1. Définitions et généralités - microbiologie

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TS1 ABM - Cours de Microbiologie
15/12/2011
BTS Analyses de Biologie Médicale
Cours de Microbiologie (1e année)
Chapitre n°4 : Les agents antimicrobiens
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1. Définitions et généralités
Stérilisation
Désinfectants
Antiseptiques
Antibiotiques
Spectre d’activité
Bactériostase / Bactéricidie
CMI / CMB
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Croissance bactérienne en présence d’antibiotique
Découverte des antibiotiques par Fleming
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Les micro-organismes producteurs d’antibiotiques
PROCARYOTES
Bactéries :
* Streptomyces (Actinomycètes)
Streptomycine
Erythromycine
Kanamycine
Néomycine
Nystatine…
* Bacillus
Bacitracine
Polymixines
EUCARYOTES
Moississures :
* Penicillium
Pénicilline
Griséofulvine
Les rapports entre malade, agent infectieux et
antibiotique
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2. Classification des antibiotiques
Mode d’action des antibiotiques : la notion de
cible
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2.1. Les β-lactamines
Structure des β-lactamines
Les béta-lactamines sont caractérisées par un
cycle béta-lactame associé à un noyau
thiazolidine formant l’acide 6-amino-pénicillinique
(pénicillines) ou à un noyau dihydrothiazine
formant l’acide 7-amino-céphalosporanique
(céphalosporines). Ces antibiotiques, actifs
lorsque les bactéries sont en phase de croissance
exponentielle, inhibent la synthèse de
peptidoglycane, et plus particulièrement la
réaction de transpeptidation. Les bétalactamines se fixent sur des protéines liant la
pénicilline (PLP ou PBP) : ce sont principalement
des enzymes (carboxypeptidases) qui
interviennent dans l’assemblage du
peptidoglycane. Les béta-lactamines activent
également les autolysines bactériennes.
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Mode d’action des β-lactamines
2.2. Les
glycopeptides
Mode d’action :
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2.3. Les aminosides
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2.4. Les macrolides et apparentés
Mode d’action des aminosides et des macrolides
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2.5. Les phénicolés
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2.6. Les tétracyclines
Mode d’action du chloramphénicol (CP) et des tétracyclines
2.7. Sulfamides et du triméthoprime
Mode d’action des sulfamides et du triméthoprime
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2.8. Quinolones
Mode d’action
2.9. Autres antibiotiques
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3. L’antibiogramme
L’antibiogramme a pour but de déterminer in vitro l’antibiotique le plus actif sur le germe,
c’est à dire celui qui sera prescrit au malade infecté par ce germe. Un certain nombre de
facteurs susceptibles de modifier l’activité antimicrobienne de l’agent testé doivent être pris
en compte :
- L’antibiotique : il doit conserver son activité au cours du test (à 37°C) et sa capacité de
diffusion en milieu gélosé solide doit être convenable.
- Le milieu : sa composition doit être rigoureusement définie pour que les résultats soient
reproductibles.
- Les bactéries : le nombre de bactéries mises au contact de l’antibiotique devrait toujours
être le même. L’activité métabolique de la bactérie et la durée d’incubation sont des
facteurs importants aussi. La mesure de l’activité antimicrobienne s’effectue toujours avec
des souches pures.
Mueller-Hinton (Gélose)
Usage : Gélose riche pour la réalisation de l'antibiogramme standard
Composition :
infusion de viande de bœuf 300,0 ml
peptone de caséine 17,5 g
amidon de maïs 1,5 g
agar 17,0 g
pH = 7,4
Préparation :
38 g par litre. Stérilisation à l'autoclave.
Lecture :
Cette gélose standardisée est la gélose permettant de tester l'action des antibiotiques sur les bactéries. Elle peut être
additionnée de sang (pour les Streptococcus ), d'extrait globulaire (pour Haemophilus ), Elle doit être coulée en boîte de façon à
obtenir une épaisseur de 4 mm. Il existe un bouillon équivalent.
Courbe de concordance
Les méthodes par diffusion en milieu gélosé
solide permettent d’observer des zones
d’inhibition autour des sources
d’antibiotiques. Il existe une relation linéaire
entre le diamètre de la zone d’inhibition et le
logarithme de la concentration au niveau de la
source. En effet, l’antibiotique diffuse dans le
milieu selon un gradient de concentration
inversement proportionnel à la distance du
dépôt du disque imprégné d’antibiotique. Pour
établir la relation entre le diamètre de la zone
d’inhibition et la CMI, on utilise des courbes de
concordance établies par des laboratoires
spécialisés (Institut Pasteur) avec des
souches de référence.
