Dynamique d`assemblage des protéines de réserve et du

Transcription

THESE
Présentée pour l’obtention du titre de
DOCTEUR DU CENTRE INTERNATIONAL D’ETUDES SUPÉRIEURES EN SCIENCES
AGRONOMIQUES DE MONTPELLIER
Discipline : Biochimie, Chimie et Technologie des Aliments
École Doctorale : Sciences des Procédés - Sciences des Aliments
Dynamique d’assemblage des protéines de réserve et
du remplissage du grain de blé dur
par
Mariana SIMÕES LARRAZ FERREIRA
Soutenue publiquement le 17 mai 2011 devant le jury composé de :
M. Jean Claude Davidian
M. Thierry Aussenac
M. Christophe Bailly
M. Philippe Grieu
M. Michel Rossignol
M. Paulo J. A. Sobral
Mme Marie-Hélène Morel
M. Yves Popineau
Professeur, SupAgro, Montpellier
Professeur, IPLB, Beauvais
Professeur, UPMC, Paris
Professeur, INP/ENSAT, Toulouse
Directeur de Recherche, INRA, Montpellier
Professeur, FZEA-USP, Brésil
Directeur de Recherche, INRA, Montpellier
Directeur de Recherche, INRA, Nantes
Président
Rapporteur
Rapporteur
Examinateur
Examinateur
Membre Invité
Directrice de thèse
Co-directeur de thèse
Remerciements
Tout d’abord je tiens à remercier la direction de l’UMR « Ingénierie des Agro-polymères et
des Technologies Emergentes» pour m’avoir accueillie lors de mon stage de fin d’études en
octobre 2006 et ensuite lors de ma thèse. Je tiens particulièrement à remercier Stéphane
Guilbert, mais également Xavier Rouau et Hugo De Vries pour l’appui et la confiance qu’ils
m’ont accordé tout au long de ce travail de thèse.
En qualité de directeurs de cette thèse, je remercie vivement Marie-Hélène Morel, qui fut
l’encadrante principale de ce travail, pour son engagement hors pair, pour avoir su me former
progressivement sur le plan expérimental et scientifique, ainsi que pour ses nombreux
commentaires toujours très pertinents. Je remercie également Yves Popineau, par son intérêt
constant dans mon travail, et qui, malgré l’éloignement géographique, a su me donner une
source supplémentaire de motivation pendant la rédaction de cette thèse.
J’adresse mes plus sincères remerciements à Marie-Françoise Samson, qui a quotidiennement
participé à l’encadrement de cette thèse. Je la remercie pour sa disponibilité, sa rigueur et sa
précieuse contribution à la réalisation de ce travail. Je souhaite exprimer toute ma
reconnaissance à Cécile Mangavel, pour son encadrement lors de mon séjour à Nantes ainsi que
qui a participé de façon active au suivi de mon travail de thèse réalisé à Nantes et qui a su me
guider toujours de façon claire et précise.
Je suis très sensible à l’honneur que m’ont fait Christophe Bailly et Thierry Aussenac de juger
ce travail, ainsi que Philippe Grieu, Michel Rossignol et Paulo Sobral pour leur examen critique
de ce travail. Je remercie également M. Jean-Claude Davidian d’avoir accepté de présider ce jury
de thèse ainsi que pour ses commentaires avisés lors de réunions, qu’il trouve ici mes
remerciements les plus sincères.
J’exprime également mes sincères remerciements à Pierre Martre et Christine Girousse de
l’INRA de Clermont-Ferrand, qui ont suivi le déroulement de mon travail de thèse, pour leur
disponibilité, leur précieuse collaboration, ainsi que pour l’intérêt qu’ils ont témoigné à l’égard
de ce travail.
Je remercie l’équipe de la plate-forme BIBS de l’INRA de Nantes, et tout particulièrement
Hélène Rogniaux et David Ropartz pour l’investissement dans mon travail et les bons conseils
pour maitriser le MALDI-TOF. Je souhaite exprimer toute ma reconnaissance à Stéphanie
Penninck pour sa disponibilité, sa gentillesse et sa précieuse contribution lors de la rédaction de
cette thèse.
Remerciements
Mes remerciements s’adressent d’autre part à tous ceux qui ont contribué activement au bon
déroulement de ce travail. Pour son aide technique, plus qu’essentielle, qui m’a permis de
recueillir beaucoup des données mais aussi pour m’avoir fait part de son (immense) savoir-faire,
je remercie vivement Joëlle Bonicel. Pour leur investissement important et très sérieux dans mes
analyses microscopiques et en spectrométrie de masse, je tiens à remercier Axelle Bouder et
Gilbert Deshayes de l’INRA de Nantes. Je remercie également toutes les personnes ayant
participé à la mise en place des dispositifs expérimentaux en chambre de culture et au champ, et
plus particulièrement Pierre Roumet de l‘INRA, UMR DIAPC, Montpellier. Je remercie également
Morgane Ardisson et Sylvain Santoni pour m’avoir accueillie périodiquement dans son
laboratoire (UMR DIAPC, INRA, Montpellier) et m’avoir fait partager les compétences
scientifiques de son équipe. Je n’oublie pas ma stagiaire ‘en or’ et amie Natalia Rosa pour son
travail minutieux dans le cadre de cette thèse.
A ceux qui ont contribué en amont de ce travail, Mariza de Melo, Paulo Sobral et Claire
Bourlieu, je leur exprime ma profonde reconnaissance pour m’avoir initiée et motivée à
poursuivre dans le domaine de la recherche. Je tiens à remercier également Emanuelle Gastaldi,
Valérie Guillard, Hélène Angellier, Carole Guillaume et Bernard Cuq qui m’ont confié des
activités d’enseignements et m’ont permis de passer de l’autre coté des salles de cours.
Je tiens à remercier tous les membres de l’UMR IATE pour leur contribution, les conseils
scientifiques et les échanges culturels, c’était un grand plaisir d’être parmi vous, je garderai sans
doute un très bon souvenir. Je remercie tout particulièrement Cécile Barron, Valérie Micard,
Valérie Lullien et Joël Abecassis pour les discussions qui m’ont permis d’avancer dans mes
recherches, ainsi qu’à ceux qui ont fait des innombrables démarches administratives une très
simple formalité : Christophe, Anne-Marie, Carole, Laurence et Dominique.
Un grand merci également aux docteurs du labo qui sont passés par là : Miguel, Sana, Youna,
Mane, Gisela, Fred Auger, Magali ; aux futurs docteurs : Fred Baudouin, Privat, Moustafa,
Mathilde, Emna, Sandra, Adeline et Marine, ainsi que les nombreux stagiaires brésiliens pour la
bonne ambiance et les rires partagés.
Je voudrais remercier spécialement pour leur soutien, leur gentillesse et les très bons
moments passés ensemble, mes très chères amies : Maud, Milena, Natalia et Gabi. En effet, plus
que merci à Gabi pour son soutien moral que j’espère réciproque à l’aube de nos soutenances et
pour son aide au combien précieuse à l’égard de mon travail.
Remerciements
Un grand merci à tous mes amis franco-français et franco-brésiliens qui ont fait de ces
dernières années des moments inoubliables : Gisa, Fernando, Marie-Laure, Marcelo, Alessandra,
Manoel, Bruna, Gabriel et João Gabriel, Flávia, Guilherme, Renata, Pedro, Michel, la famille
Suchet et ma petite famille nantaise : Francesca, Barbara, Iole, Giulia et à tous ceux qui ont fait
également de mon court séjour à Nantes un moment chaleureux et moins pluvieux !
A tous mes amis, je ne peux que leur faire part de ma profonde amitié…
Une dédicace spéciale à celui qui m’a guidé depuis le tout début de ce travail : mon très cher
Pedro merci de ta gentillesse, ta sagesse, ton enthousiasme sans faute, ta joie de vivre, tu es
formidable et je te remercie de tout mon cœur pour ton soutien.
Et enfin à ceux qui m’ont énormément motivée et ont contribué au bon déroulement de ce
travail même à 9000 km de distance : ma famille et ma (future) belle famille…
Ao meu nerd’s pai Homero, minha adorável mãe Cleuza, meus queridos irmãos Rodrigo e
Eduardo, assim que minhas queridas cunhadas Cris e Carla, aos meus pequeninos (que
saudade !) Eloá, Caio e Marcelinha, não poderia deixar de agradecer e citar estes que são como
se fossem meus pais e minhas irmãs Alzira, Aristides,Tia Bina, Cassi, Kele e Karina e também
Solange e Reinaldo.
Très honnêtement c’était une belle aventure, aussi bien sur le plan humain
que sur le plan professionnel et si c’était à refaire (je crois) je le ferai à nouveau !
Je dedie ce travail …
à mes parents
Sommaire
Sommaire
Sommaire
Liste des abréviations ........................................................................................................... vi
Liste des tableaux ................................................................................................................ vii
Liste des figures ...................................................................................................................viii
Introduction .......................................................................................................................... 3
Chapitre I- Synthèse bibliographique .................................................................................. 9
1. Le grain de blé ...................................................................................................................... 9
1.1. Généralités ....................................................................................................................... 9
1.2. Morphologie et histologie .............................................................................................. 10
1.3. Les principaux constituants ............................................................................................ 13
1.4. Phases clés du développement du grain : la phase d’accumulation de l'eau et de la
matière sèche, le palier hydrique, la dessiccation.................................................................... 14
2. L’amidon ............................................................................................................................ 21
3. Les protéines de réserve du grain de blé ........................................................................... 22
3.1. Classification des protéines du grain de blé................................................................... 22
3.1.1. La gliadine ................................................................................................................... 24
3.1.2. La gluténine ................................................................................................................ 25
3.2. Protéines et qualité technologique du blé dur .............................................................. 26
3.3. Séquences et caractéristiques structurales des prolamines.......................................... 28
3.3.1. Structures primaires et secondaires........................................................................... 28
3.3.2. Modalités d’appariement des sous-unités gluténine................................................. 32
3.3.3. Modèle structural global des polymères de gluténines ............................................. 33
3.4. Dynamique d’assemblage des protéines de réserve ..................................................... 34
3.4.1. Biosynthèse, routage et formation de corpuscules protéiques ................................. 34
3.4.2. Accumulation des protéines de réserve au cours de la croissance du grain ............. 39
3.4.3. Formation des polymères de gluténines .................................................................... 40
3.4.3.1. Évolution de la distribution en taille des gluténines .............................................. 40
3.4.3.2. Évolution de l’état d’oxydoréduction des gluténines ............................................. 42
3.4.3.3. Mécanisme de formation des polymères de gluténines ........................................ 44
4. Effets agro-climatiques : azote, stress hydrique, températures élevées sur les protéines
de réserve du grain de blé ........................................................................................................ 45
Chapitre IIEffet de températures élevées pendant le remplissage du grain de blé dur sur
la dynamique de synthèse et d'aggrégation des protéines de réserve................................... 51
Physicochemical control of durum wheat grain filling and glutenin polymers assembly under
different temperature regimes ............................................................................................ 52
1. Introduction ....................................................................................................................... 53
2. Materials and methods ...................................................................................................... 55
2.1. Plant material and growth conditions............................................................................ 55
i
Sommaire
2.2. Determination of grain dry mass, water content, total protein concentration and
percentage of vitreous grains.................................................................................................... 56
2.3. Grain sample preparation for biochemical analyses ...................................................... 56
2.4. Determination of grain protein composition and size distribution................................ 56
2.5. Determination of protein thiol content.......................................................................... 58
2.6. Determination of total glutathione and protein-bound glutathione contents .............. 58
2.7. Confocal laser scanning microscope observation of protein bodies.............................. 59
2.8. Statistics and data analyses ............................................................................................ 59
3. Results ................................................................................................................................ 60
3.1. Dynamics of grain dry mass and water........................................................................... 60
3.2. Dynamics of protein accumulation during grain development and final grain protein
composition ............................................................................................................................... 63
3.3. Dynamics of glutenin polymer assembly during grain development ............................. 66
3.4. Relationship between glutenin polymer assembly and changes in thiol redox status
during grain development ......................................................................................................... 68
3.5. Evolution of protein bodies during grain development ................................................. 70
4. Discussion ........................................................................................................................... 71
4.1. Effect of temperature regimes on grain dry mass accumulation ................................... 72
4.2. Control of grain-filling duration – Control of grain-filling stop....................................... 73
4.3. Effect of temperature regimes on glutenin polymer assembly ..................................... 74
4.4. Control of grain dehydration in relation to endosperm texture .................................... 77
5. Acknowledgements ............................................................................................................ 79
6. Supplementary data ........................................................................................................... 79
Chapitre IIIEvolution de l’état redox du grain au cours de sa croissance ......................... 83
Relationship between endosperm cell redox homeostasis and the glutenin polymerization in
developing durum wheat ..................................................................................................... 84
1. Introduction ........................................................................................................................ 84
2. Materials and methods ...................................................................................................... 86
2.1. Chemicals ........................................................................................................................ 86
2.2. Field growth experiments ............................................................................................... 86
2.3. Preparation of wheat fractions....................................................................................... 87
2.4. Water content and dry mass .......................................................................................... 87
2.5. Vitreousness determination ........................................................................................... 87
2.6. Determination of grain protein composition by Size Exclusion-High Performance Liquid
Chromatography (SE-HPLC) ....................................................................................................... 88
2.7. Determination of protein thiol, reduced and oxidized glutathione and protein-bound
glutathione contents ................................................................................................................. 88
2.8. Analysis of Ascorbate pools ............................................................................................ 90
2.9. Enzyme extraction and assays ........................................................................................ 90
2.10.
Malondialdehyde content measurements.................................................................. 91
ii
Sommaire
2.11.
Statistics and data analyses ........................................................................................ 92
3. Results ................................................................................................................................ 92
3.1. Grain filling: evolution of water, dry mass and protein content ................................... 92
3.2. Grain protein composition and pattern of deposition................................................... 94
3.3. Grain protein redox status ............................................................................................. 96
3.4. Evolution of Glutathione pool ........................................................................................ 97
3.5. Evolution of Ascorbate pool ......................................................................................... 100
3.6. Lipid peroxidation ........................................................................................................ 100
3.7. Activities of antioxidant enzymes ................................................................................ 101
4. Discussion......................................................................................................................... 103
Chapitre IVDynamique d’assemblage des polymères de gluténines au cours du
développement de grains de blé dur .................................................................................. 113
Étude préliminaire : choix méthodologique pour l’extraction des protéines des grains de blé
dur en cours de développement ........................................................................................ 114
1. Extraction des fractions protéiques solubles et insolubles dans le SDS à 1% (p/v) ........ 115
1.1. Méthodes ..................................................................................................................... 116
1.1.1. Extraction .................................................................................................................. 116
1.1.2. Analyse SE-HPLC ....................................................................................................... 116
2. Résultats........................................................................................................................... 118
3. Conclusions ...................................................................................................................... 124
Chapitre IV. A) How are gluten polymers assembled during grain filling in durum wheat? .. 125
1. Introduction ..................................................................................................................... 126
2. Materials and methods .................................................................................................... 127
2.1. Wheat samples ............................................................................................................. 127
2.2. Determination of thiol groups ..................................................................................... 128
2.3. Fluorescent thiol groups labelling and protein sequential extraction ......................... 128
2.4. Analysis of the protein fractions .................................................................................. 129
2.5. Cysteine content determination by SE-HPLC and Fluorescent detection.................... 130
3. Results and discussion ..................................................................................................... 131
3.1. Changes in protein content of the different extracts .................................................. 131
3.2. SE-HPLC analysis ........................................................................................................... 133
3.3. SDS-PAGE analysis ........................................................................................................ 138
3.4. Changes in SH numbers carried by the different species fractionated by SE-HPLC from
proteins sequentially extracted from developing grains of durum wheat............................. 144
Chapitre IV. B) Identification des résidus cystéine réduits dans les gluténines polymériques de
grains de blé dur en développement .................................................................................. 151
1. Introduction ..................................................................................................................... 151
2. Stratégie générale ............................................................................................................ 153
2.1. Méthodologie retenue pour l’étude ............................................................................ 154
2.2. Matériel végétal utilisé................................................................................................. 156
iii
Sommaire
2.3. Protocole d’alkylation des thiols protéiques et extraction de protéines ..................... 156
2.3.1. Alkylation des groupements thiols ........................................................................... 156
2.3.2. Extraction séquentielle de protéines ........................................................................ 157
2.3.3. Extraction totale des protéines ................................................................................. 158
2.4. SE-HPLC ......................................................................................................................... 158
2.5. SDS- PAGE ..................................................................................................................... 159
2.5.1. Coloration des gels .................................................................................................... 159
2.5.2. Acquisition d’images ................................................................................................. 159
2.6. Préparation des échantillons pour l’analyse MS .......................................................... 160
2.6.1. Digestion trypsique ................................................................................................... 160
2.7. Analyse MALDI-TOF ...................................................................................................... 161
2.7.1. Calibration du spectromètre de masse MALDI-TOF ................................................. 161
2.7.2. Dépôt de l’échantillon ............................................................................................... 162
2.7.3. Analyse MALDI-TOF/TOF ........................................................................................... 163
2.8. Recherche en banque de données ............................................................................... 163
2.8.1. Cartographie peptidique ........................................................................................... 163
2.8.2. Sequence Editor - Biotools ........................................................................................ 164
2.8.3. Séquençage « de novo » ........................................................................................... 164
3. Résultats ........................................................................................................................... 165
3.1. Recherche de sous-unités de gluténines dans la banque de données Uniprot ........... 165
3.2. Analyse de sous-unités de gluténines par SDS-PAGE ................................................... 168
3.3. Efficacité des réactifs alkylants ..................................................................................... 174
3.4. Analyse des protéines par MALDI-TOF/TOF ................................................................. 178
3.4.1. Identification des SG-FPM ......................................................................................... 179
3.4.1.1. Les « SG-FPM 1 » ................................................................................................... 182
3.4.1.2. Les « SG-FPM 2 » ................................................................................................... 183
3.4.1.3. Les « SG-FPM 3 » ................................................................................................... 184
3.4.1.4. Les « SG-FPM 4 » ................................................................................................... 184
3.4.2. Analyse des oligomères de gluténines de masses moléculaires apparentes 200, 110
et 85 kDa .................................................................................................................................. 188
4. Discussion ......................................................................................................................... 194
5. Conclusion ........................................................................................................................ 197
Chapitre VSynthèse et conclusions sur les principaux résultats ................................... 201
1. Contexte et rappel des objectifs ...................................................................................... 201
2. Les principaux résultats obtenus ...................................................................................... 201
2.1. Dynamique de remplissage du grain ............................................................................ 202
2.2. Dynamique d’assemblage des polymères de gluténines ............................................. 209
2.3. Elaboration de la qualité technologique du grain ........................................................ 212
3. Perspectives...................................................................................................................... 216
iv
Sommaire
Annexe 1. Complément Méthodologique .............................................................................. 243
Annexe 2. Alignement des séquences en acides aminés des SG-HPM de type y................... 253
Annexe 3. Exemple d’une recherche sur Mascot. .................................................................. 254
Annexe 4. Exemple de résultat Biotools et de la recherche sur Mascot (Analyse MS/MS). .. 255
Annexe 5. Spectre de la bande SG-FPM 1 (extrait Tris-HCl, conditions non-réductrices)...... 256
Annexe 6. Spectre de la bande SG-FPM 2 (extrait Tris-HCl, conditions non-réductrices)...... 257
Annexe 7. Spectre de la bande Mr 110 kDa (extrait SDS-soluble, conditions réductrices).... 259
Travaux relatifs à cette étude ............................................................................................ 260
v
Liste des abréviations
Liste des abréviations
°CJAF
°Cd
aa
AP
ADN
ARNm
ASC
APX
BiP
BSA
CAT
CP
DAA
DHA
DM
FM
GR
GSH
GSSG
GWC
HMW-GS
HT
JAF
LMW-GS
LRW
LT
MALDI-TOF
mBBr
MDA
MS
N
PB
PCD
PSH
PSSG
RE
RP-HPLC
SDS-PAGE
SE-HPLC
SG-FPM
SG-HPM
SOD
Degrés-jours après floraison
Thermal time after anthesis
Acide aminé
Anti-protéase
Acide désoxyribonucléique
Acide ribonucléique messager
Ascorbate
Ascorbate Peroxidase
Binding Protein
Bovine Serum Albumin
Catalase
Corpuscule protéique
Day after anthesis
Dehydroascorbate
Dry mass
Fresh mass
Glutathione Reductase
Glutathion réduit/ reduced glutathione
Glutathion oxydé/ oxidized glutathione
Grain Water Concentration
High Molecular Weight Glutenin Subunit
High temperature
Jour après floraison
Low Molecular Weight Glutenin Subunit
London Resin White
Low temperature
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization- Time of Flight
Monobromobimane
Malondialdehyde
Mass Spectrometry
Nitrogen
Protein body
Programmed cell death
Protein thiol content
Protein-bound glutathione
Réticulum Endoplasmique (Endoplasmic Reticulum)
Reversed Phase-High Performance Liquid Chromatography
Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis
Size Exclusion-High Performance Liquid Chromatography
Sous Unités de Gluténines de Faible Poids Moléculaire
Sous Unités de Gluténines de Haut Poids Moléculaire
Superoxide Dismutase
vi
Liste des tableaux
Liste des tableaux
Table II-1. Grain dry mass, maximum water content, total nitrogen, protein concentration and
percentage of vitreous grains at physiological maturity for plants of durum wheat (cv. Dakter)
grown under different temperature regimes. .............................................................................. 61
Table II-2. Protein composition of mature grains from plants of durum wheat (cv. Dakter) grown
under different temperature regimes. ......................................................................................... 65
Tableau IV-1. Alkylation des groupements thiols avec différents réactifs alkylants. ................. 157
Tableau IV-2. Exemples de différents types de modifications. .................................................. 164
Tableau IV-3. Les sous-unités de gluténines de haut poids moléculaire des variétés étudiées
répertoriées dans la banque Uniprot. ........................................................................................ 166
Tableau IV-4. Digestion trypsique in silico de la SG-HPM 1Bx20 (Mr 86,054 kDa, numéro
d’entrée Q8RVX0), Triticum turgidum subsp. durum. ................................................................ 167
Tableau IV-5. Identification de protéines par analyse MALDI-TOF et confirmation de séquence
de peptides à cystéines par MALDI-TOF/TOF (MS/MS).............................................................. 191
vii
Liste des figures
Liste des figures
Figure I-1. A) Coupe transversale de grains entièrement vitreux (à gauche) et entièrement
farineux (à droite), B) grains mitadinés. Source : INRA – Montpellier (Samson). ......................... 10
Figure I-2. Schéma histologique d’une coupe longitudinale d’un grain de blé (Surget & Barron,
2005). ............................................................................................................................................. 11
Figure I-3. Image de la partie centrale de l’albumen obtenue par microscopie électronique à
balayage (MEB). Présence de deux populations de grains d’amidon morphologiquement
différents, les petits (SB) et les gros (SA), englobés dans une matrice protéique (Mills et al.,
2005). ............................................................................................................................................. 13
Figure I-4. Schéma du processus de cellularisation de l’albumen. ............................................... 15
Figure I-5. Phases-clés du développement du grain de blé. Adapté de DuPont et Altenbach
(2003)............................................................................................................................................. 16
Figure I-6. La croissance du grain chez le blé (d'après Triboï, 1990)............................................. 17
Figure I-7. Coupes de grains de blé colorées au bleu de toluidine à 8 (A), 12 (B), 16 (C), 20 (D), et
22 (E) jours après floraison. Les barres correspondent à 1 mm pour la coupe transversale et à
100 µm pour les agrandissements (d'après Tosi et al., 2009). ..................................................... 19
Figure I-8. Classification des protéines du blé. Comparaison des classifications d'Osborne (1907)
et de Shewry et al. (1986). ............................................................................................................ 24
Figure I-9. Représentation schématique des structures primaires des prolamines (Shewry &
Halford, 2002). A) Exemple d’une prolamine pauvre en soufre : -gliadine. B) Exemple d’une
prolamine riche en soufre : !-gliadine. P : proline ; Q : glutamine ; F : phénylalanine. Les ponts
disulfures intramoléculaires sont schématisés en rouge. ............................................................. 29
Figure I-10. Représentation schématique de la structure primaire des "-gliadines (Shewry &
Tatham, 1990). Le domaine répétitif, permettant d’identifier deux motifs conservés, est basé
sur les séquences proposées par (Kasarda et al., 1984). .............................................................. 29
Figure I-11. Schéma proposé pour des structures typiques de SG-FPM de type m et s (A) et type
i (B) (d'après D'Ovidio & Masci, 2004)........................................................................................... 30
Figure I-12. Schéma synthétique des séquences des SG-HPM de type x et y, d’après (Shewry et
al., 2002). ....................................................................................................................................... 31
Figure I-13. Représentation schématique des positions des résidus cystéine dans la structure
primaire de la SG-HPM 1Bx20 d’après les séquences présentées par Shewry et al. (2003b). ..... 32
Figure I-14. Schéma d’association des SG-HPM et des SG-FPM et localisation des ponts
disulfures identifiés d’après Shewry et. al (2003c). ...................................................................... 33
Figure I-15. Schéma conceptuel de l’ontogénie des corpuscules protéiques et de la vacuole de
stockage protéique (PSV) (Herman & Larkins, 1999). ................................................................... 36
Figure I-16. Double immunolocalisation des prolamines dans les corpuscules protéiques de
l’albumen de grains en développement........................................................................................ 38
Figure I-17. Exemple de profil SE-HPLC de protéines SDS-solubles (—) et SDS-insolubles (—) de
grain de blé dur mature................................................................................................................. 41
viii
Liste des figures
Figure II-1. Typical SE-HPLC profiles of the SDS-soluble proteins from developing grains of
durum wheat plants (LT). .............................................................................................................. 57
Figure II-2. Grain dry mass (A, B) and water content (C, D) versus days (A, C) and thermal time
(B, D) after anthesis. ..................................................................................................................... 62
Figure II-3. Relationship between (A) percent of maximum grain water content and percent of
final grain dry mass and (B) relationship between grain water concentration and percent of final
grain dry mass for developing grains. ........................................................................................... 63
Figure II-4. Grain nitrogen versus days (A) and thermal time (B) after anthesis for developing
grains. ............................................................................................................................................ 64
Figure II-5. Accumulation of large and small SDS-soluble and SDS-insoluble polymers versus
thermal time after anthesis for developing grains. ...................................................................... 67
Figure S II-1. Relationship between SDS-insoluble and small and large SDS-soluble polymers for
developing grains. ......................................................................................................................... 68
Figure II-6. SDS-insoluble polymers versus grain water concentration........................................ 68
Figure II-7. Protein thiol content (PSH) versus thermal time after anthesis (A) or grain water
concentration (B) for developing grains. ...................................................................................... 69
Figure S II-2. Relationship between protein bound glutathione (PSSG) and ratio of SDS-insoluble
(Fi) to small SDS-soluble glutenin polymer (F2) in mature grains. ............................................... 70
Figure II-8. Superimposed bright field and fluorescence images of endosperm cross sections
from developing grains. ................................................................................................................ 71
Figure II-9. Timings of the main physiological and biochemical events observed during grain
filling.............................................................................................................................................. 73
Figure S II-3. Content of protein thiol (PSH) versus accumulation of SDS-insoluble glutenin
polymers (mg grain-1)................................................................................................................... 76
Figure S II-4. Grain water concentration versus days after anthesis. ........................................... 78
Figure III-1. Changes during grain development, in dry mass (A), water content (B), protein
content (C) and grain protein concentration (% DM) (D). ............................................................ 93
Figure III-2. Accumulation of the main grain protein classes during grain development. ........... 94
Figure III-3. Typical evolution of SE-HPLC profiles of SDS-soluble protein extracts from Orlu-1 (A)
and Dakter (B). .............................................................................................................................. 95
Figure III-4. A- Evolution of P4f (circle), P4s (square) from gliadin peak and B- accumulation of
small (square), large (circle) and SDS-insoluble glutenin polymers (triangle).............................. 96
Figure III-5. A- Evolution of protein sulfhydryl groups (PSH) and B- protein-bound glutathione
(PSSG) contents during grain development. Data are the means ± SD for n = 3 independent
measurements. ............................................................................................................................. 97
Figure III-6. Distribution of total glutathione and protein-bound glutathione contents in the
different wheat fractions from mature grains for Orlu-2 and Dakter samples, expressed as Aper mg of dry mass and B- per grain basis.................................................................................... 98
ix
Liste des figures
Figure III-7. Evolution of reduced (GSH, empty circle) and oxidized (GSSG, full circle) glutathione
during grain development for Orlu-1, Orlu-2 and Dakter. Data are the means ± SD for n = 3
independent measurements. ........................................................................................................ 99
Figure III-8. Evolution of the equilibrium constant (K1) of protein thiol oxidation by oxidized
glutathione (semi-log scale). Inset graph shows the same results in normal scale. ................... 100
Figure III-9. Evolution of dehydroascorbate (DHA, empty circle) and ascorbate (ASC, full circle)
independent measurements. ...................................................................................................... 101
Figure III-10. Evolution of malondialdehyde content (MDA) during grain development for Orlu-1,
Orlu-2 and Dakter. Data are the means ± SD for n = 3 independent measurements................. 101
Figure III-11. Evolution of the activities of A- glutathione-reductase (GR), B- superoxidedismutase (SOD) and C- catalase (CAT) during grain development for Orlu-1, Orlu-2 and Dakter.
Data are the means ± SD for n = 3 independent extracts made in triplicate.............................. 103
Figure III-12. Evolution patterns of protein sulfhydryl groups (PSH, empty circle), catalase
activity (triangle down), protein-bound glutathione (PSSG, grey diamond) and glutenin
polymers accumulation (empty diamond). ................................................................................. 109
Figure IV-1. Récapitulatif des protocoles d’extraction des protéines totales solubles et insolubles
dans le SDS 1% obtenues à partir de grains de blé dur immatures et matures.......................... 117
Figure IV-2. Aires totales des chromatogrammes SE-HPLC (unités arbitraires) pour l’ensemble
des protocoles testés aux différents stades de développement. ............................................... 118
Figure IV-3. Aires des différentes fractions protéiques issues des chromatogrammes SE-HPLC
(unités arbitraires) obtenues à partir des extraits SDS-solubles (F1-F5) et SDS-insolubles (Fi), de
grains immatures (318 et 371°CJAF) et murs (779 et 817°CJAF) selon les protocoles 1 (bleu) et 2
(rouge). ........................................................................................................................................ 119
grains immatures (318 et 371°CJAF) et murs (779 et 817°CJAF) selon les protocoles 1 (bleu), 3
(vert) et 4 (orange). ..................................................................................................................... 121
(unités arbitraires) obtenues à partir des extraits SDS-solubles (F1-F5) et SDS-insolubles (Fi) de
grains immatures (371°CJAF) et murs (779°CJAF) selon les protocoles 4 (orange), 5 (rose) et 6
(violet).......................................................................................................................................... 122
Figure IV-7. Effet d’alkylation et de l’extraction des protéines réalisée à froid ou à chaud sur la
fraction insoluble de farine. ........................................................................................................ 123
Figure IV-8. Changes in protein content of the different extracts (Tris-HCl, EtOH, SDS-soluble
and SDS-insoluble) from developing grains of durum wheat, after ATTO-labelling of SH groups
(A) or non-labelling (B). ............................................................................................................... 132
Figure IV-9. Changes in SE-HPLC elution patterns of Tris-HCl (A) and EtOH (B) soluble proteins
after SH labelling (ATTO) or non-labelling (without ATTO) from developing grains of durum
wheat. .......................................................................................................................................... 136
x
Liste des figures
Figure IV-10. Changes in SE-HPLC elution patterns of SDS-soluble (A) and SDS-insoluble (B)
proteins after SH labelling (ATTO) or non-labelling (without ATTO) from developing grains of
durum wheat............................................................................................................................... 137
Figure IV-11. Changes in SDS-PAGE patterns of Tris-HCl soluble proteins from developing grains
of durum wheat. Fluorescent (A and C) and Coomassie blue stained (B and D) gels are
presented in non-reducing (A and B) and reducing (C and D) conditions. ................................. 139
Figure IV-12. Changes in SDS-PAGE patterns of EtOH soluble proteins from developing grains of
durum wheat. Fluorescent (A and C) and Coomassie blue stained (B and D) gels are presented
under non-reducing (A and B) and reducing (C and D) conditions............................................. 141
Figure IV-13. Fluorescent (left) and Coomassie blue stained (right) bands of EtOH extracts from
immature grains at 473 and 601°Cd after anthesis. ................................................................... 142
Figure IV-14. Changes in SDS-PAGE patterns of SDS-soluble proteins from developing grains of
durum wheat. Fluorescent (A and C) and Coomassie blue staining (B and D) gels are presented
under non-reducing (A and B) and reducing (C and D) conditions............................................. 143
Figure IV-15. Changes in SDS-PAGE patterns of SDS-insoluble proteins from developing grains of
durum wheat. Fluorescent (A) and Coomassie blue staining (B) gels are presented under nonreducing conditions. ................................................................................................................... 144
Figure IV-16. Changes in protein thiol content during grain development measured by the DNTB
method and the cysteine content determined by SE-HPLC fluorescent detection. .................. 145
Figure IV-17. Evolution of the SH number per molecule from Tris-HCL extracts of developing
grains of durum wheat (327-681°Cd). Thermal times (°Cd) after anthesis are indicated at the top
of each curve............................................................................................................................... 146
Figure IV-18. The SH number per molecule. SE-HPLC profiles (UV and Fluo) at 473°Cd were
subtracted from 881°Cd for Tris-HCl (A) and EtOH (B) extracts. ................................................ 147
Figure IV-19. Evolution of the SH number by protein subunits from SDS-soluble and SDSinsoluble extracts of developing grains of durum wheat. .......................................................... 148
Figure IV-20. Stratégie générale de double alkylation. .............................................................. 153
Figure IV-21. Exemple de réaction d’alkylation de groupement thiol (SH) par A : la 2-vinylpyridine (VP), B : l’Iodoacetamide (IAM) et C : le N-éthyl-maléimide (NEM) (d'après Hansen &
Winther, 2009). ........................................................................................................................... 155
Figure IV-22. Spectres MS des SG-HPM de la variété de blé dur Bidi 17 à partir d’une analyse
MALDI-TOF (Gao et al., 2010). .................................................................................................... 166
Figure IV-25. SDS-PAGE en conditions non-réductrices (A) et réductrices (B) des extraits
séquentiels : Tris-HCl, Ethanol (EtOH) et SDS 2% (SDS-soluble). ................................................ 173
Figure IV-26. SDS-PAGE en conditions non-réductrices des extraits totaux. ............................. 174
Figure IV-27. Exemple de chromatogrammes SE-HPLC en fluorescence des extraits séquentiels
de grains immatures à 473°CJAF (Ex. 532 nm, émission 553nm). .............................................. 176
Figure IV-28. Fluorescence résiduelle des extraits séquentiels de grains immatures (#$%%&'()*+,
des variétés Dakter et Néfer. ...................................................................................................... 177
xi
Liste des figures
Figure IV-29. SDS-PAGE en conditions non-réductrices d’extrait éthanol soluble (EtOH). Les
extraits protéiques (variété Orlu à 473°CJAF) ont été alkylés avec l’ATTO. ............................... 179
Figure IV-30. Schéma représentant les structures des SG-FPM identifiées en MALDI-TOF. Les
cystéines sont désignées selon le système de lettres proposé par Köhler et al. (1993). ........... 181
Figure IV-31. Répresentation schématique des résidus cystéines identifiés. ............................. 187
Figure IV-32. Analyse de la composition fine d’un oligomère de gluténine de 200 kDa. ........... 190
Figure IV-33. Schéma global proposé pour l’état d’oxydoréduction des résidus cystéines d’une
SG-FPM de grain de blé dur immature........................................................................................ 196
Figure V-1. Superposition d'images de fluorescence (marquage Fast Green) et de fond clair de
corpuscules protéiques de l’albumen de grains de blé dur en développement (Orlu-1). .......... 206
Figure V-2. Évolution du poids sec et de la quantité d’eau par grain pour Néfer et Dakter au
cours du développement du grain. ............................................................................................. 208
Figure V-3. Photographies de grains de blé dur matures de la variété Dakter soumis à différents
régimes de température pendant le remplissage (HT1), la dessiccation (HT2) ou tout au long du
développement des grains (HT3). ............................................................................................... 214
Figure V-4. Photographies de grains de blé dur immatures mitadinés (variété Orlu-1)............. 214
xii
Introduction générale
1
2
Introduction
Ces travaux de thèse ont été effectués dans le cadre de l’axe 3 - Élaboration de la qualité du
grain de blé dur - du programme de recherche GARICC (Génotypes de blé dur et Adaptation
Régionale aux Itinéraires techniques et aux Contraintes Climatiques) avec le soutien du pôle de
compétitivité de la région Languedoc-Roussillon QualiMéditerranée et du FUI (Fonds Unique
Interministériel). Ce programme, allant de la production de grains de blé dur en conditions
contrôlées à l’étude de l’impact des conditions agro-climatiques et génétiques sur l’élaboration
de la qualité du grain de blé dur a impliqué trois laboratoires de recherche publique : les Unités
de Recherche INRA de Nantes « Biopolymères, Interactions, Assemblages » (BIA), de
Montpellier « Ingénierie des Agro-polymères et Technologies Émergentes » (IATE) et de
Clermont-Ferrand « Génétique, Diversité et Écophysiologie des Céréales » (GEDEC).
Le contexte de la production du blé a subi depuis quelques années une évolution importante
sur les plans économique, social et environnemental. La production devrait augmenter de 40%
en 2020 pour faire face à l’augmentation de la population mondiale (Pinstrup-Andersen et al.,
1999). Néanmoins, le rendement du blé tend à stagner depuis 1990, en particulier dans les
régions à fort rendement comme en France, et ce malgré les progrès génétiques des 30
dernières années (Brisson et al., 2010). L’augmentation doit venir principalement de
l'amélioration du potentiel du milieu, nécessitant des productions plus régulières, avec moins
d’intrants afin de préserver l'environnement et les ressources naturelles présentes.
Le blé est actuellement une des céréales les plus cultivées au monde avec une production
annuelle totale de près de 680 millions de tonnes. En France, premier producteur de blé
européen, cette culture représente une production d’environ 39 millions de tonnes (FAOSTAT,
2009). Le blé dur est une céréale cultivée notamment dans tout le bassin méditerranéen et
dans le sud de la France, principalement en Languedoc-Roussillon, Provence et Midi-Pyrénées.
Du fait de sa faible résistance au froid et à l'humidité, sa culture nécessite un ensoleillement
élevé. Aux vues de ces exigences, le rendement annuel est sujet à de fortes variations liées aux
conditions climatiques.
Le blé dur est principalement consommé sous forme de semoule et de pâtes alimentaires. Sa
qualité technologique est évaluée au travers de plusieurs critères, parmi ceux-ci on distingue la
valeur semoulière et la valeur pastière. Le rendement semoulier varie selon la taille, le poids du
3
grain et la vitrosité du grain tandis que la qualité pastière dépend de la composition qualitative
et quantitative en protéines. Pour satisfaire à la demande de l'industrie, un blé dur de qualité
doit donc répondre à des exigences technologiques, il doit avoir une couleur “ambrée”, une
amande vitreuse, opaque et non farineuse, c'est-à-dire présenter moins de 20% de grains
mitadinés1, tout en possédant un taux de protéines minimum d’environ 12%. La vitrosité peut
être altérée par le mitadinage qui pénalise la valeur semoulière. L'apparition du mitadinage est
liée à une baisse du contenu en protéine de l'amande, ce phénomène se traduit par l'apparition
de zones farineuses dans tout ou partie de l’amande vitreuse. Les critères qui déterminent la
valeur pastière vont dépendre de façon assez complexe et pas complètement connue, de la
manière dont les structures et les composants macromoléculaires du grain sont organisées
(amidon et protéines). Les propriétés rhéologiques des pâtes, via celles du gluten, dépendent
de la composition en protéines de réserve de la semoule, mais aussi de l’assemblage sous
forme polymérique de celles-ci.
Ces critères, fortement liés au polymorphisme génétique du blé, sont également largement
influencés par les conditions agro-climatiques au moment du développement et de la
maturation du grain. En effet, des températures modérées et un apport important en azote
sont nécessaires pour garantir la quantité et l'assemblage des protéines de réserve du grain.
Jusqu'à présent, seuls quelques travaux portant sur la dynamique d'accumulation des protéines
de réserve au cours de l’élaboration du grain de blé dur ont été publiés.
Dans ce contexte, des aspects agronomiques, biochimiques et dans une moindre mesure
technologiques sont considérés dans ce manuscrit et visent à approfondir les connaissances sur
les événements physiologiques et physico-chimiques intervenant au cours du remplissage du
grain de blé dur et ce en fonction de la température et des conditions pédoclimatiques pour
deux variétés différentes. Plus précisément, nous avons cherché à cerner le contexte cellulaire
dans lequel s’effectue l’élaboration du grain et l’assemblage des prolamines. Nous avons
également porté notre intérêt sur les liens possibles entre ces événements et la texture de
l’albumen de blé dur, dans la mesure où celle-ci conditionne le rendement semoulier et pour
une grande partie, à travers sa relation avec la teneur en protéine, la qualité pastière.
1
Selon le règlement communautaire n° 824/2000 du 19 avril 2000.
4
Les principaux résultats acquis au cours de la thèse sont regroupés en trois chapitres,
s’articulant autour de trois articles scientifiques rédigés en anglais pour soumission dans des
revues internationales à comité de lecture. Des résultats complémentaires, rédigés en français,
sont également présentés dans le chapitre 4. La rédaction des résultats sous forme de
publications a pour objectif de valoriser dès à présent les travaux de recherche. Toutefois, par
souci de clarté, le restant du manuscrit de thèse est rédigé en français.
Le manuscrit est organisé en cinq chapitres :
Le chapitre I est consacré à la synthèse bibliographique. Les travaux antérieurs sont
présentés et analysés dans la perspective des deux principales thématiques développées : le
remplissage du grain et l’assemblage des protéines de réserve. Tout d’abord les phases clés
du développement du grain ainsi que la biosynthèse et le routage subcellulaire des
protéines de réserve seront envisagés, avant d’aborder à une échelle plus fine l’agrégation
sous forme polymérique de ces dernières.
Le chapitre II est consacré à l’étude de l'effet de températures élevées appliquées à
différents stades de la formation du grain, soit pendant les phases de remplissage ou de
dessiccation soit tout au long du développement du grain de blé dur. Un suivi fin de
l’évolution physiologique (analyse des vitesses et durées d’accumulation des réserves,
statut hydrique du grain, morphologie des corpuscules protéiques) et physico-chimique du
grain (teneur en protéines, état de distribution et d’oxydation des protéines de réserve) a
été réalisé. Les mécanismes physiques gouvernant les modalités de dessiccation et l’arrêt
de la croissance du grain sont discutés à la lumière des résultats obtenus dans la publication
n°1.
Les travaux décrits dans le chapitre III font l’objet de la publication n°2 qui porte sur la
relation entre l’évolution du statut redox de l’albumen et l’accumulation et la
polymérisation des gluténines. Pour cela, les analyses ont été réalisées à partir de grains
prélevés tout au long de leur cycle de remplissage. Il s’agissait notamment de cerner la
dynamique d’assemblage des protéines de réserve pour deux variétés associées à
différentes performances technologiques et pour des grains présentant des textures très
contrastées à la récolte. En parallèle, l’évolution du statut rédox du grain a notamment été
jugée de la fin de la phase de cellularisation à la fin de la dessiccation du grain, par la
5
mesure des activités spécifiques des enzymes impliquées dans la détoxication cellulaire, des
formes réduites et oxydées du glutathion et de l’ascorbate ou encore par le dosage des
lipides peroxydés.
Le chapitre IV est consacré à l’étude de la dynamique d’assemblage des gluténines au
cours de l’élaboration du grain de blé dur, il est partagé en trois parties distinctes. La
première constitue les conditions expérimentales retenues pour l’extraction totale des
protéines solubles et insolubles au SDS. La deuxième constitue la publication n° 3, qui porte
sur les changements du statut rédox des différentes classes protéiques au cours du
développement du grain de blé dur. En s’appuyant sur le marquage des thiols par un
alkylant spécifique fluorescent, nous avons cherché à caractériser le couplage entre
l’oxydation des thiols protéiques et la croissance en taille des assemblages de sous-unités
de gluténines. Une double détection (UV et fluorescente) lors des analyses par
chromatographie d'exclusion-diffusion (SE-HPLC) a été employée pour quantifier le nombre
de thiols portés par les différentes espèces protéiques fractionnées par SE-HPLC. A partir de
ces travaux, une deuxième étude a été mise en place afin d’identifier par spectrométrie de
masse, l’état d’oxydoréduction des résidus cystéines dans les sous-unités gluténines
extraites de grains immatures. Les résultats obtenus nous amènent à proposer un modèle
d’assemblage de polymères de gluténines.
Le chapitre V est une synthèse et conclusion des principaux résultats obtenus au cours de
ce travail. Sa lecture devrait permettre une meilleure compréhension : des relations existant
entre l’accumulation de matière sèche et le statut hydrique du grain ; de la dynamique
d’assemblage des protéines de réserve ; de la vitrosité et la formation de macro-polymères
de gluténines, ainsi que des mécanismes contrôlant l’arrêt du remplissage du grain de blé
dur. Le manuscrit se termine par les perspectives qui proposent de nombreuses pistes
envisageables pour la suite de ce travail.
6
Chapitre I.
Synthèse bibliographique
7
8
Chapitre I
Chapitre I- Synthèse bibliographique
1. Le grain de blé
1.1. Généralités
Les deux espèces de blé les plus cultivées au monde sont le blé tendre (Triticum aestivum L.)
qui représente plus de 90% de la production mondiale et le blé dur (Triticum durum Desf.) qui
constitue 5% de celle-ci et qui est traditionnellement cultivé dans le bassin méditerranéen
(Gooding, 2009). D’un point de vue botanique, le blé est une monocotylédone appartenant à la
famille des graminées, divisées génétiquement selon leur nombre de chromosomes (2n). Le blé
dur, utilisé pour la fabrication de pâtes alimentaires, présente un génome tétraploïde (génome
AA BB). Chaque génome est constitué de 7 paires de chromosomes homéologues, soit un total
de 28 chromosomes (2n = 28). Le blé tendre, essentiellement utilisé pour la fabrication du pain,
est hexaploïde (génome AA BB DD) avec un total de 42 chromosomes.
Les différentes variétés de blé peuvent être classées d'un point de vue technologique selon
la texture de leur albumen et leur teneur en protéines, caractéristiques qui conditionnent le
rendement en farine ou en semoule lors de la première transformation et la qualité culinaire
des produits de seconde transformation. Ces critères de classification sont sous l'influence, à la
fois, de facteurs génétiques et environnementaux (Kent & Evers, 1994).
La dureté, propriété mécanique qui se réfère à la texture, traduit la cohésion du grain. Chez
le blé tendre, elle est génétiquement contrôlée par le gène Ha (Symes, 1965, Baker, 1977). Ce
gène est localisé sur le bras court du chromosome 5D (Chowdhury & Wardlaw, 1978). Les
allèles du gène de la dureté sont également présents sur les chromosomes 5A et 5B du blé
hexaploïde, mais ne sont pas exprimés. C'est pour cette raison que les blés durs tétraploïdes
dépourvus du génome D sont plus durs que les blés hexaploïdes. Il existe trois classes de dureté
qui séparent les espèces et les variétés de blé : soft et hard pour les hexaploïdes et dur pour les
tétraploïdes.
La vitrosité, caractéristique très recherchée chez le blé dur, est une propriété optique
fortement influencée par les conditions agro-climatiques et directement liée à la teneur et à la
composition en protéines (rapport gliadine/gluténine) (Dexter et al., 1988, Dexter et al., 1989,
Samson et al., 2005). Sur la base de la vitrosité, on distingue trois catégories de grains : les
9
grains vitreux, présentant une surface translucide et lisse à la coupe avec un albumen compact,
pratiquement dépourvu d’espaces vides ; les farineux, présentant un albumen blanc et opaque,
lié à la présence des nombreuses poches d’air (Czarnes et al., 1999) qui diffractent et diffusent
la lumière (Hoseney, 1994) et les grains mitadinés, caractérisés par la présence de zones
adjacentes farineuses et vitreuses (Dexter et al., 1989), fréquemment rencontrés chez le blé dur
(Figure I-1).
Au cours de cette étude, nous nous intéresserons uniquement au blé dur, toutefois la
comparaison de nos résultats avec ceux de la littérature nécessitera de faire référence à des
travaux sur le blé tendre infiniment plus nombreux que ceux sur le blé dur.
A
B
Figure I-1. A) Coupe transversale de grains entièrement vitreux (à gauche) et entièrement
farineux (à droite), B) grains mitadinés. Source : INRA – Montpellier (Samson).
1.2. Morphologie et histologie
Le grain de blé est un fruit sec et indéhiscent, appelé caryopse, constitué d’une graine et de
téguments. Sur l’épi, il est entouré d’enveloppes : les glumes et les glumelles qui n’adhérent
pas au grain et sont éliminées lors du battage. Sur le plan morphologique, le grain possède une
forme ovoïde et est caractérisé par la présence d’un sillon qui s'étend sur toute la longueur de
la face ventrale. Sur la face dorsale, le germe s’étend du pôle basal jusqu'au tiers de la longueur
du grain, et à l’opposé, sur le pôle apical le grain est coiffé d’une brosse à peine visible à l’œil
nu.
La taille du grain (de 5 à 7 mm de long, de 2,5 à 4 mm de large et de 2,5 à 3,5 mm
d’épaisseur) et son poids (entre 20 et 50 mg) (Surget & Barron, 2005) sont des caractéristiques
variétales qui peuvent varier en fonction des conditions de culture (i.e. échaudage lié à des
facteurs d'ordre climatique ou parasitaire) et de la position du grain sur l’épi. En général, les
gros grains sont localisés au centre de l’épi (Calderini et al., 2000, Evers & Millar, 2002). Chez les
10
Chapitre I
espèces avec de multiples tailles, la taille moyenne des grains diminue progressivement de la
tige principale vers les autres (Evers & Millar, 2002).
Histologiquement, le grain de blé dur est formé de trois types de tissu : le germe (3%), les
enveloppes (13-16% du grain) et l’albumen (80-85% du grain) (Kent & Evers, 1994, Barron et al.,
2007) (Figure I-2).
Sillon
Albumen amylacé
Albumen
Couche à aleurone
Epiderme du nucelle
Test a
Cellules
Enveloppes
tubulaires
Péricarpe
Cellules
interne
transversales
Péricarpe externe
Scutellum
Germe
Axe embryonnaire
Figure I-2. Schéma histologique d’une coupe longitudinale d’un grain de blé (Surget & Barron,
2005).
Le germe ou embryon 2, résulte de la fusion des gamètes mâles et femelles. À maturité du
grain, il comprend l’axe embryonnaire et le scutellum, qui est considéré comme homéologue à
un cotylédon. Dans les céréales le germe a la plus forte teneur en lipides et en vitamines
liposolubles. Il a également la plus forte teneur en humidité dans le grain mature (Song et al.,
1998). À l'exception du maïs, où l'huile est économiquement importante, le germe n'est pas
considéré comme une cible d'amélioration génétique (Evers & Millar, 2002) et est
généralement éliminé pendant la mouture (blé), le polissage (riz), le pelage (orge) ou le
décorticage (sorgho) avant la consommation humaine (Shewry & Halford, 2002).
2
Le terme embryon est plutôt adopté en botanique. Le terme germe est le plus souvent utilisé par les meuniers et
les semouliers pour désigner la fraction riche en axe embryonnaire produite lors de la mouture (Kent & Evers,
1994). Dans ce travail le terme germe sera adopté.
11
Les enveloppes du grain sont composées de cinq tissus superposés, chacun de ces tissus
possède une épaisseur et une nature différente (Barron et al., 2007). De la surface externe vers
le centre du grain se trouvent successivement le péricarpe externe (épicarpe) et le péricarpe
interne constitué par le mésocarpe et l'endocarpe. Viennent ensuite la testa et l’épiderme du
nucelle (ou couche hyaline) (Surget & Barron, 2005). Ces tissus sont essentiellement constitués
de cellules vides dont les parois sont riches en fibres et en composés phénoliques (Hemery et
al., 2007).
L'albumen, représente le tissu le plus abondant du grain. Il est constitué de l’albumen
amylacé 3 et des cellules de la couche à aleurone. L’albumen amylacé est décrit comme la masse
centrale, composée de cellules compactes remplies de grains d’amidon enchâssés au sein d’une
matrice protéique plus ou moins dense (Figure I-3). Ces éléments nutritifs sont mobilisés pour
soutenir la croissance de l'axe embryonnaire au début de la germination. Les cellules de
l'albumen amylacé sont entourées de la couche à aleurone, aussi appelée assise protéique. Elle
est formée d'une seule couche de cellules cubiques de 50 µm à paroi épaisse et au contenu
dense, où les noyaux sont au premier plan. Contrairement à l’albumen amylacé, ces cellules ne
contiennent pas d'amidon mais ont une forte teneur en protéines et en lipides. Les cellules de
l’aleurone sont d'une extrême importance, d'une part pour le développement du grain car elles
se divisent pour former les cellules de l'albumen amylacé, et d'autre part pour la germination
car elles sont le siège de la synthèse d’enzymes hydrolytiques responsables de la solubilisation
des réserves (Kent & Evers, 1994).
3
Dans ce travail, aussi comme dans des nombreuses références, le terme « l'albumen» sera utilisé pour faire
référence uniquement à l'albumen amylacé.
12
Chapitre I
Figure I-3. Image de la partie centrale de l’albumen obtenue par microscopie électronique à
balayage (MEB). Présence de deux populations de grains d’amidon morphologiquement
différents, les petits (SB) et les gros (SA), englobés dans une matrice protéique (Mills et al.,
2005).
1.3. Les principaux constituants
Le grain est principalement constitué de glucides (amidon et fibres, 65-75%) et de protéines
(8 à 17%, selon les variétés et les conditions de culture), mais aussi de lipides (2-6%), d'eau (1214%) et de micronutriments (Pomeranz, 1988, Kent & Evers, 1994). Ces constituants se
répartissent de manière inégale au sein des différentes fractions histologiques du grain.
L’amidon se retrouve en totalité dans l’albumen amylacé, les protéines et les lipides dans le
germe et la couche à aleurone (Hemery et al., 2007). L'hétérogénéité existe également entre les
cellules de ces différents tissus. En particulier, il est bien établi qu’il existe un gradient
protéique entre l'albumen amylacé et les cellules externes de la couche à aleurone
(subaleurone), ces dernières étant plus riches en protéines avec moins d'amidon que les
cellules de l'albumen central (Evers, 1970, Lending & Larkins, 1989).
Les protéines du blé sont divisées selon leurs caractéristiques biologiques et leur localisation
dans le grain, on distingue ainsi deux classes de protéines : les protéines métaboliques avec les
albumines et les globulines (15-20% des protéines) et les protéines de réserve avec les gliadines
et les gluténines (80-85% des protéines) (Wrigley & Bietz, 1988). !Les albumines-globulines,
encore appelées protéines solubles, sont constituées d’un grand nombre de protéines se
différenciant par leurs propriétés physico-chimiques (poids moléculaire, point isoélectrique,
acides aminés) et fonctionnelles (activités enzymatiques : "- et --amylase, protéases,
13
oxydoréductases ; inhibiteurs enzymatiques, pouvoir émulsifiant et moussant). On les retrouve
dans l’ensemble des différents compartiments de la graine. Les gliadines et les gluténines, aussi
appelées prolamines en raison de leur richesse en proline et en glutamine, représentent une
source d’acides aminés pour la germination et pour le développement de la graine (Richard et
al., 1996). Ces protéines de réserve sont majoritairement localisées au sein de l’albumen
amylacé. Elles sont également les principaux constituants du gluten, le complexe protéique
viscoélastique obtenu par lavage à l’eau d’une pâte de blé. Elles seront présentées plus loin
dans ce chapitre.
1.4. Phases clés du développement du grain : la phase d’accumulation de l'eau et de la
matière sèche, le palier hydrique, la dessiccation
Le développement du grain est classiquement divisé en quatre phases (Simmonds & O’Brien,
1981, Olsen, 2001), selon le développement de l’albumen (Figure I-4) :
-
La phase syncytiale (0-4 JAF) qui correspond à une période de divisions mitotiques sans
formation des parois cellulaires. Suite à ces divisions, les noyaux migrent formant l’albumen
coenocytique.
-
La division cellulaire
ou embryogenèse (4-18 JAF) caractérisée par une intense
multiplication cellulaire et la formation des parois cellulaires conduisant à la cellularisation
complète de l’albumen.
-
L’accumulation ou remplissage (18-36 JAF) correspondant à la déposition linéaire de la
matière sèche.
-
La phase de dessiccation ou de maturation (36-58 JAF), marquée par un arrêt de
l’accumulation de la matière sèche et une chute de la teneur en eau du grain.
Le développement de l'albumen commence par la fécondation de la cellule centrale diploïde
du sac embryonnaire. Après la floraison, son développement est caractérisé par une courte
phase syncytiale pendant laquelle le noyau de la cellule centrale se divise sans la formation des
parois cellulaires. Les noyaux sont alors répartis dans une bande de cytoplasme entourant une
large vacuole centrale : c’est l’albumen coenocytique (Figure I-4A).
Le processus de cellularisation de l’albumen coenocytique est initié par la formation d’un
réseau de microtubules émergeant de l’enveloppe des noyaux. La maturation de l’albumen
14
Chapitre I
continue par des divisions répétées des noyaux triploïdes, la formation progressive de la paroi
cellulaire et après plusieurs cycles de divisions cellulaires centripètes, la vacuole centrale est
comblée (Figure I-4B-D) (Olsen et al., 1999, Olsen, 2001).
A
B
C
D
Figure I-4. Schéma du processus de cellularisation de l’albumen. A) les divisions mitotiques se
déroulent sans formation de la paroi cellulaire, les noyaux migrent formant l’albumen
coenocytique, B) la cellularisation est initiée par la formation d’un réseau de microtubules
émergeant des noyaux, C) la formation des parois cellulaires est facilitée par l’interaction des
microtubules émergeant des noyaux. Chaque noyau se retrouve entouré par une structure
proche de la paroi, D) après plusieurs cycles de divisions cellulaires centripètes, la vacuole
centrale est comblée (d’après Olsen et al. 2001).
