la goutte epaisse, la methode qbc, la sonde a adn, la

ETUDE COMPARATIVE DE CINQ METHODES DE
DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DU PALUDISME :
LA GOUTTE EPAISSE, LA METHODE QBC,
LA SONDE A ADN, LA PCR ET LE PARASIGHT F TEST
O. GAYE*, G. MC LAUGHLIN**, M. DIOUF*, S. DIALLO*
RESUME
22 échantillons sanguins ont été analysés par la goutte
épaisse, la méthode QBC, la PCR, la sonde à ADN et le
ParaSight F test qui détecte l’antigène histidine rich
Protein II de Plasmodium falciparum. Le ParaSight F
test a trouvé les mêmes échantillons positifs en goutte
épaisse avec une correspondance entre l’intensité des
réactions colorimétriques et les densités parasitaires.
Le QBC et la PCR ont détecté en plus les parasites au
niveau d’un échantillon non trouvé positif par les
2 autres et la PCR a trouvé positif en plus un échantillon non détecté par les 3 autres.
Les différentes méthodes ont aussi été comparées selon
l’équipement et les réactifs utilisé d’une part, et d’autre
part selon la rapidité de leur réalisation. Le ParaSight
II peut ainsi être utile dans les zones où P. falciparum
est l’espèce dominante, où le paludisme peut revêtir des
allures épidémiques et où un examen microscopique de
qualité n’est pas réalisable. La persistance de l’antigénémie après guérison et sa monospécificité vis-à-vis de
P. falciparum constituent des inconvénients majeurs.
Au vu des avantages et inconvénients des dif f é re n t s
tests, la goutte épaisse demeure pour le moment le test le
plus approprié.
Mots-clés : Goutte épaisse, QBC, PCR, Sonde ADN,
ParaSight F test, paludisme.
ABSTRACT
A comparison of thick smears, QBC malaria, Enzymelinked DNA, PCR and the ParaSight F assay in
Plasmodium falciparum diagnosis
A battery of 22 blood samples from Senegal was
analysed using thick smear microspcopy, QBC malaria
analysis, PCR, Enzyme-linked synthetic DNA, and the
* Service de Parasitologie, Faculté de Médecine, UCAD, Dakar, Sénégal.
** Department of pathology and laboratory Medicine, Indiana University
School of Medicine.
Médecine d'Afrique Noire : 1998, 45 (4)
new Becton Dickinson ParaSight F test which detect the
histidine rich protein II antigen of Plasmodium
falciparum. The ParaSight F test detected the same
positive samples as were detected by thick smear
m i c roscopy with general agreement between signal
intensities and parasite densities. One additional
positive sample was detected both by QBC analysis and
the PCR detected two additional samples not detected
by the other methods. the enzyme-linked DNA probe
assay fail to detect one low positive sample. Assays were
also compared with regard to the expense of equipment
ad reagents and speed and ease of use. The rapid
ParaSight F test can be performed with minimal training and may be specially usefull in areas where P. falciparum is the predominant malaria species, in epidemic
malaria regions, and where skilled microscopy is not
readily available.
Key-words : Thick-smear, QBC, PCR, Enzyme-linked
DNA, ParaSight F test, Malaria.
I - INTRODUCTION
Le paludisme demeure la plus importante maladie parasitaire, responsable environ d’un million de décès chaque
année.
L’augmentation de la morbidité et des souches de Plasmodium falciparum chimiorésistantes incitent à améliorer
les méthodes de diagnostic de la parasitose.
L’examen microscopique des étalement sanguins est la
méthode de choix. D’autres techniques sont en train d’être
évaluées : les sondes à ADN (1, 3, 5, 8, 11, 12), la PCR (2,
4, 9, 13), la méthode QBC (10) et le ParaSight F test mis au
point par les laboratoires Becton Dickinson. Ce dernier
détecte l’antigène Histidine Rich Protein sécrété au cours
de l’accès palustre ; c’est une réaction qui utilise des anti-
ETUDE COMPARATIVE…
corps spécifiques et l’antigène est révélé sur une bandelette
sous forme d’une coloration rose.
La plupart des études n’ont pas comparé plus de 3 techniques entre elles.
Le but de celle-ci était de comparer en même temps 5
méthodes de diagnostic du paludisme à Plasmodium
falciparum en prenant tour à tour chacune comme méthode
de référence, la goutte épaisse, le QBC, la PCR, une sonde
à ADN et le ParaSight F test.