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Interprétation
Un germe est dit sensible si la CMI de
l’antibiotique pour le germe est plus faible que
la concentration critique inférieure (taux
sanguin moyen obtenu aux posologies
habituelles et sans danger pour l’organisme).
Un germe est dit de sensibilité intermédiaire
si la CMI de l’antibiotique pour le germe est à
l’intérieur de la zone des taux thérapeutiques,
c’est à dire entre la concentration critique
inférieure et la concentration critique
supérieure (taux sanguin maximal obtenu par
l’administration de fortes doses). Un germe est
dit résistant si la CMI de l’antibiotique pour le
germe est plus élevée que la concentration
critique supérieure. Il faut distinguer cette
résistance clinique de la résistance absolue
d’un microorganisme vis-à-vis d’un
antibiotique donné.
E-Test
Il s'agit d'une technique de détermination de la
CMI fondée sur l'utilisation de bandelettes
imprégnées d'un gradient exponentiel
prédéfini de l'antibiotique à tester. L’E-test
associe les caractéristiques des méthodes de
diffusion et de dilution en milieu solide. Les
bandelettes sont des supports inertes,
hydrophobes. Elles sont appliquées sur la
surface d'une gélose préalablement
ensemencée avec la souche à étudier.
Après incubation, l'inhibition de la croissance
bactérienne se traduit par la présence d'une
ellipse dont les points d'intersection avec la
bandelette définissent la CMI. Une échelle de
lecture imprimée sur la face supérieure de la
bandelette permet une interprétation rapide.
Résultat d’un « E-test » pour la pénicilline
G (concentrations exprimées en µg.mL-1)
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Antibiogramme miniaturisé en milieu liquide (ATB Gram-)
4. Association d’antibiotiques
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Association
d’antibiotiques :
schéma
triangulaire
5. Mécanismes de résistance aux antibiotiques
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Pour qu'un antibiotique soit actif, il faut :
Pour résister à l’antibiotique, la bactérie peut :
- qu'il pénètre dans la bactérie
- devenir imperméable ou s'opposer à son transport
- l’excréter activement
- qu'il ne soit ni modifié ni détruit
- synthétiser des enzymes qui le modifient
- synthétiser des enzymes qui l'hydrolysent
- synthétiser des protéines qui le séquestrent
- qu'il se fixe à sa cible
- modifier le site de reconnaissance de la cible
- produire la cible de façon plus importante
- qu’il bloque une voie métabolique
- changer de voie métabolique
•
•
•
– L'imperméabilisation
Elle concerne la membrane externe (pour les bactéries à Gram négatif) ou la
membrane cytoplasmique (pour toutes les bactéries). C'est le mécanisme le
plus souvent responsable de la résistance naturelle . Il peut concerner tous les
antibiotiques.
– Modification de la cible
C'est un mécanisme dont l’origine génétique est souvent mutationnelle. La cible
est légèrement modifiée par la substitution d'un acide aminé dans la protéine
(s'il s'agit d'une enzyme ou d'une protéine ribosomale) ou la substitution d'un
nucléotide (s'il s'agit de l'ARN ribosomal). Il peut concerner les b-lactamines, les
aminosides, les macrolides, les quinolones…
On peut rencontrer ce mécanisme dans la résistance plasmidique : dans le cas
des macrolides, une méthylase modifie deux nucléotides du ribosome qui perd
son affinité pour l'antibiotique. Dans le cas des sulfamides ou du triméthoprime,
le plasmide code pour des isoenzymes qui ne fixent pas ces molécules.
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•
•
•
•
•
– L'inactivation ou la modification de l’antibiotique
C'est un mécanisme dont l’origine génétique est souvent plasmidique. Il
concerne particulièrement :
- les béta-lactamines : béta-lactamases (pénicillinases, céphalosporinases)
hydrolysant la molécule,
- les aminosides : transférases qui phosphorylent ou acétylent certains sites de
la molécule,
- les phénicolés : transférase qui acétyle la molécule.