Le développement du grain peut également être décrit selon des critères physiologiques et
de composition du tissu, ce qui permet de déterminer les phases clés en prenant en compte les
points de transition de l'accumulation en eau, de la matière sèche totale, de l'amidon et des
protéines (Figure I-5) (DuPont & Altenbach, 2003).
La phase de division cellulaire est la période pendant laquelle la teneur en eau augmente
rapidement tandis que les grains d'amidon et les protéines de réserve s'accumulent à une faible
vitesse (Sofield et al., 1977b, Schnyder & Baum, 1992, Carceller & Aussenac, 1999, DuPont &
Altenbach, 2003). L’importance de cette phase précoce du développement du grain trouve son
explication dans la relation étroite entre le poids sec final du grain et le nombre de cellules de
l’albumen (Brocklehurst, 1977, Macleod & Duffus, 1988). Les quantités d'amidon et de
protéines qui vont être accumulées dans chaque grain sont dépendantes du nombre de cellules
de l'albumen et de la taille finale des cellules, elle même influencée par l'absorption d'eau, la
plasticité de la paroi cellulaire, la vitesse et la durée de remplissage du grain (Egli, 1998). A la fin
15
de la phase de division cellulaire, le grain se trouve au stade « laiteux » et contient environ 60%
maturité / récolte
fin d'accumulation de protéine
fin d'accumulation d'amidon
début de l'apoptose
100
teneur en eau maximale
accumulation linéaire de protéine
accumulation linéaire d'amidon
d’eau.
mg par grain
80
60
matière sèche
40
eau
20
matière frâiche
0
0
200
400
600
800
1000 °C JAF
0
12
24
36
48
60 JAF
Développement du grain
Figure I-5. Phases-clés du développement du grain de blé. Adapté de DuPont et Altenbach
(2003).
La phase d’accumulation ou remplissage du grain suit une courbe sigmoïdale avec une phase
de faible accumulation de matière sèche, une phase linéaire et enfin un plateau (Triboï, 1990,
Yin et al., 2009). La phase linéaire se caractérise par deux variables déterminantes pour le poids
du grain : la durée (D) et la vitesse de remplissage (V) (Triboï, 1990). La durée peut être
exprimée en jours après floraison (JAF) ou en somme de températures moyennes journalières
(°CJAF, degrés-jours). Il en résulte que V s’exprime en mg.JAF-1 ou mg.°CJAF-1 (Figure I-6). La
durée et la vitesse de remplissage du grain de blé peuvent varier considérablement en fonction
des génotypes et des conditions thermiques de culture (Yin et al., 2009).
16
Chapitre I
Figure I-6. La croissance du grain chez le blé (d'après Triboï, 1990).
Pendant la phase de remplissage, les grains d’amidon et les protéines de réserve
s’accumulent dans les cellules de l’albumen (Singh & Jenner, 1982) de manière quasi-linéaire et
le volume du grain augmente à une vitesse réduite (Sofield et al., 1977b). Bien que les vitesses
et les durées d'accumulation de l'amidon et des protéines soient considérées comme des
événements indépendants, contrôlés par des mécanismes distincts (Jenner et al., 1991,
Panozzo & Eagles, 1999), elles sont essentiellement parallèles (Shewry et al., 2009b).
Une étude récente portant sur des caryopses récoltés entre 8 et 22 JAF a mis en évidence
par microscopique optique les modifications spatio-temporelles de l'accumulation des grains
d’amidon et des protéines de réserve chez le blé dur (Tosi et al., 2009) (Figure I-7). Au stade le
plus précoce (8 JAF, Figure I-7A), l’assise aleuronique située en périphérie de l’albumen semble
être constituée de plusieurs couches de cellules dont les morphologies se distinguent bien de
celles des cellules plus centrales. Du fait que seule la couche la plus externe constituera à
maturité la couche à aleurone (Kent & Evers, 1994), les autres vont évoluer et acquérir la
morphologie typique des cellules de l’albumen central. Les cellules internes de l'albumen ont
une apparence typique de l'albumen amylacé, avec des grandes vacuoles, des noyaux bien
distincts et des gros grains d'amidon (type A) présents dans le cytoplasme périphérique. A 12
JAF (Figure I-7B) la couche à aleurone commence à s’individualiser. Des changements sont
également intervenus dans les cellules intérieures de l'albumen, la vacuole centrale se divisant
en plusieurs petites vacuoles qui contiennent des dépôts de protéines. L'accumulation
d'amidon et de protéines dans les cellules de l'albumen continue d'augmenter jusqu’à 16-20
17
JAF (Figure I-7C-D), vers 22 JAF (Figure I-7E) la quasi-totalité du contenu cellulaire renferme les
protéines et les grains d’amidon.
Une des particularités du grain de blé dur (partagée avec les autres espèces de blé et de
maïs) est que son contenu en eau est constant durant la phase d’accumulation des réserves. En
effet, la teneur en eau du grain augmente pendant la phase de division cellulaire avant
d'atteindre un maximum. À ce stade, le mouvement de l'eau dans le grain (absorption racinaire)
est approximativement égal à la perte d'eau par évapotranspiration et ainsi la teneur en eau
reste constante (Sofield et al., 1977b, Gooding et al., 2003), c'est la phase du palier hydrique.
Il est bien établi que la maturité physiologique est atteinte lorsque l’accumulation des
protéines et de l'amidon se stabilise et que le grain atteint donc son poids final (Schnyder &
Baum, 1992, Calderini et al., 2000). À la fin du remplissage du grain, le grain présente un aspect
« pâteux » et contient alors 40-45% d’eau. La perte en eau se poursuit mais l'absorption cesse,
par conséquent, la teneur en eau diminue et le grain entre en phase de dessiccation.
18
Chapitre I
1
2
A
B
C
D
Figure I-7. Coupes de grains de blé
colorées au bleu de toluidine à 8
(A), 12 (B), 16 (C), 20 (D), et 22 (E)
jours après floraison. Les barres
correspondent à 1 mm pour la
coupe transversale et à 100 µm
pour les agrandissements (d'après
Tosi et al., 2009).
E
Il est difficile d'évaluer avec précision si la diminution de la teneur en eau précède ou suit
l'arrêt de l’accumulation de la matière sèche dans le grain. Des données contrastées sont
discutées par Sofield et al. (1977b) qui suggère que la diminution de la teneur en eau ainsi que
la stabilisation de la matière sèche seraient dues au blocage, par formation d'une couche
lipidique, du pole chalazien (ou tégument séminal 4). En effet, ces auteurs ont montré par
microscopie électronique conventionnelle que l’accumulation de lipides dans la région du
tégument séminal augmente à partir de 33 JAF, coïncidant avec l’arrêt de croissance du grain,
et cela jusqu’à 55 JAF.
4
Le tégument séminal se compose de deux tissus : la testa et le film pigmentaire. Ensemble ces deux tissus
recouvrent la surface complète de la graine, ils participent de manière coopérative à la maturation de celle-ci par
un contrôle de la circulation de l’eau et des nutriments (Bechtel et al., 2009).
19
Au cours du développement, les tissus du grain de blé subissent une mort cellulaire
programmée intervenant à des moments différents. Celle-ci se produit dans le
nucelle/péricarpe au début du développement (4-6 JAF) pour faire place à la croissance rapide
de l’albumen (Young & Gallie, 2000, Dominguez et al., 2001). Certains auteurs proposent qu’aux
alentours de la maturité physiologique, l'albumen des céréales subit lui aussi une forme de
mort cellulaire progressive ou mort cellulaire programmée (Young et al., 1997, Young & Gallie,
1999), caractérisée principalement par une augmentation de la dégradation de l'ADN
(Altenbach et al., 2003). Toutefois, il est reconnu que la fragmentation de l’ADN et la présence
de corps apoptotiques sont bien deux indicateurs de la mort cellulaire par apoptose mais qu'ils
apparaissent bien au delà du "point de non retour" et du moment de la mort elle même
(Halliwell & Gutteridge, 1999, Jones, 2001). Par conséquent, le stade du développement du
grain où la dégradation de l’ADN est véritablement initiée doit se produire avant l'apparition
des fragments d'ADN (Young & Gallie, 1999).
Plus récemment les travaux de Li et al. (2004a) ont mis en évidence des changements
ultrastructuraux, caractéristiques de l’apoptose, intervenant très précocement dans l’albumen
du blé. Ces auteurs ont avancé l’hypothèse que la mort cellulaire de l'albumen se produirait en
deux étapes, la première consistant en la désintégration du noyau dès 6-14 JAF. Au cours de la
désintégration nucléaire un grand nombre d'organites intacts sont encore observés dans le
cytoplasme. Après la désintégration nucléaire, la cellule est encore vivante et la synthèse et
l'accumulation de l'amidon et des protéines continue normalement dans le cytoplasme, jusqu'à
ce que les cellules de l’albumen meurent dès lors qu'elles sont pleines de réserves.
La phase de dessiccation des grains se traduit non seulement par la stagnation du profil
d'accumulation de la masse sèche, amidon et protéines, mais aussi par des changements dans
l'apparence des grains (perte de la couleur verte) (Schnyder & Weiss, 1993). Les grains
commencent à changer de couleur à la maturité physiologique, en passant du vert au brun
entre 26 et 31 JAF ; pendant la dessiccation ils deviennent entièrement bruns et secs (Altenbach
et al., 2003).
20
Chapitre I
2. L’amidon
L’amidon est le principal constituant (85%) de l’albumen amylacé. Les grains d’amidon sont
déposés sous forme semi-cristalline et insoluble dans l'eau, dans un organite appelé
amyloplaste. Il est composé de deux polymères de glucose : l’amylose (26-28%) et
l'amylopectine (72-74%). Ces deux polymères présentent différents degrés de polymérisation et
de ramification. L’amylose est formée de longues chaînes linéaires de monomères de Dglucopyranose reliées par des liaisons glycosidiques en "(1-4). Son poids moléculaire est
compris entre 100 et 1 000 kDa (Hoseney, 1994). L’amylopectine est une molécule ramifiée de
poids moléculaire plus élevé (10 000 à 100 000 kDa), constituée de monomères de Dglucopyranose reliés par des liaisons glycosidiques en "(1-4) sur lesquelles des chaînes latérales
identiques viennent se brancher par des liaisons "(1-6) (Colonna & Buléon, 1992).
La structure de l'amidon lui confère des propriétés spécifiques dans certaines conditions
d’hydratation et de température : solubilité, viscosité, gélatinisation et adhésion. Insolubles
dans l’eau froide et à la température ambiante, les grains d'amidon gélatinisent sous effet de la
température (60°C) et de l’hydratation (teneur en eau : 30%) (Kulp, 1972).
Les grains d'amidon se distinguent selon leur taille et leur forme. Plusieurs techniques
comme la diffraction de la lumière, la microscopie et la sédimentation sont employées pour
déterminer leur distribution en taille. Chez le blé, comme chez les autres membres de la famille
des Triticeae, les granules d'amidon présentent une distribution en taille bimodale (Peng et al.,
1999, Edwards et al., 2008, Stamova et al., 2009). Toutefois, les travaux de Bechtel et son
équipe (Bechtel et al., 1990, Bechtel & Wilson, 2003, Wilson et al., 2006) ont mis en évidence
trois classes de tailles. Les grains de type A, qui possèdent un diamètre supérieur à 16 .m et
une forme lenticulaire ou elliptique ; les grains moyens de type B allant de 5,3 à 15,9 .m de
diamètre et présentant une forme sphérique et les petits grains de type C qui possèdent des
diamètres inférieurs à 5,3 .m (Bechtel et al, 1990). Les grains de type A représentent plus de
70% du poids total et environ 3% du nombre total des grains d’amidon dans l’albumen. Les
grains de type B représentent 90% du nombre total et moins de 30% du poids total de l'amidon
dans l'albumen du blé (Evers, 1973, Morrison & Gadan, 1987).
Une étude menée sur la distribution en taille des grains d'amidon de blés présentant des
degrés de dureté différents a montré que les blés les plus tendres présentaient plus de gros
21
grains (type A) entourés par une matrice protéique dans laquelle sont inclus les petits grains
(Edwards et al., 2008). Selon ces auteurs, le manque de petits grains d’amidon pour remplir les
espaces vides entre les gros contribuerait à diminuer la densité de l’albumen.
Au cours du développement du grain de blé, la synthèse des grains d'amidon se déroule en 3
phases dans les cellules de l'albumen. Les grains de type A sont formés dès 4 JAF, leur taille
moyenne passe de 5.6 µm à un maximum compris entre 25 et 50 µm aux alentours de 19 JAF.
Les grains de type B sont détectés à partir de la deuxième semaine après la floraison et
contrairement aux types A, les types B augmentent en taille à partir de 21 JAF et cela jusqu’à la
maturité où ils atteignent une taille moyenne de 9 µm. Le plus petits de type C apparaissent
seulement après la troisième semaine après la floraison (Bechtel & Wilson, 2003). A maturité,
l’amidon représente 55% du poids sec du grain, cette quantité d'amidon accumulée au cours du
développement du grain est essentiellement associé à une augmentation de la teneur en
amylose (Shewry et al., 2009b, Stamova et al., 2009). En effet, les vitesses d’accumulation de
l'amidon total et de l'amylose augmentent respectivement, de 4 à 18 fois vers 28 JAF avant de
chuter jusqu'à la fin du développement du grain (Stamova et al., 2009).
3. Les protéines de réserve du grain de blé
L’objectif de cette partie bibliographique est d’introduire les connaissances sur la structure
et les voies de synthèse des protéines de réserve du blé (prolamines) en insistant plus
particulièrement sur la formation des corpuscules protéiques et les mécanismes d’assemblage
des polymères de gluténines au cours du développement du grain. Les effets des conditions
environnementales, telles que la température, les stress hydrique et azoté, sur l’accumulation
des prolamines et la structuration des polymères de gluténines seront également abordés.
3.1. Classification des protéines du grain de blé
En 1907, Osborne a développé une première classification des protéines du blé basée sur
leur solubilité respective dans l’eau (albumines), les solutions salines neutres (globulines), les
mélanges hydro-alcooliques (gliadines) et les solutions acides ou alcalines (gluténines solubles).
Le résidu insoluble après extraction séquentielle avec les solutions précédemment citées
constituant la fraction gluténine insoluble.
22
Chapitre I
Par la suite, une autre classification basée sur les caractéristiques moléculaires des protéines
de réserve du blé, notamment leur capacité de polymérisation et leur composition en acides
aminés a été proposée (Shewry et al., 1986). Les protéines sont classées en deux groupes
principaux : les gliadines monomériques et les gluténines polymériques, puis en trois sousgroupes en fonction de leur teneur en soufre. Les deux classifications sont regroupées dans la
Figure I-8. Les prolamines pauvres en soufre représentent 10 à 12% des prolamines totales. Ce
sont exclusivement des protéines monomériques de type
-gliadines, caractérisées par des
masses moléculaires comprises entre 44 et 78 kDa (Shewry & Tatham, 1990). Les prolamines
riches en soufre représentent environ 70 % des prolamines totales. Elles sont caractérisées par
des masses moléculaires comprises entre 20 et 45 kDa. Ce groupe est constitué des !-" et #gliadines, ainsi que des sous unités de gluténines de faible poid moléculaire (SG-FPM). Enfin, les
prolamines de haut poid moléculaire, intermédiaires en soufre, que l’on peut séparer en deux
sous groupes : les sous unités de gluténines de hauts poids moléculaires (SG-HPM) de type x et
de type y, qui chez Triticum aestivum (blé tendre) représentent environ 20 % de la fraction
totale des prolamines (Halford et al., 1992). Leurs masses moléculaires (estimation d’après la
séquence et après élimination du peptide signal) sont comprises entre 67 (type y) et 88 kDa
(type x).
23
Protéines de réserve
(80-85%)
Protéines métaboliques
(15-20%)
Albumine
Globuline
Solubles
dans l’eau
Solubles dans
solutions
salines
Gliadine (30-40%)
monomérique
Solubles dans
éthanol 70%
- gliadine
Shewry et al. (1986)
Osborne (1907, 1924)
Protéines de blé
"- gliadine
Gluténine (40-50%)
polymérique
Solubles dans
Insolubles
solutions acides
ou bases diluées
SG-FPM
- - gliadine
SG-HPM
type x
type y
!- gliadine
Prolamines
pauvres en soufre
Protéines fonctionnelles
Prolamines riches
en soufre
Prolamines de haut
poids moléculaire
Protéines du gluten
Figure I-8. Classification des protéines du blé. Comparaison des classifications d'Osborne (1907)
et de Shewry et al. (1986).
3.1.1. La gliadine
La gliadine représente environ 45% des protéines de réserve du blé. Elle est constituée d’un
grand nombre de polypeptides répartis en quatre groupes : , !, " et # en fonction de leur
mobilité décroissante, lors d’un fractionnement sur gel d’électrophorèse en milieu acide, et par
ordre croissant de poids moléculaire (Woychik et al., 1961). Les -, !- et "-gliadines présentent
un poids moléculaire de l’ordre de 30-45 kDa avec des pHi compris entre 6,5 et 8, tandis que les
#-gliadines se distinguent par un poids moléculaire plus élevé, allant jusqu’à 75 kDa et des pHi
compris entre 5 et 7 (Feillet, 2000, Shewry & Halford, 2002). Les séquences primaires des - et
!-gliadines sont très proches, c’est pourquoi elles sont souvent regroupées sous un terme
unique de gliadines de type
ou encore -! gliadines. Les gliadines contiennent principalement
des résidus glutamine et proline (Bushuk & Wrigley, 1974) et sont typiquement pourvues d’un
nombre pair de résidus cystéine. Toutefois, plusieurs auteurs rapportent l’existence de
gliadines modifiées, présentant un nombre impair de cystéines et donc capables de former des
ponts disulfure inter-chaînes. De ce fait elles se trouvent impliquées dans les polymères de
gluténines (Masci et al., 1993, Masci et al., 1999).
24
Chapitre I
Les gènes codant pour les gliadines sont situés sur le bras court des chromosomes des
groupes homéologues 1 et 6 des génomes A et B et leurs loci sont nommés respectivement Gli1 et Gli-2, (Joppa et al., 1983).
3.1.2. La gluténine
La gluténine représente 40 à 50% des protéines de réserve du blé. Elle se présente sous la
forme de polymères polydisperses stabilisés par des liaisons disulfures intermoléculaires qui
peuvent atteindre des tailles supérieures à 1 million (Wrigley, 1996). L’encombrement
moléculaire de ces polymères allié à leur faible densité de charge et leur propension à interagir
rendent difficile leur analyse par les techniques biochimiques classiques. Ce sont des
assemblages protéiques insolubles dans l’eau et l’éthanol et solubilisés en présence d’agents
fortement dissociant comme l’urée (Pomeranz, 1965) ou le dodecyl sulfate de sodium (SDS)
(Graveland et al., 1979). Les polypeptides qui composent les gluténines sont appelés sousunités de gluténines, sont libérés après l’action d’agents réducteurs de ponts disulfures et sont
également insolubles dans les tampons classiques, seuls les solvants protéiques polaires
assurent leur mise en solution. Ces sous-unités sont séparées en deux sous-groupes, les SGFPM (poids moléculaire compris entre 30 et 45 kDa) et les SG-HPM (poids moléculaire compris
entre 70 et 90 kDa).
Les SG-FPM se rapprochent des gliadines par leur composition, leur structure secondaire et
leurs propriétés physico-chimiques (Payne & Corfield, 1979, Tatham et al., 1987). Les SG-FPM
séparées par SDS-PAGE ont été subdivisées en trois groupes (B, C et D). Le groupe B, le plus
abondant, inclut trois types de sous-unités appelés s-, m- et i-. Ces sous-unités diffèrent par
leurs séquences qui présentent respectivement des résidus sérine, méthionine et isoleucine en
position N-terminale. Le groupe D inclurait des #-gliadines ayant acquis un résidu cystéine
(D'Ovidio & Masci, 2004). Le groupe C est constitué de sous-unités présentant un faible
encombrement (<35 kDa).
En se basant sur les caractéristiques structurales des groupes B, C et D, Kasarda (1989) a
suggéré l’existence de deux types de SG-FPM. Le premier type, qui englobe principalement les
SG-FPM de type B, aurait la capacité de former deux ponts disulfures intermoléculaires
permettant l’extension des polymères de gluténines. Le second type, présent parmi les SG-FPM
25
de type C et D, ne posséderait qu’un seul résidu cystéine et pourrait jouer un rôle dit de
terminaison.
Les SG-HPM présentent un poids moléculaire compris entre 70 et 90 kDa. Comparativement
aux SG-FPM, elles incluent un nombre limité d’espèces moléculaires, avec en général 2 à 3
sous-unités pour les blés Triticum turgidum durum, contre 4 à 5 pour Triticum aestivum. Chez
ces deux espèces, elles représentent respectivement 5 à 10% des protéines totales. Les SG-HPM
sont classées en type x et y selon leur structure primaire et le nombre de résidus cystéines
présents dans leurs séquences, en général pair pour les types x et impair pour les types y.
Les gènes codant pour les SG-HPM sont situés sur le bras long des chromosomes 1A et 1B,
qui sont liés aux loci Glu-A1 et Glu-B1 dans le cas du blé dur, et en plus au locus Glu-D1 dans le
cas du blé tendre. Chacun de ces loci code pour une sous-unité de type-x et de type-y. Les loci
Glu-A3, Glu-B3 et Glu-D3, ce dernier en plus pour le blé tendre, sont situés sur le bras court des
chromosomes 1 et sont les loci majeurs des SG-FPM. Plus complexes, ils codent pour un
nombre plus important de composés. Trois à cinq SG-HPM et 15-20 SG-FPM différentes sont
identifiées en électrophorèse 2D pour les blés hexaploïdes (Lew et al., 1992).
3.2. Protéines et qualité technologique du blé dur
Nous n’envisagerons brièvement ici, que l’impact des protéines de réserve dans le
déterminisme de la qualité d’usage des blés et ceci en cohérence avec notre travail davantage
consacré à l’étude du développement du grain, à l’accumulation des protéines et à
l’assemblage des polymères de gluténine.
Le blé dur est principalement consommé sous forme de semoule et de pâtes alimentaires. Le
rendement en semoule (valeur semoulière des grains) et l’aptitude des semoules à fournir des
pâtes de qualité (valeur pastière), sont les deux paramètres critiques du potentiel de qualité
des grains. Le rendement semoulier varie selon le poids du grain et sa vitrosité, alors que la
qualité pastière dépend de la composition qualitative et quantitative en protéines.
La teneur en protéines est un critère de qualité fréquemment utilisé dans les échanges
commerciaux. Elle est en effet essentielle à plus d’un titre dans la mesure où, fréquence du
mitadinage et teneur en protéine sont des paramètres inversement reliés (Dexter et al., 1988,
Dexter et al., 1989, Samson et al., 2005). Différents facteurs semblent être à l’origine du
26
Chapitre I
mitadinage, d'une part des facteurs environnementaux : apport azoté, climat, sol et d’autre
part des facteurs génétiques. Selon Dexter et al. (1989), le mitadinage serait lié à une
diminution du contenu protéique du grain du fait d’un déficit de fertilisation azotée. Selon
Matveef (1963), le rapport protéine sur amidon serait critique afin de saturer l’espace intergranulaire, en l’absence de quoi on assisterait à la formation de vacuoles d'air au sein de
l'albumen qui devient poreux et d’aspect blanc caractéristique.
Les propriétés viscoélastiques des pâtes alimentaires sont en grande partie déterminées par
les propriétés fonctionnelles des protéines de réserve du blé qui, à l’état hydraté, s’associent
pour former une masse viscoélastique : le gluten. L’élasticité et la ténacité du gluten sont
associées à la gluténine alors que la viscosité et l'extensibilité sont associées à la teneur en
gliadine (Wall, 1979). Cette dernière constitue une phase "diluante" des gluténines. En agissant
comme un compétiteur des liaisons intermoléculaires entre les polymères de gluténine, elle
contribuerait à diminuer l’élasticité du gluten et à en augmenter l’extensibilité.
L’élasticité du polymère de gluténines dépend de la nature des sous-unité entrant dans sa
composition (MacRitchie et al., 1991, Gupta et al., 1992, Khatkar et al., 2002). Bien que les SGHPMne représentant pas plus de 10% des protéines totales ou encore 20% de la fraction
gluténine chez le blé tendre, elles influent directement sur la qualité de la pâte en panification
et sont considérées comme responsables pour 45-70% de la variation de la performance
boulangère des blés européens (Branlard & Dardevet, 1985, Payne et al., 1987). Par ailleurs,
l’encombrement en taille des polymères, évalué notamment à travers la fraction de polymères
insolubles dans les solutions de SDS, est un facteur clef de l’élasticité du gluten (Singh et al.,
1990b, MacRitchie et al., 1991, Gupta et al., 1992, Popineau et al., 1994, Flagella et al., 2010).
L’encombrement en taille des polymères de gluténines et leur contenu en SG-HPM sont
d’ailleurs des paramètres fortement liés (Popineau et al., 1994). La situation est différente chez
le blé dur où l’absence du génome D entraîne une diminution de la proportion de SG-HPM.
L’effet est également qualitatif puisque avec la disparition du locus Glu-1D ce sont les SG-HPM
qui deveiennent les plus importantes pour l’élasticité des gluténines qui disparaissent.
Dans le cas des blés durs et contrairement au blé tendre, la qualité viscoélastique du gluten a
surtout été évaluée après traitement thermique. A cru, les glutens de blé dur présentent une
élasticité et une ténacité nettement inférieures à celles des glutens de blé tendre. Par contre,
27
après un traitement thermique, la classification s’inverse et les glutens de blé dur s’avèrent plus
tenaces et élastiques (Damidaux et al., 1978). Les propriétés rhéologiques des glutens de blé
dur thermoformés sont directement liées à leur composition et à leur teneur en SG-FPM. Ce
sont les SG-FPM du groupe B codées par le locus Glu- B3 qui exercent l’effet le plus marqué
(Masci et al., 2000, Edwards et al., 2003, D'Ovidio & Masci, 2004, Edwards et al., 2007). D’un
génotype à l’autre, la différence de qualité rhéologique du gluten serait davantage liée aux taux
d’expression des sous-unités selon les allèles, plutôt qu’à des différences structurales (Autran et
al., 1987, Morel & Autran, 1990).
3.3. Séquences et caractéristiques structurales des prolamines
3.3.1. Structures primaires et secondaires
Les prolamines partagent des caractéristiques structurales communes. Leur structure
primaire peut être subdivisée en domaines distincts dont certains sont constitués par des
séquences de 6 à 8 acides aminés répétés ou alors des séquences enrichies par un acide aminé
spécifique (i.e. méthionine) (Shewry & Halford, 2002).
Les séquences primaires de gliadine se composent de deux domaines distincts : un domaine
N-terminal composé de séquences répétées et un domaine C-terminal non répétitif. Le
domaine répétitif est fait de séquences basées sur des motifs riches en proline (P) et en
glutamine (Q) ; ce domaine représente la quasi totalité de la séquence des protéines pauvres en
soufre (Figure I-9A) (Shewry et al., 1995). Le domaine non répétitif contient la quasi-totalité des
résidus cystéine. Huit cystéines sont présentes chez les "-gliadines contre (Figure I-9B) six chez
les -gliadine (Shewry & Tatham, 1990). Dans tout les cas, ces résidus sont engagés dans des
ponts disulfures intramoléculaires. En raison de leur caractère monomérique et de l'absence de
groupements sulfhydriles, il a été proposé que les 6 résidus cystéine des -gliadines étaient
engagés dans des ponts disulfures intramoléculaires (Kasarda et al., 1987). Par la suite, les
travaux de Müller et Wieser (1995) ont mis en évidence que ces ponts intramoléculaires
s’établissent entre les cystéines 1 et 4, les cystéines 5 et 7 et entre les cystéines 6 et 8 (Figure
I-10).
28
Chapitre I
13
251
A
PQQPFQ
12
B
261
125
PQQPFQ
276
1 2
3
4 5 6
7 8
Figure I-9. Représentation schématique des structures primaires des prolamines (Shewry &
Halford, 2002). A) Exemple d’une prolamine pauvre en soufre : #-gliadine. B) Exemple d’une
prolamine riche en soufre : "-gliadine. P : proline ; Q : glutamine ; F : phénylalanine. Les ponts
disulfures intramoléculaires sont schématisés en rouge.
95
PQQPY/ QPPPFP
266
1
4 5 6
7 8
Figure I-10. Représentation schématique de la structure primaire des -gliadines (Shewry &
Tatham, 1990). Le domaine répétitif, permettant d’identifier deux motifs conservés, est basé
sur les séquences proposées par (Kasarda et al., 1984).
L’analyse de la structure secondaire des gliadines réalisée par dichroïsme circulaire a mis en
évidence que les gliadines riches en soufre ( -, !- et "-gliadines) ont une conformation
différente de celle des gliadines pauvres en soufre (# gliadines). En général, les gliadines ont
une structure globulaire plus riche en hélices
qu’en coudes !, sauf les #-gliadines qui ont une
structure secondaire riche en coudes !. Les polypeptides sont structurés par des liaisons
hydrogènes, les liaisons disulfures intramoléculaires assurant le maintient du repliement de la
chaîne (Tatham & Shewry, 1985, Shewry & Tatham, 1990). Plus spécifiquement, les - et !gliadines possèdent un domaine N-terminal qui contient la majorité des coudes !, le domaine
C-terminal est constitué d’hélices
et est plus compact.
En ce qui concerne les SG-FPM, la structure générale a été revise, et un nouveau modèle a
été proposé par (D'Ovidio & Masci, 2004). Cette structure présente un peptide signal de 20
acides aminés, une courte région N-terminale (13 aa) qui contient généralement le premier
résidu cystéine, un domaine répétitif riche en glutamine et une région C-terminale. Cette
dernière région peut être subdivisée en trois : une région riche en cystéine contenant 5 résidus
cystéine, une région riche en glutamine contenant 1 résidu cystéine et enfin une région Cterminale conservée contenant la dernière cystéine (Figure I-11).
29
Figure I-11. Schéma proposé pour des structures typiques de SG-FPM de type m et s (A) et type
i (B) (d'après D'Ovidio & Masci, 2004). Les cystéines sont désignées selon le système de lettres
proposé par Köhler et al. (1993). Les astérisques entourés (SH) représentent les cystéines
tenues pour former des ponts disulfures intermoléculaires et les astérisques encadrés indiquent
les cystéines supplémentaires signalées dans les SG-FPM de type-i.
En général, les SG-FPM possèdent 8 résidus cystéine, dont 6 sont engagés dans des ponts
disulfures intramoléculaires. Des études portant sur l'analyse des peptides cystines dérivés de
fractions de gluténines ont mis en évidence des informations importantes sur la cartographie
des ponts disulfures intra et intermoléculaires des SG-FPM (Köhler et al., 1993, Keck et al.,
1995, Müller et al., 1998). Il est donc bien établi que ces sous-unités contiennent six résidus
cystéines impliqués dans des ponts disulfures intramoléculaires et deux résidus cystéines qui
sont susceptibles d'être impliqués dans des ponts disulfures intermoléculaires, à savoir le
premier (Cb) et le septième (Cx) (Figure I-11). Ces résidus sont entourés par des régions de
grande flexibilité, ce qui pourrait favoriser la polymérisation (Masci et al., 1998, D'Ovidio &
Masci, 2004).
La structure secondaire des SG-FPM comporterait 37% d’hélices , 15% de feuillets !, 28%
de coudes ! et 20% de structures aléatoires. Tatham et al. (1987) ont proposé un domaine Nterminal qui serait le plus riche en coudes !, répartis inégalement tandis que les hélices
seraient prédominantes dans le domaine C-terminal, considéré comme le plus compact (Masci
et al., 1998).
Toutes les SG-HPM ont une structure similaire, avec des domaines non-répétitifs aux
extrémités N-terminales (81 à 104 résidus) et C-terminales (42 résidus) encadrant un long
domaine répétitif central (627 à 827 résidus) (Shewry et al., 2002). Les domaines non-répétitifs
N- et C-terminaux ont une structure globulaire principalement en hélices
et ils entourent le
domaine répétitif central, de longueur moyenne estimée à 500 Å, qui possède une
30
Chapitre I
conformation en spirale basée sur la présence de coudes ! (Tatham et al., 1990, Shewry et al.,
2002).
Les cystéines sont majoritairement dans le domaine non-répétitif. Les sous-unités de type x
possèdent quatre résidus cystéine conservés (3 dans le domaine N-terminal, 1 dans le domaine
C-terminal), et les sous-unités de type y contiennent généralement sept résidus cystéine
conservés (5 dans le domaine N-terminal, 1 dans le domaine répétitif et 1 dans le domaine Cterminal) (Figure I-12). Entre les différentes SG-HPM, les domaines C-terminaux ne diffèrent
que par des substitutions. C’est par exemple le cas de la sous-unité 1Bx20, largement présente
chez le blé dur (Branlard et al., 1989), qui diffère des autres sous-unités de type x. Elle ne
contient qu’un seul résidu cystéine dans les 47 premiers acides aminés du coté N terminal, les
deux autres étant remplacés par des tyrosines (Y) (Tatham et al., 1991, Shewry et al., 2003b)
(Figure I-13). Les travaux de Köhler et al. (1993) ont mis en évidence que le premier et le
deuxième résidu cystéine de SG-HPM de type x sont impliqués dans un pont disulfure
intramoléculaire et n’ont pas d’implication dans la formation de polymères. A l'inverse, le
troisième et le quatrième, respectivement présents dans les parties N- et C-terminales, seraient
impliqués dans la formation de ponts intermoléculaires. En accord avec ces résultats, les deux
résidus de la SG-HPM 1Bx20 seraient donc impliqués dans des ponts disulfures
intermoléculaires.
Figure I-12. Schéma synthétique des séquences des SG-HPM de type x et y, d’après (Shewry et
al., 2002).
31
N
C
Y38 Y53
Cys31
Cys783
Figure I-13. Représentation schématique des positions des résidus cystéine dans la structure
primaire de la SG-HPM 1Bx20 d’après les séquences présentées par Shewry et al. (2003b).
3.3.2. Modalités d’appariement des sous-unités gluténine
Une approche utile pour obtenir des informations sur les modalités d'appariement des
différentes sous-unités a été l’analyse des produits de la réduction partielle ou progressive des
liaisons disulfures stabilisant les polymères. Partant d'un gluten partiellement réduit et alkylé,
des dimères de SG-HPM ont été isolés (Lawrence & Payne, 1983, Werner et al., 1992). Ces
dimères se sont révélés majoritairement formés d’une SG-HPM de type x et d'une autre de type
y, plutôt que par deux SG-HPM de type x tandis que des dimères y-y n’ont jamais été identifiés.
Les travaux de Tao et al. (1992) ont par ailleurs mis en évidence la formation de liaisons
intermoléculaires spécifiques entre l’extrémité C-terminale des SG-HPM de type x et l’extrémité
N-terminale des SG-HPM de type y. De ces études découle l’hypothèse que les dimères x-y des
SG-HPM pourraient fonctionner comme des « briques élémentaires » dans les polymères de
gluténines (Figure I-14) (Shewry et al., 2003c).
L’étude de la cartographie des ponts disulfures intra- et intermoléculaires des gluténines a
été entreprise par quelques chercheurs et notamment Köhler et son équipe (Köhler et al., 1991,
1993, Keck et al., 1995, Köhler et al., 1996). L’approche, très lourde, consiste à isoler des
peptides issus de l’attaque protéolytique de fractions protéiques enrichies en gluténines. On
identifie alors les peptides porteurs d’une liaison disulfure en RP-HPLC (par exemple en
observant leur changement d’élution et après réduction des disulfures) puis on réalise l’analyse
de leur séquence. On cherche ensuite à affecter cette séquence à celle de SG dont la structure
primaire est établie. C’est ainsi qu’il a été possible de décider sans ambiguïté de l’engagement
intramoléculaire ou intermoléculaire de cystéines portées par des SG-HPM 1Bx et 1By. Il s'agit
notamment d’un pont disulfure intramoléculaire entre la Cys 10 et la Cys 17 dans la région Nterminale de la SG-HPM 1Bx7, un pont disulfure intermoléculaire entre un résidu cystéine de la
région répétée des SG-HPM 1By9 (Cys 564) ou 1Dy10 (Cys 507) et une SG-FPM et un pont
32
Chapitre I
disulfure intermoléculaire entre deux cystéines adjacentes (Cys 44, Cys 45) dans les régions Nterminales de deux SG-HPM de type y (1By9 et 1By10).
N
SG-HPM de type x
SG-FPM
C
N
SG-HPM de type y
C
N
SG-HPM de type y
C
Figure I-14. Schéma d’association des SG-HPM et des SG-FPM et localisation des ponts
disulfures identifiés d’après Shewry et. al (2003c).
3.3.3. Modèle structural global des polymères de gluténines
De nombreux modèles ont été proposés pour rendre compte de la structure polymérique de
la gluténine. Néanmoins, aucun des modèles proposés ne fait actuellement l’unanimité et
l’organisation moléculaire des polymères de gluténines n’est toujours pas connue du fait,
principalement, de leur solubilisation difficile et de la grande diversité des sous-unités de
gluténines entrant dans leur composition (Kasarda et al., 1976). Les polymères de gluténines
seraient stabilisés par des liaisons de faible énergie (i.e. liaisons hydrogènes non-covalentes et
hydrophobes)
et
par
des
liaisons
covalentes5,
notamment
les
ponts
disulfures
intermoléculaires. Le nombre de résidus cystéine et leur position dans la structure primaire des
différentes sous-unités gluténine joueraient un rôle déterminant sur la taille et la structure
finale des polymères de gluténine (Morel & Bonicel, 1996a, Lafiandra et al., 1999).
Ewart (1968) fut l’un des premiers à fournir des preuves de la présence d'un arrangement
largement linéaire de plusieurs sous-unités de gluténine au sein d’un polymère de gluténine
sans toutefois exclure la possible existence de ramifications.
Khan et Bushuk (1979) en se basant sur l’encombrement en taille et la composition en sousunités de polymères de gluténine extraits par des solvants plus ou moins dénaturants ont
5
D’autres types de liaisons covalentes ont été proposés dans la littérature, comme les liaisons de type tyrosine
formées spécifiquement entre deux résidus tyrosine (TyrTyr) présents dans les motifs répétés des SG-HPM (Tilley
et al., 2001).
33
proposé un modèle reposant sur l’existence de deux types de complexes de type I et II. Dans ce
modèle, le complexe de type I comprend uniquement des sous-unités de poid moléculaire
inférieur à 68 kDa, maintenues agrégées par des liaisons hydrogène et des interactions
hydrophobes. Le complexe de type II inclus des SG-FPM et des SG-HPM liées par des liaisons
disulfures intermoléculaires et stabilisées par des liaisons non-covalentes extrêmement fortes.
Les complexes de type I interagirait avec les types II par l’intermédiaire de liaisons
hydrophobes.
Graveland et al. (1985) ont formulé l'hypothèse que les polymères de gluténine sont
construits autour d’un squelette linéaire de SG-HPM liées par leurs extrémités terminales avec
une alternance de SG-HPM de type x et y. Sur cet enchaînement linéaire, les SG-FPM
viendraient se brancher en se connectant avec les SG-HPM de type y, qui possèdent un nombre
impair de cystéines.
Kasarda (1989) a proposé un autre modèle basé sur les connaissances disponibles sur les
structures et la composition des sous-unités de gluténine. Ce modèle propose que les cystéines
des extrémités des SG-HPM de type-x et de type-y forment des ponts intermoléculaires par
l’intermédiaire d’une ou plusieurs SG-FPM. Il a également suggéré que ce mode de
polymérisation aléatoire ne serait pas favorable à la formation de longues chaînes de SG-HPM
dans la mesure où le nombre de SG-FPM est six fois supérieur au nombre de SG-HPM.
3.4. Dynamique d’assemblage des protéines de réserve
3.4.1. Biosynthèse, routage et formation de corpuscules protéiques
Toutes les protéines de réserve des céréales sont synthétisées au niveau du réticulum
endoplasmique (RE). Au départ ces protéines possèdent un peptide ou séquence-signal localisé
dans la partie N-terminale de la séquence protéique. Ce peptide contient les informations
nécessaires pour le routage des protéines, permettant la translocation de la chaîne
polypeptidique dans la lumière du RE. Les protéines se condensent dans le RE avant d’être
acheminées, via des vésicules, vers leurs lieux de stockage et ce après avoir transitées ou non
dans l’appareil de Golgi. Dans la lumière du RE les protéines de réserve subissent des étapes de
repliement (folding) catalysées par des protéines chaperonnes et des protéases (DuPont et al.,
1998). Parmi ces molécules, la BiP (binding protein) et la PDI (protéine disulfure isomérase)
34
Chapitre I
seraient impliquées dans la maturation des protéines de réserve du blé et l’établissement de
ponts intramoléculaires qui stabilisent leur structure tertiaire (Li et al., 1993, DuPont et al.,
1998). Néanmoins, il est encore difficile de savoir si ces molécules participent seulement au
repliement des protéines ou encore à leur condensation.
Chez le blé, durant le développement du grain, les protéines de réserve s’accumulent sous la
forme de corpuscules protéiques (CP) avant la formation d’une matrice protéique (Pernollet &
Camilleri, 1983). Néanmoins, les voies de synthèse de ces CPs sont très complexes et peuvent
varier en fonction de l’espèce végétale considérée et du stade de développement de l’albumen
(Tosi et al., 2009).
Chez d'autres céréales comme le maïs (Larkins & Hurkman, 1978), le riz (Krishnan et al.,
1986) et l’avoine (Lending et al., 1989) les protéines de réserve s'accumulent directement dans
la lumière du RE sous forme d’accrétions internes entourées d’une membrane d’origine
réticulaire avec peu d’évidence de transport ou de transfert vers la vacuole (Shewry & Halford,
2002).
Dans le cas du blé, le routage subcellulaire des protéines de réserve jusqu’aux vacuoles a été
étudié de façon exhaustive. Les techniques d’immunomarquage ont largement été utilisées
pour révéler à partir de coupes de grains de blé immatures et au niveau ultrastructural, le
dépôt des protéines de réserve (Parker et al., 1990, Bechtel et al., 1991, Stenram et al., 1991).
Ces travaux ont mis en évidence deux voies de routage des protéines de réserve et donc de
formation des CPs qui peuvent coexister (Levanony et al., 1992, Rubin et al., 1992, Tosi et al.,
2009). Une voie implique le transport des protéines sécrétées à travers le système
endomembranaire avant leur transfert, via l’appareil de Golgi, vers les vacuoles (Bechtel et al.,
1982, Kim et al., 1988, Loussert et al., 2008). La seconde voie, qui semblerait plus spécifique des
protéines de réserve du blé, implique la production par le RE de vésicules dont le contenu serait
déchargé dans les vacuoles sans transit via l’appareil de Golgi par un processus similaire à
l’autophagocytose (Levanony et al., 1992, Herman & Larkins, 1999) (Figure I-15).
35
Figure I-15. Schéma conceptuel de l’ontogénie des corpuscules protéiques et de la vacuole de
stockage protéique (PSV) (Herman & Larkins, 1999).
Les travaux cités précédemment démontrent que la plupart des protéines de réserve du blé
sont stockées dans des CPs qui dérivent directement du RE (Levanony et al., 1992, Galili et al.,
1993). Néanmoins, deux types de CPs ont été mis en évidence lors d’isolements par
fractionnement subcellulaire : des CPs légers contenant des gliadines et des CPs lourds
contenant des gluténines (Rubin et al., 1992). En outre, à partir de ces travaux il a été proposé
que les gliadines seraient principalement transportées via l’appareil de Golgi (Kim et al., 1988,
Rubin et al., 1992) alors que les sous-unités de gluténines seraient principalement dans les CPs
RE-dérivés (Levanony et al., 1992, Rubin et al., 1992, Galili et al., 1993). D’où l’hypothèse,
proposée par Shewry (1999), que le choix d’une voie ou l’autre dépendrait des propriétés de
solubilité ou de stabilité des protéines de sorte que, les protéines monomériques comme les
gliadines, seraient facilement transportées via l'appareil de Golgi, alors que les polymères de
gluténines ne le seraient pas. D’Ovidio et Masci (2004) suggèrent que les SG-FPM de type B, les
plus abondantes et capables de former des ponts disulfures intermoléculaires, suivraient cette
dernière voie.
36
Chapitre I
Pendant longtemps, les questions de savoir si les deux voies de routage étaient
opérationnelles tout au long du développement du grain ou si certaines protéines de réserve ne
seraient pas capables de les utiliser indifféremment, sont restées posées. Les récents travaux
de Loussert et al. (2008) et de Tosi et al. (2009) ont permis de dégager l’hypothèse que le
routage des protéines de réserve pourrait être déterminé par le stade de développement de
l’albumen. Pendant la phase précoce du développement du grain, l'appareil de Golgi serait le
principal élément impliqué dans le transport des protéines de réserve (Loussert et al., 2008).
Les travaux de Tosi et al. (2009), basés sur une approche de marquage d'épitopes, ont montré
que la même protéine pouvait être transportée par les deux voies. Dans le cas de grains
immatures, la SG-FPM suit clairement la route via l’appareil de Golgi, mais elle peut aussi,
pendant la phase de remplissage du grain (14 à 16 JAF), s’accumuler dans la lumière du RE.
Loussert et al. (2008) et Tosi et al. (2009) ont également montré que différents types de
protéines de réserve coexistent au sein des même CPs. Les travaux de Loussert et al. (2008),
menés à différents stades du développement du grain et utilisant l'immunomarquage des CPs
avec des anticorps polyclonaux et monoclonaux spécifiques des différentes classes de
prolamines, mettent en évidence la co-localisation de gliadines et de gluténines au sein du
même CP, sans distribution spatiale particulière (Figure I-16). Cependant, Tosi et al. (2009) ont
montré que certains CPs riches en SG-HPM contenaient peu ou pas de gliadines et que cette
ségrégation était conservée même après la fusion des CPs et la formation de la matrice
protéique.
37
A
B
C
D
Figure I-16. Double immunolocalisation des prolamines dans les corpuscules protéiques de
l’albumen de grains en développement. Les flèches vides (petites particules) indiquent les /!gliadines (anticorps monoclonaux) et les flèches pleines (grosses particules) les diverses
prolamines (anticorps polyclonaux). A) anti-"-gliadines ; B) anti-SG-HPM ; C) anti-#-gliadines ; D)
anti-SG-FPM. A, B : 11 JAF ; C, D : 15 JAF. Barre= 0,1 $m (d'après Loussert et al., 2008).
Les corps protéiques peuvent être détectés pendant la phase de divisions cellulaires vers 6-7
JAF (Bechtel et al., 1982). Dans les travaux de Loussert et al. (2008) l’ontogénie des CPs a été
étudiée pendant le développement du grain de blé tendre entre 7 et 43 JAF. Pendant la phase
de divisions cellulaires, les CPs sont nombreux et de petite taille (diamètre apparent moyen de
1,25 µm). Tout au long du développement de l’albumen les CPs augmentent en taille et en
nombre jusqu’à atteindre des diamètres de l’ordre de 10 $m. Aux environ de 15 JAF, des
agrégats de CPs sont observés dans la zone centrale des cellules. Pendant le remplissage du
grain, ces corpuscules et les grains d’amidon occupent la quasi-totalité du compartiment
cellulaire. A partir de 21 JAF les CPs fusionnent petit à petit par des processus encore mal
connus et vers la maturité physiologique ces corpuscules disparaissent. Dans le grain mûr on ne
distingue plus qu’une matrice protéique englobant les grains d’amidon.
En accord avec ces données, avant la maturité physiologique les grains immatures
présentent dans le cytoplasme l‘intégrité des ses organites cellulaires (i.e. RE, appareil de Golgi)
et aussi des corps protéiques intacts et délimités. Comme l’ont montré les travaux de Carceller
(2000), l’application d’une dessiccation artificielle à 21 JAF altère complètement l‘ultrastructure
cellulaire et fait disparaître les organites. Ces travaux suggèrent qu’une déshydratation
38
Chapitre I
prématurée peut conduire à la formation d’une matrice protéique, semblable au grain muri
naturellement.
En résumé, il ressort de ces travaux que le routage des différentes protéines de réserve reste
sujet à débats. Par ailleurs, le lien entre le routage et la maturation des protéines de réserve
(repliement et assemblage) reste à établir.
3.4.2. Accumulation des protéines de réserve au cours de la croissance du grain
De nombreux auteurs ont étudié l’accumulation et la polymérisation des gluténines au cours
du développement du grain de blé tendre (Johansson et al., 1994, Gupta et al., 1996, Stone &
Nicolas, 1996b, Carceller & Aussenac, 1999, 2001a, Daniel & Triboï, 2002, Rhazi et al., 2003a,
Shewry et al., 2009b), les travaux conduits sur le blé dur étant plus rares. Ceux-ci ont montré,
par analyse de profils électrophorétiques, que toutes les fractions protéiques ( -, !-, "gliadines, #-gliadines et les SG-FPM et HPM, ainsi que les albumines) étaient synthétisées
simultanément (Galterio et al., 1987, Bénétrix et al., 1994). Les travaux conduits sur le blé
tendre ont également montré qu’entre 5 et 13 JAF, la synthèse des SG-HPM se produit en
même temps que celle des SG-FPM et des gliadines, selon le génotype et les conditions de
croissance (Johansson et al., 1994, Gupta et al., 1996, Carceller & Aussenac, 1999, DuPont &
Altenbach, 2003, Abonyi et al., 2007) et se poursuit jusqu'à l’entrée en dessiccation du grain. En
outre, il a été montré par une analyse des populations d'ARNm (par RT-PCR) que les gènes
individuels des SG-HPM et au moins sept gènes de SG-FPM, présentent des profils temporels de
régulation identiques (Altenbach et al., 2002).
En revanche, Panozzo et al. (2001) ont signalé que les SG-FPM ne sont synthétisées en
quantités significatives qu’après 14 JAF, clairement après les SG-HPM. Plus récemment des
travaux utilisant une procédure plus précise que l'analyse densitométrique des gels SDS-PAGE
ont confirmé que les transcrits codant pour les SG-HPM précèdent d'environ 2 jours
l'accumulation de ceux codant pour les SG-FPM et les gliadines et continueraient au delà de la
phase d’accumulation de la matière sèche (essentiellement relative à la synthèse d’amidon)
(Shewry et al., 2009b). Selon ces auteurs les différentes fractions de protéines de réserve
(gliadines, SG-FPM, SG-HPM) s'accumulent surtout entre 14 et 35 JAF et selon des profils
relatifs d’accumulation stables (par rapport à la quantité finale de chaque fraction protéique).
39
Des résultats contradictoires sont rapportés par Gupta et al. (1996) qui soulignent que le
rapport entre SG-HPM et SG-FPM augmente au cours du développement du grain.
3.4.3. Formation des polymères de gluténines
3.4.3.1.
Évolution de la distribution en taille des gluténines
La synthèse de la gluténine et la formation des polymères débutent dès 7 JAF durant la
phase de cellularisation (Gupta et al., 1996). La formation des polymères de gluténines peut
être suivie par analyse de leur croissance en taille. Différentes techniques sont utilisées pour
cela : SDS-PAGE en condition non-réductrice (Wrigley et al., 1998), SE-HPLC (Dachkevitch &
Autran, 1989, Morel et al., 2000a, Carceller & Aussenac, 2001b) et FFF (Fractionnement par
couplage flux-force) (Stevenson & Preston, 1996, Wahlund et al., 1996, Rhazi et al., 2003b).
Dans la plupart des cas on a recours à une extraction par le SDS afin de maximiser l’extraction
des polymères de gluténines. Toutefois, le profil de distribution en taille des polymères solubles
n’est souvent pas correctement évalué par SE-HPLC car les colonnes classiquement utilisées
(TSK 4000 de Tosoh Bioscience, Biosep-SEC 4000 de Phenomenex) excluent les fractions de plus
grandes tailles (supérieures à 600 kDa) (Shewry et al., 2009a). Par ailleurs, la distribution en
taille du matériel insoluble dans le SDS reste inatteignable et seule la proportion de ces
polymères est accessible à l’analyse après réduction (i.e. DTT) ou sonication (Singh et al.,
1990a). Le ratio entre polymères insolubles et polymères totaux est donc souvent utilisé
comme critère d’estimation du taux de polymérisation des gluténines (Gupta et al., 1993). Un
profil de tamisage moléculaire des fractions SDS-solubles et SDS-insolubles de protéines de blé
est donné en exemple dans la Figure I-17.
40
Chapitre I
UV (214 nm) Unité arbitraire
F4
F5
F3
F1
F2
8
10
12
14
Temps de retention (min)
16
18
Figure I-17. Exemple de profil SE-HPLC de protéines SDS-solubles (—) et SDS-insolubles (—) de
grain de blé dur mature. Les profils chromatographiques des protéines solubles sont découpés
en cinq fractions selon leur distribution en masse moléculaire (Dachkevitch & Autran, 1989). On
distingue les fractions F1 et F2 incluant les plus gros polymères (145.000<Mr<2.500.000), F3 qui
contient les fractions oligomériques et monomériques (78.000<Mr<145.000), F4 incluant les
protéines monomériques (17.000<Mr<78.000) et F5 constitué des petites protéines
monomériques (7.000<Mr<17.000) selon Morel et al. (2000a).
Panozzo et al. (2001) ont étudié pour quatre variétés de blé tendre, cultivées au champ dans
différentes conditions environnementales, l’évolution des différentes fractions protéiques au
cours de la croissance du grain. De cette étude, il ressort que la proportion de polymères de
taille médiane (> 150 kDa) demeure relativement constante, tandis que celles des petits
polymères diminue significativement. En parallèle, la proportion de polymères de taille
supérieure à 400 kDa, la plus faible au début du remplissage du grain, augmente ensuite
régulièrement. Bénétrix et al. (1994) ont rapporté pour le blé dur, une évolution similaire de la
croissance en taille des polymères de gluténines.
Ces différents auteurs ont proposé que l’augmentation de la taille moléculaire moyenne des
polymères de gluténines pendant le remplissage du grain signalait un processus de
polymérisation continu. La baisse progressive de la proportion des petits polymères au bénéfice
de la croissance des plus gros supporte un tel schéma réactionnel.
Toutefois, des résultats sensiblement différents sont rapportés par Gupta et al. (1996). Ces
auteurs constatent que la formation de polymères insolubles intervient assez tardivement (au
41
delà de 25 JAF). Ils proposent que cette formation nécessite, avant d’être initiée, l’accumulation
d’une concentration seuil en SG-HPM ou en polymères de petite taille (i.e. 60-75%), ou encore
que la formation des polymères insolubles soit sous la dépendance d’un processus de
polymérisation particulier qui ne se met en place que lors des stades tardifs de maturation du
grain. L’étude de différents génotypes a d’ailleurs conduit d’autres auteurs à postuler que la
proportion de polymères insolubles du grain à maturité ne dépendrait que de la teneur en SGHPM devant celle des SG-FPM (Carceller, 2000, Carceller & Aussenac, 2001a).
Reste que l’accumulation des polymères insolubles, a priori ceux dont l’encombrement
moléculaire est maximum, semble un phénomène plutôt tardif, du moins chez le blé tendre.
Ainsi, Carceller et Aussenac (1999) montrent qu’alors que l’accumulation des polymères
solubles s’initie dès 7 JAF, celle des polymères insolubles ne démarre que très tardivement au
cours du développement du grain (30 à 45 JAF), coïncidant avec l’entrée en dessiccation du
grain. De plus, elle s’accompagne d’une augmentation nette de la teneur en polymères totaux.
Plus récemment Shewry et al. (2009a) font état de résultats équivalents montrant que la teneur
globale en polymères augmente à partir de l’entrée en dessiccation du grain. Ces résultats
s’opposent au mécanisme de polymérisation continue rapporté par Panozzo et al. (2001) ou
Bénétrix et al. (1994). Selon nous, ils pourraient indiquer l’existence d’un pool de sous-unités de
gluténines encore non engagées dans des polymères, et ce jusqu’au moment de l’entrée en
dessiccation.
3.4.3.2.
Évolution de l’état d’oxydoréduction des gluténines
Dans la mesure où les polymères de gluténines sont stabilisés par des liaisons disulfures
intermoléculaires, plusieurs auteurs se sont attachés à décrire l’évolution de l’état redox des
protéines au cours du développement du grain. Partant des travaux pionniers de Kobrehel et al.
(1992), plusieurs auteurs ont étudié l’évolution de l’état redox des protéines au cours de leur
accumulation dans le grain, en recourant au monobromobimane (mBBr), un complexant
irréversible et fluorescent des fonctions thiols (Gobin et al., 1997, De Gara et al., 2003, Rhazi et
al., 2003a). Les protéines sont ensuite réduites et séparées par SDS-PAGE ou RP-HPLC (Rhazi et
al., 2003a). Ces travaux montrent que dans le grain immature, seules les albumines/globulines
et les gluténines présentent des fonctions thiols. Les gliadines seraient pour leur part
42
Chapitre I
rapidement repliées après synthèse avec l’établissement des ponts disulfures intramoléculaires
(Rhazi et al., 2003a).
De l’ensemble des ces travaux conduits avec des blés durs et tendres, il apparaît que jusqu’à
28-31 JAF les gluténines présentent des fonctions thiols. La formation de polymères de
gluténines solubles n’entraîne donc pas l’oxydation totale des sous-unités de gluténines.
Gobin et al. (1997) proposent que l’oxydation des gluténines s’initie au moment de la
coalescence des CPs. Rhazi et al. (2003a) montrent quand à eux que la formation des polymères
de gluténines insolubles dans le SDS coïncide avec l’extinction de la fluorescence des
gluténines. Ils observent que la dessiccation artificielle prématurée du grain entraîne la
formation de polymères de gluténines et la disparition des thiols protéiques et ce quel que soit
le stade de croissance du grain. Ils révèlent par ailleurs le rôle critique de l’oxydation des thiols
protéiques dans la conception des polymères, en montrant qu’un marquage du grain par le
mBBr inhibe totalement l’accumulation de polymères de gluténines au cours de la dessiccation
artificielle.
Après avoir proposé que les phénomènes d'oxydation des gluténines jouent un rôle
important lors de la formation de polymères insolubles, Rhazi et al. (2003b) ont entrepris une
étude plus spécifique afin de déterminer l’évolution du tripeptide glutathion ("-glutamylcysteinyl-glycine) (GSH) et ses relations avec la distribution en taille des polymères de blé au
cours du développement du grain. Leur objectif était de déterminer si le GSH était susceptible
d’interférer avec la polymérisation des gluténines.
