Communications Orales - Club Exocytose

- PARIS 2002 -
Communications Orales
ENDOCYTOSE, EXOCYTOSE ET LIPID FLIP-FLOP
Philippe F.Devaux
UMR CNRS 7099, Institut de Biologie Physico-chimique, 13 rue Pierre et Marie Curie 75005 Paris
L’endocytose et l’exocytose impliquent des changements de courbure membranaire importants qui
imposent des variations d’aire des 2 monocouches. La compressibilité latérale d’une monocouche de
lipides étant limitée, il faut soit une redistribution des lipides soit un processus d’adsorption-désorption
asymétrique de protéines extrinsèques. Le temps caractéristique de diffusion transversale (ou flip-flop),
de l’ordre de plusieurs heures, exclut une adaptation spontanée des bicouches aux changements de
courbures qui pourraient être imposées par des protéines du cytosquelette. Toutefois, il existe dans les
membranes
plasmiques
des
cellules
eucaryotes
une
batterie
de
protéines
intrinsèques
(aminophospholipide translocase, flippase, floppase, scramblase) capables de réguler la distribution
transmembanaire des lipides, soit en facilitant la diffusion, soit en effectuant un transport sélectif de
lipides d’un feuillet vers l’autre. Le transport actif de lipides du feuillet externe vers le feuillet interne
pourrait être le moteur moléculaire du premier stade l’endocytose, c’est-à-dire le repliement de la
membrane plasmique. Des expériences avec des cellules K562 sauvages ou exprimant le glycoprotéineP permettent de montrer l’influence du trafic des lipides dans la vitesse d’endocytose.
P.Devaux (2000) "Is lipid translocation involved during endo- and exocytosis?" Biochimie 82, 497-509;
Farge E, et al.(1999) Enhancement of endocytosis due to aminophospholipid transport across the plasma membrane
of living cells. Am. J. Physiol. 276, C725-C733
Rôle de la proximité des membranes dans la fusion
Frédéric Pincet
Laboratoire de Physique Statistique de l’Ecole Normale Supérieure –CNRS UMR8550, 24 rue
Lhomond 75005 Paris
Pour que des bicouches lipidiques soient stables, il faut que les têtes polaires des lipides soient
suffisamment hydratées. Ainsi, lorsque deux membranes se rapprochent, si la distance les séparant
est trop petite, l’hydratation des têtes devient trop faible et une transition vers une phase connexe doit
avoir lieu. Ce phénomène, déjà été très étudié en physico-chimie par la description du diagramme de
phases (fraction lipides/eau, tempéraure) de nombreuses molécules amphiphiles, s’apparente à une
étape de la fusion membranaire : l’hémifusion.
Les forces entrant en jeu pour déterminer la distance d’équilibre sont bien caractérisées : attraction de
van der Waals, répulsion électrostatique double couche, répulsions à courte portée (protrusion,
hydratation,…). Il est donc possible, en jouant sur les différents paramètres qui définissent ces forces,
de contrôler cette distance d’équilibre et donc de déclencher l’hémifusion. Par exemple, l’utilisation de
molécules attractives, telles que des protéines ou des lipides fonctionnalisés, à la surface des
membranes permet une telle appproche. Les temps caractéristiques d’échange des molécules entre
les membranes donnent aussi des indications quant à la structure de la zone hémifusionnée.
Courbure membranaire, fusion entre membranes et formation de spicules
Alain Bienvenüe (UMR5539, CNRS, Université Montpellier2)
Le rôle de la courbure membranaire sera considéré dans deux phénomènes :
La fusion membranaire : en s’inspirant de considération physico-chimiques et des propriétés des
protéines de fusion, nous avons conçus des assemblages modèles contenant des peptides attachés à
des membranes. La fusion de la membrane de ces assemblages avec une membrane cible est rapide,
efficace bien qu’accompagnée d’aucune fuite des contenus internes des vésicules. La conformation
du peptide est déterminant dans ce processus. Cette conformation dépend simultanément de la
séquence peptidique et de la composition de la membrane.
La morphologie cellulaire : la tension et la courbure membranaires peuvent être artificiellement
modifiées par l’addition de lipides sur l’un des feuillets de la membrane. Les plaquettes sanguines
(comme d’autres cellules) répondent réversiblement à cette contrainte par la formation de très longs
filopodes. Nous montrons que ceci s’accompagne d’une polymérisation de l’actine, via une activation
de la PI3kinase et la phosphorylation de la protéine Akt. Il s’agit ici d’un nouveau mode de couplage
entre la forme de la cellule et l’organisation du cytosquelette.
Rôle des microdomaines
transmembranaires
lipidiques
dans
le
trafic
des
récepteurs
Christophe Lamaze (Institut Curie, UMR 144 CNRS Equipe « Trafic et Signalisation »)
Un certain nombre de résultats récents indiquent que l’asymétrie latérale de répartition lipidique dans
les membranes biologiques est responsable de la formation de microdomaines membranaires ou
« rafts ». Les microdomaines ont surtout été impliqués dans les phénomènes de signalisation car la
plupart des protéines associées aux microdomaines sont des molécules du signal. Certains
récepteurs transmembranaires sont également retrouvés dans les microdomaines avec toutefois des
caractéristiques d’association particulières. Le rôle de cette association dans le trafic des récepteurs
sera discuté au travers de différents exemples récents.
Rôle de la phospholipase D dans l’exocytose
Nicolas Vitale
CNRS UPR-2356 Strasbourg
Les cellules nerveuses et neuroendocrines communiquent par exocytose, mécanisme étroitement
contrôlé par le calcium cytoplasmique, et qui implique le recrutement et l’arrimage des granules de
sécrétion à la membrane plasmique, puis la fusion entre membranes plasmique et granulaire
permettant la libération des produits dans l’espace extracellulaire. Un certain nombre d'arguments
expérimentaux indiquent que le modèle SNARE qui décrit les étapes de positionnement et/ou de fusion
des vésicules à une membrane cible s'applique à l’exocytose des vésicules synaptiques et granules de
sécrétion. Toutefois, le rôle des lipides dans le mécanisme d’exocytose reste peu étudié . Dans ce
contexte, nous avons étudié la participation des phospholipases D (PLD) dans les mécanismes de
sécrétion des cellules neuroendocrines et des neurones. Les phospholipases D hydrolysent la
phosphatidylcholine en produisant de l’acide phosphatidique dont la participation au trafic vésiculaire et
à la dynamique du cytosquelette a été suggérée.
Nous avons pu mettre en évidence la PLD1 au niveau de la membrane plasmique des cellules
neuroendocrines (chromaffines et PC12) et neuronales (synaptosomes et neurones du cervelet). La
surexpression de PLD1 dans les cellules PC12 stimule l'exocytose, tandis que la PLD2 n'a pas d'effet.
