Manuel du kit QIAamp® DSP Virus

1050717_FR
16.04.2008
10:27 Uhr
Seite 1
Novembre 2007
Manuel du kit
QIAamp® DSP Virus
Σ
50
Version 1
IVD
Le kit QIAamp DSP Virus est un système générique utilisant la technologie
QIAamp pour extraire et purifier les acides nucléiques viraux à partir
d’échantillons de plasma ou de sérum humain pour des applications de
diagnostic in vitro.
Pour utilisation en diagnostic in vitro
REF
60704
H B
1050717FR
11/2007
QIAGEN GmbH, D-40724
Hilden, Tel: +49-2103-29-0
R1
MAT
1050717FR
Sample & Assay Technologies
1050717_FR
16.04.2008
10:27 Uhr
Seite 2
Marques déposées : QIAGEN®, QIAamp®, QIAvac, MinElute™ (Groupe QIAGEN); AMPLICOR HBV MONITOR®, AMPLICOR HCV MONITOR®, AMPLICOR
HIV-1 MONITOR®, COBAS®, TaqMan® (Groupe Roche); artus™, RealArt™ (artus GmbH); Eppendorf® (Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH). Les noms enregistrés,
les marques déposées etc., utilisés dans ce document, même si non mentionnés comme tels ne peuvent être considérés comme non protégés juridiquement.
Le procédé de PCR est couvert par les brevets US 4.683.195 et 4.683.202 et les équivalents étrangers enregistrés par Hoffmann-La Roche AG.
© 2004 QIAGEN, tous droits réservés.
1050717_FR
16.04.2008
10:27 Uhr
Seite 3
Sommaire
Contenu du kit
4
Symboles
5
Conservation
6
Contrôle qualité
6
Domaine d’utilisation
6
Limites d’utilisation
7
Informations de sécurité
7
Introduction
9
Principe et procédé
11
Matériel supplémentaire nécessaire
14
Remarques importantes
15
Remarques préliminaires importantes
15
Préparation d’ARN
15
Conservation des échantillons
16
Préparation des réactifs et tampons
16
Elution des acides nucléiques viraux
19
Rendement et qualité des acides nucléiques viraux
19
Mise en place du système QIAvac 24 Plus
19
Protocole
Extraction et Purification d’Acides Nucléiques Viraux
à partir de Plasma et de Sérum
Distributeurs QIAGEN
Manuel du kit QIAamp DSP Virus 11/2007
22
25
3
1050717_FR
16.04.2008
10:27 Uhr
Seite 4
Contenu du kit
Kit QIAamp® DSP Virus
Référence n°
60704
Nombre de preps
50
QIAamp
MinElute
Colonnes QIAamp MinElute™
avec tubes de lavage (WT) (2 ml)
COL
EXT
Réhausseurs de colonnes
(3 ml)
COL
EXT
Tubes d'élution (1,5 ml)
ELU
TUBE
50
VC
VacConnectors
VAC
CON
50
LT
Tubes de lyse (2 ml)
LYS
TUBE
50
WT
Tubes de lavage (2 ml)
WASH
TUBE
50
AL
Tampon de lyse*
LYS
BUF
33 ml
AW1
Tampon de lavage 1*
(concentré)
WASH
BUF
1 CON
AW2
Tampon de lavage 2†
(concentré)
WASH
BUF
2 CON
AVE
Tampon d’élution
(capuchons mauves)
ELU
PS
Solvant de protéase
QPROT
SOLV
Carrier
ARN entraîneur
(capuchons rouges)
CAR
RNA
QP
Protéase‡ QIAGEN®
QPROT
ET
50
50
19 ml
13 ml
†
BUF
4 x 2 ml
4,4 ml
310 µg
CD
H
Manuel anglais
B
H B
1 flacon
1
1
* Contient du chlorure de guanidine. Pas compatible avec des désinfectants contenant de l’eau de Javel. Pour
plus d’informations voir page 7.
†
Contient de l’azide de sodium comme agent de conservation.
‡
Le volume de resuspension est de 4,4 ml.
4
Manuel du kit QIAamp DSP Virus 11/2007
1050717_FR
16.04.2008
10:27 Uhr
Seite 5
Symboles
Σ
Kit contient des réactifs pour 50 préparations d’échantillons
50
Lire les informations dans le manuel
i
A utiliser avant
IVD
Dispositif destiné au diagnostic in vitro
REF
Référence du catalogue
LOT
Numéro de lot
MAT
Référence du matériel
Composants
COMP
Volume
VOL
Limites de température
Fabricant légal
A l’arrivée
i
Remarque importante
Changer de gants après cette étape
8°C
2°C
ADD
Ouvrir à l’arrivée ; garder les colonnes QIAamp MinElute à une température
entre 2 et 8°C
Noter la date du jour sur le flacon après avoir ajouté l’éthanol
Ajouter
CONT
Contient
LYOPH
Lyophilisé
RCNS
Reconstituer dans
EtOH
Ethanol
GuHCI
Chlorure de guanidine
SUBT
➡
Subtilisine
Mène à
Manuel du kit QIAamp DSP Virus 11/2007
5
1050717_FR
16.04.2008
10:27 Uhr
Seite 6
Conservation
Garder les colonnes QIAamp MinElute à une température entre 2 et 8°C dès leur
arrivée. Les tampons peuvent être conservés à température ambiante (15 à 25°C).
L’ARN entraîneur lyophilisé peut être conservé à température ambiante (15 à 25°C)
jusqu’à sa date d’expiration. Il doit uniquement être dissous dans du tampon d’élution
(AVE) ; ajouter immédiatement l’ARN entraîneur dissous dans le tampon de lyse (AL)
comme décrit à la page 14. Cette solution doit être fraîchement préparée. Elle est stable
48 heures entre 2 et 8°C. Pour l’ARN entraîneur dissous dans le tampon d’élution (AVE)
non utilisé, il est recommandé de l’aliquoter et de le conserver à –20°C.
