Habilitation à Diriger les Recherches

Habilitation à Diriger les Recherches
Discipline : Biologie
Université Paris-Sud XI
UFR Scientifique d’Orsay
Christophe Antoniewski
Mémoire :
Épigénétique de la Drosophile :
des histones aux petits ARN interférants.
Soutenu le 16 décembre 2005
Devant le jury composé de :
Monsieur Dario Coen, Professeur (Université Paris-Sud XI), Président
Madame Annick Harel-Bellan, Directeur de Recherche (CNRS), rapporteur
Monsieur Jacques Pradel, Directeur de Recherche (CNRS), rapporteur
Monsieur Laurent Théodore, Professeur (Université Paris-Sud XI), rapporteur
Monsieur Jean-Antoine Lepesant, Directeur de Recherche (CNRS), examinateur
Remerciements
Je voudrais en tout premier lieu remercier très chaleureusement toute l’équipe du « G5 »
Génétique & Épigénétique de la Drosophile, Josette Pidoux, Hélène Thomassin, Delphine
Fagegaltier, Bassam Berry, Caroline Jacquier et Clément Carré. Merci d’avoir tenté
l’aventure, et de supporter avec bonne humeur mes coups de « stress », je l’espère pas trop
fréquents quand même… Merci surtout pour tout ce travail fourni avec tant d’énergie et
dans la bonne humeur pendant ces deux années d’existence du « GED ». Ça ne pourrait pas
marcher sans vous et sachez que j’en suis bien conscient !
Je souhaite ensuite exprimer toute ma reconnaissance à Jean-Antoine Lepesant, pour les
douze années passées avec bonheur dans son laboratoire de « Biologie du Développement »,
pour sa confiance, pour son soutien, et pour les innombrables choses, grandes et petites,
qu’il m’a apprises. Ce mémoire est aussi l’occasion d’adresser mes pensées attendries à Jean
Deutsch, Pascal Lapie, Bruno Mugat, François Schweisguth, Constantin Yanicostas, Florence
Maschat, Nuria Serrano, Hélène Doerflinger, Geneviève Gonzy, Antoine Guichet, Patricia et
Kedidja, les Martines… et à toutes celles et ceux qui ont accompagné alors ma route à
l’Institut Jacques Monod. Mes pensées vont aussi à mes camarades d’infortune, Marcel
Koken, Ali Saib, Frédérique Quignon, Luis Pélicano et Valérie Lallemand, et à la « parenthèse
enchantée » de Saint-Louis.
Un grand merci aux étudiants en thèse, Véronique Brodu, Jean-Yves Roignant, Dimitri
Szymczak et Clément Carré qui ont accepté de tenter l’aventure avec moi, et qui j’espère ne
s’en sont pas trop mal sortis ! Une pensée particulière pour Véronique, la toute première, et
pour la « Gataventure » que nous avons partagée, et évidemment pour Clément, le petit
gars sympa croisé un jour à la cafétéria. Décidemment, la vertu des machines à café… Merci
aussi Clément pour avoir, cette fois ci, accepté de changer de rôle et d’être mon correcteur.
Tu es mûr pour la thèse !
Merci aux collaborateurs et amis, et en particulier à Hélène Benes, Vince Henrich, Marcus
Lezzi et Carsten Elke, Alain Bruat et Jean-Louis Couderc, Laurent Théodore, Alex Mazo,
Carl Thummel, Claude Desplan, Margrit Schubiger et Jim Truman, François Dautry,
Geneviève Almouzni et Nathalie Dostatni, Hervé Bouhin et Jean-Philippe Charles, Catherine
Bourgouin, Dario Coen, Stéphane Ronsseray, Thierry Grange, Luis Quintana-Murci et
Olivier Voinnet, pour la confiance qu’ils m’ont témoignée, les aides précieuses et les
discussions passionnées.
Je veux dire toute ma gratitude aux « Pastoriens » pour l’accueil qu’ils m’ont réservé dans
le département de Biologie du Développement de l’Institut Pasteur. Je tiens tout
ii
particulièrement à remercier Margaret Buckingham pour son attention et son soutien
efficace et constant. Une pensée amicale aussi pour Charles Babinet, Michel CohenTannoudji, Catherine Bourgouin, Nicole Guiso et Jean-Christophe Olivo.
Tout mon amour à mes deux anges gardiens, Gabrielle et Annabelle, sans qui rien ne
serait possible ! Ces derniers jours n’ont pas été de tout repos…
Enfin, je voudrais remercier Dario Coen, Annick Harel-Bellan, Jacques Pradel, Laurent
Théodore, et Jean-Antoine Lepesant, d’avoir accepté de juger ce travail et de siéger dans
mon jury d’HDR, et Marie-Jo Daboussi et Annie Gloux pour leur encadrement
« administratif » sympathique et efficace.
iii
Table des matières
1.
CURRICULUM VITAE ABRÉGÉ ........................................................................................................ 1
2.
INTRODUCTION..................................................................................................................................... 4
3.
PETITE, MAIS COMPLEXE : L’UNITÉ DE RÉPONSE HORMONALE DU GÈNE FBP1...... 6
3.1.
RÉGULATION HORMONALE DU DÉVELOPPEMENT POST-EMBRYONNAIRE CHEZ D. MELANOGASTER. .. 6
3.2.
CARACTÉRISATION MOLÉCULAIRE DE LA « CASCADE D’ASHBURNER »............................................... 8
3.3.
RÉGULATION TISSULAIRE DE LA RÉPONSE HORMONALE ..................................................................... 10
3.4.
L’ENHANCER DU GÈNE FBP1, UN MODÈLE POUR ANALYSER IN VIVO LE FONCTIONNEMENT D’UNE
UNITÉ DE RÉPONSE À L’HORMONE STÉROÏDE ECDYSONE......................................................................................... 12
3.4.1.
Le facteur GATAb (Brodu et al., 1999). .................................................................................... 13
3.4.2.
Une approche originale pour analyser le mode d’action de GATAb (Brodu et al., 2001)..... 14
4.
DE BROAD À BATMAN, EN PASSANT PAR UN DOMAINE BTB-POZ (FAUCHEUX ET
AL., 2003). .................................................................................................................................................................... 16
5.
DE LA CHROMATINE À RETORDRE AVEC DGCN5................................................................. 19
5.1.
« FLASH-BACK »................................................................................................................................... 19
5.2.
UN CONGRÈS IMPORTANT ..................................................................................................................... 20
5.3.
GCN5, UNE HAT À MULTIPLES FACETTES. .......................................................................................... 21
5.3.1.
Le membre fondateur d’une famille d’histone-acétyltransférases. .......................................... 21
5.3.2.