En revanche, la surexpression d'un mutant catalytiquement inactif de la PLD1 inhibe l'exocytose,
tandis qu'un mutant inactif de la PLD2 n'a aucun d'effet. La microinjection de protéine PLD1 et PLD2
recombinantes catalytiquement inactives, nous a permis mettre en lumière un rôle clé de PLD1 aussi
bien dans la sécrétion des cellules chromaffines que des neurones d’Aplysie. Des analyses
ampérométrique et électrophysiologique nous ont permis de définir que la PLD1 participait aux étapes
ultimes de la fusion des granules de sécrétion et des vésicules synaptiques avec la membrane
plasmique. Une hypothèse qu’il nous reste maintenant à vérifier, serait que l’acide phosphatidique
généré par la PLD favorise la déstabilisation des bicouches lipidiques au niveau des sites d’exocytose.
Rôle des modifications lipidiques dans la dynamique des membranes
Anne Schmidt, Groupe ATIPE-CNRS, IBPC, UPR 1929, 13 rue Pierre et Marie Curie, 75005 Paris. Email : [email protected]
Parmi les lipides constituant les membranes biologiques, certains - souvent présents en
minorité - subissent des modifications structurales dont les régulations, dans l’espace (membrane
cible) et dans le temps, sont essentielles à la dynamique des membranes (homéostasie des
compartiments et transport inter-compartimentaux). L’objectif de cet exposé sera d’abord de présenter
les voies métaboliques des phospholipides membranaires localisés sur la face cytosolique de la
bicouche lipidique, en particulier celles conduisant aux dérivés phosphorylés du phosphatidylinositol et
d’un phospholipide tel que l’acide phosphatidique. On s’intéressera ensuite à l’implication de ces
phospholipides dans des étapes précises de la dynamique des membranes, en particulier celles
conduisant à l’exocytose et à l’endocytose. Enfin, l’endocytose médiée par le manteau de clathrine
sera prise en exemple pour introduire les concepts émergents quant aux modes possibles d’action de
protéines
cytosoliques
(exemples :
AP180/CALM,
endophilines,
amphiphysines,
dynamines)
participant aux processus de déformations membranaires tels que le bourgeonnement et la fission,
après interaction et/ou modification des phospholipides.
Exocytose des lysosomes : réponses bactéricide, inflammatoire et tumorale invasive
Cougoule, C., Carréno, S, Peyron, P., Astarie-Dequeker, C. et Maridonneau-Parini, I.
Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale, CNRS UMR 5089, Toulouse.
Les phagocytes possèdent des lysosomes dont la sécrétion est régulée. Ces lysosomes sont
capables de fusionner avec la membrane plasmique, la libération de protéases permet la dégradation
de la matrice extracellulaire nécessaire à la migration des phagocytes jusqu’au site infectieux. Ces
lysosomes fusionnent également avec les phagosomes contenant des agents infectieux dans le but
de les tuer. Les mécanismes moléculaires impliqués n’ont pas été identifiés. Dans ce but, nous avons
reconstitué le premier test in vitro permettant le suivi de la fusion des lysosomes avec des
phagosomes purifiés provenant de neutrophiles humains. D’autre part, nous présenterons des
résultats concernant la fusion des lysosomes avec la membrane plasmique et l’implication de la
protéine tyrosine kinase Hck dans ce processus. Les mécanismes moléculaires et les structures
cellulaires impliqués dans la migration des phagocytes à travers des barrières anatomiques ont des
éléments communs avec les cellules tumorales invasives.
LA
COMPARTIMENTATION
DES
METABOLITES
DANS
LA
VOIE
DE
SECRETION :
CARACTERISATION DE NOUVEAUX TRANSPORTEURS DE LYSOSOMES
Bruno Gasnier
CNRS UPR 1929, Institut de Biologie Physico-Chimique, 13 rue P. et M. Curie, 75005 Paris
Dans les cellules eucaryotes, le milieu interne des organites diffère du cytosol. Pour les petites
molécules, cette compartimentation est assurée par des transporteurs membranaires couplés à des
ATPases translocatrices d’ions. Dans le cas des lysosomes, une multitude de transporteurs, inconnus
pour la plupart, assurent l’évacuation des produits d’hydrolyse de la lumière lysosomale vers le
cytosol. Cet efflux est en général activé par le gradient de protons créé par la V-ATPase de ces
organites.
Une stratégie d’analyse fonctionnelle basée sur l’expression des transporteurs lysosomaux sur la
membrane plasmique nous a permis récemment d’identifier ou de caractériser deux transporteurs
lysosomaux, en collaboration avec d’autres laboratoires. Cette approche expérimentale, qui revient à
créer des lysosomes géants inversés, a l’avantage de permettre des manipulations du compartiment
intralysosomal et de transformer l’« efflux » lysosomal en un influx cellulaire beaucoup plus facile à
étudier. L’acidification du milieu extracellulaire complète la configuration de lysosome inversé et
stimule ces transports.
De cette manière, nous avons identifié un premier transporteur lysosomal d’acide aminés, LYAAT-1,
en collaboration avec le groupe de B. Giros (INSERM U 513, Créteil). Ce transporteur assure
l’évacuation lysosomale de la proline, l’alanine et la glycine dans les neurones. Une seconde protéine,
la cystinosine, avait été identifiée par le groupe de C. Antignac (INSERM U 423, Paris) comme le
produit du gène muté dans les cystinoses néphropathiques. Cette maladie se caractérise par une
accumulation lysosomale de cystine dans divers tissus. En mutant son motif de ciblage, nous avons
démontré avec ce groupe que la cystinosine était le transporteur lysosomal de cystine, bien qu’elle ne
présente pas d’homologie de séquence ou de structure (7 domaines transmembranaires) avec les
familles de transporteurs connues jusqu’ici.
Références :
Sagné C., Agulhon C., Ravassard P., Darmon M., Hamon M., El Mestikawy S., Gasnier B. and Giros
B. (2001) Identification and characterization of a lysosomal transporter for small neutral amino acids.
P.N.A.S. 98, 7206-7211.
Kalatzis V., Cherqui S., Antignac C. and Gasnier B. (2001) Cystinosin, the protein defective in
cystinosis, is a H+-driven lysosomal cystine transporter. EMBO J. 20, 5940-5949.
Rab3 and Rab27 control exocytosis in neuroendocrine cells
Schonn J.-S, Desnos C., *El Amraoui A., §Menashé G., Chapuis C., Henry J. P. ,
§
de Saint-
Basile G., *Petit C. and Darchen F.
CNRS UPR 1929, Institut de Biologie Physico-Chimique, Paris ([email protected]); *CNRS URA
1968, Institut Pasteur, 25 rue du Dr Roux, 75724 Paris Cedex 15 ; §INSERM U429, Hôpital Necker
149 rue de Sèvres 75015 Paris
Secretion is a complex process involving many steps. The monomeric GTP-binding protein
Rab3a is a negative regulator of exocytosis in neuroendocrine cells. In order to define more precisely
its site of action, we performed a kinetic study of the secretory activity of PC12 cells overexpressing
Rab3a or the GTPase-deficient mutant (Rab3aQ81L). The initial phase of the secretory response was
strongly inhibited by Rab3a Q81L, as measured by carbon fiber amperometry (90% inhibition in the
first 30s) or by means of a 5HT release assay from cells co-transfected with the plasma membrane
serotonin transporter (SERT). In contrast, after 2 min, the rate of 5HT release on secretion was not
affected anymore. The Rab3aQ81L inhibitory effect was increased upon repetitive stimulation
excepted if the time intervals between stimuli was lengthened to 10 min. In digitonin permeabilized
PC12 cells, preincubation with ATP increased the secretory response in control cells (priming effect),
but not on cells transfected by the Rab3aQ81L mutant. Our data indicate that Rab3-GTP decreases
the size of the readily releasable pool of secretory vesicles.
