MALADIE DE NEWCASTLE

Transcription

CHAPITRE 2.1.15.
MALADIE DE NEWCASTLE
RÉSUMÉ
La maladie de Newcastle est due à un paramyxovirus aviaire de sérotype 1 (APMV-1), du genre
Avulavirus, appartenant à la famille des paramyxoviridés. Il existe 9 sérotypes de paramyxovirus
aviaires appelés APMV-1 à APMV-9.
La sévérité de la maladie provoquée par le virus chez les oiseaux varie considérablement selon la
souche virale impliquée. Les souches les moins virulentes peuvent induire une maladie grave en
présence d'autres micro-organismes ou de certaines conditions environnementales. La méthode de
diagnostic préférée est l'isolement du virus suivi de sa caractérisation.
Identification de l’agent pathogène : des suspensions préparées dans une solution
d'antibiotiques à partir d’écouvillonnages trachéaux et cloacaux (ou de matières fécales) pour les
oiseaux vivants, ou à partir de matières fécales et de prélèvements d'organes regroupés pour les
sujets morts, sont inoculées dans la cavité allantoïque d’œufs de poule embryonnés, de 9 à
11 jours. Les oeufs sont mis à incuber à 37°C pendant 4 à 7 jours. Les oeufs contenant des
embryons morts ou moribonds (à mesure qu’ils apparaissent) et tous les oeufs restants à la fin de
la période d'incubation sont examinés pour rechercher l'activité hémagglutinante dans le liquide
allantoïque.
Toutes les substances hémagglutinantes doivent être testées pour rechercher l'inhibition spécifique
avec un antisérum monospécifique dirigé contre le virus de la maladie de Newcastle. Ce virus
(APMV-1) peut présenter certaines relations antigéniques croisées avec d’autres sérotypes de
paramyxovirus aviaires, notamment APMV-3 et APMV-7.
Le pouvoir pathogène de tout virus nouvellement isolé peut être évalué en déterminant le délai
moyen de l’effet létal sur des embryons de poulets, l’indice de pathogénicité intracérébrale chez des
poussins d'un jour ou l’indice de pathogénicité intraveineuse chez des poulets de 6 semaines.
Certains pays utilisent des variantes de ces techniques standards. Le pouvoir pathogène des
souches isolées peut également être évalué à l’aide de techniques moléculaires telles que la
transcription inverse couplée à une amplification en chaîne par polymérase (RT-PCR) et le
séquençage. L'isolement et la caractérisation des souches pathogènes suspectées du virus doivent
être conduits dans un laboratoire réunissant les conditions de sécurité biologique nécessaires pour
les virus.
Épreuves sérologiques : l'inhibition de l'hémagglutination est très largement utilisée pour la
recherche sérologique de la maladie de Newcastle. Son utilité diagnostique dépend du statut
immunitaire vaccinal des oiseaux examinés et des conditions sanitaires qui prévalent.
Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique :
selon la situation sanitaire, la vaccination des volailles repose sur l'utilisation de virus vivants
faiblement virulents (lentogènes) ou modérément virulents (mésogènes). On utilise également des
vaccins inactivés.
Différentes voies d'administration peuvent être utilisées chez les volailles pour les vaccins vivants.
Les vaccins sont généralement produits en recueillant les liquides infectieux
allantoïques/amniotiques après inoculation d’œufs de poule embryonnés ; certains sont préparés à
partir de cultures cellulaires infectées. Le produit fini est obtenu en portant les semences primaires
et les semences de travail au volume voulu pour la production.
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Manuel terrestre de l’OIE 2005
Chapitre 2.1.15. — Maladie de Newcastle
Les vaccins inactivés sont administrés par voie intramusculaire ou sous-cutanée. Ils sont
généralement produits par addition de formol aux préparations virales infectieuses ou par traitement
à la bêta-propiolactone. La plupart des vaccins inactivés sont présentés en émulsion dans une huile
minérale ou végétale.
Si des virus pathogènes sont utilisés pour produire des vaccins ou effectuer des épreuves
virulentes, les installations doivent répondre aux exigences de l'OIE en matière de confinement des
agents pathogènes (classe 4).
A. INTRODUCTION
La maladie de Newcastle est due à un paramyxovirus aviaire de sérotype I (APMV-I), du genre Avulavirus,
appartenant à la sous-famille des paramyxovirinés et à la famille des paramyxoviridés. Les paramyxovirus isolés
des espèces aviaires ont été classés d'après les épreuves sérologiques en 9 sérotypes appelés APMV-1 à
APMV-9 ; le virus de la maladie de Newcastle est connu sous la dénomination « APMV-1 » (4).
Depuis son identification en 1926, la maladie de Newcastle est considérée comme enzootique dans de nombreux
pays. La vaccination préventive est pratiquée dans presque tous les pays qui produisent des volailles à l'échelle
industrielle.
L'une des caractéristiques majeures du virus est la forte variation du pouvoir pathogène des différentes souches
virales chez les poulets. Les souches virales ont été classées en 5 pathotypes sur la base des signes cliniques
observés chez les poulets infectés (13), à savoir :
1.
les souches viscérotropes vélogènes hautement pathogènes qui provoquent fréquemment des lésions
intestinales hémorragiques ;
2.
les souches neurotropes vélogènes qui provoquent une forme se caractérisant par une mortalité massive,
généralement à la suite de signes respiratoires et nerveux ;
3.
les souches mésogènes qui provoquent une forme se caractérisant par des signes respiratoires, des signes
nerveux occasionnels mais une faible mortalité ;
4.
les souches lentogènes ou respiratoires qui provoquent une forme se traduisant par une infection
respiratoire mineure ou infraclinique ;
5.
les souches asymptomatiques entériques qui provoquent une forme se traduisant généralement par une
infection intestinale infraclinique.
Le classement par pathotypes produit rarement des catégories bien distinctes (6) et même les infections
provoquées chez des oiseaux indemnes d’organismes pathogènes spécifiques peuvent donner lieu à des
chevauchements considérables. Il peut aussi se produire une exacerbation des signes cliniques induits par les
souches les moins virulentes en cas d’infection concomitante par d'autres micro-organismes ou en présence de
certaines conditions environnementales.
Étant donné que les manifestations cliniques varient considérablement chez les poulets et que le diagnostic peut
être compliqué par la variabilité des réponses entre les hôtes, les signes cliniques ne sont pas suffisants pour
poser un diagnostic de maladie de Newcastle. Les signes et les lésions typiquement associés aux pathotypes
virulents feront toutefois fortement suspecter la maladie.
B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC
1.
Identification de l’agent pathogène
a)
Prélèvements destinés à l'isolement du virus
Lorsque la maladie de Newcastle est recherchée en présence d'une maladie sévère et d'une mortalité
massive dans un élevage de poulets, il est habituel de tenter d'isoler le virus chez des oiseaux morts
récemment ou bien trouvés moribonds et mis à mort dans des conditions décentes. Prélèvements à
effectuer chez les oiseaux morts : écouvillonnages de la sphère oro-nasale et prélèvements tissulaires sur
les poumons, les reins, l'intestin (y compris le contenu), la rate, le cerveau, le foie et le cœur. Ces
307
prélèvements peuvent être recueillis séparément ou bien regroupés, quoique les prélèvements intestinaux
soient généralement traités à part.
