48h
24h
48h
24h
24h
Solide nTp/
molle nTp
Solide nTp/
molle Tp
Solide Tp/
molle nTp
0,1
0,3
0,1
0,2
0,1
0,1
0,1
0,1
0
0
0,1
0,4
0,1
0,2
0,4
0,4
0,4
0,4
0,1
0
0,1
0,1
0,2
0,2
1,0
1,0
0,8
0,8
1,2
1,2
0,8
0,8
0,6
0,8
0,8
0,5
Solide Tp/
molle Tp
Synergie des
halos
1,4
Synergie des
halos
1,4
Synergie des
halos
Page 74
LBMB
 La réalisation de la méthode de Schillinger et lücke (1989) avec une gélose solide
tamponnée permet une bonne diffusion. Ce même résultat a été observé dans le cas de la
piscicoline, pour laquelle Blom et al. (1999) ont remarqué une meilleure diffusion dans un
milieu de pH 7.
 A l’inverse dans le cas de la gélose solide et molle non tamponnées, on remarque des
diamètres très faibles, ne dépassant pas 0,4 cm.
 La diffusion est maximale dans le cas, où la gélose solide et molle, sont tamponnées,
on observe une très grande augmentation des halos d’inhibition dans ces conditions. Comme
dans le cas du surnageant de la culture, réalisée en MRS contenant le saccharose comme
source de carbone, qui inhibe la H2.3 avec un halo de 0,1 cm dans un milieu où la gélose
solide et molle sont non tamponnées. Un halo de 0,8 cm est enregistré dans un milieu dont la
gélose solide est tamponné et la gélose molle est non tamponnée alors qu’il atteint 1,4 cm
dans un milieu dont la gélose solide et molle sont tamponnées.
 La diffusion maximale de la bactériocine, comme rapporté par Hoover et al. (1989),
dépend de l’agent tampon qui interfère avec les zones d’inhibition, dans leur cas il s’agissait
du glycero-phosphate contenu dans le milieu M17. Dans notre tampon, les sels de KH2PO4 et
Na2HPO4 sont utilisés, en effet Wolf et Gibbons (1996) ont remarqué une meilleure détection
de la nisine Z par la méthode de diffusion sur gélose en diminuant la quantité d’agar et en y
incorporant le phosphate de sodium (Na2HPO4).
 Dans d’autres cas, Blom et al. (1997) notent que le pH peut provoquer une ionisation
de la matrice agar, ce qui entraine une répression de la diffusion, en effet pour une gélose à
pH 7, ils enregistrent des surfaces de diffusion faible dans le cas de la nisine et de la
pediocinePA-1.
3.6 Production de la bactériocine CHM9 en présence de lait
Dans le but, de savoir si l’ajout de lait
dans le milieu de culture de la souche
inhibitrice, donne une meilleure production de la bactériocine. Nous avons testé l’effet des
milieux MRS, MRSY et MRSm dans des conditions tamponnées ou non tamponnées en
présence ou en absence de lait. Le résultat obtenu est montré dans la figure 23 et le tableau 18
suivants :
Page 75
LBMB
1
2
5
9
3
6
4
7
8
12
10
11
Figure 23 : L’effet de la présence du lait dans trois milieux différents (MRS, MRSY et
MRSm) sur la production de la bactériocine CHM9.
Les surnageant de culture de la CHM9 cultivée en :
1 : MRS. 2 : MRS Tp. 3 : MRS+lait. 4 : MRS Tp+lait. 5 : MRSY. 6 : MRSY Tp. 7 : MRSY+lait.
8 : MRSY Tp+lait. 9 : MRSm. 10 : MRSm Tp. 11 : MRSm+lait. 12 : MRSm Tp+lait.
Tableau 18 : L’effet de différentes conditions sur la production de bactériocine chez CHM9
Les milieux de
culture
MRS
MRSY
MRSm
Les conditions des
milieux
nTp
Tp
nTp+lait
Tp+lait
nTp
Tp
nTp+lait
Tp+lait
nTp
Tp
nTp+lait
Tp+lait
Diamètres des halos
d’inhibition
0,2
1,0
0,3
0,9
0,9
0,8
0,35
1,0
0,7
1,3
0,8
1,3
Les diamètres des zones d’inhibition sont mentionnés en cm
D’après les résultats obtenus, les remarques suivantes peuvent être faites :

Le milieu MRSm permet une meilleure production de bactériocine par rapport aux
milieux MRS et MRSY, surtout lorsqu’il est tamponné et/ou supplémenté en lait.

Le milieu MRS tamponné, supplémenté ou non en lait, donne une bonne production.

Les milieux MRSY donnent une production intéressante sauf dans le cas du MRSY
non tamponné et supplémenté en lait où le halo d’inhibition est de seulement (0,35
cm).
Page 76
LBMB
Pour ces tests, nous pouvons conclure que les milieux tamponnés donnent une bonne
production de bactériocine. Ceci est distingué surtout dans le cas du MRS et MRSm. Cette
même observation a été faite par Mandal et al. (2008) qui ont constaté, une production de
bactériocine maximale dans le milieu TGE+Tween 80 tamponné à pH 6,8 (citrate de sodium,
acetate de sodium et phosphate dipotassique, chaque élément est à 0,2%).
Zaoui (2011), a observé que le surnageant de la souche Enterococcus faecalis BO2 a
montré une activité inhibitrice très importante, lorsque la souche est cultivée en milieu M17
Tp+lait
Pour la réalisation des tests suivants, nous avons retenu le milieu MRSm tamponné.
3.8 Propriétés physico-chimique de la bactériocine
La plupart des auteurs s’intéressent à l’étude de la stabilité de l’activité de la
bactériocine, à différents pH acides et basiques ainsi qu’aux températures élevées.
Ces études permettent d’une part de caractériser la bactériocine pour une utilisation en
industrie agro-alimentaire, et d’autres part de la classer en fonction de son degrés de
résistance aux traitements thermiques.

L’effet du pH
Dans ce cas les pH des surnageants de culture sont divisés en deux lots. Pour un lot le
pH est ajusté à la valeur désirée puis ramené à pH 7 (R). Pour le deuxième lot le pH est ajusté
à la valeur désirée et maintenu à cette même valeur (Nr).
L’effet du pH acide ou basique sur l’activité de la bactériocine CHM9 est montré dans
la figure 24 et le tableau 19 suivants :
Nr2
Nr9
R9
T
R2
Nr4
R4
Nr6
R6
Nr7
Nr7
Nr8
R8
Nr12
R12
Figure 24 : L’effet des pH acides ou basiques sur l’activité de la bactériocine CHM9 contre
H2.3.
Nr : Non réajusté, R : réajusté.
Page 77
LBMB
Tableau 19 : L’effet du pH sur l’activité de la bactériocine CHM9.
pH du milieu
Etat du milieu
Témoin (pH>6)
Non réajusté
pH=2
réajusté
Non réajusté
pH=4
réajusté
Non réajusté
pH=6
réajusté
Non réajusté
pH=8
réajusté
Non réajusté
pH=9
Réajusté
Non réajusté
pH=12
Réajusté
Diamètre du halo l’inhibition
1,2
1,2
1,4
1,2
1,2
1,2
1,4
1,2
0,2*
1,4
1,2
0
0.2*
Les diamètres des zones d’inhibition sont mentionnés en cm.
*
halos trouble.
D’après ce qui est indiqué dans le tableau, on peut faire les remarques suivantes :
 De manière générale l’activité de la bactériocine CHM9 n’est pas affectée par les pH
qu’ils soient acides ou basiques. Ceci est observé par plusieurs chercheurs, Todorov et Dicks
(2004), Kwaadsteniet et al. (2005) et Ozlem (2005) qui ont respectivement remarqué que
l’activité de la mesentericine ST99, la bactériocine ST15 et la leucocine OZ ne sont pas
affectées par des pH allant de 2 à 12. Ghrairi et al.(2008) ont indiqué la stabilité de l’activité
de la bactériocine produite par Enterococcus faecium MMT21 aux pH compris entre 2 et 10.
 Néanmoins, on remarque une absence d’inhibition pour l’échantillon de pH8 non
réajusté et les échantillons de pH 12 réajusté et non réajusté, ceci est dû à une dilution lors de
l’ajout du NaOH ou du HCl pour l’ajustement ou le réajustement.
 Dans le cas de la bactériocine produite par Enterococcus faecium NIAI 157, Ohmomo
et al. (1999) ont remarqué qu’au-delà du pH7, l’activité de cette bactériocine diminue. Alors
que l’entérocine F-420 est stable à des pH allant de 4 à 8. Les pH acides ou basiques affectent
légèrement l’activité de la sakacine C2 alors que le pH 6 permet de maintenir totalement
l’activité de cette bactériocine (Gao et al., 2010).
 Ces résultats rejoignent ceux observés par Benmouna (2008) et Kout (2011), qui ont
observé que l’activité inhibitrice des bactériocines n’est pas affectée par les pH acides ou
basiques.
Page 78
LBMB

L’effet de la température
Dans le but d’analyser l’effet de la chaleur sur l’activité de la bactériocine produite
par CHM9, Les surnageants de culture ont été soumis à différents traitement thermiques, à
savoir 60, 80 ou 100°C pendant 10,15 ou 20 min et 120°C pendant 20 min (autoclavage).
Puis, ils ont été testés par la méthode de schillinger et Lücke (1989) avec comme témoin un
surnagent qui n’a pas été traité.
Le résultat obtenu est montré dans la figure 25 suivante :
T
10min
15min
20min
60°C
80°C
100°C
120°C
20 min
Figure 25 : L’effet de différentes températures sur l’activité de la bactériocine CHM9 contre
H2.3.
L’effet de différentes températures sur l’activité de la bactériocine CHM9 est indiqué
dans le tableau 20:
Tableau 20 : L’effet des températures sur l’activité de la bactériocine CHM9
Températures
Durée
d’incubation
Surnageant natif
60°C
80°C
100°C
120°C
10 min
15 min
20 min
10 min
15 min
20 min
10 min
15 min
20 min
20 min
Diamètre du halo
d’inhibition
1,4
1,2
1,4
1,2
1,4
1,4
1,4
1,4
1,2
1,2
0,8
Les diamètres des zones d’inhibition sont mentionnés en cm.
Page 79
LBMB
On peut faire les remarques suivantes :
 L’activité de la bactériocine CHM9 n’est pas affectée par les traitements à 60, 80
ou 100°C pendant 10, 15 ou 20 minutes, mais l’autoclavage du surnageant de culture a
entraîné une perte partielle qu’on peut estimer à 30%. la thermorésistance des bactériocines
est notée par plusieurs chercheurs. L’acidocine D20079 n’est pas sensible aux traitements
thermiques à 70°C ou 100°C pendant 60min, alors que son activité est diminuée de 50% après
30 min à 120°C (Deraz et al., 2005). Les mêmes résultats ont été obtenus concernant l’activité
des bactériocines AMA-K et plantaricin LR/14 qui n’est pas affectée après 20 min à 121°C
(Todorov et al., 2007, Kumar Tiwari et Srivastava. 2008), alors que l’activité de la bozacine
14 et la bactériocine ST15 est complètement abolie à 121°C pendant 20 min (Ivanova et al.,
2000, Kwaadsteniet et al., 2005).
 L’activité inhibitrice de la CHM9 a été conservée après des traitements à des
températures assez élevées, comparables, à la pasteurisation (80°C pendant 10 min) et à la
stérilisation du lait (100°C pendant 5 min).
 Nous pouvons conclure que la bactériocine de la souche CHM9 est
thermorésistante.
 Grace à cette caractéristique, la bactériocine CHM9 peut être classée soit dans la
classe I ou II.
 Aussi la résistance de la bactériocine CHM9 à ces traitements (pH et températures)
est un témoin qu’elle peut présenter un grand intérêt en technologie agroalimentaire, soit au
cours de la fabrication soit en étape finale de fabrication mais aussi dans la conservation des
aliments.
3.8 Estimation de la quantité de bactériocine produite
La quantification de la bactériocine produite, permet d’apprécier sa concentration et a
été estimée en unité arbitraire par ml de surnageant de culture de la souche bactériocinogène.
Pour cela, nous avons utilisé la méthode de dilution critique décrite par Pucci et al.
(1988) mais réalisée selon Yanagida et al. (2005). Nous avons obtenu le résultat suivant:
Selon Parente et al. (1994), on calcule la quantité de bactériocine produite par la
formule suivante :
AU/ml = (1000/d)*D
d : est le volume mis dans les puits
Page 80
LBMB
D est le facteur de dilution.
Dans notre cas la dilution maximale de bactériocine ayant produit une inhibition est :
AU/ml = (1000/0,1)*1/8 = 1250 AU/ml
La quantité de bactériocine produite par CHM9 cultivée dans le milieu MRSm Tp est
de 1250 AU/ml de surnageant de culture.
Chaque bactériocine produite par une bactérie lactique se caractérise par une
concentration propre à sa production dans un milieu bien défini. Cette quantification dépend
de la sensibilité de l’indicatrice utilisée dans l’essai, l’utilisation d’une souche plus sensible
permet d’apprécier cette quantité à la hausse. Dans notre cas, chacune des conditions permet
de produire une quantité de bactériocine différente.
Pour cela, nous avons réalisé la cinétique de croissance et de production de la
bactériocine dans différents milieux, à savoir : le milieu MRS, MRS Tp, MRSm et MRSm Tp.
3.9 Cinétique de croissance bactérienne et de production de la bactériocine
Les cinétiques de croissance de la bactérie bactériocinogène et de production de la
bactériocine par la souche CHM9, permettent de nous donner des indications sur l’étape
durant laquelle la bactériocine est produite mais aussi sur la phase pendant laquelle la
production est maximale.
Selon la littérature, la plupart des bactériocines des bactéries lactiques sont des
métabolites primaires (De Vuyst et Vandamme, 1992), mais il existe certaines qui sont des
métabolites secondaires. Les métabolites primaires sont produits au cours de la phase de
exponentielle et jouent un rôle vital pour une croissance active, alors que les métabolites
secondaires sont synthétisés après la phase de croissance de l’organisme et n’interviennent
pas généralement dans les fonctions vitales de l’organisme (Kleinkauf et al., 1986).
Nous avons essayé de suivre la cinétique de croissance de la souche CHM9 et la
production de sa bactériocine toutes les deux heures d’incubation pendant 30 heures à 30°C
dans quatre milieux différents : MRS, MRS Tp, MRSm et MRSm Tp.
Les figures 26 (a, b, c et d) 27 (a, b, c et d) suivantes montrent le résultat obtenu :
Page 81
LBMB
c
a
t0
t2
t10
t4
t24
t0
t2
t0
t6
t26
t4
t2
t8
t28
t6
t4
t10
t24
t0
t2
t6
t28
t30
t4
t8
t10
t10
t8
t30
t8
t24
t26
t26
t28
b
d
t30
Figure 26 : Les cinétiques de production de la bactériocine dans quatre milieux différents.
a: MRS nTp, b: MRS Tp, c: MRSm nTp et d: MRSm Tp.
a
2,2
1,2
1
1,6
0,8
1,4
1,2
0,6
1
0,8
0,4
0,6
0,4
0,2
0,2
0
t=2
t=4
t=6
1,6
1,2
0,6
1
0,8
0,4
0,6
0,4
0,2
0,2
0
0
t=0
t=2
t=4
t=6
2
1
t=8 t=10 t=24 t=26 t=28 t=30
Diamètre du halo…
La DO (600nm)
d
1,2
1,8
0,8
1,4
t=8 t=10 t=24 t=26 t=28 t=30
2,2
1
1,8
La DO (600nm)
c
1,2
2
0
t=0
La DO (600nm)
2,2
2
1,8
b
La DO (600nm)
2,2
1,2
2
1
1,8
1,6
1,6
0,8
1,4
0,8
1,4
1,2
1,2
0,6
1
0,6
1
0,8
0,8
0,4
0,6
0,4
0,2
0,4
0,6
0,4
0,2
0,2
0,2
0
0
t=0
t=2
t=4
t=6
t=8 t=10 t=24 t=26 t=28 t=30
0
0
t=0
t=2
t=4
t=6
t=8 t=10 t=24 t=26 t=28 t=30
Figure 27 : Cinétiques de croissance bactérienne et de production de la bactériocine par
CHM9 dans quatre milieux différents.
(a) : MRS nTp
(b) : MRS Tp (c) : MRSm nTp
(d) : MRSm Tp.
Page 82
LBMB
L’analyse des deux figures précédentes nous permet de faire les remarques suivantes :

La souche CHM9 a un comportement différent dans les 4 milieux de culture
utilisés.