Rab27a is associated with melanosomes and contributes to the intracellular transport of these
organelles via the recruitment of myosin Va or myosin VIIa. We identified a tripartite molecular
complex composed of Rab27a, myosin VIIA, and MyRIP (Myosin VIIA and Rab Interacting Protein)
that is likely to bridge melanosomes and actin cytoskeleton and to control the local trafficking of these
organelles (EMBO Report, in press). In PC12 cells, MyRIP was found to colocalise with secretory
granules markers. We investigated a possible role for MyRIP and Rab27 in calcium-dependent
exocytosis. We found that Rab27a is also associated with secretory granules in PC12 cells and bovine
adrenal chromaffin cells. Transient overexpression of either wild type Rab27a or a GTPase-deficient
Rab27a mutant (Rab27aQ78L) or MyRIP Rab-Binding-Domain reduced the secretory activity of PC12
cells.
These results suggest that Rab3 and Rab27 might have complementary role in secretion. This might
account for the mild phenotype that results from Rab3a gene inactivation.
Structure cristalline de la petite protéine G Rab11 liée au GDP
Sebastiano Pasqualato1, Francesca Senic-Matuglia2, Louis Renault1, Bruno Goud2
Jean Salamero2 et Jacqueline Cherfils1
1
LEBS, CNRS - 1, avenue de la Terrasse 91198 Gif-sur-Yvette Cedex France 2UMR CNRS 144,
Laboratoire Mécanismes Moléculaires du Transport Intracellulaire, Institut Curie, 75248 Paris Cedex05
France
Les compartiments endosomaux se caractérisent par des populations différentes de Rabs,
principalement Rab5 pour les endosomes précoces, Rab4/Rab5 et Rab4/Rab11 pour les endosomes
de recyclage. Rab11 joue un rôle clef dans le tri des endosomes de recyclage entre le TGN et la
membrane plasmique.
Comme les autres protéines G, Rab11 bascule entre une forme ‘inactive’ liée au GDP et une forme
‘active’ liée au GTP qui interagit avec les effecteurs, sous le contrôle des facteurs d’échange et GAPs
encore mal caractérises. Rab11 est recyclée dans le cytosol sous forme GDP en complexe avec les
protéines GDI. Il semble que Rab11, ainsi que autre protéines Rab, puisse interagir avec des
effecteurs communs, qui constituent ainsi une jonction entre des étapes successives du transport
endosomal.
Dans le but de comprendre les bases structurales des mécanismes moléculaires qui régulent la
spécificité de Rab11 vers ses partenaires cellulaires, nous avons entrepris son étude
cristallographique. Rab11•GDP tronquée de ses 43 acides aminés C-terminaux cristallise sous forme
d’un dimère avec une surface enfouie de ~1900 Å2 entre les deux molécules, comparable à celle
typique d’un complexe protéine-protéine stable. La dimèrisation séquestre les régions switchs, qui
sont les senseurs structuraux de la nature du nucléotide et les sites majeurs de l’interaction des
protéines G avec leurs partenaires cellulaires. La formation de ce dimère dans la cellule inhiberait
ainsi les interactions de Rab11 avec ses effecteurs et probablement ses régulateurs. En particulier
l’impossibilité d’une interaction avec le GDI suggère que ce dimère serait localisé à la membrane.
L’étude structurale suggère l’hypothèse que le dimère observé dans le cristal pourrait correspondre à
une forme inactive localisée à la membrane dont le rôle nécessitera une investigation ultérieure.
Priming synaptic vesicles at the neuromuscular junction in C. elegans
Erik Jorgensen, Department of Biology, University of Utah, 257 South 1400 East, Salt Lake City,
T84112-0840
Synaptic vesicle exocytosis is extremely rapid because the vesicle is in a readied or primed state.
Priming is thought to require the formation of the SNARE complex, comprised of the vesicle protein
synaptobrevin and the plasma membrane proteins SNAP-25 and syntaxin. In solution syntaxin adopts
a closed conformation that occludes the SNARE interaction domain.
UNC-18 (also known as n-Sec1) is an active zone protein which binds syntaxin. In the nematode C.
elegans, unc-18 mutants are paralyzed and synaptic vesicle exocytosis is severely reduced. The
UNC-18 protein binds syntaxin with high affinity and it has been proposed that syntaxin is required to
convert syntaxin from the closed to open state. Our data indicate that UNC-18 is not required to open
syntaxin and that the interaction with syntaxin is not relevant for the facilitory function of UNC-18 in
exocytosis.
Protéines synaptiques et synapses bruyantes
Yann HUMEAU, Frédéric DOUSSAU et Bernard POULAIN
Neurotransmission et Sécrétion Neuroendocrine, UPR2356, CNRS, 5 rue Blaise Pascal F-67084
Strasbourg Cédex,
En réponse à la modification de la fonctionnalité d’une protéine vous observez que l’exocytose
est modifiée. Victoire ! Vous tenez une protéine impliquée de près ou de loin dans l’exocytose ou sa
régulation. Au fait, quelle est l’étape du processus de sécrétion qui a été changée? Trafic des
vésicules? Docking? Priming? Fusion? Le but de cette présentation est de commenter rapidement
l’intérêt que présente, pour le domaine de l’exocytose, une approche analytique développée
récemment dans plusieurs équipes d’électrophysiologistes pour étudier la dynamique de la libération
des neurotransmetteurs (Quastel, 1997; Silver et al., 1998; Reid et Clements, 1999; Oleskevich et al.,
2000; Clements et Silver, 2000; Humeau et al, 2000 ; 2001a et b ; Meyer et al., 2001; Scheuss et
Neher, 2001 ; Scheuss et al., 2002). Il n’y a pas
de nouveauté théorique dans tout cela mais
seulement la mise en application pratique au service de l’analyse de l’exocytose des transmetteurs de
ce qu’on savait sur les aspects quantiques de la neurotransmission depuis 50 ans.
Un peu d’histoire. En 1952, Fat et Katz observent que les réponses postsynaptiques dues à la
libération évoquée de transmetteur présentent des fluctuations d’amplitude autour de certaines
valeurs préférentielles et que l’amplitude de ces sauts est identique à celle des réponses miniatures
spontanées. C’est le point de départ de la formulation de l’hypothèse quantique de la
neurotransmission : chaque réponse miniature (ou ‘quantum de réponse’) est produite par l’exocytose
du contenu d’une vésicule (ou ‘quantum’ de transmetteur). Chaque potentiel d’action déclenche la
fusion synchrone de plusieurs vésicules.