Les prélèvements à effectuer chez les oiseaux vivants doivent inclure à la fois des écouvillonnages
trachéaux et cloacaux, ces derniers devant être visiblement enrobés de matières fécales. Les oiseaux petits
et fragiles peuvent être lésés par l'écouvillonnage et le recueil de matières fécales fraîches peut constituer
une alternative correcte.
Lorsque la possibilité d'obtenir des prélèvements est limitée, il est important d'examiner des écouvillonnages
cloacaux (ou des matières fécales) et des écouvillonnages trachéaux (ou du tissu trachéal) ainsi que des
organes et des tissus apparaissant lésés à l'œil nu ou connus pour être associés aux formes cliniques de la
maladie. Les échantillons doivent être prélevés aux stades précoces.
Les prélèvements sont placés dans une solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS) isotonique,
de pH 7,0 à 7,4, additionné d’antibiotiques. Les antibiotiques peuvent varier selon les conditions locales. On
peut utiliser par exemple la pénicilline (2 000 unités/ml), la streptomycine (2 mg/ml), la gentamycine
(50 µg/ml) et la mycostatine (1 000 unités/ml) pour les tissus et les écouvillonnages trachéaux, mais il faut
des concentrations 5 fois plus élevées pour les matières fécales et les écouvillonnages cloacaux. Il est
important de réajuster la solution à pH 7,0-7,4 après avoir ajouté les antibiotiques. Les matières fécales et
les coupes tissulaires minces doivent être préparées sous forme de suspensions à 10-20 % (p/v) dans la
solution d'antibiotiques. Les suspensions doivent être traitées dès que possible après incubation pendant 1 à
2 h à température ambiante. Lorsqu'il n'est pas possible de traiter les prélèvements immédiatement, ceux-ci
peuvent être conservés à 4°C pendant un maximum de 4 jours.
b)
Culture du virus
Les surnageants des matières fécales ou des suspensions tissulaires, obtenus par une clarification par
centrifugation à 1 000 g pendant environ 10 min à une température ne dépassant pas 25°C, sont inoculés
sous des volumes de 0,2 ml dans la cavité allantoïque d'au moins 5 œufs de poule embryonnés, indemnes
d’organismes pathogènes spécifiques, incubés pendant 9 à 11 jours. Après inoculation, les oeufs sont mis à
incuber à 35 ou 37°C pendant 4 à 7 jours. Les oeufs contenant des embryons morts ou moribonds (à
mesure qu'ils apparaissent) et tous les oeufs restants à la fin de la période d'incubation doivent être refroidis
à 4°C afin de rechercher l'activité hémagglutinante dans le liquide allantoïque. Les liquides allantoïques
donnant une réaction négative doivent être repassés sur une nouvelle série d’œufs.
c)
Identification du virus
L'activité hémagglutinante décelée dans les liquides bactériologiquement stériles recueillis sur des oeufs
inoculés peut être due à la présence de n'importe lequel des 15 sous-types d’hémagglutinine du virus de
l'influenza A ou à l'un des 8 autres sérotypes de paramyxovirus (un liquide non stérile pourrait contenir de
l’hémagglutinine bactérienne). Le virus de la maladie de Newcastle peut être confirmé par l'utilisation
d'antisérum spécifique dans un test d'inhibition de l'hémagglutination. On utilise généralement de l'antisérum
de poulet dirigé contre une souche du virus de la maladie de Newcastle.
Les réactions croisées se produisant dans les tests d'inhibition de l'hémagglutination entre le virus de la
maladie de Newcastle et certains autres paramyxovirus aviaires, notamment les sérotypes APMV-3 et
APMV-7, risquent d’être sources de problèmes qui se résolvent en utilisant des antigènes et des antisérums
témoins appropriés.
d)
Indices de pathogénicité
Compte tenu de la très forte variation de virulence entre les différentes souches virales isolées et de la large
utilisation des vaccins vivants, l'identification d'une souche en tant que virus de la maladie de Newcastle
chez des oiseaux présentant des signes cliniques ne confirme pas ce diagnostic. Il est par conséquent
également indispensable d'évaluer la virulence de la souche (voir la Section B.1.f. ci-après intitulée
« Définition de la maladie de Newcastle »). Plusieurs tests in vitro possibles pour établir la virulence sont
actuellement étudiés par différents groupes de chercheurs dans le monde ; ils portent généralement sur les
bases moléculaires du pouvoir pathogène (voir la Section B.1.e. ci-après). L’évaluation définitive de la
virulence du virus repose aujourd’hui en principe sur une ou plusieurs des épreuves in vivo décrites ci-après,
bien que la définition actuelle de l'OIE (voir la Section B.1.f.) autorise une évaluation moléculaire de la
virulence.
308
•
Délai moyen de l'effet létal sur les oeufs
i)
Du liquide allantoïque frais, contaminé par le virus mais bactériologiquement stérile, est dilué
dans du soluté stérile de chlorure de sodium afin d’obtenir des dilutions en série au 10e comprises
entre 10–6 et 10–9.
ii)
Un volume de 0,1 ml de chaque dilution est inoculé dans la cavité allantoïque de 5 œufs de poule
embryonnés de 9 à 10 jours, indemnes d’organismes pathogènes spécifiques ; ces oeufs sont alors
mis à incuber à 37°C.
iii)
Les dilutions virales restantes sont conservées à 4°C et une inoculation de 0,1 ml de chaque dilution
est effectuée 8 h plus tard dans 5 autres œufs, mis ensuite à incuber à 37°C.
iv)
Chaque œuf est examiné 2 fois par jour pendant 7 jours et la date et l’heure de toute mort
embryonnaire sont relevées.
v)
La dose létale minimale est la dilution virale la plus élevée qui provoque la mort de tous les embryons
inoculés.
vi)
Le délai moyen de l'effet létal est la durée moyenne, en heures, nécessaire pour obtenir la mort de tous
les embryons inoculés avec la dose létale minimale.
vii)
Le délai moyen de l'effet létal a été utilisé pour répartir les souches du virus de la maladie de
Newcastle dans les groupes suivants : souches vélogènes (mort des embryons en moins de 60 h),
souches mésogènes (mort en 60 à 90 h) et souches lentogènes (mort en plus de 90 h).
•
Indice de pathogénicité intracérébrale
i)
Du liquide allantoïque infectieux frais présentant une activité hémagglutinante de titre >24 (>1/16) est
dilué au 10e dans du soluté isotonique de chlorure de sodium stérile, sans autres additif du type
antibiotique.
ii)
Un volume de 0,05 ml de la dilution virale est injecté par voie intracérébrale chez 10 poussins issus
d’œufs provenant d'un élevage indemne d’organismes pathogènes spécifiques. Les poussins doivent
avoir plus de 24 h et moins de 40 h au moment de l'inoculation.
iii)
Ils sont ensuite examinés toutes les 24 h pendant 8 jours.
iv)
À chaque observation, le score suivant est attribué : 0 si l'état est normal, 1 si le poussin est malade et
2 s'il est mort. (Pour les poussins morts, le chiffre 2 doit être réattribué lors de chacune des cotations
journalières restantes.)
v)
L'indice de pathogénicité intracérébrale est le score moyen obtenu par poussin et par observation sur
cette période de 8 jours.
Les virus les plus virulents donnent des indices qui approchent le score maximal de 2,0 alors que les
souches lentogènes donnent des valeurs proches de 0,0.