En effet, l’existence de glutathion lié aux protéines de la farine de blé et en particulier de la
fraction gluténines avait été rapportée par Chen et Schofield (1995) 6. En outre, les travaux de
Köhler et al. (1996) avaient démontré que le GSH ajouté aux pâtes de farine malaxée se
retrouvait presque exclusivement lié aux résidus cystéines des sous-unités de gluténines
proposés pour être impliqués dans la formation des ponts disulfures intermoléculaires.
6
La méthode de dosage développée comprend d’abord l’élimination des formes non liées aux protéines (GSH
et GSSG) par extraction à l’acide, la libération du glutathion lié aux protéines (PSSG) par un réducteur (DTT), puis le
blocage de sa fonction thiol par l’IAA (acide iodoacétique) et son marquage par un composé fluorescent (1-fluoro-2
,4-dinitrobenzène). Les peptides marqués sont ensuite séparés par RP-HPLC. Cette méthode a par la suite été
reprise et adaptée (Rhazi et al., 2003b, Li et al., 2004b).
43
Chez les plantes, le glutathion existe naturellement sous trois formes : la forme réduite
(GSH), la forme oxydée (GSSG) et la forme liée aux protéines (PSSG) et joue un rôle primordial
dans le maintien de l’homéostasie redox du contenu cellulaire. La glutathionylation des
protéines (PSSG) qui est la principale forme de S-thiolation (Kuninori & Matsumoto, 1964,
Sarwin et al., 1992, Chen & Schofield, 1995, Schofield & Chen, 1995) constituerait un
mécanisme de défense contre l’oxydation irréversible des thiols protéiques en dérivés
sulfoniques. C’est en effet une modification à caractère réversible (Kranner & Grill, 1996,
Ghezzi, 2005, Dalle-Donne et al., 2007), notamment sous l’action de la glutathione réductase
(GR).
L’analyse des pools de glutathions réduits et oxydés au cours du développement du grain,
entreprise par Rhazi et al. (2003b) a révélé que le ratio GSSG/GSH augmentait dramatiquement
lors de l’entrée en dessiccation du grain, démontrant ainsi que la dessiccation coïncide avec une
augmentation brutale de l’oxydation du contenu cellulaire. En parallèle, le contenu en
protéines glutathionylées, jusqu’alors quasi nul, croit rapidement et ce jusqu’à la fin de la
dessiccation du grain (Rhazi et al., 2003b, Tea et al., 2005). Ces auteurs montrent qu’à 85%
cette glutathionylation concerne les polymères de gluténines (Rhazi et al., 2003b). Enfin,
l’analyse par SEC-MALLS de la distribution en taille des polymères de gluténines montre que
ceux qui présentent la plus faible taille et le plus faible degré de ramification sont ceux
présentant le plus fort taux de glutathionylation (Rhazi et al., 2003b).
3.4.3.3.
Mécanisme de formation des polymères de gluténines
L’ensemble de ces résultats ont amené Rhazi et al. (2003a, 2003b) à proposer un mécanisme
séquentiel pour la polymérisation des sous-unités de gluténines par couplage disulfure. Dans
une première étape, de 7 à 33 JAF, des polymères de gluténines solubles porteurs de
groupements sulfhydryls se forment. Ici l’implication de chaperonnes est vraisemblable dans la
mesure où cette polymérisation intervient dans un contexte non oxydant. La présence de SGHPM serait privilégiée et ces polymères présenterait un taux de branchement proportionnel à
leur contenu en SG-HPM de type y. Ces dernières sont en effet porteuses d’un nombre impair
de cystéines. Les SG-FPM seraient plus particulièrement fréquentes au niveau des branches,
selon le schéma organisationnel proposé par Lindsay et Skerritt (1999, 2000). La deuxième
étape, provoquée par la dessiccation assure la mise en interaction des premiers polymères. Ici
44
Chapitre I
la capacité des polymères de gluténines à interagir via des liaisons hydrogène serait
directement impliquée (Belton et al., 1995). L’établissement de liaisons disulfures
intermoléculaires interviendrait alors, stabilisant les complexes ainsi formés. A ce moment et
du fait d’une oxydation intense du contenu cellulaire, les polymères de gluténines sont l’objet
d’un processus de glutathionylation dont l’importance limiterait d’autant la formation des
polymères insolubles.
4. Effets agro-climatiques : azote, stress hydrique, températures élevées sur les protéines de
réserve du grain de blé
Les caractéristiques intrinsèques de la qualité des cultivars de blé sont fortement liées aux
conditions agro-climatiques au moment du développement et de la maturation du grain et/ou à
l’interaction de ces conditions avec leur génotype.
Avant la floraison, les conditions environnementales peuvent affecter la germination, la
photosynthèse, le tallage, l'inflorescence, le nombre et le volume des ovules et donc leur
fertilité (Egli, 1998). Après la floraison, l’effet se porte principalement sur la taille du grain et sur
sa composition (DuPont & Altenbach, 2003).
De nombreux travaux réalisés en conditions contrôlées ont permis de mettre en évidence les
effets de la luminosité (Sofield et al., 1977a), de la température, de la fertilisation azotée et de
la sécheresse (Sofield et al., 1977a, Wardlaw et al., 1980, Brooks et al., 1982, Wardlaw et al.,
1989, Altenbach et al., 2003, Gooding et al., 2003) sur les composantes du remplissage du
grain, sur sa taille et sa composition à maturité.
Les températures optimales de culture de blé permettant un rendement maximum sont
comprises entre 15 et 20°C (DuPont & Altenbach, 2003, Ercoli et al., 2006). Il est bien établi que
la température impacte sur le rendement en modifiant la durée et le taux de remplissage du
grain de blé. L'application de températures élevées à des stades précoces, spécialement avant
la fin du remplissage du grain, augmente la concentration en protéines et diminue le poids final
des grains (Gooding et al., 2003, Del Moral et al., 2007). Cette augmentation intervient alors
que la quantité d’azote par grain reste stable dans la mesure où l'accumulation d'amidon est
quant à elle fortement diminuée. Cependant, Panozzo et son équipe (Panozzo & Eagles, 1999,
Panozzo et al., 1999, Panozzo et al., 2001) rapportent des vitesses de synthèse de gliadines et
gluténines supérieures dans les parcelles non-irriguées et exposées aux plus fortes
45
températures enregistrées. Bien que la quantité totale de protéines par grain soit généralement
peu affectée par la température pendant la période de remplissage des grains, les
caractéristiques fonctionnelles des protéines de réserve du grain peuvent être significativement
modifiées (Randall & Moss, 1990, Ciaffi et al., 1996a, Wardlaw et al., 2002).
Il est difficile de comparer des résultats provenant d’études utilisant différentes méthodes
d'analyse et de fractionnement des protéines, néanmoins plusieurs travaux réalisés au champ
indiquent que les conditions environnementales, particulièrement la température et l’apport
de fertilisant, influent sur la quantité, la composition et/ou la polymérisation des protéines de
réserve (Borghi et al., 1995, Graybosch et al., 1995, Ciaffi et al., 1996a, Jia et al., 1996, Panozzo
& Eagles, 2000, Johansson et al., 2001).
Blumenthal et al. (1993) ont suggéré qu’en conditions de températures très élevées
(supérieures à 35°C) lors du remplissage du grain, la synthèse des gliadines serait favorisée par
rapport à celle des gluténines. Toutefois, la réponse des cultivars à ces conditions de stress
thermique ne semble pas homogène.
Des études ultérieures ont montré chez le blé tendre, que l'accumulation de polymères de
gluténines insolubles est réduite suite à l’application du stress thermique, entraînant leur
diminution sans modification de la teneur en polymères totaux (Stone & Nicolas, 1996a, 1998).
A l’opposé, Daniel et Triboï (2002) en étudiant les effets d’une augmentation de 10°C de la
température moyenne quotidienne et d’un déficit hydrique n’observent aucune modification
du taux d'accumulation des protéines solubles et insolubles, même si la formation des
polymères insolubles intervient plus précocement.
L’application de très hautes températures (supérieures à 35°C) entraine une réduction
significative des polymères insolubles (Ciaffi et al., 1996a, Corbellini et al., 1997). De plus,
l’application de courtes périodes de hautes températures à la fin du remplissage du grain
provoque une augmentation des protéines solubles (polymères de gluténines, gliadines,
albumines et globulines) au détriment des polymères insolubles (Corbellini et al., 1997).
A l’opposé de ces résultats , il a été rapporté chez le blé tendre, que la taille des polymères
de gluténines augmente en réponse à des courtes périodes de très hautes températures (Don
et al., 2005, Spiertz et al., 2006). En accord avec ces derniers résultats, une étude récente,
combinant déficit hydrique et température élevée pendant le remplissage du grain de blé dur,
46
Chapitre I
montre que la proportion de polymères insolubles augmente avec le nombre de jours à une
température entre 30 et 35°C (Flagella et al., 2010).
Il nous semble que ces résultats contrastés pourraient trouver leur origine dans les
conditions de croissance des plantes avant floraison, ce qui reflète des différences d’adaptation
des génotypes aux stress abiotiques, ou encore provenir du stade de développement au cours
duquel les contraintes ont été appliquées.
47
48
Chapitre II.
Effet de températures élevées
pendant le remplissage du
grain de blé dur
49
50
Chapitre II
Chapitre II- Effet de températures élevées pendant le remplissage du grain de
blé dur sur la dynamique de synthèse et d'aggrégation des protéines de réserve
La qualité technologique du blé dur est évaluée au travers de plusieurs critères, parmi ceuxci : la valeur semoulière, influencée par la taille et la texture des grains ; et la valeur pastière qui
dépend de la composition qualitative et quantitative en protéines. Ces différents critères,
fortement liés au polymorphisme génétique du blé, sont également influencés par les
conditions agro-climatiques au moment du développement du grain. Parmi les contraintes
environnementales, une hausse des températures pendant le développement des grains peut
être préjudiciable en termes de rendements et de qualité finaux.
Ce chapitre de thèse est consacré à décrire les mécanismes physiologiques (rythmes
d’accumulation des réserves, statut hydrique, morphologie des corpuscules protéiques, statut
redox du grain) et physico-chimiques (teneur en protéines, état d’association et d’oxydation
des protéines de réserve) qui accompagnent l’élaboration du grain de blé dur. Afin
d’approfondir les connaissances sur les modalités de remplissage du grain de blé dur nous
avons analysé l’effet de la température pendant l’élaboration du grain. Des températures
élevées ont été appliquées, soit pendant les phases de remplissage ou de dessiccation ou tout
au long du développement du grain de blé dur.
Dans un premier temps, un suivi fin du remplissage du grain sous influence de la
température a été réalisé. Nous avons également étudié l’effet de la température sur les
événements reliés à la texture de l’albumen et ceux conduisant à la polymérisation des
gluténines du grain. Dans un deuxième temps nous nous sommes particulièrement intéressés
sur les mécanismes physiques gouvernants les modalités de dessiccation et d’arrêt de
croissance du grain.
51
Physicochemical control of durum wheat grain filling and glutenin polymers under HT regimes
Physicochemical control of durum wheat grain filling and glutenin polymers
assembly under different temperature regimes
Mariana S. L. Ferreira, Pierre Martre, Cécile Mangavel, Christine Girousse, Natalia N. Rosa,
Marie-Françoise Samson and Marie-Hélène Morel
Publication n°1, Journal of Cereal Science, submitted
Abstract
Durum wheat is the main cereal grown in the Mediterranean area where drought and high
temperature (HT) frequently prevailed. Moderate HT (< 35°C) positively impacts grain protein
concentration, whereas it decreases yield. However data are lacking on the effect of high
temperatures at different stages of grain growth. In addition, the relationship between grain
vitreousness and large size glutenin polymers accumulation, the main determinants of pasta
dough quality, has not been investigated in detail yet. In this work, HT was applied to durum
wheat in the linear grain-filling or the dehydration phases as well as during whole grain
development. Grain dry mass and water content patterns, protein bodies’ deposits, changes in
glutenin polymers molecular size and in protein redox status were evaluated. HT applied during
the grain-filling phase shortened the duration of this developmental phase and increased rate
of N translocation to grain on a per-day basis. This resulted in a significant increase in grain
protein concentration. Irrespective of high temperature timings, the arrest of grain dry mass
accumulation was always observed at 45.9% grain water concentration. At this point, the starch
granule content of the endosperm cells would reach its physical packing limit. HT applied during
grain filling favoured late formation of SDS-insoluble glutenin polymers as grain water
concentration dropped below 30%. Saturation of starch granules by a visco-elastic protein
matrix prior to grain dehydration appeared mandatory to obtain vitreous grains and to form
SDS-insoluble glutenin polymers. Remarkably, the two main determinants of pasta dough
quality appear only related to the overall grain protein concentration.
Key words: durum wheat, glutathione, glutenin, grain filling, grain water content, high
temperature, polymerization, protein bodies, storage proteins, vitreous grain.
52
Chapitre II
1. Introduction
Temperature is one of the major environmental factors affecting small grain cereal yield and
composition (Randall & Moss, 1990, Borghi et al., 1995, Graybosch et al., 1995). Its impact on
durum wheat (Triticum turgidum L. var. durum Desf.) crop productivity and grain quality is even
more important since this cereal species is commonly grown in Mediterranean environments,
where high temperature (HT) during grain filling is recurrently occuring (Borghi et al., 1995). In
southern Europe, durum wheat is mainly used for pasta production. Durum wheat end-use
quality relies mainly on semolina yield and cooked pasta viscoelasticity (Troccoli et al., 2000).
Both are related to the grain protein concentration and composition.
Chronic moderate HT (25°C to 35°C) and short periods of very HT (> 35°C) during the grainfilling phase have frequently been associated with an increase in grain protein concentration
and a decrease in final grain dry mass and hence grain yield (e.g. Correll et al., 1994, Panozzo &
Eagles, 1999, Triboï et al., 2006). These effects are simply explained by the effects of
temperature on the rate and duration of grain filling and by the lowering of starch (which
accounts for ca. 70% of mature grain dry mass) synthesis (Jenner et al., 1991). Wheat grain
filling duration was proposed to be controlled by the kernel water content since dry mass
accumulation appears to stop at a constant critical grain water concentration (GWC) around 3745% (Schnyder & Baum, 1992, Calderini et al., 2000). How temperature affects kernel water
content according to the timing of its application remained to be documented.
On a day basis the temperature-driven decrease in grain-filling duration is generally
compensated for by a higher rate of grain nitrogen (N) accumulation. So the quantity of N per
grain is usually little affected and the grain protein concentration increases with the
temperature (Triboï & Triboï-Blondel, 2002).
Although the total quantity of N accumulated per grain is generally little affected by the
growing temperature, storage proteins composition and functionality can be significantly
altered (Randall & Moss, 1990, Ciaffi et al., 1996a, Wardlaw et al., 2002). Storage proteins start
to accumulate in the endosperm around the end of the endosperm cells division phase (Triboï
et al., 2003). They are deposited within protein bodies (PBs) which ultimately disrupted and
fused into a continuous protein matrix embedding the starch granules. This event takes place at
the end of the grain-filling phase (Shewry & Halford, 2002, Loussert et al., 2008). In mature
53
grains, storage proteins account for 70% to 80% of the total proteins and can be divided into
monomers (i.e. mainly gliadin) and polymers (i.e. mainly glutenin). The exceptional rheological
properties of wheat gluten depend on the balance between gliadin and glutenin polymers and
especially on the size distribution of the latter. Glutenin polymers are composed of individual
polypeptide subunits assembled through disulfide bonds. In mature grain, the polymers exhibit
a wide size distribution, from 200,000 up to several million mol g-1 (Wrigley, 1996). As a
consequence, the larger polymers are insoluble in denaturing buffers like 2% sodium dodecyl
sulphate (SDS). In bread wheat (T. aestivum L.) the proportion of SDS-insoluble polymers within
the glutenin protein fraction has been positively correlated with breadmaking quality and with
dough visco-elastic characteristics (Popineau et al., 1994, Naeem & MacRitchie, 2005). SDSinsoluble polymers were found to accumulate mainly during wheat grain dehydration as
glutenin sulfhydryl groups declined and glutathionylation of glutenin was proposed to limit the
shift of molecular weight distribution to higher molecular weight (Rhazi et al., 2003a, Rhazi et
al., 2003b). Timing of polymerization seemed to be synchronized with rapid grain water loss but
the relationship with drying temperatures remained unknown.
Some results suggest that very HT around mid-grain filling has positive effects on dough
strength (Stone et al., 1997, Panozzo & Eagles, 2000), whereas very HT around physiological
maturity has a negative effect (Randall & Moss, 1990, Blumenthal et al., 1991, Stone & Nicolas,
1996a). In bread wheat HT favours glutenin accumulation over gliadin (Stone & Nicolas, 1996a,
1998). But change of gliadin to glutenin ratio remains negligible compared with the alteration of
the glutenin polymers size distribution (Ciaffi et al., 1996a). Chronic moderate HT or short
periods of very HT were reported to result in a significant reduction in the SDS-insoluble protein
fraction (Ciaffi et al., 1996a, Corbellini et al., 1997, 1998, Wardlaw et al., 2002). Others showed
that the size of the glutenin polymers increases in response to short periods of very HT (Don et
al., 2005, Spiertz et al., 2006). In agreement with these latter results, Flagella et al. (2010) found
that dough strength and the percentage of SDS-insoluble polymeric proteins increases with the
number of days at which maximum daily temperatures range from 30 to 35°C for both durum
and bread wheat. All these conflicting results might be due to differences in either the growing
development stage at which the temperature has been increased or in genotypes studied.
This study focuses on durum wheat and studies the effects of a moderate HT applied at
different timings of the grain growing cycle. The dynamics of grain dry mass, total N and water
54
Chapitre II
content were analyzed. Depending on the timing of HT exposure, grain-filling duration and final
protein content were affected. In parallel, PB deposition, kinetics and extent of glutenin
polymer accumulation, redox status of storage protein were studied and found to be altered.
Data are analyzed and discussed in view of revealing how grain water dynamic and protein
content could control grain filling duration and glutenin polymerization.
2. Materials and methods
2.1. Plant material and growth conditions
Seeds of cv. Dakter (Triticum turgidum L. var. durum Desf.) were sown in 50 mL plastic pots
(two seeds per pot) placed in a nine m2 walk-in growth chamber. Light/dark air temperatures
were maintained at 10°C/18°C, air relative humidity was set at 70%/50% (light/dark) and the
photosynthetic photon flux density (PPFD), provided by Metal Halide lamp (HQI-TS 400W/NDL,
Osram, München, Germany), was 450 µmol m-2.s-1 at the plant level during the 16 h
photoperiod. When the third leaf emerged, the plants were transferred into a vernalization
chamber maintained at 6°C. The PPFD in the vernalization chamber was 50 µmol.m-2.s-1 during
the 8 h photoperiod. After six weeks, the plants were transplanted into PVC columns (inner
diameter 7.5 cm, length 50 cm) and were arranged in the walk-in growth chamber to form a
homogeneous stand with a plant density of 261 plant m-2. The air temperature was regulated at
19.9°C/13.8°C (light/dark) and the PPFD averaged 550 µmol.m-2.s-1 during the 16 h photoperiod.
The air relative humidity was controlled at 70%/50% (light/dark). The plants were daily watered
with a 0.5 strength Hoagland nutrient solution to maintain the soil water potential above -0.3
MPa. At anthesis, the nutrient solution was replaced by water. Main stems were tagged when
the anthers of the central florets appeared.
Compared to a control treatment at a mean daily temperature of 17.4°C (LT), three high
temperature (HT) treatments were applied by transferring part of the plants to a second growth
chamber similar to the first one except that air temperature was regulated at 27.5°C/21.6°C
(light/dark). In the second growth chamber, the average PPFD was 590 µmol.m-2.s-1 during the
16 h photoperiod and the air relative humidity was maintained at 70°C/50°C (light/dark). Plants
were transferred to the HT growth chamber either from the end of the endosperm cell division
phase (18 d [310°Cd] after anthesis) to physiological maturity (29 d [590°Cd] after anthesis;
treatment HT1), or from physiological maturity (33 d [580°Cd] after anthesis) to grain ripeness
55
(52 d [1050°Cd] after anthesis; treatment HT2), or from three days (50°Cd) after anthesis to
grain ripeness (43 d [1080°Cd] after anthesis; treatment HT3). Temperature heterogeneity
within the growth chambers was less than 0.4°C and 1.7°C during the light and dark periods,
respectively; while the PPFD heterogeneity was less than 150 µmol.m-2.s-1. For each
temperature treatment, 11 main-stem ears were randomly sampled every two to six days from
18 days after anthesis to ripeness.
2.2. Determination of grain dry mass, water content, total protein concentration and
percentage of vitreous grains
The fresh and dry masses (after 48h at 80°C) of grains were determined from six ears. Dry
grains were milled using a Cyclotec sample mill (Foss, Höganäs, Sweden) equipped with a 1-mm
mesh screen and their nitrogen (N) concentration was determined with the Dumas method
(AOAC method n° 7.024) using a FlashEA 1112 NC Analyser (Thermo Electron Corp., Waltham,
MA, USA). Grain protein concentration was calculated by multiplying N by 5.62 (Mossé et al.,
1985). Grain vitreousness was estimated from a visual inspection of grains sampled from 4
mature ears (ICC Standard Methods, method n°129). Grains were designated as non-vitreous if
the endosperm showed an opaque (whitish) spot.
2.3. Grain sample preparation for biochemical analyses
After harvest, four ears were immediately frozen in liquid nitrogen and freeze-dried to a final
water concentration ranging from 9% to 15%. Then, they were placed at 25°C and 54% relative
humidity above a saturated NaBr solution and were maintained in these conditions for two
weeks until their water content equilibrate at 12%. On an ear basis, grains were manually
sampled and ground with a ball mill under liquid nitrogen. The powder was stored at 5°C in
sealed bottles for further biochemical analyses.
2.4. Determination of grain protein composition and size distribution
Total SDS-soluble proteins were extracted from ground grains (160 mg) at 60°C for 80 min
with 20 mL of 1% SDS (w/v) and 4 mM iodoacetamide (IAM) in 0.1 M phosphate buffer (pH 6.8).
IAM was used to prevent the oxidation and aggregation of protein during extraction. The
homogenate was centrifuged at 40,000 × g for 30 min at 20°C. The supernatant was stored at –
20°C until being analysed. The pellet was suspended in 5 mL of 1% SDS (w/v) in 0.1 M
56
Chapitre II
phosphate buffer (pH 6.8) and SDS-insoluble proteins were brought into solution by sonication
(7.5 W for 3 min with a Vibracel 72434, Bioblock Scientific, Illkirch, France). The homogenate
was centrifuged as above. The SDS-soluble and insoluble extracts (20 µL) were fractionated by
SE-HPLC on a TSK G4000SWXL column (Tosoh Europe N.V., Lyon, France) using phosphate
elution buffer including 0.1% SDS. Protein elution was detected at 214 nm. Chromatograms of
SDS-soluble extracts were divided into 5 fractions (F1 to F5), on an elution time basis and
according to the known size range of the different wheat proteins (Figure I-1) (Dachkevitch &
Autran, 1989). The total areas of SDS-insoluble extracts were considered. Content in polymeric
glutenin was calculated as the sum of the areas of SDS-insoluble and the first two fractions (F1
plus F2) of the SDS-soluble extracts. For the SDS-soluble extract, the fraction F3 and F4 are
mainly made of #-gliadin and "-/!-gliadin, respectively; while the fraction F5 is mainly made of
albumin/globulin plus some
-gliadin. Results are presented as percent of total protein,
calculated from the sum of the areas of the SDS-insoluble and SDS-soluble chromatograms,
after correction for solid to solvent ratios. Full details on the procedure and column calibration
are given in Morel et al. (2000b).
Absorbance (x 0.1 A.U.)
2.5
F4
340°Cd
500°Cd
700°Cd
1040°Cd
2.0
1.5
F3
F2
F1
F5
1.0
0.5
0.0
8
10
12
14
16
18
Retention time (min)
Figure II-1. Typical SE-HPLC profiles of the SDS-soluble proteins from developing grains of
durum wheat plants (LT). F1, large glutenin polymers (750,000 < Mr < 2,000,000); F2, small
glutenin polymers (90,000 < Mr < 750,000); F3, #-gliadin proteins (55,000 < Mr < 90,000); F4, "/!-gliadin proteins (18,000 < Mr < 55,000); F5, albumin/globulin and -gliadin proteins (5,000 <
Mr < 18,000). Arrow indicates the extra-peak.
57
2.5. Determination of protein thiol content
The protein thiol content (PSH) of ground grains (60 mg) was determined using Ellman’s
reagent according to the conditions described in Morel and Bonicel (1996b).
2.6. Determination of total glutathione and protein-bound glutathione contents
Status of glutathione within mature grains was evaluated using Tietze (1969) glutathione
reductase (GR) recycling assay adapted for a 96-well microtiter plate. In view of measuring the
total grain glutathione content, series of 9 tubes replicates containing 35 mg of ground grains
and 350 µL of a 5% (w/v) sulfosalicylic acid solution were prepared. The tubes were shaken (20
min), centrifuged (3,800 × g for 10 min) at 4°C and pooled into one batch. The supernatant was
neutralized to pH 7.3 by the addition of 7.5 M triethanolamine. Aliquots of 10, 7 and 5 µL of
each supernatant were tested, in parallel with a series of GSSG standard solutions (6 samples
from 0 to 45 µM GSSG in 5% [w/v] sulfosalicylic acid, 5 mM EDTA, 14 mM triethanolamine). The
sample volume was adjusted to 10 µL with the solution of sulfosalicylic. The reaction mixture
comprised 170 µM DTNB, 0.3 GR unit mL-1, 1 mM EDTA and 0.1 M phosphate buffer (pH 7).
After sample addition, the plate was shaken during 15 s and left for 5 min before addition of 50
µL of 0.35 mM NADPH. For each assay, the initial reaction rate (in DO s-1) was estimated from
the absorbance change monitored at 414 nm. The reaction rates were plotted against the
volume of supernatants (sample series) or against the concentration of GSSG (standard series).
Total glutathione content was obtained from slope ratios of the two plots (samples vs standard
series).
In order to determine protein-bound glutathione the remaining protein pellets were
neutralized with 3 µL of 7.5 M triethanolamine (pH 7.3) and reduced with TCEP (Tris 2carboxyethyl phosphine hydrochloride) in order to release the PSSG. As TCEP interfered with
the Tietze recycling assay, its amount was limited to two-third of total protein thiol equivalents
(ca. 120 µmol.g-1 protein). In addition, an internal calibration was used. Typically, the 9
alkalinised pellets were suspended with 700 µL of a series of 9 standard solutions of GSSG (from
0 to 45 µM in 300 µM TCEP, 5 mM EDTA). The tubes were sealed under an argon atmosphere
and shaken for 20 min before being centrifuged at 20,800 × g for 10 min, at room temperature.
Supernatants (10µL) were assayed as described above for the total glutathione assay. PSSG
content was calculated by plotting reaction rates against GSSG concentrations. The y-intercept
58
Chapitre II
of the linear plot, once corrected for the basal reaction rate in absence of added GSSG was
divided by the slope. The basal reaction rate in absence of added GSSG was obtained by
assaying 10 µL of 5 mM EDTA, 30 mM triethanolamine and 5% [w/v] sulfosalicylic acid in place
of the pellet extract. All results were expressed as GSH equivalent (GSH eq µmol g-1 protein).
2.7. Confocal laser scanning microscope observation of protein bodies
Endosperm from grains of the first floret of mid-ear spikelets were cut into 1 mm3 cubes
with a razor blade and were immediately fixed in 1% glutaraldehyde and 3% paraformaldehyde
in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4) for 4 h at 4°C. The samples were then dehydrated and
embedded in LR White resin as described previously (Loussert et al., 2008). Thick sections (1
µm) of LR White embedded samples were prepared using an Ultramicrotome (LEICA, EM UC7,
2009, Austria). The sections were placed on glass slides and incubated for 5 min with 1% Fast
Green and then washed in deionized water. Glass slides were stored in the darkness and
observed using a confocal laser scanning microscope (CLSM, Nikon A1, 2009, Japon) at 636 nm.
2.8. Statistics and data analyses
Differences in dry mass, water content, quantity of N per grain, protein concentration, and
protein composition of mature grains were analyzed using one-way ANOVA ( = 0.05) followed
by a Tukey’s test. The maximum rate and duration of dry mass, water, total N accumulation
were estimated by fitting a 3-parameter logistic function equation as described previously
(Triboï et al., 2003). Grain water concentration (GWC) at physiological maturity (i.e. end of grain
filling) was determined by fitting a broken-stick linear regression model (Calderini et al., 2000)
to relative grain dry mass against water concentration. The rate and duration of grain
dehydration were determined by fitting the following 4-parameter logistic function equation to
the quantity of water per grain versus thermal time after physiological maturity ( tPM ):
Q & Q0 '
Qmin
(1)
( $1 0.05 % Qmin * Q0 )
( 4r $ tPM * t95min % )
1' +
, exp +
,
Q0
Qmin
.
.
where Q is the quantity of water per grain at tPM ; Q0 and Qmin are the values of Q
approached as tPM / '0 and *0 , respectively; r is the maximum rate of water loss defined as
the derivative of the point of inflexion; and t95min is the duration of the dehydration phase
59
defined as the time period, from physiological maturity, in which 95% of Qmin is reached. Fitted
rates and durations between two temperature treatments were considered as significantly
different ( = 0.05) when the confidence interval of the difference between the two treatments
did not contain zero (Sokal & Rohlf, 1995, Fowler et al., 1998).
3. Results
3.1. Dynamics of grain dry mass and water
Dry mass accumulation was compared for developing grains produced under low
temperature (LT) or high temperature (HT) applied during either the linear grain-filling phase
(HT1), the dehydration phase (HT2), or during the whole grain development (HT3). Compared
with LT, final grain dry mass was reduced by 20% and 43% when HT was applied during the
linear grain-filling phase and the whole grain development, respectively (Table II-1). The grainfilling duration was 40 ± 1.3 d (695 ± 22°Cd) for LT and it was reduced by 4 d (99°Cd) and 18 d
(175°Cd) when the HT treatment was applied during the linear (HT1) and the whole (HT3) grain
development phases, respectively (Figure II-2AB). The maximum rates of grain dry mass
accumulation either expressed in days (2.65 ± 0.23 mg DM grain-1 d-1) or degree-days (0.12 ±
0.01 mg DM grain-1 °Cd-1) after anthesis were not significantly different between the
treatments.
Maximum grain water content decreased by 29% and 7%, respectively, compared with LT
when the plants where transferred to HT at the beginning (HT3) and at the end (HT1) of the
endosperm cell division phase (Table II-1; Figure II-2CD). In accordance with the higher
temperature applied during the dehydration phase, grain dehydration duration was much
shorter for HT2 (11 ± 1.4 d) than for LT (20 ± 3.2 d; Figure II-2C). Surprisingly similar durations of
grain dehydration were observed for HT3 and HT1 and LT treatments. Grain dehydration rate
estimated for HT1 and HT3 (2.59 ± 0.35 mg H20 grain-1 d-1) was significantly lower than for LT
and HT2 (4.67 ± 0.60 mg H20 grain-1 d-1). Expressed in degree-days, the duration of grain
dehydration was similar for all treatments, averaging 403 ± 28°Cd, but the rate of water loss
was significantly lower for HT1 and HT3 (0.125 ± 0.016 mg H20 grain-1 °Cd-1) compared to LT and
HT2 (0.21 ± 0.027 mg H20 grain-1 °Cd-1; Figure II-2D). These results were unexpected since HT2
and HT3 were both under HT during the grain dehydration phase. Therefore it appeared that
the temperature during the grain-filling phase affected grain dehydration in a complex way.
60
Dehydration
Whole grain development
Control
HT2
HT3
LT
43.0 ± 2.17b
46.7 ± 0.67c
32.9 ± 1.31a
46.1 ± 1.23c
42.7 ± 1.89b
55.1 ± 2.04c
30.7 ± 3.69a
53.3 ± 2.91c
1.13 ± 0.041b
0.89 ± 0.036a
1.15 ± 0.034b
1.07 ± 0.031b
11.7 ± 0.21a
16.0 ± 0.37c
11.8 ± 0.27a
14.6 ± 0.34b
49.7
100.0
44.1
87.4
61
by different letters within a column are significantly different at the 0.05 probability level.
whole grain development (HT3) phases. Data are means ± SE for n = 6 independent replicates, except for the percentage of vitreous grains. Values followed
Day/night temperatures were increased from 19.9/13.8°C (LT) to 27.5/21.6°C (HT) either during the linear grain-filling (HT1), the dehydration (HT2) or the
Linear grain-filling
HT1
Table II-1. Grain dry mass, maximum water content, total nitrogen, protein concentration and percentage of vitreous grains at
physiological maturity for plants of durum wheat (cv. Dakter) grown under different temperature regimes.
Dry mass
Maximum water
Total nitrogen Protein concentration
Vitreous
Treatment
Phase of HT
(mg grain-1)
content (mg grain-1)
(mg N grain-1)
(% dry mass)
grain (%)
Chapitre II
60
B
A
Grain dry mass
-1
(mg DM grain )
50
40
30
20
HT1
HT2
HT3
LT
10
Grain water content
-1
(mg H20 grain )
0
D
C
50
40
30
20
10
0
0
10
20
30
40
50
60 0
Days after anthesis
200
400
600
800 1000 1200
Thermal time after anthesis (°Cd)
Figure II-2. Grain dry mass (A, B) and water content (C, D) versus days (A, C) and thermal time
(B, D) after anthesis. Day/night temperatures were increased from 19.9/13.8°C (LT) to
27.5/21.6°C either during the linear grain-filling (HT1), the dehydration (HT2) or the whole grain
development (HT3) phases. Data are means ± SE for n = 6 independent replicates.
The analysis of the kinetics of grain dry mass (Figure II-2AB) and water content (Figure
II-2CD) suggested that the end of grain filling was synchronous with the onset of grain water
loss. In the Figure II-3A, the change in grain water content normalized by the maximum water
content is plotted against grain dry mass normalized by the final grain dry mass. The result
confirmed this coincidence. Furthermore during the linear phase of grain filling, the relative
grain dry mass was related to the decrease in grain GWC (Figure II-3B). Since no significant
difference was found between the different treatments, the regression was established from
the data of all the treatments pooled. The final grain dry mass was reached at 45.9 ± 1.0% GWC.
Therefore grain dry mass accumulation appeared to be tightly linked with water dynamics,
independently of the temperature.
62
Chapitre II
% of maximum
grain water content
120
A
100
80
60
40
20
0
20
HT1
HT2
HT3
LT
40
60
80
100
120
% of final grain dry mass
Grain water concentration
(% GWC)
80
B
60
40
20
0
20
40
60
80
100
120
% of final grain dry mass
Figure II-3. Relationship between (A) percent of maximum grain water content and percent of
final grain dry mass and (B) relationship between grain water concentration and percent of final
grain dry mass for developing grains. Day/night temperatures were increased from 19.9/13.8°C
(LT) to 27.5/21.6°C either during the linear grain-filling (HT1), the dehydration (HT2) or the
whole grain development (HT3) phases. Data are means ± SE for n = 6 independent replicates.
Line shows broken-stick linear regression model fitting simultaneously to all data (B).
3.2. Dynamics of protein accumulation during grain development and final grain protein
composition
The pattern of grain N accumulation (Figure II-4) was less modified by HT treatments than
that of dry mass accumulation (Figure II-2AB). For all treatments, the duration of grain dry mass
and N accumulations were not significantly different. Compared with LT (706 ± 41.3°Cd) the
duration of grain N accumulation was significantly reduced for HT3 (526 ± 51 °Cd; Figure II-4B).
The duration of grain N accumulation was 40 ± 2.4 d for LT and it was significantly reduced by
18 d and 5 d for HT3 and HT1, respectively (Figure II-4A). The maximum rate of grain N
63
accumulation was not significantly different among the treatments, averaging 54 ± 17 µg N
grain-1 d-1 (2.37 ± 0.69 µg N grain-1 °Cd-1). At maturity, the quantity of N per grain was mainly
determined by the duration of accumulation in degree-days. Only when temperature was
increased during the whole grain development (HT3) the final quantity of N per grain was
significantly reduced (–21%) compared with the LT treatment (Table II-1). However at maturity,
grain protein concentration was 25% and 37% higher for HT1 and HT3 compared to LT, mainly
because of the effect of HT treatments on grain dry mass. The percentage of vitreous grains
was tightly correlated (r = 0.99; P = 0.0087, d.f. = 2) with the grain protein concentration (Table
Grain nitrogen (mg N grain-1)
II-1).
1.4
B
A
1.2
1.0
0.8
0.6
HT1
HT2
HT3
LT
0.4
0.2
0.0
0
10
20
30
40
50
60 0
200
400
600
800 1000 1200
Days after anthesis
Figure II-4. Grain nitrogen versus days (A) and thermal time (B) after anthesis for developing
grains. Day/night temperatures were increased from 19.9/13.8°C (LT) to 27.5/21.6°C either
during the linear grain-filling (HT1), the dehydration (HT2) or the whole grain development
(HT3) phases. Data are means ± SE for n = 6 independent replicates.
Storage protein composition of mature grain was significantly modified only for HT3 which,
compared with LT, sho%&'( )*( +*,-&).&( +*( /0&( 1-212-/+2*( 23( "-4!-gliadins at the expense of
glutenins (Table II-2). The allocation of N to the different classes of storage proteins was
determined early in grain development during the cell division phase, since protein composition
of HT1 grains approached that of LT rather than that of HT3. The size distribution of glutenin
polymers was also significantly affected by application of HT during whole grain-filling phase
(HT3). Mature grains from HT3 showed both the lowest content in glutenin and the largest
proportion of SDS-insoluble polymers (Table II-2). When HT was applied only during grain-filling
(HT1) or dehydration phases (HT2) the impact on the proportion of SDS-insoluble glutenin
polymers of mature grain was not significant.
64
Dehydration
Whole grain development
Control
HT2
HT3
LT
33.8 ± 2.72a
27.0 ± 3.36a
40.8 ± 3.68b
29.0 ± 2.97a
40.42 ± 0.10b
41.7 ± 0.58b
38.4 ± 0.62a
40.5 ± 0.36b
32.5 ± 0.35b
36.1 ± 0.55a
32.0 ± 0.48b
33.4 ± 0.26b
8.5 ± 0.25b
7.5 ± 0.13a
8.5 ± 0.10b
8.6 ± 0.11b
significantly different at the 0.05 probability level.
65
whole grain development (HT3) phases. Data are means ± SE for n = 4 independent replicates. Values followed by different letters within a column are
Day/night temperatures were increased from 19.9/13.8°C (LT) to 27.5/21.6°C (HT) either during the linear grain-filling (HT1), the dehydration (HT2) or the
Linear grain-filling
HT1
Table II-2. Protein composition of mature grains from plants of durum wheat (cv. Dakter) grown under different temperature regimes.
Glutenin polymers
SDS-insoluble glutenin
"-4!- gliadins
#- gliadins
Treatment
Phase of HT
(% total protein)
polymers (% total polymer)
(% total protein)
(% total protein)
Chapitre II
3.3. Dynamics of glutenin polymer assembly during grain development
The dynamics of glutenin polymer assembly during grain development was revealed from
changes in the size distribution of SDS-soluble proteins (Figure II-1). Compared to the typical SEHPLC profile from mature grain, fraction F4 i*,56'+*7("-4!- gliadin showed an unusual shoulder
for immature grains irrespective of plants temperature regime. When iodoacetamide was
omitted during protein extraction, this shoulder was missing and the proportion of glutenin
polymers increased (data not shown). For all treatments, the F4 shoulder strongly diminished
after 550°Cd (50% water content). From 350 to 620°Cd after anthesis, the quantity of small SDSsoluble glutenin polymers (F2) per grain increased almost linearly (Figure II-5). Beyond 550°Cd
after anthesis the accumulation rate of large SDS-soluble polymers (F1) increased sharply
before reaching a plateau at 620°Cd (HT1, HT3) or continued to increase up to 700-750°Cd
(HT2, LT) (Figure II-5). The accumulation of SDS-insoluble glutenin polymers run parallel to that
of large SDS-soluble glutenin polymers up to ca. 700 to 750°Cd after anthesis. Beyond 750°Cd
after anthesis, while protein synthesis was over, the proportion of SDS-insoluble glutenin
polymer suddenly increased and became three- (HT3) to two- (other treatments) folds higher
(Figure II-5).
66
Chapitre II
Glutenin polymers
(mg grain-1)
1.8
A
B
C
D
1.5
1.2
0.9
0.6
0.3
0.0
Large SDS-sol. polym.
Small SDS-sol. polym.
SDS-insol. polym.
Glutenin polymers
(mg grain-1)
1.5
1.2
0.9
0.6
0.3
0.0
300
450
600
750
900
1050
450
600
750
900
1050
Thermal time after anthesis (°Cd) Thermal time after anthesis (°Cd)
Figure II-5. Accumulation of large and small SDS-soluble and SDS-insoluble polymers versus
thermal time after anthesis for developing grains. Day/night temperatures were increased from
19.9/13.8°C (LT, A) to 27.5/21.6°C either during the linear grain-filling (HT1, B), the dehydration
(HT2, C) or the whole grain development (HT3, D) phases. Data are means ± SE for n = 4
independent replicates.
A plot of the proportions of small and large SDS-soluble glutenin polymers against SDSinsoluble glutenin polymers, revealed that the small SDS-soluble glutenin polymers contributed
sooner and to a larger extent (65% vs. 35%) to SDS-insoluble polymers (Supplementary Figure S
II-1). SDS-insoluble glutenin polymers (on a grain FM basis) were also plotted as function of
GWC in order to get a better insight of the effect of protein over-concentration during grain
dehydration on polymerization (Figure II-6). For all the treatments, the final accumulation of
SDS-insoluble glutenin polymers started when the grains reached a water concentration of 30
to 32% (Figure II-6). This accumulation was even more efficient with grain dehydration when
the total glutenin polymer concentration (on a grain FM basis) was high (HT3 = HT1 > LT = HT2)
or when HT was applied during grain dehydration (HT3 = HT2 > HT1 = LT; Figure II-6).
67
SDS-soluble glutenin polymers
(% total protein)
30
HT1
HT2
HT3
LT
25
20
Small polym. (S = 0.65)
15
10
5
Large polym. (S = 0.35)
0
0
5
10
15
20
% SDS-insoluble glutenin polymers
(% total protein)
Figure S II-1. Relationship between SDS-insoluble and small and large SDS-soluble polymers for
developing grains. Day/night temperatures were increased from 19.9/13.8°C (LT) to 27.5/21.6°C
either during the linear grain-filling (HT1), the dehydration (HT2) or the whole grain
development (HT3) phases. Data are means ± SE for n = 4 independent replicates. Slopes (S) are
given as eyes guide.
SDS-insoluble polymer
(mg g-1 FW)
25
20
HT1
HT2
HT3
LT
15
10
5
0
70
60
50
40
30
20
10
(% GWC)
Figure II-6. SDS-insoluble polymers versus grain water concentration. Day/night temperatures
were increased from 19.9/13.8°C (LT) to 27.5/21.6°C either during the linear grain-filling (HT1),
the dehydration (HT2) or the whole grain development (HT3) phases. Data are means ± SE for n
= 4 (SDS-insol. polym.) and n = 6 (%GWC) independent replicates.
3.4. Relationship between glutenin polymer assembly and changes in thiol redox status
during grain development
Protein thiol groups (PSH) were analysed to report changes in protein redox status during
grain development. Most of PSH in immature grains can be ascribed to partly reduced glutenin,
68
Chapitre II
since gliadin polypeptides are rapidly folded after synthesis and never exhibit reduced
sulfhydryl groups (Rhazi et al., 2003a, Ferreira et al., 2009). PSH levels were found to span over
two decades and to decrease exponentially during grain filling. For convenience data are
presented as semi-log plots (Figure II-7). Irrespective of HT treatments, PSH content decreased
from ca. 20 to 2.5 µmol g-1 protein from 350 to 600°Cd after anthesis (Figure II-7A). The later
timing corresponds to 45% GWC (Figure II-7B) and so coincided with the physiological maturity.
At this moment, most of glutenin polypeptides were assembled into polymers mainly devoids
of sulfhydryl groups. Below 45% grain GWC, PSH content stabilized for HT3 and HT1, but
continued to decrease to less than 0.2 µmol g-1 protein for LT and HT2. Below 35% GWC and
after 750°Cd after anthesis, a reverse trend was observed and at maturity similar PSH contents
were observed for all the treatments.
B
(µmol g-1 protein)
A
10.0
1.0
HT1
HT2
HT3
LT
0.1
300
450
600
750
900 1050
70
60
50
40
30
20
10
(%GWC)
Figure II-7. Protein thiol content (PSH) versus thermal time after anthesis (A) or grain water
concentration (B) for developing grains. Day/night temperatures were increased from
19.9/13.8°C (LT) to 27.5/21.6°C either during the linear grain-filling (HT1), the dehydration
(HT2) or the whole grain development (HT3) phases. Data are means ± 1 SD for n = 3 (PSH) and
n = 6 (%GWC) independent replicates.
Total glutathione and protein-bound glutathione (PSSG) contents were examined for mature
grains. PSSG contents were within the range of PSH varying from 1.3 to 2.5 µmol g-1 protein
depending on temperature during grain filling. Ratio of small SDS-soluble to SDS-insoluble
glutenin polymers was negatively correlated to PSSG content (r = 0.58, P = 0.05, df = 10;
Supplementary Figure S II-2). On the other hand, PSSG always represented 41% of the grain
total glutathione, indicating that both were in equilibrium. In fact, all samples included similar
69
amounts of total glutathione on a grain mass basis (0.64 ± 0.10 nmol g-1 dry mass) but when
related to grain protein content, higher content was obtained for LT and HT2 (5.46 ± 1.0 µmol g1
protein) compared to HT3 and HT1 (3.8 ± 0.6 µmol g-1 protein). The results are consistent with
the ability to maintain the redox balance between protein sulfhydryl/disulfide and GSH/GSSG
couples, irrespective of grain-filling temperature.
Protein-bound glutathione
(µmol g-1 protein)
2.7
HT1
HT2
HT3
LT
2.4
2.1
1.8
1.5
y = -3.368x - 3.3
2
R = 0.5812
1.2
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Fi / F2
Figure S II-2. Relationship between protein bound glutathione (PSSG) and ratio of SDS-insoluble
(Fi) to small SDS-soluble glutenin polymer (F2) in mature grains. Day/night temperatures were
increased from 19.9/13.8°C (LT) to 27.5/21.6°C either during the linear grain-filling (HT1), the
dehydration (HT2) or the whole grain development (HT3) phases. Solid line is linear regression,
dashed lines are 95% confidence interval.
3.5. Evolution of protein bodies during grain development
Protein bodies (PBs) from endosperm sections of developing grains were examined by
confocal laser scanning microscopy after specific protein staining with Fast Green (Figure II-8).
For the control samples (LT) spherical and small PBs were observed at the earliest stage of
development analysed (252°Cd; Figure II-8A). From this developmental stage on, PBs were
more numerous and larger before becoming very heterogeneous in size (data not shown).
Departure from the spherical aspect of large PBs signals the beginning of their disruption, which
was noticeable at 588°Cd; here full development of a continuous protein matrix surrounding
starch granules was achieved at 672°Cd after anthesis (Figure II-8B-C), thus somewhat before
the onset of grain dehydration. The process was accelerated when HT was applied during grain
development. A continuous protein matrix was observed at 470°Cd for HT1 (Figure II-8D) and
70
Chapitre II
434°Cd for HT3 (Figure II-8F) (i.e. before the onset of dehydration), whereas HT2 resulted in
similar patterns as LT (Figure II-8E).
(A) 252°Cd (71%)
LT
(B) 588°Cd (47%)
(C) 672°Cd (44%)
HT1
(D) 470°Cd (54%)
HT2
(E) 674°Cd (44%)
HT3
(F) 434°Cd (54%)
Figure II-8. Superimposed bright field and fluorescence images of endosperm cross sections
from developing grains. Day/night temperatures were increased from 19.9/13.8°C (LT) to
27.5/21.6°C either during the linear grain-filling (HT1), the dehydration (HT2) or the whole grain
development (HT3) phases. Sections were stained with Fast Green and were observed with a
confocal microscope. Thermal time after anthesis and grain water concentration (% GWC) are
indicated. Bars = 20 µm.
4. Discussion
In order to assess the effects of temperature on the dynamics of grain dry mass, protein
accumulation and on the assembly of glutenin polymers, plants of durum wheat were subjected
to a 6.5°C increase of mean daily temperature (from 17.4°C to 25.1°C) at different phases of
grain development. These temperatures correspond to the average and deciles of the long term
average daily mean temperature in the major durum wheat growing regions in France during
the grain-filling phase (data not show).
71
4.1. Effect of temperature regimes on grain dry mass accumulation
The timings of some of the physiological and biochemical events examined during this study
are summarized in Figure II-9. The temporal patterns of grain development in terms of dry mass
and water evolution were substantially compressed when HT was applied before physiological
maturity. The final grain dry mass was accordingly diminished as the maximum rate of dry mass
accumulation remained unchanged under HT. Final grain dry mass was closely correlated to the
maximum grain water content, in accordance with previous works (Millet & Pinthus, 1984, Saini
& Westgate, 2000). Irrespective of HT treatments, grain dry mass accumulation stopped when
grain water content reached 45.9%. This value is within the range (40 to 45%) reported in
previous studies on bread wheat (Schnyder & Baum, 1992, Egli & TeKrony, 1997, Pepler et al.,
2006). It is also consistent with the results of Gooding et al. (2003) showing that environmental
constraints, like soil water deficit and high temperature during the linear grain-filling phase did
not impact on water content at the end of grain filling.
In wheat grains, net water uptake mainly occurs during the endosperm cells division phase.
During the linear grain-filling phase grain water content remains stable (Schnyder & Baum,
1992). When HT was applied immediately after flowering during the cell division phase, grain
water content was reduced by 27% and the final grain dry mass was accordingly reduced (42%). Therefore it appears that potential grain dry mass is mainly determined very early in
grain development. These results are in good agreement with previous results suggesting that
pericarp expansion during the endosperm cell division phase, which parallels grain water
uptake, controls the final size of the grain (reviewed in Foulkes et al., 2011). Recent results,
suggest that the expansins may play a key role in the control of the final grain volume (Lizana et
al., 2010).
Once the maximum water content was fixed, dry mass accumulation increased at the same
rate on a day basis, irrespective of growing temperature. Similar results were reported by Triboï
et al. (2003) and Dupont et al. (2006). This can be explained by the fact that carbon
accumulation depends mainly on the quantity of radiation intercepted by the plants, while N
accumulation is depends mainly on the accumulated thermal time due to the fact that N
remobilisation is governed by temperature (Triboï & Triboï-Blondel, 2002). Shortening of grainfilling duration together with increasing N translocation rate on a real time (days) basis led to
grains less enriched in proteins.
72
Chapitre II
beginning of
water plateau
ºCd GWC%
ºCd GWC%
ºCd GWC%
100
100
100
200
200
200
300
300
300
400
end of water plateau
end of dry mass
accumulation
end of protein
accumulation
61.6%
400
60.4%
400
57.0%
disruption of PBs
49.8% disappearance of free
glutenin subunits
500
51.8%
500
52.2%
500
600
46.7%
600
45.8%
600 40.5%
700
43.0%
700
37.4%
700 29.7%
800
35.2%
800
26.0%
800 20.4%
LT
HT1
onset of final SDSinsoluble glutenin
polymers assembly
HT3
Figure II-9. Timings of the main physiological and biochemical events observed during grain
filling. Day/night temperatures were increased from 19.9/13.8°C (LT) to 27.5/21.6°C either
during the linear grain-filling (HT1) or the whole grain development (HT3) phases.
4.2. Control of grain-filling duration – Control of grain-filling stop
The endosperm cell can be viewed as a compartment including granular matter (cell
organelles, protein bodies, starch granules) and water. Because of geometrical constraints the
volume occupancy of starch granules will never reach that of the cell and at the best it would
approach a maximum volume fraction, i.e the random close packing limit. At the approach of
the random close packing limit, starch synthesis should be impeded unless development of
increasing internal pressure, granules deform and irreversible damage cell organelles.
According to Medcalf and Gilles (1965), isolated durum wheat starch granules after compaction
by centrifugation and bed water drainage include 0.91 ± 0.021 g of water per g of starch; i.e.
47.6% water concentration of close-packed starch granules. Estimation of the compactness
73
limit of the granular matter deposited within endosperm cell remains elusive due to
interference of storage proteins. Starch granules and PBs could both contribute to cell granular
density because of their discrete solid nature. Being more deformable than starch granules,
large PBs will be the firsts to undergo changes in internal pressure. Deformation of PBs and
subsequent release of storage proteins in the cytoplasm matrix were observed around 50%
GWC for all samples. Disruption of PBs occurred when 75% (HT1 and HT3) to 85% (LT) of the
final quantity of dry mass was accumulated, allowing to create some space for further deposit
of starch granules. Small B and C starch granules, which synthesis occurs 28 to 35 days after
anthesis, would fill the gap between the larger A granules (Stamova et al., 2009). Accumulation
of starch granules could then continue up to random close packing limit, reached around 45.9%
GWC, which marked the onset of rapid grain dehydration in all cases. Without ruling out
molecular regulations of compounds synthesis in endosperm cells, it can be proposed that
starch compactness limit, determine grain-filling arrest. The hypothesis is consistent with the
onset of the stochastic progression of wheat endosperm cell death at the physiological maturity
(Young et al., 1997, Olsen, 1998, Young & Gallie, 1999) and also with an accumulation of starch
and protein that can continues beyond the beginning of the endosperm cell death, as reported
by Li et al.(2004a).
4.3. Effect of temperature regimes on glutenin polymer assembly
The size distribution of glutenin polymers is one of the main determinants of wheat end-use
quality as proportion of SDS-insoluble polymers is directly related to gluten and dough
viscoelasticity (Popineau et al., 1994, Naeem & MacRitchie, 2005). The way glutenin subunits
assemble in vivo and the structural-functional relationship of the final polymers remained a
subject of debate (Lombardi et al., 2009). The accumulated thermal time during grain filling and
the concentration in glutenin polymers were the main parameters influencing glutenin
polymerization rate. On the other hand and surprisingly, size or integrity of PBs seemed of no
importance for glutenin polymers assembly. Disruption of PBs and development of a
continuous matrix anticipated the end of dry mass accumulation, i.e. the end of starch
synthesis.
74
Chapitre II
Irrespective of temperature regime, glutenin polymerization began as early as 350°Cd after
anthesis, the first date investigated here. Nevertheless, until 550°Cd part of the newly
synthesized glutenin would accumulate in the form of free subunits. Indeed, the extra-peak of
F4, due to its sensitivity towards oxidation and its size range, most likely corresponded to single
low-molecular weight glutenin subunits. Relationships between accumulations of the different
types of glutenin polymers were typical of a continuous polymerization process, where small
glutenin polymers assemble into large ones which in turn are progressively converted into SDSinsoluble ones. The latter accumulated below 30% GWC as concentration of SDS-soluble
polymers (on a grain FM basis) increased, due to grain dehydration. Here again an analogy with
the synthesis of chemical polymers could be made, where concentration and temperature are
the main determinants of the conversion rate of monomers. First-order decay of PSH
accompanying the accumulation of glutenin polymers was consistent with a polymerization
mechanism involving PSH into inter-chain disulfide bonds. In contrast, the rapid accumulation
of SDS-insoluble proteins, which was observed below 30% GWC, occurred at constant (for HT3
and HT1) or slightly (for LT and HT2) increasing PSH levels (Supplementary Figure S II-3),
suggesting that a specific mechanism could contribute to their formation. Below 30% GWC,
water associated to endosperm storage proteins would decrease below 2 mL g-1 protein (for
details of calculation see Supplementary Text S1), which corresponds to the water
concentration of vital gluten extracted from mixed dough by lixiviation. Thus, below 30% water
concentration and as grain drying continues, gluten condenses over its water swelling
equilibrium. Water loss from polypeptides backbone will progressively induce a structural
transition from -turns to intermolecular -sheets (Georget & Belton, 2006). Redistribution of
glutenin polypeptides disulfide pairing would accompany this shift in protein conformation. The
pool of reduced glutathione which was found in equilibrium with glutenin-bound glutathione
may catalyse disulfide bonds exchange reactions. Polymer size could then increase without any
net reduction in sulfhydryl groups.
75
(µmol.g-1 protein)
10.0
1.0
HT1
HT2
HT3
LT
0.1
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
SDS-insoluble glutenin polymer
(mg grain-1)
Figure S II-3. Content of protein thiol (PSH) versus accumulation of SDS-insoluble glutenin
polymers (mg grain-1). Day/night temperatures were increased from 19.9/13.8°C (LT) to
27.5/21.6°C either during the linear grain-filling (HT1), the dehydration (HT2), or the whole
grain development (HT3) phases. Data are means ± 1 SD for n = 3 (PSH) and n = 4 (SDS-insol.
polym.) replicates.
Reduced glutathione, which is likely to play a pivotal role in the late accumulation of SDSinsoluble glutenin polymers, would influence adversely early increase of glutenin polymer size.
In durum wheat grain, reduced glutathione content was reported to increase steadily during
the grain-filling phase (400 to 700°Cd) (Ferreira et al., 2008). During this time, even if most of
PSH decay would rely on disulfide pairing of glutenin polypeptides, their glutathionylation
cannot be ruled out. Blocking of sulfhydryl groups normally involved in glutenin inter-chain
pairing will prevent further enlargement of polymers. Similar involvement of glutathione in the
glutenin polymers formation has been postulated (Rhazi et al., 2003b). Furthermore, Tea et al.
(2005) showed by SE-HPLC/Multi-Angle-Laser-Light-Scattering (MALLS) that the size of SDSsoluble glutenin polymers is inversely related to their glutathione contents. In the same way, in
this study a relation was found between the size distribution of glutenin polymers and PSSG
content.