La production de bactériocine débute pendant la phase exponentielle dans les 4
milieux utilisés. Cependant l’effet inhibiteur maximum n’est pas atteint au même moment.
 Généralement, on remarque 3 à 4 phases selon les milieux:
☞ Phase de latence : de 0 à 2 heures d’incubation, est observé pour tous les milieux
☞ Phase d’accélération : elle est de 2 heures, cette phase n’est observée qu’en milieu
MRS et MRS Tp, pour les milieux MRSm et MRSm Tp, la souche CHM9 passe directement
de la phase de latence à la phase exponentielle.
☞ La phase exponentielle : est atteinte après 2h (MRSm non tamponné et tamponné)
à 4h (MRS non tamponné et tamponné) d’incubation et elle est achevée avant 24h
d’incubation pour les quatre milieux.
☞ La phase stationnaire : elle est atteinte avant les 24 heures d’incubation.
 La cinétique en milieu MRS
La croissance de cette souche est relativement faible dans le milieu MRS, par rapport
aux autres milieux. Après 2 heures d’incubation, une phase d’accélération est observée et à 4h
d’incubation, la croissance de la bactérie entame la phase exponentielle pour aboutir à la
phase stationnaire (une DO de 1,5), avant les 24 h d’incubation. La production de bactériocine
dans ce milieu est la plus faible par rapport aux autres milieux. Elle commence après 2h (avec
un halo de 0,3 cm), à 6h la production augmente (un halo de 0,6 cm) et reste stable jusqu’à
28h où on remarque une petite augmentation du halo (0,8 cm) pour diminuer légèrement à
30h (halo de 0,7 cm).
 La cinétique en milieu MRS Tp
La cinétique de croissance de la CHM9 en milieu MRS Tp est semblable à celle
observée en milieu MRSm Tp. à l’exception des 6 premières heures pendant lesquelles on
remarque une phase d’accélération qui précède la phase exponentielle dans le cas du MRS
tamponné. Après 6 h d’incubation, une croissance concomitante est observée entre celle en
milieu MRSm Tp et en MRS Tp. La production de bactériocine en milieu MRS Tp est aussi
similaire à celle observée en milieu MRSm Tp. Mais à 24h d’incubation une légère
augmentation est enregistrée (un halo de 1,2 cm) puis la diminution est amorcée à partir de
30h.
Page 83
LBMB
 La cinétique en milieu MRSm nTp
La croissance de la souche CHM9 est plus importante dans le milieu MRSm nTp que
dans les autres milieux. La phase exponentielle est rapidement atteinte après les 2 heures
d’incubation. La phase stationnaire commence avant les 24 h, avec une DO de 1,9. La
production de bactériocine dans ce milieu est importante, à 6 heures d’incubation, un halo de
1,0 cm de diamètre est mesuré. Cette production atteint son maximum à 8 heures (un halo de
1,2 cm) et reste stable jusqu’à 24h, Au delà, nous remarquons, une diminution des diamètres
des halos d’inhibition avec un léger bond à 28h. La diminution des halos d’inhibition est peut
être du, soit à une diminution de production de la bactériocine, soit à la dégradation par des
protéases non spécifiques synthétisées durant la phase stationnaire, soit à une agrégation des
bactériocines. Ceci est observé par plusieurs chercheurs, Todorov et Dicks, (2005c), ont noté
une diminution de la production de bactériocine ST311LD au-delà de 22h.
La reproductibilité du léger bond observé à 28h, doit être confirmée par d’autres
essais, dans le cas d’une confirmation, des explications doivent être apportées
 La cinétique en milieu MRSm Tp
La croissance de la souche CHM9 en milieu MRSm Tp débute après 2h d’incubation,
pour s’achever à la phase stationnaire avant les 24h avec une DO de 1,8. Après 30h
d’incubation, on remarque une augmentation de la DO à 1,9. La production de bactériocine
par la souche CHM9 dans le milieu MRSm Tp augmente progressivement puis se stabilise à
un premier palier à partir de 6 h (halo de 1 cm) puis un 2ème palier par augmentation de la
production est atteint à partir de 24h (halo de 1,2 cm de diamètre). La diminution en
bactériocine est amorcée à partir de 30h.
En comparant les cinétiques obtenues entre les différents milieux, on peut conclure ce
qui suit :

En générale, la production de la bactériocine CHM9 est négligeable pendant les
quatre premières heures, celle-ci commence après 6h d’incubation. Todorov et al. (2007) ont
remarqué que la production de AMA-K se fait après 5h d’incubation.

Une meilleure cinétique de croissance de la CHM9 est observée en milieu MRSm
nTp par rapport aux autres milieux: à titre indicatif, après 4h d’incubation, on note une DO de
0,96 de la CHM9 dans ce milieu, alors qu’elle est de 0,3 dans les milieux MRS et MRS Tp.
Une DO de 0,6 est enregistrée en milieu MRSm Tp. Concernant la production de bactériocine,
Page 84
LBMB
elle est presque identique dans les milieux MRSm nTp et Tp (à 24h d’incubation, une même
production est observée dans ces milieux).

La production de bactériocine commence au début de la phase exponentielle,
atteint son maximum au début de phase stationnaire, et reste presque stable durant cette phase.
Ce résultat rejoint celui observé par Tomé et al. (2008), en effet la production de la
bactériocine synthétisée par Enterococcus faecium ET05 a été détectée au début de la phase
exponentielle (6h) et atteint son maximum à 24h d’incubation c'est-à-dire pendant la phase
stationnaire.

La croissance de la souche CHM9 et la production de la bactériocine sont les plus
faibles en milieu MRS.

La croissance de la souche CHM9 et la production de bactériocine sont aussi
importantes dans le milieu MRS Tp.

Nous remarquons aussi, que le milieu tamponné, soit MRS ou MRSm, donne de
meilleure cinétique de croissance et de production de bactériocine. La présence de 2% de
K2HPO4 permet de tamponner le milieu à la neutralité ce même résultat a été décrit par
Mandal et al. (2008) qui ont observé une croissance optimale, de la souche Pediococcus
acidilactici LAB 5 (DO de 1,8) et une production maximale de la pediocine NV 5 dans un
milieu tamponné à pH6,6 (2200 AU/ml).
Tous ces résultats montrent que la bactériocine produite par CHM9 est un métabolite
primaire, synthétisé pendant la phase active de croissance (phase exponentielle). De
nombreux auteurs, dont Todorov et al. (2007), Cocolin et al. (2007), Ghrairi et al. (2008) et
Kumar et al. (2010), ont observé ce même résultat et ont indiqué que, la plupart des
bactériocines sont des métabolites primaires. Néanmoins de rares bactériocines ont été
décrites comme étant des métabolites secondaires, comme l’acidocine B, la production de
cette bactériocine par Lactobacillus acidophilus M46 n’est pas liée à la croissance (Ten Brink
et al.,1994). Biswas et al. (1991) ont indiqué que la pediocine AcH est produite à 60%
pendant les 8 premières heures et les 40% restants, sont synthétisés pendant les 8 heures qui
suivent. Ces auteurs ont considéré que cette bactériocine est un métabolite secondaire. Les
mêmes observations ont été faites par d’autres chercheurs mais, ils ont noté qu’il s’agit de
métabolites primaires (De Vuyst et al, 1996, Todorov et Dicks, 2005a et Todorov, 2008)
Page 85
LBMB
La purification des bactériocines ainsi que leur utilisation dans les différentes
industries nécessitent une bonne connaissance de leur comportement dans différentes
conditions et en présence de différents produits comme par exemple les détergents.
3.10 L’effet des détergents sur l’activité de la bactériocine
L’effet des détergents sur l’activité de la bactériocine permet de déterminer la
structure de la molécule, les détergents anioniques tels que le tween 80 interfèrent avec le
noyau intérieur (hydrophobe) de la protéine, ce qui peut affecter la conformation
tridimensionnelle de la molécule, (Ivanova et al., 2000).
Pour le test de l’effet des détergents sur l’activité de la bactériocine, le surnagent d’une
culture de la souche inhibitrice réalisée dans le milieu MRSm Tp est traité par le SDS, tween
20, tween80, triton X-100, urée et le NaCl à une concentration finale de 1% et par l’EDTA à
0,1, 2 et 5mM. Comme témoin, nous avons utilisé l’eau distillée stérile traitée de la même
manière pour visualiser l’effet inhibiteur ou pas des détergents sur la souche indicatrice H2.3.
Comme deuxième témoin nous avons utilisé du surnageant de culture non traité avec les
détergents. Le résultat obtenu est indiqué dans le tableau 21 ci-dessous :
Tableau 21 : L’effet de différents détergents sur l’activité de la bactériocine CHM9.
Echantillon testé
Traitement
Surnageant traité avec
1% SDS
1% tween 20
1% tween 80
1% triton X-100
1% NaCl
0,1 mM EDTA
2 mM EDTA
5 mM EDTA
Surnageant non traité
Eau distillée stérile
traitée avec
1% SDS
1% tween 20
1% tween 80
1% triton X-100
1% NaCl
0,1 mM EDTA
2 mM EDTA
5 mM EDTA
Diamètre des halos
d’inhibition
0,8
1,0
1,0
1,4
0,8
0,8
0,8
0,8
1,0
1,0
0
0
1,4
0
0
0
0
Page 86
LBMB
Le comportement de la bactériocine vis-à-vis des détergents a été différent. En effet,
certains détergents ont affecté l’activité de la bactériocine CHM9 alors que d’autres ne
causent aucune changement de son activité :
Les résultats obtenus, nous permettent de faire les remarques suivantes :

L’eau distillée stérile traitée par le SDS (détergent anionique) et le Triton X-100
(détergent non ionique) inhibent la H2.3 avec respectivement, un halo de 1,0 cm et 1,4 cm,
dans ce cas nous ne pouvons rien conclure quant à l’effet de ces deux détergents sur la
bactériocine CHM9. Cependant nous pouvons dire que l’effet des détergents et de la
bactériocine ne s’additionnent pas. Il semble même qu’on retrouve comme effet inhibiteur
seulement celui des détergents. La plantaricine C19 répond de la même manière face au
traitement par SDS et Triton X-100 (Atrih et al., 2001), alors que les bactériocines HA-61112 et HA-5692-3 ne sont pas affectées par le SDS mais perdent leur activités par le traitement
au Triton X-100 à 1%, (Albano et al., 2007).

Pour les autres échantillons, seule les surnageants traités inhibent H2.3, ce qui signifie
que la bactériocine n’est pas affecté par les traitements au tween 20, tween 80 (détergents non
ionique), le NaCl, et l’EDTA. Kumari et al. (2011) justifient ce résultat par le fait que ces
détergents n’ont causé aucune dissociation de la bactériocine ou ils n’ont pas provoqué des
agrégats qui font perdre l’activité, alors que le SDS dans leur cas a augmenté l’activité de la
bactériocine.
 Des bactériocines ont montré une résistante face à ces détergents et ont été décrites par
plusieurs auteurs, comme le cas de, la bozacine 14, la mesentericine ST99, la bactériocine
ST15, la bactériocine AMA-K, la bactériocine produite par la souche LR/6, la bactériocine
R1333 et les bactériocines SD1, SD2, SD3 et SD4 (Ivanova et al., 2000, Todorov et Dicks
2004, De Kwaadsteniet et al., 2005, Todorov et al., 2007, Todorov et al., 2010, Kumar et al.,
2010 et Schirru et al., 2012).

Dans notre cas, l’activité de la bactériocine n’a pas été sensiblement affectée par le
traitement au tween80, tween20, le NaCl et l’EDTA. Concernant l’effet du SDS et du triton
X-100 à 1%, nous ne pouvons rien conclure étant donné qu’ils ont montré un effet inhibiteur
sur la souche indicatrice, même utilisés seuls.
Page 87
LBMB

Pour la partie suivante, nous avons essayé de purifier notre bactériocine afin d’estimer
son poids moléculaire.
3.11 Purification partielle de la bactériocine
Les méthodes de purification des bactériocines sont nombreuses et différentes
stratégies sont décrites dans la littérature. Cependant seules quelques unes ont été
complètement purifiées, en effet les faibles rendements à l’issue de chacune des étapes des
stratégies établies rendent très difficile la purification sachant que les tests de mise en
évidence des bactériocines doivent toujours être réalisés sur des souches indicatrices.
Pour cela, pour une purification efficace, une étape de concentration de la bactériocine
produite est nécessaire.
Plusieurs méthodes ont été décrite pour la concentration de bactériocine, comme
l’emploi de solvants organiques (Piva et Headon, 1994), ou concentrer le surnageant à l’aide
d’un rotavapeur (Gao et al., 2010). Une ultrafiltration à l’aide de filtres spéciaux, ou une
précipitation par un sel sont aussi utilisées pour concentrer le surnageant de culture. Les sels
possèdent la propriété de relarguer les protéines. Le sulfate d’ammonium est largement utilisé
par la plupart des chercheurs.
3.11.1 Concentration de la bactériocine par le sulfate d’ammonium
Le sulfate d’ammonium est considéré comme un sel de choix, il est très utilisé pour
concentrer de nombreuses protéines. Cette méthode n’est pas très résolutive mais elle est
largement utilisée pour concentrer un extrait brut contenant des protéines. La précipitation au
sulfate d’ammonium est un procédé de séparation basé sur le degré de solubilité de la protéine
(Osterlund et Janson, 1997).
En se basant sur les principes de l’emploi de ce sel, nous avons réalisé la précipitation
au sulfate d’ammonium d’un surnagent de culture récupéré par 2 centrifugations d’une culture
réalisée dans le milieu MRSm Tp. Nous avons commencé par la saturation de 40%, le
précipité résultant a été suspendu à un dixième ou à un centième du volume initial, dans du
tampon K/Na2, pH7, 0,2M. Alors que le surnageant récupéré a été reprécipité pour avoir une
saturation finale de 50%, et ainsi de suite pour les autres précipitations jusqu’à 80%. L’essai
du précipité qui ne donnera aucune inhibition, indique que la saturation précédente a été
adéquate :
Page 88
LBMB
Le résultat obtenu est montré dans les figures 28 (a et b) et indiqué dans le tableau 22,
suivants :
a
b
S
S
P40%
S40%
S50%
S50%
P50
%
P50
%
Figure 27 : Concentration de surnageant de culture par sulfate d’ammonium.
a : récupération du précipité dans 1/10 du volume initial du surnageant.
b : récupération du précipité dans 1/100 du volume initial du surnageant.
Tableau 22 : La concentration par le sulfate d’ammonium du surnageant de culture de la
CHM9
Pourcentage de
saturation en sulfate
d’ammonium
Sur. natif
S
40%
P
S
50%
P
S
60%
P
S
70%
P
S
80%
P
S : surnageant
Récupération à
1/10 du volume
initial
Récupération à
1/100 du volume
initial
1,2
1,4
0,1
0,1
1,4
0
0
0
0
0
0
0,2
2,6
-
P : précipité
: test non réalisé
 L’inhibition de la H2.3, par le surnageant de culture résultant de la précipitation à la
saturation 40%, a donné un halo dont le diamètre est égal à celui obtenu avec le surnageant
natif.
Page 89
LBMB
 Alors que le diamètre de l’inhibition de son précipité est très faible. Ceci indique que la
saturation à 40% en sulfate d’ammonium n’a pas totalement précipitée la bactériocine CHM9.
 Le précipité de saturation à 50% a donné un diamètre d’inhibition de 1,4 cm et l’effet
inhibiteur du surnageant de cette saturation est très faible (0,1 cm). On peut conclure que 50%
est le pourcentage de saturation adéquat pour faire précipiter la bactériocine CHM9.
 Lors des centrifugations effectuées pour la récupération des précipités, nous avons
observé des pellicules à la surface des surnageants. Ces pellicules n’ont pas pu être récupérées
totalement, mais lorsqu’elles ont été testées par la méthode de diffusion en puits, un effet
inhibiteur a été observé par la formation de petits halos d’inhibition. Cette constatation a été
faite par plusieurs auteurs. Deraz et al. (2005) ont suggéré que la présence de tween 80 dans le
milieu interfère avec les protéines, après précipitation au sulfate d’ammonium, les
bactériocines liées au tween 80 (de nature lipidique, légère) sont présentes à la surface des
surnageants de culture après centrifugation. Muriana et Klaenhammer, (1991) et Van Laack et
al. (1992) ont remarqué trois phases distinctes après centrifugation :
☞ Le précipité
☞ Le surnageant de culture
☞ Une phase à la surface constituée de pellicules contenant des bactériocines (avec une
activité antimicrobienne).
Ces auteurs expliquent que ce phénomène est causé par la présence de tween80 dans le milieu
MRS.
 La thermophiline ST-1 produite par Streptococcus thermophilus ACA-DC 0001
(Aktypis et Kalantzopoulos, 2003), la curvaticine L442 produite par Lactobacillus curvatus
L442 (Xiraphi et al., 2005) et la bactériocine SD1 produite par Enterococcus faecium SD1
(Schirru et al., 2012) précipitent bien à 50% de saturation en sulfate d’ammonium.
 Pour concentrer plus le surnageant de culture, nous avons suspendu le précipité à 50%
du surnageant de culture à un centième du volume initial, ceci nous a montré un meilleur effet
inhibiteur (l’effet inhibiteur de la bactériocine a augmenté de 2,2 fois), montré dans la figure
27b présentée ci-dessus.
 Chaque bactériocine décrite dans la littérature est précipitée par le sulfate d’ammonium
à une saturation bien définie. En effet, quelque soit la bactérie productrice de bactériocine, des
saturations allant de 40% à 90% de saturation en sulfate d’ammonium sont utilisées pour
précipiter les bactériocines.
Page 90
LBMB
 La propionicine T1, la bactériocine AMA-k et la bactériocine HA-6111-2 produites par
Propionibacterium thoenii T1, Lactobacillus plantarum AMA-K et Pediococcus acidilactici,
ont toutes été précipitées à 40% (Faye et al., 2000, Todorov et al., 2007, Albano et al., 2007).
D’autres bactériocine sont précipitées à une saturation de 60% à 65% en sulfate d’ammonium,
comme l’entérocine ON-157 produite par Enterococcus faecium NIAI 157 (Ohmomo et al.,
2000), l’acidocine D20079 produite par Lactobacillus acidophilus DSM 20079 (Deraz et al.,
2005) et la bactériocine produite par Lactococcus lactis subsp lactis LL171 (Kumari et al.,
2011), alors que la plantaricine S produite par Lactobacillus plantarum LPCO10, la
bactériocine ENTI produite par Enterococcus faecium 6T1a, et la sakacine LSJ618 produite
par Lactobacillus sakei LSJ618 précipitent à 80% de saturation en sulfate d’ammonium
(Jiminez Diaz et al., 1995, Floriano et al., 1998, Jiang et al., 2012), quand à la plantaricine
LR14 produite par Lactobacillus plantarum LR/14, elle a été précipité à 90% de saturation en
sulfate d’ammonium (Kumar Tiwari et Srivastava, 2008).