•
Indice de pathogénicité intraveineuse
i)
Du liquide allantoïque infectieux fraîchement recueilli (ne devant pas avoir plus de 24 à 48 h et négatif
à un test de contamination bactérienne), présentant une activité hémagglutinante de titre >24 (>1/16),
est dilué au 10e dans du soluté isotonique de chlorure de sodium stérile.
ii)
Un volume de 0,1 ml de la dilution virale est injecté par voie intraveineuse chez 10 poulets âgés de
6 semaines, indemnes d’organismes pathogènes spécifiques.
iii)
Les poulets sont examinés toutes les 24 h pendant 10 jours et les scores suivants sont attribués à
chaque observation : 0 si l'état est normal, 1 si le poulet est malade, 2 s'il est paralysé ou présente
d'autres signes nerveux et 3 s'il est mort. (Pour les poulets morts, le chiffre 3 doit être réattribué à
chacune des cotations journalières restantes.)
iv)
L'indice de pathogénicité intraveineuse est le score moyen obtenu par poulet et par observation sur
cette période de 10 jours.
Les souches lentogènes et certaines souches mésogènes ont des indices de pathogénicité intraveineuse de
0 alors que les indices des souches virulentes approchent une valeur de 3,0.
Certaines variantes ont été recommandées pour ces tests. Un écouvillonnage cloacal et conjonctival
effectué chez des poulets de 8 semaines, en utilisant du liquide allantoïque non dilué, a été substitué au test
de détermination de l'indice de pathogénicité intraveineuse (23). Le but est de distinguer les souches
vélogènes viscérotropes des souches vélogènes neurotropes.
309
•
Interprétation des indices de pathogénicité
Les indices de pathogénicité obtenus ne doivent pas être interprétés en vue d'imposer des restrictions sur
les échanges commerciaux ou les déplacements, ou encore d’édicter d'autres réglementations. L'objectif est
de maîtriser les souches du type Hitchner-B1 ou La Sota qui sont significativement plus virulentes que les
souches lentogènes. Étant donné que les virus capables de produire des maladies sévères peuvent avoir
des indices de pathogénicité intraveineuse de 0, c’est l'indice de pathogénicité intracérébrale qui est le plus
souvent choisi pour ces évaluations. Cependant, étant donné que dans cette épreuve les différentes
souches présentent une fourchette comprise entre 0,00 et 2,00, il est clair que toute valeur retenue pour une
définition doit reposer sur des critères pratiques.
e)
Bases moléculaires du pouvoir pathogène
Lors de la réplication, les particules du virus de la maladie de Newcastle sont produites à partir d’un
précurseur de la glycoprotéine F0, qui doit être clivé en F1 et F2 pour que les particules virales deviennent
infectieuses. Ce clivage post-translationnel est médié par des protéases de la cellule hôte. La trypsine est
capable de cliver F0 sur toutes les souches virales de la maladie de Newcastle.
Il semble que les molécules F0 des virus virulents chez les poulets puissent être clivées par une ou plusieurs
protéases de l’hôte, présente(s) dans toute une série de cellules et de tissus ; ces molécules peuvent ainsi
se propager chez l'hôte en endommageant les organes vitaux. Le clivage des molécules F0 des virus
faiblement virulents est en revanche conditionné par la présence de certaines protéases de l'hôte, de sorte
que ces virus se multiplient uniquement dans certains types de cellules hôtes.
Sur la plupart des virus de la maladie de Newcastle qui sont pathogènes pour les poulets, on constate la
présence de la séquence 112R/K-R-Q-K/R-R116 sur la fraction C-terminale de la protéine F2, et de F
(phénylalanine) sur le résidu 117, c’est-à-dire la fraction N-terminale de la protéine F1 ; sur les virus de faible
virulence on observe la présence de séquences 112G/E-K/R-Q-G/E-R116 dans la même région et de
L (leucine) au résidu 117. Sur certains variants trouvés chez le pigeon (PPMV-1), on a observé la séquence
112G-R-Q-K-R-F117, mais avec des indices élevés de pathogénicité intracérébrale. Ainsi, pour que le virus
soit virulent pour les poulets, il apparaît nécessaire qu’existe au moins une paire d'acides aminés
basiques aux résidus 116 et 115, en plus d’une phenylalanine au résidu 117 et d’un acide aminé basique (R)
au 113.
Plusieurs études ont été réalisées à l'aide de techniques moléculaires pour déterminer la séquence du site
de clivage de F0 en utilisant la transcription inverse couplée à une amplification en chaîne par polymérase
(RT-PCR), soit sur le virus isolé, soit sur des tissus et des matières fécales provenant d'oiseaux infectés. Le
produit a été soumis à une analyse par enzyme de restriction, à une hybridation par sonde ou à un
séquençage nucléotidique, en vue d'établir un test in vitro de routine pour le contrôle de la virulence (voir la
référence 2 pour une revue de la littérature). La détermination de la séquence de clivage de F0 peut donner
une indication claire de la virulence du virus. Aussi, cette notion a-t-elle été intégrée à la définition de la
maladie de Newcastle (voir la Section B.1.f).
Dans le diagnostic de la maladie de Newcastle, la mise en évidence d'un virus comportant de multiples
acides aminés basiques au site de clivage de F0 confirme la présence d'un virus virulent ou potentiellement
virulent. Il est important de souligner en revanche qu’il ne faut pas conclure à l'absence de virus virulent en
cas de non détection du virus ou en cas de caractérisation d’un virus de la maladie de Newcastle dénué
d'acides aminés basiques multiples au site de clivage de F0, à l'aide des techniques moléculaires. S’il y a
mésappariement de l’amorce ou en présence d'une population mélangée de virus virulents et non virulents,
il restera nécessaire d'isoler le virus et d’en évaluer la virulence in vivo.
Des analyses récentes sur des virus isolés en Irlande en 1990, ou trouvés lors des épisodes survenus en
Australie entre 1998 et 2000, ont démontré que les virus virulents peuvent provenir de virus progéniteurs de
faible virulence (5, 39). Des virus virulents de la maladie de Newcastle ont également été générés
expérimentalement à partir de virus de faible virulence par passage chez des poulets (34).
f)
Définition de la maladie de Newcastle
Il semble probable que la grande majorité des oiseaux soient sensibles aux infections par les souches
virales de la maladie de Newcastle fortement ou faiblement virulentes pour les poulets. Les signes cliniques
observés chez les oiseaux infectés par ces virus varient cependant considérablement et dépendent de
facteurs tels que le virus, l'espèce hôte, l'âge de l'hôte, les infections par d'autres micro-organismes, les
stress environnementaux et le statut immunitaire. Dans certaines circonstances, les infections par des virus
extrêmement virulents peuvent se traduire par une mortalité massive soudaine, avec relativement peu de
signes cliniques. Ainsi, les signes cliniques sont variables et dépendent d'autres facteurs, et aucune
manifestation ne peut être considérée comme pathognomonique.
310
Même chez les hôtes sensibles comme les poulets, le virus de la maladie de Newcastle présente une très
large fourchette de virulence. Généralement, les tests utilisés pour évaluer la virulence montrent un
regroupement par « grappes » autour des 2 extrêmes mais, pour toute une série de raisons, certains virus
peuvent présenter une virulence intermédiaire.
Compte tenu des variations considérables qui apparaissent au niveau de la virulence et des signes
cliniques, il convient de définir soigneusement les éléments constitutifs de la maladie de Newcastle pour les
besoins des échanges commerciaux, des mesures de prophylaxie et des politiques réglementaires. La
définition de la maladie de Newcastle actuellement utilisée dans tous les États membres de l'Union
européenne est définie par la Directive 92/66/EEC (17).