La deuxième observation fondamentale est que le processus de libération se comporte
comme un phénomène probabiliste : le nombre des fusions déclenchées par un potentiel d’action peut
être décrit comme la distribution binomiale de deux paramètres : n, le nombre de sites de libération
indépendants et p, la probabilité de libération à ces sites. Ainsi, à chaque stimulation, en moyenne n.p
vésicules fusionnent. Comme chaque fusion de vésicule génère une réponse miniature d’amplitude q,
l’amplitude moyenne des réponses est Imoyen = n.p.q. D’une stimulation à l’autre on a pas toujours n.p
vésicules qui fusionnent. Dans le cas d’une distribution binomiale, la variance des fluctuations autour
de n.p se ré-exprime sous une forme simple : Var = n.p.(1-p) et la variance des fluctuations en
amplitude des réponses postsynaptiques est Var = n.p.(1-p)q2.
Pour plus de détails voyez les textes historiques de Fatt et Katz (1952), Boyd et Martin (1956),
la ‘Sherrington Lecture’ de Katz (1969), l’irremplaçable ouvrage de Hubbard, Llinas et Quastel (1969)
et pour des textes récents sur le système nerveux central, voyez par exemple le volume édité par
Faber et collègues en 1998.
Analyse de variance et décryptage des mécanismes de l’exocytose. L’analyse des relations entre
l’amplitude moyenne des réponses postsynaptiques et la variance de leurs fluctuations en amplitude
permet de déterminer des valeurs approchées de n, p et q. Cette idée est ancienne (Katz et Miledi,
1972 ; Brown et coll, 1976 ; Simonneau et coll, 1980). Le problème est néanmoins ardu. Les
approches utilisées alors ont été abandonnées parce que leur validité est réduite au cas ou la
probabilité d’exocytose initiale est artificiellement très faible. Dans les années 1980, les biophysiciens
montrent qu’on peut déterminer le nombre des canaux ioniques activés et l’amplitude des courants
ioniques élémentaires à partir des fluctuations d’amplitude d’un courant ionique macroscopique sans
nécessairement avoir recours à de l’analyse de Fourier (Sigworth, 1980 ; Robinson et coll, 1981 ;
Traynelis et coll, 1993). Sigworth (1980) fait l’observation qu’en exprimant la variance d’un signal en
fonction de son amplitude moyenne, dans le cas où l’on a affaire à une distribution binomiale, la
relation Var = f(Imoyen) prend la forme d’une parabole simple dont la pente d’attaque est l’amplitude du
quantum q. L’apex correspond à p= 0,5. Elle recroise d’axe des x pour une valeur Imax= n.q.
Après l’époque héroïque de Katz, Quastel, Martin… et leurs collègues, à partir de 1970,
l’essentiel des analyses quantiques restaient plutôt descriptives. Avec les années 1990, l’imagerie
synaptique, la découverte des protéines d’exocytose, les données sur le cycle des vésicules et la
dynamique des pools vésiculaire relance l’intérêt d’une ‘fusion’ entre la vision quantique de la synapse
et la biologie cellulaire de la terminaison nerveuse. L’approche de Sigworth a été re-formalisée pour
l’analyse de la libération par Quastel (1997), Clements et Silver (2000), Scheuss et Neher (2001) qui
incorporent dans leur modèles d’autres sources de variabilité, d’autres formes d’expressions de la
variabilité des signaux. Le papier de Quastel est important car il réintroduit l’idée initiale de Brown et
coll (1976) que p est un terme composé : la
probabilité d’output (po, c. à d. ce qu’on entend
habituellement par probabilité de libération) ne peut s’exercer que sur des sites de fusion occupés par
une vésicule libérable. A chaque instant, les sites de libérations sont alimentés en vésicule avec une
probabilité pA.
A la suite des travaux de Quastel (1997) découlent des analyses du processus de libération
pendant l’expression de certaines formes de plasticité synaptique (Silver et coll, 1998; Reid et
Clements, 1999; Oleskevich et coll., 2000; Meyer et coll 2001; Scheuss et al., 2002). Nous avons
utilisé ces approches pour déterminer le rôle de protéines synaptiques dans la libération (Humeau et
coll, 2000, 2001a,b, article soumis). Nous résumons ci-dessous ce à quoi peuvent correspondre n, p
et q pour la biologie cellulaire (c. à d. trafic des vésicules, docking, priming ou fusion)
-n est le nombre des sites de fusion qui sont capables de ‘faire’ de l’exocytose. Le n
déterminé par analyse de variance est au plus égal au nombre des zones actives (au sens de
Couteaux et Pécot-Dechavassine, 1974), car certains sites de libération peuvent être silencieux
constitutivement. Si la modification d’une protéine induit un changement de n, cela indique que des
sites d’exocytose ont disparu (cas du remodelage morphologique) ou bien que certains d’entre eux ne
sont plus fonctionnels ou sont devenus silencieux. Par exemple, nous avons observé qu’après
l’application intraneuronale de PLD inactive, le nombre de sites de libération était réduit (Humeau et
al, 2001a, cf. la présentation de Nicolas Vitale). L’application intraneuronale de toxine létale de C.
sordellii qui glucosyle Rac produit le même effet ce qui suggère que Rac ‘contrôle’ le site de fusion
(Humeau et coll, 2000; Humeau et al, 2001b, et Humeau et coll, article soumis).
-po (probabilité ‘d’output’) renseigne sur le couplage entre l’augmentation cytosolique de Ca2+
et le déclenchement de l’exocytose. Par exemple, l’inactivation des canaux calcium ou la diminution
de l’entrée d’ions Ca2+ se traduit par une diminution de la probabilité de libération.
- pA (probabilité d’alimentation) renseigne sur la probabilité que le site d’exocytose soit occupé
par une vésicule libérable. Tout changement de pA indique soit une modification de l’efficacité du trafic
vésiculaire vers les sites de libération soit la perturbation du docking ou du priming. Par exemple, nous
avons observé que pA est fortement modifiée quand le rythme de stimulation est augmenté fortement,
c’est à dire quand la fréquence de stimulation est plus rapide que les mécanismes de ‘replenishment’
ou de ‘priming’ (Humeau et coll, article soumis).
-q. Comme biologistes cellulaires, vous entendez ‘q = contenu de la vésicule/granule’, comme
électrophysiologistes, nous entendons ‘q = amplitude de la réponse miniature’ puisque c’est ce signal
que nous détectons. Vousnous avezons tous raisons (sic). L’amplitude de la réponse miniature
dépend i) du signal émis (= nombre des molécules de transmetteur libéré lors de l’exocytose) et ii) du
nombre des récepteurs postsynaptiques qui font face au site d’exocytose et de leur probabilité
d’activation. Si un traitement spécifiquement présynaptique induit une modification de q, on peut en
déduire que soit le contenu de la vésicule a été modifié (action sur les transporteurs ? sur les vATPases ?) soit la quantité de transmetteur délivrée lors de la fusion a changé. Ce dernier point ouvre
des perspectives intéressantes dans le cadre de l’hypothèse du « Kiss an Run » et pour l’étude des
modifications du fonctionnement du pore de fusion. Par exemple, est-ce que q diminue si le rythme de
stimulation est plus rapide que la cinétique de remplissage en transmetteur de la vésicule ? Si la
dynamine contrôle l’expansion du pore de fusion dans les synapses, est-ce que q augmente lors
d’entrées répétées de Ca2+ comme cela a été montré pour les cellules chromaffines (Elhamdani et
coll, 2001)? Pourquoi l’action de la BoNT/A sur les synapses d’aplysie s’accompagne-elle d’une
diminution de la taille du quantum ? Ceci rappelle les observations antérieures de Kriebel et coll
(1976) et de Dunant et al., (1987). Est-ce que clivage de SNAP-25 altère le fonctionnement du pore
de fusion?