La Protéase QIAGEN lyophilisée (QP) peut être conservé à température ambiante
(15 à 25°C) jusqu’à sa date d’expiration sans altération de ses performances.
Une fois mise en solution, la Protéase QIAGEN (QP) est stable 1 an à une température
entre 2 et 8°C, dans la limite de sa date d'expiration.
Le tampon de lavage 1 (AW1) et le tampon de lavage 2 (AW2) sont stables 1 an à
température ambiante (15 à 25°C), mais que jusqu’à leur date d’expiration.
Contrôle qualité
En accord avec le Total Quality Management System certifié de QIAGEN, chaque lot
du kit QIAamp DSP Virus a été testé dans les spécifications prédéterminées, afin
d’assurer une qualité égale du produit.
Domaine d’utilisation
Le kit QIAamp DSP Virus est un système générique utilisant la technologie QIAamp pour
extraire et purifier les acides nucléiques viraux à partir d’échantillons de plasma ou de
sérum humain pour des applications de diagnostic in vitro. Tout résultat diagnostic
obtenu par ce procédé en combinaison avec toute analyse diagnostic de techniques
d’acides nucléiques (NAT) doit être interprété suivant les bilans diagnostic ou les bilans
de laboratoire. Le produit doit uniquement être utilisé par des professionnels comme le
personnel de laboratoire formé aux techniques de biologie moléculaire. Il a été
développé pour toute application d’amplification enzymatique en aval ou autre
modification enzymatique d’ADN ou ARN, suivie d’une détection de signaux ou d’une
amplification. Les acides nucléiques viraux purifiés peuvent être utilisés dans des tests
diagnostic NAT de détermination qualificative (par exemple le dépistage sanguin) ou
quantitative (par exemple la charge virale).
Afin de minimiser les irrégularités dans les résultats, le produit est supposé être utilisé
avec un contrôle interne et des contrôles positifs et négatifs pendant la préparation des
échantillons. Réaliser le contrôle qualité pour l’amplification et la détection selon les
tests utilisés en aval. Le produit a été développé pour une utilisation avec le système
QIAvac 24 Plus ou une chambre à vide équivalente.
6
Manuel du kit QIAamp DSP Virus 11/2007
1050717_FR
16.04.2008
10:27 Uhr
Seite 7
Limites d’utilisation
Le kit n’a pas été développé pour une utilisation avec le sang, les tissus, la mœlle
osseuse ou les cellules en culture, ni pour l’extraction et la purification d’acides
nucléiques bactériens, fongiques ou parasitaires. La performance du kit concernant
l’extraction et la purification d’acides nucléiques viraux à partir de liquides biologiques
acellulaires tels l’urine et le LCR n’a pas été déterminée.
Informations de sécurité
Lors de la manipulation de produits chimiques, toujours porter une blouse appropriée,
des gants jetables et des lunettes de sécurité. Pour plus d’informations sur les kits
QIAGEN et leurs composants, veuillez consulter les Fiches de Données de Sécurité
(FDS). Elles sont disponibles sur notre site Internet www.qiagen.com/ts/msds.asp en
format PDF et vous pouvez les consulter ou les imprimer pour chaque réactif ou kit
QIAGEN.
ATTENTION : NE JAMAIS verser de l’eau de Javel ou des solutions acides
directement dans les déchets de préparation de l’échantillon.
Le tampon de lyse (AL) et le tampon de lavage 1 (AW1) contiennent du chlorure de
guanidine et peuvent former des composés hautement réactifs au contact de l’eau de
Javel. Au cas où du liquide contenant ces tampons serait renversé sur la paillasse,
nettoyer avec un détergent de laboratoire et de l’eau. Si le liquide renversé contient des
agents à risque infectieux, nettoyer l’endroit contaminé d’abord avec un détergent et
de l’eau, puis avec de l’hypochlorite de sodium à 1% (v/v).
Si les flacons des tampons sont abîmés ou fuient, porter des gants et des lunettes de
sécurité pour les éliminer afin d’éviter tout risque de blessure.
QIAGEN n’a pas testé la présence de matériel infectieux dans les déchets liquides en
provenance du protocole QIAamp DSP Virus. Une contamination des déchets liquides
est très peu probable mais ne peut pas être complètement exclue. Par conséquent, les
déchets liquides sont à considérer comme infectieux et à traiter et éliminer selon les
mesures de sécurité en vigueur dans votre laboratoire.
Manuel du kit QIAamp DSP Virus 11/2007
7
1050717_FR
16.04.2008
10:27 Uhr
Seite 8
Les indications de Risque et Sécurité (R & S) de la classification CEE sont indiquées
ci-dessous pour les composants du kit QIAamp DSP Virus:
Tampon de lyse (AL) et tampon de lavage 1 (AW1)
Contient du chlorure de guanidine : nocif, irritant. Indications R & S:* R22-36/38, S1326-36-46
Protéase QIAGEN (QP)
Contient de la subtilisine (de Bacillus subtilis) : sensibilisant, irritant. Indications R & S:*
R37/38-41-42, S22-24-26-36/37/39-46
Service d’urgences 24h/24
En cas d’urgence, contacter le Service d’informations 24h/24 francophone :
Centre d’information Anti-poison, Mayence, Allemagne
Tél : 0049-6131-19240
* R22 : Nocif en cas d'ingestion ; R36/38 : Irritant pour les yeux et la peau ; R37/38 : Irritant pour les voies
respiratoires et la peau ; R41 : Risque de lésions oculaires graves ; R42 : Peut entraîner une sensibilisation
par inhalation ; S13 : Conserver à l'écart des aliments et boissons, y compris ceux pour animaux ;
S22 : Ne pas respirer les poussières ; S24 : Éviter le contact avec la peau ; S26 : En cas de contact avec
les yeux, laver immédiatement et abondamment avec de l'eau et consulter un spécialiste ; S36 : Porter un
vêtement de protection approprié ; S36/37/39 : Porter un vêtement de protection approprié, des gants et
un appareil de protection des yeux/du visage ; S46 : En cas d'ingestion, consulter immédiatement un
médecin et lui montrer l'emballage ou l'étiquette.