II - PATIENTS, MATERIELS ET METHODES
Au cours du mois d’août 1993, 22 patients présentant des
signes évocateurs de paludisme ont été recrutés dans un
dispensaire de Pikine situé dans la banlieue de Dakar au
Sénégal. Les âges des patients répartis en 14 femmes et
8 hommes variaient de 18 à 55 ans.
Des prélèvements de sang à la pulpe du doigt ont été réalisés pour la confection de gouttes épaisses. Après coloration au Giemsa et identification des plasmodium, la densité parasitaire a été calculée sur la base de 8000 leucocytes
par µl.
Pour le test QBC, le sang recueilli sur un tube à hématocrite contenant de l’acridine orange (tube QBC) est
ensuite centrifugé à 12000 t/mn pendant 5 mn puis l’identification est faite par lecture au microscope à fluorescence
(10).
La PCR a été réalisée selon le protocole suivant :
Après extraction à partir de 100 microlitres de sang par la
méthode Isoquick (Bio101, San Diego) l’ADN est ensuite
resuspendue dans 100 microlitres d’une solution 0,1 TE
puis dilué au dixième dans de l’eau. chaque tube d’amplification contient 3 microlitres du DNA dilué, 10 microlitres
de tampon de réaction 10X (100 mM tris à pH 8, 500 mM
KCL, 15 mM Mgcl2), 5 microlitres de chaque amorce, 18
AP853 et 18AP1488 obtenus à partir d’une séquence
spécifique de l’ADN ribosomal du groupe des Apicomplexa, 61,5 microlitres H2O stérile, 0,5 unités de polymérase et 2 microlitres de dNTP (Kit Perkin Elmer Cetus).
Une phase initiale de dénaturation pendant 2 minutes à 94°
suivie de 30 cycles comprenant chacun 3 étapes : 1 minute
de dénaturation, 1 minute d’hybridation à 58° et 1 minute
d’élongation à 72°. Une phase d’élongation supplémentaire
à 72° pendant 5 minutes termine l’amplification. Les pro-
245
duits amplifiés (600 bp) sont révélés par électrophorèse sur
gel d’agarose à 2 % et photographiés en immunofluorescence après coloration à l’éthidium bromide (13).
L’extrême sensibilité de la PCR peut aboutir à des faux
positifs ; aussi un témoin négatif a été ajouté dans la série
des prélèvements à examiner.
La sonde à ADN : Une sonde synthétique de DNA
couplée à la phosphatase alcaline (PFR1-AP) est utilisée
(11). 2 séries d’échantillons de sang sont mis en contact
avec la sonde et la réaction est révélée par coloration du filtre par le NBT/BCIP ou par chemiluminescence utilisant
0,1 mg/ml de Lumiphos 540 (Tropix) et le film rayon X.
L’intensité des réactions positives a été établie selon une
échelle allant de 0 à 4 + (11).
ParaSight F test : Suivant les instructions du fabricant
50 microlitres de sang total de chaque échantillon sont
mélangés avec 3 gouttes d’une solution hémolysante. Une
goutte de ce sang hémolysé et filtré déposée à la base de
bandelettes contenant des anticorps monoclonaux spécifiques antihistidine II, puis une goutte d’un agent de révélation contenant des liposomes est ajoutée. La positivité du
test est affirmée par l’apparition d’une ligne rose à la base
des bandelettes. L’intensité de la coloration est déterminée
suivant une échelle de 0 à 4+. Une coloration de contrôle
identifiable au niveau des bandelettes témoigne de la bonne
réalisation du test.
Analyse statistique : La sensibilité, la spécificité, les
valeurs prédictives positives et négatives et la concordance
entre les différents test ont été calculées en utilisant
successivement chacune des techniques comme méthode
de référence.
III - RESULTATS
10 échantillons ont été retrouvés positifs avec présence de
P. falciparum à des parasitémies variant de 2156 à 164.160
parasites par microlitre (tableau I).
Goutte épaisse
10 échantillons ont été retrouvés positifs avec présence de
P. falciparum à des parasitémies variant de 2156 à 164.160
parasites par microlitres (Tableau I).