Un vieux proverbe Breton dit que chez les Poulain rien est simple. Notre problème
d’électrophysiologiste est que nous déterminons des index expérimentaux qui nous renseignent
indirectement sur des étapes de l’exocytose. Il existe de ce fait des cas limites pour l’interprétation des
changements de n, p, q. Parfois un changement de q ou de p peut se manifester sous l’apparence
d’un changement de n (vous avez bien lu !). Quand un site de fusion n’est couplé qu’à un seul canal
calcique, l’inactivation de ce canal unique fait tomber à 0 la probabilité de libération du site auquel est
couplé le canal (po locale→0). Le site apparaît donc éliminé fonctionnellement (= réduction de n). De
même, si des vésicules/granules se dockent mais ne peuvent plus fusionner ni se dédocker, le site est
occupé de façon permanente par une VS ‘non libérable’. La pA locale→0 et donne l’apparence que le
site de fusion est inactivé (diminution apparente de n). C’est peut être ainsi que l’on peut expliquer
comment le clivage de la VAMP par la TeNT ou la BoNT/B se traduit par une diminution apparente du
nombre n de site de libération plutôt que comme une diminution de la probabilité d’alimenter le site de
fusion avec des vésicule libérables (diminution de pA) (cf. nos observations non publiées : poster de
Yann Humeau à la réunion du Club Exocytose à Arcachon en 2001). Simple, non ?
NB Les fluctuations d’un signal (électrique) sont appelées un « bruit » d’où le titre de « synapses
bruyantes ».
Références
Boyd IA, Martin AR (1956). The end-plate potential in mammalian muscle. J Physiol 132:74-91.
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APPROCHE GÉNÉTIQUE ET MOLÉCULAIRE DE LA FUSION MEMBRANAIRE LORS DE
L'EXOCYTOSE RÉGULÉE CHEZ LA PARAMÉCIE
Marine Froissard, France Koll, Anne Marie Keller et Jean Cohen
Centre de Génétique Moléculaire, CNRS, 91198 Gif-sur-Yvette cedex, France.
La paramécie possède une voie de sécrétion régulée permettant la libération d'organelles de défense
appelés trichocystes. Les trichocystes mûrs sont ancrés en état de "pré-fusion" membranaire en des
sites prédéterminés de la membrane plasmique. Ces sites forment des microdomaines
reconnaissables
en
microscopie
électronique
sous
la
forme
de
rosettes
de
particules
intramembranaires visibles en cryodécapage et de matériel de connexion visible coupes minces [1].
Des mutants déficients dans la fusion membranaire associée à l'exocytose des trichocystes ont été
isolés. Ils définissent 15 groupes de complémentation. Cinq de ces gènes ont été clonés et
séquencés, ND2, ND6, ND7 [2], ND9 [3], et ND169. Les protéines déduites ne sont pas similaires aux
protéines connues actuellement pour être impliquées dans la fusion membranaire telles les SNAREs,
la synaptotagmine ou les petites protéines G. Cependant, elles portent des motifs conservés qui
donnent un fil conducteur pour déterminer leur fonction potentielle: motifs Armadillo (interaction
protéine-protéine) pour ND9, répétitions RCC1 (associées à une activité GEF) pour ND6, motifs à
ponts disulfures de type EGF et plexine (impliqués dans des interactions protéine-protéine et dans la
signalisation transmembranaire pour ND2, ND7, et ND169.
Les premiers résultats d'un projet génome de la paramécie [4; 5] ont permis le clonage et l'analyse
fonctionnelle du gène NSF, qui est apparu essentiel pour l'assemblage de la rosette de particules
intramembranaires, montrant ainsi que la machinerie ubiquitaire NSF/SNAP/SNARE est impliquée
dans l'exocytose des trichocystes de la paramécie [6].
Notre objectif est de comprendre comment le fonctionnement des nouvelles protéines de type Ndp
s'intègre dans la machinerie de fusion conservée dans l'évolution et de déterminer si les partenaires
découverts chez la paramécie ne pourraient pas être des représentants de nouvelles familles encore
inconnues et impliquées dans la fusion membranaire dans d'autres systèmes.
1. Vayssié, L., F. Skouri, L. Sperling.et J. Cohen, 2000. Molecular genetics of regulated secretion in Paramecium. Biochimie, 82,
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2. Skouri F. et J. Cohen, 1997. Genetic approach to regulated exocytosis using functional complementation in Paramecium :
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3. Froissard, M., A. M. Keller et J. Cohen, 2001. ND9P, a novel protein with Armadillo-like repeats involved in exocytosis:
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4. Dessen, P., M. Zagulski, R. Gromadka, H. Plattner, R. Kissmehl, E. Meyer, M. Bétermier, J.E. Schultz, J.U. Linder, R.E.
Pearlman, C. Kung, J. Forney, B.H. Satir, J.L. Van Houten, A.-M. Keller, M. Froissard, L. Sperling and J. Cohen. 2001
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6. Froissard, M., Kissmehl, R., Dedieu, J.-C., Gulik-Krzywicki, T., Plattner, H., & Cohen, J. 2002. NSF is required to organize
functional exocytotic microdomains in Paramecium. Genetics in press.
Organizing the axonal initial segment : dynamic targeting and clustering of the
sodium channel Nav1.2
Juan José Garrido-Jurado, Marie-Pierre Fache, Pierre Giraud, Fanny Fernandes, Anissa Moussif and
Bénédicte Dargent.
INSERM U464, Institut Jean Roche, Université de la Méditerranée, Faculté de Médecine SecteurNord, Boulevard P. Dramard, 13916 Marseille cedex 20, France
The axonal initial segment (AIS) plays a pivotal role in the physiology of the nerve cell. This subdomain of the neuron contains a high density of the voltage-gated sodium channel Nav1.2 (sodium
channel type II), allowing the generation of the action potentials, one of the basic signals in neuronal
communication. In addition, the AIS constitutes a diffusion barrier involved in the maintenance of the
asymmetrical organization of the plasma membrane. The molecular and cellular mechanisms
accounting for the compartmentalization of proteins at the AIS are unknown. To obtain a better
understanding of how hippocampal neurons selectively target proteins to the AIS, we assessed
whether any of the large cytoplasmic regions of neuronal sodium channel Nav1.2 contain sufficient
information for compartmentalization in the AIS. Our results show that addition of the cytoplasmic
region that links the domains II and III of Nav1.2 restricted the distribution of a dendritic-axonal reporter
protein to the AIS, when expressed by transfection in hippocampal neurons. The analysis of mutants
revealed that a novel targeting motif of 26 amino acids mediates chimera compartmentalization.