8
Manuel du kit QIAamp DSP Virus 11/2007
1050717_FR
16.04.2008
10:27 Uhr
Seite 9
Introduction
Le kit QIAamp DSP Virus Kit se sert d’une technologie bien établie pour extraire et
purifier en parallèle l’ADN et ARN viral. Le protocole QIAamp DSP Virus combine les
avantages de la fixation sélective d’une membrane de gel de silice avec des volumes
d’élution très faibles de 20 µl ou 60 µl.
L’intervalle linéaire du procédé QIAamp DSP Virus a été déterminé pour l’ARN VIH et
l’ADN VHB dans plusieurs tests diagnostic en aval (Tableau 1, Figures 1 et 2).
Tableau 1. Tests diagnostics en aval dans lesquels l’intervalle linéaire du procédé
QIAamp DSP Virus a été déterminé
Analyse
Kit
RT-PCR en temps réel
d’ARN VIH
TaqMan® assay et COBAS®
AMPLICOR HIV-1 MONITOR® Test
RT-PCR en temps réel
d’ADN VHB
TaqMan assay et COBAS AMPLICOR
HBV MONITOR® Test
Analyse de la linéarité d’extraction du procédé QIAamp par des tests TaqMan
Log UI/ml détecté
8
6
4
y = 1,0042x + 0,0832
R2 = 0,9974
2
0
1
2
3
5
4
6
log UI/ml introduit
7
8
Log UI/ml détecté
B
A
6
5
4
3
2
1
0
y = 0,9725x + 0,0982
R2 = 0,9984
1
2
3
4
5
Log UI/ml introduit
l
6
Figure 1 L’intervalle linéaire du procédé QIAamp DSP Virus avec un volume d’élution de 60 µl a été
déterminé par les tests TaqMan pour A l’ARN VIH et B l’ADN VHB .
Manuel du kit QIAamp DSP Virus 11/2007
9
1050717_FR
16.04.2008
10:27 Uhr
Seite 10
Analyse de la linéarité d’extraction du procédé QIAamp par des tests
COBAS AMPLICOR MONITOR
B
6
5
4
3
2
1
Log UI/ml détecté
Log UI/ml détecté
A
y = 1,0098x + 0,1234
R2 = 0,9982
2
3
4
Log UI/ml introduit
l
4
3
2
y = 0,8839x + 0,1718
R2 = 0,984
1
0
5
1
2
3
4
Log UI/ml introduit
5
Figure 2 L’intervalle linéaire du procédé QIAamp DSP Virus avec un volume d’élution de 60 µl a été
déterminé par les tests COBAS AMPLICOR MONITOR pour A l’ARN VIH et B l’ADN VHB.
Le protocole est prévu pour des applications avec le plasma ou le sérum pouvant
contenir du citrate ou de l’EDTA. Les échantillons peuvent être frais, lyophilisés ou
congelés, à condition qu’ils n’aient pas été congelés et décongelés plus d’une fois. Le
protocole peut être utilisé pour la purification d’ARN et ADN viral à partir d’un grand
nombre de virus à ARN ou ADN. Il a été développé de façon à éviter des
contaminations croisées entre les échantillons pour permettre, en toute sécurité, la
manipulation d’échantillons potentiellements infectieux. Le protocole est adapté au
traitement de plusieurs échantillons en parallèle. Les acides nucléiques viraux sont élués
dans du tampon d’élution (AVE) et prêts pour des réactions d’amplification ou pour une
conservation à –20°C.
Principe et procédé
Le protocole QIAamp DSP Virus comprend 4 étapes :
■
La lyse des particules virales dans l’échantillon
■
La fixation du lysat d’acides nucléiques viraux à la membrane de la colonne
QIAamp MinElute
■
Le lavage de la membrane
■
L’élution des acides nucléiques viraux de la membrane
Le protocole est réalisé avec des colonnes QIAamp MinElute à l’aide d’une chambre à
vide.
10
Manuel du kit QIAamp DSP Virus 11/2007
1050717_FR
16.04.2008
10:27 Uhr
Seite 11
Volume des échantillons
Pour le procédé QIAamp DSP Virus, les limites de détection (DL) et de quantification
(QL) conformes aux directives ICH 2QA et 2QB ont été déterminées à l’aide de
nombreux tests diagnostics en aval (Tableaux 2 et 3).
Tableau 2. Limites de détection du procédé QIAamp DSP Virus
Test en aval
Volume d’élution
Limite de détection*
artus™ RealArt™ HBV DNA
20 µl
2,31 UI/ml (n=240)
artus RealArt HCV RNA
20 µl
24,31 UI/ml (n=192)
AMPLICOR manual HIV RNA
60 µl
90,92 UI/ml (n=209)
TaqMan HBV DNA
60 µl
4,73 UI/ml (n=192)
* Titre pour lequel 95 positifs sur 100 tests réalisés ont pu être détectés
Tableau 3. Limites de quantification du procédé QIAamp DSP Virus
Test en aval
QL
CV (coefficent de
variation)
TaqMan HBV DNA
5,7 UI/ml
< 70% (n=88)
TaqMan HIV RNA
52 UI/ml
< 60% (n=88)
COBAS AMPLICOR HIV RNA
100 UI/ml
< 60% (n=88)
COBAS AMPLICOR HBV DNA
30 UI/ml
< 60% (n=88)
COBAS AMPLICOR HCV RNA
700 UI/ml
< 60% (n=66)
Lyse des particules virales
Les échantillons sont lysés dans des conditions dénaturantes à température élevée. La
lyse est réalisée en présence de Protéase QIAGEN (QP) et de tampon de lyse (AL).