On peut conclure que la précipitation à 50% de saturation en sulfate d’ammonium
permet la précipitation de la bactériocine produite par Lactobacillus sp CHM9.

Lors des essais ultérieurs, une diminution ou une absence du halo d’inhibition, ont été
observés, respectivement, avec le surnagent de la précipitation à 40%, et du précipité à 50%.
Ceci est du à la perte d’activité de la bactériocine. La perte de l’activité des fractions
précipitées par le sulfate d’ammonium est aussi notée par Doumandji et al. (2010). D’où la
nécessité d’effectuer un dessalement. Pour cela, nous avons précipité le surnageant de culture
à 50%, et le précipité est récupéré dans un centième du volume initial du surnageant de
culture.

Le dessalement après une précipitation au sulfate d’ammonium peut être réalisé par
une simple dialyse ou par chromatographie en gel filtration en utilisant généralement le
Sephadex G25.
3.12.2 Dessalement
Le dessalement par simple dialyse présente deux principaux inconvénients : la
nécessité de changer le milieu de dialyse de temps à autre et la lenteur de la méthode. Pour
cela, le dessalement par une chromatographie en gel filtration a préférentiellement été utilisé.
En plus de sa rapidité, cette méthode permet de séparer les protéines. Le Sephadex G25 est le
gel utilisé pour cette technique (Scopes, 1994).
Page 91
LBMB
Un échantillon de 13 ml (obtenu après précipitation à 50% et récupération du précipité
dans un tampon d’un centième du volume initial) est déposé dans une colonne de (45×1,3)
cm2 de Sephadex G25 pré-équilibrée par le tampon de Na2/K, 0,05 M, pH7,0. Cet échantillon
(jusqu’à 30% du volume du gel) est élué avec ce même tampon (3 fois le volume du gel), à un
débit de 2 ml/min. Des fractions de 1,5 ml sont collectées et leurs densités optiques sont
mesurées à 280nm. De l’ensemble des fractions présentant des pics, seule la moitié (une
fraction sur deux) seront testées par la méthode de diffusion en puits. Les résultats obtenus
sont présentés en figures 29 et 30.
25
F2
F1
0,45
0,4
20
0,35
DO des fraction à 280 nm
0,3
15
0,25
0,2
10
0,15
0,1
5
0,05
0
0
1
4
7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94 97 100 103 106
Figure 29 : chromatogramme représentant la DO à 280 nm des fractions obtenues par la
chromatographie et graphe de l’effet inhibiteur des fractions.
P50
%
f22
f20
f26
f28
f24
f30
f26
f32
f34
Figure 30 : L’effet inhibiteur des fractions obtenues par la chromatographie.
Page 92
LBMB
D’après le résultat obtenu, les remarques suivantes peuvent être faites :
Le graphe obtenu représente la DO des fractions obtenues à 280 nm et montre deux grands
pics :
☞ F1 (de la fraction 20 à la fraction 32) dont la DO la plus élevée est de 17.
☞ F2 (de la fraction 33 à la fraction 56) dont la DO la plus élevée est de 21.

Ces deux grands pics, renferment des petits pics. Ces DO élevées reflètent la quantité
importante des protéines dans les fractions, et sont les premières à être éluées par leur poids
moléculaire plus important que celui des sels d’ammonium.

Après le pic F2, les DO sont moins importantes (de 0,1 à 2,5). Ces petites DO
constituent fortement les sels d’ammonium qui sont retardés à cause de leurs faibles poids
moléculaires.

De ce fait, nous n’avons testé seulement les fractions des deux pics F1 et F2 par la
méthode de diffusion en puits.
D’autre part, le test de l’effet inhibiteur des fractions des pics F1 et F2 montre que :
 Le halo d’inhibition du précipité était de 0,8 cm. Les fractions de 20 à 27 du pic F1 ont
montré un effet inhibiteur qui s’est exprimé par un halo d’inhibition de 0,4cm, par contre, la
fraction 28 présente un halo d’inhibition de seulement 0,1 cm.
Cette diminution du halo d’inhibition est du à différents phénomènes :
 La dilution lors de l’élution, en effet les fractions collectées sont diluées après
chromatographie.
 Scopes (1994), indique que cette méthode cause une perte de protéines d’environ 10 à
15%.
 La présence de substances dans le surnageant de culture, qui sont essentielles pour
l’activité de la bactériocine et qui ne sont pas éluées avec la bactériocine au cours de la
chromatographie (Jiménez-Diaz et al., 1995).
Ceci a été observée par plusieurs auteurs, Kumar Tiwari et Srivastava, (2008) ont
indiqué que l’activité totale de la bactériocine produite par Lactobacillus plantarum LR/14
diminue d’environ 4 fois après le passage du précipité en chromatographie échangeuse de
cation, de la même manière l’activité de la plantaricine S a subi une perte de 4 fois après une
chromatographie (Jiménez-Diaz et al., 1995).
Page 93
LBMB
 Les autres fractions de ce pic n’ont montré aucun effet inhibiteur, ceci peut être du à la
dilution plus importante de ces fractions, ou alors il s’agit d’autres protéines, que la
bactériocine, produites par la souche CHM9.
3.11.3 Estimation du poids moléculaire par électrophorèse tricine SDS-PAGE
La SDS PAGE (électrophorèse en gel d’acrylamide en utilisant le sodium dodécyl
sulfate, en condition non dénaturante) est une méthode très utilisée pour séparer les protéines,
selon leur poids moléculaire. Cette séparation permet de mettre en évidence les protéines qui
constituent un échantillon.
La tricine SDS PAGE (Schägger et Von Jagow, 1987) utilise un tampon de cathode
plus résolutif (la tricine) que celui utilisé dans l’électrophorèse en SDS PAGE. Ainsi, elle est
destinée pour la séparation des protéines de poids moléculaire allant de 5 à 20KDa. Pour cela,
un gel contenant trois concentrations en acrylamide (16%, 10% et 4%) est constitué (voir
annexe 2). Après polymérisation du gel, 60 µl des échantillons traités par un tampon de
charge, ont été déposés en double (sauf les marqueurs de taille) dans les puits du gel. Les
échantillons sont :
☞ Marqueur.1 : lysozyme (0,8mg/ml) (14,4 KDa)
☞ Marqueur.2 : nisine (0,8mg/ml) (3,3 KDa)
☞ échantillon.1 : Surnageant obtenu en MRSm.
☞ échantillon.2 : Surnageant obtenu en MRSm tamponné (nouveau)
☞ échantillon.3 : précipité 50%.
Après électrophorèse (50 V, 18h), le gel est coupé en deux parties,

la partie qui contient les marqueurs de tailles sera colorée par une solution de
coloration (voir annexe 2) et décolorée par une solution de décoloration (voir annexe 2), après
l’avoir traitée par une solution de fixation (voir annexe 2).

L’autre partie sera fixée par une autre solution d’isopropanol/acide acétique/eau
distillée (20:10:70) et rincée plusieurs fois à l’eau distillée stérile. Elle sera déposée sur une
surface de gélose solide tamponnée, on coule dessus une gélose molle ensemencée par
l’indicatrice H2.3.
Le résultat obtenu est montré dans les figures 31 (a et b) suivantes :
Page 94
LBMB
1
2 3
4
a
b
5
5
Zone d’inhibition
de la H2.3.
Figure 31 : Tricine SDS PAGE de différents échantillons de surnageant.
(a) gel coloré par le bleu de Coomassie R250.
(b) gel mis à l’essai pour le pouvoir inhibiteur des échantillons.
1 : Mar.1 : lysozyme (0,8mg/ml) (14,4 KDa)
2 : Mar.2 : nisine (0,8mg/ml) (3,3 KDa)
3 : échant.1 : Surnageant obtenu en MRSm.
4 : échant.2 : Surnageant obtenu en MRSm Tp.
5 : échant.3 : précipité 50%.
D’après les résultats obtenus, les observations suivantes peuvent être faites :
 La migration de l’échantillon de lysozyme donne, 3 bandes dont la dernière est
intense, cette dernière correspond au lysozyme. Les deux autres bandes indiquent que le
lysozyme est en présence de deux autres protéines, dont on ne connaît pas le poids
moléculaire, néanmoins, ils sont nettement inférieur à 14,4 KDa. Le deuxième marqueur qui
est la nisine n’a donné aucune bande électrophorétique.
 Aucune bande électrophorétique n’est observée dans les cas du surnageant 1 et du
surnageant issu du milieu MRSm tamponné, ceci peut être du, à la faible concentration de la
bactériocine. Ces échantillons n’ont pas, non plus, donné des inhibitions.
 La migration du précipité à 50% donne 4 bandes, dont la dernière est sous forme d’une
bande opaque et diffuse. Cette dernière correspond à celle qui a inhibé l’indicatrice H2.3. Ce
résultat confirme bien que l’absence de bandes électrophorétiques et de l’effet inhibiteur dans
le cas des échantillons 1 et 2 est bien du à la faible concentration en bactériocines.
 La bande qui correspond à la bactériocine CHM9 a un poids moléculaire nettement
inférieur à 14,4 KDa. Ce qui confirme bien qu’il s’agit d’une bactériocine de la classe I ou II.
Page 95
LBMB
Plusieurs auteurs, ont observé une bande électrophorétique diffuse, cette bande
correspondait au peptide qui a inhibé l’indicatrice. En effet, van Reenen et al. (1998), ont
observé une trainée après coloration du gel au bleu de Coomassie. Cette bande (la plantaricine
423) correspondait à une bande peptide de 3,5 KDa, qui a inhibé la croissance de Listeria
monocytogenes. Todorov et al. (2007), ont aussi observé ce genre de bande (bande diffuse),
après coloration au bleu de Comassie du gel. Cette bande (2,9 KDa) correspondait à la
bactériocine AMA-K, qui a inhibé la croissance de la souche Lactobacillus casei LHS. Kumar
Tiwari et Srivastava (2008), ont observé des bandes électrophorétiques diffuses de la
plantaricine LR14 α et β, après coloration du gel au bleu de Coomassie. ces bandes ont des
poids moléculaires compris entre 3,4 à 6,2 KDa.
D’autres auteurs, décrivent les bactériocines synthétisées par les espèces de
Lactobacillus, comme étant des bactériocines dont le poids moléculaire ne dépasse pas les 10
KDa (De Vuyst et Vandamme, 1994), comme les plataricines produites par les souches de
Lactobacillus plantarum, dont le poids moléculaire est inférieur ou égal à 10KDa (JiménezDiaz et al., 1995) et les sakacines synthétisées par les espèces de Lactobacillus sake, qui ont
des poids moléculaire qui varient entre 3,8 et 5,5 KDa (Gao et al., 2010). D’autres auteurs,
notent que la plupart des bactériocines produites par les lactobacilles sont de la classe IIa.
A ce stade, puisque la bactériocine CHM9 n’a pas été dégradée par les 3% de SDS
contenu dans le tampon de charge (annexe 2), nous pouvons déduire que 1% de SDS n’a pas
affecté l’activité de la bactériocine CHM9 (résultat du § 3.10). Cette constatation a été aussi
notée par De Kwaadsteniet et al. (2005), en effet, lors de l’électrophorèse en tricine SDSPAGE, la mundtcine KS produite par Enterococcus mundtii ST15, a montré une bande
peptidique active, et ont conclu que cette bactériocine n’a pas été inactivé en présence de 1%
de SDS.
Page 96
Page 97
LBMB
Conclusion & perspectives
4. Conclusion générale et perspectives:
Les bactéries lactiques sont un outil de bioconservation efficace de nombreux aliments
et Grace à leur métabolisme, elles sont reconnues comme GRAS. Parmi les produits de leur
métabolisme, les bactériocines sont des substances antimicrobiennes efficaces et très
recherchées pour des applications en industrie agro-alimentaire, parapharmaceutique et
pharmaceutique.
C’est dans ce sens que s’inscrit l’objectif de notre travail qui consiste à détecter des
bactéries lactiques bactériocinogènes et de faire une étude microbiologique, physico-chimique
et biochimique de leurs bactériocines.
Nous avons réalisé, tout d’abord, un criblage des interactions négatives chez 24
souches lactiques testées les une contre les autres (14 souches du genre Leuconostoc et 10
souches du genre Lactobacillus), isolées de différents biotopes. La méthode directe, a montré
que les lactobacilles sont plus inhibiteurs que les leuconostocs. Cependant l’effet inhibiteur de
ces souches, par la méthode indirecte (Schillinger et Lücke, 1989) était très faible et non
reproductible.
L’addition de 2,5% d’extrait de levure et de 25% de lait dans le milieu MRS
(MRSY+lait), a permis de montrer une activité inhibitrice importante contre H2.3, par les
surnageants de culture des souches Lactobacillus sp CHM9, Lactobacillus sp CHM18 et une
souche de Leuconostoc mesenteroides subsp dextranicum CHBK310.
L’agent inhibiteur produit par ces souches, a été dégradé par la trypsine et la pronase
E, et n’a pas été affecté en présence de catalase, alors que, la pepsine n’a levé que très
faiblement l’effet inhibiteur de ces trois inhibitrices. Ceci nous permet de conclure que les
inhibitions produites par les trois souches contre H2.3 sont dues à des bactériocines que nous
avons nommé, Bactériocine CHM9, Bactériocine CHM18 et mésentéricine CHBK310.
Puis, nous avons essayé d’optimisation la production de la bactériocine CHM9, tout en
suivant la croissance bactérienne. La production de la bactériocine CHM9 a été optimisée
dans du MRS modifié (MRSm) en source d’azote (1% try+0,5% EV+0,5%EY) et en source
de potassium (2% de K2HPO4). Le glucose à 2% constitue la meilleure source de carbone
pour une production importante de la bactériocine. Les températures d’incubation 25, 30,35 et
40°C n’ont pas affectées la production de la bactériocine CHM9, alors qu’à 45°C, une très
faible production a été enregistrée. La diffusion de la bactériocine CHM9 dans les géloses
(molle et solide) est meilleure dans les conditions tamponnées à pH7.
Page 98
LBMB
Ensuite, nous avons comparé l’effet de différents milieux et conditions de culture de la
souche CHM9 sur la production de sa bactériocine, à savoir : MRS, MRSY et MRSm, en
conditions, tamponnées ou pas, supplémentés en lait ou pas. Une production maximale de la
bactériocine CHM9 a été enregistrée en milieu MRSm Tp et MRSm Tp+lait. Le milieu
MRSm Tp a été utilisé pour la suite de notre travail. La quantité de la bactériocine CHM9
produite dans ce milieu, est estimée à 1250 AU/ml.
La bactériocine CHM9 n’est généralement pas affectée par les pH acides ou basiques
(de 2 à 12), ni aux traitements à la chaleur (60, 80 et 100°C pendant 10, 15 et 20min et 120°C
pendant 20min). Ces caractéristiques ouvrent une perspective d’utilisation de la bactériocine
en agro-alimentaire, et permet de la situer en classe I ou II.
La cinétique de croissance bactérienne et de production de la bactériocine par la
souche CHM9 dans les milieux MRS et MRSm, non tamponnés (nTp) et tamponnés (Tp),
montre que la production de la bactériocine commence dès 6 heures d’incubation (phase
exponentielle), indiquant qu’il s’agit d’un métabolite primaire. Une production maximale
étant atteinte au début de la phase stationnaire (24 h). Les milieux MRSm nTp et Tp,
permettent la meilleure production de la bactériocine CHM9.
L’activité de la bactériocine n’a pas été sensiblement affectée par le traitement au
tween80, tween20, le NaCl et l’EDTA. Concernant l’effet du SDS et du triton X-100 à 1%,
nous ne pouvons rien conclure étant donné qu’ils ont montré un effet inhibiteur sur la souche
indicatrice, même utilisés seuls. Néanmoins, la présence d’une bande électrophorètique
inhibitrice de la H2.3, dans le gel de tricine SDS-PAGE (tampon de charge à 3% de SDS),
indique que la bactériocine CHM9 n’a pas été dégradée par les 1% de SDS.
La bactériocine produite par CHM9 a été précipitée à 50% en sulfate d’ammonium, le
dessalement par chromatographie en gel de Sephadex G25 a montré un chromatogramme à
deux grand pics. Certaines fractions du premier pic ont montré un effet inhibiteur.
L’estimation, du poids moléculaire de la bactériocine, a été effectuée avec un précipité
à 50% réalisé avec du sulfate d’ammonium. Ce précipité a donné 4 bandes électrophorètiques,
dont la dernière est sous forme d’une bande dense et diffuse. Cette bande correspond à la celle
qui a inhibé la H2.3, et son poids moléculaire est nettement inférieur à 14,4KDa. Les autres
échantillons (natifs) n’ont donné aucune bande électrophorétique.
Page 99
LBMB
Pour approfondir plus, cette étude, notre travail pourra être complété par :

La stimulation de la production de bactériocines chez les 21 autres souches
utilisées dans cette étude, en essayant d’autres moyens d’optimisation, en vu de
détecter d’autres bactéries bactériocinogènes.