Médecine d'Afrique Noire : 1998, 45 (4)
O. GAYE, G. MC LAUGHLIN, M. DIOUF, S. DIALLO
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Tableau I : Comparaison de 5 tests pour le diagnostic du paludisme
Echantillon
Parasitémie
QBC
PCR
Parasight
PFR1- AP
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
25,360
121,920
81,440
54,000
2,156
164,160
41,200
49,000
40,880
121,440
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
nd
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
2+
3+
3+
4+
1+
2+
2+
4+
4+
1+
-
2+
4+
4+
4+
1+
4+
3+
3+
3+
-
QBC
Sur les 21 échantillons examinés (un récolté sans anticoagulant n’ayant pu être examiné faute de buffy coat),
9 soit 43 % ont été retrouvés positifs aussi bien par goutte
épaisse que par QBC et 11 soit 52 % étaient négatifs avec
les 2 méthodes. Un échantillon retrouvé positif par QBC et
négatif avec la goutte épaisse a été identifié positif avec la
PCR.
Si la goutte épaisse est prise comme méthode de référence,
la sensibilité du QBC était de 100 %, la spécificité de
92 %, la valeur prédictive positive de 90 %, la valeur prédictive négative de 100 % et la concordance avec la goutte
épaisse de 95 %.
PCR
10 échantillons sur les 22 soit 45 % étaient positifs en
goutte épaisse et PCR. 3 soit 14 % étaient négatifs à la
microscopie mais positifs avec la PCR qui a détecté 2
échantillons de plus que le QBC ; la sensibilité de la PCR
était de 100 %, la spécificité de 75 %, la valeur prédictive
positive de 77 %, la valeur prédictive négative de 100 % et
la concordance avec la goutte épaisse de 86 %.
Médecine d'Afrique Noire : 1998, 45 (4)
Sonde à ADN
il y avait une correspondance entre l’hybridation et la goutte épaisse sauf au niveau de l’échantillon n°8 présentant
une faible parasitémie (2156 p/mm3) qui n’a pas été retrouvé positif par la sonde à ADN. L’intensité des réactions
était comparable entre la coloration par le NBT/BICP et les
rayons X, de même qu’avec le ParaSight (Tableau I).
La goutte épaisse étant prise comme méthode de référence,
la sensibilité de la sonde était de 90 %, la spécificité de
100 %, la valeur prédictive positive de 100 %, la valeur
prédictive négative de 92 % et la concordance de 95 %.
ParaSight F test
Chaque test a été réalisé entre 5 et 15 minutes. De fortes
colorations positives (3+ à 4+) ont été visibles à la base des
bandelettes après 5 minutes. Tous les échantillons retrouvés
positifs avec la goutte épaisse l’ont été également avec le
ParaSight. Un échantillon négatif avec le ParaSight F a été
retrouvé positif aussi bien par QBC que par PCR.
Utilisant la goutte épaisse comme méthode de référence, la
sensibilité, la spécificité, les valeurs prédictives négative et
ETUDE COMPARATIVE…
247
positive et la correspondance étaient de 100 %. L’intensité
de la réaction positive obtenue avec le ParaSight F test était
généralement bien correlée avec la parasitémie déterminée
en goutte épaisse.
Tableau II : Comparaison de la goutte épaisse prise comme méthode de référence aux autres méthodes de diagnostic
Micro+
Micro-
Total
PCR+
PCR-
10
0
3
9
13
9
Total
10
12
22
Micro+
Micro-
Total
ParaSight +
ParaSight -
10
0
0
12
10
12
Total
10
12
22
IV - DISCUSSION
22 prélèvements de sang ont été analysés avec 5 méthodes
de diagnostic. Les essais avec la PCR ont été répétés 2 fois
et régulièrement ont détecté 3 fois plus de positifs que la
microscopie et le ParaSight F test. Il est généralement
admis que la PCR est plus sensible (4, 13). Sur la totalité
des prélèvements nous avons observé 3 faux négatifs en
goutte épaisse, ParaSight et hybridation avec la sonde à
ADN et 2 en QBC. Il faut cependant noter que l’existence
de réactions faussement positives du fait de la grande sensibilité de la PCR est un problème courant (13).
La sonde à ADN n’a pas détecté les plasmodium au niveau
d’un échantillon présentant pourtant une parasitémie plus
forte (2156p/µl) que son seuil de détection sur sang frais
qui est de 30 à 100p/µl (14). Bien que la sonde soit stable,
de nombreuses congélations et décongélations peuvent
décolorer le filtre et occasionnellement décroître la sensibilité du test (4).
Il faut préciser cependant que les densités parasitaires de
nos échantillons étaient particulièrement élevées et la plupart de nos patients présentaient probablement une infection récente ; les prélèvements ont été effectués au début de
la période de transmission et l’infection survient en général
chez des populations non ou semi-immunes.