Noteworthy, the identified motif contains 3 acidic cluster motifs and it is highly conserved in Nav1.6,
the sodium channel nodal type. Consistently, CD4-Nav1.6 II-III chimera was found to be restricted at
AIS. In conclusion, our data demonstrate the existence of a specific determinant located within loop IIIII of Nav1.2 and Nav1.6 accounting for sodium channel targeting to AIS and potentially to the node of
Ranvier. They also open the possibility that a dynamic membrane traffic, including endocytotic
processes, is implicated in the complex localization of sodium channels at discrete sites of the
neuronal membrane.
Dynamic organization of neuronal sodium channels : analysis of the trafficking
of the beta 1 auxiliary subunit
Fanny Fernandes, Véronique Cornet, Juan José Garrido-Jurado, Marie-Pierre Fache and Bénédicte
Dargent.
INSERM U464, Institut Jean Roche, Université de la Méditerranée, Faculté de Médecine SecteurNord, Boulevard P. Dramard, 13916 Marseille cedex 20, France
Among the family of voltage-gated ion channels, the auxiliary beta 1-3 subunits of the neuronal
sodium channel, are unique because they are integral transmembrane proteins homologous to the
immunoglobulin-like cell adhesion molecules (CAMs). The observation that the beta 1 subunit interacts
with Neurofascin and NrCAM raised the possibility that auxiliary subunits could be involved in sodium
channel clustering at the axonal initial segment and Node of Ranvier.
To get new insights into the mechanisms accounting for sodium channel organization, we analyzed
the intracellular trafficking of the beta subunits. Upon transfection in COS-7 cells, HA-tagged beta 1
and myc-tagged beta 2 showed high expression levels at the cell surface. The application of an
immuno-endocytosis assay revealed that beta 1 was internalized and co-localized with EEA1, a
marker of early endosomes. In contrast, beta 2 impaired internalization. The ability of beta1 to be
recognized by components of an endocytotic pathway was also found in PC12 cells and in polarized
hippocampal neurons. Preliminary data suggest that internalized beta 1 follows a clathrin-independent
pathway in COS-7 cells. To examine the implication of either the C-terminal or the N-terminal domain
of beta 1, we constructed beta 1-beta 2 and beta 2-beta 1 chimeras. The results showed that each of
the constructed beta chimeras underwent endocytosis, when expressed in PC12 cells, in COS-7 cells
and in hippocampal neurons, similar to observations with beta 1. These results suggest that both
domains contain sufficient information for endocytosis, and are recognized by an unconventional
endocytotic pathway.
The novel property of the sodium channel beta1 subunit reported here could reflect a mechanism
involved in the regulation of the adhesion properties of beta 1 and, consequently, in the regulation of
interactions with Neurofascin and NrCAM. Such a mechanism could contribute to sodium channel
targeting and clustering at critical sites of the neuronal membrane.
Phocéine et striatine, une nouvelle plate-forme du trafic neuronal, réunissant
EPS15, NDPK et la dynamine
Gaillarda, S., Baillatb, G., Castetsa, F. and Monnerona, A.
(a INSERM U464, Faculté de Médecine Nord, Bd Pierre Dramard, 13916 Marseille cedex 20 ; b CNRS
UMR 6032, Faculté de Pharmacie, 27 Bd Jean Moulin, 13385 Marseille cedex 5)
La striatine, SG2NA et la zinédine, constituent une nouvelle famille de protéines
d'échafaudage impliquées dans la signalisation calcique qui officient dans les épines dendritiques des
neurones du système nerveux central des mammifères. Nous avons montré que la phocéine est le
partenaire avéré de ces trois protéines [1]. Excessivement bien conservée au cours de l'évolution, la
phocéine est une protéine ubiquitaire intracellulaire de 225 acides aminés, qui présente des
homologies partielles avec les sous-unités sigma des complexes adaptateurs de la clathrine. En
utilisant la phocéine comme appât dans le crible d'une banque d'ADNc de cerveau de rat par la
technique du double-hybride, deux nouveaux partenaires ont été identifiés : la nucléoside-diphosphate
kinase (NDPK) et EPS15 [2]. Ces interactions ont été validées biochimiquement par des expériences
d'immunoprécipitation et de co-purification. De plus, la NDPK et EPS15 ont été récemment identifiée
comme étant des partenaires fonctionnels de la dynamine [3, 4]. Nous avons montré 1) que la NDPK
interagit directement avec la dynamine-1 par l'intermédiaire de son domaine C-terminal riche en
proline; 2) que la phocéine recombinante s'associe avec la dynamine-1 native; 3) que la phocéine,
localisée dans le compartiment somato-dendritique des neurones adultes, est partiellement colocalisée avec la dynamine-1 dans les neurones d'hippocampe en culture [2]. Il semble donc que la
phocéine intervienne dans le trafic vésiculaire et plus précisément dans des complexes impliqués
dans la formation de vésicules.
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Endocytose indépendante de la clathrine du récepteur du glutamate mGluR5
Fourgeaud L. (1), Rossignol F. (1), Olivo-Marin J.C. (2) & Hemar A (1)
(1) PCS, UMR 5091, Université Bordeaux2 ; (2) URA CNRS 1947, Institut Pasteur Paris
Le trafic intracellulaire des récepteurs membranaires aux neurotransmetteurs (biosynthèse et
endocytose) détermine la localisation et le nombre de récepteurs présents à la surface des cellules,
constituant ainsi un mécanisme de modulation de l'activité neuronale.
Le glutamate libéré au niveau des synapses du système nerveux central active deux classes de
récepteurs : des récepteurs ionotropiques et des récepteurs métabotropiques (mGluRs). Les mGluRs
sont des récepteurs à sept domaines transmembranaires couplés aux protéines G hétérotrimériques
qui sont impliqués dans la modulation de la transmission synaptique glutamatergique notamment lors
des processus de plasticité synaptique.
Nous étudions l'endocytose des récepteurs mGluR5 étiquetés après transfection de cellules COS-7 ou
de neurones d'hippocampe de rat en culture. En incubant des cellules vivantes à 37°C avec des
anticorps anti-étiquette, nous avons montré la co-endocytose du complexe anticorps-récepteur. Par
l'utilisation d'un agoniste inverse spécifique de mGluR5 et d'un mutant de mGluR5 ayant perdu son
affinité pour le glutamate nous avons montré que l'endocytose de mGluR5a est constitutive.
L'utilisation de mutants dominant négatifs de la dynamine 1, 2 et de la protéine EPS15 permet de
montrer que mGluR5a est endocyté par une voie indépendante de la voie des puits recouverts de
clathrine aussi bien dans les cellules COS-7 que dans les neurones. De plus, le devenir intracellulaire
des récepteurs après leur internalisation a été analysé en réalisant des doubles marquages avec le
récepteur de la transferrine (marqueur de la voie de recyclage) ou la protéine Lamp1 (marqueur des
lysosomes). Après quantification de la colocalisation observée sur les images obtenues en
microscopie de fluorescence, il semble que le récepteur mGluR5 soit dégradé dans les cellules COS-7
et recyclé dans les neurones. Ceci laisse supposer le rôle de protéines spécifiquement neuronales sur
l'endocytose de mGluR5 ainsi qu'une influence de l'état d'activation des neurones sur le recyclage de
mGluR5.