L’optimisation de la production de la bactériocine CHM18 et de la
mésentéricine CHBK310.

L’optimisation de la production de la bactériocine CHM9, en essayant d’autres
sources d’azote, afin de repérer les acides aminés nécessaires pour une
production maximale. D’autres sources de carbone, peuvent être aussi étudiées,
pour leur effet sur la production de bactériocine.

La confirmation que dans le cas des 2% de KH2PO4, il s’agit bien d’une lyse
cellulaire.

L’identification moléculaire des souches Lactobacillus sp CHM9 et CHM18,
pour faire une comparaison de leur bactériocines avec celles décrites dans la
littérature.

La quantification de la production de la bactériocine CHM9 dans les milieux,
qui ont permis une bonne production (MRS Tp et MRSm), et la recherche
d’une souche indicatrice plus sensible, pour une meilleure évaluation de la
quantité de cette bactériocine en AU/ml.

L’utilisation des marqueurs de taille, pour une estimation précise du poids
moléculaire, de la bactériocine CHM9, afin de déterminer avec exactitude la
classe à laquelle elle appartient.

De connaître le spectre d’action de la bactériocine CHM9,
en utilisant
différentes bactéries pathogènes et/ou d’altération, comme : E. coli, des
espèces de Pseudomonas, de Salmonella, de Shigella et d’autres...
Page 100
Tableau 10 : Les interactions inhibitrices inter-bactériennes exercées par les souches utilisées
IN
LVK11
LVK30
LVK31
LVK32
CHM9
CHM18
CHM19
H2.3
CHTD27
CHTD29
CHBK309
CHBK310
CHBK311
CHBK312
CHBK314
CHBK315
CHBK316
CHM9
1,0
1,2
1,2
0,8
0,9
0,9
1,6
0,9
0
0
0,9
0,7
0,7
1,2
0,6
0,6
0,6
CHM18
1,0
1,2
1,2
0,8
1,0
0,9
1,6
0,9
0
0
0,9
0,7
08
1,2
0,6
0,6
CHM19
0,9
0,9
0,7
0,6
0,6
0,9
1,6
0
0
0
0,9
0,7
0.7
1,2
0
0
LVK11
0,8
1,1
1,0
0,8
0,7
0,9
1,6
0,8
0
0
0,9
0,8
0.7
1,2
0,6
LVK30
0,9
1,1
1,0
0,8
0,7
0,9
1,6
0,8
0
0
0,9
0,7
0,8
1,2
LVK31
0,7
1,0
1,0
0,8
0,9
1,0
1,6
0,7
0
0
0,9
0,7
0,8
1,0
LVK32
0,9
1,0
1,0
0,8
0,8
0,9
1,6
0,8
-
0
0,9
0,8
0,8
CHTD27
1,2
1,4
1,5
1,0
1,1
0,9
2,4
-
0,6
0,6
0,9
0,8
CHTD29
1,0
1,4
1,5
1,0
1,2
1,0
2,4
-
0,6
0,6
0,9
0,8
BH14
1,2
1,4
1,5
1,0
1,2
1,0
2,4
0,9
-
0,6
0,9
CHBK309
0,8
-
0,7
0,9
-
-
0,9
0,9
0
0
CHBK310
1,0
-
0,9
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
0
0
CHBK311
1,1
-
0,9
0,9
1,0
1,0
1,0
0,9
0
CHBK312
1,0
-
0,8
1,0
1,0
1,0
1,0
0,9
CHBK314
1,1
-
0,9
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
CHBK315
1,1
-
0,8
0,9
1,0
1,0
1,0
CHBK316
1,0
-
0,9
0,9
1,0
1,0
CHBK318
1,0
-
0,8
0,8
1,0
1,1
CHBK319
0,6
-
0,6
0,7
0,8
CHBK320
1,0
-
1,0
1,0
CHBK323
1,0
-
0,9
0,8
CHBK325
1,0
-
1,0
CHBK326
1,0
-
CHBK327
1,1
-
LEUCONOSTOC
LACTOBACULLUS
ID
CHBK319
CHBK320
CHBK323
CHBK325
CHBK326
CHBK327
-
0,6
0,7
0,8
0.5
0,7
0,7
0,6
-
0,6
0,7
0,8
0,5
0,8
0,8
0
-
0
0,7
0,8
0
0,8
0,7
0,6
0,6
-
0,6
0,7
0,8
0,5
0,8
0,7
0.6
0,6
0,6
-
0,6
0,7
0,8
0,5
0,8
0,6
0.6
0,6
0,6
-
0,6
0,7
0,7
0,5
0,7
0,7
1,0
0,6
0,6
0,6
-
0,6
0,6
0,8
0,5
0,7
0,6
0,9
1,4
1,0
1,0
0,9
-
0,9
0,9
0,7
1,0
0,8
0,8
0,9
1,4
0,9
0,9
0,9
-
0,8
0,9
0,7
0,9
0,8
0,9
0,8
0,9
1,4
1,0
0,9
0,9
-
0,9
0,9
0,7
0,9
0,8
0,9
0,8
0,6
0,6
0,6
0,6
-
0,6
0,7
0,7
0,6
0,6
0,6
0,6
0,6
0,8
0,8
0,6
0,7
0,6
-
0,7
0,8
0,8
0,8
0,7
0,7
0,7
0,8
0
0,7
0,8
0,6
0,7
0,6
-
0,7
0,8
0,8
0,8
0,7
0,7
0,7
0,8
0
0
0,8
0,8
0,7
0,7
0,6
-
0,7
0,8
0,8
0,8
0,7
0,7
0,7
0,8
0
0
0,8
0,7
0,7
0,7
0,6
-
0,7
0,8
0,7
0,8
0,7
0,7
0,7
0,8
1,0
0
0
0,8
0,8
0,7
0,7
0,6
-
0,7
0,8
0,7
0,8
0,7
0,7
0,7
0,7
1,0
1,0
0
0
0,8
0,8
0,7
0,7
0,6
-
0,7
0,8
0,7
0,8
0,7
0,7
0,7
0,8
1,0
0,9
0
0
0,8
0,8
0,6
0,7
0,6
-
0,7
0,8
0,8
0,7
0,7
0,7
0,7
0,8
0,9
0,9
0,8
0
0
0,6
0,6
0,7
0,6
0,6
-
0,6
0,7
0,6
0
0,6
0,6
0,6
0,7
1,0
1,0
1,0
1,0
0
0
0,8
0,8
0,7
0,7
0,6
-
0,7
0,8
0,8
0,8
0,7
0,7
0,7
0,7
0,9
0,9
1,0
0,9
0
0
0,8
0,8
0,7
0,7
0,6
-
0,7
0,8
0,8
0,7
0,7
0,7
0,7
0,7
1,1
1,0
0,9
1,0
1,0
0
0
0,8
0,8
0,7
0,7
0,6
-
0,7
0,8
0,8
0,7
0,7
0,7
0,7
0,7
1,0
1,0
1,0
0,9
1,0
1,0
0
0
0,9
0,6
0,7
0,8
0,6
-
0,7
0,8
0,8
0,7
0,7
0,7
0,7
0,8
1,0
1,1
1,0
0,9
1,0
1,0
0
0
0,9
0,7
0,7
0,7
0,6
-
0,7
0,8
0,8
0,8
0,7
0,7
0,7
0,8
Les diamètres sont mentionnés en centimètre.
In : Inhibitrices.
CHBK318
Id : Indicatrices.
102
Tableau 12 : L’effet de l’addition du lait à 25% dans du MRS supplémenté de 2,5% d’extrait
de levure sur la production de l’agent inhibiteur par les 24 souches.
Les
souches
CHBK312
CHBK314
CHBK325
CHM9
CHM18
LVK11
CHBK310
CHBK311
CHBK315
LVK30
LVK31
LVK32
Les milieux de
culture
MRSY
MRSY Tp
MRSY+lait
MRSYTp+lait
MRSY
MRSY tp
MRSY+lait
MRSY Tp+lait
MRSY
MRSY Tp
MRSY+lait
MRSYTp+lait
MRSY
MRSY Tp
MRSY+lait
MRSYTp+lait
MRSY
MRSY Tp
MRSY+lait
MRSYTp+lait
MRSY
MRSY Tp
MRSY+lait
MRSYTp+lait
MRSY
MRSY tp
MRSY+lait
MRSY Tp+lait
MRSY
MRSY Tp
MRSY+lait
MRSY Tp+lait
MRSY
MRSY Tp
MRSY+lait
MRSY Tp+lait
MRSY
MRSY Tp
MRSY+lait
MRSY Tp+lait
MRSY
MRSY Tp
MRSY+lait
MRSTp+lait
MRSY
MRSY Tp
MRSY+lait
MRSY Tp+lait
CHM19
Non TP
TP
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0,6
0,6
0
0
0,6
0,6
0
0
0
0
0
0
0
0,3
0
0
0,2
0*
0
0
0
0*
0
0
0
0*
0
0
0,2
0*
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0,6
0,6
0
0
0,6
0,6
0
0
0
0
0
0
0,8
0,3
0
0
0
0*
0
0
0
0*
0
0
0
0*
0
0
0,4
0*
0
0
0
0*
H2.3
Non TP
TP
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1,2
1,0
0
0
1,2
1,2
0
0
0
0
0,6
0,6
0
1,6
0
0
0,8
0*
0
0
0
0*
0,2
0
0
0*
0
0
0
0*
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1,4
1,2
0
0
1,2
1,2
0
0
0
0
0,8
0,8
0
1,8
0
0
0,8
0*
0
0
0
0*
0,2
0
0
0*
0
0
0
0*
0
0
0
0
103
Tableau 12 (suite) : L’effet de l’addition du lait à 25% dans du MRS supplémenté de 2,5%
d’extrait de levure sur la production de l’agent inhibiteur par les 24 souches.
Les
souches
CHBK316
CHBK318
CHBK320
CHBK323
CHBK327
CHBK326
CHM19
CHTD27
CHTD29
BH14
Les milieux de
culture
MRSY
MRSY Tp
MRSY+lait
MRSY Tp+lait
MRSY
MRSY Tp
MRSY+lait
MRSYTp+lait
MRSY
MRSY Tp
MRSY+lait
MRSY Tp+lait
MRSY
MRSY Tp
MRSY+lait
MRSY Tp+lait
MRSY
MRSY Tp
MRSY+lait
MRSYTp+lait
MRSY
MRSY Tp
MRSY+lait
MRSY Tp+lait
MRSY
MRSY Tp
MRSY+lait
MRSY Tp+lait
MRSY
MRSY Tp
MRSY+lait
MRSYTp+lait
MRSY
MRSY Tp
MRSY+lait
MRSYTp+lait
MRSY
MRSY Tp
MRSY+lait
MRSYTp+lait
CHM19
Non Tp
Tp
0
0
0
0*
0
0
0
0*
0
0
0
0*
0
0
0
0*
0
0
0
0*
-
0
0
0
0*
0
0
0
0*
0
0
0
0*
0
0
0
0*
0
0
0
0*
-
Les diamètres sont mentionnés en cm. 0* : halos trouble
H2.3
Non Tp
Tp
0
0
0
0*
0
0
0
0*
0
0
0
0*
0
0
0
0*
0
0
0
0*
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0*
0
0
0
0*
0
0
0
0*
0
0
0
0*
0
0
0
0*
0
0
0
0,8
0
0
0
0,4
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
- : non déterminé
104
105
Les milieux de culture

MRS
Peptone 10g
Extrait de viande10g
Extrait de levure 5g
Glucose 20g
Acétate de sodium 5g
Citrate d’ammonium 1g
Sulfate de manganèse 0,05g
Sulfate de magnesium 0,1g
Phosphate dipotassique 2g
Tween80 1ml
pH6,8
Pour 1000 ml de culture
Stériliser à 120°C pendant 20 min (autoclavage).

Mayeux
Tryptone 10g
Saccharose 100g
Citrate de sodium 1g
Glucose 5g
Gélatine 2,5g
Azide de sodium 0,0075g
pH7
pour 1000ml de culture
stériliser à 120°C peandant 20 min (autoclavage)
La procédure de la coloration de Gram

Recouvrir le frottis fixé d’une quantité suffisante de violet de Gentiane, laisser en
contact 1 minute.
Entrainer le violet de Gentiane avec le Lugol, Recouvrir la lame de Lugol et laisser agir 1
minute. Ne pas laver à l’eau.
Décolorer aussitôt par L’alcool, pour cela verser l’alcool à la surface de la préparation
placé obliquement et observer sa couleur, la coloration est violet, puis bleuté. Avant
qu’elle soit incolore, laver rapidement à l’eau courante.
Recouvrir la lame de la solution Fushine laisser agir 20 à 30 secondes, laver et sécher par
exemple.



L’observation au microscope :
Les bactéries à Gram +, sont colorées en violet noir.
Les bactéries à Gram -, prennent la couleur rose.
La préparation des tampons et solutions

Tampon K/Na2 à 0,2M, pH7, pour 600ml de tampon :
106
La solution A : la solution de KH2PO4 à 0,2 M. Dissoudre 5,44g (136,96g/mole) dans 200ml
d’eau distillée.
La solution B : La solution de Na2HPO4 à 0,2 M. Dissoudre 11,35g (141,96g/mole), ou
28,65g (358,14g/mole) dans 400ml d’eau distillée.
Mélanger les deux solutions A et B en vérifiant le pH du mélange.

Pour 0,05M de ce même tampon, une dilution de 4 fois est pratiquée.

Tampon Na2/Na à 0,1M, pH7 :
La solution A : la solution de NaH2PO4 à 0,2M. Dissoudre 27,8g (139g/mole) dans 1L.
La solution B : la solution de Na2HPO4 à 0,2M. Dissoudre 28,37g (141,96g/mole) ou 71,62g
(358,14g/mole) dans 1L d’eau distillée.
Mélanger 39ml de A+61ml de B, ajouter l’eau pour avoir 200ml de volume final.