La définition utilisée par l'OIE pour la déclaration des foyers de maladie de Newcastle contient les éléments
suivants :
La maladie de Newcastle est une maladie infectieuse des oiseaux due à un paramyxovirus aviaire de
sérotype 1 (APMV-1) présentant l’un des critères de virulence ci-après :
a)
Le virus possède un indice de pathogénicité intracérébrale d’au moins 0,7 pour les poussins
(Gallus gallus) d’un jour.
ou
b)
Il a été démontré (directement ou par déduction) que le virus possède de multiples acides aminés
basiques dans la fraction C-terminale de la protéine F2, et une phénylalanine au niveau du
résidu 117, c'est-à-dire de la fraction N-terminale de la protéine F1. Le terme « multiples acides
aminés basiques » se réfère à la présence d’au moins 3 acides aminés correspondant à l’arginine
ou à la lysine entre les résidus 113 et 116. En l’absence de démonstration des multiples acides
aminés basiques caractéristiques décrits ci-dessus, il convient de caractériser le virus isolé en
déterminant son indice de pathogénicité intracérébrale.
Dans cette définition, les résidus d’acides aminés sont numérotés à partir de la fraction Nterminale de la séquence amino-acide déduite de la séquence nucléotidique du gène F0, et les résidus 113116 correspondent aux résidus –4 à –1 à partir du site de clivage.
g)
Anticorps monoclonaux
Des anticorps monoclonaux de souris dirigés contre des souches du virus de la maladie de Newcastle ont
été utilisés dans les tests d'inhibition de l'hémagglutination pour permettre une identification rapide du virus,
en excluant les réactions croisées avec d'autres sérotypes de paramyxovirus aviaires, qui peuvent survenir
avec du sérum polyclonal. Certains travaux ont permis de produire des anticorps monoclonaux donnant lieu,
dans les tests d'inhibition de l'hémagglutination, à des réactions spécifiques de certaines souches
particulières ou de certains variants du virus de la maladie de Newcastle (4, 9).
Des séries d'anticorps monoclonaux ont été utilisées pour établir les profils antigéniques des souches
virales, sur la base de la présence ou de l'absence de réaction avec les virus. Cette méthode s’est révélée
intéressante pour classer et différencier les souches du virus de la maladie de Newcastle, et elle a été
particulièrement utile pour comprendre l'épidémiologie des foyers (9).
h)
Études phylogénétiques
Les études phylogénétiques se sont multipliées au cours des dernières années en raison de l'amélioration
des techniques de séquençage nucléotidique, du développement de bases de données informatisées
précisant les séquences d’un nombre croissant de virus et des travaux montrant que des séquences même
relativement courtes pourraient donner des résultats significatifs dans les analyses phylogénétiques. Une
diversité génétique considérable a été détectée, mais les virus partageant différentes caractéristiques
temporelles, géographiques, antigéniques ou épidémiologiques tendent à faire partie de lignées ou de
clades spécifiques, ce qui s'est révélé utile à l'évaluation aussi bien de l'épidémiologie mondiale que de la
propagation locale de la maladie (3, 8, 16, 24, 27, 28, 33, 36 à 38).
Alors que par le passé il était impossible de recourir aux analyses phylogénétiques comme à des outils de
routine, les laboratoires ont aujourd’hui plus largement accès aux trousses sophistiquées commercialisées
pour la RT-PCR ainsi qu’aux séquenceurs automatiques, avec des résultats de plus en plus rapides. Les
laboratoires sont ainsi beaucoup plus nombreux à pouvoir assurer ces études qui fournissent des données
significatives en temps réel et non plus seulement a posteriori (2).
311
i)
Techniques moléculaires utilisées pour le diagnostic
Outre la RT-PCR et d'autres techniques analogues utilisées pour déterminer la virulence des souches du
virus de la maladie de Newcastle (voir la Section B.1.e) ou pour réaliser des études phylogénétiques (voir la
Section B.1.h), plusieurs rapports ont fait état du recours à ce type de techniques moléculaires pour déceler
le virus dans les prélèvements cliniques. Ces approches présentent l'avantage de détecter le virus très
rapidement, voire d’en déterminer la virulence si les amorces utilisées couvrent la partie du génome codant
le site de clivage de F0 (12, 20, 21). Les prélèvements cliniques doivent être soigneusement sélectionnés
car certaines études ont montré un manque de sensibilité lors de la détection du virus dans certains organes
et surtout dans les matières fécales (20, 21, 25). Comme pour la détermination de la virulence, il est
important que ces techniques ne soient pas utilisées seules pour conclure à la négativité des recherches en
cas de suspicion de la maladie de Newcastle.
Comme précisé dans la Section B.1.f. de ce chapitre, la maladie de Newcastle fait l'objet de contrôles officiels, et
il existe un grand risque de propagation du virus hors des laboratoires. Il convient par conséquent de procéder à
une appréciation de risque pour déterminer le niveau de sécurité biologique nécessaire pour le diagnostic et la
caractérisation du virus. Les installations doivent répondre aux spécifications correspondant à la classe de
confinement voulue, déterminée après l'appréciation du risque, comme stipulé dans l’Annexe I.1.6.1. du
Chapitre I.1.6. du présent Manuel terrestre. Les pays qui n'ont pas accès à un laboratoire national ou régional
spécialisé de ce type doivent adresser leurs prélèvements à un Laboratoire de référence de l'OIE.
2.
Épreuves sérologiques
Le virus de la maladie de Newcastle peut être utilisé comme antigène dans toute une série de tests sérologiques,
ce qui permet d'utiliser la technique de neutralisation ou la méthode immuno-enzymatique ELISA à des fins
diagnostiques. C’est l'épreuve d'inhibition de l'hémagglutination qui est aujourd'hui la plus largement utilisée. Avec
cette méthode, les sérums de poulet donnent rarement des réactions positives non spécifiques, de sorte qu'il est
inutile de prétraiter les sérums. Les sérums provenant d'autres espèces que le poulet peuvent parfois provoquer
une agglutination des érythrocytes de poulet. Aussi, cette réaction doit-elle être recherchée avant l'épreuve et
supprimée, s’il y a lieu, par adsorption du sérum avec des érythrocytes de poulet. La technique consiste à ajouter
0,025 ml d’un culot d’érythrocytes de poulet à chaque volume de 0,5 ml d’antisérum, à agiter doucement et à
laisser reposer pendant au moins 30 min. Un culot de centrifugation est alors préparé à 800 g sur 2 à 5 min puis
les sérums adsorbés sont mis à décanter.