Even if a late accumulation of SDS-insoluble polymers driven by grain desiccation has been
proposed in bread wheat, assembly of SDS-insoluble polymers coincided also to a net increase
in total glutenin polymer content in bread wheat (Gupta et al., 1996, Rhazi et al., 2003a, Shewry
et al., 2009b). This last feature suggests that until the beginning of grain dehydration, a large
number of glutenin subunits would remain present as monomers. In contrast, Bénétrix et al.
76
8 A!**/B % 2
:
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""
(% GWC)
45
40
35
30
HT1
HT2
HT3
LT
25
20
15
10
5
20
30
40
50
60
Days after anthesis
Figure S II-4. Grain water concentration versus days after anthesis. Day/night temperatures
were increased from 19.9/13.8°C (LT) to 27.5/21.6°C either during the linear grain-filling (HT1),
the dehydration (HT2) or the whole grain development (HT3) phases. Data are means ± SE for n
= 6 independent replicates. The non-hatched zone highlights the late phase where SDSinsoluble polymers accumulated.
The longer duration of the phase of rapid grain dehydration observed for HT3 and HT1, could
be related to their high protein concentration. In vitro, suspensions of wheat gliadin or gluten
spontaneously organize into an elastic weak gel at 0.25 to 0.30 g mL-1 (Xu et al., 2001). For LT
and HT2, showing grain protein concentration of 11.75%, the critical gel concentration (0.25 g
mL-1) would be attained at a GWC of ca. 35%, whereas it would occur at 40% GWC for HT3 (for
details of calculations see Supplementary Text S1 at JXB online). For HT3, formation of a
continuous visco-elastic matrix would occur just after grain dry mass accumulation stopped, i.e.
as water loss began. High protein concentration, guarantees the saturation of the starch
granules bed by a visco-elastic gluten matrix. Grain water loss will be slow and lead to a matrix
condensation. As starch granules are embedded in gluten, water loss results in plastic grain
shrinkage. In these conditions, a dense and vitreous endosperm is finally obtained. In opposite,
when grain protein concentration is low, dehydration will proceed rapidly because the capillary
tension between starch granules is low. Air invasion occurs and a mealy endosperm is obtained.
Thus, HT during grain filling appears as a key parameter that would control final grain texture
and protein quality, simply through its effect on maximum grain water content and differential
rates of protein and starch translocation to the grain.
78
Chapitre II
5. Acknowledgements
This work was supported by the Fond Unique Interministériel (GARICC project, grant n° 06-290-6310) through the Q@liMéditerranée competitiveness cluster. Dr. Yves Popineau is
acknowledged for the helpful comments on earlier version of the manuscript. The authors
thank Joëlle Bonicel, Axelle Bouder, Bernard Bonnemoy, and Nicole Allard for excellent
technical assistance.
6. Supplementary data
Text S1. Calculation of the water concentration of storage protein
When grain filling is completed (below 45.9% moisture content), ratio of storage protein to
water content in endosperm cells can be valuated based upon the following assumptions:
- starch granules hold 0.25 mL of water per g of dry mass (w = 0.25)
- gliadin and glutenin, amount to 85% of total endosperm protein (a = 0.85)
- endosperm cells moisture content (%MC) is closed to that determined for the grain
- protein content of endosperm cells (P) is that of the grain minored by 1.5%,
- starch and protein constitute 95% of total dry mass content of endosperm cells
Starting from grain protein concentration (P), it can be calculated:
Endosperm Protein content (EP)
Endosperm Starch content (ES)
EP = (P-1.5)
ES = 95-EP
Grain moisture content for which gluten proteins reach the critical gel concentration (C = 0.25 g
mL-1) or begin to condensate during grain desiccation (C = 0.5 g.mL-1), is given by :
% MC "
100 (a EP ! w C ES )
(a EP ! w C ES ! 100 C )
79
80
Chapitre III.
Evolution de l’état redox du
grain au cours de sa croissance
81
82
Chapitre III
Chapitre III- Evolution de l’état redox du grain au cours de sa croissance
Les résultats présentés dans le chapitre précédent ont mis en évidence que l’élévation de la
température durant la phase de remplissage du grain exerce un effet significatif sur l’agrégation
des gluténines et tout particulièrement sur les formes agrégées insolubles. Ces dernières
semblent négativement reliées aux taux de glutathion couplé aux gluténines.
En effet, au cours du développement du grain de blé, les sous-unités gluténines
s’accumulent après leur synthèse dans des corpuscules protéiques, dans les cellules de
l’albumen. Elles subissent alors plusieurs mécanismes d’oxydation, tels que la glutathionylation
et la formation de ponts disulfures (S-S) intermoléculaires. Ce dernier mécanisme entraîne leur
assemblage sous forme de polymères. Du fait de l’importance de ces mécanismes d'oxydoréduction, il nous a semblé intéressant d'étudier en parallèle l'évolution de l’état redox global
du grain au cours de son élaboration.
En vue d’approfondir nos connaissances sur les mécanismes d’assemblage des gluténines,
nous avons cherché dans ce chapitre à mettre en relation les changements d’oxydoréduction
des cellules de l’albumen et le niveau de polymérisation des gluténines, et ceci tout au long du
développement du grain. Pour cela, trois séries d’échantillons provenant de deux variétés (Orlu
et Dakter) cultivées aux champs ont été analysées. Il s’agissait notamment de cerner la
dynamique d’assemblage des gluténines pour deux variétés associées à différentes
compositions en SG-HPM et pour des grains présentant des textures très contrastées à la
récolte. L’évolution du statut redox du grain a notamment été jugée, de la fin de la phase de
cellularisation à la fin de la dessiccation, par la mesure : des activités spécifiques des enzymes
impliquées dans la détoxication cellulaire, des formes réduites et oxydées du glutathion, de
l’ascorbate et par le dosage des lipides peroxydés.
83
Relationship between endosperm cell redox homeostasis and glutenin polymerization
Relationship between endosperm cell redox homeostasis and the glutenin
polymerization in developing durum wheat
Mariana S. L. Ferreira, Joëlle Bonicel, Marie-Françoise Samson and Marie-Hélène Morel
Publication n°2 in preparation
1. Introduction
Wheat is a monocotyledon essentially composed by a germ, outer layers (brans) and an
endosperm. The latter consists of the aleurone layer and starchy endosperm, whose cells are
filled with starch granules embedded in a protein matrix. The starchy endosperm of durum
wheat contains between 10 and 16% of storage proteins. These proteins are accumulated
during the grain development and represent a source of amino acids for germination and
seedling growth (Richard et al., 1996).
In developing wheat endosperm, storage proteins are initially accumulated within protein
bodies (PB) and can be detected during the cellularization phase (Pernollet & Camilleri, 1983).
The route of protein deposition is not completely understood, PBs can be formed by direct
assembly in the ER lumen or by transport via the Golgi and Golgi-derived vesicles into the
vacuole. It has been recently proposed that it could be determined by the developmental stage
of the tissue (Tosi et al., 2009). In a physiological point of view, different types of storage
proteins can be co-located within the same PB (Loussert et al., 2008). At the physiological
maturity the PBs disappear to form a continuous protein matrix entrapping starch granules
(Shewry & Halford, 2002).
Storage proteins concentration and assembly mainly determine durum wheat quality. In
mature grains, these proteins account for 70 to 80% of the total proteins and can be divided
into monomers (i.e. Gliadin) and polymers (i.e. Glutenin). Gliadin contains only intra-chain
disulfide bonds. Glutenin polymers result from the assembly of glutenin subunits and their
molecular weight can extend up to several million mol.g-1 (Wrigley, 1996).
Glutenin polymerization takes place during mid to late grain filling. We have recently
proposed that glutenin oligomers accumulate during the linear grain filling still bearing some
free thiol (SH) groups (Ferreira et al., 2009). After physiological maturity these oligomers start
84
Chapitre III
to assemble into polymers and the average size of polymers increases while their last SH groups
become involved into inter-polymer SS bonds, resulting in a strong oxidation of SH groups. A
certain amount of the wheat glutenin polymers remains insoluble even in denaturing buffers
such as sodium dodecyl sulphate (SDS). These changes in the protein redox status involve
oxidation of protein SH groups such as the formation of inter-chain disulfide bonds (SS) and
glutathionylation. Considering the importance of these changes for the protein polymerization,
it seems interesting to make a parallel with the changes in the redox status within the
endosperm cells throughout grain development.
In this way, particular attention has been focused on glutathione (GSH) and ascorbate (ASC)
metabolisms. These two water-soluble non-enzymatic antioxidants have crucial roles in plant
metabolism and in defense system against reactive oxygen species (ROS) (Noctor & Foyer,
1998, Asada, 1999). Glutathione, the major low-molecular-weight thiol compound, has been
reported to be naturally present in wheat under reduced (GSH) and oxidized (GSSG) forms and
as well in protein-bound glutathione form (PSSG) (Chen & Schofield, 1995, Schofield & Chen,
1995). On the contrary, mature seeds are devoid of ASC and contain a moderate amount of
dehydroascorbate (DHA), the oxidized form of ASC (Arrigoni et al., 1992, De Gara et al., 1997,
Tommasi et al., 1999, De Gara et al., 2003).
The defense in the plant cell comprises also several antioxidant enzymes such as superoxide
dismutase (SOD; EC 1.15.1.1), catalase (CAT; EC 1.11.1.6), ascorbate peroxidase (APX; EC
1.11.1.11) and glutathione reductase (GR; EC 1.6.4.2). Considered as a major ROS-scavenger,
SOD is found in almost all cellular compartments and acts as the first line of defense catalysing
the dismutation of superoxide to hydrogen peroxide and oxygen (Mittler, 2002). APX and CAT
play also pivotal roles on the global H2O2 removal capability of cells. In the Asada-Halliwell
cycle, contrasting with CAT, APX reduces H2O2 using ascorbate as an electron donor (Asada,
1999). GR also participates in this cycle and catalyses the NADPH-dependent reaction for
maintaining the GSH pool.
It has recently appeared that ROS can act as cellular signalling molecules (Mittler, 2002,
Foyer & Noctor, 2005, Bailly et al., 2008, Møller & Sweetlove, 2010). The shift from a signalling
to a deleterious role has been related to an overproduction of ROS (Bailly 2008). The grain
desiccation phase in plant tissues has been often associated with ROS accumulation (McDonald,
85
1999), that can interact with other molecules causing damages to cellular components (Møller
et al., 2007). Lipid peroxidation has been considered as the main indicator of oxidative damage
inducing a loss of membrane integrity in seeds (McDonald, 1999), i.e. in sunflower (Gidrol et al.,
1989, Corbineau et al., 2002) and wheat (Lin et al., 2007).
In previous works on bread wheat grain, artificial and premature desiccation led to an
increase of the SDS-insoluble glutenin fraction during grain development (Carceller & Aussenac,
1999). Furthermore, recent works also showed an increase in large glutenin polymers as the
grain dries (Rhazi et al., 2003a, Shewry et al., 2009b). Despite these evidences in bread wheat,
data are lacking regarding the dynamic of grain protein polymerization in durum wheat.
The current study was undertaken to elucidate if changes in the endosperm redox-status
may impact on the mechanism leading to the polymerization of glutenins. The objectives of this
work were to characterize the physiological and physicochemical events occurring during grain
filling of durum wheat. These results are discussed in connection with the agro-climatic
conditions and the two contrasting genotypes (cv. Orlu and Dakter). Moreover, since
vitreousness and the polymerization degree are the two parameters determining respectively
semolina yield and cooking quality of pasta, we have also examined the different patterns
between starchy and vitreous grains.
2.1. Chemicals
All the reagents were purchased from Sigma Aldrich (Saint Quentin Fallavier, France),
except NADPH, ascorbic acid, NaBr, PEG 4000 which were obtained from Merck (VWR
International S.A.S, Fontenay sous Bois, France).
2.2. Field growth experiments
Durum wheats (Triticum turgidum L. var. durum Desf.) from two cultivars (cv. Orlu and
Dakter) were grown in 2008 in INRA experimental fields (Southern France) in two different
locations under conventional growing conditions (rainfed Mediterranean conditions,
fertilization and fungicide protection). Three samples named Orlu-1, Orlu-2 and Dakter were
used in this study. Caryopses from Orlu-1 were sown earlier (19 October 2007) than Orlu-2 and
Dakter (8 November 2007). Orlu-1 and Orlu-2 were grown in the same location but in two plots
86
Chapitre III
differing by soil depth. Thermal time accumulation was calculated from daily average
temperature hourly recorded. For each sample, 250 main-stem ears were tagged at anthesis,
which was estimated when the anthers of the central florets appeared. Ears were then
handpicked at different intervals from anthesis to ripeness, i.e. when grain water content
reached 10-12 % fresh mass (FM) basis. They were separated from the stems before storage at
-20°C. Additional fresh ears were used immediately for moisture content determinations. For
each sampling date, five ears stored at –20°C were then freeze-dried in order to reach a
moisture content comprised between 9 and 15%. Grains from the middle part of the ear were
separated and placed for 2 weeks at 25°C and 54% relative humidity (RH) above a saturated
NaBr solution until the grain water concentration (GWC) reached 12%. Whole grains and wheat
fractions (as described below) were ground for two minutes using a ball mill under liquid N2 and
stored at 4°C in sealed bottles for further analysis.
2.3. Preparation of wheat fractions
Five grams of freeze-dried grains were firstly degermed by cutting off the germ part with as
little endosperm as possible. A germ-rich fraction comprising embryonic axis and scutellum has
been prepared. The endosperm and the peripheral layers were separated from each other by
abrasion (Satake Model TM-05C, Stockport, UK) at a constant speed of 830 rpm. The abrasion
process was monitored by time control up to 10% of the total grain mass (as reviewed by
Hemery et al., 2007). After abrasion two fractions were obtained: an endosperm-rich part with
large parts of aleurone layer still present and a bran-rich fraction consisting of pericarp
fragments and other bran particles.
2.4. Water content and dry mass
For each sampling date, water content was determined on four ears by drying at 130°C until
constant dry mass (DM) be reached (4h). Dry mass was determined from whole grains
previously freeze-dried and after the GWC stabilized at 12%. The average dry mass was
obtained from three replicates of ten grains.
2.5. Vitreousness determination
Grain vitreousness was assessed by NIRS analysis (Gorretta et al., 2006). The results were
expressed as percentage of starchy grains.
87
2.6. Determination of grain protein composition by Size Exclusion-High Performance
Liquid Chromatography (SE-HPLC)
The composition and the size distribution of polymeric proteins were achieved by SE-HPLC.
Total SDS-soluble proteins were extracted from ground grains (160 mg) at 60°C for 80 min with
20 mL of 1% SDS (w/v) in 0.1 M phosphate buffer (pH 6.8) containing 4 mM iodoacetamide
(IAM) to prevent protein thiol (PSH) oxidation of during extraction. After centrifugation at
40,000 g for 30 min at 20°C, the supernatant was stored at –20°C until analysis. SDS-insoluble
polymeric proteins were extracted from the pellet with 5 mL of 1% SDS (w/v) in 0.1 M
phosphate buffer (pH 6.8) by sonication at 7.5 W for 3 min (Vibracel 72434, Bioblock Scientific,
Illkirch, France). The homogenate was centrifuged as described above. The chromatography
was performed using a HPLC Alliance system (Waters, Saint Quentin en Yvelines, France). The
extracts (20µL) were fractionated on a TSKgel G4000SWXL column (Tosoh Bioscience, Sigma
Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France) with 0.1% SDS (w/v) in 0.1 M phosphate buffer (pH 6.8)
as eluent. Elution flow rate was maintained at 0.7 mL/min, UV detection was performed at 214
nm and data recorded with Empower 2 software (Waters, Saint Quentin en Yvelines, France).
The chromatogram was divided into 5 fractions (F1-F5) on an elution time basis and according
to the known size distribution of the different wheat proteins (Dachkevitch & Autran, 1989).
Results are presented as percent of total protein, calculated from the sum of the areas of the
SDS-insoluble and SDS-soluble chromatograms, after correction for solid to solvent ratios. Total
content in polymeric glutenin was calculated as the sum of the areas of SDS-insoluble and the
first two fractions (F1, large and F2, small polymeric protein) of the SDS-soluble extracts. For
the SDS-soluble extract, the fraction F3 and F4 mainly include
-gliadin and !-/"-gliadin,
respectively; while the fraction F5 includes albumin/globulin plus some #-gliadin. Full details on
the procedure and column calibration are given in Morel et al. (2000b).
2.7. Determination of protein thiol, reduced and oxidized glutathione and protein-bound
glutathione contents
The protein thiol content (PSH) of ground grains (60 mg) was measured with acid
5,5’dithiobis (2-nitro-benzoic acid) (DTNB) (Morel & Bonicel, 1996b).
Glutathione compounds (GSH, GSSG and PSSG) were estimated using Tietze (1969)
glutathione reductase (GR) recycling assay adapted for a 96-well microtiter plate, for
88
Chapitre III
developing whole grains as well for wheat fractions from mature grains. Specific measurement
of GSSG was achieved by derivatization of extract aliquots with 2-vinylpyridine (VPD) to mask
GSH and to allow the determination of GSSG (Griffith, 1980). The determination of proteinbound glutathione form (PSSG) was performed on the same way. Total glutathione was first
extracted with sulphosalicylic acid and the pellet which contains precipitated proteins was used
to measure PSSG. Glutathione assays were performed using a Multiskan Ex microplate reader
(Thermo Scientific, Courtaboeuf, France).
In view of measuring the total grain glutathione content (GSH plus GSSG), series of 9 tubes
replicates containing 35 mg of ground grains and 350 µL of a 5% (w/v) sulfosalicylic acid
solution were prepared. The tubes were shaken (20 min), centrifuged (3,800 × g for 10 min) at
4°C and pooled into one batch. The supernatant was neutralized to pH 7.3 by the addition of
7.5 M triethanolamine. The neutralized supernatants (100 µL) were used for the determination
of total glutathione. The 250 µL remaining were pre-treated with 0.5% of VPD for 30 min at
20°C. The homogenate was centrifuged at 14,000 g for 10 min at 20°C.
Aliquots of 10, 7 and 5 µL of each supernatant were tested, in parallel with a series of GSSG
standard solutions (6 samples from 0 to 45 µM GSSG in 5% [w/v] sulfosalicylic acid, 5 mM EDTA,
14 mM triethanolamine). The sample volume was adjusted to 10 µL with the solution of
sulfosalicylic. The reaction mixture comprised 170 µM DTNB, 0.3 GR unit.mL-1, 1 mM EDTA and
0.1 M phosphate buffer (pH 7). After sample addition, the plate was shaken during 15 s and let
stand for 5 min before addition of 50 µL of 0.35 mM NADPH. For each assay, the initial reaction
rate (in DO.s-1) was estimated from the absorbance change monitored at 414 nm. The reaction
rates were plotted against the volume of supernatants (sample series) or against the
concentration of GSSG (standard series). Total glutathione and GSSG contents were obtained
from slope ratios of the two plots (samples vs standard series).
In order to determine protein-bound glutathione the remaining protein pellets were
neutralized with 3 µL of 7.5 M triethanolamine (pH 7.3) and reduced with TCEP (Tris 2carboxyethyl phosphine hydrochloride) in order to release the PSSG. As TCEP interfered with
the Tietze recycling assay, its amount was limited to two-third of total protein thiol equivalents
(ca. 120 µmol.g-1 protein). In addition, an internal calibration was used. Typically, the 9
alkalinised pellets were suspended with 700 µL of a series of 9 standard solutions of GSSG (from
89
0 to 45 µM in 300 µM TCEP, 5 mM EDTA). The tubes were sealed under an argon atmosphere
and shaken for 20 min before being centrifuged at 20,800 × g for 10 min, at room temperature.
Supernatants (10µL) were assayed as described above for the total glutathione assay. PSSG
content was calculated by plotting reaction rates against GSSG concentrations. The y-intercept
of the linear plot, once corrected for the basal reaction rate in absence of added GSSG was
divided by the slope. The basal reaction rate in absence of added GSSG was obtained by
assaying 10 µL of 5 mM EDTA, 30 mM triethanolamine and 5% [w/v] sulfosalicylic acid in place
of the pellet extract.
2.8. Analysis of Ascorbate pools
Total ascorbate content was determined after reduction of dehydroascorbate (DHA) to
ascorbate (ASC) with DTT. The DHA concentration was then estimated from the difference
between total ascorbate (ASC plus DHA) and ASC. ASC measurement was based on the
reduction of ferric (Fe3+) to ferrous ion (Fe2+) with ascorbic acid in acidic condition. The
following of Fe2+ production was performed at 525 nm after its complexation with 2,2’dipyridyl. Ground grains (200 mg) were homogenized with 1 mL of cold 5% meta-phosphoric
acid at 5°C for 20 min. The homogenate was centrifuged at 20,000 g for 15 min at 4°C and the
supernatant (100 µL) was immediately used for ascorbate assay as described by Kampfenkel et
al. (1995) with modifications. The reaction mixture for total ascorbate determination was
prepared with 50µL 0.2 M phosphate buffer (pH 7.4) and 50µL 10 mM DTT. After incubation for
15 min in a water bath at 40°C, 50 µL of 0.5% N-ethylmaleimide (NEM) was added to remove
excess DTT. ASC was measured in the same way except that DTT and NEM were replaced
respectively by 50µL of 0.2 M phosphate buffer (pH 7.4) and 50µL of water. The assay was
performed by adding 0.25 mL of 10% TCA, 0.2 mL of 44% ortho-phosphoric acid, 0.2 mL of 4%
2,2’-dipyridyl in 70% ethanol and 0.1 mL of 3% (w/v) FeCl3. After FeCl3 addition, samples were
immediately and vigorously vortexed to homogenize the mixture and avoid turbidity. The
mixture was then incubated for 40 min at 40°C. The standard curve was prepared with ASC in
TCA 6% in the range of 0-50 nmol.
2.9. Enzyme extraction and assays
Unless stated otherwise, all procedures for enzyme extraction were carried out according to
Lehner et al. (2006) with minor modifications. Ground grains (200 mg) were homogenized at
90
Chapitre III
4°C for 2 hours in 1 mL of 50 mM Tris-HCl (pH 7.8) containing 2 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 1.25
mM PEG 4000, 2% (w/v) of PVPP and 0.1% (w/v) BSA. The homogenates were centrifuged at
14,000 g at 4°C for 20 min and then the supernatants were immediately analyzed. Enzymatic
assays were developed on a Lambda 25 UV–Vis Spectrophotometer (PerkinElmer, Courtaboeuf,
France). Enzymatic activities were expressed on a per-grain basis normalized to Dakter final
grain mass; it means that once expressed in mol.grain-1, results were multiplied by the mass of
Dakter mature grains relative to the final grain mass of the sample. The results presented
correspond to the means ± SD of 3 different extracts, each measured 3 times.
GR (EC 1.6.4.2) activity was measured at 25°C as described previously by Esterbauer and
Grill (1978), by following the rate of NADPH oxidation. For this purpose, 100 µL of enzyme
extract were added to an assay mixture containing 0.38 mM NADPH, 1.1mM GSSG, 3 mM MgCl2
in a total volume of 1 mL and NADPH oxidation was recorded at 340 nm for 6 min. SOD (EC
1.15.1.1) activity was assayed using the nitroblue tetrazolium (NBT) method (Marklund &
Marklund, 1974). In the assay, superoxide ions (O2-) generated by xanthine oxidase (XOD) after
conversion of xanthine to uric acid and H2O2, converts NBT to NBT-diformazan, which absorbs
at 560 nm. SOD reduces the concentration of O2- and thereby lowers the rate of NBTdiformazan formation. Fifty microliters of enzyme extract were added to a reaction mixture
containing 0.2 mM NBT, 0.2 mM xanthine, 0.013 U XOD in 55 mM phosphate buffer (pH 7,8), 80
µM EDTA to a final volume of 1 mL. SOD activity was assayed at 25°C for 3 min. One unit of SOD
activity was defined as the amount of SOD contained in the extract which caused 50 %
inhibition of the NBT reduction. CAT (EC 1.11.1.6) activity assay was performed by following
the H2O2 dismutation at 240 nm according to Claiborne (1985) with modifications. Ten
microliters of enzyme extract were added in a reaction mixture containing 50 mM phosphate
buffer (pH 7), 30 mM H2O2 to a final volume of 1 mL. Absorbance changes were recorded at 240
nm for 3 min. The CAT activity was calculated using the extinction coefficient (43.6 M-1.cm-1).
2.10.
Malondialdehyde content measurements
Lipid peroxidation was evaluated by measuring malondialdehyde (MDA) content according
to Heath and Packer (1968). Ground grains (100 mg) were homogenized with 1.0 mL of distilled
water and an equal volume of 0.5% (w/v) 2-thiobarbituric acid (TBA) in 20% (w/v)
trichloroacetic acid (TCA). The homogenate was heated in a boiling water bath for 30 min and
91
then centrifuged at 16,000 g for 30 min. The supernatant was used for MDA determination
(extinction coefficient 155 mM-1.cm-1) at 532 and 600 nm. Results were expressed as nmol.g-1 of
dry mass (DM) or as nmol.grain-1 normalized and represented the means of 3 replicates ± SD.
2.11.
Statistics and data analyses
Differences in grain dry mass, water content, protein content and composition were
analyzed using one-way ANOVA (# = 0.05) followed by a Tukey’s test. The maximum rate and
duration of dry mass and protein content were estimated by fitting a 3-parameter logistic
function equation as described previously (Triboï et al., 2003). Grain water concentration (GWC)
at physiological maturity (i.e. end of grain filling) was determined by fitting a broken-stick linear
regression model (Calderini et al., 2000) to relative grain dry mass against water concentration.
Fitted rates between two different samples were considered as significantly different (# = 0.05)
when the confidence interval of the difference between the two treatments did not contain
zero (Sokal & Rohlf, 1995, Fowler et al., 1998).
3. Results
3.1. Grain filling: evolution of water, dry mass and protein content
Patterns of grain water content, dry mass and protein accumulation, of the three samples
are showed in Figure 1A-C. The water plateau seemed already attained at the first sampling
date (280°Cd) and was maintained up to about 460°Cd for Dakter while being longer (600°Cd)
for Orlu samples (Figure III-1A). Orlu-1 grains accumulated significantly more water (56.3 ± 3.8
mg.grain-1) than Orlu-2 and Dakter (46.0 ± 4.21 mg.grain-1.C°d-1). For all samples, the end of dry
mass accumulation occurred at 602 ± 56 °Cd but maximum grain-filling rate was significantly
higher for Orlu-1 (0.22 ± 0.018 mg.grain-1.C°d-1) than for Orlu-2 and Dakter (respectively 0.13 ±
0.011 and 0.11 ± 0.018 mg.grain-1.C°d-1). Therefore at maturity, average final grain weight for
Orlu-1 (65.01 ± 2.78 mg DM) was significantly higher than for Orlu-2 (49.10 ± 2.13 mg DM) and
Dakter (40.73 ± 3.68 mg DM).
In contrast, maximum rate of protein accumulation was not significantly different between
samples (0.018 ± 0.0022 mg.grain-1.°Cd-1). In average, protein accumulation stopped around
592 ± 41°Cd, but even if non-significant, the duration of protein accumulation was longer for
Orlu-1 (626 ±38°Cd) than Orlu-2 (605 ± 42°Cd) and Dakter (545 ±45°Cd). At grain maturity, a
92
Chapitre III
similar arrangement to the one observed for grain dry mass was obtained for grain protein
content with 6.7 ± 0.23, 5.9 ± 0.31 and 4.9 ± 0.38 mg for Orlu-1, Orlu-2 and Dakter grains,
respectively. Nevertheless due to its higher rate of grain dry mass accumulation, Orlu-1showed
lower protein concentration (10.21 ± 0.244%) compared to Orlu-2 and Dakter (respectively,
11.96 ± 0.22% and 12.11 ± 0.40 %) (Figure III-1D). Endosperm texture of mature grains varied
between samples. Grains from Orlu-1 exhibited 75% of starchy grains against 20% for Orlu-2,
whereas only vitreous grains were obtained for Dakter. Similar changes in the texture of durum
wheat grains in relation to grain protein concentration have been reported by Samson et al.
(2005). These authors showed among a collection of 4 durum wheat cultivars produced in
several locations that fully vitreous grains were always obtained above a threshold of 9.7% of
protein (FM, c.a. 11.2% in dry basis, Samson personal communication).
B
Orlu1
Orlu2
Dakter
60
60
40
40
20
20
8
CC
D
14
6
12
4
10
2
8
Water content (mg.grain-1)
80
A
Protein concentration (%)
Protein content (mg.grain-1)
Dry mass (mg.grain-1)
80
0
300
600
900
300
600
900
Figure III-1. Changes during grain development, in dry mass (A), water content (B), protein
content (C) and grain protein concentration (% DM) (D). Data are the mean ± SD for n = 3
independent measurements of 10 grains (dry mass).
93
3.2. Grain protein composition and pattern of deposition
Time course deposit of the different wheat protein classes as fractionated by SE-HPLC are
presented in Figure II-2. Data were expressed in percent of total protein content from the
mature grains, allowing comparison of the protein composition of the samples. Protein
composition and time course of protein deposits were found similar between the three samples
and differed only by subtle variations. Typically mature grains included 18.14 ± 0.55%
albumin/globulin, 34.41 ± 0.81% gliadin and 40.4 ± 1.05% total glutenin polymers. Nevertheless,
the final size distribution of the glutenin polymers differed between samples. Orlu-1 included
significantly lower proportion of SDS-insoluble polymers (4.86 ± 0.18%) than Orlu-2 and Dakter
(6.57 ± 0.82%). Deposit of gliadin and albumin/globulin ran in parallel and achievement of
accumulation arose similarly around 450-500°Cd (Figure III-2A). By comparison, progress in
total glutenin polymers accumulation was delayed until 400°Cd, before increasing readily up to
700-750°Cd (Figure III-2B). Accumulation of albumin/globulin and gliadin proceeded readily,
50
A
B
50
40
40
30
30
20
20
10
0
300
600
900
300
600
Orlu1
Orlu2 10
Dakter
0
900
Total glutenin polymers
(% protein of mature grain)
Alb/glo and gliadin
whereas increase in glutenin polymers followed a sigmoid pattern.
Figure III-2. Accumulation of the main grain protein classes during grain development. AAlbumin/globulin (circle) and gliadin (square) were determined from SE-HLPC profiles of SDSsoluble protein extracts (fraction 5 and 4, respectively). B- Total glutenin polymers (triangle
down) were determined from SE-HPLC profiles of SDS-soluble and SDS-insoluble protein
extracts (fractions F1, F2 and total profile area, respectively).
94
Chapitre III
Examination of SE-HPLC elution profiles revealed significant differences between mature and
immature grains mainly until 500°Cd. Some typical profiles obtained for Orlu-1 and Dakter are
showed in the Figure III-3. In immature grains, the fraction 4 which in corresponding mature
$%&'()* '(+,-./)* !- &(.* "- gliadins, displayed a marked upstream shoulder. This fast peak of
gliadin fraction (F4) progressively vanished, leaving only the slow classical gliadin peak
(respectively, P4f and P4s) as showed in the Figure III-3 (arrows). Evolutions of the fast and slow
peaks of the gliadin fraction (F4) are presented in Figure III-4. For both cultivars, the evolution
of P4s was parallel and its content continued to grow up until 550°Cd. For Dakter samples at
the beginning of grain filling P4f ran in parallel to P4s, until drop slightly around 450°Cd
thereafter remaining stable. For Orlu samples, P4f increase followed longer in parallel to P4s,
before dropping smoothly after 500°Cd then stabilizing around 600°Cd. For all series, drop in
P4f coincided to an upturn in small SDS-soluble glutenin polymers accumulation and to the
onset of large SDS-soluble polymers formation (Figure III-4). This coincidence supported that
the protein present in P4f participated to the formation of glutenin polymers. According to their
relative molecular mass (43,000) those proteins could be assimilated to free LMW-GS. To check
this assumption, protein extraction was performed also in absence of IAM. The absence of the
sulfhydryl alkylant agent led to P4f disappearance whereas proportion in glutenin polymers
increased. The feature corroborated the presence of free LMW-GS within the gliadin peak at
least until 500°Cd.
Absorbance 214 nm (A.U.)
0.25
0.20
0.15
A
P4f
365°Cd
473°Cd
601°Cd
681°Cd
F3
0.10
F1
F3
F5
F2
F1
B
P4f
338°Cd
372°Cd
462°Cd
593°Cd
F5
F2
0.05
P4s
P4s
0.00
7
9
11
13
15
17
19
7
9
11
13
15
17
19
elution time (min)
Figure III-3. Typical evolution of SE-HPLC profiles of SDS-soluble protein extracts from Orlu-1 (A)
and Dakter (B). Vertical bars marked the time elution intervals used for quantification of
fractions F1 to F5. F1- Large and F2- small SDS-soluble glutenin polymers, F3 and F4- gliadins
and F5- Albumin/globulin. Arrows indicated the fast (P4f) and slow (P4s) eluting peaks in the F4
(gliadin).
95
The onsets of glutenin polymers accumulation ranked according to their mean molecular
sizes (Figure III-4B). Hence accumulation of small SDS-soluble polymers was accomplished
around 600°Cd, whereas large SDS-soluble and SDS-insoluble glutenin polymers just started to
accumulate (450-500°Cd) and concluded later (700-750°Cd). Only slight differences in glutenin
polymers accumulation patterns were observed between samples. It refers to the up-turn in
the accumulation profile of SDS-soluble polymers which was more delayed for Orlu compared
to Dakter cultivar, indicating that the involvement of free LMW-GS present in the P4f into
30
30
A
B
25
25
20
20
15
15
10
10
Orlu1
Orlu2
Dakter
5
5
0
0
300
600
900
300
600
900
Large and small SDS-soluble polymers
SDS-insoluble polymers
P4f and P4s of gliadin peak
polymers structure stopped earlier in Dakter samples (Figure III-4).
Figure III-4. A- Evolution of P4f (circle), P4s (square) from gliadin peak and B- accumulation of
small (square), large (circle) and SDS-insoluble glutenin polymers (triangle).
3.3. Grain protein redox status
During grain development, similar patterns of protein sulfhydryl contents (PSH, in µmol.g-1
protein) were observed for all samples (Figure III-5A). For Orlu-2 and Dakter, PSH content
decreased readily from about 300°Cd (0*12*3mol.g-1 protein) until 500°Cd, where a stable value
of 6 µmol.g-1 protein was attained. For Orlu-1, PSH drop was delayed until 470°C, finally
reaching similar value as the other samples. It was noteworthy that the end of PSH decay
coincided to the onset of large SDS-soluble glutenin polymers accumulation. Therefore, the PSH
content drop marked the involvement of protein sulfhydryl groups (SH) into inter-chain
disulfide bonds (S-S).
In contrast to relatively similar time course evolutions of PSH contents, kinetic of proteinbound glutathione (PSSG) formation differed between Orlu and Dakter samples (Figure III-5B).
96
Chapitre III
The PSSG formation occurred more readily for Dakter samples and reached its maximum
around 450°Cd. For Orlu series, PSSG levels increased more progressively, especially for Orlu-1
where the maximum level was attained beyond 750°Cd (Figure III-5B). The increasing profiles of
PSSG seemed closely linked to changes in the accumulation of small SDS-soluble glutenin
polymers, particularly for Dakter profiles growing faster in both cases (Figure III-4B). In all cases,
PSSG content was very low (0.3-0.5 µmol.g of protein-1) at the beginning of grain filling phase
and ultimately reached similar contents averaging 2.5 µmol.g of protein-1.
PSH
(µmoles.g-1 protein)
B
A
50
Orlu1
Orlu2
Dakter
40
3.0
2.5
2.0
30
1.5
20
1.0
10
0.5
PSSG
(µmoles.g-1 protein)
3.5
60
0.0
0
300
600
900
300
600
900
Figure III-5. A- Evolution of protein sulfhydryl groups (PSH) and B- protein-bound glutathione
(PSSG) contents during grain development. Data are the means ± SD for n = 3 independent
measurements.
3.4. Evolution of Glutathione pool
The distribution of total GSH equivalents (GSH+GSSG) and PSSG in the different grain tissues
was estimated after fractionation of mature grains into endosperm-, bran- and germ-rich
fractions for Orlu-2 and Dakter samples (Figure III-6). The germ-rich fraction exhibited the
highest levels of both total GSH eq. and PSSG per g of DM (Figure III-6A). Bran- and endospermrich fractions included similar contents of GSH and PSSG. Although the highest glutathione
content was found in the germ-rich fraction, this tissue represents the smallest proportion of
the whole wheat grain (3%). When data were expressed on a per-grain basis, using the relative
amounts of tissues previous reported for mature wheat grain (Kent & Evers, 1994, Barron et al.,
2007), the germ-rich fraction still exhibited a substantial proportion of GSH pool, accounting for
25% of the content measured on grain (Figure III-6B). Nevertheless, it was clear that the
endosperm-rich fraction contained by far the greatest amount of total glutathione compounds,
97
as free- and protein bound-form (GSH eq. and PSSG), accounting respectively for 68% and 77%
of the total GSH and PSSG contents of the grain.
GSH or PSSG
(Eq. GSH nmol.g-1 of DM)
3500
2800
2100
1400
700
B
% GSH or PSSG. grain-1
endosperm-rich
bran-rich
germ-rich
A
100
80
60
40
20
0
0
Orlu
Dakter
GSH
Orlu
Orlu
Dakter
PSSG
Dakter
GSH
Orlu
Dakter
PSSG
Figure III-6. Distribution of total glutathione and protein-bound glutathione contents in the
different wheat fractions from mature grains for Orlu-2 and Dakter samples, expressed as Aper mg of dry mass and B- per grain basis.
Since the grain dry mass, protein and water contents change continuously during grain
development, activities of antioxidant enzymes and metabolites were reported on a per grain
basis, instead of on a per weight or per mg protein basis. In order to suppress the shifts caused
by the different potential final grain weights, a mass adjustment was performed using Dakter
mature grain as reference (i.e. once expressed in mol.grain-1 the data were previous multiplied
by 40.75/65, 40.75/49 and 40.75/40.75, for Orlu-1, Orlu-2 and Dakter samples, respectively).
Contents of total free glutathione expressed as GSH eq. remained rather low during the grain
filling phase before rising significantly as the physiological maturity approached (Figure III-7). At
maturity, similar contents of total GSH were observed for all samples averaging 20.45 ± 1.65
nmol GSH eq.grain-1 normalized (± SE). For all samples, the content in oxidized glutathione
(GSSG) increased significantly beyond 600°Cd, as the grain entered into the desiccation phase.
At maturity, GSSG accounted for 4.5 ± 0.86 nmol.grain-1 normalized. In average, in mature
grains 50.5 ± 3.67% of glutathione was in protein-bound form while 22.9 ± 1.92% and 27.8 ±
5.5% were respectively, in oxidized and reduced state.
98
GSH and GSSG
(nmoles.grain-1 normalized)
Chapitre III
20
Orlu-1
GSSG
GSH
15
Orlu-2
Dakter
10
5
0
300
600
900
300
600
900
300
600
900
Figure III-7. Evolution of reduced (GSH, empty circle) and oxidized (GSSG, full circle) glutathione
independent measurements.
Due to the coinciding presence of protein sulfhydryl (PSH), glutathionylated protein (PSSG),
oxidized (GSSG) and reduced (GSH) glutathione forms within endosperm cells, a relationship
between these different species were examined by considering their interplay, according to:
PSH + GSSG
! PSSG + GSH
with
K1 = [PSSG]*[GSH]/[GSSG]*[PSH]
(1)
The evolution patterns of the equilibrium constant (K1, equation 1) estimated for the
different samples as function of the accumulated thermal time (°Cd) are showed in the Figure
III-8. Data are presented as normal and semi-log scales since K1 spanned several decades. The
equilibrium constant draws close to unity (1) around 600°Cd, i.e. at the end of protein
accumulation. Unity is typically the value expected for the different glutathione forms at
chemical equilibrium (Gilbert & Lester, 1995). From the first investigated sampling date up to
400°Cd, K1 remained low below 0.2 reflecting the low content of GSSG relative to GSH and the
high content of PSH. Thereafter K1 progressively shifted toward unity indicating that cell
metabolism failed to maintain the redox potential needed to keep PSH into reduced form.
Depletion in reduced nucleotide coenzymes and redox enzymes which till then were
regenerated by the cell machinery was likely to occur from 400 to 600°Cd. The evolution of K1
was faster for Dakter samples and was reminiscent of the higher oxidation rate of the reduced
proteins present in P4f compared to Orlu samples.
99
K1
[GSH] [PSSG] / [GSSG] [PSH]
1
Orlu1
Orlu2
Dakter
2.0
1.5
0.1
1.0
0.5
0.0
300
0.01
300
600
600
900
900
Figure III-8. Evolution of the equilibrium constant (K1) of protein thiol oxidation by oxidized
glutathione (semi-log scale). Inset graph shows the same results in normal scale.
3.5. Evolution of Ascorbate pool
Ascorbate (ASC) was the prevalent form at the beginning of the grain filling phase. From the
entry of the grain into desiccation phase ASC dropped, whereas its oxidized form (DHA)
remained almost the only present (Figure III-9). Differences in ascorbate pool between the
three samples were not significant. Nevertheless, even if both cultivars (Orlu and Dakter)
showed the same profiles of ASC oxidation, ASC remained present for Dakter at very low levels
until maturity. These results are in agreement with previous works, which showed that the
seeds at the end of their development are devoid of ASC and contain a moderate amount of
DHA (Arrigoni et al., 1992, De Gara et al., 1997, Tommasi et al., 1999, De Gara et al., 2003).
3.6. Lipid peroxidation
Oxidative degradation of lipids during grain development was evaluated by the
determination of malondialdehyde (MDA) content (Figure III-10). For Orlu-1 and Orlu-2 samples
similar MDA contents were obtained, with steady profiles before the physiological maturity
(600°Cd). However a slight decrease after the physiological maturity was observed, resulting in
lower MDA contents for mature grains than for immature grains at the grain filling phase.
Dakter grains presented approximately the same MDA content at maturity as Orlu grain.
Nevertheless, higher contents prevailed at the beginning of grain filling period, characterizing a
more sharply decreased during the grain filling phase compared to Orlu samples.
100
Chapitre III
ACS and DHA
(nmol.grain-1 normalized)
60
ASC
DHA
50
Orlu-1
Orlu-2
Dakter
40
30
20
10
0
300
600
900
300
600
900
300
600
900
MDA
-1
(nmoles.grain normalized to Dakter)
Figure III-9. Evolution of dehydroascorbate (DHA, empty circle) and ascorbate (ASC, full circle)
independent measurements.
6
5
4
3
2
1
0
300
600
900
Figure III-10. Evolution of malondialdehyde content (MDA) during grain development for Orlu-1,
Orlu-2 and Dakter. Data are the means ± SD for n = 3 independent measurements.
3.7. Activities of antioxidant enzymes
The GR activity increased just from the first date investigated (280°Cd) (Figure III-11A). Until
400°Cd, GR activity was significantly greater for Dakter than for Orlu samples (16.86 ± 1.21
versus 10.16 ± 1.86 units.grain-1 normalized, ± SE). Beyond 450°Cd, GR activity started to
increase almost linearly up to 750°Cd while discrepancies between samples decreased. At
maturity, GR activities were similar to previous work on durum wheat (De Gara et al., 2003).
Increase in GR during grain development was consistent with Paradiso et al. (2006), who found
higher GR activity in semolina prepared from mature than from immature grains. In addition,
Lehner et al. (2006) showed that GR activity of wheat embryos increased during the desiccation
phase, remaining high in mature grains of bread wheat.
101
SOD activity started to increase steadily from 350-400°Cd and up to the grain physiological
maturity (600°Cd) (Figure III-11B). Thereafter SOD activity remained stable during grain
dehydration. The same evolution of the SOD activity profile was found for the three samples,
except that below 440°Cd SOD activity was significantly higher for Orlu-2 grains (1.57 ± 0.28
versus 1.1 ± 0.19 units.grain-1 normalized, ± SE). During the late period of grain filling and
before the physiological maturity SOD activity increased more rapidly than GR activity (400600°Cd).
In contrast with SOD and GR activities, CAT followed complex up and down variations. For
Dakter and Orlu-2, CAT activity increased rapidly up to 350°Cd before dropping sharply by 5 to 6
folds, reaching a minimum around 480°Cd. Then a prompt restoration of the activity occurred
as the grain entered into desiccation phase (Figure III-11C). CAT activity was maintained
relatively high in mature grains. For Orlu-1 , variations in CAT activity were smoother and the
transient minimum of activity was shifted around 600°Cd. Whereas for Orlu-2 and Dakter decay
in CAT activity occurred during the grain water plateau of the grain, Orlu-1 showed a more
stable activity profile during the same period. In average, Orlu-1 showed lower levels of CAT
activity during most of the grain filling period compared to Orlu-2 and Dakter.
102
GR activity
(nmoles.min-1.grain-1 normalized)
Chapitre III
50
A
40
30
20
Orlu1
Orlu2
Dakter
10
0
300
600
900
4
40
C
B
30
3
20
2
Orlu1
Orlu2
Dakter
1
10
0
0
300
600
900
300
600
900
CAT activity
(µmoles.min-1.grain-1 normalized)
SOD activity
(unit.grain-1 normalized)
Figure III-11. Evolution of the activities of A- glutathione-reductase (GR), B- superoxidedismutase (SOD) and C- catalase (CAT) during grain development for Orlu-1, Orlu-2 and Dakter.
Data are the means ± SD for n = 3 independent extracts made in triplicate.
4. Discussion
This work was focused on the mechanism of glutenin polymer assembly in relation to the
redox status of the grain. To this end, two cultivars (Orlu and Dakter) belonging to the elite
durum wheat germplasm were chosen. Both expressed LMW-GS type 2 and so can be
assimilated to superior pasta making quality cv (Pogna et al., 1988). Nevertheless, the two
cultivars differ in respect of their HMW-GS allelic composition, Orlu cv. possesses the 1B20x and
20y subunits pair, instead of 1B7x and 8y for Dakter. Among the different 1-B encoded HMWGS, the 20 subunits are known to present a poor pasta making quality (Peña et al., 1994, Liu et
al., 1996).
Orlu samples were field-grown in two plots of the same experimental domain and Orlu-1
was sown three weeks before Orlu-2 and Dakter. Dakter was cultivated at less than 10 km
103
distance from Orlu samples in a plot with a similar soil type as Orlu-2. All crops experienced
similar cultural practices and did not present any sign of temperature stress. Orlu-1 plants
flowered one week before Orlu-2 and Dakter. Orlu-1 crop showed a reduced number of grains
per spike (-27%), an increased grain dry weight (+25%) and a decreased grain protein
concentration (-13%) when compared to Orlu-2. Because superior grain weight compensated
for lower grain number, yields were similar for the two Orlu crops (differing by 3%) indicating
equivalent sink potential at anthesis. The lower grain N storage efficiency (by 16.3%) of Orlu-1
was attributed to the clay-calcareous soil of the plot in conjunction with water shortage during
stem elongation. Variation in soil composition are known to affect pre-anthesis N and C storage
and post-anthesis remobilization (Ercoli et al., 2006). In contrast Orlu-2 and Dakter were sown
on a deep alluvial soil exhibiting high water holding capacity. They developed leafier canopies
and showed higher florets fertility than Orlu-1. The positive relationship linking spike biomass
and/or N content at anthesis and final grain number is well established (Fischer, 1993, Justes et
al., 1997, Demotes-Mainard et al., 1999, Ercoli et al., 2006, Sinclair & Jamieson, 2006). In
wheat crop, 60 to 92 % of the final grain protein content derives from nitrogen remobilized
from the vegetative organs (Löffler et al., 1985). In agreement with our results on Orlu samples,
Masoni et al. (2007) reported that plants grown on a clay-loam soil, stored higher amounts of N
which was remobilized with a 25% higher efficiency, compared to plants grown on a sandyloam soil.
At first glance, patterns of glutenin polymers assembly appeared similar irrespective of
cultivars or final grain protein content. At the first date investigated (280°Cd), contents in large
SDS-soluble or SDS-insoluble glutenin polymers were almost null. Nevertheless, small SDSsoluble glutenin polymers were present and also free LMW-GS, co-eluting within the gliadin
peak of SDS-soluble proteins SE-HPLC profile. Occurrence of free LMW-GS carrying sulfhydryl
groups at the beginning of grain filling period has already been reported on bread wheat (Gobin
et al., 1997, De Gara et al., 2003, Rhazi et al., 2003a). Around 400-450°Cd, accumulation of free
LMW-GS slowed-down at the benefit of small SDS-soluble polymers and as accumulation of
large SDS-soluble and SDS-insoluble glutenin polymers started. A drop in PSH content
accompanied glutenin polymers accumulation and molecular size growth up to 500-550°Cd.
These features were consistent with glutenin subunits assembly through disulfide bonds
toward polymers structures. The delay in accumulation of large SDS-soluble and SDS-insoluble
104
Chapitre III
glutenin polymers, compared to the straightforward accumulation of the small SDS-soluble
ones, attested for a progressive increase in polymers size. Careful examination of the evolution
of P4f patterns allowed distinguishing Dakter from Orlu samples by the earlier involvement of
their free LMW-GS (P4f) into polymers. Differences between Orlu and Dakter could originate
from their specific HMW-GS compositions (i.e. 20x+20y or 7x+8y, HMW-GS pair). Because
subunit 20x lacks two cysteine residues, compared to others equivalent x subunits, its insertion
into glutenin polymers has be proposed to be impaired (Morel & Bonicel, 1996a, Shewry et al.,
2003a). LMW-GS subunits were proposed to build-up branches anchored to backbones of linear
polymers constituted mainly by HMW-GS (Lindsay & Skerritt, 1999, 2000). In the context of this
structural model, the delay in the HMW-GS backbone building would slow down LMW-GS
insertion into glutenin polymers.
Accumulation of glutenin polymers coincided with appearance of glutathionylated proteins.
For Dakter, glutathionylation proceeded readily and leveled off around 450°Cd, whereas for
Orlu samples it proceeded slowly and spread out until the beginning of grain desiccation phase.
A parallel could be established with the different rates of P4f decay observed for Dakter and
Orlu samples. The coincidence support that glutathione would play a pivotal role in glutenin
polymer assembly. Rhazi et al. (2003b) showed that in bread wheat, accumulations of SDSinsoluble glutenin polymers and PSSG coincided and started as the grain went on desiccation.
At grain maturity, they found that SDS-insoluble polymers consisted of 25 to 45% of the total
polymeric fraction whereas the PSSG level was about 7-8 nmol.grain-1, depending on the HMWGS composition of cultivars.
Mature grains from both Orlu and Dakter cultivars included approximately a two-fold higher
PSSG content (13-17 nmol.grain-1 normalized) and lower SDS-insoluble polymers contents
(12.8-16% total glutenin polymers). At first sight, the negative relationship established by Rhazi
et al. (2003b) between the amount of protein-S-glutathionylated and glutenin polymer size
might also apply for durum cvs. Nevertheless, when expressed on a total protein basis, PSSG
contents measured in this work (in average 2.5 µmol.g-1 total protein) were close to the 1.752.0 µmol.g-1 of total protein found on bread wheat (Rhazi et al., 2003b). Nevertheless, the two
species differed markedly according to their glutenin polymerization patterns. In bread wheat,
grain desiccation boosted the accumulation of glutenin polymers by 25-30%, at the direct
benefit of SDS-insoluble glutenin polymers (Rhazi et al., 2003b, Tea et al., 2005, Shewry et al.,
105
2009b). For Dakter and Orlu samples and in accordance with previous reports on durum grain
development (Bénétrix et al., 1994) size increasing of glutenin polymers was continuous and
stopped as grain went into desiccation. Especially and contrarily to bread wheat, formation of
SDS-insoluble glutenin was not noticeably boosted by grain water loss. Moreover, for Orlu
samples and above all for Dakter, protein-S-glutathionylation occurred mostly during the grain
filling phase and not during grain desiccation. Differences between durum and bread wheat
species point to different building mechanisms and final architectures of glutenin polymers.
Increase in PSSG and decay in PSH groups indicated that endosperm cells shifted towards a
more oxidant environment as grain filling progressed. Concentrations of redox species were
estimated by considering grain water contents. Typically in the middle of the grain filing phase
(350°Cd) concentration of GSH and ASC were around 0.25 mM and 1.5 mM, respectively. In
mature grains, the average cell redox potential estimated from [GSH]2/[GSSG] ratio reached –
180 mV, consistently with the orthodox status of wheat grain (Kranner et al., 2006). The high
value calculated in the middle of the grain filling period (-138 mV) was unlikely to reflect the
true endosperm cell redox potential. This artificial estimation is likely to originate from the
irregular distributions of water and glutathione within cell organelles and grain histological
tissues.
Ascorbic acid whose content dropped suddenly as the grain went into desiccation, would
play a critical role in maintaining cell metabolism until grain physiological maturity. Indeed
endosperm cells redox homeostasis is likely to be regulated by the interplay between ASC and
GSH and all the enzymes of the Asada-Halliwell cycle are present in the cytosol of plant cells
(Potters et al., 2002). De Gara et al. (2003) reported that several redox enzymes involved in the
ASC/DHA turnover (ascorbate peroxidase, dehydroascorbate reductase, ascorbic free radical
reductase) were active during wheat grain filling period. In this respect, the increasing in GR
and SOD activities observed during grain filling phase highlighted the cell metabolism action
against oxidation. It is exemplary because both enzymes are involved at the two edges of the
Asada-Halliwell cycle (Foyer & Noctor, 2011).
Beyond 350°Cd, CAT activity dropped abruptly by 5 up to 7 times for Orlu-2 and Dakter
samples. For Orlu-1 the drop was less abrupt and extended as far as 600°Cd. The role of CAT
deficiency and the subsequent H2O2 accumulation in the triggering of programmed cell death
106
Chapitre III
(PCD) is well documented (Vandenabeele et al., 2004, Gechev & Hille, 2005). Drop of CAT
activity during grain filling might signal the onset of PCD. In wheat, whereas the aleurone layer
remains alive until advanced stages of the grain development, the PCD concerns specifically the
endosperm cells and progresses stochastically since the onset of the grain filling phase or the
water plateau period (Young & Gallie, 1999, 2000). It has been reported that PCD of endosperm
cells would not impaired starch and storage protein accumulation, since even after nucleus
disintegration, cytoplasm and endoplasmic reticulum remained in place (Li et al., 2004a). In a
PCD context, it might be hypothesized that the raise in K1 above 400°Cd could coincide to the
beginning of the loss of protein bodies’ integrity and the spreading of storage protein within the
cytosol.
The main function of endosperm cells is to store N and C assimilates into starch and storage
protein and most of their metabolic machinery is likely to be dedicated to that aim. In order to
keep metabolic proteins in reduced state, often mandatory for their proper catalytic activity,
the cell redox potential has to be maintained to a low value. Plant cells used to regulate redox
potential by maintaining mM amounts of glutathione in reduced state. Being in excess ahead
others redox couples, glutathione may then buffer cell redox changes. In endosperm cells, the
redox buffer provided by glutathione could be questioned. Indeed the large content in PSH (30
times greater than GSH equivalents at 450°Cd) makes glutathione as the redox buffer of the
endosperm cytosol only under the strict partitioning of storage proteins within PBs. In other
words as soon as storage proteins invade cytosol they would become the preferential sink of
ROS.
In this way, the catalase role should be discussed in conjunction with the PSH oxidation,
protein S-glutathionylation and glutenin polymers assembly. First of all, drop of catalase is likely
to result in an increase in H2O2 within endosperm cells. Incapacity of cell to deal with H2O2
accumulation through the Asada-Halliwell cycle could trigger the direct oxidation of glutenin
subunits according to:
2PSH + H2O2
! PSSP + 2 H2O
(2)
Presence of catalytic traces of heavy metal could also definitively impair polymer size growth
through reactions of PSH with hydrogen peroxide or superoxide anion radical:
(PSSP)nPSH + 3H2O2 ! (PSSP)nPSO3H + 3 H2O
107
(3a)
(PSSP)nPSH + O2 + OH ! (PSSP)nPSO3H
(3b)
The SOD activation may prevent the last deleterious reactions, whereas GR in conjunction
with APX may promote GSSG recycling. Drop of catalase activity is expected to depreciate H2O2
scavenging thereby triggering glutathione oxidation by APX and DHAR (De Pinto et al., 2006).
Increase in GSSG/GSH ratio favours protein-S-glutathionylation according to reaction (1).
Metabolites released as well as the storage protein in the cytosol would be the target of Sglutathionylation. In fact, blocking of glutenin sulfhydryl groups prevents themselves from an
irreversible oxidation which otherwise would definitely endanger polymer assembly. Again the
elevated SOD and GR activities during the grain filling period indicates their contribution in the
protect mechanisms that have been switch on in response of ROS accumulation.
Until 450-500°Cd, PSSG levels remain low and represent less than 5% of the total PSH. This
feature was consistent with the well established transient nature of protein S-glutathionylation
during oxidative stress (Beer et al., 2004). Typically, the sulfhydryl group from glutathionylated
proteins reacts rapidly with a vicinal sulfhydryl group and form an intra-chain disulfide bond,
according to:
PSSG|SH + GSH
! PS2 + 2 GSH
(4)
In the particular context of wheat glutenin polymers build-up, involvement of protein Sglutathionylation as a way to disulfide pairing of subunits can also be proposed:
PSSG + PSH
! PSSP + GSH
(5)
According to Rhazi et al. (2003b) and Tea et al. (2005), glutathione interacts with glutenin
during grain development and in mature grains is recovered at 85% as bound to the protein
polymeric fraction (Grosch & Wieser, 1999). According to our results, the germ-rich fraction
exhibited a substantial proportion of GSH accounting for 25% of the total grain content. Taken
together these results indicate that glutenin is the main target of glutathionylation. In addition,
Kölher et al. (1996) demonstrated, using added S35 glutathione, that the target cysteine
residues were those expected to be involved in glutenin subunits pairing. In addition, Rhazi et
al. (2003b) measured predominantly glutathione bound to polymeric glutenin in mature grains
and found values ranging from 6.3 to 6.9 µmol.g-1 polymeric glutenin. If by analogy we estimate
that 85% of total PSSG in mature grains is bound to glutenin polymers, values ranging from 5.4
to 6 µmol.g-1 polymeric protein can be designed. Surprisingly and irrespective of large contrast
108
Chapitre III
in glutenin subunits composition of bread and durum wheat species, similar ratios of gluteninbound glutathione are found. It might indicate that LMW-GS are the main targets of Sglutathionylation. Despite their low content of glutathione per g of glutenin polymers, mature
grains from Orlu and Dakter did not present remarkable amounts of SDS-insoluble glutenin
PSH
CAT
Glutenin Pol.