Tampon d’acide citrique à 0,05M, pH2,0 :
Dissoudre 0,21g de l’acide citrique dans 20 ml d’eau distillée. Vérifier le pH.
La préparation des gels (4, 10 et 16%) d’acrylamide pour Tricine SDS-PAGE
Tableau 23 : préparation des gels à 16, 10 et 4% d’acrylamide
AB-3
AB-6
Tampon de gel
Glycérol
ED ajusté à
APS (10%)
TEMED
Le gel de séparation
16%, (11cm)
10 ml
10ml
2,5 ml
30 ml
250 µl
30 µl
Le gel d’espace
10%, (1cm)
0,6 ml
1 ml
0,3 ml
3 ml
15 µl
1,5 µl
Le gel de concentration
4%, (2,4cm)
1 ml
3 ml
12 ml
90 µl
9 µl
La préparation de la solution AB-3 :
Pour 50 ml de solution : (49,5% T, 3% C), dissoudre 24g d’acrylamide+0,75g de
bisacrylamide dans 50ml d’eau distillée.
La préparation de la solution AB-6 :
Pour 50 ml de solution : (49,5% T, 6% C), dissoudre 23,25g d’acrylamide+1,5g de
bisacrylamide dans 50ml d’eau distillée.
107
La préparation du tampon de gel (1x):
Pour 200ml :
Tris
HCl (1/3M)
SDS
pH
72,68g
19,45ml
0,6ml
8,45
La préparation du tampon de cathode (1x):
Pour 500ml :
Tris
6,08g (+3g)
Tricine
8,95g
SDS
0,5g
pH ≈8,25 (le pH de cette solution doit être égale 8,25 sans correction de pH).
La préparation du tampon d’anode (1x) :
Pour 500ml :
Tris : 0,1 M :
6,08g
HCl : 0,0225 M
pH :
8,9
La solution HCl est préparée pour ajuster le pH de la solution Tris préparée.
La préparation du tampon de charge
Pour 100ml :
SDS
Glycerol
Bleu de Coomassie G-250
Tris/HCl (pH7)
Mercaptoéthanol
3g
30ml
0,05g
150mM
6ml
La préparation de la solution de fixation
Pour 200ml :
Méthanol
Acide acétique
Acétate d’ammonium
100ml
20ml
100mM
La préparation de la solution de coloration
Pour 500ml :
Bleu de Coomassie R250
Acide acétique
0,125g
50ml
La préparation de la solution de décoloration
Pour 1L :
Acide acétique
100ml
108
LBMB
Références bibliographiques
 Aasen I.M., Moretro T., Katla T., Axelsson L. et Storro I. (2000). Influence of complex nutrients,
temperature and pH on bacteriocin production by Lactobacillus sakei CCUG 4268. In Must and in Wine.
König H. et Fröhlich J. (2009) Springer ed, Allemagne, p 3-29.
 Aktypis A. et Kalantzopoulos G. (2003). Purification and characterization of thermophilin ST-1, a novel
bacteriocin produced by Streptococcus thermophilus ACA-DC 0001. Lait. 83: 365-378.
 Albano, H., Todorov, S.D., van Reenen, C. A., Hogg, T., Dicks, L.M.T. et Teixeira, P. (2007).
Characterization of two bacteriocins produced by Pediococcus acidilactici isolated from “Alheira”, a
fermented sausage traditionally produced in Portugal. Elsevier. International Journal of Food
Microbiology. 116: 239-247.
 Allison, G.E., Fremaux, C. et Klaenhammer, T.R. (1994). Expansion of bacteriocin activity and host range
upon complementation of two peptides encoded within the lactacin F operon. J Bacteriol. 176:2235–2241.
 Altermann, E., Russell, W.M., Azcarate-Peril, M.A., Barrangou, R., Buck, B.L., McAuliffe, O.,
Souther, N., Dobson, A., Duong, T. et Callanan, M. (2005). Complete genome sequence of the probiotic
lactic acid bacterium Lactobacillus acidophilus NCFM. Proc Natl Acad Sci. 102:3906-3912.
 Anderssen, E.L., Diep, D.B., Nes, I.F., Eijsink, V.G.H. et Nissen-Meijer, J. (1998). Antagonistic activity
of Lactobacillus plantarum C11: 2 new 2-peptide bacteriocins, plantaricins EF and JK, and the induction
factor plantaricin A. Appl Environ Microbiol. 6:2269-2272.
 Aranha, C., Gupta, S. et Reddy, K. V. R. (2004). Contraceptive efficacy of antimicrobial peptide nisin: in
vitro and in vivo studies. Contraception. 69:333-338.
 Arnusch, C.J., Bonvin, A.M., Verel, A.M. , Jansen, W.T., Liskamp, R.M., de Kruijff, B. , Pieters, R.J.,
et Breukink, E. (2008 ). The vancomycin-nisin(1-12) hybrid restores activity against vancomycin resistant
Enterococci . Biochemistry. 47 :12661-12663.
 Aroutcheva, A.A., Simoes, J.A. et Faro, S. (2001). Antimicrobial protein produced by vaginal
Lactobacillus acidophilus that inhibits Gardnerella vaginalis. Infect Dis Obstet Gynecol. 9:33-39.
 Atrih, A., Rekhif, N., Moir, A.J.G., Lebrihi, A. et Lefebvre, G. (2001). Mode of action, purification and
amino acid sequence of plantaricin C19, an anti-Listeria bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum
C19. Int. J. Food Microbiol. 68: 93-109
 Axelsson L. (2004). Lactic acid bacteria: classification and physiology. In Biology of Microorganisms on
Grapes, in Must and in Wine. König H. et Fröhlich J. (2009) Springer ed, Allemagne, p 3-29.
 Azcarate-Peril, M.A. et Klaenhammer, T.R. (2010). Genomic of lactic acid bacteria : The post-genomic
challenge from sequence to function. Wiley-Blackwell. 35-65.
 Bauer, R. et Dicks, L.M.T. (2005). Mode of action of lipid II-targeting lantibiotics. Int. J. Food Microbiol.
101 : 201-216.
 Belkheir, K. (2004). Identification des souches de Lactobacillus isolées de lait de chamelle de Tindouf :
Etude de leur activité protéolytique. Mémoire d’ingénieur d’état en Biotechnologie.
 Benkeroum, N., Oubel, H., Zahar, M., Dlia, S. et Filali-Maltout, A. (2002). Isolation of a bacteriocinproducing Lactococcus lactis subsp. lactis and application to control Listeria monocytogenes in Moroccan
jben. Journal of Applied Microbiology.89: 960-968.
 Benmouna, Z. (2008). Bactériocines des coques lactiques isolées de «ghars» de la région de Biskra.
Mémoire d’ingeniorat d’état en Biotechnologie, université d’Oran.
 Bhunia A.K., Johnson M.C. et Ray B. (1987). Direct detection of an antimicrobial peptide of Pediococcus
acidilactici in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Elsevier. Journal of Industrial
Microbiology. 2 : 319-322.
 Biswas, S. R., Ray, P., Johnson, M. C. et Ray, B. (1991). Influence of Growth Conditions on the
Production of a Bacteriocin, Pediocin AcH, by Pediococcus acidilactici H. Applied And Environmental
Microbiology. 57 : 1265-1267.
 Blom, H., Katla, T., Hagen, B F. et Axelsson, L. (1997). A model assay to demonstrate how intrinsic
factors affect diffusion of bacteriocins. Elsevier. International Journal of Food Microbiology. 38 :103-109.
 Blom, H., Katla, T., Holck, A., Sletten, K., Axelsson, L et Holo, H. (1999). Characterization, Production,
and Purification of Leucocin H, a Two-Peptide Bacteriocin from Leuconostoc MF215B. springer-verlag.
Current Microbiology. 39: 43-48.
110
LBMB
 Bolotin, A., Quinquis, B., Renault, P., Sorokin, A., Ehrlich, S.D., Kulakauskas, S., Lapidus, A.,
Goltsman, E., Mazur, M. et Pusch, G.D. (2004). Complete sequence and comparative genome analysis of
the dairy bacterium Streptococcus thermophilus. Nat Biotechnol. 22:1554-1558.
 Bounoua, M.D. (2005). Isolement et pré-identification des bactéries lactiques de différents laits de chamelles
du sud-algérien. Mémoire d’ingéniorat d’état en Biotechnologie. Université d’Oran.
 Bouziani, I. et Sebbaha, F.Z. (2006). Isolement et identification des bactéries lactiques à partir de blé
fermenté. Etude technologique et extraction d'ADN plasmidique. Mémoire d'ingénieur d'état. Université de
Mostaganem.
 Bover-Cid, S., Izquierdo-Pulido, M., et Vidal-Carou, M. (2001). Effectiveness of a Lactobacillus sakei
starter culture in the reduction of biogenic amine accumulation as a function of the raw material quality.
Journal of Food Protection. 64: 367-373.
 Brashears, M.M., Galyean, M.L., Loneragan, G.H., Mann, J.E., Killinger-Mann, K. (2003a) Prevalence
of Escherichia coli O157:H7 and performance by beef feedlot cattle given Lactobacillus direct-fed
microbials. J Food Prot. 66:748-754.
 Brashears, M.M., Jaroni, D. et Trimble, J. (2003b). Isolation, selection, and characterization of lactic acid
bacteria for a competitive exclusion product to reduce shedding of Escherichia coli O157:H7 in cattle. J
Food Prot. 66:355-363.
 Breukink, E. et de Kruijff, B. (2006). Lipid II as a target for antibiotics. Nat Rev Drug Discov. 5: 321-323.
 Breukink, E. (2006). A lesson in efficient killing from two-component lantibiotics. Molecular Microbiology.
61: 271-273.
 Bruno Bàrcena, J.M., Sineriz, F., Gonzàlez de Liano, D., Rodriguez, A. et Suàrez, J.E. (1998)
Chemostat production of plantaricin C by Lactobacillus plantarum LL441. Appl Environ Microbiol.
64:3512-3514.
 Cai, Y., Ng, L.K. et Farber, J.M. (1997). Isolation and characterisation of nisinproducing Lactococcus
lactis subsp. lactis from bean-sprouts. Journal of Applied Microbiology. 83: 499-507.
 Callanan, M., Kaleta, P., O'Callaghan, J., O'Sullivan, O., Jordan, K., McAuliffe, O., Sangrador-Vegas,
A., et al. (2008). Genome sequence of Lactobacillus helveticus, an organism distinguished by selective
gene loss and insertion sequence element expansion. J Bacteriol. 190:727-735.
 Caplice, E. et Fitzgerald, G. F. (1999). Food fermentation: role of microorganisms in food production and
preservation. Int. J. Food Microbiol. 50 : 131-149.
 Carr, F.J., Hill, D. et Maida, N. (2002). The lactic acid bacteria: A literature survey. Crit. Rev. Microbiol.
28 :281-370.
 Chaillou, S., Champomier-Verges, M.C., Cornet, M., Crutz-Le Coq, A.M., Dudez, A.M., Martin, V., et
al. (2005). The complete genome sequence of the meatborne lactic acid bacterium Lactobacillus sakei 23K.
Nat Biotechnol. 23:1527-1533.
 Cheikh, O.A.M. (2008). Résistance et adaptation au sel chez des lactobacilles isolées de lait de chamelle de
Mauritanie. Mémoire d’ingéniorat d’état en Biotechnologie. Université d’Oran.
 Chen, H. et Hoover, D.G. (2003). Bacteriocins and their Food Applications. Comprehensive Reviews In
Food Science And Food Safety. 2: 82-100.
 Chen, Y. S. et Yanagida, F. (2006). Characteristics and Effects of Temperature and Surfactants on
Bacteriocin-Like Inhibitory Substance Production of Soil-Isolated Lactobacillus animalis C060203.
Current Microbiology. 53 : 384-387.
 Choi, H.J., Lee, H.S., Oh, S. et Yoon, S.S. (1997). Partial characterization and cloning of leuconocin J, a
bacteriocin produced by Leuconostoc sp.J2 isolated from the Korean fermented vegetable kimchi. Journal
of Applied Microbiology. 86 :175-181.
 Cintas, L. M., Casaus, P., Havarstein, L. S., Hernandez, P. E., et Nes, I. F. (1997). Biochemical and
genetic characterization of enterocin P, a novel sec-dependent bacteriocin from Enterococcus faecium P13
with a broad antimicrobial spectrum. Applied and Environmental Microbiology. 63 : 4321-4330.
 Cocconcelli, P. S. et Fontana, C. (2008). In Meat Biotechnology : Characteristics and applications of
microbial starters in meat fermentations. eds F. Toldrà. Italie. 129-148.
111
LBMB
 Cocolin, L., Foschino, R., Comi, G et Fortina, M.G. (2007). Description of thz bacteriocins produced by
two strains of Enterococcus faecium isolated from Italien goat milk. Elsevier. Food Microbiology. 24 : 752758.
 Coconnier, M.H., Lievin, V., Hemery, E. et Servin, A.L. (1998). Antagonistic activity against Helicobacter
infection in vitro and in vivo by the human Lactobacillus acidophilus strain LB. Appl Environ Microbiol.
64:4573-4580.
 Colas, J.C., Shi, W., Rao, V. S. N. M., Omri, A., Mozafari, M. R. et Singh, H. (2007). Microscopical
investigations of nisin-loaded nanoliposomes prepared by Mozafari method and their bacterial targeting.
Micron. 38 : 841-847.
 Collins M.D., Williams A.M. et Wallbanks S. (1990). The phylogeny of Aerococcus and Pediococcus as
determined by 16S rRNA sequence analysis: description of Tetragenococcus gen. In Biology of
Microorganisms on Grapes, in Must and in Wine. König H. et Fröhlich J. (2009) Springer ed, Allemagne, p
3-29.
 Corr, S.C., Li, Y., Riedel, C.U., O’Toole, P.W., Hill, C. et Gahan, C.G.M. (2007). Bacteriocin production
as a mechanism for the antfinfective activity of Lactobacillus salivarius UCC118. Proc Natl Acad Sci U S
A. 104:7617-7621.
 Cotter, P.D., Hill, C. et Ross, R.P. (2005). Bacteriocins: developing innate immunity for food. Nat. Rev.
Microbiol. 3 :777-788.
 Daba, H., Lacroix, C., Huang, J et Simard, R. E. (1993). Influence of growth conditions on production and
activity of mesenterocin 5 by a strain of Leuconostoc mesenteroides. Appl Microbiol Biotechnol. 39:166173.
 Daeschel, M.A. (1989). Antimicrobial substances from lactic acid bacteria for use as food preservatives.
Food Technol. 43:164-167.
 Dalache, F. (2006). Effets inhibiteurs des bactéries lactiques. Bactériocines de Lactococcus et
d’Enterococcus : Mise en évidence d’un support plasmidique. Thèse de Doctorat d’état, université d’Oran.
 De Arauz, L. J., Faustino Jozala, A., Gava Mazzolab, P. et Vessoni Penna, T. C. (2009). Nisin
biotechnological production and application: a review. Elsevier. Trends in Food Science & Technology.
20 :146-154.
 De Kwaadsteniet, M., Todorov, S.D., Knoetze, H. et Dicks, L.M.T. (2005). Characterization of a 3944 Da
bacteriocin, produced by Enterococcus mundtii ST15, with activity againstGram-positive and Gramnegative bacteria. Elsevier. International Journal of Food Microbiology. 105 : 433- 444.
 De Man, J. C., Rogosa, M. et Sharpe, E. M. (1960). A medium for the cultivation of lactobacilli. J. Appl.
Bacteriol. 23: 130-135.
 De Vuyst, L et Vandamme, E. J. (1992). Influence of the carbon source on nisin production in Lactococcus
lactis subsp. lactis batch fermentations. J Gen Microbiol. 138 : 571-578.
 De Vuyst, L et Vandamme, E. J. (1993). Influence of the phosphorus and nitrogen source on nisin
production in Lactococcus lactis subsp, lactis batch fermentations using a complex medium. Appl
Microbiol Biotechnol. 40:17-22.
 De Vuyst, L., Callewaert, R. et Crabbe, K. (1996). Primary metabolite kinetics of bacteriocin
biosynthesisby Lactobacillus amylovorus and evidence for stimulation of bacteriocin production under
unfavourable growth conditions. Microbiol. 142: 817-827.
 De Vuyst, L., Avonts, L., Neysens, P., Hoste, B., Vancanneyt, M., Swings, J. et Callewaert, R. (2004).
Applicability and performance of the bacteriocin producer Lactobacillus amylovorus DCE 471 in type II
cereal fermentations. International Journal of Food Microbiology. 90: 93-106.
 Delgado, A., Britob, D., Peresb, C., Noé-Arroyoc, F. et Garrido-Fernàndez, A. (2005). Bacteriocin
production by Lactobacillus pentosus B96 can be expressed as a function of temperature and NaCl
concentration. Elsevier. Food Microbiology. 22 :521-528.
 Dellaglio F. et Felis G. (2005). Taxonomy of lactobacilli and bifidobacteria. In Biology of Microorganisms
on Grapes, in Must and in Wine. König H. et Fröhlich J. (2009) Springer ed, Allemagne, p 3-29.
 Dellaglio, F., De Roissart, H., Torriani, S., Curk, M. C. et Janssens, D. (1994). Caractéristique générale
des bactéries lactiques. In Bactéries lactiques vol 1. pp. 25-116. ed. De Roissart, H. et Luquet, F. M. Lorica.
112
LBMB
 Deraz, S.F., Karlsson, E. N., Hedström, M., Andersson, M.M et Mattiasson, B. (2005). Purification and
characterization of acidocin D20079, a bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus DSM 20079.
Elsevier. Journal of Biotechnology. 117 : 343-354.
 Dicks L.M.T., Dellaglio F. et Collins M.D. (1995). Proposal to reclassify Leuconostoc oenos a Oenococcus
oeni gen. In Biology of Microorganisms on Grapes, in Must and in Wine. König H. et Fröhlich J. (2009)
Springer ed, Allemagne, p 3-29.
 Dortu, C. et Thonart, P. (2009). Les bactériocines des bactéries lactiques : caractéristiques et intérêts pour
la bioconservation des produits alimentaires. Biotechnol. Agron. Soc. Environ. 13 : 143-154
 Doumandji, A., Hellal, A. et Saidi, N. (2010). Purification de la bacteriocine à partir de Lactobacillus
acidophilus 11. Rev Microbiol Ind San et Environn. 4: 25-47.
 Drider, D., Fimland, G., Hechard, Y., McMullen, L.M. et Prevost, H. (2006). The continuing story of
class IIa bacteriocins. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 70 : 564-582.
 DSMZ. (2008). Bacterial nomenclature up to date
(http://www.dsmz.de/microorganisms/bacterial_nomenclature)
 Dubchak, I., Grigoriev, I., Shabalov, I., Cantor, M.N., Dusheyko, S., Hornick, L., Hugenholtz, P., et al.
(2006b). Lactobacillus casei ATCC 334.
 Dubchak, I., Grigoriev, I., Shabalov, I., Cantor, M.N, Dusheyko, S., Hornick, L., Hugenholtz, P., et al.
(2006c). Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ATCC 8293.
 Dubois, A. (1995). Spiral bacteria in the human Stomach: the gastric Helicobacter. EID-Digestive Diseases
Division. 1 : 79-85.
 Eijsink V.G.H., Axelsson L., Diep D.B., Havarstein L.S., Holo H., Nes I.F. (2002). Production of class II
bacteriocins by lactic acid bacteria; an example of biological warfare and communication. Antonie Van
Leeuwenhoek. 81: 639-654.
 Ennahar, S., Sashihara, T., Sonomoto, K. et Ishizaki, A. (2000). Class IIa bacteriocins: biosynthesis,
structure and activity. Elsevier. FEMS Microbiology Reviews. 24 : 85-106.
 Falagas, M.E, Betsi, G.I. et Athanasiou, S. (2007). Probiotics for the treatment of women with bacterial
vaginosis. Clin Microbiol Infect. 13:657-664.
 Faustino-Jozala, de Lencastre-Novaes, A. L. C., Cholewa, O., Moraes, D et Vessoni-Penna, T. C.
(2005). Increase of nisin production by Lactococcus lactis in different media. African Journal of
Biotechnology. 4 : 262-265.
 Faye, T., Langsrud, T., Nes, I.F et Holo, H. (2000). Biochemical and genetic characterization of
propionicin T1, a bacteriocin from Propionibacterium thoenii. American Society for Microbiology. Applied
and Environmental Microbiology. 66 :4230-4236.
 Ferchichi, M., Frère, J., Mabrouk, K. et Manai, M. (2001). Lactococcin MMFII, a novel class IIa
bacteriocin produced by Lactococcus lactis MMFII, isolated from a Tunisian dairy product. FEMS
Microbiol Lett. 205:49-55.
 Fleming, H. P., Etchells, J. L. et Costilow, R. N. (1975). Microbiological inhibition of isolate of
Pediococcus from cucumber brine. Appl. Environ. Microbiol. 30 :1040-1042.
 Floriano, B., Ruiz-Barba, J. L. et Jiminez-Diaz, R. (1998). Purification and genetic characterization of
enterocin I from enterococcus faecium 6T1a, a novel antilisterial plasmid-encoded bacteriocin which does
not belong to the pediocin family of bacteriocins. Appl and Environ Microbiol. 64: 4883-4890.
 Font de Valdez, G. (2002). Maintenance of Lactic Acid Bacteria. In Food Microbiology Protocols. Spencer,
J. F. T et Ragout de Spencer, A. L. eds Humana Press. Totowa, New Jersey, Argentine. 163-171.
 Franz, C.M.A.P., Schillinger, U. et Holzapfel, W.H. (1996). Production and characterisation of enterocin
900, a bacteriocin produced by Enterococcus faecium BFE 900 from black olives. Inter J of Food
Microbiol. 29: 255-270.
 Galvez, A., Abriouel, H., Lopez, R.L. et Omar, N.B. (2007). Bacteriocin-based strategies for food
biopreservation. Int. J. of Food Microbiol. 120 :51-70.
 Gao, Y., Jia, S., Gao, Q et Tan, Z. (2010). A novel bacteriocin with a broad inhibitory spectrum produced
by Lactobacillus sabe C2, isolated from traditional chinese fermented cabbage. Elsevier. Food Control.
21 :76-81.
113
LBMB
 Garrity G.M. (2005). Bergey’s manual of systematic bacteriology. The proteobacteria. In Biology of
Microorganisms on Grapes, In Must and in Wine. König H. et Fröhlich J. (2009) Springer ed, Allemagne, p
3-29.
 Ghrairi, T., Frere, J., Berjeaud, J.M et Manai, M. (2008). Purification and characterization of bacteriocins
produced by Entercoccus faecium from Tunisian rigouta cheese. Elsevier. Food Control. 19 : 162-169.
 Gillor, O., Etzion, A. et Riley, M. A. (2008). The dual role of bacteriocins as anti- and probiotics. Appl
Microbiol Biotechnol. 81:591-606.
 Gratia, .(1925). Sur un remarquable exemple d’antagoniste entre souches colibacilles. Conseil Royal Société
Biologie.93 : 1040-1041.
 Grattepanche, F. (2005). Etude d’un système de préfermentation en continu du lait par une culture mixte.
Thèse de Doctorat. Université Laval. Canada.
 Hammes W.P., Weis N., Holzapfel W.P. (1991). The genera Lactobacillus and Carnobacterium. In Biology
of Microorganisms on Grapes, In Must and in Wine. König H. et Fröhlich J. (2009) Springer ed,
Allemagne, p 3-29.
 Hammes, W.P. et Vogel, R.F. (1995). The genus Lactobacillus. In Wood BJB, Holzapfel, W.H. The genera
of lactic acid bacteria. Blackie Academic & Professional.19–54.
 Harris, L.J., Daeschel, M.A., Stiles, M.E. et Klaenhammer, T.R. (1989). Antimicrobial activity of lactic
acid bacteria against Listeria monocytogenes. J Food Prot. 52 :384-387.
 Harris, L.J., Fleming, H.P. et Klaenhammer, T.R. (1992). Novel paired starter culture system for
sauerkraut, consisting of a nisin-resistant Leuconostoc mesenteroides strain and a nisin-producing
Lactococcus lactis strain. Applied and Environmental Microbiology. 58: 1484-1489.
 Hartnett, D.J., Vaughan, A. et Van Sinderen, D. (2002). Antimicrobial producing lactic acid bacteria
isolated from raw barley and sorghum. Journal of the Institute of Brewing. 108: 169-177.
 Haugaard, N. (1968). Cellular mechanisms of oxygen toxicity. Physiol Rev. In Inhibiting factors produced
by lactic acid bacteria : 0xygen metabolites and catabolism end-products. Piard, J.C. et Desmazeaud, M.
(1991). Elsevier. Lait. 71 :525-541.
 Héchard, Y., Dérijard, B., Letellier, F. et Cenatiempo, Y. (1992). Characterization and purification of