Une sous-unité d’un complexe d’initiation de la transcription................................................ 22
5.3.3.
Des partenaires très en vue. ...................................................................................................... 23
5.3.4.
Au club des coactivateurs des récepteurs nucléaires : acétylation à tous les étages ! ........... 24
5.3.5.
Un acteur au cœur de l’hypothèse du« code des histones »..................................................... 25
5.4.
LA PROTÉINE GCN5 DE DROSOPHILE ET LES QUESTIONS INITIALES. ................................................... 28
5.5.
L’HAT DGCN5 EST UN ACTEUR ESSENTIEL DE LA MÉTAMORPHOSE DE LA DROSOPHILE. ................. 30
5.6.
LES FUTURS DU PROJET DGCN5............................................................................................................ 42
5.6.1.
Beau temps… après dissipation des brumes matinales : Gcn5 est-il un coactivateur du
récepteur EcR/USP de l’ecdysone ?................................................................................................................... 42
5.6.2.
Les gènes cibles de dGcn5 : une analyse globale par puces à ADN. ...................................... 44
5.6.3.
Interactions fonctionnelles entre dGcn5 et dCBP. ................................................................... 46
5.6.4.
Le complexe de remodelage NURF........................................................................................... 49
6.
UN MONDE DE PETITS ARNS .......................................................................................................... 52
6.1.
LES VERTUS D’UNE MACHINE À CAFÉ. ................................................................................................. 52
6.2.
DES TRANSGÈNES IR POUR CONTRÔLER L’INTERFÉRENCE PAR L’ARN CHEZ LA DROSOPHILE :....... 53
6.3.
UN SUPER « JOKER » ! LES LIGNÉES TRANSGÉNIQUES UAS-IR[ECR-CORE]...................................... 64
6.4.
LES ANNÉES GLORIEUSES DES PETITS ARN : PETIT RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE. ................................ 65
iv
6.4.1.
Les différentes classes de petits ARN ........................................................................................ 65
6.4.2.
Des machines pour faire taire… par tous les moyens. ............................................................. 67
6.4.3.
Les miRNA : une nouvelle classe de régulateurs de l’expression génétique........................... 69
6.5.
6.5.1.
Inhibiteurs du RNAi et des miRNA. ........................................................................................... 70
6.5.2.
Systèmes transgéniques indicateurs. ......................................................................................... 71
6.5.3.
Des puces à LNA pour analyser les profils d’expression des miRNAs. ................................... 71
6.6.
7.
DES OUTILS POUR ANALYSER LES FONCTIONS DES PETITS ARN CHEZ LA DROSOPHILE..................... 70
PROJET .................................................................................................................................................. 72
6.6.1.
Analyse de la fonction des siRNA endogènes de la drosophile ................................................ 72
6.6.2.
Identification et la caractérisation des miRNA impliqués dans la métamorphose.................. 74
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES............................................................................................. 77
v
1. Curriculum Vitae abrégé
Christophe ANTONIEWSKI
Laboratoire de Génétique et Épigénétique de la Drosophile
Institut Pasteur, Bat Jacques Monod
25 rue du Dr Roux
75724 Paris cedex 15
Tel 01 44 38 93 35
Email [email protected]
Cursus Universitaire
1994
Thèse de Biologie du Développement de l’Université Paris VI
1988
D.E.A. de Microbiologie – Insitut Pasteur et Université Paris VI
Magistère de l’ENS – Université Paris XI.
1984
DEUG B – Université Paris XI.
Parcours Scientifique
2003-05 Responsable du Groupe-à-5-ans « Génétique et Epigénétique de la Drosophile
»
Institut Pasteur – CNRS URA 2578
2002
Lauréat du programme CNRS « ATIPE-Développement »
2000
Nommé Chargé de Recherche 1 au CNRS
1996
Nommé Chargé de Recherche 2 au CNRS dans le laboratoire de J.A. Lepesant
Institut Jacques Monod – Paris
1994-95 Stage Post-doctoral dans le laboratoire de H. de Thé. Hôpital Saint-Louis –
Paris
1990-94 Thèse dans le laboratoire de J.A. Lepesant – Institut Jacques Monod – Paris
1988
Stage de DEA à la faculté d’Orsay (Paris XI) dans le laboratoire de P. Stragier
1984
Stage de DEUG à la faculté d’Orsay (Paris XI) dans le laboratoire de M.
Guerino.
Encadrement de la Recherche
Thèses de Doctorat
Caroline Jacquier (en cours)
Bassam Berry (en cours)
Clément Carré (soutenance en septembre 2006)
Dimitri Szymczak (Université Paris VII, soutenue le 15 septembre 2004)
Jean-Yves Roignant (Université Paris VI, soutenue le 7 février 2003)
Véronique Brodu (Université Paris VII, soutenue le 11 Février 2000)
DEA, DESS, Master-2
- Nicolas Dos Santos (Master-2 de l’Université de Versailles-StQuentin, 2005)
- Audrey Solino (DESS de Bioinformatique Université de Cergy-Pontoise, 2004)
- Frederic Delbac (Maîtrise de l’Université de Clermont-Ferrand, 1994)
- Magalie Lecourtois (Maitrise de l’Université Paris VII, 1993).
1
Membre examinateur de Jurys de Thèses
Michaël Durand-Dubief (2005), Carole Ribet (2005), Benoit Miotto (2004), Stephane
Fraichard (2002), Nathalie Sedano (2001)
Publication des 5 dernière années
Brodu, V., Mugat, B., Fichelson, P., Lepesant, J. A., and Antoniewski, C. (2001). A UAS
site substitution approach to the in vivo dissection of promoters: interplay between the
GATAb activator and the AEF-1 repressor at a Drosophila ecdysone response unit.
Development 128, 2593-2602.
Carre, C., Szymczak, D., Pidoux, J., and Antoniewski, C. (2005). The Histone H3
Acetylase dGcn5 Is a Key Player in Drosophila melanogaster Metamorphosis. Mol Cell
Biol 25, 8228-8238.
Colombani, J., Bianchini, L., Layalle, S., Pondeville, E., Dauphin-Villemant, C.,
Antoniewski, C., Carre, C., Noselli, S., and Leopold, P. (2005). Antagonistic Actions of
Ecdysone and Insulins Determine Final Size in Drosophila. Science.
Colombani, J., Bianchini, L., Layalle, S., Pondeville, E., Dauphin-Villemant, C.,
Antoniewski, C., Carre, C., Noselli, S., and Leopold, P. (2005). Antagonistic actions of
ecdysone and insulins determine final size in Drosophila. Science 310, 667-670.