PSSG
60
3.5
3.0
50
2.5
40
2.0
30
1.5
20
1.0
10
0.5
-1
PSSG (µmoles.g protein)
Total glutenin polymers (% total grain protein)
-1
PSH (in µmoles.g protein)
-1 -1
CAT activity (µmoles.min .g protein)
polymers.
0.0
0
200 300 400 500 600 700 800 900
Figure III-12. Evolution patterns of protein sulfhydryl groups (PSH, empty circle), catalase
activity (triangle down), protein-bound glutathione (PSSG, grey diamond) and glutenin
polymers accumulation (empty diamond).
As already highlighted, S-glutathionylation progressed faster for Dakter compared to Orlu
samples, coinciding clearly to the catalase activity and PSH drops (Figure III-12). In addition for
Dakter samples, polymer accumulation was still progressing after 460°Cd while Sglutathionylation has already been completed. Comparing Orlu and Dakter, it appears that
paradoxically, fast S-glutathionylation favoured polymerization rate. Moreover Dakter mature
grains were those showing the higher amount of SDS-insoluble glutenin polymers. Gathering on
a single frame the results of Rhazi et al. (2003b) on bread wheat, a reconciling hypothesis can
be proposed with our results obtained on durum wheat. Until enclosed in PBs, glutenin
subunits would start to assemble into small SDS-soluble polymers. Above a critical cell crowd
caused by starch granules, a physical disintegration of PBs would occur. The release of glutenin
into the cytosol would coincide to a drop in catalase and a burst of H2O2 triggering PCD. Then,
binding of glutathione to glutenin would occur preventing an irreversible oxidation of the
sulfhydryl groups into sulphonic or sulphinic forms. Through disulfide exchanges as catalyzed by
109
PDI (Every et al., 2003), glutenin polymer size growth would go on until molecular mobility
stopped due to the grain water loss. The earlier protein-S-glutathionylation occurs, the better
will be the prevention of sulfhydryl groups from irreversible oxidation and the more polymer
size will grow. The negative relationship between PSSG content and polymer size on bread
wheat (Rhazi et al., 2003b) would just reflect the well know negative relationship linking
glutenin polymer size and LMW-GS content. Indeed small polymers are richer in LMW-GS and
thus include more potential target for S-glutathionylation.
110
Chapitre IV.
Dynamique d’assemblage des
polymères de gluténines
111
112
Chapitre IV
Chapitre IV- Dynamique d’assemblage des polymères de gluténines au cours du
développement de grains de blé dur
Au cours des chapitres précédents nous avons étudié la dynamique d’accumulation des
protéines de réserve et d’assemblage des polymères de gluténines au cours du développement
du grain, et ce pour deux variétés. Nous avons également analysé les effets de températures
élevées appliquées à différents stades du développement du grain, sur ces modalités. A partir
de là, il apparaît important de cerner le mécanisme d’assemblage des gluténines sous forme de
polymères. Plusieurs modèles structuraux ont été avancés pour décrire les polymères de
gluténines, toutefois à l’heure actuelle, les données concernant les mécanismes d’assemblage
intervenant au cours du cycle de remplissage du grain de blé dur sont assez rares.
Nous nous sommes particulièrement intéressés à suivre l’évolution du statut redox des
gluténines au cours du développement du grain. Pour cela les protéines du grain ont été
marquées par un alkylant fluorescent et puis fractionnées selon leur solubilité dans différents
solvants. L’analyse de leur composition a été envisagée par électrophorèse et SE-HPLC. Avec
cette dernière technique une quantification de l’intensité de la fluorescence a été réalisée afin
de remonter à la stœchiométrie de marquage. Nous avons également cherché à identifier la
position des résidus cystéine précédemment détectés grâce à la sonde fluorescente. Pour ce
faire, nous avons réalisé une étude portant sur l’identification par spectrométrie de masse de
l’état d’oxydoréduction des résidus cystéines de plusieurs sous-unités gluténine sous forme
monomérique ou déjà engagée dans les polymères.
Ces travaux nous ont amené à croiser différentes approches biochimiques permettant
l’étude à l’échelle supramoléculaire (SE-HPLC, SDS-PAGE) et à l’échelle moléculaire (MALDITOF) de gluténines et leurs assemblages. Les résultats obtenus seront discutés à la lumière de
modèles d’assemblages actuellement en vigueur.
Dans un premier temps, ce chapitre s’ouvre sur une présentation de protocoles
expérimentaux retenus. Nous présenterons donc les conditions expérimentales retenues pour
l’extraction totale des protéines solubles et insolubles au SDS. Une fois validée cette procédure,
elle a été employée pour l’obtention de toutes les données issues d'analyses SE-HPLC
présentées dans les chapitres précédents.
113
Extraction des protéines des grains de blé dur en cours de développement
Étude préliminaire : choix méthodologique pour l’extraction des protéines
des grains de blé dur en cours de développement
La formation des polymères de gluténine peut être suivie par chromatographie liquide haute
performance d’exclusion diffusion (SE-HPLC) (Dachkevitch & Autran, 1989, Singh et al., 1990a,
Batey et al., 1991). Dans la plupart des cas, on recourt à l’utilisation d’un détergent anionique
comme le SDS afin de solubiliser et donc de maximiser l’extraction des polymères de
gluténines. En effet, la charge négative du détergent combinée à son hydrophobicité entraîne la
dénaturation et le dépliement des protéines.
Toutefois, la distribution en taille des polymères de gluténines reste mal évaluée par SEHPLC car sur les colonnes classiquement utilisées (TSK 4000 de Tosoh Bioscience, Biosep-SEC
4000 de Phenomenex), les fractions supérieures à 600 kDa sont exclues sans pour autant être
fractionnées (Shewry et al., 2009a). Par ailleurs, la distribution en taille des polymères
insolubles dans le SDS reste inatteignable et n'est accessible à l’analyse qu'après réduction
partielle (i.e. DTT) ou sonification (Singh et al., 1990a, Ciaffi et al., 1996b). L’extractibilité des
polymères est donc utilisée comme critère d’estimation de la distribution en taille des
polymères, notamment par le degré de polymérisation jugé par le ratio entre polymères SDSinsolubles et polymères totaux (Gupta et al., 1993). La plupart des protocoles utilisés
actuellement dérive des procédures d’extraction à température ambiante avec utilisation des
ultrasons (Singh et al., 1990a, Gupta et al., 1993) ou de la méthode d’extraction à chaud,
décrite par Dachkevitch et Autran (1989).
Afin d’étudier la dynamique d’assemblage des polymères de gluténines de grains de blé dur
en cours de développement, il a été nécessaire de commencer par définir un protocole
d’extraction des protéines adapté aux échantillons à différents stades de croissance. Il s’agissait
surtout d’éviter l’oxydation des sous-unités de gluténines et donc leur agrégation intempestive.
Du fait même du caractère vivant du grain immature et de son métabolisme actif, il nous fallait
également prendre en compte la présence d’activités protéasiques. Pour cette raison nous
avons étudié l’influence de différents paramètres tels que la température, l’action d’antiprotéase, l’ajout d’un réactif alkylant afin de bloquer les thiols protéiques ainsi que le temps de
contact entre l’alkylant et les protéines sur l'exhaustivité de l'extraction. Nous avons également
testé les effets des différentes conditions d’extraction sur une farine témoin de blé tendre.
114
Chapitre IV
Enfin, le protocole le plus adapté pour les grains en cours de développement mais aussi pour les
échantillons murs a été choisi.
1. Extraction des fractions protéiques solubles et insolubles dans le SDS à 1% (p/v)
En vue de leur analyse par SE-HPLC les protéines de réserves des farines de blé sont
classiquement extraites à 60°C par un tampon phosphate SDS 1%. L’usage du détergent
optimise la mise en solution des prolamines, alors que la température permet l’inhibition des
protéases présentes dans les farines (Morel & Bar-L'Helgouac'h, 2000). En l’absence de SDS, les
prolamines sensibles à la température s’agrègent à 60°C par formations de ponts disulfures
intermoléculaires. La mise en place de ces derniers relève de réactions d’échanges entre
disulfures intramoléculaires catalysées par des fonctions thiols (Chen & Schofield, 1996).
L’oxydation directe des thiols protéiques en disulfures intermoléculaires, théoriquement
possible reste limitée du fait de la faible proportion de thiols réduits portés par les prolamines.
Ceci n’est pas le cas chez les blés immatures, cette réaction pourrait donc intervenir et conduire
à une modification de la distribution en taille des protéines. D’autre part, dans le grain en cours
de développement on est en droit de suspecter une présence accrue de protéases par rapport
aux grains murs. Ceci rendrait donc l’étape d’inactivation thermique d’autant plus nécessaire.
Ces questions nous ont amené à étudier l’influence des conditions paramétriques de
l’extraction des grains immatures sur le rendement d’extraction et la distribution en taille des
protéines. Il s’est agit de confirmer l’inactivation/inhibition des protéases par la température
(60°C) tout en s’assurant de l’absence de réaction d’agrégation par oxydation des thiols des
prolamines. A cette fin les différents protocoles de solubilisation présentés dans la Figure IV-1
ont été testés. Nous avons cherché à inhiber les protéases par un cocktail d’anti-protéases et à
limiter la formation des disulfures à l’aide d’un agent alkylant des thiols. Ces additifs ont été
ajoutés en préalable à la procédure d’extraction en tampon SDS, qui a été réalisée dans un
second temps à froid (25°C) ou à chaud (60°C). L’effet des paramètres d’extraction sur la
solubilité et la distribution en taille des protéines a été évalué par analyse SE-HPLC des extraits.
115
1.1. Méthodes
1.1.1. Extraction
Des grains très immatures (318 et 371°CJAF) et matures (779 et 817°CJAF) de la variété Orlu
ont été utilisés pour cette étude. 160 mg de broyat (grains entiers broyés au broyeur à bille
avec de l’azote liquide) placés dans des tubes à centrifuger de 30 mL sont mis en suspension
dans 2 mL de tampon phosphate de sodium 0,1M (pH 6.8) contenant 1% (p/v) de SDS en
présence ou non d'Iodoacétamide (IAM 10mM, IAM 40 mM et 0 IAM). Une première étape
d'extraction est réalisée à froid (25°C) en présence de 20 µL d’anti-protéase (AP, Protease
Inhibitor Mix, GE Healthcare Life Science) et pour des durées de mise en contact avec la
solution alkylante de 0, 20 et 120 minutes sans agitation. Passée cette première étape,
l’extraction proprement dite des protéines est réalisée avec l’ajout de 18 mL de tampon
phosphate de sodium 0,1M (pH 6.8) SDS 1% (p/v). Après 80 minutes d’extraction sous agitation
permanente à froid (25°C) ou à chaud (60°C), les tubes sont centrifugés pendant 30 minutes à
20°C à 40.000 x g. Le surnageant recueilli correspond à l’extrait des protéines solubles en SDS
1%. Le culot est repris par 5 mL de tampon phosphate de sodium 0,1M (pH 6,8) SDS 1% (p/v) et
sonifié pendant 3 minutes à 7,5 W (Vibracel 72434, Bioblock Scientific). Le surnageant obtenu
après centrifugation (30 min, 20°C, 40000 g) représente la fraction SDS-insoluble (Fi) des
protéines du grain.
1.1.2. Analyse SE-HPLC
Les extraits sont tamisés par SE-HPLC avec un système Alliance (Waters), piloté avec
Empower2 (Waters). Vingt 4L de chaque extrait sont injectés sur une colonne TSK gel
G4000SWXL (7,8 x 300 mm, taille des particules 8 m, porosité 450 !, précédée d’une précolonne TSK gel SWXL 6 x 40 mm, taille des particules 7 m, Tosoh Bioscience). Les protéines
sont éluées par du tampon phosphate de sodium 0,1 M (pH 6,8) SDS 0,1% (p/v) avec un débit
de 0,7 mL.min-1. L’absorbance des protéines est mesurée à 214 nm.
Les chromatogrammes des fractions protéiques SDS-solubles ont été découpés en 5 fractions
(F1 à F5), sur la base du temps d'élution et de la distribution en poids moléculaire des familles
de protéines identifiées dans les grains de blé (Figure I-17, page 41) (Dachkevitch & Autran,
1989). Ainsi, pour un échantillon provenant d'un grain de blé mur on peut établir des
correspondances entre les : pics F1 et F2 et les polymères de gluténines d’encombrements
116
Chapitre IV
moléculaires décroissants ; le pic F3 et les "-gliadines ; le pic F4 et les #-$-%-gliadines et enfin le
pic F5 avec les albumines-globulines ainsi que des #-gliadines. Pour les extraits SDS-insolubles
l’aire totale du chromatogramme a été prise en compte. Le cumul des aires totales des
chromatogrammes des deux extraits (SDS-solubles + SDS-insolubles), ajustés au même rapport
masse de broyat/volume de solvant d’extraction permet d’évaluer le rendement d’extraction.
Les aires des différentes fractions sont exprimées en pourcentage de ce cumul.
Conditions
Alkylation*
1. IAM +AP
2. IAM
3. IAM +AP
4. IAM +AP
5. IAM
6. 0 IAM
* Concentration finale
IAM 1 mM
IAM 1 mM
IAM 4 mM
IAM 4 mM
IAM 4 mM
0 IAM
160 mg de broyat
+
2 mL tampon phosphate de
sodium 0.1M pH 6.8 + SDS 1% (p/v)
Anti-protéase
(AP)
oui
–
oui
oui
–
–
Temps d’attente
à froid
2 heures
2 heures
20 min
20 min
–
–
Extraction
80 min à 25°C
80 min à 60°C
80 min à 25°C
80 min à 60°C
80 min à 60°C
80 min à 60°C
Alkylation
Temps de contact à froid
(alkylation)
Sans
alkylation
IAM (10 mM)
IAM (40 mM)
2 heures à 25°C
20 min à 25°C
AP
X
AP
AP
25°C
60°C
25°C
60°C
0 IAM
18 mL tampon phosphate de
sodium 0.1M pH 6.8 + SDS 1% (p/v)
Agitation (80 minutes)
Manip 1 Manip 2
60°C
Manip 3 Manip 4 Manip 5
60°C
Manip 6
Centrifugation 30 min 40.000 g à 20°C
Surnageant
(Fraction soluble)
Culot
(Fraction insoluble)
Sonification 3 min (7,5 W)
Figure IV-1. Récapitulatif des protocoles d’extraction des protéines totales solubles et insolubles
dans le SDS 1% obtenues à partir de grains de blé dur immatures et matures.
117
2. Résultats
Quelques soient les protocoles testés ou le stade développement des grains, les rendements
d’extractions évalués à partir du cumul des aires des 2 extraits (SDS-solubles + SDS-insolubles),
sont très similaires (Figure IV-2) (CV = 5%). A partir de ce constat on peut en conclure que le
taux d’extraction des protéines est le même pour les différents protocoles.
1. IAM (AP) 2h froid
3. IAM (AP) 20 min froid
5. IAM chaud
2. IAM 2h chaud
4. IAM (AP) 20 min chaud
6. 0 IAM chaud
3.5E+07
3.0E+07
2.5E+07
2.0E+07
1.5E+07
1.0E+07
5.0E+06
Figure IV-2. Aires totales des
chromatogrammes SE-HPLC
(unités arbitraires) pour
l’ensemble des protocoles
testés aux différents stades
de
développement.
Les
barres verticales indiquent
l’écart type pour chaque
protocole testé (n=6).
0.0E+00
318°C JAF
371°C JAF
779°C JAF
817°C JAF
Effet protéasique
La Figure IV-3 présente la proportion des différentes fractions protéiques obtenues à partir
des protocoles 1 et 2. En l'absence d’anti-protéase (protocole 2) les protéines ont été soumises
pendant les 2 heures d’attente à froid à une forte protéolyse qui a entraîné une augmentation
de la fraction F5, significative pour les échantillons immatures (+ 50%) et dans une moindre
proportion pour les échantillons matures (+ 10%). De fait, les fractions Fi, F1, F2 et F3, ont
fortement diminuées d’approximativement 40% pour les grains immatures et 20% pour les
grains matures, tandis que la fraction F4 est restée inchangée. L’activité protéasique semble
avoir pour cible privilégiée les gluténines présentes dans les fractions Fi, F1 et F2, plutôt que les
gliadines (F4).
118
Chapitre IV
2. IAM 2h chaud
318°C JAF
1.4E+07
1.2E+07
1.2E+07
1.0E+07
1.0E+07
8.0E+06
8.0E+06
6.0E+06
6.0E+06
4.0E+06
4.0E+06
2.0E+06
2.0E+06
0.0E+00
371°C JAF
1.4E+07
0.0E+00
F1
F2
F3
F4
F5
Fi
779°C JAF
1.4E+07
F1
1.2E+07
1.0E+07
1.0E+07
8.0E+06
8.0E+06
6.0E+06
6.0E+06
4.0E+06
4.0E+06
2.0E+06
2.0E+06
0.0E+00
0.0E+00
F2
F3
F4
F5
F3
F4
F1
Fi
F5
Fi
817°C JAF
1.4E+07
1.2E+07
F1
F2
F2
F3
F4
F5
Fi
grains immatures (318 et 371°CJAF) et murs (779 et 817°CJAF) selon les protocoles 1 (bleu) et 2
(rouge).
Effet de la température
A partir de résultats présentés dans la Figure IV-3, on constate que pour les échantillons
murs, l’extraction à 60°C diminue la proportion de protéines SDS-insolubles (Fi) au bénéfice des
fractions F1 et F2. Ce résultat montre que l’action du SDS est potentialisée quand les protéines
sont extraites à chaud. L’effet négatif de la température sur les liaisons hydrogènes permettrait
au SDS d’interagir plus efficacement avec les polymères de gluténines.
Le même résultat est retrouvé en comparant les procédures d’extraction à froid (protocoles
1 et 3) et à chaud (protocole 4, Figure IV-4). L’extraction à froid, maximalise toujours la
proportion de protéines SDS-insolubles (Fi) et ce d’autant plus que le temps de mise en contact
est long. Pour les grains les plus immatures, la fraction Fi augmente en moyenne de 30% et cela
avec les deux protocoles à froid, et pour les échantillons à 779°CJAF l’augmentation est encore
119
plus forte (respectivement 68% et 40% avec les protocoles 1 et 3). Pour les grains murs, la
hausse du Fi n’est plus que de 10% quand les protéines sont extraites à froid (1 et 3) par
rapport au protocole à chaud (4). On observe également que l’extraction à froid augmente
sensiblement la fraction SDS-soluble des agrégats de haut poids moléculaire (F1) et cela
principalement chez les grains immatures (+50%). Par contre, lorsque les protéines sont mises
en contact 20 min avec la solution alkylante et ensuite extraites à chaud, les fractions de plus
faibles poids moléculaires augmentent légèrement, notamment la fraction F4. L’extraction à
froid ne permettrait donc pas la déstabilisation des interactions faibles établies entre les
polymères de gluténines ou entre gliadine et gluténine.
Nous avons finalement testé une extraction en présence d’alkylant sans temps de mise en
contact à froid, c’est à dire avec une alkylation et une extraction directement à chaud pendant
80 minutes (protocole 5, Figure IV-5). Avec ce protocole, la proportion de gluténines très
polymérisées diminue par rapport à l’extraction avec 20 min d’attente à froid, de 22% (F1) pour
l’échantillon immature et 15% (Fi) pour le grain mur ce qui traduit encore une fois l’effet
« dépolymérisant » du SDS à chaud. Par ailleurs, on peut observer que lorsque les protéines
sont extraites directement à chaud la fraction F4 est augmentée légèrement (5%) et cela aussi
bien pour les grains immatures que pour les grains murs (Figure IV-5).
En outre, le fait d’extraire directement à chaud, évite l’effet protéasique observé dans le cas
d’extraction à froid sans l’ajout d’anti-protéase, puisque les fractions F5 restent inchangées
mêmes en absence d’agent alkylant (Figure IV-5).
120
Chapitre IV
3. IAM (AP) 20 min froid
318°C JAF
1.6E+07
1.6E+07
1.4E+07
1.4E+07
1.2E+07
1.2E+07
1.0E+07
1.0E+07
8.0E+06
8.0E+06
6.0E+06
6.0E+06
4.0E+06
4.0E+06
2.0E+06
2.0E+06
0.0E+00
371°C JAF
0.0E+00
F1
F2
F3
F4
F5
Fi
779°C JAF
1.6E+07
F1
F2
F3
F4
1.4E+07
1.2E+07
1.2E+07
1.0E+07
1.0E+07
8.0E+06
8.0E+06
6.0E+06
6.0E+06
4.0E+06
4.0E+06
2.0E+06
2.0E+06
Fi
817°C JAF
1.6E+07
1.4E+07
F5
0.0E+00
0.0E+00
F1
F2
F3
F4
F5
F1
Fi
F2
F3
F4
F5
Fi
grains immatures (318 et 371°CJAF) et murs (779 et 817°CJAF) selon les protocoles 1 (bleu), 3
(vert) et 4 (orange).
Effet de l’agent alkylant
L’utilisation d’un réactif alkylant lors de l’extraction des protéines des grains de blés
immatures s’est avérée incontournable afin d’éviter l’agrégation des sous-unités de gluténines.
En l’absence d’alkylant, l’oxydation des sous-unités gluténine est observée par l’augmentation
de la fraction F2 (32%) associée à la baisse de la fraction F4 (24%) (protocole 6, Figure IV-5). Ce
résultat indique qu’en absence d’alkylant, les thiols portés par les sous-unités gluténine
pourraient s’oxyder et s’engager dans des liaisons disulfures intermoléculaires. Chez les grains
murs, il n’y a pas d’effet majeur de l’alkylant puisque la plupart des groupements thiols
susceptibles de s’oxyder sont déjà sous forme de ponts disulfures. Paradoxalement, l’alkylant
qui prévient l’agrégation des sous-unités gluténine, favorise également la proportion de la
fraction insoluble qui augmente de 17% pour les grains immatures et de 5% pour les grains
121
murs. L’action de l’alkylant semble ralentir l’effet « dépolymérisant » du SDS à chaud, et ce
d’autant plus que la teneur en thiols réduits est faible. Ainsi à chaud et en présence de SDS, la
présence de thiols libres permettrait un réarrangement des liaisons disulfures intermoléculaires
facilitant l’action solubilisante du SDS.
5. IAM chaud
6. 0 IAM chaud
1.6E+07
371°C JAF
779°C JAF
1.6E+07
1.4E+07
1.4E+07
1.2E+07
1.2E+07
1.0E+07
1.0E+07
8.0E+06
8.0E+06
6.0E+06
6.0E+06
4.0E+06
4.0E+06
2.0E+06
2.0E+06
0.0E+00
0.0E+00
F1
F2
F3
F4
F5
Fi
F1
F2
F3
F4
F5
Fi
(unités arbitraires) obtenues à partir des extraits SDS-solubles (F1-F5) et SDS-insolubles (Fi) de
grains immatures (371°CJAF) et murs (779°CJAF) selon les protocoles 4 (orange), 5 (rose) et 6
(violet).
Des protocoles d’extraction des protéines avec un agent alkylant sans temps d’attente ont
aussi été testés sur une farine témoin de blé tendre (Figure IV-6). Les protéines ont été
extraites en présence d’IAM à la concentration finale de 4 mM pendant 80 minutes à froid ou à
chaud. Les résultats sont similaires à ceux obtenus avec les grains de blé dur en cours de
développement. Les aires totales des chromatogrammes sont quasiment identiques entre les
différents types d’extractions (CV = 0,9%). Dans le cas de la farine, on observe moins l’effet de
l’alkylant pour la même raison que pour les grains de blé dur murs. Toutefois on retrouve l’effet
température ; quand les protéines sont extraites à froid les fractions insolubles sont
significativement augmentées de 30% par rapport au même type d’extraction à chaud.
122
Chapitre IV
2.5E+07
0 IAM (AP) froid
0 IAM chaud
IAM (AP) froid
IAM chaud
Farine
2.0E+07
1.5E+07
1.0E+07
5.0E+06
0.0E+00
F1
F2
F3
F4
F5
Fi
Total
(unités arbitraires) obtenues à partir des extraits SDS-solubles (F1-F5), SDS-insolubles (Fi) et
SDS-soluble + insoluble (aire totale) d’une farine témoin en présence (IAM) ou en l'absence
d’alkylant (0 IAM), directement à chaud ou à froid. Les valeurs représentent une moyenne de
deux répétitions.
Dans la Figure IV-7 les pourcentages de la fraction insoluble sont représentés. On observe
clairement l’effet « dépolymérisant » du SDS quand les protéines sont extraites à chaud (-5,7%).
La présence d’IAM décale l’effet de la température puisque la fraction insoluble augmente alors
de 2%, la proportion de gluténines (F1+F2+Fi) restant quant à elle inchangée.
25
23
21
19
26,4
24,4
- 5,7%
% Fraction insoluble
27
20,7
18,7
17
0 IAM (AP) froid
IAM (AP) froid
0 IAM chaud
IAM chaud
Figure IV-7. Effet d’alkylation et de
l’extraction des protéines réalisée à froid ou à
chaud sur la fraction insoluble de farine.
123
3. Conclusions
A partir de ces résultats le protocole retenu pour l’extraction totale de protéines de blé dur
au cours de la croissance du grain jusqu’à sa maturité a été le protocole 5, avec une alkylation
de groupement thiols et extraction directement à 60°C.
L’extraction des protéines à température ambiante en absence d’anti-protéase est
susceptible de modifier fortement la distribution en taille des poids moléculaires des protéines
du blé. On a constaté un effet protéasique très prononcé chez les grains immatures, qui
provoque une forte augmentation de la fraction de poids moléculaire inférieure à 20 kDa (F5)
au détriment essentiellement des fractions composées des agrégats de gluténines (F1 et F2)
ainsi que de la fraction F3, qui chez les grains immatures pourrait contenir des sous-unités de
gluténines libres et de sous-unités classiques "-gliadines.
De plus, la température joue aussi un rôle important dans la solubilisation de protéines. En
effet, les principales forces de liaisons entre deux protéines, ou entre une protéine et d’autres
molécules, hormis les ponts disulfures, sont les interactions dites non covalentes (i.e. liaisons de
type ionique, liaisons hydrogène et interactions hydrophobes). Le SDS de part sa structure est à
même de s’attaquer à l’ensemble de ces liaisons faibles. La température en provoquant un
changement de conformation des protéines et de leurs assemblages faciliterait son action.
L’alkylant agit en bloquant les fonctions thiols et empêche toute réaction d’échange entre
disulfures. Par conséquent, avec l’extraction à chaud en présence d’alkylant ce que l’on obtient
comme résidu n’est pas surestimé et correspond incontestablement aux polymères SDSinsolubles présent dans le grain. L’usage de l’agent alkylant permet d’extraire les gluténines aux
différents stades de développement du grain tout en évitant leur oxydation et donc leur
agrégation intempestive.
124
Chapitre IV. A
Chapitre IV. A) How are gluten polymers assembled during grain filling in
durum wheat?
Mariana S.L. Ferreira, Joëlle Bonicel, Marie-Françoise Samson, Marie-Hélène Morel
Publication n°3 in preparation
Abstract
The way glutenin subunits are assembled in insoluble polymers is not yet completely
understood. In this study, changes in protein thiol status, in glutenin polymers composition and
size distribution were monitored in developing durum wheat grains. After labelling sulfhydryl
groups (SH) with a fluorescent alkylant (ATTO-maleimide), protein was sequentially extracted
and analysed by SE-HPLC and SDS-PAGE under reducing and non-reducing conditions. For both
fractionation methods, dual detection (UV and fluorescence) was performed. SE-HPLC profiles
of protein appeared brightly fluorescent until 473°Cd. After this date, fluorescence declined
dramatically and the amount of polymeric protein increased, demonstrating that the formation
of glutenin polymers comes under oxidation of protein SH groups. The same extracts were
analysed by SDS-PAGE. Up to 473°Cd, LMW-GS and HMW-GS mainly accumulated as monomers
carrying SH groups. The minor polymeric fraction extracted with SDS buffer included a higher
proportion of HMW-GS than of LMW-GS, whereas EtOH extractable polymers consisted mainly
of LMW-GS. After 473°Cd, monomers disappeared to the advantage of polymeric fractions,
which still carried some SH groups. We postulate that as they are synthesized, LMW-GS and
HMW-GS tend to assemble in small polymers still carrying SH groups. As grain development
progressed oligomers of LMW-GS combined with HMW polymer backbones to form almost fully
oxidized polymers. During desiccation, there was a further increase in the size of the polymers
and total extinction of SH groups.
Key words: durum wheat, fluorescence labelling, oxidation, polymers assembly, thiol groups.
125
How are glutenin polymers assembled during grain filling in durum wheat?
1. Introduction
Durum wheat contains 10-16% total proteins among which 85% are storage proteins
typically divided into monomers (i.e. gliadin) and polymers (i.e. glutenin). Gliadin contains only
intra-chain disulfide bonds. Glutenin polymers include low-molecular weight (LMW) and high
molecular weight (HMW) polypeptides, named glutenin subunits (GS). Glutenin polymers result
from the assembly of these subunits through inter-chain disulfide bonds.
The exceptional rheological properties of wheat gluten depend on the ratio between gliadin
and glutenin polymers and especially on the size distribution of the latter. Their molecular
weight can extend up to several million mol.g-1 (Wrigley, 1996). As consequence, in mature
grains a significant proportion of the polymeric protein fraction is insoluble, even in denaturing
buffers such as sodium dodecyl sulphate (SDS) buffer. It has been reported that the SDSinsoluble glutenin polymers as a proportion of total polymers were closely related to the HMWGS/LMW-GS ratio of these proteins (Carceller & Aussenac, 2001a, Naeem & MacRitchie, 2005).
In addition, the proportion of SDS-insoluble glutenin polymers has often been correlated with
bread making quality and dough viscoelastic properties (Popineau et al., 1994, Naeem &
MacRitchie, 2005).
During the grain development, wheat storage proteins are accumulated in protein bodies
(PB) after their synthesis in the endoplasmic reticulum (ER). Contrary to most plants (i.e.
leguminous), PBs of wheat coalesce during advanced stages of grain development and
ultimately vanished. Then the released proteins embedded starch granules forming a
continuous network in the cytoplasm (Pernollet & Camilleri, 1983, Shewry & Halford, 2002,
Loussert et al., 2008).
Several studies have been undertaken to monitor the time course of storage protein
synthesis and accumulation during grain development in T. aestivum (Johansson et al., 1994,
Gupta et al., 1996, Stone & Nicolas, 1996b, Carceller & Aussenac, 1999, Panozzo et al., 2001,
Shewry et al., 2009b). The formation of SDS-soluble glutenin polymers takes place throughout
grain development and polymers size increases as grain filling approached the physiological
maturity. Some of these authors have proposed that the formation of large glutenin polymers
(i.e. SDS-insoluble) was closely associated with the desiccation of the grain (Carceller &
Aussenac, 1999, 2001a, Rhazi et al., 2003b, Shewry et al., 2009b). The mechanism leading to
126
Chapitre IV. A
the insolubilisation of glutenin polymers in mature wheat grains seems to start mainly after
physiological maturity during grain desiccation. At this point, dramatic changes in the sulfhydryl
status of endosperm proteins assessed by mBBr-labelling have been reported (Gobin et al.,
1997, De Gara et al., 2003, Rhazi et al., 2003a). Coincident with the oxidation of protein thiol
groups, SDS-insoluble polymers accumulated. In addition, Gobin et al. (1997) suggested that
proteins, synthesized in reduced form with a large number of thiol groups (SH), become
oxidized when PBs disrupted whereas albumins and globulins retained their reduced structure
in mature grains.
Until now, apart the pioneer works of Bénétrix et al. (1994), very little has been reported on
the dynamics of glutenin assembly during the formation of T. durum kernels. Glutenin polymers
assembly in this specie could differ markedly from the patterns reported on bread wheat
because of the absence of chromosome D. Indeed, durum included half HMW-GS compared to
bread wheat.
The present study was undertaken to investigate how polymeric proteins accumulate in
developing caryopses of durum wheat. For this purpose a thiol-specific fluorescent labelling
(ATTO-maleimide) was used to examine the sulfhydryl (SH) to disulfide (SS) changes of storage
proteins. Sequential extraction allowed proteins to be categorized owing to their solubility.
SDS-PAGE and SE-HPLC using a dual detection (UV and fluorescence) were performed to
identify proteins carrying fluorescent labelled sulfhydryl groups and to monitor changes in the
glutenin polymer size distribution throughout grain filling. Protein fractionation by SE-HPLC with
dual detection allowed us to quantify the number of labelled cysteine residues carried by the
different protein fractions. The results are discussed in the light of the similar data previously
reported for bread wheat.
2.1. Wheat samples
Wheat kernels from cultivar Orlu (Triticum turgidum L. var. durum Desf.) possessing high
molecular weight glutenin subunits (HMW-GS) Glu-1B 20x+20y were used in this study. The
plants were grown in INRA experimental fields (Mauguio, Southern France) in 2008 under
conventional growing conditions (rainfed Mediterranean conditions, fertilization and fungicide
127
protection). Thermal time accumulation was calculated from daily average temperature hourly
recorded. At anthesis, main-stem ears (n=250) were tagged when the anthers of the central
florets appeared. They were hand collected from 250°Cd (thermal time after anthesis) at
different intervals until maturity. For each sampling date, five ears were separated from the
stems before storage at -20°C. Then they were freeze-dried in order to reach a moisture
content comprised between 9 and 15%. Grains from the middle part of the ear were separated
and placed for 2 weeks at 25°C and 54% relative humidity (RH) above a saturated NaBr solution
until the grain water concentration (GWC) reached 12%. Whole grains were then ground for
two minutes using a ball mill under liquid N2 and stored at 4°C in sealed bottles for further
analysis.
2.2. Determination of thiol groups
Protein thiol content (PSH) of ground grains (60 mg) was determined using Ellman’s reagent
(5,5’dithiobis acid 2-nitro-benzoic acid-DTNB) according to Morel and Bonicel (1996b).
2.3. Fluorescent thiol groups labelling and protein sequential extraction
Based on PSH content of each sampling date, sulfhydryl groups (SH) were stoichiometrically
labelled by ATTO 532, a specific maleimide-fluorochrome (Fluka). For each sampling date, two
tubes containing 40 mg of ground grains were prepared. The first one was incubated with 150
µL of 80 mM Tris-HCl buffer (pH 6.5) without ATTO (non-labelling) and the second one was
incubated with the same buffer containing the fluorescent-maleimide reagent (1.5 fold molar
excess of ATTO to PSH content) at room temperature (RT). All samples were shaken for 10
minutes and incubated in dark for 90 minutes without agitation.
Proteins from labelled or non-labelled samples were then sequentially extracted. Albumins
and globulins (A/G) were extracted by adding 400 µL of 80 mM Tris-HCl buffer (pH 6.5) in each
tube. The supernatants (A/G fraction) were obtained after centrifugation at 10,600 x g at 20°C
for 10 minutes. Pellets were then resuspended with 750 µL of 70% (v/v) ethanol (EtOH) for 15
minutes at RT to prepare Gliadin fraction. After centrifugation at 10,600 x g at 20°C for 20
minutes, the pellets were re-extracted with 300 µL of 2% (w/v) SDS in 80 mM Tris-HCl buffer
(pH 6.5) to solubilise glutenin for 1 h at RT. After centrifugation at 20,800 x g at 20°C for 10
minutes, the SDS-soluble fractions were obtained from the supernatants. The last pellets were
reduced with 300 µL of 20 mM DTE in 2% (w/v) SDS and 80 mM Tris-HCl buffer (pH 6.5) for 30
128
Chapitre IV. A
minutes at 60°C and sonicated for 15 s at 7.5 Watts (Vibracel 72434, Bioblock Scientific, Illkirch,
France) before centrifugation at 20,800 x g at 20°C for 10 minutes.
2.4. Analysis of the protein fractions
SE-HPLC
An aliquot (150 µL) of each extract was diluted one-third in 1% (v/v) TFA in the case of the
Tris-HCl extract and diluted to half for the other extracts (EtOH, SDS-Soluble and SDS-insoluble).
Twenty µL of all four extracts were fractionated by SEC on a TSK gel G4000SWXL column (Tosoh
Bioscience, Sigma Aldrich, France) using 0.1 M phosphate (pH 6.8) including 0.1% SDS (w/v) as
elution buffer. Elution flow rate was set at 0.7 mL.min-1 and fluorescent and UV (214 nm)
signals were recorded. The chromatogram was integrated into 5 main fractions (F1-F5) on an
elution time basis and according to the known size distribution of aggregates and monomers of
wheat proteins (Dachkevitch & Autran, 1989). Calibration of the column allowed us to estimate
the following molecular limits, from the earliest (7.4 min) to the latest eluted fraction (19 min):
fractions F1 and F2 included glutenin polymers with molecular weight (Mr) ranging from
750,000 to 2,000,000 (F1, large glutenin polymers) and 90,000 to 750,000 (F2, small glutenin
polymers), fractions F3 (55,000 < Mr < 90,000) and F4 (18,000 < Mr < 55,000) corresponded
mainly to gliadins while fraction F5 likely corresponded to remaining wheat soluble proteins
incl&'()*+ ,-.&/()0*-1.&-()+ ,)'+ 21/3+ #-gliadin proteins (5,000 < Mr < 18,000). The protein
contents of the different extracts were calculated from total chromatogram area, using UV
signal calibration factor previously established (Morel in gluten 2000). Results are presented as
percent of total protein of each sampling date (from 291 to 884°Cd), calculated from the sum of
the total chromatogram areas corrected from their different mass to solvent extraction volume,
in order to allow direct comparison between the sequential extracts.
SDS-PAGE
The same labelled extracts were also fractionated by SDS-PAGE in reducing and nonreducing conditions. All the extracts were diluted one half with SDS-PAGE loading buffer
containing 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% SDS (w/v), 10% glycerol (v/v) and 0.1% bromophenol
.-&3+45067+,2+89,:;()*+'<3=+>19+8?3+93'&:()*+:1)'(8(1)2@+AB+$-mercaptoethanol (v/v) was added
in the loading buffer. Samples were shaken for 1 hour at RT. Samples (25µL) were loaded on the
top of a 13.5% polyacrylamide gel (160x180x75 mm). The gel was run at 20 mA constant
129
current until the tracking dye reached the bottom of the gel. After electrophoresis, fluorescent
images of gels were immediately taken using a scanner FLA-5000 (Fluorescent Image Analysing
System, Fujifilm). The images were acquired at 532 nm (LPG filter) and processed with the
ImageGauge software. For Coomassie staining, gels were first fixed in 15% (w/v) trichloracetic
acid (TCA) for 1 h and then stained with 0.1% (w/v) Coomassie brilliant blue G-250 solution for
24 h. The gels were distained with 10% (w/v) TCA for 24h and soaked in water for 24h. Gels
were scanned with a GS-710 Imaging Densitometer (Bio-Rad) at a standard resolution of 600
DPI (Dots per Inch). Image acquisition was performed using PDquest 6.2 analysis software (BioRad).
2.5. Cysteine content determination by SE-HPLC and Fluorescent detection
To determine the number of labelled cysteine residues carried by the different protein
species fractionated by SE-HPLC, it was first necessary to link the signal intensity obtained in
fluorescence to the UV signal. To this end, we firstly established a calibration factor (CF) using
$-lactoglobulin (kindly provided by Christophe Schmitt, CRN Nestlé, Lausanne, Suisse) since this
globular whey protein with a molecular mass of 18,400 Da has only one thiol per molecule. The
ratio Fluo to UV210 intensities of $-lactoglobulin alkylated with ATTO-maleimide was
determined after SE-HPLC fractionation and the CF was calculated as follow:
Fluo " P ! nthiol !
Fluo nthiol !
"
UV
# ! Mr
(3)
) P' &
P"'
$
( Mr %
CF "
UV " P '!#
(1)
#
"
Fluo
! Mr
UV
(2)
(4)
(5)
Where P and P’ are the $-lactoglobulin concentrations (in molar and g.L-1, respectively), Mr is
18,400 Da (in g.mol-1), $ and C are the fluorescence and absorbance response factors
respectively (in arbitrary units).
To quantify the labelled cysteines carried by wheat proteins, the UV and Fluo SE-HPLC
profiles were first re-scaled to the same elution time basis. Then, ratio Fluo to UV210 intensities
was divided by CF and multiplied by the relative molecular weight of the protein thanks to the
column, as detailed in Morel et al. (2000).
130
Chapitre IV. A
) Fluo &
'
$
UV %
(
nthiol "
! Mr
CF
(6)
3. Results and discussion
3.1. Changes in protein content of the different extracts
In this study, our primary concern was to keep grain proteins in their reduced states. With
immature grains and in opposite to flour, sulfhydryl groups reactivity towards oxygen cannot be
neglected. Coupling of reactive sulfhydryl groups with the fluorescent probe ATTO-maleimide
was chosen to hinder protein aggregation through misleading inter-chain disulfide bonds. In
addition, it allows specific identification of the target protein through an easy detection of
ATTO fluorescence absorbency at 532 nm. For both labelled and non-labelled samples, protein
recoveries estimated from the sum of the areas of the different extractions, were within the
same range (CV < 3%). Calibration of the SE-HPLC UV signal allowed the estimation of an
average grain protein content of 10.2 ± 0.34% (fresh mass) and that irrespective of the grain
developmental stage from 293 to 881°Cd. Stability and fullness of grain protein recovery permit
a direct evaluation of the change in protein sequential solubility during grain filling. Relative
weights of the different sequential extracts in total protein recovery changed during grain
development and differed depending on protein alkylation.
For ATTO-labelled samples (Figure IV-8A), protein content in Tris-HCl extracts was rather
stable and averaged 33.2 ± 1.79% up to 473°Cd. Thereafter, this proportion decreased sharply (10%) and then remained constant until maturity at about 23.2 ± 0.92%. Content of ethanolic
soluble proteins increased progressively all along the grain-filling phase, from 18% for the first
immature sample (293°Cd) to 44% at 600°Cd. After this point, it decreased until grain maturity
stabilizing at approximately 35% of total protein content. Evolutions of protein recovered in SDS
extracts (soluble and insoluble) were parallel. Both represented 25% of total protein at the first
date investigated and then decreased until 473°Cd where a minimum was achieved around 20%
and 9% for SDS-soluble and SDS-insoluble proteins respectively. Beyond 600°Cd, protein
contents of these two extracts increased slightly until 750°Cd and stabilized around 28.1 ±
0.66% and 12.9 ± 0.34% of protein, for SDS-soluble and SDS-insoluble extracts respectively.
131
Results obtained for non-labelled samples are presented Figure IV-8B. Even if similar to
those of ATTO-labelled samples, some differences can be underlined. Protein extracted in TrisHCl buffer was slightly lower averaging 31.1 ± 1.58% from 293 to 473°Cd. After a decrease of
9%, it reached 22.0 ± 0.67% at maturity. Increase in protein content of ethanolic fractions was
smoother compared to previous ATTO-labelled samples and stabilized at approximately 38% of
total protein content, since grain physiological maturity was achieved (600°Cd). Evolution of
SDS-soluble extracts was reminiscent of labelled samples. Nevertheless, the final level was
slightly lower (26.3 ± 1.19%). Protein content in SDS-insoluble extracts showed at first a sharp
decreased, from 27% to 11% at 600°Cd. Beyond it increased steadily until maturity reaching
16% of total protein. All these results demonstrated that labelling favored protein solubility in
Tris-HCl and EtOH solvents, whereas SDS-soluble and SDS-insoluble proteins were preferentially
A
Tris-HCl
SDS-soluble
50
EtOH
SDS-insoluble
B
50
Protein content (% SE-HPLC)
Protein content (% SE-HPLC)
accumulated otherwise.
40
30
20
10
Tris-HCl
SDS-soluble
EtOH
SDS-insoluble
40
30
20
10
ATTO labelling
0
non-labelling
0
200
400
600
800
1000
200
400
600
800
1000
Figure IV-8. Changes in protein content of the different extracts (Tris-HCl, EtOH, SDS-soluble
and SDS-insoluble) from developing grains of durum wheat, after ATTO-labelling of SH groups
(A) or non-labelling (B).
132
Chapitre IV. A
3.2. SE-HPLC analysis
SE-HPLC profiles of all extracts (UV and fluorescent) at some key stages of grain
development are presented Figure IV-9 and Figure IV-10. As can be expected, SE-HPLC analysis
revealed that polymeric proteins (F1 and F2 peaks) were mostly recovered in SDS extracts
whereas monomeric proteins (F3 to F5 peaks) formed the main part of Tris-HCl and ethanolic
extracts (Figure IV-9 and Figure IV-10). In general, fluorescent labelling was essentially found in
Tris-HCl buffer, EtOH and the first SDS extracts. For all extracts, the fluorescence was mainly
detected in immature samples and until 600°Cd.
Tris-HCl extracts
F3, F4 and F5 constituted the main fractions of SE-HPLC UV profiles of Tris-HCl buffer
extracts (Figure IV-9A). ATTO-labelled and non-labelled proteins showed rather similar UV
profiles. Consistently with Figure IV-8, protein content of Tris-HCl buffer reached a maximum at
473°Cd before decreasing until maturity (881°Cd) (Figure IV-9A). Bright fluorescence was
detected until 473°Cd. The fluorescence was mainly present within F3, F4 and F5 peaks. The
maximum relative molecular weight of F3 peak corresponds to 67,000 and could correspond to
$-amylase. For ATTO-labelled samples, fractions F4 and F5 included two shouldered peaks,
detected by UV and fluorescence. For non-labelled samples fraction F4 included only the slow
part of the shouldered peak (Figure IV-9, arrow 1), contrarily to fraction F5 whose UV profiles
coincided to the one of non-labelled samples. According to this result, it may be inferred that
the peak shoulder included a fluorescent protein specifically recovered within the Tris-HCl
extract when samples were labelled with ATTO-maleimide. After 473°Cd, even with ATTOlabelled samples, this double F4 peak disappeared in UV response (Figure IV-9, arrow 2). Overall
fluorescence also decreased strongly but remained present until 881°Cd. As it could be
expected from the known low solubility of flour protein in salt buffer, Tris-HCl soluble proteins
from 600°Cd to maturity contained mostly monomeric proteins and a very little amount of F2
fraction (Figure IV-9, arrow 3).
EtOH extracts
SE-HPLC profiles from EtOH extracts also appeared brightly fluorescent until 473°Cd (Figure
IV-9B). As for Tris-HCl extracts, the EtOH soluble proteins from immature grains up to 473°Cd
showed an unusual double (shouldered) F4 peak with UV detection (Figure IV-9B, arrow 4)
133
which strongly reduced and almost disappeared at 600°Cd. Furthermore until 473°Cd,
fluorescence was mainly associated with this double F4 peak (Figure IV-9B, arrow 5) and within
F3 peak. It is interesting to note that these two fluorescent peaks were not in the UV profiles of
non-labelled samples. Fractions F4 and F3 included mainly proteins with relative molecular
weights ranging from 35,000 up to 90,000. Therefore, fluorescence of the double F4 peak could
be assigned to free LMW-GS, whereas peak F3 may include free HMW-GS or small oligomers of
LMW-GS still soluble in EtOH extracts in the early stages of the grain development.
In accordance with the net increase of protein content within EtOH extracts (Figure IV-8), UV
profiles increased until 600°Cd, whereas from 473°Cd to 600°Cd the fluorescence intensity
declined dramatically (Figure IV-9A and B). At the same time the amount of polymeric protein
(F1 + F2) increased. This increase was even more obvious and rapid when the samples were not
labelled (compare blue and green lines in Figure IV-9 at 473 and 600°Cd). Loss of fluorescence
together with an increase in polymeric proteins was consistent with the expected loss of
protein sulfhydryl groups accompanying glutenin polymerization. Beyond 600°Cd protein
contents in F1 and F2 decreased. In fact, further growing of glutenin polymers size would have
shift their solubility from EtOH to SDS extracts. Furthermore, at 881°Cd, UV profiles of both
labelled and non-labelled samples were practically superimposed. This result shows that at
maturity, polymeric proteins soluble in EtOH extract did not carried any sulfhydryl groups.
SDS-soluble and insoluble extracts
At the first date investigated (293°Cd), large polymeric proteins eluting within fractions F1
and F2 were detected in both SDS extracts. Unexpectedly reduction by DTE (SDS-insoluble
extract) did not lead to a significant release of the polymers constitutive polypeptides, which
otherwise should have been recovered within fraction F3 to F5 (as it was observed from
473°Cd). Nevertheless, SDS-PAGE analysis of these SDS extracts indicated that they mainly
included glutenin polypeptides (see below). Absence of DTE effectiveness might indicate
formation of protein-polyphenol aggregates. Indeed in the very immature grains, polyphenol
reactivity may be important and should have been counteracted by adding polyvinylpyrrolidone
(PVPP) to the first solvent.
134
Chapitre IV. A
As found for Tris-HCl and EtOH extracts, fluorescence of the both SDS-extracts was mainly
detected before 600°Cd (Figure IV-10). Fluorescence was associated with peaks F3 and F4 but
also with proteins eluting before 13 min, corresponding to glutenin polymers (F2 and F1
fractions) (Figure IV-10A, arrows 6). Most of the fluorescence decay occurred between 473°Cd
and 600°Cd went down slowly until 881°Cd. From 600 to 881°Cd, the UV profiles from SDSsoluble extracts clearly shifted to higher molecular weights (Figure IV-10A), the proportion of
the larger polymeric fractions increasing significantly. The shift to higher polymers occurred
earlier for the non-labelled samples (compare blue and green lines in Figure IV-10A at 473 and
600°Cd). The results revealed that during extraction misleading inter-chain coupling of
polymers still carrying sulfhydryl groups polymers has happened.
Changes in the SE-HPLC profiles of SDS-insoluble proteins were not as remarkable as those of
SDS-soluble extracts. Nevertheless, it is interesting to note that even for the more mature grain,
some fluorescence remained associated to the subunits released after DTE reduction of SDSinsoluble polymers. Although labelling of the reduced subunits by traces of ATTO-maleimide
still present in the last pellet cannot be excluded, fluorescence in the previous SDS extract was
just detectable at 20 min (elution time of free ATTO-maleimide), thus that residual labelling
seems unlikely. The result might point to different structures for SDS-soluble and SDS-insoluble
polymers, the latter bearing some no-coupled cysteine residues.
To summarise, three phases occurred: (i) before 473°Cd proteins accumulated mainly as
monomers carrying SH groups, but oligomers were also present, (ii) from 473 to 600°Cd,
oxidation of glutenin subunits and polymers assembly occurred, (iii) after 600°Cd, the average
polymers size increased while their last SH groups became involved in inter-polymer SS bonds.
135
Arbitrary units (214 nm)
5
F1
5
20
5
5
10
327°Cd
10
15
15
20
20
5
5
10
473°Cd
10
4
5
1
15
15
20
20
5
5
10
601°Cd
10
601°Cd
2
15
15
20
20
5
5
10
881°Cd
10
3
881°Cd
15
15
20
20
0.3
0.4
0.5
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0
10
15
0
0.1
F3 F4 F5
20
473°Cd
0.05
F2
ATTO fluo
ATTO UV
non-labelling UV
15
F3 F4 F5
327°Cd
0.2
F1
293°Cd
10
F2
ATTO fluo
ATTO UV
non-labelling UV
0.1
0.15
0.2
0.25
B) EtOH
0
0.05
0.1
0.15
0.2
293°Cd
A) Tris-HCl
0.25
136
Figure IV-9. Changes in SE-HPLC elution patterns of Tris-HCl (A) and EtOH (B) soluble proteins after SH labelling (ATTO) or non-labelling (without
ATTO) from developing grains of durum wheat. Thermal times after anthesis are indicated on the top-left. Green (non-labelling) and blue (ATTO
UV) lines: UV response and red (ATTO fluo): fluorescence response. Arrows are explained in the text.
Arbitrary Units (fluorescence)
5
15
20
5
10
15
20
5
10
15
20
5
10
15
20
5
10
881°Cd
15
20
0.3
0.4
0.5
5
0
10
15
20
5
10
15
20
5
10
473°Cd
15
20
5
10
601°Cd
15
20
5
10
881°Cd
15
20
0.3
0.4
0.5
0
0.1
F3 F4 F5
327°Cd
0.05
F2
ATTO Fluo
ATTO UV
non-labelling UV
0.2
F1
293°Cd
0
0.1
0.15
0.2
0.25
B) SDS-insoluble
0
10
6
601°Cd
0.1
F3 F4 F5
473°Cd
0.05
F2
327°Cd
0.2
F1
ATTO Fluo
ATTO UV
non-labelling UV
0.1
0.15
0.2
293°Cd
A) SDS-soluble
0.25
Chapitre IV. A
137
Figure IV-10. Changes in SE-HPLC elution patterns of SDS-soluble (A) and SDS-insoluble (B) proteins after SH labelling (ATTO) or non-labelling
(without ATTO) from developing grains of durum wheat. Thermal times after anthesis are indicated on the top-left. Green (non-labelling) and
blue (ATTO UV) lines: UV response and red (ATTO fluo): fluorescence response. Arrows are explained in the text.
How are glutenin polymers assemblede during grain filling in durum wheat?
3.3. SDS-PAGE analysis
To identify proteins carrying SH groups, the previous extracts were analysed by SDS-PAGE in
reduced and non-reduced conditions. Protein detection was carried out by fluorescence and
Coomassie Blue staining. Such as for the SE-HPLC profiles, bands appeared brightly fluorescent
for all extracts from the beginning of grain filling until 473°Cd. After this date, the fluorescence
dropped substantially.
Tris-HCl extracts
In non-reducing conditions and consistent with 1&9+ D936(1&2+ ?<D18?32(2@+ $-amylase (Mr
61,000-66,000) was identified and found brightly fluorescent from 327 until 600°Cd. During the
same time interval, bands migrating in the zone corresponding to LMW-GS and gliadin,
between the 45 and 30 kDa molecular weight markers (Figure IV-11A) were also shown to carry
fluorescence. Only faint fluorescence was assigned to others HMW albumins (Mr > 66 kDa) and
to albumin/globulin proteins (Mr < 25 kDa). The Coomassie stained bands coinciding with the
fluorescent $-amylase and 45 kDa polypeptides, were found to vanish beyond 600°Cd,
indicating for these proteins changes in solubility as grain physiological maturity approached.
In Coomassie blue stained gel, some few additional bands appeared such as the small
polypeptides (Mr < 15 kDa) (Figure IV-11B). In reducing conditions, additional bright fluorescent
spots were observed with relative molecular masses of 30 kDa (Figure IV-11C). No clear
Coomassie blue band could be associated to this bright signal, whose origin remains unknown.
In contrary to previous statement (Gobin et al., 1997), albumins and globulins did not exhibit
marked fluorescence in mature grains. With Coomassie blue staining and compared to the nonreduced gel, the intensity of a faint band which could correspond to superimpose HMW-Gs 20x
and 20y slightly increased up to 600°Cd (Figure IV-11D). Faint fluorescence was also associated
to this band. Intensity of $-amylase band strongly increased up to 681°Cd and was still
detectable until the maturity. This feature confirms previous works on bread wheat that
2?153'+ 8?,8+ $-amylases are accumulated early during grain cellularization phase and
progressively assemble into polymeric form through disulfide pairing (Gupta & MacRitchie,
1991, Gupta et al., 1996).
Beyond 473°Cd and before the onset of grain desiccation phase, reduction of the protein
extract did not increase fluorescence intensity or Coomassie blue stain of LMW-GS bands
138
Chapitre IV. A
(Figure IV-11C-D). This result is in complete agreement with SE-HPLC findings (see Figure IV-9,
arrow 2). Until 600°Cd, LMW-GS exist as reduced and monomeric polypeptides soluble in TrisHCl buffer. After this date, they probably become engaged in inter-chain disulfide bonds and
were no more soluble in this extract.
A
B
HMW
albumins
Mr
97
66
$-amylase
45
LMW-GS
#-,$-,%-gliadins
30
Albumins
Globulins
20
14
293 327 365 403 473 601 681 739 779 881 1053°Cd
293 327 365 403 473 601 681 739 779 881 1053°Cd
C
D
HMW
albumins
Mr
97
$-amylase
66
LMW-GS
#-,$-,%-gliadins
45
30
Albumins
Globulins
20
293 327 365 403 473 601 681 739 779 881 1053°Cd
293 327 365 403 473 601 681 739 779 881 1053°Cd
14
Figure IV-11. Changes in SDS-PAGE patterns of Tris-HCl soluble proteins from developing grains
of durum wheat. Fluorescent (A and C) and Coomassie blue stained (B and D) gels are
presented in non-reducing (A and B) and reducing (C and D) conditions. The thermal time (°Cd)
after anthesis are indicated at the bottom.
EtOH extracts
When EtOH extracts were analysed in non-reducing conditions, fluorescence was mainly
associated with three bands migrating around 45 kDa (Figure IV-12A). These bands correspond
to type 2 LMW-GS (Figure IV-13) and their fluorescence tended to disappear after 600°Cd. In
the corresponding Coomassie blue stained gel, they were no longer detected after 600°Cd.
139
After this date, only a non-fluorescent band remained soluble in the EtOH extracts and was
accumulated until maturity. These results pointed in the same direction that those obtained by
SE-HPLC analysis, demonstrating that the fluorescent double F4 peak corresponds to
monomeric LMW-GS present only until 473°Cd. After this time, only the slow-part of the double
peak is still present and did not exhibit any fluorescence (Figure IV-9B). A slight band with a
relative molecular mass of 75 kDa was detected but without fluorescence at any time. This
.,)'+ 5,2+ ,221:(,83'+ 81+ ,+ "-gliadin, which was accumulated mainly after 473°Cd and until
maturity (Figure IV-12B). Smears and faint multiple bands appeared in the upper part of both
gels after 473°Cd. These smeared bands likely represent groups of larger oligomeric forms of
glutenin subunits (Figure IV-12A and B, arrows) and were fluorescent until 681°Cd. They can be
related to the increase of fractions F1 and F2 on SE-HPLC profiles from 473°Cd (Figure IV-9B).