L’ensemble des deux composants assure l’inactivation des RNases.
Manuel du kit QIAamp DSP Virus 11/2007
11
1050717_FR
16.04.2008
10:27 Uhr
Seite 12
Fixation d’acides nucléiques à la membrane de la colonne QIAamp MinElute
Afin d’optimiser la fixation d’ADN et ARN viral à la membrane de la colonne QIAamp
MinElute, il est nécessaire d’ajouter d’abord de l’éthanol au lysat. Chaque lysat est
transféré dans une colonne QIAamp MinElute. Les acides nucléiques viraux sont fixés
à la membrane de gel de silice alors que le lysat passe à travers la membrane à l’aide
de la dépression de la chambre à vide.
Elimination de résidus de contaminants
Pendant que les acides nucléiques viraux restent fixés sur la membrane de la colonne
QIAamp MinElute, les contaminants sont éliminés par lavage, d’abord par le premier
tampon de lavage 1 (AW1), ensuite par le deuxième tampon de lavage 2 (AW2), puis
par l’éthanol.
Elution des acides nucléiques purifiés
L’élution des acides nucléiques viraux de la membrane de la colonne QIAamp MinElute
est réalisée à l’aide du tampon d’élution (AVE). La colonne QIAamp MinElute permet de
traiter des volumes d’élution de 20 µl ou 60 µl.
Selon le test utilisé en aval, le volume de la réaction peut contenir jusqu’à 50% de l’éluat
d’acides nucléiques sans produire d’effets inhibants.
12
Manuel du kit QIAamp DSP Virus 11/2007
1050717_FR
16.04.2008
10:27 Uhr
Seite 13
Procédé QIAamp DSP Virus
Echantillon
Avant de commencer, lire attentivement le protocole
(page 22)
dans le tube de lyse, déposer 75 µl de QP,
500 µl d’échantillon et 500 µl de AL
Lyser
Vortexer 15 sec
Incuber 15 min (±1 min) à 56°C (±1°C)
Ajouter 600 µl d’éthanol
Vortexer 15 sec
Incuber 5 min (±1 min) à température ambiante (15 à 25°C)
Fixer
Transférer le lysat dans la colonne QIAamp MinElute avec le
réhausseur attaché
Vide
Laver
(AW1)
Détacher le réhausseur
de la colonne avant
d’appliquer le vide !
Ajouter 600 µl de AW1 reconstitué
Détacher le réhausseur
Vide
Laver
(AW2)
Ajouter 750 µl de AW2 reconstitué
Vide
Laver
(Ethanol)
Ajouter 750 µl d’éthanol
Vide
Placer la colonne QIAamp MinElute dans le tube de lavage
Centrifuger
pour sécher
Eluer
Centrifuger 1 min à 14000 rpm
Placer la colonne QIAamp MinElute dans le tube de lavage
Incuber 3 min à 56°C
Placer la colonne QIAmp MinElute dans le tube d’élution
Ajouter 20 µl ou 60 µl de AVE
Incuber 3 min à température ambiante (15 à 25°C)
Centrifuger 1 min à 14000 rpm
Acides nucléiques viraux purifiés
Manuel du kit QIAamp DSP Virus 11/2007
13
1050717_FR
16.04.2008
10:27 Uhr
Seite 14
Matériel supplémentaire nécessaire
Lors de la manipulation de produits chimiques, toujours porter une blouse appropriée,
des gants jetables et des lunettes de sécurité. Pour plus d’informations veuillez consulter
les Fiches de Données de Sécurité (FDS) disponibles chez le fournisseur du produit.
■
Ethanol (96 à 100%)
■
Pipettes* et cônes (il est recommandé d’utiliser des cônes à filtre afin d’éviter toute
contamination croisée)
■
Gants jetables
■
Bloc chauffant* pour la lyse des échantillons à 56°C (il est recommandé d’utiliser
le Thermomixer comfort Eppendorf® avec bloc chauffant pour des microtubes† de
2,0 ml)
■
Microcentrifugeuse*
■
Eprouvette (50 ml)
■
Agitateur à vortex
■
Un système QIAvac 24 Plus‡ (Chambre à vide QIAvac 24 Plus, Réf. 19413,
QIAvac Connecting System, Réf. 19419 et pompe à vide, Réf. 84020), ou un
système équivalent de chambre à vide générale de laboratoire
* Afin d’assurer que les échantillons soient correctement traités au cours du protocole QIAamp DSP Virus, il
est fortement recommandé de calibrer tous les instruments (par exemple les pipettes et le bloc chauffant)
selon les recommandations du fabricant.
†
La liste des fournisseurs n’est pas complète. Il manque un grand nombre de fournisseurs de matériel
biologique.
‡ Disponible à partir de la mi-mai 2004.
Pour plus d’informations veuillez consulter www.qiagen.com/products/accessories
14
Manuel du kit QIAamp DSP Virus 11/2007
1050717_FR
16.04.2008
10:27 Uhr
Seite 15
Remarques importantes
Remarques préliminaires importantes
■
Vérifier le contenu du kit dès son arrivée et s’assurer de l’intégrité des composants.
Si les emballages blister ou les flacons de tampon sont endommagés, contacter le
Support Technique QIAGEN ou votre distributeur local. Au cas où du liquide serait
renversé, veuillez vous référer aux “ Informations de Sécurité ” (page 7). Ne pas
utiliser de composants endommagés puisque la performance du kit risque d’être
plus faible.
■
Toujours utiliser du matériel exempt de RNases.
■
Au cours du protocole conserver l’éthanol (96 à 100%) dans la glace.
■
Changer de cône de pipette après chaque transfert de liquide. Pour éviter des
contaminations croisées, il est recommandé d’utiliser des cônes à filtre.