Faucheux, M., Roignant, J. Y., Netter, S., Charollais, J., Antoniewski, C., and Theodore, L.
(2003). batman Interacts with Polycomb and trithorax Group Genes and Encodes a
BTB/POZ Protein That Is Included in a Complex Containing GAGA Factor. Mol Cell
Biol 23, 1181-1195.
Roignant, J. Y., Carre, C., Mugat, B., Szymczak, D., Lepesant, J. A., and Antoniewski, C.
(2003). Absence of transitive and systemic pathways allows cell-specific and isoformspecific RNAi in Drosophila. Rna 9, 299-308.
Schubiger, M., Carre, C., Antoniewski, C., and Truman, J. W. (2005). Ligand-dependent
de-repression via EcR/USP acts as a gate to coordinate the differentiation of sensory neurons
in the Drosophila wing. Development.
2
À Daniel Blangy,
in memoriam
3
2. Introduction.
Le fil conducteur de mes activités de recherche est l’analyse des mécanismes moléculaires
permettant le contrôle de l’expression génétique dans les organismes complexes. J’ai choisi
de m’attacher au modèle drosophile pour aborder cette question car il possède des atouts
essentiels. Tout d’abord, il est possible d’utiliser la drosophile pour conduire des approches
génétiques d’un raffinement encore inégalé dans d’autres modèles expérimentaux (Adams
and Sekelsky, 2002; St Johnston, 2002). Par ailleurs, la croissance des tissus larvaires de la
drosophile s’accompagne d’endoréplication, conduisant à la formation de chromosomes
polytènes d’une taille importante dans les glandes salivaires. Ils sont visibles avec un simple
microscope optique, sont facilement analysables par méthodes immunohistochimiques et
leur topographie coïncide avec les cartes génétiques établies par Calvin et Philip Bridges. À la
fin du troisième stade larvaire, l’activation d’un grand nombre de gènes s’accompagne d’une
décondensation des chromosomes, créant des renflements appelés « Puffs ». Les
chromosomes polytènes sont de prodigieux objets qui donnent à voir, au sens propre, la
chromatine et l’activité des gènes. Enfin, D. melanogaster est un insecte holométabole qui
subit une métamorphose complète, déclenchée à la fin du troisième stade larvaire par un pic
d’hormone stéroïde ecdysone et son récepteur nucléaire, l’hétérodimère EcR/USP. L’étude
des récepteurs nucléaires a été l’occasion d’avancées majeures dans la compréhension des
mécanismes élémentaires de la transcription. Forte de ces avancées, la cascade
morphogénétique qui gouverne la métamorphose constitue, aujourd’hui plus que jamais, un
modèle de choix pour étudier comment, au cours du développement d’un organisme
complexe, l’expression génétique est coordonnée dans l’espace en réponse à des signaux
extracellulaires.
• La première partie du mémoire retrace brièvement des travaux effectués entre 1996 et
2000 dans le laboratoire de Jean-Antoine Lepesant à l’Institut Jacques Monod, à partir de
résultats obtenus au cours de ma thèse. Ces travaux portent sur l’analyse des interactions
qui s’établissent au niveau du promoteur du gène Fbp1 de D. melanogaster entre le
récepteur nucléaire de l’ecdysone et les régulateurs transcriptionnels GATAb et AEF-1.
Ils correspondent aussi en grande partie au travail de thèse de Véronique Brodu.
• La deuxième partie rapporte des travaux effectués de 1999 à 2002, période au cours de
laquelle j’ai commencé à m’intéresser aux aspects chromatiniens de la régulation
4
transcriptionnelle. Le gène Fbp1 fournissait une première occasion d’opérer cette
transition thématique car il est régulé par les protéines Broad et plusieurs arguments
suggéraient que ces protéines agissent au niveau de la chromatine de leurs gènes cibles.
Dans le cadre de sa thèse, Jean-Yves Roignant a recherché et isolé un partenaire des
protéines Broad. En collaboration avec l’équipe de Laurent Théodore à Orsay, nous avons
démontré que ce partenaire, la protéine Batman, est un facteur de régulation de la
chromatine du groupe Polycomb.
• Une autre raison de s’intéresser aux mécanismes de modulation de la structure
chromatinienne était que le gène Fbp1 est une cible directe du récepteur nucléaire de
l’ecdysone. Or, les récepteurs nucléaires des vertébrés induisent des modifications
covalentes des nucléosomes, en recrutant des cofacteurs à activité histoneacétyltransférase, histone-déacétylase ou histone-méthylase. J’ai entamé en 1999 l’analyse
de la fonction de dGCN5, homologue chez la drosophile du coactivateur P/CAF de
vertébrés. Dimitri Szymczak en 1999, puis Clément Carré en 2000 se sont joints à ce
projet, présenté en 3ème partie. Il se poursuit aujourd’hui à l’Institut Pasteur avec l’aide de
Caroline Jacquier et de Josette Pidoux.
• La dernière partie du mémoire retrace les travaux réalisés sur l’interférence par l’ARN,
ainsi que les projets entamés au laboratoire pour comprendre les mécanismes d’action
des petits ARN. Depuis 1998, des articles rapportaient que l’injection d’une séquence
d’ARN double-brin dans C. elegans induisait de façon très spécifique la dégradation de
l’ARNm correspondant. Le phénomène avait également été observé après injection
d’ARN double-brin dans des embryons de drosophile, et l’idée d’induire in vivo une
inactivation génétique en utilisant un système transgénique producteur d’ARN doublebrin était dans « l’air du temps ». Ce projet entamé avec Bruno Mugat, Clément Carré et
Dimitri Szymczak avait au départ un objectif méthodologique, celui de se doter d’un
système inductible d’inactivation génétique. Une fois qu’il a eu pris corps, avec
l’inactivation réussie du gène EcR, nous étions en position d’analyser des aspects
fondamentaux et mécanistiques de l’interférence par l’ARN et c’est en suivant cet axe de
recherche que Jean-Yves Roignant a achevé son travail de thèse à l’Institut Jacques
Monod. Le projet trouve aujourd’hui son prolongement au laboratoire à l’Institut Pasteur,
grâce aux travaux d’Hélène Thomassin, Delphine Fagegaltier et Bassam Berry.
5
3. Petite, mais complexe : l’unité de réponse hormonale du
gène Fbp1.
3.1. Régulation hormonale du développement post-embryonnaire chez D.
melanogaster.
L’embryogenèse de D. melanogaster s’achève après environ 23 heures de développement à
25°C, avec l’émergence d’une larve de premier stade, organisme différencié d’une centaine
de milliers de cellules (Fig. 1). L’animal croît en passant par deux autres stades larvaires
séparés par des mues qui s’opèrent respectivement 48 et 72 heures après la ponte de l’œuf.