mesentericin Y 105, an anti-Listeria bacteriocin from Leuconostoc mesenteroïdes. J. Gen Microbiol. 138 :
2725-2731.
 Henderson, J.T., Chopko, A.L. et van Wassenaar, P.D. (1992). Purification and primary structure of
pediocin PA-1 produced by Pediococcus acidilactici PAC-1.0. Arch Biochem Biophys 295:5-12.
 Heng, N.C.K. et Tagg, J.R. (2006). What’s in a name? Class distinction for bacteriocins. Nat. Rev.
Microbiol. 4.
 Holzapfel, W.H., Geisen, R. et Schillinger, U. (1995). Biological preservation of foods with reference to
protective cultures, bacteriocins and food-grade enzymes. International Journal of Food Microbiology. 24:
343-362.
 Hoover, D.G., Dishart, K.J. et Hermes, M.A. (1989). Antagonistic effect of Pediococcus spp. Against
Listeria monocytogenes. Food Biotechnology.3:183-196.
 Hur, J.W., Hyun, H.H., Pyun, Y.R., Kim, T.S., Yeo, I.H. et Paik, H.D. (2000). Identification and partial
characterisation of lacticin BH5, a bacteriocin produced by Lactococcus lactis BH5 isolated from kimchi.
Journal of Food Protection. 63: 1707-1712.
 Hurst, A. (1981). Nisin. Adv Appl Microbiol. 27: 85-123.
 Ivanova, I., Kabadjova, P., Pantev, A., Danova, S., Dousset, X. (2000). Detection, purification and partial
characterization of a novel bacteriocin substance produced by Lactococcus lactis subsp lactis B14 isolated
from boza-Bulgarian traditional cereal beverage. Biocatalysis-2000: Fundamentals & Applications. 41: 4753.
 Jack, R. W., Tagg, J. R. et Ray, B. (1995). Bacteriocins of Gram positive bacteria. Microbiol. Rev. 59: 171200.
 Jacob, F., Lwoff, A., Siminovitch, A. et Wollman, E. (1953). Définition de quelques termes relatifs à la
lysogénie, Ann. Inst. Pasteur. 84:222-224.
114
LBMB
 Jiang, J., Shi, B., Zhu, D., Cai, Q., Chen, Y., Li, J., Qi, K. et Zhang, M. (2012). Characterization of a
novel bacteriocin produced by Lactobacillus sakei LSJ618 isolated from traditional Chinese fermented
radish. Elsevier. Food Control. 23: 338-344.
 Jiménez-Díaz, R., Ríos-Sánchez, R. M., Desmazeaud, M., Ruiz-Barba, J. L. et Piard, J. C. (1993).
Plantaricin S and T, two new bacteriocins produced by Lactobacillus plantarum LPCO10 isolated from a
green olive fermentation. Appl. Environ. Microbiol. 59:1416-1424.
 Jiminez-Diaz, R., Ruiz-Barba, J. L., Cathcart, D. P., Holo, H., Nes, I. F., Sletien, K. H. et Warner, P. J.
(1995). Purification and partial amino acid sequence of plantaricin S, a bacteriocin produced by
Lactobacillus plantarum LPCO10, the activity of which depends on the complementary action of two
peptides. Applied And Environmental Microbiology. 61: 4459-4463.
 Joerger, C. M. et Klaenhammer, T. R. (1986). Characterization and purification of helveticin J and
evidence for a chromosomally determined bacteriocin produced by Lactobacillus helveticus 481. Journal of
Bacteriology 167:439-446.
 Juàrez Tomàs, M.S., Bru, E., Wiese.,B et Nader-Macıàs, E. M. F. (2010). Optimization of Low-Cost
Culture Media for the Production of Biomass and Bacteriocin by a Urogenital Lactobacillus salivarius
Strain. Probiotics & Antimicro. Prot. 2 :2-11.
 Juàrez-Tomas, M.S., Bru, E., Wiese, B., de Ruiz Holgado, A.A.P. et Nader-Macias, M.E. (2002).
Influence of pH, temperature, and culture media on the growth and bacteriocin production by vaginal
Lactobacillus salivarius CRL 1328. J. Appl. Microbiol. 93: 714-724.
 Kacem, M. (2005). Bactéries lactiques d’Algérie. Isolement, identification et caractéristiques
technologiques. Bactériocines produites par Lactococcus lactis et Lactobacillus plantarum. Thèse de
doctorat. Université d'Oran.
 Kaewsrichan, J., Peeyananjarassri, K. et Kongprasertkit, J. (2006). Selection and identification of
anaerobic lactobacilli producing inhibitory compounds against vaginal pathogens. FEMS Immunol Med
Microbiol. 48:75-83.
 Kalbaza, K. (2010). Identification et étude des caractéristiques technologiques de 18 souches de
Leuconostoc isolées du lait de chamelle de Bechar. Mémoire d’ingéniorat d’état en Biotechnologie,
université d’Oran.
 Kandler O., et Weiss N. (1986). Lactobacillus. In Biology of Microorganisms on Grapes, in Must and in
Wine. König H. et Fröhlich J. (2009) Springer ed, Allemagne, p 3-29.
 Karam N-E. et Karam H. (1994). Isolement et caractérisation de bactéries lactiques de laits crus d’Algérie.
In Alimentation, Génétique et Santé de l’enfant, ed. M. Touhami et J-F. Desjeux, L’Harmattan, 257-264.
 Karam, N-E., Dalache, F., Kacem, M. et Zadi-Karam, H. (2004). Lactic acid bacteria II: Interactions
among strains of Lactobacillus and Lactococcus isolated from Raw milks of western Algeria. Sci. Technol.
22: 32-37.
 Kashet, E.R. (1987). Bioemergetics of lactic and bacteria cytoplasmic pH and osmotolerance. FEMS
Microbiol Rev. 46 :233-244.
 Kelly, W.J., Asmundson, R.V. et Huang, C.M. (1996). Isolation and characterisation of bacteriocinproducing lactic acid bacteria from ready-to-eat food products. International Journal of Food Microbiology.
33: 209-218.
 Keyzer, J., van der Does, C. et Driessen, A. (2003). The bacterial translocase: a dynamic protein channel
complex. Cell. Mol. Life Sci. 60:2034-2052.
 Kim, T. S., Hur, J. W., Yu, M. A., Cheigh, C. I., Kim, K. N., Hwang, J. K., et Pyun, Y. R. (2003).
Antagonism of Helicobacter pylori by bacteriocins of lactic acid bacteria. Journal Food Protection. 66: 312.
 Kim, J.F., Jeong, H., Lee, J.S., Choi, S.H., Ha, M., Hur, C.G., Kim, J.S., Lee, S., Park, HS., Park, Y.H.
et al. (2008). Complete genome sequence of Leuconostoc citreum KM20. J Bacteriol 190:3093-3094.
 Kim-Mi, H., Kong, Y.J., Baek, H et Hyun, H. H. (2005). Optimization of culture conditions and medium
composition for the production of micrococcin GO5 by Micrococcus sp. GO5.
 Klaenhammer, T. R. (1988). Bacteriocins of lactic acid bacteria. Bioch. 70:337-349.
 Klaenhammer, T. R. (1993). Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria. FEMS. Microbiol.
Rev.12: 39-86.
115
LBMB
 Klaenhammer, T. R., Fremaux, C. et Hechard, Y. (1994). Activité antimicrobienne des bactéries
lactiques. In Bactéries Latiques, H. De Roissart et F. M. Luquet, Lorica.
 Kleerebezem, M. (2004). Quorum sensing control of lantibiotic production; nisin and subtilin autoregulate
their own biosynthesis. Peptides. 25 :1405-1414.
 Kleinkauf, H., von Döhren, H., Dornauer, H. et Nesemann, G. (1986). Regulation of Seconday Metabolite
Formation. Weinheim : VCH. In Influence of the carbon source on nisin production in Lactococcus lactis
subsp. lactis batch fermentations. De Vuyst, L et Vandamme, E. J. (1992). J Gen Microbiol. 138 : 571-578.
 Kout, A. (2011). Essai de purification de bactériocine produite par Lactococcus lactis subsp lactis LV12.
Mémoire d’ingéniorat d’état en Biotechnologie. Université d’Oran.
 König H. et Fröhlich J. (2009). Biology of Microorganisms on Grapes, in Must and in Wine. Springer ed,
Allemagne, p 3-29.
 Krier, F., Revol-Junelles, A. M. et Germain, P. (1998). Influence of temperature and pH on production of
two bacteriocins by Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides FR52 during batch fermentation.
Appl Microbiol Biotechnol. 50: 359-363.
 Kumar Tiwaria. et Srivastavaa, S. (2008). Statistical Optimization of Culture Components for Enhanced
Bacteriocin Production by Lactobacillus plantarum LR/14. Food Biotechnology. 22:64-77.
 Kumar, M., Ghosh, N et Srivastava. (2010). Production and characterization of a bacteriocin produced by
Enterococcus faeciul LR/6. The Internet Journal of Microbiology. 8
 Kumari, A., Akkoc, N. et Akçelik, M. (2011). Purification and partial characterization of bacteriocin
produced by Lactococcus lactis ssp. lactis LL171. World J Microbiol Biotechnol.
 Laukova, A., Guba, P., Nemcova, R. et Vasilkova, Z. (2003). Reduction of Salmonella in gnotobiotic
Japanese quails caused by the enterocin A-producing EK13 strain of Enterococcus faecium. Vet Res
Commun. 27:275-280.
 Laukova, A., Strompfova, V., Skrivanova, V., Volek, Z., Jindrichova, E. et Marounek, M. (2006).
Bacteriocin-producing strain of Enterococcus faecium EK 13 with probiotic character and its application in
the digestive tract of rabbits. Biologia (Bratisl) 61:779–782
 Leal-Sànchez, M. V., Jiménez-Díaz, R., Maldonado-Barragàn, A. et Garrido-Fernàndez, A. et RuizBarba, J. L. (2002). Optimization of Bacteriocin Production by Batch Fermentation of Lactobacillus
plantarum LPCO10. Applied And Environmental Microbiology. 68 : 4465-4471.
 LeBlanc, J.G., Taranto, M. P., Molina, V. et Sesma, F. B. (2010). B - Group Vitamins Production by
Probiotic Lactic Acid Bacteria. In Biotechnology of lactic acid bacteria : Novel application. WileyBlackwell. 2121 State Avenue, Ames, Iowa 50014-8300, USA.
 Leer, R.J., van der Vossen, J.M., van Giezen, M.; van Noort, J.M. et Pouwels, P.H. (1995). Genetic
analysis of acidocin B, a novel bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus. Microbiology. 65: 974981.
 Leroy, F., De Winter, T., Adriany, T., Neysens, P. et De Vuyst, L. (2006). Sugars relevant for sourdough
fermentation stimulate growth of and bacteriocin production by Lactobacillus amylovorus DCE 471. Int J
Food Microbiol 112:102–111
 Lewus, C.B., Kaiser, A. et Montville, T.J. (1991). Inhibition of food-borne pathogens by bacteriocins from
lactic acid bacteria isolated from meat. Appl. Environ. Microbiol. 57:1683-1688.
 Li, C., Bai, J., Cai, Z. et Ouyang, F. (2002). Optimization of a cultural medium for bacteriocin production
by Lactococcus lactis using response surface methodology. J Biotechnol. 93:27-34.
 Lim, S. M (2010). Cultural conditions and nutritional components affecting the growth and bacteriocin
production of Lactobacillus plantarum KC21. Food Sci. Biotechnol. 19: 793-802
 Lubelski, J., Rink, R., Khusainov, R., Moll, G.N. et Kuipers, O.P. (2008). Biosynthesis, immunity,
regulation, mode of action and engineering of the model lantibiotic nisin. Cell. Mol. Life Sci. 65: 455-476.
 Liu, W. et Hansen, N. (1990). Some chemical and physical properties of nisin, a small-protein antibiotic
produced Lactococcus lactis. Appl Environ Microbiol. 56 :2551-2558.
 Makarova, K., Slesarev, A., Wolf, Y., Sorokin, A., Mirkin, B., Koonin, E., Pavlov, A., Pavlova, N., et al.
(2006). Comparative genomics of the lactic acid bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 103:15611-15616.
116
LBMB
 Mandal, V., Kumar, S.S et Mandal, N.C. (2008). Optimized culture conditions for bacteriocin production
by Pediococcus acidilactici LAB 5 and its characterization. Indian Journal of Biochemistry & Biophysics.
45 : 106-110.
 Martinez-Murcia A.J. et Collins M.D. (1990). A phylogenetic analysis of the genus Leuconostoc based on
reverse transcriptase sequencing or 16S rRNA. In Biology of Microorganisms on Grapes, in Must and in
 Mataragas, M., Drosinos, E.H., Tsakalidou, E. et Metaxopoulos, J. (2004). Influence of nutrients on
growth and bacteriocin production by Leuconostoc mesenteroides L124 and Lactobacillus curvatus L442.
Antonie van Leeuwenhoek. 85: 191-198.
 Mathot, A. G., Kihal, M., Prévost, H., & Diviès, C. (1994). Selective enumeration of Leuconostoc on
vancomycin agar medium. International Dairy Journal. 4 :459-469.
 Mauriello, G., Ercolini, D., La Storia, A., Casaburi, A. et Villani, F. (2004). Development of polythene
films for food packaging activated with an antilisterial bacteriocin from Lactobacillus curvatus 32Y.
Journal of Applied Microbiology. 97 :314-322.
 McAuliffe, O., Ross, R.P. et Hill, C. (2001). Lantibiotics: structure, biosynthesis and mode of action. FEMS
Microbiol. Rev. 25 : 285-308.
 McDonald, C., Fleming, H.P. et Hassan, H.M. (1990). Acid Tolerance of Leuconostoc mesenteroides and
Lactobacillus plantarum. Applied And Environmental Microbiology. 56: 2120-2124
 Messens, W., Verluyten, J., Leroy, F. et De Vuyst, L. (2003). Modelling growth and bacteriocin
production by Lactobacillus curvatus LTH 1174 in response to temperature and pH values used for
European sausage fermentation process. Int. J. Food Microbiol. 81: 41-52.
 Michetti, P., Dorta, G., Wiesel, P.H., Brassart, D., Verdu, E., Herranz, M., Felley, C., et al. (1999).