Les différents critères d’évaluation varient selon la méthode choisie comme référence. Si le QBC est la méthode de
référence, les sensibilités seraient respectivement : de
100 %, 91 %, 91 % et 82 % pour la PCR, la goutte épaisse,
Micro+
Micro-
Total
QBC+
QBC-
9
0
1
11
10
11
Total
9
12
21
Micro+
Micro-
Total
PFR1Ap+
PFRAp-
9
1
0
12
9
13
Total
10
12
22
le ParaSight et la sonde à ADN ; la concordance serait au
moins de 90 %. Si la PCR est prise comme méthode de
référence, les sensibilités seraient respectivement de 85 %,
77 %, 77 % et 70 % pour le QBC, la goutte épaisse, le
ParaSight F test et la sonde à ADN ; les concordances
seraient supérieures ou égales à 85 %.
La rapidité dans l’établissement du diagnostic, la facilité
d’exécution de la technique employée, les équipements
utilisés et les coûts des réactifs sont des facteurs importants
qu’il faut prendre en compte pour le choix de la méthode
de diagnostic.
Chaque technique a ses avantages et ses limites ; la goutte
épaisse quand elle est réalisée correctement à un seuil de
détection de 10 parasites par microlitre ; elle est sensible,
permet de quantifier la parasitémie, son coût est abordable (5
FF) et elle ne nécessite pas de matériels sophistiqués pour sa
réalisation. Sa correcte réalisation suppose cependant
disposer d’un bon microscope et d’un bon technicien (2).
Le QBC présente une meilleure sensibilité, une rapidité de
réalisation et de lecture, et un apprentissage rapide, mais
elle requiert des équipements et consomme beaucoup de
réactifs.
La sonde à ADN et la PCR sont utiles dans les études portant sur de grands effectifs. Elles permettent une identification des souches plasmodiales. Etant plus sensibles elles
sont appropriées en cas de faibles parasitémies. Cependant,
la cherté des équipements, la lenteur des réactions (8 heures
dans la PCR) et le coût élevé des réactifs utilisés constituent de sérieux inconvénients.
Médecine d'Afrique Noire : 1998, 45 (4)
O. GAYE, G. MC LAUGHLIN, M. DIOUF, S. DIALLO
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Le ParaSight F test ne requiert pas les équipements utilisés
and les autres essais de cette étude ; la détection de l’antigène est simple, rapide, réalisable par un personnel moyennement formé ; les réactifs par ailleurs sont stables et
transportables facilement. Aussi le ParaSight F test peut
être indiqué là où l’examen microscopique n’est pas disponible. Il pourra être utilisé pour le diagnostic de l’accès
aigu d e paludisme à P. falciparum en vue de la mise en
route rapide du traitement.
La persistance de l’antigénémie après guérison constitue
cependant le gros inconvénient de ce test . En effet, avec
l’exigence de surveiller la chimiorésistance de P. falciparum ceci constitue un sérieux handicap pour juger de
l’échec parasitologique. Par ailleurs ce test n’est spécifique
que de P. falciparum et limite ainsi grandement son utilisation pour le diagnostic d’espèce même si dans nos zones P.
falciparum domine dans 95 % des cas.
Il est évident par ailleurs que le choix d’une méthode
dépendra également de l’objectif recherché. La PCR et la
méthode QBC sont particulièrement indiquées dans les études portant sur des populations importantes et ayant trait à
l’épidémiologie, aux évaluations des mesures de lutte, à
l’identification des souches parasitaires.
Le paludisme à P. falciparum est grave chez les populations
non immunes comme c’est le cas dans les zones où il est
hypoendémique et saisonnier ; là il peut avoir des allures
épidémiques avec des parasitémies élevées (6). Dans ce
contexte épidémiologique la survenue de plus en plus
d’échecs thérapeutiques (7) dus le plus souvent à des traitements inadaptés par défaut de diagnostic biologique doit
conduire à une meilleure codification des techniques. La
goutte épaisse et le ParaSight F test peuvent être utiles dans
ces conditions, permettant la mise en route d’un traitement
rapide, efficace et d’un coût supportable par les populations
de nos pays.
Au vu des tous les avantages et limites des différents tests,
la goutte épaisse reste actuellement celui qui remplit les
meilleurs conditions optimales d’utilisation en zone d’endémie palustre.
Remerciements
Nous remerçions J. PERRONE de Becton Dickinson Corporation pour l’octroi du test ParaSight.
Support financier
Cette étude a reçu un support financier du programme
Fullbrigt octroyé à O. GAYE et une subvention TDR accordée à G. Mc LAUGHLIN.
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