Au cours de cette période, les cellules des tissus larvaires croissent sans se diviser,
effectuant plusieurs cycles d’endoréplication de leur ADN. Le nombre d’endoréplications,
variable selon les tissus, peut atteindre 16 dans les glandes salivaires, donnant lieu à la
formation de chromosomes géants polytènes, aisément visibles en microscopie optique.
Dans le même temps, de petits îlots de cellules, disques imaginaux et histoblastes, se divisent
par mitose et commencent à se différencier.
110 heures après la ponte, les larves de 3ème stade cessent de s’alimenter, sortent du
milieu nutritif et entame une phase d’errance. À son terme, les larves déploient leurs
spiracles antérieurs, secrètent une glu et se fixent sur un support. L’éversion des spiracles,
120 h après la ponte, définit le début de la période prépupale qui durera 12 h. La dernière
cuticule larvaire se tanne rapidement et devient le puparium, dans lequel la métamorphose
va se dérouler. Dans le même temps, les cellules imaginales et larvaires commencent à
synthétiser une nouvelle cuticule et les disques imaginaux entament une phase de
prolifération rapide. L’épiderme se décolle du puparium. L’achèvement de cette apolyse
larvo-pupale, ainsi que l’éversion de la tête du futur insecte adulte marque la fin de la période
prépupale. La métamorphose se poursuit pendant les 3 jours et demi que dure la période
pupale. À son terme, la plupart des tissus larvaires ont été histolysés et les structures adultes
se sont formées à partir des disques imaginaux et histoblastes. L’insecte adulte peut éclore
du puparium.
Le développement embryonnaire et post-embryonnaire de D. melanogaster est rythmé par
des variations importantes du titre en 20-OH ecdysone (Fig. 1), considérée comme la forme
active des ecdystéroïdes circulants (Andres and Thummel, 1992). Quelques heures avant la
fin du 3ème stade larvaire, un pic majeur d’ecdysone déclenche la formation du puparium et le
début de la phase prépupale. Douze heures plus tard, un pic d’hormone plus modeste met
6
fin au stade prépupal et déclenche la pupaison. La phase pupale se caractérise par le pic
d’ecdysone le plus important, corrélé au développement des structures adultes.
Figure 1. Cycle de développement de Drosophila melanogaster. Les durées indicatives sont données pour
une température de 25°C. La partie inférieure de la figure montre les variations de concentration de l’hormone de mue, la
20-hydroxyecdysone qui induit les mues larvaires, la formation du puparium et la métamorphose.
Les travaux d’Ashburner et Richards ont permis d’établir chez la drosophile le rôle direct
de l’ecdysone dans le contrôle de l’expression génétique au cours du développement
(Ashburner, 1972; Richards, 1976a; Richards, 1976b). À la fin du troisième stade larvaire, des
« puffs » apparaissent et disparaissent séquentiellement au niveau des chromosomes
polytènes des glandes salivaires. Ces structures, visibles au microscope, correspondent à des
régions de décondensation de la chromatine associées à une intense activité
transcriptionnelle.
Au milieu du troisième stade larvaire, environ 15 puffs d’intermue sont présents. Ils
régressent quand la concentration en ecdysone augmente et 6 puffs « précoces »
apparaissent. À leur tour, ces puffs régressent après quelques heures et sont suivis de
l’apparition d’une centaine de puffs « tardifs ». Les puffs tardifs régressent au début de la
phase prépupale. Au cours de cette phase, un deuxième pic d’ecdysone induit à nouveau une
séquence d’apparition des puffs précoces et tardifs. Cette séquence est très similaire à la
séquence de « puffing » observée à la fin du troisième stade larvaire. Ashburner et al ont
analysé les séquences d’apparition et de disparition des puffs dans des glandes salivaires de
larves, disséquées et incubées à différents moments et pendant différentes périodes en
présence ou en absence d’ecdysone. A partir de leurs observations, ils ont élaboré un
modèle d’activation génétique en deux étapes dans lequel la liaison de l’ecdysone par son
récepteur à la fin du troisième stade larvaire provoque l’activation d’un petit nombre de
7
gènes localisés au niveau des puffs « précoces ». Les produits de ces gènes sont des facteurs
de transcriptions qui activent à leur tour un ensemble plus large de gènes effecteurs de la
morphogenèse, localisés au niveau des puff « tardifs ». Ils inhibent également leur propre
expression par un mécanisme de rétrocontrôle négatif.
Cette cascade d’activation se reproduit une dizaine d’heures après la formation du
puparium, lors du « pic » d’ecdysone de la fin de la phase prépupale.
3.2. Caractérisation moléculaire de la « cascade d’Ashburner ».
Le modèle d’activation du programme génétique de la métamorphose proposé par
Ashburner et ses collaborateurs a fait preuve d’une remarquable robustesse. Au cours des
années 90, les gènes localisés au niveau des puffs des chromosomes des glandes salivaires ont
été caractérisés, et leurs rôles dans la régulation du programme génétique déclenché par
l’ecdysone à la fin du troisième stade larvaire ont été analysés au niveau moléculaire.
Une première validation éclatante du modèle d’Ashburner est la caractérisation du
récepteur de l’ecdysone lui-même. Il est constitué d’un hétérodimère entre les produits des
gènes Ecdysone Receptor et ultraspiracle qui appartiennent tous les deux à la superfamille des
récepteurs nucléaires (Koelle et al., 1991; Yao et al., 1993). La protéine Ultraspiracle (USP)
s’est avéré être l’homologue structural et fonctionnel du récepteur RXR de l’acide 9-cis
rétinoïque. Par ailleurs les gènes des puffs précoces E74, E75 et Broad ont été clonés (Burtis
et al., 1990; DiBello et al., 1991; Segraves and Hogness, 1990). Tous sont directement
inductibles par l’ecdysone et codent de multiples isoformes, par utilisation de plusieurs
promoteurs et épissage alternatif. En accord avec les prédictions du modèle d’Ashburner ces
produits sont tous des facteurs de transcription. Les isoformes E74A et E74B appartiennent
à la famille des facteurs de transcription à domaine ets. Les isoformes de E75A sont des
récepteurs nucléaires qui étaient jusqu’à récemment considérés comme « orphelins », c’està-dire sans ligand connu. Des développements récents suggèrent qu’ils pourraient
fonctionner comme des récepteurs de très petites molécules comme le NO ou le CO
(Reinking et al., 2005). Enfin, les isoformes Broad Z1, Z2, Z3 et Z4 possèdent toutes un
domaine de dimérisation BTB/POZ et diffèrent par un domaine alternatif à doigt à zinc.