Effect of whey-based culture supernatant of Lactobacillus acidophilus (johnsonii) La1 on Helicobacter
pylori infection in humans. Digestion. 60:203-209.
 Mitra, S., Chakrabartty, P.K. et Biswas, S.R. (2005). Production and characterization of nisin-like peptide
produced by a strain of Lactococcus lactis isolated from fermented milk. Curr Microbiol. 51:183–187.
 Morelli L., Vogensen F.K. et von Wright A. (2004). Genetics of lactic acid bacteria. In Biology of
Microorganisms on Grapes, in Must and in Wine. König H. et Fröhlich J. (2009) Springer ed, Allemagne, p
3-29.
 Møretrø, T., Aasen, I.M., Storrø, I. et Axelsson, L. (2000). Production of sakacin P by Lactobacillus sakei
in a completely defined medium. J Appl Microbiol. 88:536-545.
 Morita, H., Toh, H., Fukuda, S., Horikawa, H., Oshima, K., Suzuki, T., Murakami, M., Hisamatsu, S.,
Kato, Y., Takizawa, T. et al. (2008). Comparative genome analysis of Lactobacillus reuteri and
Lactobacillus fermentum reveal a genomic island for reuterin and cobalamin production. DNA Res. 15:151161.
 Mortvedt, C.I., Nissen-Meyer, J., Sletten, K. et Nes, I.F. (1991). Purification and amino acid sequence of
lactocin S, a bacteriocin produced by Lactobacillus sake L45. Appl Environ Microbiol. 57:1829-1834.
 Motlagh, A.M., Bhunia, A.K., Szostek, F., Hansen, T.R., Johnson, M.G. et Ray, B. (1992). Nucleotide
and amino acid sequence of pap-gene (pediocin AcH production) in Pediococcus acidilactici H. Lett Appl
Microbiol. 15:45-48.
 Muriana, P.H. et Klaenhammer, T.R. (1991). Purification and partial characterization of lactacin F, a
bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus 11088. Appl Environ Microbiol. 53 :553-560.
 Muthaiyan, A., Limayem, A et Ricke, S.C. (2010). Antimicrobial strategies for limiting bacterial
contaminants in fuel bioethanol fermentations. Elsevier. Progress in Energy and Combustion Science.1-20.
 Nes, I.F. et Holo, H. (2000). Class II antimicrobial peptides from lactic acid bacteria. Biopolymers. 55:5061.
 Nes, I.F., Diep, D.B., Havarstein, L.S., et Brurberg, M.B., Eijsink, V. et Holo, H. (1996). Biosynthesis of
bacteriocin in lactic acid bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek. 70: 113-128.
 Neysens, P. et De Vuyst, L. (2005). Carbon dioxide stimulates the production of amylovorin L by
Lactobacillus amylovorus DCE 471, while enhanced aeration causes biphasic kinetics of growth and
bacteriocin production. Elsevier. International Journal of Food Microbiology. 105 :191– 202.
117
LBMB
 Nissen-Meyer, J., Holo, H., Havarstein, L. S., Sletten, K. et Nes, I. F. (1992). A novel lactococcal
bacteriocin whose activity depends on the complementary action of two peptides. J. bacteriol., 174, 17:
5686 – 5692.
 Ohmomo, S., Murata, S., Katayama, N., Nitisinprasart, S., Kobayashi, M., Nakajima, T., Yajima, M et
Nakanishi, K. (2000). Purification and some characterization of enterocin ON-157, a bacteriocin produced
by Enterococcus faecium NIAI 157. Journal of Applied Microbiology. 88: 81-89.
 Orla-Jensen S.H. (1919). The lactic acid bacteria. In Biology of Microorganisms on Grapes, in Must and in
 Osterlund B. and Janson J. C. 1997 - A strategic approach to protein purification, Part 1.
Science Tools. 3: 8-10.
 Ozlem, O. (2007). Detection and characterization of leucocin OZ, a new anti-listerial bacteriocin produced
by Leuconostoc carnosum with a broad spectrum of activity. Elsevier. Food Control. 18 : 118-123.
 Pal, A., Ramana, K.V. et Bawa, A.S. (2010). Simplification and optimization of de Man Rogosa Sharpe
(MRS) medium for enhanced production of bacteriocin by Weissella paramesenteroides DFR-8. J Food Sci
Technol. 47 :258-265.
 Papagianni, M. (2003). Ribosomally synthesized peptides with antimicrobial properties: biosynthesis,
structure, function, and applications. Elsevier. Biotechnology Advances. 21 : 465-499.
 Parente, E., Brienza, C., Moles, M. et Ricciardi, A. (1995).A comparison of methods for the measurement
of bacteriocin activity. Elsevier. Journal of Microbiological Methods. 22 :95-108.
 Patton, G.C. et Van Der Donk, W.A. (2005). New developments in lantibiotic biosynthesis and mode of
action. Curr. Opin. Microbiol. 8:543-551.
 Penderup Jensen, M., Braun, A., Vogensen, F. K. et Ardö, Y. (2009). Study of antimicrobial activity
among Lactobacillus helveticus strains using three different assays. Annals of Microbiology. 59:187-190.
 Piva et Headon, (1994). Pediocin A, a bacteriocin produced by Pediococcus pentosaceus FBB61. Microbial.
140: 697-702. In Purification of bacteriocins of lactic acid bacteria: problems and pointers, Verna
Carolissen-Mackay, Gottlieb Arendse, John W. Hastingsb, (1996).
 Price, R.J. et Lee, J.S. (1970). Inhibition of Pseudomonas ssp by hydrogen peroxyde producing lactobacilli.
J Milk Food Technol. 33 :13-16.
 Pridmore, R.D., Berger, B., Desiere, F., Vilanova, D., Barretto, C., Pittet, A.C., et al. (2004). The
genome sequence of the probiotic intestinal bacterium Lactobacillus johnsonii NCC 533. Proc Natl Acad
Sci U S A. 101:2512-2517.
 Pucci, M. J., Vedamuthu, E. R., Kunka, B. S. et Vandenbergh, P. A. (1988). Inhibition of Listeria
monocytogenes by Using Bacteriocin PA-1 Produced by Pediococcus acidilactici PAC 1.0. Applied And
Environmental Microbiology. 54 : 2349-2353.
 Quadri, L.E.N., Sailer, M., Roy, K.L., Vederas, J.C. et Stiles, M.E. (1994) Chemical and genetic
characterization of bacteriocins produced by Carnobacterium piscicola LV17B. J. Biol. Chem. 269, 1220412211.
 Burgess, R. R. (2009). In Methods in enzymology : Guide to proteine purification. 2nd ed. Elsevier.
Californie. 463 : 329-337.
 Riley, M.A., Wertz, J.E. (2002). Bacteriocins: evolution, ecology, and application. Annu Rev Microbiol.
56:117-137.
 Rogers, L.A. et Whittier, E.O. (1928). Limiting factors in lactic fermentation. J Bacteriol. 16:211-229.
 Ross, R.P., Stanton, C., Hill, C., Fitzgerald, G.F. et Coffey, A. (2000). Novel cultures for cheese
improvement. Trends in Food Science & Technology. 11 : 96-104.
 Rossano, R., Del Fiore, A., D’Elia, A., Pesole, G., Parente, E. et Riccio, P. (1998). New procedure for the
determination of nisin in milk. Biotechnology Techniques. 12 :783–786
 Ruiz-Barba, J. L., Caballero-Guerrero, B., Maldonado-Barragàn, A et Jiménez-Diaz, R. (2010).
Coculture with specific bacteria enhances survival of Lactobacillus plantarum NC8, an autoinducerregulated bacteriocin producer, in olive fermentations. Elsevier. Food Microbiology. 27 : 413–417.
 Sahl, H.G. et Bierbaum, G. (1998). Lantibiotics: biosynthesis and biological activities of uniquely modified
peptides from Gram-positive bacteria. Annu Rev Microbiol. 52:41-79.
118
LBMB
 Schägger, H et Von Jagow, G. (1987). Tricine–sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
for the separation of proteins in the range from 1–100 kDalton. Anal. Biochem. 166, 368–379 (1987). In
Tricine-SDSPAGE. Schägger, H. (2006). Nature Protocol.1 :16-22.
 Schillinger, U., Geisen, R. et Holzapfel, W.H. (1996). Potential of antagonistic microorganisms and
bacteriocins for the biological preservation of foods. Trends in Food Science & Technology. 71 : 58-64.
 Schillinger, U et Lücke, F.K. (1989). Antibacterial activity of Lactobacillus sake isolated from Meat.
Applied And Environmental Microbiology. 55: 1901-1906
 Schirru, S., Todorov, S. D., Favaro, L.,. Mangia, N. P., Basaglia, M., Casella, S., Comunian, R., de
Melo Franco, B. D. G. et Deiana, P. (2012). Sardinian goat’s milk as source of bacteriocinogenic
potential protective cultures. Elsevier. Food Control. 25: 309-320.
 Scopes, R.K. (1994). Protein purification : Principles and Practice. 3ième eds. Springer. Bundoora, Victoria
3083. Australia. p :17-21.
 Settanni, L., Massitti, O., Van Sinderen, D. et Corsetti, A. (2005). In situ activity of a bacteriocinproducing Lactococcus lactis strain. Influence on the interactions between lactic acid bacteria during
sourdough fermentation. Journal of Applied Microbiology. 99: 670-681.
 Settanni, L et Corsetti, A. (2008). Application of bacteriocins in vegetable food biopreservation. Elsevier.
International Journal of Food Microbiology. 121:123–138
 Speelmans, G., Vriesema, A.J. et Oolhorst, S.D.E. (2006). Pediocin-producing pediococci. USA Patent
20060165661.
 Stackendgrandt, E. et Tenber, M. (1988). Biochimie. 70:317.
 Stein, T., Heinzmann, S., Solovieva, I., Entian, K.D. (2003). Function of Lc. lactis nisin immunity genes
nisI and nisFEG after coordinated expression in the surrogate host Bacillus subtilis. J. Biol. Chem. 278: 8994.
 Stiles, M.E. (1994). Bacteriocins produced bu Leuconostoc species. J Dairy Sci. 77: 2718-2724.
 Stiles, M.E. (1996). Biopreservation by lactic acid bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek. 70:331-345.
 Strompfová, V. et Lauková, A. (2007). In vitro study on bacteriocin production of Enterococci associated
with chickens. Anaerobe. 13 : 228-237.
 Talarico, T.L., Axelsson, L.T., Novotny, J., Fiuzat, M. et Dobrogosz, W. (1990). Purification and
characterization of glycerol dehydratase from Lactobacillus reuteri. Appl Environ Microbiol. 56 :11951197.
 Tamime, A.Y. et Robinson, R.K. (1999). Yoghurt: science and technology. Woodhead, Cambridge.
 Tannock G. (ed.) (2005). Probiotics and prebiotics: Scientific aspects. In Biology of Microorganisms on
Grapes, in Must and in Wine. König H. et Fröhlich J. (2009) Springer ed, Allemagne, p 3-29.
 Ten Brink, B., Minekus, M., van der Vossen, J. M. B. M., Leer, R. J. et Huis in't Veld, J. H. J. (1994).
Antimicrobial activity of lactobacilli : preliminary characterization and optimization of production of
acidocin B, a novel bacteriocin produced by Lactobacilhs acidopbilus M46. J Appl Bacteriol. 77, 140-148.
 Thomas, L.V., Clarkson, M.R. et Delves-Broughton, J. (2000). Nisin. In: Naidu, A.S. (Ed.), Natural food
antimicrobial systems. CRC Press, Boca-Raton, FL, pp. 463-524.
 Todorov, S.D (2008). Bacteriocin production by Lactobacillus plantarum AMA-K isolated from amasi, a
Zimbabwean fermented milk product and study of the adsorption of bacteriocin AMA-K to Listeria sp.
Brazilian Journal of Microbiology. 39:178-187
 Todorov, S.D ., Rachman, C ., Fourrier, A., Dicks, L.M.T., van Reenen, C.A., Prévost, H et Dousset, X.
(2010). Characterization of a bacteriocin produced by Lactobacillus sakei R1333 isolated from smoked
salmon. Elsevier. Anaerobe. 1-9.
 Todorov, S.D et Dicks, L.M.T. (2004). Characterization of mesentericin ST99, a bacteriocin produced by
Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum ST99 isolated from boza. Society for Industrial
Microbiology. J Ind Microbiol Biotechnol. 31 :323-329.
 Todorov, S.D et Dicks, L.M.T. (2005a). Lactobacillus plantarum isolated from molasses produces
bactériocins active against Gram-negative bacteria. Elsevier. Enzyme and Microbial Technology. 36 :318326.
119
LBMB
 Todorov, S.D. et Dicks, L.M.T. (2005b). Production of bacteriocin ST33LD, produced by Leuconostoc
mesenteroides subsp. mesenteroides, as recorded in the presence of different medium components. World
Journal of Microbiology & Biotechnology. 21:1585-1590.
 Todorov, S.D. et Dicks, L.M.T. (2005c). Effect of growth medium on bacteriocin production by
Lactobacillus plantarum ST194BZ, a strain isolated from boza. Food Technology and Biotechnology.
43:165-173.
 Todorov, S.D. et Dicks, L.M.T. (2006). Screening for bacteriocin-producing lactic acid bacteria from boza,
a traditional cereal beverage from Bulgaria Comparison of the bacteriocins. Elsevier. Process Biochemistry.
41 :11-19.
 Todorov, S.D., Nyati, H., Meincken, M. et Dicks, L.M.T. (2007). Partial characterization of bacteriocin
AMA-K, produced by Lactobacillus plantarum AMA-K isolated from naturally fermented milk from
Zimbabwe. Elsevier. Food Control. 18 :656-664.
 Tomé, E., Pereira, C.V., Lopes, C.I., Gibbs, P.A. et Teixiera, P.C. (2008). In vitro tests of suitability of
bacteriocin-producing lactic acid bacteria, as potential biopreservation cultures in vacuum-packaged coldsmoked salmon. Elsevier. Food Control. 19 :535-543.