Les différents laboratoires utilisent des variantes des méthodes utilisées pour la recherche de l’activité
hémagglutinante et pour l’épreuve d'inhibition de l'hémagglutination. Les exemples recommandés ci-après
correspondent à l'utilisation de plaques en matière plastique à micropuits, munies d’un fond en V, dans lesquelles
le volume final pour les 2 types d'essais est de 0,075 ml. Les réactifs nécessaires pour ces épreuves sont du
tampon PBS isotonique (0,1 M), de pH 7,0-7,2, et des érythrocytes prélevés au minimum sur 3 poulets indemnes
d’organismes pathogènes spécifiques, et réunis dans un volume égal de solution d’Alsever. (S'il n'est pas
possible de disposer de poulets indemnes d’organismes pathogènes spécifiques, le sang peut être prélevé chez
des individus non vaccinés, surveillés régulièrement et non porteurs d'anticorps dirigés contre le virus de la
maladie de Newcastle.) Les globules rouges doivent être lavés à 3 reprises dans du tampon PBS avant d'être
utilisés sous forme de suspension à 1 % (volume globulaire/volume total). Des antigènes et antisérums témoins
positif et négatif appropriés doivent être utilisés pour chaque analyse.
a)
312
Épreuves d’hémagglutination et d'inhibition de l'hémagglutination
•
Épreuve d’hémagglutination
i)
Verser 0,025 ml de tampon PBS dans chacun des puits d’une plaque de microtitrage en matière
plastique, munie d’un fond en V.
ii)
Ajouter 0,025 ml de la suspension virale (liquide allantoïque infectieux) dans le premier puits. Afin de
déterminer avec exactitude la teneur en hémagglutinine, cette étape doit être effectuée à partir d'une
fourchette étroite de dilutions initiales (1/3, 1/5, 1/7, etc. par exemple).
iii)
Des dilutions au demi de volumes de 0,025 ml de la suspension virale sont effectuées sur l’ensemble
de la plaque.
iv)
Un volume supplémentaire de 0,025 ml de tampon PBS est ajouté à chaque puits.
v)
Un volume de 0,025 ml de suspension d’érythrocytes de poulet à 1 % (v/v) est ajouté à chaque puits.
vi)
La solution est mélangée en tapotant doucement la plaque. On laisse ensuite se déposer les
érythrocytes pendant 40 min à température ambiante (c'est-à-dire à environ 20°C), ou pendant 60 min
à 4°C si la température ambiante est élevée ; les érythrocytes témoins doivent alors former un bouton
distinct.
vii)
La lecture de l’activité hémagglutinante est effectuée en inclinant la plaque et en recherchant la
présence ou l'absence d’un flux d’érythrocytes en forme de larme. Le titre doit être lu à la dilution la
plus élevée produisant une activité hémagglutinante complète (pas de flux) ; cette valeur représente
1 unité hémagglutinante et peut être calculée avec précision à partir de la fourchette initiale de
dilutions.
•
Inhibition de l’hémagglutination
i)
Verser 0,025 de tampon PBS dans chacun des puits d’une plaque de microtitrage en matière plastique,
munie d’un fond en V.
ii)
Ajouter 0,025 ml de sérum dans le premier puits de la plaque.
iii)
Des dilutions au demi de volumes de 0,025 ml du sérum sont effectuées sur l’ensemble de la plaque.
iv)
4 unités hémagglutinantes de virus ou d’antigène dans 0,025 ml sont ajoutées à chaque puits et la
plaque est laissée pendant au moins 30 min à température ambiante, c'est-à-dire à environ 20°C, ou
pendant 60 min à 4°C.
v)
On ajoute 0,025 ml de suspension d’érythrocytes de poulet à 1 % (v/v) dans chaque puits et, après
avoir mélangé doucement, on laisse décanter les érythrocytes pendant une quarantaine de minutes à
température ambiante (c'est-à-dire à environ 20°C), ou pendant environ 60 min à 4°C si la température
ambiante est élevée ; les érythrocytes témoins doivent alors former un bouton distinct.
vi)
Le titre d'inhibition de l'hémagglutination est la dilution sérique la plus poussée qui provoque une
inhibition complète de 4 unités hémagglutinantes d'antigène. L'agglutination est évaluée en inclinant les
plaques. Seuls les puits dans lesquels les érythrocytes s’écoulent au même rythme que dans les puits
témoins (contenant seulement 0,025 ml d’érythrocytes et 0,05 ml de PBS) doivent être considérés
comme présentant une inhibition.
vii)
La validité des résultats doit être évaluée par rapport à un sérum témoin négatif, ce qui ne devrait pas
donner un titre >1/4 (>22 ou >log2 2 en valeur inverse), et par rapport à un sérum témoin positif pour
lequel le titre ne devrait pas s'écarter de plus d'une dilution du titre connu.
La valeur des épreuves sérologiques dans le diagnostic est clairement liée au statut immunitaire escompté
des oiseaux touchés. Les titres d’inhibition de l'hémagglutination peuvent être considérés comme positifs si
une inhibition est obtenue avec une dilution sérique de 1/16 (24 ou log2 4 en valeur inverse) ou davantage en
présence de 4 unités hémagglutinantes d'antigène. Certains laboratoires préfèrent utiliser 8 unités
hémagglutinantes dans les tests d'inhibition de l'hémagglutination. Si cette valeur est autorisée, elle influe
sur l'interprétation des résultats, de sorte qu'un titre est alors positif à partir de 1/8 (23 ou log2 3). Le titrage
inverse de l'antigène doit être inclus dans toutes les épreuves pour vérifier le nombre d'unités
hémagglutinantes utilisées.
Les titres d'inhibition de l'hémagglutination peuvent servir à évaluer le statut immunitaire d'un élevage. Dans
les élevages vaccinés soumis à une surveillance sérologique, il est possible d'identifier des réponses
anamnestiques après une épreuve virulente utilisant des souches de terrain (11). Il faut toutefois rester très
prudent car des variations dues à d'autres causes peuvent survenir. Il a ainsi été montré que les infections
par le virus APMV-3 chez des dindons vaccinés contre la maladie de Newcastle entraînent un
accroissement substantiel des titres spécifiques du virus de la maladie (7).
Toute une série de trousses ELISA sont actuellement commercialisées. Elles reposent sur plusieurs
stratégies différentes pour la détection des anticorps dirigés contre le virus de la maladie de Newcastle, y
compris les techniques indirectes, sandwich et bloquantes ou compétitives avec anticorps monoclonaux.
L’une des trousses au moins fait appel à un antigène sous-unitaire. Ces tests ont généralement été évalués
et validés par le fabricant et il est donc essentiel que les instructions d'utilisation soient soigneusement
respectées.
C. SPÉCIFICATIONS APPLICABLES AUX VACCINS ET AUX PRODUITS
BIOLOGIQUES À USAGE DIAGNOSTIQUE
Une description détaillée de tous les aspects des vaccins préparés à partir du virus de la maladie de Newcastle, y
compris leur production et leur utilisation, a été publiée (11). Il convient de s'y référer pour obtenir des
informations détaillées sur les procédures présentées ici. Des lignes directrices sur la production des vaccins
313
vétérinaires figurent dans le Chapitre I.1.7. consacré aux principes de fabrication des vaccins à usage vétérinaire.
Les lignes directrices fournies ici et dans le Chapitre I.1.7. sont de type général et peuvent être complétées par
des spécifications nationales et régionales.
La présente section traite des vaccins vivants et inactivés classiques car ceux-ci sont toujours utilisés
universellement. Il faut cependant rappeler que de nombreux travaux récents ont été consacrés à l'application des
techniques de biologie moléculaire pour la production de nouveaux vaccins. Des résultats intéressants ont permis
d'obtenir une protection immunitaire en utilisant le virus recombinant de la variole aviaire, le virus de la vaccine, le
virus de la variole du pigeon, l'herpèsvirus du dindon et des cellules aviaires dans lesquelles sont exprimés le
gène HN et/ou le gène F du virus de la maladie de Newcastle. L'emploi de plusieurs de ces virus recombinants a
été autorisé dans certains pays.