Toujours en accord avec le modèle d’Ashburner, les transcrits des gènes précoces sont tous
induits par l’ecdysone. Cependant, leur cinétique d’apparition a révélé un degré de
complexité qui n’était pas prédit par le modèle basé seulement sur l’observation des puffs
(Andres et al., 1993; Karim and Thummel, 1991; Karim and Thummel, 1992). Quelques
heures avant la formation du puparium, alors que la concentration en ecdysone commence
8
juste à augmenter dans l’animal, une première classe de transcrit précoces est exprimée
(classe I), qui comprend les transcrits EcR, E74B, E75C et certains transcrits Broad. Les
transcrits de classe II, comprenant E74A, E75A, E75B et d’autres transcrits Broad, sont
exprimés plus tardivement à la fin du troisième stade larvaire, en réponse à une plus forte
concentration d’ecdysone. Dans le même temps, l’expression des transcrits de classe I
diminue. Seuls les gènes localisés au niveau des puffs tardifs 71E, 82F et 63E ont été
caractérisés. Les produits du gène L82 ne comportent pas de domaine caractéristiques
permettant d’inférer leur fonction. En revanche le complexe génique L71 code des protéines
circulantes de l’hémolymphe impliquées dans l’immunité antibactérienne (Wright et al.,
1996), tandis que le gène L63 code une protéine kinase cycline-dépendante (Stowers et al.,
2000). Ici encore, la fonction de ces facteurs s’accorde avec un rôle effecteur lors de la
métamorphose, comme proposé par le modèle d’Ashburner.
À la fin des années 90, notre compréhension de la cascade génétique sous contrôle de
l’ecdysone s’est considérablement affinée, sous l’impulsion des travaux des équipes de D.
Hogness et de C. Thummel. Un niveau de régulation a été proposé en amont de la cascade,
à l’occasion de la caractérisation du récepteur « orphelin » DHR78 (Reinking et al., 2005).
DHR78 pourraient agir en amont du récepteur de l’ecdysone pour déclencher les étapes les
plus précoces de la métamorphose, en réponse à un ligand non encore identifié. Les
mécanismes de régulation qui lient les séquences d’activation génétique à la fin du 3ème stade
larvaire et à la fin de la phase prépupale ont aussi été caractérisés (Lam et al., 1997;
Thummel, 1997; White et al., 1997). De façon remarquable, ils mettent en jeu 3 récepteurs
nucléaires orphelins, DHR3, E75B et βFTZ-F1 (Fig. 2). Ainsi, à la fin du 3ème stade larvaire,
l’ecdysone induit, via son récepteur, l’expression de DHR3 et E75B. Dans une boucle de
rétrocontrôle négatif, DHR3 réprime l’expression des gènes précoces. Il a par ailleurs une
activité positive sur l’expression de βFTZ-F1. Cependant, cette activité est inhibée par
l’hétérodimérisation de DHR3 avec E75B, et l’activation de βFTZ-F1 ne peut se produire
que quand le titre en ecdysone régresse, après la formation du puparium. Enfin, βFTZ-F1 agit
comme un facteur de compétence nécessaire à la réinduction des gènes précoces dans la
prépupe (Broadus et al., 1999).
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Figure 2. Modèle d’action des récepteurs orphelins pendant le développement prépupal de D.
melanogaster. Deux pics d’ecdysone à la fin des périodes larvaires et prépupales induisent l’expression des gènes
précoces, via l’activation du récepteur EcR/USP. Le pic d’ecdysone larvaire induit également l’expression de DHR3 et E75B.
DHR3 réprime l’expression des gènes précoces et induit l’expression de βFTZ-F1. Cette induction est inhibée en présence
d’E75B (vraisemblablement à travers une hétérodimérisation des deux récepteurs). Le récepteur βFTZ-F1 agit comme un
facteur de compétence qui conditionne la réexpression des gènes précoces dans la prépupe.
3.3. Régulation tissulaire de la réponse hormonale
À la fin du troisième stade larvaire, la larve immobilisée excrète une glu pour permettre la
fixation de la case pupale sur un support. Ceci est possible grâce à la mise en route, quelques
heures plus tôt, d’un programme physiologique conduisant à la synthèse massive de
protéines spécifiques dans les glandes salivaires, puis à leur déversement dans le lumen de la
glande, et enfin à la dégénérescence de ces glandes par une apoptose programmée (pour une
revue, voir (Yin and Thummel, 2005). Dans la même période, le corps gras, équivalent
fonctionnel du tissus adipeux et du foie des vertébrés, capture des protéines qui circulent
dans l’hémolymphe, les arylphorines. Ceci permet vraisemblablement de mobiliser des
réserves pour la métamorphose à l’intérieur du puparium. Par la suite, les cellules du corps
gras se dissocient et se retrouvent disséminées dans tout le corps de l’animal après la
métamorphose. Nous avons aussi évoqué l’apolyse de la cuticule larvaire qui a lieu dès la
formation du puparium, ainsi que le processus de tannage qui permet le durcissement de la
case pupale, que l’expérimentateur attentif peut voir se dérouler directement sous ses yeux,
en seulement 10 à 15 minutes. Dès ce moment également, des processus morphogénétiques
majeurs s’engagent dans les disques imaginaux, avec par exemple un programme de
différenciation des ommatidies dans le disque d’œil-antenne, reflété par la progression du
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« sillon morphogénétique », ou le programme d’élongation des pattes à partir des disques
imaginaux de pattes.
Tous ces évènements ne sont possibles qu’à travers la réalisation de programmes
génétiques qui sont induits par les pics d’ecdysone précédant la métamorphose, mais sont
par nature extrêmement différenciés. La question qui se pose est d’une portée générale.
Comment un signal hormonal circulant peut-il contrôler de façon différentielle la mise en
route de programmes de développement et de différenciation qui varient d’un tissu cible à
un autre ? Plusieurs types de mécanismes peuvent êtres proposés pour répondre à cette
question.
On peut d’abord considérer une complexification du signal hormonal, telle que ce ne soit
pas une hormone mais une famille d’hormones circulantes qui soit mise en jeu, chaque tissu
cible ayant une compétence restreinte à déclancher une réponse spécifique à l’une des
hormones. Bien qu’il existe chez la drosophile plusieurs ecdystéroïdes, il n’existe pas à
l’heure actuelle de données indiquant que ce mécanisme puisse rendre compte de la
diversification des programmes génétiques dans les différents tissus de la larve ou de la pupe.
Il apparaît généralement possible d’induire les différents programmes dans les différents
tissus avec de la 20-OH ecdysone, qui est de fait considérée comme le principal
ecdystéroïde effecteur chez la drosophile.