Spectrométrie de masse et protéomique
Jean Pierre LE CAER,
Laboratoire de chimie des mécanismes réactionnels. Ecole Polytechnique Palaiseau
Joëlle VINH , Delphine PFLIEGER, Valérie LABAS, Jean ROSSIER
ESPCI CNRS UMR 7637
L’analyse protéomique a pu s’imposer au cours de ces cinq dernières années grâce aux
avancées majeures accomplies dans le décryptage des génomes, la popularisation des gels
d’électrophorèse bidimensionnelle (2D), et l’arrivée de spectromètres de masse performants.
Grâce à la commercialisation de supports d’isofocalisation reproductibles, l’électrophorèse 2D
est sortie des quelques laboratoires très spécialisés pour devenir une technique de semi routine
utilisée dans de nombreuses unités de recherche. Parallèlement, sont apparus sur le marché des
spectromètres de masse de plus en plus sensibles et résolutifs, et qui sont implantés désormais dans
des laboratoires de biochimie. Le couplage de l’électrophorèse 2D avec la spectrométrie de masse a
finalement pris son essor avec le développement de la bioinformatique et l’apparition de logiciels
permettant l’identification des protéines dans les banques de séquences génomiques à partir de
données de spectrométrie de masse.
Si ces avancées technologiques permettent de répondre à de nombreuses questions biologiques,
les limites analytiques du couplage des gels 2D avec la spectrométrie de masse ne doivent pas être
sous estimées. Dans cet exposé, nous présenterons les stratégies disponibles pour caractériser les
protéines dans le cadre d’analyses protéomiques et nous décrirons les techniques alternatives
utilisées actuellement pour caractériser des mélanges complexes de protéines par couplage de la
chromatographie liquide haute performance avec la spectrométrie de masse tandem.
TI-VAMP mediates the recycling of L1-CAM in neurons
Philipp Alberts a), Anna Hinners b), Aude Muzerelle c), Sonja Martinez-Arca a), Sharon Tooze b),
Daniel Louvard d), Fritz G Rathjen e), Patricia Gaspar c), and Thierry Galli a)
a) INSERM U536, Paris, France, b) ICRF, London, UK, c) INSERM U106, Paris, France d) CNRS
UMR144, Paris, France, e) MDC, Berlin, Germany
Tetanus neurotoxin Insensitive-Vesicle Associated Membrane Protein (TI-VAMP) is a recently
identified vesicular SNARE that we showed to be involved in neurite outgrowth. We present here
evidence that L1-CAM, a cell-adhesion molecule involved in neurite outgrowth, is a cargo protein of
the TI-VAMP-dependent membrane trafficking pathway in neuronal cells. TI-VAMP and L1-CAM are
coexpressed in growing axons in E15 and E19 rat brain. Subcellular fractionation of PC12 cells and rat
brain shows that a vesicular pool of L1 cofractionates with TI-VAMP-positive membranes.
Immunofluorescence analysis of neurons in primary culture reveals colocalization of TI-VAMP and L1CAM. Furthermore, Fabs directed against L1-CAM are internalised in the TI-VAMP positive
compartment in neurons and PC12 cells. These results suggest that TI-VAMP mediates an important
membrane fusion step in the recycling of L1-CAM.
Le domaine de liaison de la calmoduline et des phospholipides sur la VAMP2
régule l’exocytose calcium-dépendante
Stephanie Quetglas1, Cecile Iborra1, Nobuyuki Sasakawa2, Luc De Haro1, Konosuke Kumakura2,
Kazuki Sato3, Christian Leveque1,4 and Michael Seagar1*
1
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Unité 464, Université de la Méditerranée,
Institut Jean-Roche, Faculté de Médecine Secteur Nord, Bd. Pierre Dramard, 13916 Marseille Cedex
20, France;
2
Laboratory of Neurochemistry and Neuropharmacology, Life Science Institute, Sophia University,
Chiyoda-ku, Tokyo 102-8554, Japan;
3
Mitsubishi Kagaku Institute of Life Sciences, Machida, Tokyo 194-8511, Japan;
4
Unité de Méthodologie d’étude des Interactions Moléculaires, Institut Jean-Roche, Faculté de
Médecine Secteur Nord, Bd. Pierre Dramard, 13916 Marseille Cedex 20, France.
La formation du complexe SNARE (VAMP2, syntaxine1 et SNAP25) joue un rôle essentiel dans la
libération calcium-dépendante des neurotransmetteurs. Afin de déterminer la façon dont le calcium
peut réguler ce phénomène, nous avons étudié les interactions entre la calmoduline, senseur
ubiquitaire de calcium, et les protéines SNAREs. Nous avons montré que la calmoduline lie de façon
calcium-dépendante le domaine C-terminal de la VAMP2 (VAMP77-90). VAMP77-90 se situe entre le
domaine de formation du complexe SNARE et le segment transmembranaire de la VAMP2. Nous
avons également montré que les phospholipides acides lient ce même domaine, de façon calciumindépendante et que ces deux types d’interactions (VAMP/calmoduline et VAMP/phospholipides) sont
mutuellement exclusives. Nous avons ensuite identifié par résonance plasmonique de surface les
résidus de VAMP77-90 impliqués dans ces interactions. La microinjection du peptide VAMP77-90
sauvage, mais pas celle des peptides mutés, inhibe la libération de catécholamines à partir de cellules
chromaffines. Dans des cellules PC12 perméabilisées et traitées avec la toxine tétanique, la
transfection d’une VAMP résistante à la toxine tétanique restaure la libération calcium-dépendante
d’hormone de croissance humaine. Par contre, si la VAMP résistante à la toxine porte en plus les
mutations dans le site de liaison de la calmoduline, le sauvetage de la libération est aboli. Le domaine
de liaison de la calmoduline et des phospholipides sur la VAMP2 est donc nécessaire à l’exocytose
calcium-dépendante, probablement en régulant l’assemblage du complexe SNARE.
Ent3p, a yeast epsin-like protein required for vacuolar protein sorting, binds
PI(3,5)P2
Sylvie Friant, Eve-Isabelle Pécheur, Yaya Lefkir and François Letourneur
IBCP, UMR5086 CNRS, Lyon, France
The vacuole, like the mammalian lysosome, is the primary site of hydrolase-mediated turnover of
macromolecules in yeast. Many newly synthesized vacuolar proteins require transport from the Golgi
to the vacuole via the vacuolar protein sorting (vps) pathway. In yeast, there are two different sorting
routes, one that is used by the carboxypeptidase Y and requires clathrin (the CPY pathway) and the
other one that is used by the alkaline phosphatase and depends on the AP-3 adaptor complex (the
ALP pathway).