Les souches du virus de la maladie de Newcastle utilisées dans les vaccins à virus vivants commercialisés se
répartissent en 2 groupes : vaccins lentogènes tels que Hitchner-B1, La Sota, V4, NDW, I2 et F, et vaccins
mésogènes tels que Roakin, Mukteswar et Komarov. Des souches appartenant à ces 2 groupes ont été soumises
à sélection et clonage pour remplir différents critères de production et d'application. Tous les virus vaccinaux
mésogènes possèdent 2 paires d'acides aminés basiques au site de clivage de F0 et des indices de pathogénicité
intracérébrale de l'ordre de 1,4. Il en résulte que la contamination d'oiseaux par ces virus entrerait dans la
définition de la maladie de Newcastle (Section B.1.f.) mais, comme ces vaccins sont principalement utilisés dans
des pays où la maladie est enzootique, cela n'interdit pas nécessairement leur utilisation.
Les unités de production de vaccin doivent fonctionner avec les procédures et les pratiques de sécurité biologique
qui conviennent. Si des virus de la maladie de Newcastle, telle que définie dans la Section B.1.f. de ce chapitre,
sont utilisés pour produire des vaccins ou les contrôler par des épreuves virulentes, la partie des installations où
ces opérations sont effectuées doit répondre aux spécifications de classe 4 applicables au confinement des
agents pathogènes, comme indiqué dans l’Annexe I.1.6.1. du Chapitre I.1.6. du présent Manuel terrestre.
Pour produire des vaccins à virus vivant, la multiplication du virus est généralement effectuée dans la cavité
allantoïque d’œufs de poule embryonnés, mais certaines souches, et notamment des souches mésogènes, ont
été adaptées à différents systèmes de culture tissulaires.
Les vaccins à virus vivants peuvent être administrés aux oiseaux par incorporation dans l'eau de boisson, sous
forme de pulvérisation à grosses gouttes ou par instillation intranasale ou conjonctivale. Certaines souches
mésogènes sont administrées par inoculation intradermique dans la membrane alaire. Les vaccins ont été conçus
pour donner des résultats optimaux lorsqu'ils sont administrés par des voies spécifiques. En règle générale, les
vaccins vivants les plus immunogènes sont les plus virulents, et par conséquent les plus susceptibles de
provoquer des effets indésirables. Ainsi, la vaccination avec la souche La Sota peut donner des problèmes
beaucoup plus importants chez les jeunes oiseaux sensibles que la souche Hitchner-B1, mais la première induit
une réponse immunitaire plus marquée.
Les vaccins inactivés sont nettement plus onéreux que les vaccins vivants et leur utilisation entraîne la
manipulation individuelle des oiseaux pour l’injection. Ils sont préparés à partir de liquide allantoïque dont le
pouvoir infectieux a été inactivé par addition de formol ou de bêta-propiolactone. Ces vaccins sont présentés en
émulsion dans de l’huile minérale et administrés par voie intramusculaire ou sous-cutanée. Chaque oiseau reçoit
ainsi individuellement une dose standard. Il n’en résulte pas de propagation du virus ni de réaction respiratoire.
Des souches virulentes et des souches non virulentes sont utilisées comme semences virales, mais les souches
non virulentes paraissent préférables au plan de la sécurité d'emploi. Étant donné qu'aucune multiplication du
virus n'intervient après l'administration, la quantité d'antigène requise pour obtenir l'immunisation voulue est
beaucoup plus importante qu’avec les vaccins à virus vivant. Il est important d'obtenir un rendement viral élevé
pour produire un vaccin puissant, et la souche Ulster 2C convient très bien à cet effet.
La durée de l'immunité dépend du programme de vaccination choisi. L’une des considérations les plus
importantes concernant les programmes de vaccination est le niveau d'immunité maternelle qui existe chez les
jeunes poulets et qui peut varier considérablement d'une exploitation à l'autre, d'un lot à l'autre et d'un sujet à
l'autre. C’est pourquoi l'on a recours à l'une des 2 stratégies suivantes : les oiseaux ne sont vaccinés qu'à l'âge de
2 à 4 semaines, au moment où la plupart sont sensibles, ou bien ils sont vaccinés à l'âge d'un jour par instillation
conjonctivale ou par application d'une pulvérisation à grosses gouttes. Il en résulte une infection active chez
certains oiseaux, qui persistera jusqu'à la disparition de l'immunité maternelle. Une revaccination est pratiquée 3 à
4 semaines plus tard. Il a été démontré que les vaccins inactivés peuvent également être intéressants pour
vacciner les poussins d'un jour présentant un certain degré d'immunité maternelle (15). L’association d’un vaccin
vivant et d’un vaccin inactivé chez les poussins d'un jour présentant une immunité maternelle a donné des
résultats supérieurs à l'administration de l’un ou l’autre de ces vaccins utilisés séparément (14). La vaccination
d’oiseaux d'un jour totalement sensibles, même avec le plus atténué des vaccins vivants, peut entraîner une
maladie respiratoire, surtout en présence de bactéries pathogènes courantes en quantités significatives.
314
Seules les poules reproductrices et pondeuses sont normalement vaccinées après l'âge de 3 semaines. La
vaccination doit être renouvelée à intervalles suffisamment fréquents pour maintenir une immunité adaptée. Les
programmes de vaccination font souvent appel à des vaccins à virus vivants légèrement plus pathogènes pour les
rappels que pour la vaccination initiale. Ces vaccins vivants plus pathogènes peuvent également être utilisés
après une vaccination initiale avec des vaccins inactivés présentés sous forme d’émulsion huileuse.
La conception d'un programme de vaccination doit tenir compte du type de vaccin utilisé, du statut immunitaire et
sanitaire des oiseaux à vacciner ainsi que du niveau de protection requis vis-à-vis de toute possibilité d'infection
par des souches de terrain dans les conditions locales (11). Deux exemples de programmes de
vaccination pouvant être utilisés dans différentes circonstances sanitaires sont détaillés ici. Dans le premier
exemple, lorsque la maladie est discrète et sporadique, il est suggéré d'adopter l'ordre de vaccination suivant :
Hitchner-B1 vivant par administration conjonctivale ou en pulvérisation à l'âge d'un jour ; Hitchner-B1 ou La Sota
vivant à l’âge 18 à 21 jours, administré dans l'eau de boisson ; La Sota vivant administré dans l'eau de boisson à
l'âge de 10 semaines, puis un vaccin inactivé en émulsion huileuse au moment de la ponte. Dans le second
exemple, lorsque la maladie est sévère et plus répandue, le même protocole est adopté jusqu'à l'âge de 21 jours,
puis il est suivi d'une revaccination à l'âge de 35 à 42 jours avec le vaccin La Sota vivant administré dans l'eau de
boisson ou sous forme d'un aérosol. Cette revaccination est répétée à l’âge de 10 semaines où l'on administre un
vaccin inactivé (ou un vaccin vivant mésogène) et renouvelée au moment de la ponte (11).
1.
Gestion des semences virales
a)
Caractéristiques de la semence virale
La première considération dans le choix d’une souche destinée à produire un vaccin à partir du virus vivant
de la maladie de Newcastle est son utilisation comme vaccin primaire ou secondaire, et avant tout son
pouvoir pathogène. Les méthodes d'administration et la fréquence d'utilisation sont aussi des facteurs à
prendre en compte. Le recours aux anticorps monoclonaux a révélé une variation considérable de
l’antigénicité des différentes souches (9). Lors de la conception des vaccins, il pourrait donc s’avérer
nécessaire d'accorder une plus grande attention à leur relation antigénique avec les virus prévalents sur le
terrain.