■
Les centrifugations seront réalisées à température ambiante (15 à 25°C).
■
Toujours utiliser des gants jetables et s’assurer régulièrement qu’ils ne sont pas
contaminés par l’échantillon.
■
Jeter les gants s’ils sont contaminés. Les jeter au plus tard après toute étape portant
le symbole
.
■
N’ouvrir qu’un tube à la fois afin d’éviter toute contamination croisée.
■
Ne pas utiliser avec le kit actuellement en utilisation des composants de kits
différents, à moins que le numéro du lot ne soit le même.
■
Eviter de contaminer les composants du kit avec des microbes.
■
Afin de se protéger du matériel potentiellement infectieux, il est recommandé de
travailler sous des conditions de flux d’air laminaire jusqu’à ce que les échantillons
soient lysés.
■
Le kit doit uniquement être utilisé par du personnel formé aux pratiques d’un
laboratoire de diagnostic in vitro.
■
Le protocole est expliqué pour le traitement d’un seul échantillon de plasma ou de
sérum. Il est toutefois possible de traiter sur le QIAvac 24 Plus jusqu’à 24
échantillons en parallèle.
Manuel du kit QIAamp DSP Virus 11/2007
15
1050717_FR
16.04.2008
10:27 Uhr
Seite 16
Préparation des ARN
Lors de la purification d’ARN viral, travailler rapidement.
Le tampon d’élution (AVE) contient de l’azide de sodium*, une substance antimicrobienne
qui évite la croissance d’organismes produisant des RNases. Comme ce tampon ne
contient pas d’inhibeurs de RNases, il n’inhibera pas activement les RNases introduites
par une utilisation non appropriée. Faire extrêmement attention à ne pas contaminer le
tampon d’élution (AVE) par les RNases au moment de l’utilisation.
Conservation des échantillons
Après prélèvement et centrifugation, le plasma ou le sérum peuvent être conservés
6 heures entre 2 et 8°C. Pour une conservation au-delà de cette période, il est
recommandé de les aliquoter et de les conserver à –20°C ou –80°C. Ne pas
congeler/décongeler plus d’une fois les échantillons de plasma ou de sérum. Les cycles
de décongélation/congélation entraînent une dénaturation et une précipitation des
protéines, conduisant à une réduction du titre viral. Par conséquent, le rendement en
ADN et ARN viral en sera réduit. De plus, les cryoprécipités formés par la
congélation/décongélation risquent d’obstruer la membrane QIAamp MinElute. Si des
cryoprécipités sont visibles, les culotter par une centrifugation de 3 minutes à
6800 x g. Prélever le surnageant clarifié sans toucher au culot et poursuivez la
purification.
Préparation des réactifs et tampons
Préparation de la Protéase QIAGEN
Ajouter le contenu entier du flacon de Solvant de Protéase (PS), 4,4 ml, au flacon de
Protéase QIAGEN (QP) lyophilisée et mélanger avec précaution. Pour éviter que le
mélange ne mousse, mélanger en retournant plusieurs fois le flacon. Vérifier que la
Protéase QIAGEN (QP) a été entièrement dissoute.
i
Ne pas ajouter la Protéase QIAGEN (QP) directement au tampon de lyse (AL).
Addition d’ARN entraîneur et un contrôle interne au tampon de lyse
L’ARN entraîneur a deux fonctions. D’abord, il renforce la fixation des acides nucléiques
viraux sur la colonne QIAamp MinElute, en particulier s’il y a très peu de molécules cibles
dans l’échantillon. Deuxièmement, l’addition de grands volumes d’ARN entraîneur
réduit la possibilité d’une dégradation de l’ARN viral dans les rares cas où les molécules
de RNases n’ont pas été dénaturées par les sels chaotropiques et le détergent dans le
tampon de lyse (AL). Si l’ARN entraîneur n’est pas ajouté au tampon de lyse (AL), le
rendement en ADN ou ARN viral peut s’en trouver réduit.
* Lors de la manipulation de produits chimiques, toujours porter une blouse appropriée, des gants jetables et
des lunettes de sécurité.
16
Manuel du kit QIAamp DSP Virus 11/2007
1050717_FR
16.04.2008
10:27 Uhr
Seite 17
L’ARN entraîneur peut également être inclus dans certains réactifs de contrôle interne
de tests en aval disponibles dans le commerce. Dans ces cas, veuillez vous référer aux
instructions d’utilisation du fabricant du test.
Pour l’utilisation du kit QIAamp DSP Virus avec des systèmes d’amplification diagnostics
il est fortement recommandé d’utiliser un contrôle interne. Ajouter le contrôle interne
d’ARN ou ADN et l’ARN entraîneur reconstitué au tampon de lyse (AL). Mélanger
vigoureusement en retournant 10 fois le tube. Afin d’éviter que le mélange ne mousse,
ne pas vortexer.
Veuillez vous référer aux instructions du fabricant pour déterminer la concentration
optimale du contrôle interne. Si vous utilisez une concentration différente de celle
recommandée vous risquez d’obtenir des résultats incorrects. Lorsque vous calculez la
quantité de contrôle interne, tenir compte du volume initial de l’échantillon ainsi que du
volume d’élution. Le kit QIAamp DSP Virus utilise un volume d’échantillon de 500 µl.
Pour préparer la solution d’ARN entraîneur, ajouter 310 µl de tampon d’élution (AVE)
au tube contenant 310 µg d’ARN entraîneur lyophilisé pour obtenir une solution
d’1 µg/µl. Bien dissoudre l’ARN entraîneur, l’aliquoter et le congeler à –20°C. Ne pas
congeler/décongeler les aliquots d’ARN entraîneur plus de 2 fois.