A genetic screen used for isolation of new vacuolar protein sorting (vps) mutants resulted in isolation
of the ent3-1 temperature-sensitive (ts) mutant. The Ent3p protein is a yeast homolog of the
mammalian epsin, a protein required for endocytosis. Ent3p contains an N-terminal ENTH (epsin Nterminal homology) domain. The rat epsin ENTH domain was shown to bind phosphatidylinositol-4,5bisphosphate [PI(4,5)P2] in vitro and this binding is required for endocytosis in vivo. The ent3-1 mutant
shows defect neither in endocytosis nor in secretion of soluble proteins, whereas both CPY and ALP
vacuolar hydrolases are mislocalized at 37°C, the restrictive temperature. Ent3p contains a putative
clathrin binding site at its C-terminus, and we show co-immunoprecipitation between Ent3p and
clathrin. The ent3-1-ts mutant has a defect in actin cytoskeleton organization at 37°C. All these results
show that Ent3p is required for vacuolar sorting and could recruit different effectors required for the
yeast vps pathway.
We show that Ent3p ENTH domain is required for growth and proper localization of CPY and ALP
hydrolases, suggesting that this putative lipid binding domain has a crucial role for membrane
trafficking. In a lipid dot-blot assay, a fusion GST-Ent3 protein binds specifically PI(3,5)P2 and does
not bind PI(4,5)P2. PI(3,5)P2 is enriched in late endosomal/prevacuolar structures. To date, Ent3p is
the first protein described with such a lipid specificity.
By structural modelling based upon X-ray data of rat epsin ENTH domain, four potential lipid binding
sites were identified in Ent3p ENTH domain. The potential conformational rearrangements of Ent3p in
the presence of phosphoinositides are currently under investigation, through NMR and infrared
spectroscopy.
Taken together, these results suggest that Ent3p is required for transport of proteins between the TGN
and the vacuole, and combination of structural and functional data on Ent3p may shed light on the role
of PI(3,5)P2 in protein trafficking.
Adsorption membranaire et endocytose de nanoparticules magnétiques
Claire Wilhelm
LMDH case 86 tour22, UPMC, placeJussieu, 75252 Paris 05
Des nanoparticules (diamètre 8nm) magnétiques anioniques présentent une forte affinité (de nature
électrostatique) pour la membrane plasmique des cellules eucaryotes et sont internalisées de manière
très efficace en suivant la voie d’endocytose. Nous avons quantifié, par deux méthodes
complémentaires (magnétophorèse et résonance ferromagnétique), la charge en nanoparticules pour
deux lignées cellulaires différentes (macrophages de souris et cellules HeLa) et développé un modèle
traduisant la cinétique de fixation des particules sur la membrane plasmique et l’endocytose qui
s’ensuit. Si les paramètres décrivant le mécanisme d’adsorption des nanoparticules sur la membrane
plasmique (taux d’adsorption et de désorption, densité de sites accessibles aux nanoparticules) sont
identiques pour les macrophages et les cellules HeLa, en revanche, la capacité d’internalisation des
macrophages est 10 fois plus grande que celle des cellules HeLa, traduisant ainsi la spécificité
cellulaire. Enfin, les endosomes magnétiques ainsi obtenus peuvent être utilisés comme sondes
micrométriques non invasives de la viscoélasticité intracellulaire, reflétant directement l’organisation
locale du cytosquelette.
Transport des IgA par le récepteur de la transferrine
Renato Monteiro
INSERM E0225, Paris
Nous avons récemment caractérisé un nouveau récepteur Fc pour les IgA1 humaines. Ce récepteur a
été identifié comme étant le récepteur à la transferrine (RTf) de type 1 (Moura et al J Exp Med 2001).
Il lie les IgA1 polymériques plus que les IgA1 monomériques mais il ne lie pas les IgA2. La fonction de
l'interaction des IgA1 avec le RTf reste inconnue. Cependant, étant donné que le RTf est exprimé par
les cellules épithéliales, nous proposons que le RTf puisse effectuer le transport apical/basal des
IgA1. Ce transport pourrait effectuer en coopération avec d'autres récepteurs comme le récepteur des
Ig polymériques.
Enhancement of C2C12 myoblast/osteoblast transdifferentiation by epigenetic
inhibition of BMP2 endocytosis
Cyril Rauch (UMR 168, I. Curie, Paris)
We investigated the modulation of critical transcriptional steps of C2C12 myoblast/osteoblast
transdifferentiation triggered by the BMP2 signaling protein, in response to epigenetic inhibition of the
endocytotic internalization of exogenous BMP2. BMP2 endocytosis was inhibited chemically with
PEG-Chol and cyclodextrin, and mechanically by mild hypotonic treatment. BMP2-dependent nuclear
translocation of the Smad1 transcription factor was ten times faster if BMP2 endocytosis was inhibited.
The JunB expressions depending of Smad1 nuclear translocation, was increased by a factor of 3 to 4.
JunB-dependent levels of Myogenin repression, one of the critical markers of terminal myoblastic
differentiation, was amplified by a factor of 3. Smad1-dependent levels of alkaline phosphatase
expression, one of the C2C12 osteoblast differentiation markers, were 3.5 to 5 times higher. The same
behaviour was observed for osteopontin, the other C2C12 osteoblast differentiation marker. These
results suggest that the cell genome could "sense" tissue mechanical deformations by mechanical
inhibition of signalling protein endocytosis, thereby translating mechanical strains into transcription
events involved into cell differentiation.
Rôle de la Répartition Lipidique dans le Transport Intracellulaire : Exemple de
la Toxine de Shiga
Thomas Falguières et Ludger Johannes
Laboratoire « Trafic et Signalisation », UMR144 Institut Curie/CNRS, Paris, France
La toxine de Shiga lie son récepteur, le glycosphingolipide globotriaosylcéramide (Gb3), via sa sousunité B (STxB). Dans les cellules HeLa, STxB est transportée via la voie rétrograde de la membrane
plasmique au réticulum endoplasmique, via les endosomes précoces et l’appareil de Golgi. Nous
décrivons ici que, dans les cellules dérivées de monocytes humains (macrophages et cellules
dendritiques), STxB est internalisée via son récepteur mais elle n’est pas transportée par la voie
rétrograde. Cette différence de transport a été corrélée avec le fait que la sous-unité B est associée à
des membranes résistantes aux détergents (ou DRMs pour Detergent Resistant Membranes) dans les
cellules HeLa mais pas dans les cellules dérivées de monocytes. Cela suggère que le ciblage vers la
voie de transport rétrograde nécessite l’association, via son récepteur Gb3, à des domaines
spécialisés des membranes biologiques. En accord avec cette hypothèse, nous avons trouvé que,
dans les cellules HeLa, STxB résiste à l’extraction en Triton X-100 jusqu’à son arrivée dans les
compartiments cibles de la voie rétrograde. De plus, la déstabilisation des membranes résistantes au
Triton X-100 par déplétion de cholestérol inhibe potentiellement et de manière réversible le transport
rétrograde dans les cellules HeLa alors que le recyclage de la transferrine n’est pas affecté. Nos
résultats prouvent donc pour la première fois un rôle de l’asymétrie lipidique latérale des membranes
dans les phénomènes de tri à l’interface entre les endosomes précoces et le réseau trans-golgien.
Grâce à des méthodes biochimiques et biophysiques, nous étudions actuellement la distribution
intracellulaire et la dynamique des espèces moléculaires de Gb3.