Un vaccin vivant reposant sur la souche V4 du virus de la maladie de Newcastle, sélectionné pour sa
stabilité à la chaleur, a été introduit pour lutter contre les problèmes spécifiques liés aux poulets élevés en
liberté dans les villages des pays en développement. Le but est d’utiliser ce vaccin pour enrober les aliments
distribués à ces poulets. Les études réalisées à ce jour dans différents pays ont fourni des résultats
variables, ce qui peut s'expliquer par le fait que les facteurs locaux sont extrêmement importants pour la
réussite de cette stratégie (35). Plus récemment, le vaccin thermostable 12 a été développé spécifiquement
pour vacciner les poulets élevés dans les villages. Il est actuellement recommandé d'administrer ce vaccin
sous forme de collyre (1).
L'usage des vaccins vivants peut être restreint par la législation. Ainsi, la Décision 93/152/EEC de la
Commission (18) a restreint l'usage des vaccins dans les États membres de l'Union européenne depuis le
1er janvier 1995 à ceux dont la semence primaire a été contrôlée et présente un indice de pathogénicité
intracérébrale <0,4 si au moins 107 doses infectantes moyennes pour l’œuf (DIO50) sont administrées
individuellement, ou <0,5 si au moins 108 DIO50 sont administrées individuellement. De même, la
Commission des normes de l'OIE considère que si les vaccins doivent en principe présenter un indice de
pathogénicité intracérébrale <0,7, une marge de sécurité doit être prévue pour tenir compte de la variabilité
entre les essais et entre les laboratoires, de sorte que les souches virales utilisées pour la semence primaire
ne doivent pas avoir un indice supérieur à 0,4 (30).
Le facteur essentiel pour sélectionner une semence destinée à la préparation d'un vaccin inactivé est la
quantité d'antigène produite lors d'une culture sur œufs embryonnés. Il est rarement rentable de concentrer
les virus. Des souches virulentes et des souches lentogènes ont été utilisées comme vaccins inactivés, mais
les premières sont associées à des risques inutiles car elles impliquent la manipulation de grandes quantités
de virus virulents. Elles peuvent être insuffisamment inactivées et risquent de donner lieu à des
contaminations ultérieures. Ce risque est reflété par la Décision 93/152/CEE de la Commission (18) qui a
restreint l'usage des virus utilisés pour la préparation des vaccins inactivés dans les États membres de
l'Union européenne depuis le 1er janvier 1995 à ceux dont la semence primaire présente un indice de
pathogénicité intracérébrale <0,7 si au moins 108 DIO50 sont administrées à chaque individu. Certaines
souches lentogènes atteignent des titres très élevés dans les œufs. Des titres exceptionnellement élevés
peuvent être obtenus avec la souche Ulster 2C qui a été recommandée comme semence pour préparer des
vaccins inactivés (22). Il est toutefois possible de produire avec succès des vaccins inactivés
commercialisables en utilisant comme semence les souches Hitchner B1, La Sota ou F.
315
b)
Méthode de culture
Après l'établissement d'une semence primaire, il convient de préparer une semence de travail. Si la souche
a été clonée par dilution limite ou sélection sur plaque, la préparation d'une culture primaire peut nécessiter
uniquement la production d’un gros volume de liquide allantoïque infectieux (au minimum 100 ml), qui peut
être conservé sous forme de parties aliquotes lyophilisées (0,5 ml).
c)
Validation du vaccin
Une semence virale d'origine inconnue doit être passée sur des oeufs indemnes d’organismes pathogènes
spécifiques, puis clonée avant de produire la semence primaire. Quelques passages sur des poulets
indemnes d’organismes pathogènes spécifiques peuvent également être souhaitables (11). Dans tous les
cas, la semence primaire doit être contrôlée après la préparation sur les plans suivants : stérilité, innocuité,
activité et présence de substances étrangères.
2.
Méthodes de fabrication
Pour produire le vaccin, on prépare tout d’abord une semence de travail qui permettra de produire les lots de
vaccins, en portant une partie aliquote d'une semence primaire à un volume suffisant pour permettre 12 à 18 mois
de production. Il est préférable de conserver la semence de travail liquide, au minimum à –60°C, car les virus
lyophilisés ne se multiplient pas toujours jusqu’à des titres élevés lors du premier passage ultérieur (11).
La plupart des vaccins contre la maladie de Newcastle sont produits sur des oeufs de poule embryonnés et les
vaccins à virus vivants doivent être produits sur des oeufs indemnes d’organismes pathogènes spécifiques. La
méthode de production passe par la propagation aseptique à grande échelle du virus ; toutes les procédures sont
effectuées dans des conditions stériles.
Il est habituel de diluer la semence de travail dans du tampon PBS stérile de pH 7,2, de sorte qu’environ 103-104
DIO50/0,1 ml sont inoculées dans la cavité allantoïque d’œufs de poule embryonnés de 9 ou 10 jours, indemnes
d’organismes pathogènes spécifiques. Les oeufs sont alors mis à incuber à 37°C ; ceux contenant des embryons
qui meurent dans les 24 h doivent être éliminés. Le temps d’incubation dépend de la souche virale utilisée et sera
prédéterminé pour assurer le rendement maximal avec le nombre minimal de morts embryonnaires.
Les oeufs infectés doivent être refroidis à 4°C avant le recueil du liquide. L’œuf est décalotté et le liquide
allantoïque est aspiré après création d’une dépression où se logera l’embryon. Il faut éviter d’inclure du jaune ou
de l’albumine. Tous les liquides doivent être immédiatement placés à 4°C et la contamination bactérienne doit
être recherchée avant de les regrouper en pools importants destinés à la lyophilisation ou à l’inactivation. Les
vaccins vivants sont généralement lyophilisés. La méthodologie dépend de l’équipement utilisé et de l’expertise
du fabricant, mais il s’agit d’une étape très importante car une lyophilisation inadéquate entraîne à la fois une
chute du titre et une diminution de la durée de conservation.
Pour la fabrication des vaccins inactivés, le liquide allantoïque recueilli est traité soit au formol (concentration
finale habituelle de 1/1000) ou à la bêta-propiolactone (concentration finale habituelle de 1/2000-1/4000). Le
temps requis doit être suffisant pour garantir l’absence de virus vivants. La plupart des vaccins inactivés ne sont
pas concentrés ; le liquide allantoïque inactivé est généralement émulsifié avec de l’huile minérale ou végétale.
Les formulations exactes relèvent généralement de secrets de fabrication.
Les vaccins inactivés huileux sont généralement préparés sous forme d’émulsions primaires eau dans l’huile. La
phase huileuse est généralement constituée de 9 volumes d’huile minérale hautement raffinée telle que Marcol
52, Drakeol 6VR et BayolF, plus un volume d’agent émulsifiant tel qu’Arlacel A, Montanide 80 et Montanide
888 (31). La phase aqueuse est le virus inactivé auquel a été ajouté un émulsifiant non ionique tel que du
Tween 80. Le rapport phase huileuse/phase aqueuse est généralement compris entre 1:1 et 1:4. Les fabricants
s'efforcent d'obtenir un équilibre entre l’effet adjuvant, la viscosité et la stabilité. Si la viscosité est trop élevée, le
vaccin est difficile à injecter ; si elle est trop faible, le vaccin est instable.
3.
Contrôles en cours de production
Il convient de tester la viabilité et l’activité de chaque lot de vaccin à virus vivant. Pour les vaccins produits sur des
oeufs, le contrôle le plus important en cours de fabrication est la recherche des contaminations bactériennes et
fongiques. Ce contrôle est nécessaire car il arrive occasionnellement que des oeufs se détériorent et ne soient
pas décelés au moment du recueil du liquide.