Reduction did not dramatically change the fluorescent pattern but protein mobility was
decreased, reflecting an increase of their hydrodynamic volume. The feature was consistent
with the opening of some intra-chain disulfide bonds in LMW-GS. In Coomassie blue stained gel,
more LMW-GS were detected irrespective of the sampling date and until maturity. With
reduction, the smears and faint bands disappeared and after 473°Cd a new faint band
corresponding to the overlapped HMW-GS 20x+20y was detected in both gels (Figure IV-12C
and D, arrowheads). It indicates the HMW-GS involved in the oligomeric glutenin polymers may
still carried sulfhydryl groups. Reduction release further "-gliadin (above Mr 66 kDa). The band
strongly interacting with glutenin polymers might be an " -gliadin including a single cysteine
residue (Masci et al., 1993, Masci et al., 1999).
Taken together, these results allowed us to suggest that at the beginning of grain filling and
until 473°Cd, monomers of LMW-GS can be soluble in both Tris-HCl and EtOH extracts, still
carrying some SH groups. After this date, monomers disappear to form oligomers which include
some HMW-GS in their structure. Even in the newly formed polymers, both type of glutenin
subunits still carried some SH groups. The observations are in agreement with previous works
on bread wheat showing that free and accessible SH groups, detected during the grain
development, become strongly oxidized at the onset of grain desiccation (600°Cd) and so that
until complete maturity (Rhazi et al., 2003a). However, in this work and also thanks to SE-HPLC
analysis which allowed a more accurate quantification of fluorescence intensity we showed that
140
Chapitre IV. A
oxidation and assembly of storage protein began at 473°Cd, well before the grain entered into
the desiccation phase.
Polymers
A
B
Mr
97
"-gliadin
66
LMW-GS
#-,$-,%-gliadins
45
30
20
14
293 327 365 403 473 601 681 739 779 881 1053°Cd
C
293 327 365 403 473 601 681 739 779 881 1053°Cd
D
HMW-GS
Mr
97
"-gliadin
$-amylase
66
LMW-GS
#-,$-,%-gliadins
45
30
20
14
293 327 365 403 473 601 681 739 779 881 1053°Cd
293 327 365 403 473 601 681 739 779 881 1053°Cd
Figure IV-12. Changes in SDS-PAGE patterns of EtOH soluble proteins from developing grains of
durum wheat. Fluorescent (A and C) and Coomassie blue stained (B and D) gels are presented
under non-reducing (A and B) and reducing (C and D) conditions. The thermal time (°Cd) after
anthesis are indicated at the bottom. Arrows indicate smear and multiple bands ad arrowheads
show HMW-GS.
141
Mr
-97
*
*
*
-66
-45
-30
473 601 473 601°Cd
Figure IV-13. Fluorescent (left) and Coomassie blue stained
(right) bands of EtOH extracts from immature grains at 473
and 601°Cd after anthesis. (*) indicates the main
fluorescent bands migrating at between 66 and 45 kDa.
Arrow shows the non-fluorescent band.
SDS-soluble and insoluble extracts
For the first SDS extracts and before 473°Cd, a faint band migrating above the 97 kDa
molecular weight marker corresponded to the overlapped HMW-GS 20x+20y was detected in
both fluorescent and Coomassie blue stained gels (Figure IV-14A and B). It demonstrated that
HMW-GS can be present as free and partly reduced monomers at the beginning of grain filling.
Compared with LMW-GS, HMW-GS were not extracted with Tris-HCL or EtOH, perhaps
indicating that they may also interact with insoluble glutenin polymers through weak bonds.
After 473°Cd in Coomassie blue stained gel, bands became clearly more pronounced and a
smear at the top of the gel can be observed. In opposite, no significant fluorescence was
detected after this date.
Reduction allowed more HMW-GS to be detected in both gels. At the same time, only a small
amount of LMW-GS was liberated before 473°Cd. Thus, before this date HMW-GS existed as
free subunits or oligomers almost devoid of LMW-GS. The size of these oligomers appeared
larger than that those formed by only LMW-GS in EtOH extracts (compare the smears in Figure
IV-12 and Figure IV-14). After 473°Cd, Coomassie blue staining showed that disulfide bonds
reduction also allowed a large amount of LMW-GS and HMW-GS to enter the gel. These
subunits arose from the reduction of the SDS-soluble polymers detected by SE-HPLC (Figure
IV-9B). Compared with the EtOH extract, there was a larger proportion of HMW-GS than LMWGS. The reduction did not change the fluorescence pattern of the SDS-soluble proteins. These
findings suggested that beyond 600°Cd, part of LMW-GS oligomers previously soluble in EtOH
142
Chapitre IV. A
extracts become associated with HMW-GS oligomers. This ultimate assembly would rather
involve disulfide bonds interchanges than sulfhydryl oxidation into disulfide.
A
B
HMW-GS
Mr
97
66
LMW-GS
#-,$-,%-gliadins
45
30
20
293 327 365 403 473 601 681 739 779 881 1053°Cd
293 327 365 403 473 601 681 739 779 881 1053°Cd
C
D
HMW-GS
14
Mr
97
$-amylase
66
LMW-GS
#-,$-,%-gliadins
45
30
20
14
293 327 365 403 473 601 681 739 779 881 1053°Cd
293 327 365 403 473 601 681 739 779 881 1053°Cd
Figure IV-14. Changes in SDS-PAGE patterns of SDS-soluble proteins from developing grains of
durum wheat. Fluorescent (A and C) and Coomassie blue staining (B and D) gels are presented
under non-reducing (A and B) and reducing (C and D) conditions. The thermal time (°Cd) after
anthesis are indicated at the bottom.
SDS-insoluble extracts were analysed only in non-reducing conditions since these extracts
have already been reduced with DTE. As expected, the fluorescence pattern of SDS-insoluble
proteins was very similar to that of SDS-soluble proteins in reduced gel (Figure IV-15A). In
Coomassie blue stained gel, only the faint band corresponding to the overlapped HMW-GS
20x+20y was present until 473°Cd, indicating the presence of homopolymers very early in grain
development. From 600°Cd an unambiguous increase in glutenin polymers can be observed
(Figure IV-15B). However, comparison of the ratio HMW-GS to LMW-GS in the both SDS
extracts, showed that HMW-GS were present in higher proportion in the SDS-insoluble
143
polymers (see Figure IV-14D and Figure IV-15D). This result was in accordance with previous
results demonstrating that average size of glutenin polymers and flour SDS-insoluble polymer
content are strongly related to the amount of HMW-GS (Popineau et al., 1994, Gupta et al.,
1996, Carceller & Aussenac, 1999).
A
B
Mr
HMW-GS
97
$-amylase
66
LMW-GS
#-,$-,%-gliadins
45
30
20
293 327 365 403 473 601 681 739 779 881 1053°Cd 293 327 365 403 473 601 681 739 779 881 1053°Cd
14
Figure IV-15. Changes in SDS-PAGE patterns of SDS-insoluble proteins from developing grains of
durum wheat. Fluorescent (A) and Coomassie blue staining (B) gels are presented under nonreducing conditions. The thermal time (°Cd) after anthesis are indicated at the bottom.
Based on this work, we postulate that as they are synthesized, LMW-GS and HMW-GS are
assembled into homopolymers still carrying reduced SH groups. The former are soluble in TrisHCl and EtOH, in contrast with the latter, which are soluble only in SDS buffer. Both types of
homopolymers co-existed with free and partly reduced subunits. After 473°Cd, a dramatic
change occurred and mixed polymers appeared. Those which remained soluble in EtOH mainly
included LMW-GS. We propose that at the onset of desiccation, LMW-GS become associated
with the HMW polymer backbone to form fully oxidized polymers. The solubility of the
polymers in EtOH or SDS buffer thus depends on their HMW-GS and LMW-GS ratio.
3.4. Changes in SH numbers carried by the different species fractionated by SE-HPLC from
proteins sequentially extracted from developing grains of durum wheat
The ratio Fluo to UV210 intensities of SE-HPLC profiles were converted into fluorescent
residues numbers per molecule according to the calibration described in the method section.
The result can also be expressed in mol of fluorescent residues per g of protein after calibration
of the UV signal, in reference to wheat protein extracts of known concentration (in g.mL-1)
144
Chapitre IV. A
injected on the same SE-HPLC system and column. It is thus possible to extract from the SEHPLC analysis of ATTO-alkylated samples, an estimation of the extent of labelling per g of
protein. The analysis was applied on the extracts obtained from sequential extraction of the
grain.
Considering the protein content within each extract, an approximation of the labelling
content in µmol per g of total grain protein recovered after the sequential extraction was
obtained. Figure IV-16 presents the estimated values together with the amount of protein-thiol
equivalents measured on the same grain samples by using Ellman’s reagent (DNTB method). A
fairly good coincidence of the two sets of measurements was obtained, indicating that (i)
exhaustive protein extraction was achieved using sequential extraction, (ii) labelling of protein
µmol SH/ g of protein
thiol was almost complete and (iii) calibration procedure was accurate.
40
DNTB method
30
Cysteine counting
(Fluo/UV)
20
10
0
200
400
600
800
1000
Figure IV-16. Changes in protein thiol
content during grain development measured
by the DNTB method and the cysteine
content determined by SE-HPLC fluorescent
detection.
Changes in the number of thiol per molecule calculated from the UV and fluorescence
intensities of SE-HPLC profiles for Tris-HCl extracts is showed in the Figure IV-17. The peak
D936(1&2-<+('3)8(E(3'+,2+$-amylase from the analysis of SDS-PAGE electrophoresis and SE-HPLC
was found to carry during the grain filling period (300-600°Cd) between 4 and 6 labelled thiol
per molecule when considering a Mr of 68,000. This value seems underestimated because of
the overlapping of different proteins.
145
UV 214 nm
6
Fluo
nb SH/molecule
0.12
SH number/molecule
5
Fluo
403
4
0.10
0.08
365
3
UV
0.06
2
0.04
1
0.02
0
1 000 000
Fluo and UV intensities (A.U.)
327
0.00
10 000
100 000
0.12
12
0.10
SH number/molecule
10
681
8
473
Fluo
0.08
6
UV
0.06
4
0.04
2
0.02
0
1 000 000
100 000
Fluo and UV intensities (A.U.)
601
0.00
10 000
Relative molecular weight (Da)
Figure IV-17. Evolution of the SH number per molecule from Tris-HCL extracts of developing
grains of durum wheat (327-681°Cd). Thermal times (°Cd) after anthesis are indicated at the top
of each curve.
We can take advantage of the loss of solub ! "#$%&$'-amylase in the Tris-HCl in mature grains.
Hence, SE-HPLC profiles (UV and fluorescent) obtained at 473°Cd were subtracted from the
profiles obtained at 881°Cd. The resulting profiles (Figure IV-18A) showed 4 UV peaks. The first
of M($)*+,,,$ -.!/010$)$"2 %!$(13 0/134$5216"$'-amylase primary structure is still unknown, but
can be considered as close to that of barley. According to Lundgaard and Svensson (1987), this
protein with a Mr of 54,000-59,700 includes 5 to 6 free thiol and no inter-chain disulfide bonds.
The others peaks with Mr of 39,572, 24,500 and 14,510 carried 2.43, 1.46 and 1.25 thiol groups,
respectively. The same data treatment was applied to EtOH extracts (subtracting the SE-HPLC
profiles obtained at 473°Cd from 881°Cd) and revealed peaks with Mr of 84,900 and 39,223
carrying 2.76 and 2.3 thiol groups per molecules. Proteins with Mr close to 40,000 and
transiently present in Tris-HCl and EtOH extracts corresponded to LMW-GS. According to our
estimation they would carry more than 2 thiol groups (2.43 to 2.3). The protein peak of Mr
146
8 0(
5/*$$ ' 7F@ . /"-Z ),>+
A69?!5B(
#4
UV 214 nm
Fluo
nb SH/molecule
#2$ 0 10
0.12
0.10
8
0.08
6
0.06
4
0.04
2
0.02
0
100 000
* $A%% L++C
C
0.00
1 000
10 000
%'$ 0 #<!/%LC
%
UV 214 nm
Fluo
nb SH/molecule
12
0.25
#2$ 0 0.23
10
0.20
0.18
8
0.15
6
0.13
0.10
4
0.08
0.05
2
0.03
0
100 000
10 000
* $A%% L++C
1C
0.00
1 000
%'$ 0 #<!/%LC
6 9?!5( @ ( 7@) 2 AK? 6
B /"-Z :
2
55!Z2
@AB7F@AB.(
6
6
K? 2 7@) 2 2 : %'
%
2
%
%
'A6
9?!*B(
2
2
'
2
%
2
2
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% : 2 %
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:
:
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2
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3<4
@,>+
2
-$D 2 ),>+( > 2
'2
:!3$$$
*$$$$ 2 ( !/"
previously discussed for SE-HPLC and SDS-PAGE analysis, from 473°Cd to 600°Cd the number of
thiol groups carried by polymers dropped markedly (Figure IV-19). What was noteworthy was
that before 600°Cd, the polymers whatever their size carried 1 to 1.6 thiol groups per subunits
(of 40,300). From 600°Cd until maturity this number dropped to less than 0.25 thiol groups per
subunits.
293°Cd
327°Cd
365°Cd
404°Cd
473°Cd
601°Cd
681°Cd
739°Cd
779°Cd
SH number/ protein subunit
2.50
823°Cd
881°Cd
SDS-insoluble
SDS-soluble
2.00
1.50
1.00
0.50
0.00
1 000 000
100 000
10 000
1 000 000
100 000
10 000
Figure IV-19. Evolution of the SH number by protein subunits from SDS-soluble and SDSinsoluble extracts of developing grains of durum wheat. Thermal times (°Cd) after anthesis are
indicated at the top.
Even if different models have been proposed for the polymeric structure of glutenins, most
of them evoke a linear assembly of subunits (Ewart, 1972, Kasarda, 1989, Lindsay & Skerritt,
1999). According to such model the number of thiol groups carried by polymers should be
constant and equal to two, because of the two cysteine residues at the both ends of the linear
chain of polypeptides. However if for example one refers to polymers of Mr comprised between
200,000 and 250,000, which are likely formed by assembly of 4 to 5 glutenin subunits, at
473°Cd each of those subunits would carry about 1.5 reduced cysteine, i.e. 8 reduced cysteines
per molecule (Figure IV-19). Surprisingly, at 600°Cd a polymer of the same Mr would carry
about 2-2.5 thiol groups per molecule. We must conclude that assembly of glutenin subunits
into polymers would not coincide to the total oxidation of their thiol groups. In addition, our
results suggested that free glutenin subunits would carry more than two reduced cysteine
residues. In other words, the folding of LMW-GS intra-chain disulfide bond might be a late
event. Assembly of glutenin polymers appears more complex than the linear concatenation
model currently accepted. This result shed a new light on the role of glutathione binding to
148
Chapitre IV. A
glutenin polymers. Glutathionylation of glutenin polymers has been proposed to impair
polymer size growth (Rhazi et al., 2003b) by blocking the thiol groups still present on the
emerging polymer backbone. Implicitly those groups were assigned to the cysteine residues
expected to be involved in glutenin subunits pairing (Köhler et al., 1996). In view of our results,
most of the thiol groups present on polymers before 600°Cd would origin from open intra-chain
disulfide bonds. The challenging question for future investigations will be to unravel the
respective roles of glutathione, PDI and ROS on their closure.
149
150
Chapitre IV. B
Chapitre IV. B) Identification des résidus cystéine réduits dans les gluténines
polymériques de grains de blé dur en développement
Les travaux présentés dans cette étude ont été réalisés à l’INRA de Nantes, lors d’un séjour
de six mois dans l’unité de recherche « Biopolymères, Interactions et Assemblage » (BIA). Les
mesures en spectroscopie de masse ont été réalisées au sein de la Plate-forme « BiopolymèresInteractions-Biologie Structurale » (BIBS).
1. Introduction
Les SG-FPM sont des composants majeurs des polymères de gluténines, elles sont environ 5
à 6 fois plus abondantes que les SG-HPM (Kasarda, 1989). Leur incorporation dans les
polymères de gluténines est mal connue, on ne sait pas si celle-ci se fait au hasard ou si elle est
soumise à des contraintes particulières en raison de leur structure, de leur synthèse ou de
l'implication d'enzymes spécifiques (D'Ovidio & Masci, 2004).
La détermination des ponts disulfures est un aspect important dans la compréhension
globale de la structure chimique d'une protéine (Gorman et al., 2002). La formation de ponts
disulfures entre les résidus cystéines est un phénomène post-traductionnel essentiel pour la
structure et fonctionnalité des prolamines (i.e. gluténines et gliadines). Néanmoins chez le blé,
la relation entre structure et fonctionnalité n’est pas élucidée, d’autant plus que la dynamique
de formation des ponts disulfure intra et intermoléculaires, ainsi que leur position dans les
séquences des SG ne sont pas complètement connues.
Même si les informations sur la structure propre des SG-FPM sont assez éparses, des études
portant sur l'analyse des peptides cystines dérivés de fractions de gluténines ont mis en
évidence des informations importantes sur la cartographie des ponts disulfures intra et
intermoléculaires des SG-FPM (Köhler et al., 1993, Keck et al., 1995, Müller et al., 1998). Il est
donc bien établi que cette sous-unité contient deux résidus cystéine qui sont susceptibles d'être
impliqués dans des ponts disulfures intermoléculaires, à savoir le premier (Cb*) et le septième
(Cx*). Ces résidus sont entourés par des régions de grande flexibilité, ce qui pourrait favoriser la
polymérisation (Masci et al., 1998, D'Ovidio & Masci, 2004). Les autres six résidus cystéine sont
susceptibles d'être impliqués dans des ponts disulfures intramoléculaires.
151
Identification des résidus cystéine dans les sous-unités de gluténines
La spectrométrie de masse est apparue récemment comme une technique alternative pour
la caractérisation des prolamines (Mendez et al., 1995, Dworschak et al., 1998, Ghirardo et al.,
2005). Le développement des outils d'analyse permettant l’identification des liaisons disulfures
se sont considérablement améliorés au cours des deux dernières décennies, notamment en
termes de vitesse et de sensibilité. Cette amélioration est due en grande partie au
développement, en spectrométrie de masse, des techniques d’ionisation et d’analyseurs
complémentaires de haute résolution et précision (Gorman et al., 2002).
Des études ont montré que l’utilisation d'un réactif alkylant composé d’un mélange
d’acrylamide marquée et non-marquée au deutérium (31H et 32H) permet d'identifier et de
quantifier les résidus cystéine dans chaque peptide en raison de la distribution isotopique
particulière générée par les deux alkylants qui diffèrent de 3 Da (Sechi & Chait, 1998, Sechi,
2002). De plus, ces mêmes auteurs ont montré que l’alkylation des résidus cystéines améliore
significativement l’identification par spectrométrie de masse des protéines isolées par 1D SDSPAGE.
Des approches protéomiques telles que la séparation sur gel 2D et l'analyse par
spectrométrie de masse, impliquant l’utilisation de réduction partielle des ponts disulfures et
de double marquage ou marquage fluorescent spécifique des groupement thiols ont été
utilisées pour établir la cartographie des cystéines impliquées dans la formation des liaisons
disulfures (Bloom et al., 2002, Schnaible et al., 2002, Foley et al., 2008, Alvarez et al., 2009). En
outre, l’utilisation d’une double alkylation ou alkylation différentielle en combinaison avec
l'analyse par spectrométrie de masse ont été utilisées pour évaluer le niveau global d’oxydation
des cystéines (Schilling et al., 2004).
Des analyses biochimiques globales, présentées dans le chapitre 4.A, révèlent que
l’agrégation des gluténines est corrélée à l’oxydation de leurs fonctions thiols. En s’appuyant
sur le marquage des thiols par un alkylant spécifique fluorescent, nous avons pu caractériser le
couplage entre oxydation des thiols protéiques et croissance en taille des assemblages de sousunités de gluténines. Cette étude a été menée en vue de caractériser la dynamique
d’assemblage des SG-FPM et des SG-HPM dans l'albumen de blé dur au cours du
développement du grain. En pratiquant une double alkylation, nous avons analysé, par
spectrométrie de masse, l’état d’oxydoréduction des cystéines (réduites ou engagées) dans les
152
Chapitre IV. B
différents types de prolamines. Nous avons ainsi cherché à identifier quelles sont les résidus
cystéines présents sous forme réduite lors de la synthèse des sous-unités gluténines et quel est
le type de prolamine auquel elles appartiennent.
Les méthodes MALDI-TOF et MALDI-TOF/TOF ont été choisies dans le cadre de cette étude
et sont détaillées dans la partie Complément méthodologiques (Annexe 1).
2. Stratégie générale
La stratégie générale utilisée dans cette étude est présentée sous forme de schéma cidessous (Figure IV-20). Elle fait appel à une double alkylation avant et après réduction des
liaisons disulfures. Les peptides trypsiques obtenus sont identifiés d’après leur masse à partir
des séquences de gluténines répertoriées dans les banques de données (cartographie
peptidique in silico). Dans le cas où il s’agit de peptides incluant des cystéines, une déviation de
la masse dépendante de l’alkylant est attendue. Selon les alkylants présents sur les différents
peptides de la protéine, on peut déduire l’état d’oxydoréduction des différentes cystéines des
sous-unités de gluténines au moment de leur extraction.
Figure IV-20. Stratégie générale de double alkylation.
153
2.1. Méthodologie retenue pour l’étude
Électrophorèse 1D et coloration
Parmi les multiples approches méthodologiques existantes, nous avons retenu une méthode
simple et robuste. Afin de s’affranchir des pertes de matériel au cours des étapes de séparation,
nous avons choisi d’effectuer une séparation du mélange protéique d’intérêt par électrophorèse
mono-dimensionnelle sur gel d’acrylamide en présence de SDS (1D SDS-PAGE). Cette technique
permet de préfractionner les échantillons selon la masse des protéines. De plus, elle utilise un
détergent ionique en grande concentration pour la solubilisation des protéines, ce qui convient
bien pour l’analyse des prolamines. Dans le cas de mélanges protéiques complexes, une bande
de gel colorée peut contenir de nombreuses protéines. Le choix du colorant va déterminer la
sensibilité de la technique. La coloration au bleu de Coomassie colloïdal, bien que moins
sensible que les colorations à l’argent et fluorescentes, présente l’avantage d’être considérée
comme linéaire sur une large gamme de concentration et donc d’être bien adaptée pour des
études comparatives. De plus cette technique de coloration est compatible avec l’analyse par
spectrométrie de masse.
Double alkylation ou alkylation différentielle
La stratégie développée fait appel à une double alkylation l’une avant et l’autre après
réduction des liaisons disulfures. Nous avons utilisé différents agents alkylants : l’ATTOmaléimide un réactif alkylant fluorescent chargé négativement ; la 4-vinyl-pyridine (4-VP) qui
porte une charge positive ; le N-éthyl-maléimide (NEM) et l’Iodoacétamide (IAM), des alkylants
à caractère neutre (Figure IV-21).
Sur un échantillon de grains broyés, une première alkylation des SH libres est réalisée (CysA1). Ensuite une précipitation suivie de lavages successifs à l’acétone permet de se débarrasser
de l’excès de réactif alkylant (A1). On procède à l’extraction séquentielle des protéines
préalablement alkylées par A1. La séparation des fractions protéiques est réalisée par 1D SDSPAGE (en conditions non-réductrices et réductrices). Les bandes sont découpées et avant la
digestion protéasique, les protéines de ces bandes sont réduites par de DTT, cette réduction
libère ainsi les cystéines engagées dans les ponts disulfures. Ces cystéines sont ensuite alkylées
par un deuxième alkylant (A2) dont la masse diffère significativement de celle d’A1.
154
Chapitre IV. B
A)
B)
C)
Figure IV-21. Exemple de réaction d’alkylation de groupement thiol (SH) par A : la 2-vinylpyridine (VP), B : l’Iodoacetamide (IAM) et C : le N-éthyl-maléimide (NEM) (d'après Hansen &
Winther, 2009).
Hydrolyse enzymatique
Les protéines séparées par électrophorèse subissent une hydrolyse enzymatique in situ. La
protéase la plus couramment utilisée est la trypsine (Serine proteinase, EC 3.4.21.4, PM 24 kDa)
: elle coupe après une lysine (K) ou une arginine (R) sauf si ces résidus sont suivis d’une proline
(P). Une digestion protéolytique par la trypsine présente également l'avantage de générer des
pics d'autolyse bien répartis dans la gamme de masses 500-3500 Da. Ces pics peuvent être ainsi
utilisés comme étalons internes afin d'obtenir une meilleure précision de masse sur l'ensemble
du spectre. Les peptides générés sont extraits de la matrice solide de polyacrylamide par
diffusion passive et sont analysés par spectrométrie de masse MALDI-TOF/TOF.
Ainsi, à partir d’un découpage de bandes d'électrophorèse 1D sélectionnées, nous avons
commencé par l’identification des protéines par spectrométrie de masse MS puis nous avons
analysé des peptides porteurs de cystéines par spectrométrie de masse en tandem (MS/MS).
Le spectromètre de masse : MALDI-TOF
Les spectromètres de masse sont peu ou pas tolérants aux sels, tampons et détergents qui
permettent d'extraire les biomolécules. Ces composés, en quantité importante peuvent
entraîner la formation d'adduits et empêcher la formation des cristaux non-covalents de
matrice, bloquer l’absorption photonique et conduire à une production d’ions faibles ou à
155
l'extinction totale des espèces moléculaires d'intérêt. Le point fort de la technique MALDI est
son caractère « robuste » moins sensible aux conditions initiales d’environnement des
protéines et peptides dans des solutions complexes à analyser. De plus, le MALDI-TOF a été
choisi car il est bien adapté à notre type d’analyse, du fait de sa précision de mesure, de sa
sensibilité (détection de quantités femtomolaires), de sa rapidité et de la possibilité d’analyse à
haut-débit grâce à l’automatisation. Enfin, ses spectres sont directement exploitables (aucune
étape de déconvolution n’est nécessaire, contrairement à l’ESI, car seuls les ions monochargés
sont détectés).
2.2. Matériel végétal utilisé
Pour cette étude nous avons utilisé trois variétés de blé dur : Orlu, Dakter et Néfer,
caractérisées par une composition allélique différente en SG-HPM (Glu-1B 20x + 20y, Glu-1B 7x
+ 8y et Glu-1B 13x + 16y respectivement). Ces génotypes ont été cultivés à Mauguio lors de la
campagne 2008 (Orlu) et 2009 (Néfer et Dakter). Les épis ont été prélevés au cours du
développement de la plante et immédiatement congelés avant d’être lyophilisés. Les analyses
ont porté sur des extraits protéiques de grains immatures à 327 et 473°CJAF) de façon à
maximiser la présence de thiols réduits. Ces dates correspondent aussi à des états de
polymérisation partielle des gluténines.
2.3. Protocole d’alkylation des thiols protéiques et extraction de protéines
2.3.1. Alkylation des groupements thiols
L’alkylation des groupements thiols (SH) a été réalisée avant de procéder à l’extraction
séquentielle des protéines. A partir de 20 mg de grains immatures broyés entiers, sont ajoutés
200 µL de la solution alkylante, le mélange est agité à l'abri de la lumière, conforme présenté
dans Tableau IV-1.
156
Chapitre IV. B
Tableau IV-1. Alkylation des groupements thiols avec différents réactifs alkylants.
Réactif alkylant
Tampon utilisé
Durée et température de réaction
2,5 mM ATTO 532
(Fluka)
Phosphate de sodium 80 mM
(pH 6.8)
10 min d’agitation et 40 min sans
agitation à température ambiante
50 mM 4-VP
(Sigma)
Tris-HCl 80 mM (pH 8)
1 h d’agitation à 65°C
185 mM IAM
(Sigma)
Tris-HCl 80 mM (pH 8)
1 h d’agitation à température
ambiante
20 mM NEM
(Sigma)
Phosphate de sodium 80 mM
(pH 6.8)
1 h d’agitation à température
ambiante
2.3.2. Extraction séquentielle de protéines
Extraction Tris-HCl (fraction albumine/globuline)
Après la première alkylation, les échantillons sont centrifugés à 10600 g pendant 10 minutes
à 20°C. Pour éviter toute contamination avec l’alkylant résiduel ou le culot, seuls 125 µL de
surnageant sont prélevés et précipités avec 625 µL d’acétone glacial pure (placée préalablement
2 heures à -20°C) pendant 1 heure à -20°C. L’extrait albumine/globuline correspond au
surnageant récupéré après centrifugation à 10600 g pendant 10 minutes à 20°C.
Le reste du premier surnageant est éliminé et 1 mL d’acétone à 80% est ajouté au culot de
broyat dans chaque tube. Après une vive agitation, le culot de protéines précipitées à l’acétone
est placé pendant 1 heure à -20°C. Après centrifugation (10600 g ; 10 minutes ; 20°C), trois
lavages successifs avec 1 mL d’acétone 80% (v/v) sont réalisés et le surnageant est éliminé.
Extraction éthanol 70% (fraction Gliadine)
Le culot est repris par 200 µL d’éthanol 70 % (v/v) et agité pendant 15 minutes à température
ambiante à l'abri de la lumière. Après centrifugation (10600 g ; 20 minutes ; 20°C), 150 µL de
surnageant sont prélevés et le reste de surnageant est éliminé.
Extraction SDS 2% (fraction SDS-solubles)
Le culot est repris par 200 µl de SDS 2% dans le tampon de départ correspondant à l’alkylant
employé (i.e. Tris-HCl 80 mM pH 8 dans le cas de la 4-VP, de l'IAM et du NEM) et agité pendant 1
157
heure à température ambiante à l'abri de la lumière. Après centrifugation (10600 g ; 20
minutes ; 20°C), 150 µL de surnageant sont prélevés et le reste de surnageant est éliminé.
2.3.3. Extraction totale des protéines
Vingt milligrammes de grains immatures broyés sont mis en contact avec : 500 µL de la
solution alkylante contenant du tampon phosphate de sodium 80 mM (pH 8) en présence de
SDS 2% et d'IAM 185 mM ou 500 µL de tampon Tris-HCl 80 mM (pH 6.8) en présence de SDS 2%
et de NEM 20 mM.
Les échantillons sont agités pendant 1 heure à température ambiante et à l’abri de la
lumière. Au terme de l’agitation, les échantillons sont centrifugés à 10600 g pendant 10
minutes à 20°C. Le surnageant contient ainsi les protéines solubilisées avec leurs SH alkylés.
Deux cent cinquante microlitres de surnageant sont prélevés et puis les protéines extraites sont
précipitées à l’acétone glacial 80% (v/v) pendant 1 heure à -20°C. Les extraits sont centrifugés à
10600 g pendant 10 minutes à 20°C. Le culot protéique est lavé trois fois avec de l’acétone
glacial 80% (v/v). Ensuite, le culot est repris par 50 µL de tampon phosphate de sodium 80 mM
(pH 8) ou de tampon Tris-HCl 80 mM (pH 6.8).
2.4. SE-HPLC
Les extraits séquentiels alkylés par différents réactifs ont été analysés par SE-HPLC afin
d’obtenir la teneur en protéine de chaque extrait. La proportion relative de chaque fraction
protéique est obtenue comme habituellement par le calcul de l’aire totale du
chromatogramme, après injection et séparation de chaque extrait sur une colonne TSK
G4000SWXL (Tosoh Bioscience). Ses caractéristiques sont les suivantes : 7.8 x 300 mm, taille des
particules : 8 µm, porosité : 450 Å. La colonne est précédée d’une pré-colonne TSK GSWXL (6 x
40 mm) (Tosoh Bioscience). Les protéines sont éluées à température ambiante avec du tampon
phosphate de sodium 0,1 M (pH 6.8) contenant 0,1% de SDS (p/v). Le débit est maintenu à 0,7
mL/min et l’absorbance mesurée à 214 nm. La fluorescence est mesurée avec une détection
supplémentaire par un fluorimètre (Waters 474) avec une longueur d’onde d’excitation de 533
nm et d’émission à 560 nm.
Tous les extraits séquentiels obtenus sont dilués une fois avec TFA 0,1%. Au moment de
l’injection les extraits sont à nouveau dilués une fois avec du tampon phosphate de sodium 0,1
158
Chapitre IV. B
M (pH 6.8). Vingt microlitres de chaque extrait sont injectés sur la colonne. La teneur en
protéines est calculée à partir de l’aire totale du chromatogramme.
2.5. SDS- PAGE
Tous les extraits obtenus, séquentiels et totaux, sont dilués une fois avec le tampon de
charge en conditions non-réductrices contenant 62.5 mM de Tris-HCl (pH 6.8), 2% de SDS (p/v),
10% de glycérol (v/v) et 0,1% de bleu de bromophénol (p/v). En conditions réductrices 5% de 'mercaptoéthanol (v/v) sont ajoutés et les échantillons sont ensuite chauffés 2 minutes à 100°C.
Des standards des poids moléculaires allant de 10 à 200 kDa (PageRuler™ Unstained Protein
Ladder - Fermentas) ont été déposés dans l'un des puits du gel pour une migration en parallèle
avec les échantillons.
En vue de séparer des quantités équivalentes de protéines de chaque fraction, les quantités
d’extrait déposées ont été déterminées par une analyse préalable SE-HPLC. Les
chromatogrammes ont montré qu’il n’y a pas de différence significative entre les proportions
de protéines extraites par Tris-HCl, EtOH 70% et SDS 2%. Chacune de ces fractions représente
environ 30% du total. Donc en conditions non-réductrices 15 µL de chaque fraction ont été
déposés. En conditions réductrices ou pour les extraits SDS totaux 10 µL d’échantillon ont été
déposés.
Tous les extraits obtenus sont déposés sur un gel de polyacrylamide (13.5% d’acrylamide et
0.11% de bis-acrylamide) de 16x18 cm et de 0.75 mm d’épaisseur. La migration a été réalisée
durant environ 3 heures et 30 minutes jusqu’à l’arrivée du front de migration en bas du gel, à
un ampérage constant de 20 mA par gel, à une température régulée de 20°C.
2.5.1. Coloration des gels
Pour la coloration au Bleu de Coomassie, les gels sont plongés pendant une nuit dans une
solution de méthanol 20% (v/v), sulfate d’ammonium 10% (p/v), acide ortho-phosphorique
0.8% (v/v) et Bleu de Coomassie G250 0,1% (p/v). Pour retirer l’excès de colorant et révéler les
bandes protéiques, les gels sont rincés deux fois 10 minutes dans l’eau distillée.
2.5.2. Acquisition d’images
L’obtention des images fluorescentes a été effectuée sur un scanner FLA-5000 (Fluorescent
Image Analysing System, Fujifilm). Les images sont acquises à 532 nm (LPG filtre) avec une
159
tension de 400 V (PMT) et traitées par le logiciel ImageGauge. L’obtention des images des gels
colorés au Bleu de Coomassie a été effectuée sur un scanner GS-710 Imaging densitometer
(Biorad) avec un niveau de résolution de 600 DPI (« Dots Per Inch » : pixels par pouce).
L’acquisition d’images est réalisée à l’aide du logiciel Pdquest 6.2.
2.6. Préparation des échantillons pour l’analyse MS
A partir de gel de polyacrylamide, les bandes sont découpées largement à l'aide d'un scalpel
en 3 ou 4 petits morceaux et placées dans un tube Eppendorf. Afin d'éliminer les sels et le
colorant, les morceaux de gel sont lavés par 100 78$01$9 .6(9%-6"1$0:6;;%- /;$<=> 4HCO3) 25
mM pendant 1h sous agitation rotative (600 tours/min) à température ambiante. Après
élimination du surnageant, une nouvelle étape de rinçage est réalisée avec 100 78$01$=> 4HCO3
25 mM 50% / ACN 50% (v/v). Après les lavages, les ponts disulfures des protéines sont réduits
par 100 µL de DTT 10 mM dans NH4HCO3 25 mM pendant 1h à 50°C sous agitation à l'obscurité.
Le surnageant est éliminé. Les cystéines ainsi libérées sont alkylées par 100µL de 4-VP 50 mM
dans NH4HCO3 25 mM, pendant 45 minutes à l’obscurité et à température ambiante. Les
morceaux de gel sont ensuite rincés avec ?,,$78$01$=>4HCO3 25mM pendant 30 minutes sous
agitation (600 tours/min) puis 200 µL de 50% NH4HCO3 25 mM / 50% ACN, pendant 15 minutes.
La déshydratation des morceaux de gel est réalisée par une incubation de 5 minutes dans de
l'ACN 100%.
2.6.1. Digestion trypsique
Les morceaux de gel sont réhydratés et digérés par la solution de trypsine. Pour cela 20 7L
de trypsine porcine à 7,5 ng/7L solubilisée dans du tampon NH4HCO3 25 mM en présence de
0,025% de ProteaseMAX (Promega), tensio-actif qui assure une plus grande efficacité de la
digestion, sont ajoutés aux morceaux de gel. Après 20 minutes de réhydratation du gel, les
protéines sont digérées pendant 3 heures à 37°C à l’obscurité. A la fin de la digestion, la
réaction est arrêtée par ajout d’un 7L d’acide formique 1% (v/v). L’extraction des peptides hors
du gel est facilitée par l’ajout de 50 µL d’un mélange 20% eau, 70% ACN et 10% acide formique
(v/v/v), traités 15 min aux ultrasons (Sonicater 88155, Bioblock Scientific). Après centrifugation,
le surnageant est récupéré. Les morceaux de gels restant sont à nouveau lavés avec 50 µL
d’ACN et soumis 15 minutes aux ultrasons. Les deux surnageants sont regroupés et séchés sous
pression réduite (Speed-Vac, 60 min, 100 mbars à 30°C).
160
Chapitre IV. B
2.7. Analyse MALDI-TOF
Les analyses MS sont effectuées sur un spectromètre MALDI Autoflex III Smartbeam (BrukerFranzen Analytic GmbH, Brême, Allemagne). Ce MALDI-TOF/TOF est équipée d'un laser Nd :
YAG de longueur d’onde 337 nm, de fréquence allant de 1 à 200 Hz et de durée de pulse de 5 à
7 ns. Une caméra permet de visualiser le dépôt et les impacts des tirs lasers. Un spectre de
masse est généré à chaque tir laser, l’accumulation de 200 à 800 spectres est réalisée afin
d’obtenir une intensité d’environ 1000 sur plusieurs pics. Ce spectromètre de masse MALDI
TOF/TOF est piloté par le logiciel FlexControl pour l’acquisition des spectres. Le logiciel
d’exploitation des données est FlexAnalysis. Les spectres peuvent subir un certain nombre de
traitements (déconvolution, lissage, création de carte massique peak-list, etc) avant d’être
utilisés pour les recherches dans les banques de données.
2.7.1. Calibration du spectromètre de masse MALDI-TOF
Deux types de calibration sont possibles : une calibration interne et externe.
La calibration interne est utilisée pour un maximum de précision de la mesure de masse. Un
mélange de peptides connus (échantillon étalon) est incorporé à l’échantillon à analyser.
L'ensemble est co-cristallisé avec la matrice. Dans notre cas, la trypsine utilisée pour la
digestion des protéines in gel est un étalon interne. En effet, la trypsine s'autolyse et génère
des peptides de masses connues, plusieurs de ces peptides sont très bien détectés en
spectrométrie de masse MALDI-TOF. Les fragments d’autolyse de la trypsine mono-isotopiques
utilisés comme étalons internes sont 842,51 m/z ; 1045,564 m/z ; 2211,105 m/z et 2283,18 m/z.
L’assignation des masses de ces peptides standards permet de calculer les constantes de
calibration. Ces constantes permettent le calcul des masses des composés inconnus de notre
échantillon. Si la concentration de la trypsine est trop importante par rapport à l'échantillon ou
si les peptides de l'échantillon ne s'ionisent pas aisément, nous pouvons observer une
suppression des ions analytes. Afin de minimiser cela, nous avons utilisé également une
calibration dite externe.
Pour la calibration externe, l’étalon n'est donc pas incorporé à l'échantillon. L’étalon est un
mélange de peptides ou de protéines de masses moléculaires et de rapport m/z connus.
L'échantillon étalon est déposé à un endroit distinct de celui de l’échantillon sur la cible mais
dans un environnement proche. La première étape consiste à acquérir un spectre de masse du
161
mélange étalon et à réaliser la calibration de ce spectre. Dans un deuxième temps, les ions
analytes sont analysés dans les mêmes conditions (matrice et paramètres) que les étalons. Les
spectres ont été calibrés extérieurement en utilisant un mélange connu de peptides et
protéines.
Un mélange de 7 protéines nommé Protmix (Sigma) est préparé dans une solution ACN
30%/TFA 0,4% (v/v) et utilisé pour étalonner l’appareil MALDI-TOF en mode linéaire. Les
protéines sont les suivantes : l'Insuline 5734,52 m/z ; le Cytochrome c 12360,97 m/z ; le
Lysozyme 14304,50 m/z ; la Myoglobine 16952,31 m/z ; le Trypsinogène 23978,52 et
23996,38 m/z ; l’anhydrase Carbonique 28982,70 m/z et l’Alcool déshydrogénase 36743,4 m/z.
Pour l'analyse des peptides, un mélange de 7 peptides nommé Pepmix (Sigma) est utilisé et
préparé dans du TFA à 0,1% (v/v). Les peptides sont les suivants : Angiotensine I 1296,6853
m/z ; Angiotensine II 1046,5423 m/z ; Substance P 1347,7359 m/z ; Glufibrinopeptide 1570,6774
m/z ; Rénine 1758,9331 m/z ; ACTH 2465,1989 m/z et Insuline chaine B 3495,6513 m/z. Au
moins 4 pics de calibrant (mode quadratique) doivent être assignés pour que la calibration soit
effective.
2.7.2. Dépôt de l’échantillon
La qualité du dépôt sur cible est un point important pour la réalisation d’une mesure de
masse précise. L’homogénéité du dépôt permet des mesures reproductibles donc la possibilité
et l’avantage de pouvoir accumuler les signaux lorsque ceux-ci sont de faible intensité. Il s’agit
de trouver un compromis entre la matrice idéale et le mode de dépôt pour analyser un
maximum de peptides.
Pour les analyses en mode linéaire de protéines ou de peptides ayant une masse supérieure
à 5000 Da, 178$0@échantillon ou 1µL d’étalon Protmix est mélangé à 178$01$;6"( .1+$06-3$.1$.63$
l’acide sinapinique (10 mg/mL d’acide sinapinique dissous dans d’ACN 50% (v/v)). Pour les
analyses en mode réflecteur des peptides de masse compris entre 500-A,,,$ B6+$ C78$
d’échantillon digéré ou 1µL d’éthalon Pepmix est mélangé à78$
1 01$ ;6"( .1+$ >DDE$ F,GHB>I$
F,G$ <C,$ ;JH;8$ 0:6. 01$ K-cyano-4-hydroxy-cinnamique et 10 mg/mL d’acide 2.5dihydroxybenzoique dissous dans 70% d’ACN, 30% de phosphate d’ammonium NH4H2PO4 15
mM (v/v) contenant 0,1% de TFA). Le mode de dépôt utilisé est la "goutte séchée". Le mélange
est déposé sur la cible et l’acquisition des spectres est effectuée à l’aide du logiciel FlexControl.
162
Chapitre IV. B
2.7.3. Analyse MALDI-TOF/TOF
Avant une analyse MS/MS, Il faut réaliser une acquisition en MS, traiter le spectre dans le
logiciel FlexAnalysis pour obtenir la liste des m/z des ions parents qui seront fragmentés. Ainsi,
lors d'une analyse MS/MS (LIFT), la masse (m/z) du peptide (ion « parent ») qui sera fragmenté
est renseignée dans le logiciel FlexControl. La MS/MS ne nécessite pas de recalibration car
celle-ci se fait grâce à la masse de l'ion parent donnée.
L’efficacité de la fragmentation efficace dépend de la composition en acides aminés de l'ion
parent. En effet, si le peptide contient un ou plusieurs résidus prolines, il est très difficile
d'obtenir une série de fragments.
2.8. Recherche en banque de données
2.8.1. Cartographie peptidique
Les spectres MS ou MS/MS obtenus sont comparés à différentes banques de données (UniProt/Swiss-Prot et Uni-Prot/TrEMBL) compilant des séquences protéiques. La liste des masses
théoriques et celle des masses expérimentales sont comparées par l’intermédiaire du logiciel
Biotools à l’aide d’un moteur de recherche en utilisant les serveurs locaux MASCOT (Matrix
Science, London). Des paramètres concernant l’échantillon sont renseignés pour cibler la
recherche. Ces paramètres sont les suivants : la taxonomie, l'enzyme utilisée pour la digestion,
le nombre de sites protéolytiques spécifiques non coupés par l’enzyme (miss cleavage)
entraînant ainsi des fragmentations partielles, la tolérance de masse sur les peptides (ppm, Da),
modifications totales ou partielles. Il est impératif de spécifier l’agent alkylant utilisé. Ce dernier
provoque une modification des cystéines et par conséquent de masse (Tableau IV-2). Il est
possible de renseigner, dans les logiciels, des modifications connues telles que l'oxydation des
méthionines (+16 Da) de façon partielle car les réactions ne sont jamais totales.
Une liste de protéines candidates est alors proposée en fonction du nombre de peptides
communs avec les protéines digérées in silico en tenant compte de la précision de masse des
peptides. Une protéine sera considérée comme identifiée significativement dans le cas où le
spectre de masse obtenu après sa digestion aurait un grand nombre de peptides en commun
avec le spectre de masse d’une protéine de la banque.
163
Tableau IV-2. Exemples de différents types de modifications.
Réactif
Modification
Résidu
modifié
Différences de
masses (Da)
Acrylamide
Propionamide
Cys-PAM
+ 71.037
Iodoacétamide (IAM)
Carbamidométhylation
Cys-CAM
+ 57.021
N-éthyl-maléimide (NEM)
N-éthyl-maléimide
Cys-NEM
+125.125
4-vinyl-pyridine (4-VP)
Pyridylethylation
Cys-PE
+ 105.057
Oxygène
Methionine sulfoxide
MSO
+ 15.994
2.8.2. Sequence Editor - Biotools
Une fois que la protéine est identifiée par MASCOT, sa séquence peut être transférée dans
Sequence Editor (Biotools). Cet outil nous a permis à partir de séquences protéiques de réaliser
des digestions théoriques et d'apporter des modifications (i.e. alkylation, oxydation et
également de créer des ponts disulfures intra ou intermoléculaires supposés entre 2 protéines).
La liste théorique des masses des peptides édités par Sequence Editor peut alors être comparée
avec le spectre acquis. L’utilisation de cet outil nous a permis d’améliorer la couverture de
séquence et par ailleurs de localiser des peptides qui n'ont pas été préalablement identifiés.
2.8.3. Séquençage « de novo »
La fragmentation des peptides par spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) a été
réalisée afin de confirmer le statut des résidus cystéines sur les peptides identifiés par PMF.
Dans ce travail tous les peptides à cystéines ont été analysés par MS/MS. Quand les spectres de
fragmentation permettent de déterminer une séquence en acides aminés il s’agit alors de
séquençage « de novo ». Ces informations nous ont permis de réaliser des recherches selon 2
modes : recherche par homologie ou alignement de séquences pour une dizaine de résidus ou
recherche par « tag ». Par cette dernière approche, une séquence spécifique de 2 à 3 acides
aminés qui se suivent permet d'identifier une protéine. Cette méthode s’appui du fait que les
spectres MS/MS contient au moins une courte séquence des ions fragments qui spécifie sans
ambiguïté une courte séquence d'acides aminés (Mann & Wilm, 1994).
164
Chapitre IV. B
3. Résultats
3.1. Recherche de sous-unités de gluténines dans la banque de données Uniprot
Dans un premier temps une recherche a été menée afin de collecter des données sur les
séquences des sous-unités de gluténines de différentes variétés, répertoriées dans la banque
de données de séquences peptidiques UniProt. Une banque contenant des prolamines,
notamment les SG-FPM et SG-HPM, a été crée, et cela nous a permis de connaître la variabilité
entre les sous-unités, notamment en ce qui concerne la position et le nombre des résidus
cystéine dans les séquences. La banque de données qui a été créée contient 300 séquences de
prolamines, dont 73 correspondent à des fragments des séquences. Les sous-unités de
gluténines sont représentées par 185 séquences (101 de SG-FPM et 84 de SG-HPM) et les
gliadines par 115 séquences.
En ce qui concerne les SG-HPM des variétés étudiées, la plupart d’entre elles sont
répertoriées dans la banque de données UniProt et sont présentées dans le Tableau IV-3. La
séquence de la sous-unité 1Bx20 de la variété Orlu répertoriée dans UniProt est présentée dans
le Tableau IV-4. En revanche, la protéine 1By20 associée à une masse moléculaire de 75 kDa
(Figure IV-22) (Gao et al., 2010) n’est pas présente dans la banque de données. Cependant, une
étude a montré que la composition en acide aminé de la 1By20 de la variété de blé dur Lira est
similaire à celles de la 1By8 et de la 1By16 de blé dur (Buonocore et al., 1996). En ce qui
concerne la variété Dakter, les séquences des deux sous-unités 1Bx7 et 1By8 sont répertoriées
dans la banque UniProt. De plus, une étude récente a montré que la sous-unité 1By8 de T.
durum présente 99% d’homologie avec la 1By9 de T. aestivum (Dai et al., 2009). Les différences
principales étant que la 1By8 possède une insertion de 15 résidus d'acides aminés en position
342 et deux substitutions en position 78 et 442, aucunes d'entre elles ne concernent des
résidus cystéine. Les deux SG-HPM de la variété Néfer (1Bx13 + 1By16) sont répertoriées dans
la banque de données Uniprot.
165
Tableau IV-3. Les sous-unités de gluténines de haut poids moléculaire des variétés étudiées
répertoriées dans la banque Uniprot.
Variété
Famille
Protéine
Mr (kDa)
Numéro d'entrée Uniprot
Orlu
SG-HPM
1Bx20
86,054
Q8RVX0
Dakter
SG-HPM
1Bx7
1By8
85,233
77,343
Q45R38
Q84TG6
Néfer
SG-HPM
1Bx13
1By16
85,319
79,467
A5HMG1
A5HMG2
Figure IV-22. Spectres MS des SG-HPM de la variété de blé dur Bidi 17 à partir d’une analyse
MALDI-TOF (Gao et al., 2010).
Des digestions trypsiques théoriques à l’aide de l’outil Peptide mass ont été réalisées, ce qui
nous a permis de connaître la séquence et la masse théoriques des peptides trypsiques
contenant les résidus cystéines. Il ressort que parmi les variétés étudiées, la majorité des
peptides à cystéines appartient aux zones assez conservées, par conséquent les différentes SGHPM présentent souvent les mêmes séquences et donc les mêmes masses de peptides (i.e. le
peptide 22-33 porteur de la Cys-31 : EGEASGQLQCER de masse 1306,5692 Da est présent dans
les SG-HPM 1Bx20 et 1Bx13, cf. Tableau IV-4). Un alignement de séquences en acides aminés
des SG-HPM de type y est donné comme exemple en Annexe 2.
166
Chapitre IV. B
Tableau IV-4. Digestion trypsique in silico de la SG-HPM 1Bx20 (Mr 86,054 kDa, numéro
d’entrée Q8RVX0), Triticum turgidum subsp. durum.
Masse (Da)
Position
Séquence
17475,0931
491-650
QQAGQWQRPGQGQPGYYPTSPQQPGQEQQSGQAQQSGQWQLVYY
PTSLQQPGQLQQPAQGQQPAQGQQSAQEQQPGQAQQSGQWQLVY
YPTSPQQPGQLQQPAQGQQGYYPTSPQQSGQGQQGYYPTSPQQSGQ
GQQGYYPTSPQQSGQGQQPGQGQQPR
10358,7091
206-302
YYPTSPQQSGQGQQPGQGQPGYYPISPQQSEQWQQPGQGQQPGQG
QQSGQGQQGQQPGQG QRPGQGQQGYYPTSLQQPGQ
GQQSGQGQPGYYPTSSR
7251,3485
303-371
QPGQWQQPGQGQQPGQGQQGQQPGQGQQPGQGQQGYYPTSLQQ
PGQGQQPGQGQPGYYPT SPQQPGQGK
6373,8451
380-439
YYPTSSQQSGQGQQPGQGQPGYYPTSPQQSGQGQQSGQAQQGYYPT
SPQQSGQGQQPGQR
6156,8017
693-748
HEQQPGQWLQPGQGQQGYYPTSSQQSGQGQQSGQGQQGYYPTSLW
QPGQGQQPGQR
4773,1948
147-190
QQDQQPGQGQQGYYPTSPQQ PGQGQQLGQGQPGYYPTSQQ PGQK
4524,0584
651-692
QGQQGYYPISPQQSGQGQQS GQGQQGYYPTSPQQSGQGQQ PR
4460,9819
449-490
QQSGQGQQPGQGQQSGQGQQ DQQPGQGQQAYYPTSSQQSGQR
4101,8710
109-146
YYPSVTSSQQGSYYPGQAFP QQSGQGQQPGQGQQPGQR
3166,6030
80-107
AGSFYPSETTPSQQLQQMIF WGIPALLR
2069,9311
749-766
QQGYDSPYHVSAEYQAAR
1718,8708
39-52
ELEAYQQVVDQQLR
1701,8918
53-68
DVSPGYRPITVSPGTR
1585,7426
191-205
QQAGQGQQSGQGQQR
1400,7137
772-784
AQQLAAQLPAMCR
1306,5692
22-33
EGEASGQLQCER
1302,6688
69-79
QYEQQPVVPSK
1048,5269
785-794
LEGSDALSTR
1042,4952
440-448
QSGYFPTSR
898,4489
372-379
QPGQGQQR
Les peptides à cystéines sont surlignés et les résidus cystéines sont représentés en rouge.
En ce qui concerne les SG-FPM, malgré leur abondance, leur caractérisation a reçu moins
d'attention que celle des SG-HPM, probablement en raison de leur complexité, de leur
hétérogénéité et de leur co-migration avec les gliadines en SDS-PAGE (D'Ovidio & Masci, 2004).
La recherche des séquences répertoriées dans la banque de données Uniprot indique des
masses principalement comprises entre 30 et 45 kDa et un point isoélectrique d’environ 8.48.7. Selon la classification sur la base de leurs mobilités en SDS-PAGE et leurs pI (Payne et al.,
167
1985) ces protéines correspondent majoritairement aux SG-FPM de type B, avec des masses
moléculaires apparentes entre 42 à 51 kDa, et de type C, constitué de sous-unités avec des
masses moléculaires apparentes de 30 à 40 kDa. Les résultats montrent que globalement, ces
SG-FPM possèdent 8 résidus cystéine et qu’ainsi comme les SG-HPM, les séquences des
protéines déduites de SG-FPM présentent également une distribution conservée de certains
résidus cystéine.
Les SG-FPM de type B (selon la mobilité en SDS-PAGE) sont les plus abondantes, même si
une plus faible proportion des séquences de type gliadine est également présente au sein de ce
groupe. Leur séquence est divisée en trois parties : un court domaine N-terminal, un long bloc
central répétitif et un domaine C-terminal qui se subdivise en trois, où l'on retrouve la plupart
des résidus cystéine. Ces SG-FPM possèdent 8 résidus cystéine, dont 6 seraient engagés dans
des ponts disulfures intramoléculaires et les deux autres dans des ponts disulfures
intermoléculaires (D'Ovidio & Masci, 2004).
Les séquences des SG-FPM typiques sont classées comme de type-s, -m et -i, selon le
premier acide aminé du polypeptide (serine, méthionine ou isoleucine, respectivement) de la
protéine mature. Le séquençage direct de la région N-terminale des protéines isolées et des
séquences déduites des gènes de plusieurs SG-FPM, montrent que les SG-FPM de types-m et de
type-s sont majoritaires (Shewry & Tatham, 1997). A partir de notre recherche sur les
séquences des SG-FPM répertoriées dans la banque de données UniProt, Il ressort que les SGFPM de type-m sont très majoritaires chez le blé tendre mais aussi chez le blé dur. Les analyses
réalisées en MALDI-TOF révèlent l’identification de SG-FPM de type-m et également de type-i
(cf. Tableau IV-5, page 191).
3.2. Analyse de sous-unités de gluténines par SDS-PAGE
Tout d’abord, nous avons réalisé un gel SDS-PAGE à partir d’extraits totaux réduits sans
alkylation pour les 3 variétés de blé dur retenues : Orlu (SG-HPM 1B20x ; 1B20y), Dakter (SGHPM 1B7x ; 1B8y) et Néfer (SG-HPM 1B13x ; 1B16y), de façon à caractériser et comparer la
position de migration des SG pour les grains immatures aux environs de 480°CJAF et à la
maturité (Figure IV-23).
On constate que la masse moléculaire (Mr) des protéines à partir des standards utilisés est
clairement surestimée, étant donné qu’il s’agit d’un gel en conditions réduites et que les Mr
168
Chapitre IV. B
vraies des SG-HPM sont comprises entre 75-85 kDa. Il est bien rapporté dans la littérature que
les analyses SDS-PAGE entrainent généralement une surestimation de la Mr des SG-HPM,
probablement dû à la structure de gluténines qui présentent un vaste domaine répété, ainsi
qu’aux molécules de SDS attachées à ces sous-unités protéiques (Bunce et al., 1985, Muccilli et
al., 2005, Gao et al., 2010). En effet, une fois calculé les RF (rapport de la distance parcourue
par la protéine sur la distance parcourue par le front de migration) des standards la réponse
obtenue n’est pas linéaire, car ces standards sont plus adaptés et permettent une estimation
plus précise quand ils sont utilisés en gel de gradient d’acrylamide.
A partir de la Figure IV-23 on distingue très clairement les SG-HPM de types x et de type y
pour les grains matures (Figure IV-23, pistes 2, 4, 6), toutefois à des stades immatures la
synthèse de ces protéines n’est pas fini et on constate que les bandes sont beaucoup moins
colorées (Figure IV-23, pistes 1, 3, 5). En ce qui concerne les SG-FPM, il n’y a pas beaucoup de
différence entre les variétés et entre les 2 stades de développement, à l’exception de Dakter
qui présente nettement une bande supplémentaire d’une taille approximative de 45 kDa
(Figure IV-23, piste 4).
1 2 3 4 5 6
SG-HPM
20x
7
20y
8
#-gliadine
!-amylase
SG-FPM
-!, "gliadine
13
16
200
150
120
100
85
70
60
50
40
30
25
20
15
Figure IV-23. SDS-PAGE en conditions réductrices des extraits protéiques totaux de grains de blé
dur immatures et mûrs (2, 4 et 6). Variété Orlu : 1 (473°CJAF), Dakter : 3 (474°CJAF) et Néfer : 5
(485°CJAF). Les masses moléculaires standards (Da) sont représentées à droite.