Symétriquement à la diversification des signaux hormonaux, on peut considérer la
diversification des récepteurs comme un autre mécanisme de nature à spécifier des
programmes génétiques. Chez la drosophile, il existe 3 isoformes du récepteur de
l’ecdysone, les isoformes A, B1 et B2, qui portent un même domaine de fixation du ligand et
de fixation à l’ADN, mais varient par leur domaine A/B en région amino-terminale (Koelle et
al., 1991). Aucun autre récepteur « orphelin » de cet organisme ne s’est avéré jusqu’alors
répondre à des ecdystéroïdes. Par ailleurs, s’il a bien été montré que l’isoforme EcR-A est
plus spécifiquement exprimée dans les tissus imaginaux, alors que l’isoforme EcR-B1 est
majoritairement trouvée dans les tissus larvaires, cette différence ne permet pas d’expliquer
les différenciations très importantes de réponses hormonales au sein de ces deux grandes
classes de tissus.
Finalement, même si les mécanismes évoqués précédemment contribuent certainement à
la diversification des réponses tissulaires à l’ecdysone chez la drosophile, il est plus probable
que la part la plus importante de cette diversification provient d’une intégration spécifique du
même signal hormonal - une « interprétation » différente - par chacun des tissus cibles de
l’animal. Cette intégration peut se faire au niveau des promoteurs des gènes cibles, qui sont
11
non seulement régulés par le récepteur de l’ecdysone, mais également par d’autres facteurs
de transcription dont l’expression constitue une part de l’identité du tissu cible.
Ainsi, si les travaux des équipes de D. Hogness et de Carl Thummel ont permis de
comprendre comment est modulée temporellement la cascade d’activation des gènes en
réponse à l’ecdysone, je retire de mon travail dans le laboratoire de Jean-Antoine Lepesant la
conviction que la réponse à l’ecdysone d’un gène ne peut exister sans la synergie entre le
récepteur nucléaire activé EcR/USP et d’autres facteurs de transcription qui spécifient, par
leur présence et leur fixation au promoteur considéré, la compétence du gène à répondre à
l’hormone dans un tissu donné. Les pages qui suivent illustrent ce point de vue en détaillant
les travaux réalisés sur la régulation du gène Fbp1.
3.4. L’enhancer du gène Fbp1, un modèle pour analyser in vivo le
fonctionnement d’une unité de réponse à l’hormone stéroïde ecdysone.
Le gène modèle Fbp1 (Fat body protein 1) que nous avons choisi pour étudier la régulation
hormonale chez la drosophile est exprimé en réponse au pic d'ecdysone de fin de troisième
stade larvaire (Lepesant et al., 1978; Lepesant et al., 1986; Maschat et al., 1986). Cette
expression est cependant restreinte spatialement à un seul tissu, le corps gras. Un petit
élément de 70 pb, localisé dans la partie proximale du promoteur de Fbp1, joue un rôle
crucial dans le contrôle de l'expression spécifique de ce gène. Des expériences de
transgenèse ont montré qu'il agit à la fois comme un « enhancer » spécifique du corps gras
de troisième stade larvaire et comme un élément de réponse à l'ecdysone (Laval et al.,
1993). Il se présente donc comme un carrefour où viennent s'intégrer à la fois des signaux
de réponse hormonale et de régulation spatio-temporelle. Au cours de ma thèse, j'avais
démontré que l'enhancer du gène Fbp1 est une cible directe du récepteur de l'ecdysone EcR
/USP (Antoniewski et al., 1994; Antoniewski et al., 1993). Cependant, des expériences de
retardement sur gel effectuées avec un extrait nucléaire de corps gras de troisième stade
larvaire révélaient, en plus de la formation d'un complexe retardé ADN-EcR/USP, la
formation d'au moins six autres complexes ADN-protéines qui restaient à caractériser
(Antoniewski et al., 1994).
12
3.4.1. Le facteur GATAb (Brodu et al., 1999).
À mon retour en Novembre 1996 dans l'équipe de Jean-Antoine, j'ai repris l'analyse de
ces résultats et noté la présence dans l'enhancer du gène Fbp1 de séquences de type
(A/C)GATA(A/G), cibles de la famille de facteurs de transcription à doigt à zinc GATA
(Patient and McGhee, 2002). À cette même période, plusieurs travaux indiquaient que le
facteur GATAb, codé par le gène serpent (srp), est impliqué dans l'organogenèse du corps
gras, de l'intestin et du système hémocytaire (Rehorn et al., 1996). Il était donc possible
d'imaginer que la fonction spécifique de GATAb au cours de l'embryogenèse trouve un
prolongement au cours de la période larvaire et que ce facteur soit impliqué dans la
régulation de gènes cibles, dans le corps gras larvaire. À l’appui de cette hypothèse, nous
avons complété l’analyse du profil d’expression de GATAb au cours du développement et
montré que ce facteur est exprimé à un niveau constant au cours de troisième stade larvaire
dans un sous-ensemble de tissus, dont le corps gras, l'intestin, les glandes lymphatiques, les
cellules péricardiales et les gonades.
Avec Véronique Brodu, nous avons décidé de tester l'hypothèse selon laquelle l'enhancer
du gène Fbp1 serait une cible du facteur GATAb. Nous avons tout d'abord vérifié que la
protéine GATAb produite in vitro se fixe spécifiquement à cet enhancer au niveau de trois
sites distincts GBS1, GBS2 et GBS3, dont les séquences sont compatibles avec la séquence
consensus (A/C)GATA(A/G). Nous avons par ailleurs montré par retardement sur gel que la
protéine GATAb présente dans des extraits nucléaires de corps gras se fixe aux trois sites
GBS1, GBS2 et GBS3. De façon remarquable, il s’avère que GATAb est non seulement
capable de se fixer seul au niveau des sites GBS1 et GBS3, mais également sous forme de
complexes de migration électrophorétique ralentie, correspondant à une association de
GATAb avec des partenaires dont la nature reste à identifier.
L'étape suivante était de démontrer le rôle de GATAb dans l’activation in vivo de
l'enhancer du gène Fbp1. Dans ce but, nous avons établi des lignées transgéniques
comportant le gène indicateur lacZ sous contrôle de différentes versions mutées de
l'enhancer de Fbp1. Seule une mutation du site GBS1 a un effet sévère sur l'activité de
l'enhancer : elle abolit complètement la réponse du transgène lacZ normalement observé
dans le corps gras de troisième stade larvaire. En revanche, ni la mutation du site GBS2 ni la
mutation du site GBS3 n'a d'effet significatif sur la capacité de l'enhancer à diriger
l'expression du transgène lacZ dans le corps gras de troisième stade larvaire. Ces résultats
confirment l'importance in vivo d'un des sites cibles de la protéine GATAb dans l'enhancer du
gène Fbp1. Il est intéressant de noter que le seul site de fixation pour la protéine GATAb qui
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s'avère nécessaire in vivo pour l'activité de l'enhancer de Fbp1 est le site GBS1 qui permet,
avec la plus grande efficacité, la fixation de GATAb associé à ses partenaires.