Attention : l’ARN entraîneur ne se dissout pas dans le tampon de lyse (AL). Le dissoudre
d’abord dans le tampon d’élution (AVE) puis l’ajouter au tampon de lyse (AL). S’assurer
que l’ARN entraîneur soit complètement dissous dans le bon volume de tampon
d’élution (AVE) avant de le mélanger avec le tampon de lyse (AL).
i
Toujours utiliser le bon contrôle interne pour le test en aval. Pour plus
d’informations, veuillez vous référer aux instructions du fabricant.
Calculer la quantité de mélange de tampon de lyse (AL)/ARN entraîneur nécessaire
par lot d’échantillons en choisissant au tableau 3 (page 18) le nombre d’échantillons
à traiter simultanément. Calculer le volume d’après la formule suivante :
n x 0,55 ml = y ml
y ml x 11,2 µl/ml = z µl
n = le nombre d’échantillons à traiter simultanément
y = la quantité du tampon de lyse (AL) calculée
z = la quantité d’ARN entraîneur/tampon d’élution (AVE) à ajouter au tampon de lyse
(AL)
Manuel du kit QIAamp DSP Virus 11/2007
17
1050717_FR
16.04.2008
10:27 Uhr
Seite 18
Tableau 3. Volumes de tampon de lyse (AL) et de mélange d’ARN entraîneur/tampon
d’élution (AVE) nécessaires au protocole QIAamp DSP Virus
Nombre
Vol. d’AL
d’échantillons
(ml)
Vol. d’ARN
entraîneur/
AVE (µl)
Nombre
Vol. d’AL
d’échantillons
(ml)
Vol. d’ARN
entraîneur/
AVE (µl)
1
0,55
6,2
13
7,15
80,0
2
1,10
12,3
14
7,70
86,0
3
1,65
18,5
15
8,25
92,4
4
2,20
24,6
16
8,80
98,6
5
2,75
30,8
17
9,35
104,7
6
3,30
37,0
18
9,90
110,9
7
3,85
43,1
19
10,45
117,0
8
4,40
49,3
20
11,00
123,2
9
4,95
55,0
21
11,55
129,4
10
5,50
61,6
22
12,10
135,5
11
6,05
67,8
23
12,65
141,7
12
6,60
73,9
24
13,20
147,8
Préparation du tampon de lavage 1
A l’aide d’une éprouvette ajouter 25 ml d’éthanol (96 à 100%) au flacon contenant
19 ml de concentré de tampon de lavage 1 (AW1). Conserver le tampon de lavage
1 reconstitué à température ambiante (15 à 25°C).
i
Avant de commencer le protocole, toujours mélanger le tampon de lavage
1 (AW1) en retournant plusieurs fois le flacon.
Préparation du tampon de lavage 2
A l’aide d’une éprouvette ajouter 30 ml d’éthanol (96 à 100%) au flacon contenant
13 ml de concentré de tampon de lavage 2 (AW2). Conserver le tampon de lavage 2
(AW2) reconstitué à température ambiante (15 à 25°C).
i
Avant de commencer le protocole, toujours mélanger le tampon de lavage 2
(AW2) en retournant plusieurs fois le flacon.
Préparation du tampon d’élution
Le kit comprend quatre tubes de tampon d’élution (AVE). Prendre soin de ne pas
contaminer le tampon avec les RNases. Si vous utilisez un kit pour 4 préparations ou
moins, il est recommandé de jeter le tube de tampon d’élution (AVE) à la fin du
protocole.
18
Manuel du kit QIAamp DSP Virus 11/2007
1050717_FR
16.04.2008
10:27 Uhr
Seite 19
Elution des acides nucléiques viraux
Les acides nucléiques viraux élués dans 20 µl de tampon d’élution (AVE) peuvent
augmenter la sensibilité dans les tests en aval nécessitant des petits volumes initiaux
(par exemple certains tests de PCR et RT-PCR) .
Le volume de l’éluat obtenu de la colonne QIAamp MinElute peut être inférieur de 5 µl
par rapport au volume de tampon d’élution (AVE) déposé sur la colonne. Une élution
d’acides nucléiques viraux avec 60 µl de tampon d’élution (AVE) donnera par exemple
un éluat d’environ 55 µl, et donc une élution avec 20 µl donnera un éluat d’environ
15 µl. Le volume de l’éluat obtenu dépend de la nature de l’échantillon. Si le rendement
de l’éluat est trop faible pour le test en aval, augmenter son volume en ajoutant plus de
tampon d’élution (AVE).
L’éluat est récolté dans les tubes d’élution (ET). Pour une conservation des acides
nucléiques de 24 heures il est recommandé de les réfrigérer à une température entre
2 et 8°C.
Rendement et qualité des acides nucléiques viraux
Le rendement et la qualité des acides nucléiques viraux sont adaptés à tous les types
de procédés de détection en aval, en diagnostic moléculaire. Le test diagnostic doit être
réalisé selon les instructions du fournisseur.
Mise en place du système QIAvac 24 Plus
S’assurer de bien placer le réhausseur de la colonne (EXT), la colonne QIAamp
MinElute, le VacConnector (VC) et la VacValve (voir Figure 3).
4
3
2
1
Figure 3 Assemblage des composants du kit QIAamp DSP Virus pour le traitement sous vide des échantillons :
1 : VacValve (fournie avec le système à vide)
3 : Colonne QIAamp MinElute
2 : VacConnector (VC)
4 : Réhausseur de la colonne (EXT)
Manuel du kit QIAamp DSP Virus 11/2007
19
1050717_FR
16.04.2008
10:27 Uhr
Seite 20
Pour une utilisation avec le système QIAvac 24 Plus il est recommandé d’étiqueter les
tubes de lyse (LT), les tubes d’élution (ET) et les colonnes QIAamp MinElute selon le
schéma en Figure 4, afin d’éviter de mélanger les échantillons. L’image peut être
photocopiée afin de noter le nom des échantillons sur la feuille.