169
Une fois que le profil electrophorétique des extraits totaux a été caractérisé, nous nous
sommes intéressés aux extraits séquentiels. Dans cette étude, les analyses ont été portées en
particulier sur la variété Orlu sur des extraits protéiques séquentiels de grains immatures (327
et 473°CJAF) de façon à maximiser la présence de thiols réduits et donc un état de
polymérisation partiel.
Pour cela nous avons testé les trois agents alkylants les plus couramment utilisés : la 4-VP,
l’IAM et le NEM, en ordre décroissante de réactivité (rapporté par Hansen & Winther, 2009). On
constate que les charges portées par les molécules alkylantes influencent la migration des
bandes : par exemple la position de la SG-FPM de 50 kDa apparent a été clairement affectée
(Figure IV-24). Le NEM et l’IAM, alkylants neutres, marquent les SG-FPM sans entrainer de
ralentissement des bandes. La charge positive de la 4-VP entraîne une légère accélération des
bandes. De plus, l’alkylation à la 4-VP demande des températures et des pH élevés, ce qui
influence l’extraction séquentielle des protéines. En raison de sa faible réactivité, cet alkylant
s’est révélé incapable de prévenir l’oxydation des thiols des SG-FPM. Il semble que certaines
protéines de la fraction soluble dans le Tris-HCl précipitent et passent dans la fraction SDSsoluble (« Gluténines solubles ») (Figure IV-24). L’étape de précipitation et de lavages à
l’acétone afin d’enlever l’excès d'alkylant entraînerait aussi une perte de protéines qui seraient
probablement solubilisées dans l’acétone 80%.
170
8 0(
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aussi une coloration intense au dépôt, traduisant probablement la présence dans cet extrait de
polymères de grande taille à ces deux stades de développement.
Après réduction les oligomères et les polymères disparaissent et la coloration des SG-HPM
dans l’extrait SDS-soluble est plus intense. La coloration des bandes correspondant aux
gliadines et aux SG-FPM (40-50 kDa) est clairement saturée, les bandes se superposent et on
distingue nettement que deux grosses bandes (Figure IV-25B). Elles sont plus intenses dans les
extraits éthanoliques que dans les extraits SDS-solubles. Ces résultats montrent la participation
massive des SG-FPM dans des oligomères et polymères de gluténines.
172
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D’autres analyses électrophorétiques, cette fois sur des extraits protéiques totaux en
conditions non-réductrices, ont été réalisées en vue de promouvoir une dénaturation des
protéines plus importante et ainsi optimiser le marquage par le premier alkylant (A1) des
cystéines réduites. Pour ce faire, les protéines des échantillons immatures (327 et 473°CJAF)
ont été alkylées et extraites directement en présence de SDS 2% (cf. 2.3.3). Les profils
électrophorétiques des protéines alkylés au NEM et à l’IAM sont très similaires (Figure IV-26). A
473°CJAF la coloration des bandes est plus intense et on constate l’apparition des bandes de
masses comprises entre 70 et 85 kDa et d'oligomères entre 120 et 150 kDa.
327
I
N
Mr
1
2
473 °C JAF
I
N
3
4
Mr
200
150
120
100
85
70
60
50
1
2
40
30
25
20
Figure IV-26. SDS-PAGE en conditions non-réductrices des extraits totaux. Les extraits
protéiques (variété Orlu) ont été alkylés avec l’Iodoacétamide (I) et le N-éthyl-maléimide (N).
Les masses moléculaires standards (Da) sont représentées à droite. En rouge, les bandes
analysées au MALDI-TOF : à 200 kDa, 110 kDa et 45 kDa (SG-FPM 1, 2).
3.3. Efficacité des réactifs alkylants
Une expérience a été mise en place afin d’examiner par SE-HPLC l'efficacité d'alkylation des
deux réactifs utilisés comme premiers alkylants : l’IAM et le NEM. L’alkylation des thiols a été
réalisée avant de procéder à l’extraction séquentielle des protéines, comme précédemment
indiqué (item 2.3). Afin de marquer les thiols (SH) résiduels, les échantillons préalablement
alkylés à l’IAM ou au NEM ont été mis en contact pendant une heure avec une solution d’ATTO
174
Chapitre IV. B
0,8 mM, et ensuite les protéines ont été extraites séquentiellement et analysées par SE-HPLC
(item 2.4).
Les profils SE-HPLC fluorescents de chaque extrait sont présentés dans la Figure IV-27. Les
résultats montrent une efficacité de blocage de thiols plus importante pour les extraits alkylés
au NEM qu’à l’IAM, et cela pour tous les extraits (Figure IV-28). L’ajout de l’ATTO aux extraits
protéiques séquentiels après alkylation par l’IAM ou NEM a révélé que l’extrait Tris-HCl
présente environ 15% de fluorescence résiduelle, alors que l’extrait SDS-soluble présente
approximativement 10% et l’extrait EtOH quelque 5%. On doit pouvoir considérer que l’écart
est négligeable pour les extraits EtOH et SDS-solubles. Ces résultats indiquent que seulement
un faible pourcentage des groupements thiols disponibles n’a pas été alkylé au moment de la
première alkylation.
175
Extrait Tris-HCl
Fluorescence (unité arbritaire)
0.002
ATTO
IAM + ATTO
NEM + ATTO
0.0015
0.001
0.0005
0
8
10
12
14
16
Extrait EtOH
0.002
18
0.0015
0.001
0.0005
0
8
10
12
14
16
18
Extrait SDS-soluble
0.002
0.0015
0.001
0.0005
0
8
10
12
14
16
18
Temps de retention (min)
Figure IV-27. Exemple de chromatogrammes SE-HPLC en fluorescence des extraits séquentiels
de grains immatures à 473°CJAF (Ex. 532 nm, émission 553nm).
176
Chapitre IV. B
NEM
Fluorescence résiduelle (%)
40
IAM
30
20
10
0
Tris-HCl
EtOH
SDS-solubles
Figure IV-28. Fluorescence résiduelle des extraits séquentiels de grains immatures $%&&
(
°CJAF)
des variétés Dakter et Néfer. La fluorescence résiduelle est définie par le rapport d’aire totale
du chromatogramme d’échantillons alkylés au NEM ou à l’IAM et de l’aire totale du
chromatogramme d’échantillon alkylé à l’ATTO. Les barres verticales représentent les écartypes
(n=3).
En outre, il a été rapporté que les résidus cystéines peuvent être modifiés par des traces
d'acrylamide non polymérisée dans le gel, ce qui entraine la formation de Cys-S-!proprionamide (Cys-PAM, + 71 kDa) pendant l'électrophorèse (Brune, 1992, Patterson, 1994,
Sechi & Chait, 1998). Cette modification est généralement considérée comme une réaction
secondaire indésirable qui a pour effet d'augmenter la complexité de l'analyse des protéines
séparées par électrophorèse.
Dans cette étude nous avons examiné si des modifications telles que l’acrylamidation
(formation des Cys-PAM) ont lieu au cours de l’électrophorèse. Pour cela nous avons analysé en
MALDI-TOF/TOF des extraits protéiques alkylés (A1) non-réduits et réduits. Les résultats MALDITOF/TOF montrent que pour les extraits protéiques réduits, les résidus cystéines ont été
modifiés par l’acrylamide (Cys-PAM) (spectres présentés en Annexe 7), ce qui traduit la
présence des cystéines sous forme réduite (SH) au moment de la migration en gel et qui ont été
par conséquent modifiées par l’acrylamide. En revanche, les analyses des protéines alkylées et
extraites en conditions non-réductrices ont montré que l’acrylamidation des résidus cystéines
au cours de l'électrophorèse est totalement exclue, aucun résidu Cys-PAM n’ayant été détectés.
On peut donc considérer que l’alkylation des cystéines libres par le premier alkylant (IAM) est
quasi totale.
177
3.4. Analyse des protéines par MALDI-TOF/TOF
Nous nous sommes intéressés donc aux analyses des sous-unités de gluténines
monomériques (SG-FPM et SG-HPM) mais aussi d’oligomères présents dans les extraits
séquentiels et dans les extraits totaux. L’identification de protéines et des résidus cystéines a
été réalisée à partir de gel 1D SDS-PAGE en conditions non-réductrices, car cela nous permet de
déterminer le rôle des liaisons intramoléculaires dans le processus d’assemblage.
En s’appuyant sur le marquage des thiols protéiques à l’ATTO-maléimide, nous avons
démarré par l’analyse de bandes fluorescentes, ce qui traduit la présence de cystéines libres
marquées par l’ATTO. Toutefois après des analyses au MALDI-TOF l’utilisation de l’ATTO comme
agent alkylant a été rejetée du fait de l’absence de détection de peptides marqués à l’ATTO.
Des gels parallèles ont été alors réalisés, un avec des extraits alkylés à l’ATTO et d’autres avec
l’IAM et/ou NEM. Cela nous a permis d’identifier les bandes fluorescentes dans le premier gel
(ATTO) (Figure IV-29) et ensuite de découper les bandes à partir de gel IAM/NEM à retenir pour
les analyses de masse. Les résultats obtenus avec les deux couples d’alkylation : NEM–4VP et
IAM–4VP, respectivement 1er et 2nd alkylant, sont assez similaires, toutefois le taux
d’identification de résidus cystéines est supérieur avec le couple IAM-4VP.
178
Chapitre IV. B
Fluo
1
2
3
4
*
*
*
Coomassie
1
2
3
4
*
*
*
Figure IV-29. SDS-PAGE en conditions non-réductrices d’extrait éthanol soluble (EtOH). Les
extraits protéiques (variété Orlu à 473°CJAF) ont été alkylés avec l’ATTO. A gauche, détection
fluorescente des protéines marquées à l'ATTO et à droite, coloration au Bleu de Coomassie. Les
bandes des SG-FPM sont numérotées et (*) indiquent les bandes fluorescentes.
Les paramètres suivants ont été utilisés pour des recherches dans la base de données :
Viridiplantae (taxonomie), 10-75 ppm (précision de masse mono-isotopique), trypsine (protéase
utilisée), 1 miss cleavage (nombre de sites de protéolyses spécifiques non coupés),
carbamidométhylation (Cys-CAM), N-éthyl-maléimide (Cys-NEM), pyridyléthylation (Cys-PE)
(modifications fixes), propionamide (Cys-CAM) et oxydation du résidu méthionine
(modifications variables). Pour les analyses MS/MS des paramètres ont été ajoutés tels que la
tolérance de masse de 1.0 Da pour les ions précurseurs et une tolérance de 0.5 Da pour les ions
fragments. Quelques spectres des bandes analysées sont donnés comme exemple en annexe.
3.4.1. Identification des SG-FPM
Les résultats précédents (chapitre 4A), obtenus sur les extraits séquentiels analysés par SEHPLC et SDS-PAGE avec une double détection (UV et fluorescence), ont montré qu’à des stades
précoces (avant 600°CJAF) les SG-FPM (Mr 35-45 kDa) sont présentes dans tous les extraits. Il a
179
été également démontré que la bande SG-FPM 3 n’est pas fluorescente et que la fluorescence
est principalement attribuée aux trois autres bandes SG-FPM 1, SG-FPM 2 et SG-FPM 4,
essentiellement présentes dans l’extrait Tris-HCl et dans l’extrait EtOH, comme montré
également dans la Figure IV-29. Il est important de rappeler que la fluorescence indique la
présence des thiols libres marqués par l’agent alkylant fluorescent. Par ailleurs, on peut
observer des changements de la position des ces bandes selon l’alkylant employé, ce qui
indique la présence des cystéines marquées (Figure IV-24). A partir de ce constat, les bandes 1,
2, 3 et 4 des SG-FPM présentes dans les trois extraits (Tris-HCl, EtOH et SDS-soluble), ainsi que
les bandes 1 et 2 des SG-FPM des extraits totaux ont été analysées en vue d’évaluer si les sousunités présentes dans les différents extraits présentent les mêmes arrangements de cystéines
libres (SH) et de cystéines engagées dans des ponts disulfures (SS).
La détermination de la position des résidus cystéines est compliquée en raison d’une forte
présence de fragments de séquences dans les banques de données, et du fait du mélange
protéique obtenu par 1D SDS-PAGE. Afin de simplifier la compréhension et pouvoir comparer
les séquences des protéines identifiées, dans cette étude les positions des cystéines de SG-FPM
seront représentées selon le système de lettres proposé par Köhler et al. (1993). Les structures
des protéines identifiées, ainsi que les positions7 des cystéines à partir du premier acide aminé
dans le peptide signal, sont représentées dans la Figure IV-30. Les informations concernant les
protéines identifiées ainsi que toutes les séquences de peptides à cystéines sont données dans
le Tableau IV-5.
Un exemple de recherche sur Mascot donnant des informations concernant la protéine
majoritaire identifiée, ainsi que le numéro de référence UniProt, la couverture de séquence (%),
les peptides identifiés et la précision de masse isotopique est présenté enAnnexe 3.
7
Les positions de cystéines correspondent à la séquence primaire des protéines telles quelles présentées dans
Expasy et prennent en compte les vingt acides aminés du peptide signal, et donc ne correspondent pas à leur
position dans la protéine maturée.
180
Chapitre IV. B
II
257
364
368
263
271
Cy
II
144
136
Cd Ce
Cx*
205
Cf1
I
116
III
Cf2
143
65
S N
Cx*
II
Cc
108
Cb*
Cy
318
270
I
243
S N
Cd Ce
A2TN61
SG-FPM 4
type-m
314
Cf2
Cf1
235
Cc
66
B2Y2R4
SG-FPM 2
type-m
III
257
Cd Ce
Cb*
Cx*
II
249
I
229
S N
Cf1
256
237
221
C*+
Cy
Cf2
Cf2
III
253
Cd Ce
Q19MN3
SG-FPM 1
type-i
III
363
I
Cc
Cx*
313
256
Cf1
249
S N
229
Q9FEQ2
SG-FPM 1
type-i
C*+
237
221
Cc
Cy
Figure IV-30. Schéma représentant les structures des SG-FPM identifiées en MALDI-TOF. Les
cystéines sont désignées selon le système de lettres proposé par Köhler et al. (1993). Les
numéros indiquent leur position dans la structure primaire à partir du premier acide aminé du
peptide signal (S). En gris, le peptide signal (S) ainsi que les domaines N- et C-terminaux (I, II, III).
Les résidus (*) représentent les cystéines tenues pour former des ponts disulfures
intermoléculaires et (+) indique la cystéine supplémentaire signalée dans les SG-FPM de type-i
(D'Ovidio & Masci, 2004). Les codes à gauche correspondent aux numéros d’entrée des
protéines dans Expasy.
181
3.4.1.1.
Les « SG-FPM 1 »
Les bandes correspondant aux « SG-FPM 1 » observées dans l’extrait SDS-total (extraction
unique en tampon SDS) se repartissent dans les fractions éthanoliques et SDS-solubles. La
protéine majoritaire identifiée, dans tous les extraits et stades de développement, correspond à
une SG-FPM de type i (numéro de référence UniProt Q9FEQ2). Cette séquence possède 8
résidus cystéines, la moitié de résidus ont été identifiés dans les extraits analysés. Il s’agit des
peptides :
-
VFLQQQCIPVAMQR porteur de la Cys-229 (Cd). Son résidu cystéine apparaît seulement sous
forme engagée (Cys-PE) avec une masse de 1765,941 et 1781,904 Da, respectivement avec
le résidu méthionine non-oxydé et oxydé (+ 16 Da).
-
SQMLQQSICHVMQR porteur de la Cys-249 (Ce). Les pics de masses 1793,881 ; 1809,88 et
1825,975 Da correspondent au peptide avec le résidu cystéine sous forme engagée (Cys-PE),
respectivement avec les résidus méthionine non-oxydés, 1 résidu oxydé (+ 16 Da) et les 2
résidus oxydés (+ 32 Da).
-
QCCQQLR porteur des Cys-256 et 257 (Cf1 et Cf2). Le pic de masse 1040,517 Da,
correspondant au peptide avec une des cystéines sous forme réduite et l’autre engagée (1
Cys-CAM et 1 Cys-PE) et le pic 1088,549 Da correspondant aux deux résidus cystéines sous
forme engagés (2 Cys-PE) ont été identifiés. Les analyses réalisées par MS/MS du peptide de
masse 1040,517 Da (QCCQQLR) ont clairement montré que la Cys-256 (Cf1) est
pyridyléthylée (Cys-PE), alors que la Cys-257 (Cf2) est carbamidométhylée (CAM) (Annexe 4).
Le résidu Cys-257 (Cf2) peut être présent à la fois sous forme engagée (Cys-PE) et réduite
(Cys-CAM), puisque la séquence du peptide de masse 1088,549 Da (avec 2 Cys-PE) a été
aussi validée par MS/MS.
Des analyses réalisées sur les extraits protéiques totaux à 327 et 473°CJAF, ont révélé pour la
bande « SG-FPM 1 » une deuxième protéine majoritaire, la Q19MN3 (numéro de référence
UniProt). Les différences principales sont que la Q19MN3 possède deux substitutions en
position 276 et 344, une insertion en position 296 et une suppression de 17 résidus d'acides
aminés en position 369, ce qui modifie les positions et séquences des peptides porteurs des
Cys-314 et Cys-364. Dans les extraits totaux un peptide supplémentaire a été identifié : le
peptide MCSVNVP porteur de la Cys-364 (Cy). Le pic de masse 806,317 Da correspond au résidu
182
Chapitre IV. B
cystéine sous forme réduite (Cys-CAM) et le pic 854,317 Da présente le résidu cystéine sous
forme engagée (Cys-PE).
En ce qui concerne le nombre de résidus cystéines identifiés et leur statut (SH ou SS) aux
stades de développement considérés (327 et 473°CJAF), les résultats sont équivalents. Parmi les
différents extraits analysés, la seule différence est le résidu supplémentaire (Cy) identifié dans
l’extrait total. Globalement sur les cinq résidus cystéines identifiés, trois se présentent
seulement alkylés au 2nd alkylant (Cys-PE), donc strictement sous forme engagée. C’est le cas
des Cys-229 (Cd), Cys-249 (Ce) et Cys-256 (Cf1). En revanche, les résidus Cys-257 (Cf2) et Cys-364
(Cy) se présentaient à la fois sous forme réduite (Cys-CAM) et engagée (Cys-PE). Ce résultat
suggère que le processus de conformation (folding) impliquant formation du pont disulfure
entre les résidus Cf2 et Cy (cf. Figure IV-30) ne serait pas encore achevé à ce stade de
développement du grain.
3.4.1.2.
Les « SG-FPM 2 »
Le deuxième groupe, les « SG-FPM 2 », a été analysé dans tous les extraits (Tris-HCl, EtOH,
SDS-soluble et SDS-total). Pour tous les extraits la protéine majoritaire identifiée correspond à
la séquence B2Y2R4 (numéro de référence UniProt). Il s’agit d’une SG-FPM de type-m.
Globalement, trois peptides porteurs de cystéines, ce qui représente un total de 5 résidus
cystéines, ont été identifiés. Les peptides identifiés sont :
-
Le peptide VFLQQQCSPVAMPQSLAR porteur de la Cys-243 (Cd). On a détecté le pic
correspondant à la cystéine sous forme réduite : 2060,0184 Da (Cys-CAM) et sous forme
engagée : (Cys-PE) 2108,0468 et 2124,0388 Da, respectivement avec le résidu méthionine
non-oxydé et oxydée (+ 16 Da). On constate que ce résidu cystéine correspond à la Cys-229
(Cd) de la SG-FPM 1 (Q19MN3 ou Q9FEQ2). En effet, les séquences B2Y2R4 et Q9FEQ2
diffèrent par quelques mutations, notamment une substitution Cys-Ser (SLAR-CLAR).
-
Le peptide SQMLQQSSCHVMQQQCCQQLPQIPQQSR porteur des Cys-263 (Ce), Cys-270 (Cf1)
et Cys-271 (Cf2). Seul le pic de masse 3587,80 Da correspondant au peptide avec les trois
cystéines sous forme engagées (3 Cys-PE) a été identifié.
183
-
Le peptide TLPTMCNVNVPLYR porteur de la Cys-368 (Cy). Le pic correspondant à la cystéine
sous forme réduite : 1677,8545 Da (Cys-CAM) et sous forme engagée : (Cys-PE) 1725,8797
et 1741,8604 Da, respectivement avec le résidu méthionine non-oxydé et oxydée (+ 16 Da).
Deux de ces résidus cystéines (Cd et Cy) ont été détectés à la fois sous forme réduite (Cys-
CAM) et engagée (Cys-PE). Cette coexistence de cystéines réduites et engagées est présente
aussi bien à 327 qu'à 473°CJAF. Les analyses montrent que lorsque cette SG-FPM 2 est extraite
avec du Tris-HCl (fraction albumines/globulines) ou directement dans le SDS 2% (extrait total),
les cystéines Cd et Cy se trouvent marquées par le premier ou le second alkylant, alors que dans
le cas où cette protéine est soluble dans l’éthanol 70% et après dans le SDS 2%, seul le résidu Cd
présente le double marquage, le Cy n’étant pour sa part marqué que par le second alkylant,
donc engagé dans une liaison disulfure. La présence d'une même protéine dans différents
extraits et avec un statut différent des résidus cystéines doit-il être reliée à l'évolution de la
conformation de la protéine accompagnant l'oligomérisation et la polymérisation.
3.4.1.3.
Les « SG-FPM 3 »
La bande « SG-FPM 3 », présente seulement dans les extraits éthanoliques et SDS-solubles, a
été identifiée comme étant une -gliadine. La protéine majoritaire identifiée correspond à la
séquence de la B8XU43 (numéro de référence UniProt) (Tableau IV-5). Deux résidus cystéines
alkylés au 2nd alkylant (Cys-PE) ont été identifiés, il s’agit du peptide de masse 2786,349 Da :
TLPNMCNVYVRTDCSTSTHHLPA, avec 1 missed cleavage et oxydation du résidu méthionine.
Ce résultat est à rapprocher de celui obtenu par le marquage à l’ATTO qui montre que cette
bande n’est pas fluorescente (Figure IV-29). On peut en conclure que cette protéine possède 8
cystéines engagées dans des liaisons disulfures intramoléculaires d'où l’absence de résidu
cystéine libre et donc de fluorescence.
3.4.1.4.
Les « SG-FPM 4 »
Pour la bande « SG-FPM 4 », présente dans les extraits séquentiels Tris-HCl, EtOH et SDSsolubles, une nouvelle séquence de numéro de référence A2TN61 a été identifiée. Il s’agit d’une
SG-FPM de type m. Six résidus cystéines ont été identifiés sur quatre peptides :
-
Le peptide VFLQQQCSPVAMPQSLAR porteur de la Cys-116 (Cd). Les pics identifiés
correspondent à la cystéine sous forme réduite : 2060,0210 Da (Cys-CAM) et sous forme
184
Chapitre IV. B
engagée : 2108,0514 et 2124,0325 Da (Cys-PE), respectivement avec le résidu méthionine
non-oxydé et oxydée (+ 16 Da).
-
Le peptide SQMLWQSSCHVMQQQCCR porteur des Cys-136 (Ce), Cys-143 (Cf1) et Cys-144
(Cf2). Le pic de masse 2449,010 Da correspond au peptide avec une des cystéines sous
forme réduite et deux cystéines sous forme engagées (1 Cys-CAM et 2 Cys-PE). Le pic
2498,010 Da présente les trois résidus cystéines sous forme engagés (Cys-PE).
-
Le peptide QLGQCSFQQPQQQQLGQWPQQQQVPQGTLLQPHQIAQLEVMTSIALR porteur de la
Cys-205 (Cx*). Ce peptide a été identifié par mode linéaire et uniquement avec son résidu
cystéine sous forme réduite. Il s’agit des pics de masse 5422,90 et 5438,80 Da, ce dernier
correspond au résidu méthionine oxydé.
-
Le peptide TLPTMCSVNVPVYGTTTIVPFGVGTR porteur de la Cys-253 (Cy). Son résidu cystéine
apparaît seulement sous forme engagée (Cys-PE) avec une masse de 2815,3358 et
2831,3293 Da, ce dernier correspond au résidu méthionine oxydé.
Ainsi comme montré pour la SG-FPM 2, il ressort que lorsque la SG-FPM 4 est extraite dans
Tris-HCl, le résidu Cys-116 (Cd) peut exister sous forme réduite et engagée. De même, pour un
des résidus Cys du peptide SQMLWQSSCHVMQQQCCR, néanmoins il n’a pas été possible de
confirmer sa séquence par MS/MS, donc nous ne sommes pas en mesure de dire quel résidu
cystéine, parmi les trois résidus, a présenté ce double marquage. Du fait que la Cys-116 (Cd) est
donnée pour être partie prenante dans un pont disulfure intramoléculaire avec la Cys-136 (Ce),
on peut supposer que ce dernier résidu soit celui identifié comme étant marqué au 1er alkylant
(Cys-CAM). Toutefois, dans les SG-FPM 1 et 2 les résidus Ce et Cf1 ont été dans tous les cas
identifiés uniquement sous forme engagée et le résidu Cf2 dans la SG-FPM 1 a été identifié à la
fois sous forme réduite et engagée. Les séquences environnantes étant très conservées, on
peut donc formuler l’hypothèse que le statut des résidus Ce, Cf1 et Cf2 est le même dans les SGFPM 1, 2 et 4.
Quand cette protéine est extraite séquentiellement dans EtOH 70% et après dans SDS 2%,
les résidus cystéines des deux extraits apparaissent marqués uniquement par le 2nd alkylant
(Cys-PE), à l’exception de la Cys-205 (Cx*) qui dans tous les cas se présente sous forme réduite.
Au regard de la littérature et en tenant compte du fait qu’il s’agit d’extraits non réduits, ce
185
dernier résultat est tout à fait cohérent puisque le résidu Cx* est supposé former un pont
disulfure intermoléculaire.
Un schéma récapitulatif de l’état d’oxydoréduction de résidus cystéine de toutes les SG-FPM
analysées est présenté dans la Figure IV-31. En résumé, les résidus Cf2 et Cy de la SG-FPM 1
apparaissent toujours doublement marqués et les résidus Cd, Ce, Cf1 toujours sous forme
engagée, indépendamment des solvants utilisés. Pour la SG-FPM 2, le résidu Cy apparaît
doublement marqué quand extrait uniquement au SDS 2% (SDS-total) et dans Tris-HCl, ce
même résidu se trouve uniquement sous forme engagée quand extrait dans EtOH et après dans
SDS (SDS-soluble). Le résidu Cd de la SG-FPM 2 est toujours doublement marqué et les résidus
Ce, Cf1 et Cf2 sont toujours sous forme engagée, indépendamment des solvants utilisés. Pour la
SG-FPM 4, les résidus Cd et Cf2 (si l’on fait l’hypothèse d’homologie entre les SG-FPM) sont
doublement marqués dans les fractions Tris-HCl ou SDS-total, sinon dans les fractions EtOH ou
SDS-soluble ces résidus se trouvent uniquement sous forme engagée. Le résidu Cx* apparaît
toujours sous forme réduite et les résidus Ce et Cf1 toujours sous forme engagée.
186
Chapitre IV. B
Cf1
I
II
363
III
257
249
S N
229
Cx*
313
237
221
Q9FEQ2
Extrait EtOH
SDS-soluble
C*+
Cc
256
SG-FPM 1
Cd Ce Cf2/Cf2
C*+
Cx*
III
249
364
II
257
I
229
S N
314
Cf1
256
221
Q19MN3
Extrait SDS-total
237
Cc
Cy
Cd Ce Cf2/Cf2
I
II
Cd/Cd Ce
Cf2
Cy
205
Cx*
143
I
II
144
136
III
253
108
Cf1
S N
116
Extrait Tris-HCl
SDS-total
65
A2TN61
Cc
Cd/Cd Ce Cf2/Cf2
Cd
Cy
Cf1
205
II
136
Ce
144
143
Cx*
I
S N
116
Extrait EtOH
SDS-soluble
65
A2TN61
Cc
108
Cb*
Cf2
III
III
253
263
Cd/Cd Ce
Cb*
368
318
II
368
270
I
S N
SG-FPM 4
Cx*
271
235
Cf1
243
Extrait EtOH
SDS-soluble
Cy/Cy
Cf2
Cc
66
B2Y2R4
III
271
263
S N
Cb*
Cx*
318
Cf1
243
Extrait Tris-HCl
SDS-total
66
B2Y2R4
Cc
235
Cb*
270
SG-FPM 2
Cy/Cy
Cy
Figure IV-31. Répresentation schématique des résidus cystéines identifiés. En vert, cystéines
marquées au 1er alkylant (sous forme réduite), en rouge, cystéines marquées au 2nd alkylant
(sous forme disulfure) et en gris, cystéines non identifiées par MALDI-TOF/TOF.
187
3.4.2. Analyse des oligomères de gluténines de masses moléculaires apparentes 200,
110 et 85 kDa
Des oligomères présents dans les extraits séquentiels (EtOH et SDS 2%) mais aussi dans
l’extrait total ont été analysés et cela pour les deux dates étudiées (327 et 473°CJAF). Il s’agit
des bandes migrant approximativement à 200 et 110 kDa des fractions SDS (soluble et total) et
à 85 kDa de la fraction éthanolique.
L’analyse MALDI-TOF/TOF en mode réflecteur des bandes de HPM (200 et 110 kDa) des
fractions SDS (soluble et total) a révélé la présence des deux peptides à cystéines (Cys-31 et
Cys-783) de la SG-HPM 1Bx20 (cf. Tableau IV-4) à la fois sous forme réduite (Cys-CAM) et
engagée (Cys-PE). Cette coexistence de cystéines réduites et engagées est présente à 327 aussi
bien qu'à 473°CJAF.
La séquence de la SG-HPM 1By20 n’est pas répertoriée dans la banque des données.
Cependant, une séquence de SG-HPM de type y a été identifiée significativement (19% de
couverture de séquence) à partir des peptides analysés. Il s’agit de la 1By15 (Mr 77334, numéro
d’entrée UniProt B8PSA6) qui possède sept résidus cystéines, dont 6 résidus (Cys-31, Cys-43,
Cys-65-66, Cys-76 et Cys-705) identifiés par mode réflecteur et 1 résidu (Cys-603) présent dans
un peptide de masse élevée (supérieure à 12000 Da) qui n’a pas pu être identifié en mode
linéaire (voir Tableau IV-5). Ces résidus cystéines font partie de zones bien conservées dans les
séquences des SG-HPM. La séquence de la 1By15 est très similaire aux séquences des protéines
présentant une composition en acide aminé proche de la 1By20, comme la 1By8 et de la 1By16
(voir alignement en Annexe 2). Parmi les peptides identifiés, les peptides porteurs de cystéines
sont les suivants :
-
Le peptide VQQPATQLPIMCR porteur de la Cys-705. Son résidu cystéine apparaît seulement
sous forme réduite (Cys-CAM) avec une masse de 1541,7927 Da.
-
le peptide QLQCER (881,4298 Da) porteur de la Cys-31, le peptide ELQESSLEACR (1369,6416
Da) porteur de la Cys-43, le peptide CCQQLR (960,4542 Da) porteur des Cys-65-66 et le
peptide CRPVAVSQVVR (1318,7412) porteur de la Cys-76. Seuls les pics correspondant aux
peptides avec ses résidus cystéine sous forme engagée (Cys-PE) ont été identifiés.
188
Chapitre IV. B
L’analyse de l’oligomère de gluténine de masse moléculaire apparente de 200 kDa, a révélé
la présence conjointe des SG-HPM 1Bx20 (86 kDa), 1By20 (77 kDa) et d’une SG-FPM 2 (45 kDa)
(Figure IV-32). Ces trois SG présentaient au moins une des cystéines marquées avec le premier
alkylant (Cys-CAM). Dans le cas de la sous-unité 1Bx20 les deux résidus cystéines sont marqués
avec le 1er et le 2nd alkylant. L’insertion de cette SG-HPM dans les oligomères semble se faire
indifféremment avec l’une ou l’autre de ses cystéines. Il est intéressant de noter que la seule
cystéine de la 1By20 identifiée sous forme réduite est la Cys-705, toujours marquée par le 1er
alkylant et cela aux deux stades de développement (327 et 473°CJAF) et pour les deux types
d’extraits analysés (SDS-soluble et SDS-total). Étant donné que cette cystéine est tenue pour
s’engager dans une liaison disulfure intermoléculaire (Shani et al., 1992, Shani et al., 1994), on
pourrait donc imaginer que ce pont disulfure se forme a un stade ultérieur de polymérisation.
Le double marquage de la cystéine Cys-243 (Cd) de la SG-FPM 2 avec l’un ou l’autre des
alkylants est surprenant, cette cystéine étant considérée comme formant un pont disulfure
intramoléculaire avec la Cys-263 (Ce). Toutefois, le double marquage de cette cystéine a aussi
été trouvé lors de l'analyse de la SG-FPM2 isolée. Il a aussi été mis en évidence sur la cystéine
homologue Cd (Cys-116) de la SG-FPM 4 isolée. On peut donc penser que cette cystéine des SGFPM 2 et 4 n'est engagée que tardivement dans un pont disulfure intramoléculaire.
L’analyse par MALDI-TOF/TOF de la bande migrant à 110 kDa indique la présence de
peptides provenant de la 1Bx20, de la 1By20 et de la SG-FPM 2. En tenant compte des masses
moléculaires des protéines identifiées, cette bande pourrait être constituée d’un mélange de
dimères de 110 kDa, constitué d’une 1Bx20 ou d’une 1By20 associées à une SG-FPM 2, ainsi que
de dimères des SG-FPM. L’analyse de ce mélange de dimères semble confirmer le
résultat précédent : dans les oligomères de gluténines, le résidu Cd de SG-FPM ainsi que les
deux résidus cystéines de la 1Bx20 se trouvent présents sous forme réduite ou liée par une
liaison disulfure, c’est à dire alkylés par le premier (Cys-CAM) et le 2nd alkylant (Cys-PE).
La bande de 85 kDa apparent de l’extrait éthanolique, présente seulement à 473°CJAF, a
aussi été analysée. Les résultats révèlent la présence d’un mélange de peptides des SG-FPM de
type 1, 2 et 4 (respectivement Q9FEQ2, B2Y2R4 et A2TN61). Le même résultat a été obtenu
concernant le peptide porteur du résidu Cd (VFLQQQCSPVAMPQSLAR) des SG-FPM 2 et 4, ce
résidu apparaît sous forme réduite et engagée. Les autres peptides se trouvent marqués
189
seulement au 2nd alkylant (Cys-PE). En outre, cet oligomère ne contient pas de SG-HPM. Le
résidu Cd des SG-FPM 2 et 4 serait impliqué que tardivement dans un pont disulfure
intramoléculaire.
1Bx20 (Q8RVX0)
C
31
783
S N
SH/SS
SH/SS
1By20 (B8PSA6)
C
SH
SS
270
II
Cd /Cd Ce Cf2
SH/SS SS SS
III
368
SG-FPM 2 (B2Y2R4)
I
243
S N
Cx*
318
Cc
271
66
Cb*
SS
Cf1
263
SS SS SS
235
65
66
43
SS
705
N
603
S
Cy
SS
Figure IV-32. Analyse de la composition fine d’un oligomère de gluténine de 200 kDa. En vert,
cystéines marquées avec le premier alkylant (sous forme SH), en rouge, cystéines marquées
avec le second alkylant (sous forme disulfure), en gris cystéines non identifiées par MALDITOF/TOF.
190
Numéro
d’entrée
Q9FEQ2
Q19MN3
Protéine
identifiée
SG-FPM
type-i
Triticum
turgidum
subsp.
durum
SG-FPM
type-i
Triticum
aestivum
42823
MM
(Da)
44567
Cys-237
Cys-256257
Cys-313
Cys-363
223-236
237-240
241-254
255-261
274-343
362-387
CLAR
SQMLQQSICHVMQR
QCCQQLR
AIVYSIILQQQQQQQQQQQQQQQGQSIIQYQQQPPQQLGQCV
SQPQQQLQQQLGQQPQQQQLAHGTFLQPR
MCSVNVPLYETTTSVPLGVGTGVGAY
Cys-229
Cys-237
Cys-256257
Cys-314
Cys-364
223-236
237-240
241-254
255-261
274-358
363-369
CLAR
SQMLQQSICHVMQR
QCCQQLR
AIIYSIILQQQQQQQQQQQQQQQGQSIIQYQQQPPQQLGQCVS
QPQQQLQQQLGQQPQQQQLAHGTFLQPHQIAQLEVMTSIALR
MCSVNVP
Cys-249
Cys-221
21-222
ISQQQQPPPFSQQQQPPFSQQQQPPFSQQQQSPFSQQQQQPP
FSQQQQPPFSQQPLISQQQQLPFSQQQQPQFSQQQQPPYSQQ
QQPPYSQQQQPPFSQQQQPPFSQQQQPSFSQQQQQPPFTQQ
QQPPFSQQSPISQQQQQQQQQQQQPFTQQQQPPFSQQPPISQ
QQQPPFSQQQQPPFSQQQQIPVIHPSVLQQLNPCK
VFLQQQCIPVAMQR
Cys-249
Cys-229
21-222
ISQQQQPPPFSQQQQPPFSQQQQPPFSQQQQSPFSQQQQQPP
FSQQQQPPFSQQPLISQQQQLPFSQQQQPQFSQQQQPPYSQQ
QQPPYSQQQQPPFSQQQQPPFSQQQQPSFSQQQQQPPFTQQ
QQPPFSQQSPISQQQQQQQQQQQQPFTQQQQPPFSQQPPISQ
QQQPPFSQQQQPPFSQQQQIPVIHPSVLQQLNPCK
VFLQQQCIPVAMQR
Résidu
Cys
Cys-221
Position*
Peptide trypsique identifié par MS
+
1765,924
519.2708
23748,38
2672,295
519.2708
1765,924
a
1088,523
ab
1040,476
a
9892,034
b
1793,861
b
a
b
a
a
ab
1088,523
1040,476
a
8215,142
b
1793,861
b
a
b
MH
théorique
a
23748,38
1088,513
1040,50
–
1793,881
–
1765,941
–
–
1088,513
1040,50
–
1793,881
–
1765,941
+
MH
expérim.
–
oui
oui
–
–
–
–
–
–
oui
oui
–
–
–
–
–
MS/MS
191
Tableau IV-5 (suite). Identification de protéines par analyse MALDI-TOF et confirmation de séquence de peptides à cystéines par MALDI-TOF/TOF
(MS/MS).
b
806,354
806,3017
–
854,390
854,317
–
a
b
c
* Les positions des peptides et des résidus Cys dans la séquence tiennent compte du peptide signal. Cys-CAM ; Cys-PE ; résidu méthionine oxydé ; (–) non-identifié
EtOH
SDS-sol.
SDS-tot.
EtOH
SDS-sol.
SDS-tot.
Extrait
Tableau IV-5. Identification de protéines par analyse MALDI-TOF et confirmation de séquence de peptides à cystéines par MALDI-TOF/TOF
(MS/MS).
Chapitre IV. B
Numéro
d’entrée
B2Y2R4
B8XU43
Protéine
identifiée
SG-FPM
type-m
Triticum
aestivum
-gliadine
Triticum
monococc.
31953
MM
(Da)
44540
Cys-263270-271
Cys-318
Cys-368
237-254
255-282
288-362
363-376
SQMLQQSSCHVMQQQCCQQLPQIPQQSR
AIVYSIILQEQQQVQGSIQTQQQQPQQLGQCVSQPQQQSQQQLG
QQPQQQQLAQGTFLQP HQIAQLEVMTSIALR
TLPTMCNVNVPLYR
182-200
201-251
SDCQVMQQQCCQQLAQIPR
QLQCTAIHSVVHAIIMQQEQQGIQILRPLFQLVQGQGIIQPQQPAQ
YEVIR
TLPNMCNVYVRTDCSTSTHHLPA (miss cleavage)
192
257-279
Cys-165
159-181
Cys-184191-192
Cys-204
Cys-157
21-158
IQVDPSGQVQWPQQQPFPQPQPFSQQPQQAFPQPQQTFPLQPH
QVFPQPQQPQQQFPQPQQPQQPFPQPQQPQLPFPQQPFPQPQ
QPQQPFPQSQQPQQPFL QPQQQFPQPQQPQQSSPQQQ
QPLIQPYLQQQMNPCK
NYLLQQCNPVSLVSSLVSMILPR
Cys-243
21-236
MENSHIPGLERPSQQQPLPPQQTLSHHHQQQPIQQQPHQFPQQQ
PCSQQQQQPPLSQQQQPPFSQQQQPPFSQQQQPVLPQQPSFSQ
QQLPPFSQQQQPPFSQQQQPVLPQQPSFSQQQLPPFSQQLPPFSQ
QQQPVLPQQPPFSQQQLPPFSQQLPPFSQQQQPVLPQQPPFSQQ
QQQQILPQQPPFSQQQHPVLLQQQIPFVHPSILQQLNPCK
VFLQQQCSPVAMQSLAR
Résidu
Cys
Cys-66235
position
8518,338
b
5922,179
b
2522,156
b
2679,436
b
b
677,845
1725,882
b
15990,60
a
a
b
2060,042
2108,078
b
3587,659
a
+
MH
théorique
a
24808,11
c
–
–
–
1677,855
1725,969
–
–
2060,059
2108,184
3587,80
+
MH
expérim.
–
–
–
–
oui
oui
–
–
oui
oui
–
–
MS/MS
Cys-2622770,290
2786,35
–
270
a
b
c
* Les positions des peptides et des résidus Cys dans la séquence tiennent compte du peptide signal. Cys-CAM ; Cys-PE ; résidu méthionine oxydé ; (–) non-identifié
EtOH
SDS-sol.
Tris-HCl
EtOH
SDS-sol.
SDS-tot.
Extrait
86054
77334
Q8RVX0
B8PSA6
SG-HPM
type-x
Triticum
turgidum
subsp.
Durum
SG-HPM
type-y
Triticum
aestivum
MM
(Da)
31292
Numéro
d’entrée
A2TN61
Protéine
identifiée
SG-FPM
type-m
Triticum
turgidum
subsp.
Polonicum
694-706
193
+
a
a
1541,793
12250,59
1318,741
b
960,454
b
1369,642
b
881,430
b
b
1457,735
1505,772
a
1363,591
b
1411,627
a
b
2060,042
2108,078
b
2498,081
ab
2449,001
a
5422,754
ac
5438,744
a
2767,416
a
MH
théorique
a
10123,88
1541,794
–
1318,753
960,467
1369,660
881,438
2060,145
2108,051
2498,010
2449,968
5422,90
5438,8
c
2815,34
c
2831.33
1457,755
1505,795
1363,563
1411,640
+
MH
expérim.
–
oui
–
oui
–
oui
–
oui
oui
–
–
–
–
oui
oui
oui
oui
oui
oui
–
MS/MS
Cys-CAM ; Cys-PE ; résidu méthionine oxydé ; (–) non-identifié
Cys-705
576-690
QGQQGYYPTSLQQPGQGQQPGQGQQGHCPTSPQQTGQAQQP
GQGQQIGQVQQPGQGQQGYYPISLQQSGQGQQSGQGQQSGQ
GHQLGQGQQSGQEQQGYDNPYHVNTEQQTASPK
VQQPATQLPIMCR
c
Cys-603
76-86
CRPVAVSQVVR
b
Cys-6566
Cys-76
65-70
CCQQLR
a
Cys-43
34-44
ELQESSLEACR
Cys-31
28-33
Cys-783
Cys-31
QLQCER
772-784
248-273
AQQLAAQLPAMCR
201-247
QLGQCSFQQPQQQQLGQWPQQQQVPQGTLLQPHQIAQLEV
MTSIALR
TLPTMCSVNVPVYGTTTIVPFGVGTR
22-33
Cys-253
128-145
SQMLWQSSCHVMQQQCCR
EGEASGQLQCER
Cys-136143-144
Cys-205
110-127
Cys-116
21-109
METSHIPSLEKPLQQQPLPLQQILWYQQQQPIQQQPQPFPQQPP
CSQQQQPPLSQQQQPPFSQHQQPVLPQQQIPSVQPSIL
QQLNPCK
VFLQQQCSPVAMPQSLAR
Résidu
Cys
Cys-65108
position
* Les positions des peptides et des résidus Cys dans la séquence tiennent compte du peptide signal.
SDS-sol.
SDS-tot.
SDS-sol.
SDS-tot.
Tris-HCl
EtOH
SDS-sol.
Extrait
Tableau IV-5 (suite). Identification de protéines par analyse MALDI-TOF et confirmation de séquence de peptides à cystéines par MALDI-TOF/TOF
(MS/MS).
Chapitre IV. B
4. Discussion
La mise en œuvre du protocole retenu s’est révélée délicate. L’ATTO envisagé au départ
comme marqueur des SH en MS a dû être écarté, aucun peptide marqué n’ayant été détecté en
MALDI-TOF/TOF probablement du fait de son caractère anionique. Son remplacement par la 4VP a été envisagé puis abandonné, car la 4-VP s’est révélée incapable de prévenir l’oxydation
des thiols des SG-FPM du fait de sa faible réactivité. Un alkylant très réactif, le NEM, a été
employé pour les analyses MALDI-TOF/TOF. Malgré son efficacité et son caractère neutre, le
taux d’identification en masse a été significativement plus faible qu'avec l’IAM et la 4-VP. En
effet, même si l’alkylation à la 4-VP est visiblement moins efficace que celle des autres réactifs,
on obtient de très bons résultats pour l'analyse par spectrométrie de masse, car la cystéine
pyridyléthylée (Cys-PE) est basique et peut conférer une charge positive supplémentaire aux
peptides modifiés (Moritz et al., 1996). Finalement, l’IAM et la 4-VP ont été retenus comme
respectivement premier et second alkylants. L’alkylation à l’ATTO, en indiquant la présence des
résidus cystéines sous forme réduite dans les protéines séparées par électrophorèse, nous a
cependant permis de sélectionner les bandes fluorescentes qui ont été analysées par
spectroscopie de masse.
En raison du faible nombre de résidus Lysine (K) et Arginine (R) présents dans les séquences
des SG-FPM, les spectres MALDI de peptides trypsiques ont montré un faible nombre de pics
dans la gamme de m/z 800-3500 Da. De ce fait, et de façon systématique certains peptides à
cystéines qui possèdent des masses supérieures à 5000 Da n’ont pas été identifiés. Il s’agit des
peptides qui portent les résidus Cc et C*+ de la SG-FPM 1 et les résidus Cb* et Cc des SG-FPM 2 et
4, selon le schéma récapitulatif présenté dans la Figure IV-31. En contrepartie, le peptide de
masse 5422 Da qui porte le résidu Cx* de la SG-FPM 4 a pu être identifié par mode linéaire.
Le manque de sites spécifiques de protéolyse, associé au nombre relativement faible de
séquences de SG-FPM dans la base de données et au mélange protéique obtenu par
électrophorèse 1-D, a empêché dans certains cas, l'identification de la protéine par l'approche
PMF avec un score significatif. L’identification des protéines a nécessité alors une analyse des
peptides par spectrométrie de masse en tandem (MS/MS).
La confirmation par MS/MS des peptides porteurs de cystéines, ainsi que les protéines
auxquelles ils appartiennent sont présentées dans le Tableau IV-5. La confirmation par MS/MS
194
Chapitre IV. B
de la totalité des séquences des peptides identifiés n’a pas été possible, surtout pour les
peptides de faible masse avec 5 ou 6 acides aminés (800-1000 Da). Il se trouve que pour
certains pics présentant une faible résolution, l’isolement du parent a été difficile et par
conséquent la fragmentation n’a pas été probante.
Un résultat inattendu de ce travail est relatif à l’état d’oxydoréduction et donc
d’appariement des cystéines des SG-FPM (cf. Figure IV-31). Plusieurs résidus cystéines se
trouvent conjointement alkylés par le premier et par le second agent alkylant. Les analyses
montrent que lorsque ces SG-FPM sont solubilisées dans du Tris-HCl ou directement dans le
SDS 2%, le résidu Cy des SG-FPM 1 et 2 se trouve marqué par le 1er ou le 2nd alkylant. Alors que
dans le cas où cette protéine est extraite avec l’éthanol 70% et après SDS 2%, elle n’est
marquée que par le 2nd alkylant, donc engagée dans une liaison disulfure. Le même résultat a
été obtenu concernant le résidu Cd de la SG-FPM 4. Le double marquage de la Cd avec le 1er ou
le 2nd alkylant est détecté uniquement dans les fractions Tris-HCl et SDS-total.
D’une manière systématique les SG-FPM provenant des extraits Tris-HCl ou d’une extraction
unique dans le SDS 2% ont présenté la possibilité d’avoir deux ponts intramoléculaires ouverts.
C’est à dire que deux des résidus cystéines qui font normalement partie de deux ponts distincts
(Cd et Cy) ont été détectés à la fois sous forme réduite et engagée. Pour les SG-FPM éthanol et
SDS solubles, parmi les résidus identifiés, uniquement un présente ce caractère de double
marquage, donc on pourrait imaginer que dans ces extraits seulement un pont intramoléculaire
soit ouvert.
En comparant les trois séquences des différentes SG-FPM (1, 2 et 4) et sans tenir compte des
résidus supplémentaires (C*+) signalés dans les SG-FPM de type-i (SG-FPM 1) qui dans ce travail
n’ont pas été détectées, on peut proposer un schéma global pour la totalité des extraits
analysés de l’état d’oxydoréduction de résidus cystéine pour une SG-FPM de grain de blé dur
immature (Figure IV-33).
195
Cb*
Cc
S N
I
Cd/Cd Ce
Cx*
Cf1
II
Cf2/Cf2
III
Cy/Cy
Figure IV-33. Schéma global proposé pour l’état d’oxydoréduction des résidus cystéines d’une
SG-FPM de grain de blé dur immature. En vert, cystéines marquées au 1er alkylant (sous forme
réduite), en rouge, cystéines marquées au 2nd alkylant (sous forme disulfure), en gris, cystéines
non identifiées par MALDI-TOF/TOF.
Ces résultats sont en total accord avec les travaux portant sur les voies qui mènent à
l'assemblage et la formation de polymères de gluténines in vivo (Lombardi et al., 2009) mais
aussi in vitro (Orsi et al., 2001). Ces auteurs ont mis en évidence que la formation de ponts
disulfures intramoléculaires entre certains résidus cystéine est essentielle pour le repliement
correct des SG-FPM. Il s’agit du pont disulfure formé par les résidus Cc et Cf1 puisque son
élimination a entraîné une agrégation intempestive des protéines. La formation de ce pont a
été considérée comme une étape essentielle pour atteindre le repliement approprié. En son
absence, des sites "adhésifs" pourraient être exposés, conduisant à la formation de ponts
disulfures intra et intermoléculaires inappropriés qui aboutiraient à des agrégats insolubles. En
revanche, l'élimination de l'un des deux autres ponts disulfures intramoléculaires : Cd/Ce ou
Cf2/Cy n'a pas eu d'effets significatifs, ce qui suggère qu'ils ont un rôle limité dans la stabilisation
de la structure locale (Orsi et al., 2001).
La coexistence de résidus sous forme réduite et sous forme engagée a été aussi retrouvée
pour les deux résidus cystéines de la SG-HPM 1Bx20. Ce résultat pourrait être la conséquence
du blocage aléatoire de résidus cystéines par un petit thiol tel le glutathion (Cys-SSG). Ceci
pourrait être aussi le cas du résidu Cd des SG-FPM, étant donné qu’il est tenu pour être partie
prenante dans un pont disulfure intramoléculaire avec le Ce identifié uniquement sous forme
engagée. Il se peut aussi dans le cas des SG-FPM, que la formation de ponts disulfures
intramoléculaires soit faite de manière progressive et postérieure à l’assemblage des sousunités de gluténines sous forme de polymère. Il faut tenir compte également du fait que les
protéines peuvent être dans des états transitoires. Les analyses ont porté sur des grains entiers
: certaines zones de l'albumen peuvent être dans un état de maturation plus avancé que
d'autres, or l'analyse est globale.
196
Chapitre IV. B
Nonobstant toutes les hypothèses pour expliquer le double marquage identifié pour certains
résidus cystéines des SG-FPM et de la SG-HPM 1Bx20, nous ne pouvons pas écarter l’hypothèse
qu'un tel résultat pourrait être produit par une alkylation partielle par le 1er agent alkylant
(IAM) du fait d'une très faible réaction avec ATTO des protéines préalablement alkylées par
IAM. Toutefois, nous avons noté une absence d’alkylation à l’acrylamide au cours de
l'électrophorèse ce qui supporte une alkylation efficace des cystéines libres par IAM.
5. Conclusion
Cinq séquences de SG-FPM de blé dur et blé tendre ont été identifiées pour les quatre
bandes analysées, de masses moléculaires comprises entre 30 et 45 kDa. Néanmoins, il n’a pas
été possible de reconstituer l’état d’oxydoréduction de l’ensemble des cystéines des SG-FPM du
fait de l’absence de détection de certains peptides. Nos résultats soulèvent des questions
intéressantes sur l’état d’appariement des cystéines des SG-FPM monomériques et donc sur la
dynamique de formation des ponts disulfures. Le résidu Cf1 a été systématiquement identifié
comme marqué par le 2nd alkylant, donc engagé dans un pont disulfure. Ce résidu est tenu
comme primordial dans le repliement correct des SG-FPM monomériques. Les cystéines Cd et Cy
connues pour s’engager dans des liaisons intramoléculaires se présentent à la fois sous forme
réduite et engagée dans des liaisons disulfures. De plus, lorsque cette SG-FPM est engagée dans
un oligomère, son résidu Cd peut encore se retrouver sous forme réduite. Il se pourrait donc
que le repliement final de cette sous-unité intervienne très tardivement après son insertion
dans les polymères de gluténines.
Ces résultats posent des nouvelles questions. D’une part il semble que le repliement final
des SG-FPM soit un événement tardif, postérieur à leur insertion dans des assemblages
oligomériques, compte tenu de la grande similitude entre les gliadines et les SG-FPM ce résultat
n’était pas attendu. D’autre part, comme montré précédemment dans le chapitre 4-A au
travers de l’analyse du signal fluorescent par SE-HPLC, les SG-FPM monomériques ne
contiendraient que de 1,5 à 2 thiols réduits à des stades immatures du développement du grain
(327 et 473°CJAF). Il s’agit là d’une valeur cohérente avec la présence d’un pont disulfure
intramoléculaire réduit. Toutefois le résidu Cx* a été aussi identifié sous forme réduite. La
question se pose alors du statut de la cystéine Cb* qui, tout comme la Cx*, est censée former les
ponts disulfures intermoléculaires. Dans la SG-FPM monomérique, la Cx* serait donc soit
197
impliquée dans une liaison intramoléculaire, soit bloquée par un petit thiol tel le glutathion
(Cys-SSG). Si tel est le cas il est difficile d’envisager l’assemblage des gluténines sans la
participation d’auxiliaires enzymatiques.
Cette interprétation reste cependant sujette à caution dans la mesure où nous savons que
l’IAM (1er alkylant) n’alkyle que 85 à 90% des thiols réduits totaux. La présence du second
alkylant (4-VP) sur les cystéines également marquées à l’IAM, pourrait donc être liée à une
alkylation incomplète de cette cystéine. Néanmoins, cette dernière hypothèse est peu
soutenable dans la mesure où l’absence d’alkylation à l’acrylamide au cours de l'électrophorèse
nous indique une alkylation efficace des thiols disponibles. Avant de pouvoir définitivement
tirer cette conclusion, il sera nécessaire de quantifier la proportion des différentes formes de
SG-FPM co-existantes (réduites ou engagées). Toutefois en l’état actuel des connaissances, il
nous est en effet impossible de préjuger du rendement d’ionisation des peptides selon leur
marquage par l’IAM ou la 4-VP.
Les résultats montrent, pour les SG-HPM, la présence de résidus cystéines demeurant libres,
mais également la présence de résidus sous forme engagée, ce résultat indique donc une
formation d’oligomères ou de petits polymères de gluténines dès 327°CJAF. En outre, l’analyse
par MALDI-TOF/TOF des bandes à 200, 110 et 85 kDa n’a pas révélé la présence exclusive de
pics de SG-HPM, on constate d’une manière systématique la présence des résidus cystéine
provenant des SG-FPM. Ces résultats indiquent que dès qu'elles sont synthétisées ou très
précocement, les SG-HPM ne restent pas monomériques et s’assemblent sous forme de
polymères.
Ces travaux soulignent la nécessité d'une approche dynamique pour comprendre la
formation de polymères de gluténine. Les études au cours du développement fournissent de
bons outils à cet effet. Il apparaît nécessaire approfondir d’avantage l'isolement de formes
polymériques intermédiaires en exploitant aussi la variabilité génétique de composition en
sous-unités et des lignées transgéniques.
198
Chapitre V
Chapitre V.
Synthèse et conclusions
des résultats
199
Synthèse et conclusions sur les principaux résultats obtenus
200
Chapitre V
Chapitre V- Synthèse et conclusions sur les principaux résultats
1. Contexte et rappel des objectifs
Le blé dur (Triticum durum Desf.) est une céréale largement cultivée dans le bassin
méditerranéen et dans ce contexte, elle est fréquemment soumise à des stress hydriques et
thermiques. Ces contraintes environnementales modulent les conditions d’élaboration et la
composition finale du grain et peuvent aussi limiter la productivité.
Du fait de sa vitrosité et de sa composition riche en protéines, le blé dur est particulièrement
adapté à la fabrication des pâtes alimentaires. Le gluten est le principal composant fonctionnel
du blé, responsable des propriétés viscoélastiques des pâtes alimentaires. Ces propriétés sont
liées à la structure polymérique de la gluténine. Des polymères sont formés par l’assemblage de
sous-unités de gluténines par l’intermédiaire de ponts disulfures intermoléculaires entre les
polypeptides. La genèse des polymères de gluténines est la résultante de processus posttraductionnels encore mal cernés.
Les objectifs principaux de cette thèse ont été d’approfondir les connaissances sur les
modalités de remplissage du grain de blé dur et d'étudier les mécanismes d’assemblage des
protéines de réserve au cours du développement du grain. Nous avons également cherché à
cerner les mécanismes déterminant l’arrêt de la croissance du grain et ce en fonction des
conditions agro-climatiques. Nous nous sommes également attachés à préciser la dynamique
d’assemblage des sous-unités de gluténines sous forme de polymères en lien avec le statut
redox du grain et le rôle du glutathion.