On peut rencontrer ce mécanisme dans la résistance mutationnelle : certaines
bactéries synthétisent des faibles quantités de béta-lactamases (la résistance
est alors dite de bas niveau). Une mutation altère le gène de régulation et
provoque une synthèse accrue de l’enzyme qui est dite déréprimée (la
résistance est alors dite de haut niveau).
6. Déterminisme génétique des résistances aux antibiotiques
Résistance naturelle (chromosomique) : caractère d’espèce
La résistance naturelle est caractéristique d’une espèce bactérienne. Elle délimite le spectre naturel
de l'antibiotique et constitue une aide à l’identification.
La résistance naturelle se traduit habituellement par des CMI supérieures à la valeur critique basse
de concentration (c) de l’antibiotique concerné.
Les protéines codées par le chromosome ont une structure telle qu'elles empêchent la pénétration
de l'antibiotique (les membranes sont imperméables, un système de transport est absent) ou
l'inactivent (les béta-lactamases chromosomiques).
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Résistances naturelles
Résistances acquises : seules certaines souches d’une espèce sont concernées
Les résistances acquises, sont consécutives à des modifications de l'équipement génétique
chromosomique ou plasmidique, qui ne concernent que quelques souches d'une même espèce
mais peuvent s'étendre : leur fréquence varie dans le temps mais aussi dans l'espace (région, ville,
hôpital…).
• Résistance mutationnelle (chromosomique)
Une altération de l’ADN chromosomique entraîne la synthèse de protéines modifiées : les
membranes deviennent imperméables, un système de transport n'accepte plus l'antibiotique, la
cible (enzyme ou ribosome) ne fixe plus l'antibiotique, un répresseur ne contrôle plus certains gènes
(dérépression des béta-lactamases).
Les résistances mutationnelles sont :
- spontanées : elles préexistent à l'utilisation de l'antibiotique,
- stables : elles se transmettent verticalement dans le clone bactérien,
- spécifiques : elles ne concernent qu'un antibiotique ou une famille d'antibiotiques à la fois,
-rares : le taux de mutation se situe habituellement entre 10-7 et 10-8.
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Résistance extra-chromosomique (plasmidique ou liée à un transposon)
L'acquisition d'une information génétique supplémentaire permet la synthèse de protéines
additionnelles dont la présence modifie les membranes ou dont l'activité enzymatique se révèle
capable de modifier la cible ou d'inactiver l'antibiotique.
Les résistances extra-chromosomiques ont pour support génétique un plasmide (ou un
transposon) acquis par conjugaison ou plus rarement par transduction ou transformation
Les résistances plasmidiques :
- sont fréquentes (plus de 80% des résistances acquises),
- sont contagieuses et se transmettent horizontalement entre bactéries cohabitant dans un
même environnement, même entre espèces différentes,
-peuvent concerner plusieurs antibiotiques, voire plusieurs familles d'antibiotiques,
entraînant une multirésistance.
L'usage d'un seul antibiotique dont la résistance est codée par un gène plasmidique sélectionne les souches
résistantes à toutes les molécules dont le gène de résistance se trouve sur le plasmide, ce qui entraîne la sélection
rapide de souches multirésistantes. Ce sont ses souches bactériennes résistantes à plusieurs familles
d'antibiotiques pour lesquelles les possibilités thérapeutiques sont réduites et parfois anéanties. On constate, en
milieu hospitalier surtout, une recrudescence de la fréquence d'isolement de ces souches qui doivent être détectées
rapidement et signalées car elles imposent aux services d'hospitalisation des mesures strictes pour éviter leur
diffusion.
Certaines espèces bactériennes sont plus particulièrement concernées par cette multirésistance :
Staphylocoques méticillino-résistants (SARM)
Souches de Pseudomonas productrices de céphalosporinase déréprimée
Entérobactéries productrices de b-lactamase à spectre étendu (« BLSE »)
Acinetobacter (dont l’espèce A. baumannii) naturellement résistants à de nombreux antibiotiques
7. Mise en évidence des résistances acquises au laboratoire
Mise en évidence des béta-lactamases
Les béta-lactamases hydrolysent le cycle b-lactame des pénicillines (pénicillinases) et des
céphalosporines (céphalosporinases) avec plus ou moins de spécificité, les rendant ainsi inactives.