Pour les vaccins inactivés, l’efficacité de la procédure d'inactivation doit être testée sur des oeufs embryonnés, en
prenant 25 parties aliquotes (0,2 ml) de chaque lot et en procédant à 3 passages de chacune d’elles sur des
embryons indemnes d’organismes pathogènes spécifiques (11).
316
4.
Contrôles des lots
La plupart des pays ont publié des spécifications pour le contrôle de la fabrication et les tests des vaccins
préparés à partir du virus de la maladie de Newcastle (29) ; ces textes précisent les tests à pratiquer
obligatoirement sur les vaccins pendant et après la fabrication.
Il est nécessaire de tester l'infectivité des vaccins à virus vivants pour permettre l'administration de concentrations
virales adaptées. Le virus est généralement titré sur des oeufs de poule embryonnés pour obtenir le DIO50. Cette
opération passe par la préparation de dilutions virales au 1/10e ; 0,1 ml de chaque dilution est inoculé dans 5 à
7 oeufs de poule embryonnés de 9 à 10 jours. Après incubation de 5 à 7 jours à 37°C, les oeufs sont refroidis et
testés pour rechercher la présence de l'activité hémagglutinante qui est une indication de la présence du virus
vivant. Le DIO50 finale est calculée en utilisant une formule standard comme celle de Spearman-Kärber (10).
a)
Stérilité
Les tests de stérilité et d'absence de contamination des matériels biologiques sont décrits au Chapitre I.1.5.
b)
Innocuité
Le recours à des poulets pour tester les vaccins implique l'inoculation à au moins 10 individus d'âge
déterminé provenant d'un élevage indemne d’organismes pathogènes spécifiques. Dix doses de vaccin
vivant sont administrées par voie supraconjonctivale à chaque individu, puis les poulets sont observés
pendant 21 jours. Aucun sujet ne doit présenter de signes cliniques graves et aucun ne doit mourir d'une
cause imputable au vaccin (19).
Pour les vaccins inactivés, on administre une dose double par la voie recommandée à 10 individus âgés de
3 semaines. Ceux-ci sont alors observés pendant 2 semaines pour vérifier l’absence de signes cliniques ou
de lésions localisées.
c)
Activité
Plusieurs méthodes ont été proposées pour tester l'activité des vaccins préparés à partir du virus de la
maladie de Newcastle. Certains auteurs ont souligné l'importance de l'utilisation d’une souche adaptée pour
les épreuves virulentes (11). La souche Herts 33 convient à cet effet. Pour les vaccins vivants, il convient de
vacciner 20 individus indemnes d’organismes pathogènes spécifiques ou 20 autres oiseaux totalement
sensibles, présentant l'âge minimal recommandé, en utilisant la voie d’administration indiquée par le
fabricant et la dose minimale préconisée (19). Au bout de 14 à 21 jours, tous les oiseaux vaccinés ainsi que
10 oiseaux témoins sont soumis à une épreuve virulente par injection intramusculaire du virus de la maladie
de Newcastle à raison de 105 DL50 (dose létale à 50 %). L’épreuve est considérée comme satisfaisante
lorsqu’à la fin des 10 jours, 90 % des poulets vaccinés survivent sans signe de maladie et que tous les
oiseaux témoins meurent dans les 6 jours.
Pour les vaccins inactivés, on utilise des poulets indemnes d’organismes pathogènes spécifiques ou des
poulets sensibles, âgés de 21 à 28 jours. Trois groupes de 20 poulets reçoivent par voie intramusculaire des
volumes de vaccin équivalents à 1/25e, 1/50e et 1/100e d’une dose. Un groupe de 10 poulets sert de témoin.
Tous les poulets sont soumis à une épreuve virulente par injection intramusculaire du virus de la maladie de
Newcastle à raison de 106 DL50, 17 à 21 jours plus tard. Les poulets sont observés pendant 21 jours. La
dose protectrice à 50 % (DP50) est calculée par des méthodes statistiques standard. L'épreuve n’est
considérée comme satisfaisante que si tous les individus témoins meurent dans les 6 jours. Le vaccin est
conforme si la DP50 n'est pas inférieure à 50 par dose et si la limite de confiance inférieure est d’au moins
35 DP50 par dose. Certaines autorités de contrôle acceptent les épreuves effectuées seulement au 1/50e par
souci de protection animale.
Il n'est pas nécessaire de répéter le test d'activité sur chaque lot s’il a été montré qu'un lot représentatif du
produit fini préparé à partir de la semence primaire a passé l'épreuve avec succès.
d)
Durée de l’immunité
Le taux d'immunité obtenu avec chaque dose ou chaque protocole de vaccination contre la maladie de
Newcastle varie considérablement en fonction du vaccin et de l’espèce. Le taux d'immunité requis pour une
espèce donnée (protection contre la mortalité, la maladie et la perte de production de viande et d’œufs) est
extrêmement complexe et difficile à évaluer. En général, il convient d’évaluer la longévité des anticorps
sériques ainsi que les protocoles vaccinaux adoptés pour maintenir les anticorps au-dessus d'un niveau
acceptable (11).
317
e)
Stabilité
Lorsqu'il est stocké dans les conditions recommandées, le produit vaccinal fini doit conserver son activité
pendant au moins 1 an. Des tests de vieillissement accéléré provoquant une réduction de l’infectivité après
incubation à 37°C pendant 7 jours (26) peuvent être utilisés à titre indicatif pour déterminer la durée de
conservation d'un lot de vaccin vivant. Les vaccins à émulsion huileuse doivent également être soumis à un
vieillissement accéléré par conservation à 37°C pendant un minimum de 1 mois, sans séparation entre les
phases aqueuse et huileuse. Les vaccins à virus vivants doivent être utilisés immédiatement après
reconstitution. Les vaccins inactivés ne doivent pas être congelés.
f)
Agents de conservation
Aucun agent de conservation ne doit être inclus dans les vaccins vivants lyophilisés, mais des
antimicrobiens peuvent être intégrés au diluant utilisé pour reconstituer le vaccin.
g)
Précautions d’emploi et mise en garde
Les vaccins préparés à partir du virus vivant de la maladie de Newcastle peuvent constituer un danger pour
l'homme. Des infections par des virus de la maladie de Newcastle ont été rapportées chez l'homme,
s’agissant aussi bien de souches virulentes que de souches faiblement virulentes pour les poulets. La
maladie s’est généralement traduite par une conjonctivite aiguë après introduction directe dans l'œil. Les
infections sont en principe passagères et la cornée n'est pas atteinte.
Les vaccins présentés sous forme d’émulsion dans de l'huile minérale sont très dangereux pour la personne
qui les administre. L'injection accidentelle chez l'homme doit être traitée rapidement par incision et lavage du
site, comme pour une blessure par un pistolet à graisse.
5.
Contrôles du produit fini
a)
Innocuité
Voir la Section C.4.b. ci-dessus.
b)
Activité
Voir la Section C.4.c. ci-dessus.
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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*
* *
N.B. : Il existe des Laboratoires de référence de l’OIE pour la maladie de Newcastle (se reporter à la liste de la
partie 3 de ce Manuel terrestre ou consulter le site Internet de l’OIE pour obtenir une liste actualisée :
www.oie.int).
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MALADIE DE NEWCASTLE

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