 Valenta, C., Bernkop-Schnürch, A. et Rigler, H. P. (1996). The antistaphylococcal effect of nisin in a
suitable vehicle: a potential therapy for atopic dermatitis in man. Journal of Pharmacy and Pharmacology.
48 :988-991.
 Van Laack, R.L.J.M., Schillinger, U. et Holzapfel, W.H. (1992). Characterization and partial purification
of a bacteriocin produced by Leuconostoc carnosum LA44A. Int. J. Food Microbial. 16 :183-195.
 Van Reenen, C.A, Dicks, L.M.T et Chikindas, M.L. (1998). Isolation, purification and partial
characterization of plantaricin 423, a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum. The Society for
Applied Microbiology. Journal of Applied Microbiology. 84 :1131-1137.
 Vaughan, E.E., Daly, C. et Fitzgerald, G.F.( 1992). Identification and characterization of helveticin V1829, a bacteriocin produced by Lactobacillus helveticus 1829. J Appl Bacteriol. 73:299-308.
 Von Mollendorff, J. W., Todorov, S.D et Dicks, L.M.T. (2009). Optimization of growth medium for
production of bacteriocins by Lactobacillus plantarum JW3BZ and JW6BZ, and Lactobacillus fermentum
JW11BZ et JW15BZ isolated from boza. Trakia Journal of Sciences. 7: 22-33.
 Wegmann, U., O'Connell-Motherway, M., Zomer, A., Buist, G., Shearman, C., Canchaya, C., Ventura,
M., Goesmann, A., Gasson, M.J., Kuipers, O.P. et al. (2007). Complete genome sequence of the
prototype lactic acid bacterium Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363. J Bacteriol. 189:3256-3270.
 Wolf, C.E. et Gibbons, W. R. (1996). Improved method for quantification of the bacteriocin nisin. J Appl
Bacteriol. 80 :453-457.
 Xiraphi, N., Georgalaki, M., Rantsiou, K., Cocolin, L., Tsakalidou, E. et Drosinos, E.H. (2008).
Purification and characterization of a bacteriocin produced by Leuconostoc mesenteroides E131. Elsevier.
Meat Science. 80: 194-203.
 Yanagida, F., Chen, Y.S., Onda, T. et Shinohara, T. (2005). Durancin L28-1A, a new bacteriocin from
Enterococcus durans L28-1, isolated from soil. Lett Appl Microbiol 40:430-435.
 Yang, R., Johnson, M.C. et Ray, B. (1992). Novel method to extract large amount of bacteriocin from lactic
acid bacteria. App Environ Microbiol. 58:3355-3359.
 Yang, R. et Ray, B. (1994). Factors influencing production of bacteriocins by lactic acid bacteria. Food
Microbiol. 11: 281-291.
 Yildirim, Z. et Johnson, M.G. (1998). Detection and characterisation of a bacteriocin produced by
Lactococcus lactis subsp. cremoris R isolated from radish. Letters in Applied Microbiology. 26: 297-304.
 Zamfir, M et Grosu-Tudor, S. (2009). Impact of stress conditions on the growth of Lctobacillus acidophilus
IBB 801 and production of acidophilin 801. J Gen Appl Microbiol. 55 :277-282.
 Zaoui, W. (2011). Essais d’une optimisation de la production des bactériocines chez deux souches de
bactéries lactiques Enterococcus faecalis BO2 et Lactococcus lactis subsp lactis. Mémoire d’ingéniorat
d’état en Biotechnologie. Université d’Oran.
120
LBMB
 Zhang, Y., Liu, Y., Bao, Y,. et Zhang, H. (2010). Influence of pH, Heat and Enzymatic treatments on the
activity of antibacterial substance in mrs and milk media produced by Lactobacillus fermentum F6.
Agricultural Sciences in China. 9 : 911-920.
 Zhou, X.X., Pan, Y.J., Wang, Y.B. et Li, W.F. (2008). Optimization of medium composition for nisin
fermentation with response surface methodology. J Food Sci. 73:245–249
 Zhu, Y., Zhang, Y. et Li, Y. (2009). Understanding the industrial application potential of lactic acid bacteria
through genomics. Appl Microbiol Biotechnol. 83:597-610.
121
Résumé
La production de bactériocines est l’une des activités les plus recherchées, chez les bactéries lactiques, vu son
intérêt dans différentes industries. Notre travail a pour objet de détecter les bactéries bactériocinogènes, dans un
échantillon de 24 souches (10 lactobacilles et 14 leuconostocs), de réaliser une optimisation de la production de
leurs bactériocines et de caractériser ces dernières. Le criblage des interactions négatives, par une méthode
directe, a indiqué que les lactobacilles (91,6%) sont plus inhibiteurs que les leuconostocs (77%). Par une
méthode indirecte, l’effet inhibiteur des surnageants de culture a été mis en évidence puis les agents en cause ont
été caractérisés. Trois souches se sont avérées bactériocinogènes : Lactobacillus sp CHM9 (Bactériocine
CHM9), Lactobacillus sp CHM18 (Bactériocine CHM18) et Leucocnostoc mesenteroïdes subsp dextranicum
CHBK310 (Mésentéricine CHBK310). Cultivées, en milieu MRS supplémenté en extrait de levure et en lait, ces
souches bactériocinogènes voient leur effet inhibiteur amplifié. L’optimisation de la production de la
bactériocine CHM9 a été faite dans un MRS modifié (MRSm) en source d’azote et en source de potassium. Cette
production reste sensiblement stable à différentes températures (25, 30, 35 et 40°C). La meilleure diffusion de
cette bactériocine dans une gélose tamponnée à pH7, a permis une meilleure évaluation de son effet inhibiteur.
La quantité de la bactériocine CHM9, produite en milieu MRSm Tp (pH7) est estimée à 1250 AU/ml. Cette
bactériocine est un métabolite primaire. De manière générale, l’activité de la bactériocine CHM9 n’est affectée
ni par les pH acides ou basiques, ni par les traitements thermiques. Les détergents testés n’ont pas affecté
l’activité de la bactériocine CHM9 qui a été précipitée par le sulfate d’ammonium à 50%. La chromatographie en
gel filtration, a permis de collecter quelques fractions présentant un effet inhibiteur. Par électrophorèse en tricine
SDS-PAGE, le poids moléculaire de la bactériocine CHM9 a été estimé nettement inférieur à 14,4 KDa.
Mots clés : Lactobacillus- Leuconostoc – bactériocine – optimisation – gel filtration – Tricine SDS-PAGE.
Abstract
Bacteriocin production is one of the most studied activities, in lactic acid bacteria, given its interest in various
industries. The aim of our study is to detect the bacteriocinogenic bacteria in a sample of 24 strains (10
lactobacilli and 14 leuconostoc), to optimize bacteriocins production and characterize them. Screening of
negative interactions by a direct method indicated that the lactobacilli (91.6%) are more inhibitors than
leuconostocs (77%). By an indirect method, the inhibitory effect of culture supernatants was shown, and then
inhibiting agents have been characterized. Three strains were found bacteriocinogenics, Lactobacillus sp CHM9
(Bacteriocin CHM9), Lactobacillus sp CHM18 (Bacteriocin CHM18) and Leucocnostoc mesenteroïdes subsp
dextranicum CHBK310 (Mesentericin CHBK310). Cultivated in MRS medium supplemented with yeast extract
and milk, these bacteriocinogenic strains have shown an amplified inhibitory effect. The optimization bacteriocin
CHM9 production was made in a modified MRS (MRSm) in the nitrogen and potassium sources. This
production remains substantially stable at different temperatures (25, 30, 35 and 40°C). The best diffusion of this
bacteriocin in an agar buffered at pH7, allowed a better evaluation of its inhibitory effect. The quantification of
bacteriocin CHM9, produced in MRSm Tp (pH 7) is estimated at 1250 AU/ml. This bacteriocin is a primary
metabolite. In general, the activity of the bacteriocin CHM9 was neither affected by acidic or basic pH nor by
heat treatments. Detergents tested did not affect the activity of the bacteriocin CHM9 which was precipitated by
ammonium sulphate to 50%. The gel filtration chromatography has raised some fractions having an inhibitory
effect. By electrophoresis in tricine SDS-PAGE, the molecular weight of the bacteriocin CHM9 was estimated
clearly below 14.4 kDa.
Keywords: Lactobacillus- Leuconostoc – bacteriocin – optimization –filtration gel – Tricine SDS-PAGE.
‫ماخص‬
‫ الهدف من دراستنا‬.‫إن إنتاج الباكتريوسينات هو من ضمن النشاطات األكثر دراسة في بكتريا حمض الالكتيك نضرا الهتمام العديد من الصناعات‬
.‫ ( تحسين إنتاجها و دراستها‬lactobacilles 01 ‫ و‬leuconostocs 14) ‫ ساللة بكترية‬42 ‫هو البحث عن بكتريا منتجة للباكتريوسين ضمن‬
.(77%) leuconostocs ‫( هي أكثر تثبيطا من البكتريا‬91,6%) lactobacilles ‫أظهر استعمال وسيلة مباشرة لكشف التفاعالت السلبية أن ساللة‬
Lactobacillus sp CHM9 : ‫ لقد وجد ثالثة سالالت منتجة للباكتريوسين‬.‫بواسطة طريقة غير مباشرة تم إبراز مفعول المادة المثبطة و دراستها‬
mesenteroïdes subsp dextranicum ‫( و‬CHM18 ‫ )باكتريوسين‬Lactobacillus sp CHM18 , (CHM9 ‫)باكتريوسين‬
‫أدى إلى‬,‫ مضاف إليه خالصة الخميرة و الحليب‬MRS ‫ عندما زرعت البكتريا في الوسط الغذائي‬.(CHBK310 ‫ )ميزنترسين‬Leucocnostoc
‫( من حيث مصدر النيتروجين و‬MRSm) MRS‫ تم في الوسط الغذائي المتغير‬CHM9 ‫ تحسين إنتاج الباكتريوسين‬.‫تضاعف انتاج الباكتريوسين‬
pH7 ‫ سمح إسهاب الباكتريوسين في وسط‬.(‫ درجة مئوية‬22‫ و‬02 , 01,42 ) ‫ هدا اإلنتاج يبقى مستقر في درجات حرارة مختلفة‬.‫مصدر البوتاسيوم‬
‫ يعتبر باكتريوسين‬.‫مل‬/‫ وحدة كيفية‬0421 ‫ ب‬MRSm Tp (pH7) ‫ يقدر القياس الكمي للباكتريوسين المنتجة في الوسط‬.‫بتقييم أفضل لمفعولها‬
‫ إن‬.‫ في الوسط الحمضي وال في األساسي وال بعد معالجته حراريا‬CHM9 ‫ ال يتأثر نشاط الباكتريوسين‬,‫ بشكل عام‬.‫ مستقلب أولي‬CHM9
‫ أشارت تقنية الكروماتوغرافيا باستعمال هالم‬.%21 ‫ التي تم ترسيبها بكبريتات االمونيوم إلى‬CHM9 ‫المنظفات لم تؤثر على مفعول الباكتريوسين‬
‫ إلى أن وزن الجزيئي للباكتريوسين‬Tricine SDS-PAGE ‫ أبرزت تقنية التهجير الكهربائي‬.‫ترشيح أن بعض أجزاء المجموعة لهم تأثير مثبط‬
.‫ كيلو دالتون‬14,4 ‫ اقل بكثير من‬CHM9
Tricine SDS-PAGE - ‫ كروماتوغرافيا هالم ترشيح‬- ‫ تحسين إنتاج‬-‫ – باكتريوسين‬Leuconostoc – Lactobacillus : ‫الكلمات األساسية‬
Résumé
La Production de bactériocines est l’une des activités les plus recherchées, chez
les bactéries lactiques, vu son intérêt dans différentes industries. Notre travail a
pour objet de détecter les bactéries bactériocinogènes, dans un échantillon de 24
souches (10 lactobacilles et 14 leuconostocs), de réaliser une optimisation de la
production de leurs bactériocines et de caractériser ces dernières. Le criblage des
interactions négatives, par une méthode directe, a indiqué que les lactobacilles
(91,6%) sont plus inhibiteurs que les leuconostocs (77%). Par une méthode
indirecte, l’effet inhibiteur des surnageants de culture a été mis en évidence puis
les agents en cause ont été caractérisés. Trois souches se sont avérées
bactériocinogènes : Lactobacillus sp CHM9 (Bactériocine CHM9), Lactobacillus
sp CHM18 (Bactériocine CHM18) et Leucocnostoc mesenteroïdes subsp
dextranicum CHBK310 (Mésentéricine CHBK310). Cultivées, en milieu MRS
supplémenté en extrait de levure et en lait, ces souches bactériocinogènes voient
leur effet inhibiteur amplifié. L’optimisation de la production de la bactériocine
CHM9 a été faite dans un MRS modifié (MRSm) en source d’azote et en source
de potassium. Cette production reste sensiblement stable à différentes
températures (25, 30, 35 et 40°C). La meilleure diffusion de cette bactériocine
dans une gélose tamponnée à pH7, a permis une meilleure évaluation de son effet
inhibiteur. La quantité de la bactériocine CHM9, produite en milieu MRSm Tp
(pH7) est estimée à 1250 AU/ml. Cette bactériocine est un métabolite primaire.
De manière générale, l’activité de la bactériocine CHM9 n’est affectée ni par les
pH acides ou basiques, ni par les traitements thermiques. Les détergents testés
n’ont pas affecté l’activité de la bactériocine CHM9 qui a été précipitée par le
sulfate d’ammonium à 50%. La chromatographie en gel filtration, a permis de
collecter quelques fractions présentant un effet inhibiteur. Par électrophorèse en
tricine SDS-PAGE, le poids moléculaire de la bactériocine CHM9 a été estimé
nettement inférieur à 14,4 KDa.
Mots clés :
Lactobacillus; Leuconostoc; Bactéries lactiques; Bactériocines; Optimisation;
Purification; Caractérisation biochimique; Gel filtration; Tricine SDS-PAGE.

Bactériocines des bactéries lactiques

Transcription

Documents pareils

des microbes qui nous entourent…

sélection de souches de bactéries lactiques antibactériennes

RESIDENCE HELIADES Mme Florence Duvivier, directrice Rue du

HMF Candigen Cream

notice OROGYN

Les lactobacilles, défenseurs du vagin, du lait et de la

importance de l`acidification pour les fromages lactiques