2. Les principaux résultats obtenus
Dans cette étude deux variétés de blé dur ont été retenues en raison de leur composition
distincte en SG-HPM : Orlu (1Bx20 + 1By20) et Dakter (1Bx7 + 1By8) qui leur confèrent des
qualités technologiques contrastées.
Notre but étant de suivre pas à pas l'accumulation des réserves dans le grain, la phase très
précoce de formation du grain, incluant la phase de multiplication cellulaire et de structuration
des enveloppes de la graine, n’a pas été suivie. Au cours de trois années, huit séries de
prélèvements d'échantillons de blés durs ont été réalisées à partir du « stade laiteux » (i.e. fin
de la phase de cellularisation) jusqu’à la maturité.
201
2.1. Dynamique de remplissage du grain
Évolution de l’accumulation de la matière sèche et du statut hydrique du grain
Une des particularités du grain de blé dur, partagée avec les autres espèces de blés et avec le
maïs, est que son contenu en eau est invariant pendant la phase d’accumulation linéaire des
réserves. Pendant la phase de cellularisation, qui correspond à la mise en place de l’albumen et
à une activité mitotique intense, la teneur en eau du grain augmente fortement avec une faible
production de réserves. Quand la quantité d’eau dans le grain atteint son maximum, le grain
entre dans la phase du « palier hydrique » où l’arrivée d'eau dans le grain est sensiblement
égale aux pertes par évapotranspiration, dépendantes des précipitations et des températures
journalières.
Dans cette étude, les différents échantillons analysés ont présenté des masses d'eau
maximales par grain allant de 33 mg à 56 mg. Selon les échantillons analysés, le palier hydrique
a été atteint autour de 280-300°CJAF et s'est maintenu jusqu'à 460°CJAF pour les échantillons
les plus précoces, tandis qu'il s’est étendu jusqu’à 700°CJAF pour les plus tardifs. Pour
l’ensemble des échantillons la maturité physiologique a été atteinte vers 603°CJAF, date
moyenne à laquelle l'accumulation de la matière sèche s’est stabilisée.
Influence des facteurs agro-climatiques
L’effet d'une élévation de la température (24°C au lieu de 17°C de moyenne journalière) est
particulièrement marqué lorsque cette élévation concerne toute la croissance du grain. On
constate alors une diminution très significative du poids du grain et de la durée de remplissage.
Exprimée en jours, cette dernière diminue de 45% contre 25% lorsqu’elle est exprimée en
temps thermique (°CJAF). Ce différentiel résulte des différents mécanismes de contrôle de la
synthèse des grains d’amidon et des protéines. La vitesse d’accumulation de l’amidon n’est que
peu affectée par la température ; exprimée par le cumul de jours, elle est stationnaire tout au
long du cycle de croissance du grain. Pour sa part, la vitesse d’accumulation des protéines n’est
constante et stationnaire qu’exprimée en fonction des °CJAF. Ces résultats recoupent ceux déjà
obtenus pour les blés Aestivum (Triboï & Triboï-Blondel, 2002, Triboï et al., 2003, Dupont et al.,
2006). Ils signalent l’activation de la synthèse des protéines avec la température et la relative
indépendance de la synthèse d’amidon vis à vis de celle-ci. Une conséquence de ce différentiel
202
Chapitre V
est l’accumulation privilégiée de la protéine comparativement à l’amidon lorsque la
température augmente. En corollaire, le stress thermique appliqué à tous les stades de la
croissance, hormis durant la phase de dessiccation, entraîne une très forte réduction de la
masse du grain (proportionnelle à la réduction en jours de la durée de remplissage).
Même si la vitesse de remplissage apparaît globalement liée au poids final du grain, elle ne
se révèle pas être le facteur limitant du poids final du grain. À maturité, la quantité de matière
sèche par grain apparaît davantage déterminée par la durée de l'accumulation. De plus,
l’application de températures élevées en cours du développement du grain n’a influencé ni le
nombre de grains par épis, déterminé plus précocement, ni la vitesse maximale d’accumulation
de matière sèche.
Pour les échantillons cultivés au champ, différentes conditions pédoclimatiques se sont
imposées. La variété Orlu a été cultivée sur deux lieux voisins mais différents par la nature du
sol. Par conséquent, les ressources en eau et donc la disponibilité en azote n'ont pas été les
mêmes au cours de la montaison de la plante, affectant fortement la fertilité de l’épi. Le déficit
global en azote d'un des essais, l’a conduit à induire un plus faible nombre de grains viables (27%). Dans cette étude, même si la composante de rendement « nombre d’épis par m2 » n’a
pas été considérée, les rendements des deux lots estimés à partir du nombre de grain/épis et
du poids moyen des grains murs sont équivalents (à 2% près) mais le rendement en azote du lot
témoin (Orlu-2) dépasse de 18% celui du lot stressé (Orlu-1). L’augmentation du poids moyen
des grains (+35%) et la diminution de la teneur en protéines (- 13%) du lot stressé, résultent de
différences enregistrées concernent la vitesse d’accumulation de l’amidon (+60%), la durée
(+16% en jours) et la hauteur du palier hydrique (+19%).
Au cours de ce travail, nous avons pu mettre en parallèle l’évolution de la teneur en eau et
l’accumulation de la matière sèche quelles que soient la température et les conditions
pédoclimatiques appliquées pendant le développement du grain. L'analyse des cinétiques de
la teneur en eau et de la matière sèche du grain indique une coïncidence entre la fin du
remplissage du grain et le début de la perte en eau des grains. En effet, lorsque l’humidité du
grain atteint 47-42%, l’accumulation de matière s’arrête et le grain rentre en phase de
dessiccation. Ce même type de relation a été montrée pour le blé tendre (Schnyder & Baum,
1992, Calderini et al., 2000). En accord avec des travaux antérieurs (Millet & Pinthus, 1984, Saini
203
& Westgate, 2000), nos résultats suggèrent que la masse d’eau retenue par le grain au cours du
palier hydrique conditionne la masse sèche finale du grain de blé dur. Un des points clefs du
déterminisme du poids du grain résiderait ainsi dans les mécanismes physiologiques qui
déterminent la hauteur du palier hydrique et son maintien tout au long de la phase de
croissance en masse du grain.
D’après nos connaissances, c’est la première fois que l’influence du "timing" d’application de
températures élevées sur la teneur en eau est documentée. A partir de nos résultats, il ressort
que lorsque le régime de température élevée est appliqué pendant la phase linéaire de
remplissage, la teneur en eau du grain est réduite de seulement 7% et le poids sec final du grain
de 20%. Par contre, quand le stress est appliqué immédiatement après la floraison, pendant la
phase de cellularisation (HT3), la teneur en eau du grain est réduite de 27% et le poids sec final
du grain de 42%. Par conséquent, il apparaît que le poids sec potentiel du grain est déterminé
très précocement au cours du développement du grain, au moment où le tissu maternel du
grain, le péricarpe, subit un élargissement considérable (Lizana et al., 2010). La période
antérieure à la stabilisation du palier hydrique serait ainsi critique pour le déterminisme de la
masse finale du grain.
Durée de la phase de remplissage et arrêt de la croissance du grain
Nous avons montré que, indépendamment du génotype et des conditions de culture, l'arrêt
de l'accumulation de matière sèche du grain est toujours observé à une concentration en eau
d’approximativement
45%.
A
cette
humidité,
l’accumulation
de
matières
solides
supplémentaires (protéines de réserve et grains d’amidon) ne peut se faire sans une
augmentation nette du contenu en eau. En effet, l'albumen peut être vu comme un
compartiment incluant des matières granulaire (organites cellulaires, CPs, grains d'amidon) et
de l'eau. En raison de contraintes géométriques, le volume des grains d'amidon n'atteindra
jamais celui de la cellule et la fraction volumique maximale possible correspondra à un
empilement compact aléatoire (i.e. random close packing) de grains d’amidon dans les cellules
de l’albumen. Dans le grain immature, grains d'amidon et CPs contribuent ensemble à
l’encombrement granulaire des cellules de l’albumen en raison de leur commune nature solide
et discrète.
204
Chapitre V
Évolution de la morphologie des corpuscules protéiques
La présence de CPs petits et sphériques a été observée dès les premiers stades de
développement analysés (Figure V-1A). Dès l’entrée du palier hydrique, les CPs deviennent de
plus en plus gros et nombreux, certains atteignent plus de 20 µm (Figure V-1B). Avant la fin du
palier hydrique le contenu cellulaire change considérablement et on observe une coalescence
des CPs (Figure V-1C). Moins nombreux, plus volumineux, leurs contours apparaissent de plus
en plus déformés. Grâce à la microscopie confocale, on identifie nettement les invaginations
provoquées par les grains d’amidon. Du fait qu'ils sont plus facilement déformables que les
grains d'amidon, les CPs seraient les premiers à subir une pression interne exercée par le
phénomène d’entassement des grains d’amidon. A partir de ce stade, la poursuite de la
croissance en nombre et en taille des grains d’amidon va se faire au détriment du maintien de
l’intégrité des CPs. La coalescence des CPs qui se produit avant la fin du remplissage du grain,
dégagerait des espaces supplémentaires pour le dépôt de grains d’amidon, essentiellement de
types B et C, qui rempliront les espaces entre les gros grains de type A déjà synthétisés. La
disparition progressive des CPs et la libération subséquente des protéines de réserve dans le
cytoplasme permettent la formation du réseau protéique continu observé autour de 50% de
teneur en eau, c’est à dire avant la fin du remplissage du grain (Figure V-1D). La température
appliquée en début de remplissage du grain diminue la hauteur du palier hydrique et active la
translocation des ressources azotées vers le grain, sans modifier notablement la synthèse de
l’amidon. Ainsi, la proportion de protéines augmente devant celle des grains d’amidon. En
conséquence on peut envisager que les CPs seront plus précocement soumis à la pression des
grains d’amidon et que leur déstabilisation interviendra plus tôt au cours du développement du
grain.
205
A) 293°CJAF
B) 327°CJAF
C) 473°CJAF
D) 601°CJAF
Figure V-1. Superposition d'images de fluorescence (marquage Fast Green) et de fond clair de
corpuscules protéiques de l’albumen de grains de blé dur en développement (Orlu-1).
Déterminisme de l’arrêt de la croissance de grains
Au cours de cette étude nous avons formulé l’hypothèse selon laquelle des limites
purement physiques, liées à la nature granulaire des réserves stockées dans les cellules de
l’albumen (amidon et CPs) contrôleraient l’arrêt du remplissage des cellules de l'albumen.
Ainsi à 45% d’humidité, teneur en eau à laquelle le grain arrête de se remplir en matière
sèche, on peut estimer que les grains d’amidon occupent environ 54-57% du volume des
cellules de l’albumen 8. La compacité limite de l’empilement granulaire serait alors atteinte.
En amont de cette teneur en eau, la limite de compacité pourrait déjà être atteinte autour de
50% de teneur en eau si on prend en compte la présence des CPs. Plus la teneur en protéines
8
Pour ce calcul on prend en compte la densité variée de l’amidon (1,49) et du gluten (1,3). On estime que
l’hydratation de l’amidon est comprise entre 0,25 et 0,3 g/g d’amidon sec.
206
Chapitre V
de l’albumen sera élevée, plus précoce sera le moment où interviendra le développement des
pressions internes aboutissant à la déstructuration physique des CPs.
Afin d’élucider les hypothèses émises autour du déterminisme de l’arrêt de la croissance du
grain, il nous a semblé important de cibler très précisément l’entrée en dessiccation du grain.
Pour cela des échantillons de deux variétés différentes (Néfer et Dakter) ont été récoltés
régulièrement avec un pas de temps serré, de la phase de remplissage du grain jusqu’à la
récolte. Pour mieux rendre compte des modifications physiologiques, telles que l’évolution de
l'accumulation de la masse sèche et celle du contenu en eau du grain, nous avons présenté ces
données en exprimant l'axe des x par le temps thermique après la maturité physiologique,
calculé par rapport à la stabilisation du poids sec du grain. A partir de ces résultats nous
pouvons constater clairement que la fin de l’accumulation de la matière sèche dans le grain
intervient avant le début de la phase de dessiccation (Figure V-2).
A partir de ce constat nous proposons un enchaînement d’événements physiologiques
marquant l’entrée du grain en dessiccation. Ainsi, pendant la phase de remplissage, la
pression exercée par les grains d’amidon s'accroît avec pour conséquence l'éclatement des
CPs ce qui assure de la place supplémentaire pour l’accumulation de l’amidon. Celle-ci
continue alors jusqu’à atteindre la limite de compacité granulaire. La poursuite de la synthèse
d’amidon devient physiquement impossible et le grain entre alors en phase de dessiccation.
207
60
Néfer
553°C JAF
poids sec
mg par grain
50
40
30
20
quantité d'eau
10
0
-300 -200 -100
0
100 200 300
°C JAF normalisé
400
500
poids sec
60
mg par grain
50
Dakter
586°C JAF
40
30
20
quantité d'eau
10
0
-300 -200 -100
0
100 200 300
°C JAF normalisé
400
500
Figure V-2. Évolution du poids sec et de la quantité d’eau par grain pour Néfer et Dakter au
cours du développement du grain. Les points représentent les valeurs moyennes réelles
observées. Les lignes (bleues) représentent les valeurs estimées par ajustements statistiques
(cf. item 2.8, Chapitre II) d’une fonction logistique à 4-paramètres de la quantité d'eau par grain
en fonction du temps thermique après la maturité physiologique (estimée à 553 et à 586°CJAF
pour les variétés Néfer et Dakter respectivement) et les fonctions linéaires segmentées sont
utilisées pour la variable poids sec du grain.
Modalités de dessiccation du grain
Au cours des paragraphes précédents nous avons montré que les processus qui régissent la
croissance et la dessiccation du grain sont intimement liés. La vitesse de dessiccation estimée
pour les grains soumis à des températures élevées, exprimé en °CJAF ou sur une base
journalière, est significativement plus faible pour ceux ayant subit les traitements HT1 et HT3
plutôt que les traitements LT et HT2. Ces résultats s’avèrent surprenants dans la mesure où les
grains exposés aux traitements HT2 et HT3 ont subi le même régime de température élevée au
cours de la phase de dessiccation. Il semble donc que l’application d'une température élevée au
cours de la phase de remplissage (HT1 et HT3) influe sur la vitesse de perte en eau du grain
d'une manière assez complexe. Dans ce même sens, Gooding et al. (2003) ont proposé que ni la
208
Chapitre V
restriction du potentiel hydrique du sol, ni l’augmentation de la température n’influencent la
vitesse dessiccation de grains à partir de la fin de l’accumulation de la matière sèche. D’autres
phénomènes de contrôle doivent être envisagés.
En effet, le ralentissement de la dessiccation est associé aux deux traitements (HT1 et HT3)
qui ont conduits aux plus fortes teneurs en protéines. De plus, quand on observe la phase finale
de dessiccation du grain, en deçà de 30% de teneur en eau, on constate qu’elle est clairement
plus longue pour les traitements HT1 (+8 j) et HT3 (+17 j) que pour les autres traitements (+5 j).
Lorsque la concentration en protéine est élevée, les protéines de réserve libérées dans le
cytosol s’organisent en un réseau viscoélastique continu et ce avant même le début de la phase
de dessiccation. La perte en eau va alors s’accompagner du retrait du composite granulaire. En
effet, la matrice continue et viscoélastique qui emprisonne les grains d’amidon va les
compacter au delà de la limite de « random packing ». En conséquence, la perte en eau des
grains sera lente et conduira à une condensation de la matrice, à un retrait idéal et donc à un
grain vitreux. A l’opposé, lorsque la concentration en protéines est faible, la déshydratation des
cellules de l’albumen sera plus rapide du fait de la plus faible tension capillaire entre les grains
d'amidon. En l’absence d’un réseau protéique continu, les grains d’amidon ne subiront aucune
contrainte les poussant à se compacter. Lorsque, du fait de la dessiccation, la concentration en
protéines sera suffisante pour que les protéines s’associent cela sera trop tard, l’air aura déjà
envahit le système granulaire et la phase protéique ne sera pas en mesure de percoler le lit
granulaire.
En résumé, ces résultats suggèrent que le ralentissement de la vitesse de perte en eau
serait lié à la capacité des protéines du gluten à s’organiser en un réseau viscoélastique en
amont du démarrage de la phase de dessiccation, ce qui nous amène à avancer l’hypothèse
que la vitesse à laquelle le grain se dessèche serait dépendante de sa teneur en protéines.
2.2. Dynamique d’assemblage des polymères de gluténines
Évolution de la distribution en poids moléculaires des polymères de gluténines
L’accumulation des différentes classes protéiques a été évaluée par analyse de la distribution
en taille des protéines par SE-HPLC et électrophorèse. Les protéines ont été directement
extraites dans le SDS ou extraites séquentiellement selon un protocole inspiré d’Osborne. Le
209
dépôt des fractions gliadines et albumines/globulines se déroule en parallèle jusqu’à 450500°CJAF, date à laquelle la synthèse de ces dernières s’arrête tandis que les gliadines
continent de s’accumuler jusqu’à 600°CJAF. L’accumulation des polymères de gluténines ne
démarre réellement qu’après 450°CJAF et leur croissance en taille se déroule de façon
séquentielle. Dans une première phase on observe une accumulation quasiment linéaire de
petits polymères (F2) qui s’achève autour de 600°CJAF. La formation de ces petits polymères
découle de l’assemblage des SG-FPM qui au delà de 450°CJAF, s’assemblent à un rythme
supérieur à celui de leur synthèse. La vitesse d’assemblage semble directement liée au
génotype. Elle est plus rapide pour la variété Dakter qui exprime le couple de SG-HPM 1B7x+8y
que pour la variété Orlu 1B20x+20y. L’accumulation rapide de gros polymères SDS-solubles (F1)
et SDS-insolubles (Fi) démarre plus tardivement vers 500°CJAF. La formation de polymères SDSinsolubles peut se poursuivre jusqu’à 700-750°CJAF soit quasiment jusqu’à l’atteinte de la
transition vitreuse du grain, caractérisée à 16% d’humidité pour la semoule de blé dur (Cuq &
Icard-Vernière, 2001). Cependant, le phénomène n’est marqué que pour les grains soumis à un
stress thermique pendant le remplissage (HT1 et HT3). Il est donc à mettre en relation avec la
teneur en protéines des grains. C’est ce paramètre qui, comme nous l’avons discuté plus haut,
conditionne la cinétique de dessiccation du grain et donc la durée pendant laquelle sa teneur
en eau se maintient au-dessus de 16%. Durant cette phase ultime, la condensation importante
des gluténines permettrait des échanges thiol-sulfhydrile conduisant à la formation de
polymères insolubles.
En examinant l’évolution des polymères de gluténines tout au long du remplissage du
grain, on constate que la polymérisation est progressive, les petits polymères de gluténines
s’assemblent en plus gros qui sont à leur tour progressivement transformés en macropolymères insolubles dans le SDS.
Évolution de l’état d’oxydoréduction des gluténines
L’ensemble de nos résultats montre que la polymérisation des SG-HPM intervient aussitôt
après leur synthèse repérée dès 305°CJAF. Ces sous-unités ne sont en effet détectables sous
forme libre qu’à l’état de trace dans les extraits SDS-solubles avant 470°CJAF et ce
contrairement aux SG-FPM qui s’accumulent en nombre sous forme libre. Il s’agit là d’une
210
Chapitre V
différence de comportement notable. Les SG-HPM s’assemblent en homopolymères qui
présentent un encombrement moléculaire important avant même que ne démarre
l’assemblage des SG-FPM. Ce résultat est bien en accord avec le schéma couramment admis de
la formation d’un squelette de polymères de SG-HPM sur lequel les SG-FPM viendraient se
brancher. Jusqu’à 473°CJAF les SG-FPM synthétisées se trouvent majoritairement sous forme
monomérique. Selon notre estimation à partir de l’analyse du rapport Fluo/UV210 des profils SEHPLC et aussi à partir des analyses en MALDI-TOF, ces protéines transitoirement présentes dans
les extraits Tris-HCl et éthanoliques auraient entre 2 à 2,5 thiols disponibles. Après cette date,
ces monomères disparaissent pour former des oligomères qui comprennent quelques SG-HPM
dans leur structure. En accord avec la polymérisation massive des SG-FPM, le contenu en thiols
protéiques diminue fortement, indiquant l’oxydation de leurs groupements thiols. Cependant
nous avons pu montrer que les polymères sont porteurs de 1 à 1,5 thiols par sous-unité,
considérant un Mr moyen de 40.300 et ce quelque soit leur encombrement moléculaire.
Ce résultat est incompatible avec un modèle linéaire d’assemblage séquentiel pour lequel
seules deux cystéines devraient être présentes aux deux extrémités de la chaîne de
polypeptides. Il semblerait donc que le repliement final des SG-FPM et l’établissement de
leurs ponts disulfures intramoléculaires soient des événements très tardifs, postérieurs à leur
insertion dans des assemblages oligomériques. La question pendante reste celle du rôle de
ces thiols impliqués dans des ponts intramoléculaires dans l’assemblage des polymères.
Le rôle du glutathion lié aux protéines dans la formation des polymères
Nos résultats montrent que la fixation du glutathion sur les gluténines intervient
précocement pendant la phase de remplissage et peut s’étaler jusqu’au début de la
dessiccation. Dans tous les cas elle apparaît intimement liée à l’accumulation des petits
polymères de gluténines. La fixation précoce du glutathion sur les gluténines joue un rôle de
protection et préviendrait leur oxydation irréversible et prématurée lors de la dissociation
des CPs dans le cytoplasme.
En accord avec des travaux précédents (Bénétrix et al., 1994, Panozzo et al., 2001), nos
résultats montrent une polymérisation progressive des gluténines qui contrastent avec
l’augmentation brutale des gros polymères de gluténines repérée au moment de l’entrée en
211
dessiccation par d'autres auteurs (Rhazi et al., 2003a, Shewry et al., 2009b). Ces différences ne
recoupent pas les différents modèles d’études, puisque Panozzo et al. (2001) ainsi comme les
deux derniers groupes cités, ont menés leurs études sur des blés tendres. Selon nous, ces
différences pourraient provenir de différentes teneurs en protéines des grains. En fonction de
celles-ci, la déstructuration des CPs et la subséquente mise en contact des protéines avec le
glutathion du cytosol pourrait intervenir plus ou moins précocement. Plus la teneur en
protéines du grain est faible (comme par exemple dans les travaux de Rhazi et al.), plus cet
événement serait retardé, voire n’interviendrait qu’au moment de la dessiccation du grain.
Cependant, dans tous les cas, la fixation du glutathion coïncide avec l’augmentation brutale de
la polymérisation des sous-unités gluténines. Cette coïncidence nous permet de proposer la
glutathionylation des gluténines comme un des éléments clefs de la polymérisation. Dans cette
optique, les glutarédoxines pourraient jouer un rôle critique. Nos résultats indiquent un
équilibre entre le pool du glutathion réduit (GSH) et le glutathion lié aux gluténines (PSSG). Ce
résultat corrobore le fait que le glutathion pourrait participer à la catalyse de l’oxydation des
oligomères ou des petits polymères de gluténines au cours du remplissage et de la maturation
du grain.
Modèle d’assemblage des polymères au cours du développement du grain de blé dur
En résumé, trois phases sont détectées : (i) pendant le palier hydrique et avant 450°CJAF
les gluténines s’accumulent principalement sous forme monomérique, mais des oligomères
porteurs de nombreux thiols sont également présents ; (ii) entre 450 et 600°CJAF un « burst »
oxydatif se produit, les corpuscules protéiques éclatent, le glutathion se fixe sur les
gluténines et les polymères s’assemblent avec une oxydation massive des thiols ; (iii) après
600°CJAF, en impliquant un faible nombre de thiols, la taille moyenne des polymères
augmente et des échanges SH-SS entre les gluténines « glutathionylées » se poursuivent.
2.3. Elaboration de la qualité technologique du grain
Les événements décidant de la texture de l’albumen du grain mur et ceux conduisant à la
polymérisation des protéines de réserve du grain ont tout particulièrement été étudiés dans la
mesure où ce sont eux qui respectivement conditionnent le rendement semoulier et la qualité
culinaire des pâtes. Il s’agissait notamment de suivre la formation du grain et de cerner les
212
Chapitre V
déterminants physiologiques et physico-chimiques qui participent à l'élaboration de la qualité
technologique du blé dur, notamment la texture, la composition et la teneur en protéines des
grains.
Contrôle de la texture finale du grain
Nos résultats montrent qu’à la maturité, le pourcentage de grains mitadinés est inversement
corrélé à la concentration en protéines des grains (Figure V-3). Des travaux précédents ont
montré que chez le blé dur les faibles teneurs en protéine en dessous de 11,2% (en poids sec)
sont associées au phénomène du mitadinage (Samson et al., 2005). Nos résultats suggèrent
quant à eux que c’est seulement lorsque la teneur en protéines du grain dépasse le seuil de
12% que semble garanti l’obtention d’un grain vitreux. Reste qu’au caractère tranché de ce
seuil critique, correspond l’apparition d’hétérogénéités locales qui semble être installées
précocement. Ainsi à partir des observations sur des grains immatures lyophilisés, on constate
la présence de grains mitadinés présentant des zones opaques et blanchâtres à des stades très
précoces du développement du grain, c’est à dire vers 350°CJAF (Figure V-4).
Selon les travaux de Dexter et collaborateurs (1981, 1989), le phénomène du mitadinage est
associé à une diminution du contenu protéique en liaison avec une pauvre fertilisation azotée
qui se traduit par une amande moins vitreuse. Nos résultats sont en accord avec cette
conclusion. Le mitadinage ne semble relever que de la diminution du ratio protéine sur amidon
dans le grain. En activant la vitesse d’accumulation des protéines au détriment de celle de
l’amidon, le stress thermique joue un rôle non négligeable dans l’obtention de grains vitreux.
Reste que l’examen des grains immatures pointe sur l’existence d’une répartition hétérogène
des protéines entres les cellules de l’albumen. C’est autour de cette problématique que la
question du mitadinage du grain de blé dur devra être posée à l’avenir.
213
HT1-802°CJAF
HT2-818°CJAF
HT3-746°CJAF
LT-790°CJAF
Figure V-3. Photographies de grains de blé dur matures de la variété Dakter soumis à différents
régimes de température pendant le remplissage (HT1), la dessiccation (HT2) ou tout au long du
développement des grains (HT3). A droite, les traitements LT (témoin) et HT2 présentant plus
de 50% de grains mitadinés.
473°CJAF
327°CJAF
Figure V-4. Photographies de grains de blé dur immatures mitadinés (variété Orlu-1).
Composition protéique finale du grain
La composition en protéines finale du grain est très similaire pour la plupart des échantillons
analysés, à l'exception de ceux qui ont subi le stress thermique tout au long de l’élaboration du
grain. Typiquement, les grains mûrs sont composés de 17,7% d’albumines et de globulines, de
33,72 % de gliadines et de 40,43% de polymères de gluténines. L’application d'une température
élevée tout au long du cycle de développement du grain modifie cependant la composition en
214
Chapitre V
protéines de réserve du grain à maturité. Il en résulte une augmentation significative de la
fraction -/!-gliadines au détriment des gluténines et des "-gliadines.
La distribution en taille des polymères de gluténines a été étudiée au cours de ce travail et le
résultat le plus marquant concerne les taux de polymères insolubles. Les échantillons cultivés
aux champs présentent une très faible teneur en polymères insolubles par rapport à ceux
cultivés en chambre de culture en conditions contrôlées (5,82 % contre 13,0 % respectivement).
En effet, la distribution en taille des polymères de gluténines est affectée par la température. Le
stress thermique appliqué durant la phase de remplissage joue un rôle non négligeable dans
l’obtention de grains à fortes teneurs en protéines et en polymères de gluténines SDSinsolubles. L’élévation de température tout au long de la croissance des grains induit à la fois la
plus faible teneur en gluténines (TPP) et la plus grande proportion de polymères insoluble (Fi),
ce qui se traduit par une augmentation de 40% de la teneur de polymères « inextractibles »
(Fi/TPP) par rapport au témoin.
La teneur en agrégats de gluténines insolubles des grains murs est négativement reliée à
celle du glutathion lié aux gluténines. Cette relation a aussi été rapportée chez le blé tendre
(Rhazi et al., 2003b, Tea et al., 2005). Si l'on compare nos résultats avec ceux obtenus chez le
blé tendre, la proportion de gluténines insolubles est beaucoup plus faible. Chez le blé tendre la
proportion de polymères de gluténines insolubles est de l'ordre de 25 à 45% en fonction de la
composition en SG-HPM qui semble jouer un rôle essentiel dans l'assemblage des polymères de
gluténines (Gupta et al., 1996, Carceller & Aussenac, 1999, Naeem & MacRitchie, 2005). Du fait
que le blé dur ne possède que 2 génomes, les SG-HPM codées par le locus Glu-D1 sont
absentes, ce qui se traduirait par une formation de polymères plus petits.
Il est intéressant de rappeler que dans le cas de la valeur pastière des blés durs, seule la
teneur en protéines est retenue comme critère de qualité. De fait et comme le montre nos
travaux, celle-ci pourrait bien être associée à une plus forte teneur en polymères insolubles
dans le SDS. Dans le cas de la valeur boulangère c’est ce dernier critère qui est mis en avant,
devant la teneur en protéines. Mais chez les blés boulangers qui présentent en général des
teneurs en protéines bien inférieures à celles des blés durs, c’est la composition en SG-HPM
codés par le génome D qui détermine la teneur finale en polymères insolubles au SDS
(Naeem & MacRitchie, 2005).
215
Perspectives
3. Perspectives
Les travaux conduits au cours de cette thèse ont mis en lumière le rôle de la teneur en
protéines et de la composition en SG-HPM dans la dynamique d’assemblage des polymères de
gluténines du blé dur. Ils nous ont permis de montrer que la structure secondaire des sous
unités gluténines n’était pas encore fixée au moment de l’assemblage des polymères, ce qui
amène de nouvelles questions. En effet, si la polymérisation relève d’un « burst» oxydatif lié à
la mort programmée des cellules ou à l’entrée en dessiccation du gain, alors comment se fait le
tri entre les thiols qui doivent s’engager dans des liaisons intramoléculaires et ceux qui ont
vocation à établir des liaisons intermoléculaires ? Par ailleurs, le rôle du glutathion dans
l’assemblage des polymères de gluténines nous semble devoir être re-posé. Enfin, là où
d’autres ont vu un élément capable de limiter la polymérisation, nous avons plutôt identifié un
auxiliaire de la polymérisation.
Il s’agit des quelques questions qui nous paraissent devoir faire l’objet d’investigations
futures.
Teneur en protéines, nature des SG-HPM
-
Dans la mesure où, comme nous venons de le voir, la teneur en protéines et la nature des
SG-HPM semblent déterminer tout à la fois la vitrosité et la distribution en taille des
polymères des grains mûrs il nous semble primordial d’étudier simultanément l’influence de
ces deux facteurs. Pour cela, nous envisageons un suivi de la dynamique d’assemblage des
polymères de gluténines de lignées isogéniques de blé dur ne variant que pour leur
composition en SG-HPM et cultivées selon des modalités d’apports d’azote contrastées.
Thiols protéiques et assemblage
- Nos premiers travaux sur la quantification du nombre de thiols portés par SG-FPM et les
polymères de gluténines tout au long du développement du grain nous semblent devoir
être approfondis. D’une part, la méthodologie doit pouvoir être affinée en recourant à une
détection en ligne par MALLS afin d’accéder aux masses moléculaires, en nombre et en
poids, des polymères. D’autre part, la composition des polymères par tranche de taille
devra être établie par analyse électrophorétique ou RP-HPLC à partir des polymères élués
de la SE-HPLC. Les données recueillies, taille, composition, nombre de thiols et ce en
216
Chapitre V
fonction du développement du grain devraient pouvoir être intégrées dans un modèle de
cinétique de polymérisation. En tout cas, la recherche de ce modèle devrait nous permettre
de tester de nouvelles hypothèses concernant les modalités d’assemblage des sous unités
gluténines.
-
Afin de déterminer plus précisément l’état redox des cystéines des sous unités gluténine,
l’utilisation des deux modes d’ionisation tels que le MALDI et l’ESI (ionisation par
électronébuliseur) pourrait être envisagée et appliquée à des protéines alkylées par l’ATTO
et isolées préalablement par isoélectrofocalisation (IEF) en veine liquide puis par RP-HPLC. Il
sera ainsi possible de quantifier précisément le nombre de cystéines réduites et
probablement leur position.
-
Au cours de nos analyses par MALDI, certaines cystéines se sont retrouvées marquées par
les deux alkylants (IAM, 4VP) suggérant l’existence d’un équilibre entre différents états
redox. Afin de trancher sur ce point, une stratégie protéomique quantitative devrait être
mise en place avec l’analyse de témoins en quantités connues, alkylés par l’un ou l’autre des
alkylants et déposés selon différentes proportions. La quantification serait essentiellement
orientée sur l’intensité relative des pics après la mesure lors de l'analyse en spectrométrie
de masse. Le ratio des pics détectés informerait sur l’abondance relative de ces espèces
dans l’échantillon (SH ou SS).
Glutathion et mécanismes d’assemblages
-
Les travaux menés sur l’évolution de l’état redox du grain indiquent que le glutathion joue
un rôle crucial dans les mécanismes menant à la polymérisation des gluténines. La déplétion
des activités de la CAT et de l’APX avant l’entrée du grain en dessiccation suggère
vraisemblablement une oxydation du glutathion par le peroxyde d’hydrogène. La question
se pose alors de l’évolution de l’activité de la DHAR (dehydroascorbate reductase) qui agit
aussi comme protecteur de l’ascorbate tout en oxydant le glutathion. Or, on constate que le
glutathion est majoritairement sous forme libre, réduite ou couplée aux protéines dans les
grains matures. Dans ce contexte, il est difficile d’envisager l’assemblage des gluténines
sans la participation d’auxiliaires enzymatiques comme les glutarédoxines et les
thiorédoxines. Nous n’avons pas exploré cette voie, mais elle est sans doute prometteuse
pour aller vers la compréhension du rôle du glutathion dans les mécanismes de
217
Perspectives
dépolymérisation et de repolymérisation des gluténines. Dans le même ordre d’idée, il
serait intéressant d’étudier tout particulièrement la PDI (Protein disulfide-isomerase).
Et le mitadin du blé dur …
-
Si la relation entre teneur en protéines et mitadin nous parait aujourd’hui bien établie,
force est de constater que même à des teneurs en protéines élevées, une fraction
importante de la récolte peut être constituée de grains mitadinés. Il nous semble donc
qu’une étude à l’échelle du grain et non plus de la récolte s’impose. Quelles sont les
différences de composition entre les parties mitadinées ou non d’un même grain ? Existe-til une position sur la plante ou l’épi qui prédispose au mitadin ? A quelle période du
développement du grain se décide le mitadin ?
218
Références Bibliographiques
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219
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240
Annexes
241
Annexes
242
Annexes
Annexe 1. Complément Méthodologique
Principe de la spectrométrie de masse
La spectrométrie de masse repose sur la mesure précise de la masse moléculaire de
biomolécules ou plus précisément du rapport masse sur charge (m/z) de molécules ionisées à
l’état gazeux.
La spectrométrie de masse constitue un outil indispensable dans l'étude et la caractérisation
des biomolécules. L'ionisation est une étape majeure dans l'analyse des biomolécules en
spectrométrie de masse car cette étape permet la production d’ions qui vont être analysés.
C'est à la fin d’années 80 que l'Américain John B. Fenn et le Japonais Koichi Tanaka ont
développé deux méthodes d'ionisation dites « douces » (prix Nobel de chimie en 2002 obtenu
conjointement). Ces méthodes sont l'ionisation de type « electrospray ionisation » (ESI) (Fenn
et al., 1989) et l'ionisation de type « Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation » (MALDI)
(Hillenkamp, 1983, Tanaka et al., 1988, Hillenkamp & Karas, 1990). Ainsi, le MALDI-TOF a connu
un développement rapide et est récemment devenu un outil puissant pour l’étude des
prolamines (Garozzo et al., 1999, Foti et al., 2000, Gao et al., 2010, Liu et al., 2010).
Classiquement, un spectromètre de masse est constitué de différentes parties aux rôles
spécifiques :
-
Une source d'ions : produit des ions à partir de l’échantillon à analyser. Un apport
énergétique va permettre la transformation de molécules neutres électriquement
initialement à l'état liquide, solide ou gazeux, en molécules gazeuses, électriquement
chargées (positif ou négatif) formant les ions.
-
Un analyseur : trie les ions en fonction de leur rapport m/z. L'analyseur permet d'étudier la
trajectoire des ions dans un champ électrique et/ou magnétique. C'est la partie de l'appareil
où règne un vide suffisant pour que le libre parcours moyen des ions soit supérieur à la
distance à parcourir pour atteindre le détecteur.
-
Un détecteur : détecte les ions en leur associant leur rapport m/z. Le détecteur convertit en
grandeurs électriques (courant ou tension) le signal correspondant aux ions ayant atteint le
détecteur.
243
Annexes
-
Un enregistreur pour l'acquisition, le traitement du signal et la visualisation des spectres et
un système de calibration permettant l’étalonnage entre la grandeur mesurée et le rapport
m/z considéré.
Ionisation / Désorption assistée par Matrice
La technique MALDI (Karas & Hillenkamp, 1988) utilise un faisceau laser pulsé travaillant
dans l'UV et sous vide pour désorber et ioniser un mélange matrice/échantillon co-cristallisé sur
une surface métallique dit « cible » (Figure 1). L'énergie transmise par le laser est absorbée par
la matrice, provoquant une expansion de la matière en phase gazeuse. L'ionisation des
molécules cibles se fait par transfert de protons entre les molécules de matrice excitée et les
molécules cibles. L'ionisation MALDI génère essentiellement des ions [M+H]+ (Zhang et al.,
2003) pour des peptides de masse moléculaire inférieure à 5000 Da. L'ionisation des
biomolécules et ainsi la qualité de l'analyse, dépendra de la préparation de l'échantillon, du
choix de la matrice, de la présence de sels dans les différents tampons, du pH.
Figure 1. Mécanisme de désorption/ionisation MALDI.
Matrice et dépôt d’échantillons
La source d’ionisation MALDI repose sur les propriétés physicochimiques d'une matrice.
Cette dernière est constituée de petites molécules organiques ayant une forte capacité
d’absorption de l'énergie apportée par une source laser (bande d’absorption à la longueur
d’onde du laser *). Cette matrice est en excès par rapport à l’analyte dans les cristaux (environ
244
Annexes
10000/1). Il existe un grand nombre de matrices, adaptées à différentes natures de substrats.
Elles sont généralement préparées à une concentration de l’ordre de 1-20 mg/mL (Tableau 1).
Tableau 1. Exemples de matrices employées en spectrométrie de masse MALDI
Matrice
Structure
!"#$%&'()*+',!-,./
Application
337, 355 et 266
(UV)
Analyse de peptides
(< 10 kDa)
DHB
(acide 2,5hydroxybenzoïque)
337, 355 et 266
(UV)
Analyse de peptides
et digestat de
protéinesoligosaccharides
Acide Sinapinique (SA)
(acide 3,5-diméthoxy-4hydroxycinnamique)
337, 355 et 266
(UV)
Analyse de gros
peptides et
protéines (> 10 kDa)
0- HCCA
(acide alpha-cyano-4hydroxycinnamique)
Les méthodes de dépôts matrice/échantillon sur la cible métallique sont nombreuses
(Kussmann et al., 1997). On peut citer :
-
La méthode en sandwich : permet d'obtenir un dépôt homogène de matrice/échantillon.
L'échantillon est emprisonné entre deux couches de matrice.
-
La méthode de la goutte séchée : permet d'obtenir des cristaux de matrice dopés en
échantillon. Les cristaux sont donc hétérogènes mais sont plus résistants aux tirs laser.
L'analyseur TOF
Le MALDI est utilisé en association avec un analyseur en temps de vol (TOF). Après leur
ionisation, les ions monochargés sont accélérés par un champ électrique et introduits dans
l’analyseur en temps de vol. Cet analyseur mesure le temps nécessaire pour un ion de masse m
et de charge z pour atteindre le détecteur. Les mesures de notre étude, ont été
majoritairement réalisées en mode réflecteur. A l'extrémité du tube de vol est ajouté un miroir
électrostatique (réflecteur) qui permet d'améliorer la résolution. Ce réflecteur permet
d'augmenter le temps de vol entre deux ions de masses différentes et augmente ainsi la
précision de masse. De plus, il refocalise les ions de même masse mais avec une énergie
245
Annexes
cinétique légèrement différente afin de les synchroniser à leur arrivée au détecteur (Figure 2)
(Mamyrin et al., 1973).
Figure 2. Analyseur TOF de type réflecteur. Les ions de même m/z conservent leur vitesse
originale, mais arrivent au détecteur en même temps en raison du temps compensé par le
réflecteur (d'après Wu et al., 2007).
Analyse en mode MS/MS : LIFT
Le mode LIFT (ascenseur à potentiel) permet de fragmenter certains ions dits « ions
parents » et d'obtenir des ions fragments permettant d'obtenir des informations de séquence.
Ainsi, les ions dans la source MALDI sont accélérés à un potentiel de 8kV et sont fragmentés
dans la première partie du tube de vol (TOF1). La sélection des différents ions se fait par une
grille de déflection basée sur le temps de vol. La cellule LIFT placée derrière cette grille réaccélère les ions avec un potentiel de 19kV, les ions fragments seront enfin analysés dans le
TOF2 et seront détectés en mode réflecteur (Figure 3).
246
Annexes
Figure 3. Schéma d’un spectromètre de masse en mode LIFT (TOF/TOF). Le TOF1 est localisé
entre la source d'ions MALDI et la cellule LIFT ; le TOF2 est placé après le deuxième stade
d’accélération de la cellule LIFT et avant le réflecteur (d'après Suckau et al., 2003).
Identification de protéines par spectrométrie de masse
Mode MS : Empreinte peptidique massique (PMF)
L’approche la plus utilisée pour une analyse MALDI-TOF est l’établissement de cartes
peptidiques massiques ou PMF (« peptide mass fingerprinting ») car les espèces moléculaires
sont monochargées. Différentes étapes précèdent l'analyse de ces fragments, notamment une
séparation des protéines par électrophorèse et digestion par une enzyme à sites de coupures
spécifiques (ex : trypsine) pour générer des peptides. La masse de chaque peptide est
déterminée et les masses mesurées sont ensuite confrontées aux masses des peptides
théoriques des banques données (digestion in silico). L’ensemble de masses constitue une sorte
d’empreinte digitale de la protéine. Dans l'analyse PMF, seules les valeurs m/z des ions
précurseurs ou parents sont utilisés pour la recherche dans les banques de données.
Pour valider l'identification d'une protéine par PMF, différents paramètres sont à considérer
: le pourcentage de recouvrement de la protéine par les peptides protéolytiques identifiés ; le
nombre de peptides mesurés par rapport au nombre de peptides calculés et la précision de
masse des peptides mesurés. En général, il suffit de quatre à six peptides protéolytiques
mesurés avec une précision de masse comprise entre 10 et 50 ppm et 15% de couverture de la
séquence de la protéine, pour permettre une identification non ambiguë de la protéine dans les
banques de données (Mann et al., 1993, Mann et al., 2001).
Mode MS/MS : information de séquence
247
Annexes
La spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) est utilisée pour obtenir des informations
sur la structure des composés analysés. Ce type de configuration permet d’isoler un ion parent
dans le premier analyseur qui sera ensuite fragmenté dans le second. On peut ainsi obtenir des
informations de séquences en acides aminées sur un peptide isolé.
Les peptides se fragmentent principalement au niveau de la liaison peptidique (ions y et b).
Mais d’autres fragments sont également observés de part et d’autre de cette liaison (ions a, c
et x, z). Une première nomenclature a été introduite (Roepstorff & Fohlman, 1984), celle-ci a
été complétée et simplifiée par Biemann (1990) (Figure 4). On distingue deux types d’ions issus
de la fragmentation à basse énergie de la liaison peptidique : les ions a, b, c pour lesquels la
charge positive est portée par l’acide aminé N terminal et les ions x, y, z pour lesquels la charge
positive est portée par l’acide aminé C terminal (Figure 5). D’autres fragments peuvent être
également observés : les ions d, w et v dans le cas des fragmentations de haute énergie.
x3
R1 O
x2
R2 O
y2
z2
y1
R3 O
H+
R4
H2N+,+,+-+,+,$+-+,+,$+-$+,+,../
a1
a2
b2
c2
b3
Figure 4. Illustration de la nomenclature des fragmentations d’après Biemann (1990) sur un
tetrapeptide, les chaînes latérales sont notées R1, R2, R3 et R4.
Les ions les plus observés avec la technique MALDI-TOF/TOF (MS/MS) sont majoritairement
les ions y et les ions b, en raison de la fragilité de la liaison peptidique. Si on regarde les ions
d'une même série, la différence de masse entre deux pics consécutifs correspond à la valeur
d'un acide aminé perdu. Les séquences peptidiques sont déduites de la présence sur les
spectres, d'ions fragments dont les valeurs de m/z correspondent à des enchaînements d'acides
aminés déterminés. La MS/MS utilisée dans ce cas n'est applicable qu'à des composés de masse
modérés (3000 à 5000 Da est généralement un maximum).
Une séquence de 3 à 4 acides aminés consécutifs, combinés avec les masses des ions
fragments qui encadrent la séquence (i.e. la masse de départ et de fin de la série, ce qui spécifie
l'emplacement exact de la séquence dans le peptide) et la masse et séquence de l'ion parent,
issu de la digestion par endoprotéase spécifique, peuvent être suffisants pour identifier une
248
Annexes
protéine. Il s’agit d’une recherche par « tag ». Cette méthode s’appui du fait que les spectres
MS/MS contient au moins une courte séquence des ions fragments qui spécifie sans ambiguïté
une courte séquence d'acides aminés (Mann et al., 1993, Mann & Wilm, 1994, Mann et al.,
2001).
Figure 5. Formules semi-développées des ions issus de la fragmentation de peptides.
Interrogation des banques de données
Il existe une variété de banques protéiques. UniProtKB (Universal Protein Resource
Knowledgebase) est un répertoire centralisé de séquences et de fonctions de protéines. Il
regroupe les banques les plus couramment utilisées, telles que Swiss-Prot et TrEMBL. Ces
banques contiennent des séquences protéiques déterminées par séquençage direct et des
séquences déduites à partir des séquences codantes provenant des banques nucléotidiques
(EMBL).
La liste des masses théoriques et celle des masses expérimentales peuvent être comparées
par l’intermédiaire d’un logiciel Biotools (Bruker) à l’aide d’un moteur de recherche en utilisant
les serveurs locaux MASCOT (Matrix Science, London) ou au travers de serveur en accès libre
via Internet comme ExPASy du Swiss Institute of Bioinformatics (SIB) (www.expasy.ch).
Limites de l’approche
249
Annexes
Dans notre étude nous avons constaté que dans certains cas le pourcentage de
recouvrement s’est avéré insuffisant pour l’identification de protéines et que la confirmation de
séquences MS/MS a échoué pour plusieurs raisons, notamment :
-
la présence de plusieurs protéines dans l'échantillon ;
-
l’absence de la protéine étudiée dans les banques de données ;
-
les peptides générés par la digestion trypsique (inférieurs à 1000 Da) confondus avec les
pics des clusters de matrice ;
-
la protéine a généré peu de peptides dans la gamme de détection en mode réflecteur 5004000 Da (protéines avec un faible nombre de sites spécifiques de coupure pour la trypsine) ;
-
la présence de mutations dans la séquence de la protéine, de sorte que la masse mesurée
soit différente de la masse théorique attendue ;
-
la précision de mesure de masse médiocre (supérieure à 50-100 ppm) ;
-
la suppression du signal en fonction de la composition en acides aminés (i.e. acide aminé
chargé) des peptides ou des modifications apportées par le réactif alkylant (i.e. ATTO).
Les limites de la spectrométrie de masse MALDI-TOF/TOF
Une expérience de PMF-MALDI « idéale » voudrait qu’il n’y ait pas de pertes durant la
préparation de la protéine et une détection de tous les peptides générés. Ainsi, un spectre PMF
devrait contenir autant de pics qu'il existe de peptides. Mais cet idéal n’est pas envisageable. En
général, seul un petit pourcentage des peptides expérimentaux correspondent aux peptides
théoriques. La composition en acide aminé des peptides analysés, peut défavoriser
l’ionisation/détection en MALDI-TOF. Sachant que la nature des acides aminés constituant la
séquence peptidique influe sur les ions observés et que la charge est déterminée par le nombre
de résidus basiques. De plus, l'intensité de chaque pic n’est pas identique même si
théoriquement il y a la même quantité de chaque peptide. Ainsi, même si l’approche
d’identification par cartographie peptidique issu des analyses MALDI-TOF/TOF est la plus
fréquemment mise en œuvre, certains peptides de faibles intensités peuvent ne pas être isolés
et fragmentés ou donner des spectres difficilement interprétables.
La mise en évidence des modifications apportées par les réactifs alkylants a présenté
quelques difficultés car certains peptides à cystéines ont été souvent absents de la cartographie
250
Annexes
peptidique. Dans le cas spécifique de l’ATTO nous avons rencontré des problèmes dus au
phénomène d'extinction spectrale (l'ATTO apporte une charge négative) et aux ions
moléculaires de masses élevées, puisque même si l’on ne connaît pas exactement la
modification au niveau du résidu cystéine entrainée par l’ATTO 532, cette modification apport
probablement un ajout de masse de + 768 Da (selon la notice fournie par le fabricant).
Aspect quantification
La spectrométrie de masse, d'une manière inhérente, n'est pas une technique qui permet la
quantification. La hauteur d’un pic représente le courant ionique mesuré pour l’ion/peptide sur
le détecteur (normalisé sur le pic de base). Elle dépend non seulement de la concentration du
peptide mais aussi de son efficacité d’ionisation.
L’efficacité d’ionisation (nombre d’ions produits par molécule introduite dans la source) est
liée à des compétitions au niveau de la protonation des espèces et à la nature des molécules.
Ces deux facteurs feront que le nombre d’ions produits ne sera pas proportionnel aux espèces
introduites dans la source d’ions. Une molécule majoritaire dans la source peut donner un très
faible signal alors qu’une molécule minoritaire en termes de quantité dans la source peut
donner un signal très intense. Le coefficient de conversion ion/électron au niveau de la
détection est une fonction de la vitesse de l’ion et de sa masse, il augmente avec la vitesse de
l’ion mais décroît avec la masse. Un ion de faible masse moléculaire donnera un signal plus
élevé qu’un ion de même état de charge mais de masse plus élevée. Donc, relier l’intensité du
signal d’un ion à la quantité initiale de molécules produisant cet ion est très délicat et ne peut
pas être fait de manière simple.
Protéolyse enzymatique
Si la trypsine est l’enzyme la plus couramment utilisée, elle peut s’avérer dans certains cas
relativement inadaptée. En effet, la séquence primaire des prolamines présente la particularité
d’être constituée d’une large région répétée, dont les variations sont fréquentes, et de contenir
peu de sites de coupure à la trypsine (R et K). Ainsi, lors de la digestion trypsique, certains
peptides générés ont présenté des masses trop élevées et n’ont pas pu être détectés dans
l’intervalle de masses mesurées par l’instrument en mode réflecteur. Les mêmes extraits ont
été aussi analysés en mode linéaire, toutefois le pourcentage d’identification des peptides a été
significativement inférieur qu’en mode réflecteur.
251
Annexes
D’autres enzymes telles que la pepsine, la chymotrypsine et la thermolysine ont été testées
afin d’augmenter la couverture des peptides à à cystéines. Cependant, les enzymes testées ont
une plus faible spécificité (nombre de sites de coupures plus ou moins important) par rapport à
la trypsine, ce qui entraine une digestion moins « rigoureuse ». Après digestion à la
chymotrypsine et à la pepsine aucun peptide n’est identifié. En confrontant des m/z des
peptides analysés avec la liste des m/z générés par Sequence Editor à partir de séquences
connues, on constate que les masses théoriques ne correspondent pas aux masses mesurées.
Les bandes de gel digérées contiennent un mélange protéique et les protéolyses génèrent un
nombre important de peptides, ce qui rend l’analyse par MS complexe. Il peut en résulter une
superposition de pics, c’est à dire qu’un pic correspond à des peptides différents mais de masse
très proche.
De plus, l’analyse de masses inférieures à 800 Da est difficile à interpréter par la présence
des pics de clusters de matrice. La pepsine et la chymotrypsine génèrent un nombre élevé de
peptides de faible masse. Par exemple, après digestion trypsique la SG-HPM 1Bx20 présente un
total de 25 peptides de masse entre 800 et 16000 Da, dans le cas de la chymotrypsine 46
peptides de masse entre 500 et 4000 Da sont obtenus. En ce qui concerne la thermolysine une
autre difficulté a été rencontrée, cette enzyme ne figure pas dans Mascot et n’a pas pu être
utilisée pour les protéines qui ne sont pas répertoriées dans les banques de données.
252
Annexes
Annexe 2. Alignement des séquences en acides aminés des SG-HPM de type y.
L’alignement a été effectué avec le programme Align (Expasy). Les numéros d’entrée Uniprot
sont indiqués : Q84TG6 (1By8), B8PSA6 (1By15), A5HMG2 (1By16) et Q03871 (1By9). En gris, les
résidus conservés et en rouge, les résidus cystéines.
253
Annexes
Annexe 3. Exemple d’une recherche sur Mascot.
Protéine identifiée A2TN61 (SG-FPM 4).
254
2
3@+3" #& %%1$%$$ % #0/#0/#0$%L 2C+
1040,534 Da et NNN);
N!*,M-(
Abs. Int. * 1000
y
R
L
Q
Q
C*
3
2
y7
1
y5
y1
y2
y4
y3
a7
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
m/z
Q C C Q Q L R
Ion
a
b
c
y
z+2
1
Q
Q
Q
Q
Q
7
2
C*
C*
C*
C*
C*
6
3
C*
C*
C*
C*
C*
5
4
Q
Q
Q
Q
Q
4
5
Q
Q
Q
Q
Q
3
6
L
L
L
L
L
2
7 1
R
R
R
R
R
1
Gln
Cys
Cys
2
101.071
129.066
146.092
175.119
160.108
Arg
Gln
3
309.138
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Leu
Gln
4
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Gln
Leu
5
6
597.227
625.222
642.249
544.320
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Gln
Arg
7
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753.281
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Cys
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Cys
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Gln
ions y
175.119
288.203
416.262
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704.351
912.418
1040.476
différence
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128.059
128.058
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128.058
Ajout d’une
131.084
146.059
146.058
178.031
226.067
146.058
L
Q
Q
C
C
(Cys-CAM)
(Cys-PE)
molécule
H2O
résidu
R
#33
f2
f1
Q
2
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Intens. [a.u.]
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1720
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1780
1800
Intens. [a.u.]
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1.0
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2080
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2160
m /z
#34
2
3G+"0%# 4*=L3%#%#4 .0$%$$4#&0%#0C+
Intens. [a.u.]
). =' C 9, A!B 1 C /? A#B( 7 '!
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2000
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2100
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2130
Intens. [a.u.]
m /z
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m /z
#3"
2
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'57
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m/z
#35
2
3O+"0%# "#;;EQL3%#%4$ .0$%$#&0%#0C+
Intens. [a.u.]
).
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1525
1550
1575
m/z
#3*
Travaux rélatifs à cette étude
Travaux relatifs à cette étude
Publication dans des revues internationales à comité de lecture
Ferreira, M.S.L., Martre, P., Mangavel, C., Girousse, C., Rosa, N.N., Samson, M.F. and Morel,
M.H. Physicochemical control of durum wheat grain filling and glutenin polymers assembly
under different temperature regimes, Journal of Cereal Science. Submitted.
Ferreira, M.S.L., Morel, M.H., Bonicel, J.J. and Samson, M.F. Changes in redox status of T.
durum: Relationship between endosperm cell redox homeostasis and the glutenin
polymerization in developing durum wheat. Publication in preparation.
Ferreira, M.S.L., Bonicel, J.J., Samson, M.F. and Morel, M.H. How are glutenin polymers
assembled during grain filling in durum wheat? Publication in preparation.
Actes de congrès scientifique
Ferreira, M.S.L., Bonicel, J., Rosa, N.N., Samson, M.F. and Morel, M.H. 2010. How are gluten
polymers assembled during grain filling in durum wheat? In: Gluten Proteins 2009, Branlard, G.,
ed., INRA, Paris, France, 28-32.
260
Travaux rélatifs à cette étude
Communications orales à des congrès scientifiques
Ferreira, M.S.L., Bonicel, J., Mangavel, C., Samson, M.F., Rogniaux, H. and Morel, M.H.
Dynamique d’assemblage des protéines de réserve lors du développement du grain de blé dur.
Journée de l’École Doctorale SP-SA, 22 juin 2010, Montpellier, France.
Ferreira, M.S.L., Bonicel, J., Rosa, N.N., Samson, M.F. and Morel, M.H. How are Gluten
Polymers assembled during durum wheat grain filling? Xth International Gluten Workshop, 7-9
September 2009, Clermont-Ferrand-France.
Ferreira, M.S.L., Rosa, N.N., Bonicel, J., Morel, M.H. and Samson, M.F. Activité antioxydante et
accumulation des protéines de réserve chez le grain de blé dur (Triticum durum). GRAINES
2009, 2ème Colloque National du réseau Français de Biologie des graines, 4-5 juin 2009, Paris,
France.
Communications affichées à des congrès scientifiques
Rosa, N.N., Ferreira, M.S.L., Bonicel, J., Samson, M.F. and Morel, M.H. Change in starch
granule size distribution during durum wheat grain development. Xth International Gluten
Workshop, 7-9 September 2009, Clermont-Ferrand-France.
Ferreira, M.S.L., Bonicel, J., Rosa, N.N., Morel, M.H. and Samson, M.F. Activité antioxydante et
accumulation des protéines de réserve chez le blé dur. Journée de l’Ecole Doctorale SP-SA, 18
juin 2009, Montpellier, France.
Ferreira, M. S. L., Bonicel, J., Abecassis, J., Samson, M. F. and Morel, M. H. Changes in the
redox status of Triticum durum endosperm during grain filling. From Seed to Pasta: The Durum
Wheat Chain – International Durum wheat Symposium, June 30- July 3 2008, Bologna, Italy.
261
*
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