20
01
02
03
04
05
06
13
14
15
16
17
18
Manuel du kit QIAamp DSP Virus 11/2007
1050717_FR
16.04.2008
10:27 Uhr
Seite 21
Date :
Opérateur :
Expérience n° :
07
08
09
10
11
12
19
20
21
22
23
24
Figure 4 Schéma pour le marquage des tubes de lyse (LT), des tubes d’élution (ET) et des colonnes QIAamp
MinElute utilisés sur le système QIAvac 24 Plus.
Manuel du kit QIAamp DSP Virus 11/2007
21
1050717_FR
16.04.2008
10:27 Uhr
Seite 22
Protocole
Protocole : Extraction et Purification d’Acides
Nucléiques Viraux à partir de Plasma et de Sérum
Pour la purification d’acides nucléiques viraux à partir de 500 µl de plasma ou de
sérum traités à l’EDTA ou au citrate.
Avant de commencer
■
Amener les échantillons à température ambiante (15 à 25°C) et vérifier qu’il sont
bien mélangés.
■
Ajouter la solution d’ARN entraîneur dans le tampon d’élution (AVE) ou un contrôle
interne au tampon de lyse (AL) suivant les instructions de la page 15.
■
Vérifier que le tampon de lavage 1 (AW1), le tampon de lavage 2 (AW2) et la
Protéase QIAGEN (QP) ont bien été préparés suivant les instructions dans les
“ Remarques Importantes ” de la page 15.
■
Amener le tampon d’élution (AVE) à température ambiante (15 à 25°C) pour
l’étape 18. Si possible, utiliser du tampon d’élution frais (AVE) pour chaque tour
de protocole (4 tubes sont fournis dans le kit).
■
Préchauffer un bloc chauffant à 56°C pour les étapes 4 et 17.
■
Poser un VacConnector (VC) dans chaque luer adapter du système à vide pour
éviter toute contamination croisée.
■
Vérifier que le flacon de déchets du système à vide soit vide et que toutes les
tubulures soient bien connectées.
■
Pour plus d’informations sur le système à vide, plus particulièrement pour sa
maintenance, veuillez vous référer au manuel fourni avec le système.
Protocole
1.
Déposer 75 µl de Protéase QIAGEN (QP) dans un tube de lyse (LT).
i Avant de l’utiliser, vérifier la date d’expiration de la protéase reconstituée.
2.
Ajouter 500 µl de plasma ou de sérum au tube de lyse (LT).
3.
Ajouter 500 µl de tampon de lyse (AL) (contenant 11,2 µg/ml d’ARN entraîneur)
au tube de lyse (LT), fermer le capuchon et mélanger 15 sec en vortexant.
Pour assurer une lyse efficace, il est essentiel de bien mélanger l’échantillon et le
tampon de lyse (AL) afin d’obtenir une solution homogène.
i Le tampon de lyse (AL) contient le contrôle interne. Puisque le tampon de lyse
(AL) a une forte viscosité, s’assurer d’ajouter le bon volume de tampon de lyse
(AL) en le déposant avec précaution ou en utilisant une pipette adaptée telle
une pipette Eppendorf multistep (à module volumétrique) ou équivalente.
i Ne pas ajouter la Protéase QIAGEN (QP) directement dans le tampon de lyse
(AL).
22
Manuel du kit QIAamp DSP Virus 11/2007
1050717_FR
16.04.2008
10:27 Uhr
Seite 23
4.
Incuber 15 min (±1 min) à 56°C (±1°C).
5.
Centrifuger ≥5 sec le tube de lyse (LT) à vitesse maximale pour récupérer les
gouttelettes accumulées dans le capuchon.
Changer de gants et ouvrir le tube de lyse (LT) avec précaution.
7.
Ajouter 600 µl d’éthanol (96 à 100%) au tube de lyse (LT), fermer le capuchon et
bien mélanger ≥15 sec en vortexant. Incuber 5 min (±1 min) à température
ambiante (15 à 25°C).
8.
Centrifuger ≥5 sec le tube de lyse (LT) à vitesse maximale pour récupérer les
gouttelettes accumulées dans le capuchon.
9.
Poser la colonne QIAamp MinElute sur le VacConnector (VC) sur le système à vide
(voir Figure 3, page 19). Insérer un réhausseur de colonne (EXT) dans la colonne
QIAamp MinElute ouverte.
i Garder le tube de lavage (WT) pour le séchage par centrifugation à l’étape 16.
10.
Changer de gants et n’ouvrir qu’un tube à la fois.
11. Déposer avec précaution la totalité du lysat de l’étape 7 dans le réhausseur (EXT)
de la colonne QIAamp MinElute sans en mouiller le bord. Eviter de toucher la
membrane de la colonne QIAamp MinElute avec le cône de la pipette.
12. Brancher la pompe à vide. Après avoir passé le lysat à travers la colonne QIAamp
MinElute ouvrir la valve du système à vide et laisser rentrer l’air.
Si vous traitez plusieurs colonnes QIAamp MinElute à la fois, il est recommandé
de fermer la VacValve de chaque colonne après que le lysat soit passé, afin de
réduire le temps de cette étape sous vide.
i Si le lysat n’est pas entièrement passé à travers la membrane au bout de
15 min, jeter la colonne QIAamp MinElute et répéter le protocole avec un
nouvel échantillon.
i La valve du système à vide doit être utilisée pour relâcher rapidement la
dépression du vide.
13. Déposer 600 µl de tampon de lavage 1 (AW1) dans la colonne QIAamp MinElute.
Détacher avec précaution le réhausseur de la colonne (EXT) et le jeter. Fermer la
valve du système à vide. Après avoir passé le tampon de lavage 1 (AW1) à travers
la colonne QIAamp MinElute ouvrir la valve du système à vide et laisser rentrer
l’air.
i Pour éviter toute contamination croisée, s’assurer de ne pas passer les
réhausseurs de colonnes (EXT) au-dessus de colonnes QIAamp MinElute
voisines.