Le gène Fbp1 n'est exprimé que dans l'un des cinq tissus dans lesquels le facteur GATAb
est exprimé. Pour asseoir la démonstration que GATAb participe bien au contrôle de la
spécificité d'expression du gène Fbp1, nous avions donc besoin de preuves expérimentales
plus directes que le seul effet de la mutation de son site cible GBS1 dans l'enhancer. Toutes
les mutations du gène srp isolées à ce jour conduisent à une létalité embryonnaire. Il est
donc très difficile de tester l'effet de l'absence de la protéine GATAb sur l'expression du
gène Fbp1 au cours du troisième stade larvaire. En revanche, il est possible de tester l'effet
de la surexpression ectopique de GATAb à cette période du développement. Par croisement
génétique, nous avons construit une souche comportant un transgène srp qui peut être
induit dans tous les tissus après choc thermique, et le transgène indicateur lacZ sous
contrôle de l'enhancer du gène Fbp1. Nous avons montré qu'il est possible, en exprimant le
transgène srp, d'induire précocement l'expression du gène indicateur lacZ dès le début du
deuxième stade et tout au long du troisième stade larvaire. De plus, cette expression
intervient non seulement dans le corps gras, mais également dans deux autres tissus dans
lesquels le gène Fbp1 n'est normalement pas exprimé : les glandes salivaires et le
proventricule.
L'ensemble de ces résultats indique que le facteur GATAb participe à la régulation
temporelle et tissulaire du gène Fbp1, une surexpression de ce facteur aboutissant à l'activité
prématurée et ectopique de l’enhancer de Fbp1. Il est cependant clair que GATAb n’est pas
le seul facteur clé impliqué dans la modulation stricte de l’expression de Fbp1, sa
surexpression n’aboutissant à une expression ectopique de ce gène que dans un nombre
restreint de tissus. Le, ou les facteurs de transcription agissant avec GATAb pour
restreindre totalement la réponse du gène Fbp1 dans le seul corps gras demeurent encore à
ce jour inconnus.
3.4.2. Une approche originale pour analyser le mode d’action de GATAb
(Brodu et al., 2001).
Nous avons remplacé, dans l’enhancer de Fbp1, le site de fixation du récepteur de
l'ecdysone par un site de fixation UAS du facteur GAL4 de levure et fusionné cet enhancer
modifié au gène indicateur lacZ. Après transgenèse, la construction demeure silencieuse. Ce
résultat est attendu car le remplacement du site de fixation du récepteur de l'ecdysone par
le site UAS est formellement équivalent à une mutation. En revanche, après croisement avec
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une lignée exprimant de façon constitutive dans tous les tissus le facteur GAL4, la
construction s'exprime de nouveau spécifiquement dans le corps gras larvaire. Il est ainsi
possible de remplacer dans l'enhancer de Fbp1 le site cible du récepteur de l'ecdysone par
un site cible d'un autre facteur de transcription hétérologue, en conservant les propriétés
régulatrices tissu-spécifiques de cet enhancer.
Cette approche par substitution de sites cis-régulateurs, développée par Véronique
durant sa thèse, est particulièrement intéressante dans la mesure où elle révèle que la
transactivation par le facteur hétérologue GAL4 de levure peut être modulée dans la
drosophile par un mécanisme lié aux séquences environnant son site cible. Ainsi, dans
l’expérience exposée précédemment, l’approche par substitution de sites démontre le rôle
essentiel des facteurs se liant à proximité de l'hétérodimère EcR/USP au niveau de l'enhancer
de Fbp1 : ces facteurs sont capables de limiter la transactivation par EcR/USP - ou par GAL4
- au seul corps gras, alors même que ces deux facteurs sont exprimés, l’un naturellement,
l’autre artificiellement, dans la plupart des tissus.
Nous avions montré que l’action de GATAb au niveau de GBS1 est essentielle pour
l’activité tissu-spécifique de l’enhancer de Fbp1. L’approche par substitution de site UAS nous
a permis de révéler un rôle possible, jusque-là masqué, des autres sites cibles de GATAb,
GBS1 et GBS2. En effet, nous avons remplacé le site GBS1 par un site UAS et établi des
lignées transgéniques pour le gène lacZ placé sous contrôle de l’enhancer de Fbp1 ainsi
modifié. En absence de GAL4, une telle substitution annule toute expression du gène
indicateur dans les lignées transgéniques, confirmant l’importance fonctionnelle du site GBS1.
En revanche, le croisement de ces lignées avec une lignée exprimant GAL4 dans tous les
tissus et à tous les stades de développement rétablit l’expression du gène lacZ,
spécifiquement dans le corps gras de fin de troisième stade larvaire. Ce résultat surprenant
indiquait que l’action de facteurs au niveau d’autres sites cibles que le site GBS1 est
susceptible de moduler l’activation de la transcription par GAL4, et cela avec la spécificité
tissulaire du gène Fbp1. Nous avons donc émis l’hypothèse que ce que nous observions dans
notre approche par substitution du site GBS1 résulte de l’action de GATAb au niveau d’au
moins un des sites non-essentiels GBS2 et GBS3. Effectivement, un enhancer, dans lequel le
site GBS1 est substitué par un site UAS et le site GBS3 est détruit, n’est plus capable
d’activer la transcription d’un transgène indicateur lacZ, même dans un contexte génétique
où GAL4 est exprimé dans tous les tissus à tous les stades de développement. Cette
inactivation n’est pas observée si c’est le site GBS2 qui est détruit à la place du site GBS3. En
analysant toute une série de constructions supplémentaires, nous avons montré que
15
l’activation du promoteur de Fbp1 par GAL4 nécessite la présence d’au moins un site cible
du facteur GATAb de type GBS1 ou GBS3, à proximité du site UAS. Cette conclusion est
illustrée de façon spectaculaire par une construction dans laquelle les trois sites cible de
GATAb dans l’enhancer de Fbp1 sont remplacés par deux sites UAS. Après transgenèse, une
telle construction reste totalement silencieuse, même en présence du facteur GAL4 exprimé
à haut niveau et de façon ubiquitaire. En revanche, une construction similaire, dans laquelle la
région en amont du site GBS1 est excisée (la région « A »), répond maintenant à l’activation
par le facteur GAL4 dans tous les tissus et à toutes les périodes de développement. Cette
région s’est avérée être une cible du répresseur AEF-1, qui est exprimé dans tous les tissus
des larves de troisième stade et a été caractérisé par l’équipe de T. Maniatis (Falb and
Maniatis, 1992a; Falb and Maniatis, 1992b).