Les béta-lactamases peuvent être :
- constitutives (Haemophilus influenzae, Neisseria…) ou inductibles (Staphylococcus aureus) ;
- d’origine chromosomique ou plasmidique.
Il existe une méthode simple de mise en évidence rapide de ces enzymes : la méthode à la
céphalosporine chromogène. Le test Céfinase® de BioMérieux est réalisé grâce à un disque
imprégné d’un substrat chromogène (la nitrocéfine) sur lequel on dépose une colonie
bactérienne : en présence de béta-lactamase, il se forme un produit coloré rouge.
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Mise en évidence des béta-lactamases à spectre étendu (BLSE)
Les béta-lactamases à spectre étendu confèrent une résistance de haut niveau à quasiment
toutes les béta-lactamines, à l’exception des céphalosporines de 3e génération (résistance de
bas niveau). Les BLSE sont déterminées génétiquement par des plasmides (et sont donc
transmissibles entre bactéries). Elles sont inactivées par les inhibiteurs de béta-lactamase tels que
l’acide clavulanique. Leur mise en évidence repose sur la présence d’une synergie entre une
céphalosporine de 3e génération (Céfotaxime ou Ceftazidime par exemple) et un inhibiteur de blactamase (on utilise souvent le disque AMC contenant de l’amoxicilline et de l’acide clavulanique).
Mise en évidence des béta-lactamases à spectre étendu (BLSE)
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Résistance des staphylocoques aux béta-lactamines
Il s’agit d’une résistance à la méticilline due à une modification des PLP (souches dites « méticillinorésistantes » ou « SARM » : Staphylococcus aureus résistant à la méticilline).
L’acquisition d’un gène chromosomique mecA entraîne une production de PLP2a (dont l’affinité visà-vis des béta-lactamines est faible). La mise en évidence de cette résistance est délicate, car
seulement une partie de la population bactérienne (1 bactérie sur 10 000 à 100 000) exprime cette
résistance (d’où le nom de résistance hétérogène). Les conditions de culture doivent être modifiées
(incubation à 30°C ou ensemencement en milieu Mueller-Hinton hypersalé) pour observer des colonies
dans la zone d’inhibition autour d’un disque d’oxacilline.
Résistance des staphylocoques aux béta-lactamines
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Il s’agit d’un test général mettant en évidence toute réaction d’inactivation d’un antibiotique. Une
souche sensible à l’antibiotique testé est ensemencée sur un milieu Mueller-Hinton. Un disque
imprégné de l’antibiotique testé est placé au centre de la boîte. Des stries sont réalisées autour du
disque avec les souches à tester et des souches témoin. Après incubation, la présence de culture
de la souche sensible au contact des souches test ou témoin dans la zone d’inhibition témoigne de
l’inactivation de l’antibiotique.
Bibliographie :
Microbiologie technique, 1. Dictionnaire des techniques, Jean-Noël JOFFIN, Guy
LEYRAL, CRDP Bordeaux, 2001.
Le paradoxe des antibiotiques, Stuart B. LEVY, Editions Belin, 1999.
Pour la science :
- n°232 (février 1997) : « La résistance des bactéries aux antibiotiques ».
- n°331 (mai 2005) : « Les infections à l’hôpital » ; « Consommation d’antibiotiques et
résistance des bactéries ».
La recherche :
- n°384 (mars 2005) : « Le grand désert des antibiotiques ».
Sites internet :
Les ressources en ligne sont extrêmement nombreuses sur le sujet (tapez
« antibiotiques » ou « antibiogramme » sur Google par exemple), mais il faut
sélectionner les sites les plus rigoureux. Quelques suggestions :
http://www.123bio.net/cours/
http://www.frm.org/ (tapez « antibiotiques » dans le champ de recherche en haut à droite).
http://www.microbes-edu.org/etudiant/etudiants.html
http://www.bacterio.cict.fr/bacdico/atbq/sensibilite.html
http://anne.decoster.free.fr/
http://pedagogie.ac-montpellier.fr/Disciplines/sti/biotechn/microbio.html
http://biomserv.univ-lyon1.fr/wiki/dpbcoursd1/moin.cgi/Antibio
Fichiers « pdf » à télécharger (cours de l’Université de Genève) :
http://www.unige.ch/sciences/biologie/public/pif/polycop.htm
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1. Définitions et généralités - microbiologie

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