Manuel du kit QIAamp DSP Virus 11/2007
23
Protocole
6.
Protocole
1050717_FR
16.04.2008
10:27 Uhr
Seite 24
14. Déposer 750 µl de tampon de lavage 2 (AW2) dans la colonne QIAamp MinElute
sans en mouiller le bord. Eviter de toucher la membrane de la colonne QIAamp
MinElute avec le cône de la pipette. Laisser le capuchon de la colonne ouvert, et
fermer la valve du système à vide. Après avoir passé le tampon de lavage 2 (AW2)
à travers la colonne QIAamp MinElute ouvrir la valve du système à vide et laisser
rentrer l’air.
15. Déposer 750 µl d’éthanol (96 à 100%) dans la colonne QIAamp MinElute sans en
mouiller le bord. Eviter de toucher la membrane de la colonne QIAamp MinElute
avec le cône de la pipette. Après avoir passé l’éthanol à travers la colonne QIAamp
MinElute ouvrir la valve du système à vide et laisser rentrer l’air.
i Utiliser un cône à filtre pour déposer l’éthanol dans la colonne QIAamp
MinElute.
16. Fermer le capuchon de la colonne QIAamp MinElute et la détacher du système.
Jeter le VacConnector (VC). Placer la colonne QIAamp MinElute dans le tube de
lavage (gardé à l’étape 9) et centrifuger 1 min à vitesse maximale (environ
20000 x g ou 14000 rpm) pour sécher la membrane complètement. Jeter le tube
de lavage avec le filtrat.
i L’oubli de la centrifugation de séchage peut entraîner une inhibition de votre
test en aval.
17. Placer la colonne QIAamp MinElute dans un nouveau tube de lavage (WT) et
incuber le tube ouvert 3 min à 56°C pour laisser évaporer les résidus de liquide.
18. Placer la colonne QIAamp MinElute dans un nouveau tube d’élution (ET) et jeter le
tube de lavage (WT). Ouvrir le capuchon de la colonne QIAamp MinElute avec
précaution et déposer au centre de la colonne 20 µl ou 60 µl de tampon d’élution
(AVE) (dépendant de votre test en aval). Fermer le capuchon et incuber ≥3 min
à température ambiante (15 à 25°C). Centrifuger 1 min à vitesse maximale (environ
20000 x g ou 14000 rpm) pour éluer les acides nucléiques viraux.
i Une fois le protocole terminé, suivre les instructions de maintenance pour le
système à vide (pour plus d’informations, veuillez vous référer au manuel
fourni avec le système à vide).
24
Manuel du kit QIAamp DSP Virus 11/2007
1050717_FR
16.04.2008
10:27 Uhr
Seite 25
Manuel du kit QIAamp DSP Virus 11/2007
25
1050717_FR
26
16.04.2008
10:27 Uhr
Seite 26
Manuel du kit QIAamp DSP Virus 11/2007
1050717_FR
16.04.2008
10:27 Uhr
Seite 27
Manuel du kit QIAamp DSP Virus 11/2007
27
1050717_FR
16.04.2008
10:27 Uhr
Seite 28
www.qiagen.com
Australia ■ Orders 03-9840-9800 ■ Fax 03-9840-9888 ■ Technical 1-800-243-066
Austria ■ Orders 0800/28-10-10 ■ Fax 0800/28-10-19 ■ Technical 0800/28-10-11
Belgium ■ Orders 0800-79612 ■ Fax 0800-79611 ■ Technical 0800-79556
Canada ■ Orders 800-572-9613 ■ Fax 800-713-5951 ■ Technical 800-DNA-PREP (800-362-7737)
China ■ Orders 021-51345678 ■ Fax 021-51342500 ■ Technical 021-51345678
Denmark ■ Orders 80-885945 ■ Fax 80-885944 ■ Technical 80-885942
Finland ■ Orders 0800-914416 ■ Fax 0800-914415 ■ Technical 0800-914413
France ■ Orders 01-60-920-926 ■ Fax 01-60-920-925 ■ Technical 01-60-920-930 ■ Offers 01-60-920-928
Germany ■ Orders 02103-29-12000 ■ Fax 02103-29-22000 ■ Technical 02103-29-12400
Hong Kong ■ Orders 800 933 965 ■ Fax 800 930 439 ■ Technical 800 930 425
Ireland ■ Orders 1800-555-049 ■ Fax 1800-555-048 ■ Technical 1800-555-061
Italy ■ Orders 02-33430411 ■ Fax 02-33430426 ■ Technical 800-787980
Japan ■ Telephone 03-5547-0811 ■ Fax 03-5547-0818 ■ Technical 03-5547-0811
Korea (South) ■ Orders 1544 7145 ■ Fax 1544 7146 ■ Technical 1544 7145
Luxembourg ■ Orders 8002-2076 ■ Fax 8002-2073 ■ Technical 8002-2067
The Netherlands ■ Orders 0800-0229592 ■ Fax 0800-0229593 ■ Technical 0800-0229602
Norway ■ Orders 800-18859 ■ Fax 800-18817 ■ Technical 800-18712
Singapore ■ Orders 65-67775366 ■ Fax 65-67785177 ■ Technical 65-67775366
Sweden ■ Orders 020-790282 ■ Fax 020-790582 ■ Technical 020-798328
Switzerland ■ Orders 055-254-22-11 ■ Fax 055-254-22-13 ■ Technical 055-254-22-12
UK ■ Orders 01293-422-911 ■ Fax 01293-422-922 ■ Technical 01293-422-999
USA ■ Orders 800-426-8157 ■ Fax 800-718-2056 ■ Technical 800-DNA-PREP (800-362-7737)
1050717FR 11/2007
Sample & Assay Technologies
1024585FR 04/2004