En résumé, notre approche par substitution de sites UAS nous a permis de montrer que
(i) l’enhancer de Fbp1 est maintenu dans une structure réprimée, inaccessible à l’activation
par GAL4. (ii) cette répression dépend d’une séquence en amont de l’enhancer de Fbp1,
cible de répresseur AEF-1. (iii) le facteur GATAb agit en levant cette répression dans le
corps gras larvaire. En mettant en évidence un phénomène de répression modulé par le
facteur GATAb, nous avons mis à jour un nouveau type de mécanisme de régulation de la
transcription par les membres de la famille GATA. L’enhancer du gène Fbp1, flanqué de sa
région amont « A », fonctionne comme une Unité de Réponse Hormonale (URH) complexe
intégrant les fonctions du récepteur de l’ecdysone, du facteur GATAb et du répresseur
AEF-1.
4. De Broad à batman , en passant par un domaine BTBPOZ (Faucheux et al., 2003).
Le gène Broad, l’un des gènes précoces sous le contrôle direct du récepteur de l’ecdysone
EcR/USP, code 4 protéines par épissage différentiel, comportant un domaine commun
BTB/POZ d’interaction protéine-protéine et une paire spécifique de doigt à zinc (BR-C Z1 à
Z4) (Bayer et al., 1997). Il avait été montré que des mutations du gène Broad perturbent la
séquence temporelle d’induction par l’ecdysone de plusieurs gènes dans les glandes salivaires
(Crossgrove et al., 1996; Karim et al., 1993), suggérant que les protéines Broad jouent un
rôle de modulateur temporel dans la réponse hormonale d’autres gènes cibles. Jana Lepesant
et Bruno Mugat ont testé cette hypothèse dans le cas du gène Fbp1 et ont montré que
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l'expression du transgène indicateur lacZ sous le contrôle de l'enhancer de Fbp1 se trouve
abolie dans une souche mutante pour le gène Broad. Cette expression peut être restaurée si
l'on surexprime les protéines BR-C Z1, Z3 ou Z4. De manière cohérente, dans un contexte
sauvage, l’expression du transgène Fbp1-lacZ peut être avancée vers le début du troisième
stade larvaire si l’on surexprime précocement l’isoforme BR-C Z3. À l’inverse, l’expression
du transgène Fbp1-lacZ est retardée si l’on surexprime l’isoforme BR-C Z2. Ces résultats
indiquent que les produits du gène BR-C, en plus du récepteur EcR/USP, jouent un rôle
majeur dans la régulation temporelle de l'enhancer de Fbp1. La protéine BR-C Z2 verrouille
l’activité de cet enhancer au début du troisième stade larvaire, tandis que les protéines BR-C
Z1, Z3 ou Z4 contribuent à son activation. Le travail de Bruno et de Jana montre également
que si la balance relative d’expression des protéines Broad est impliquée dans le contrôle
temporel du gène Fbp1, elle ne semble en revanche pas intervenir dans sa spécificité
tissulaire d’expression (Mugat et al., 2000).
Les mécanismes moléculaires par lesquels les protéines Broad activent ou répriment la
transcription de leurs gènes cibles demeurent encore aujourd’hui inconnus. Comme elles
possèdent un domaine de doigt à zinc, nous avons recherché leur fixation directe au niveau
de l’URH du gène Fbp1, par des expériences de retardement sur gel ou d’empreinte à la
Dnase. Nous n’avons jamais observé un telle fixation, que ce soit avec des protéines
purifiées à partir d’extraits bactériens, ou d’extraits nucléaires de corps gras. Il nous est donc
apparu vraisemblable que l’activité régulatrice des protéines Broad ne passe pas par une
fixation directe à l’ADN, mais met en jeu un ou plusieurs intermédiaires protéiques. Le
domaine BTB/POZ commun aux 4 isoformes Broad est retrouvé avec une bonne
conservation dans des protéines qui jouent un rôle dans la modulation de la structure
chromatinienne, comme la protéine GAGA (Granok et al., 1995), membre du groupe
Trithorax, ou la protéine E(var) 3-93D (Dorn et al., 1993). Cette donnée, associée au rôle
pleïotrope des protéines Broad dans la régulation de nombreux de gènes, nous a conduit à
formuler l’hypothèse qu’elles agissent au sein de complexes macromoléculaires en modulant
la structure de la chromatine au niveau des cibles génétiques de l’ecdysone.
Jean-Yves Roignant a entamé son travail de thèse en effectuant une recherche de
partenaires des protéines Broad par la méthode de crible double-hybride chez la levure. En
utilisant comme appât le domaine BTB-POZ commun à toutes les isoformes Broad, il a isolé
avec une grande fréquence des clones codant une petite protéine de 120 acides aminés qui
n’est constituée que d’un seul domaine BTB/POZ, similaire au domaine BTB/POZ des
protéines BR-C. Nous avons vérifié, au moyen d’expériences de co-immunoprécipitation,
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que cette protéine, codée par le gène batman, interagit bien in vivo avec les protéines Broad.
Les tests génétiques hétéroalléliques entrepris ensuite par Jean-Yves pour établir une
interaction fonctionnelle entre les gènes Broad et Batman se sont pourtant révélés négatifs,
mais cela n’exclut pas que la protéine Batman agisse in fine comme un cofacteurs des
protéines Broad. En effet, une telle interaction, si elle existe, pourrait ne pas se révéler dans
des animaux trans-hétérozygotes, dépourvus seulement d’une dose des produits Broad et
Batman. Nous le verrons, nous nous sommes dotés plus tard d’outils d’interférence par
l’ARN qui permettraient de revisiter aujourd’hui la question. Mais à l’époque, le principal
obstacle que nous avons rencontré pour analyser plus avant l’interaction fonctionnelle entre
Broad et batman était que les mutants batman sont affectés dès la période embryonnaire, à
un moment où la fonction des protéines Broad n’est pas encore requise.
Des insertions d’un élément transposable P dans le premier intron du gène batman
conduisent à une létalité embryonnaire. Indépendamment de notre approche, Laurent
Théodore et Marianne Faucheux à Orsay, avait entamé la caractérisation du gène batman et
montré, dans des croisements hétéroalléliques, qu’une mutation du gène batman augmente
l’apparition de peignes sexuels ectopiques observés dans des mutants du gène Polyhoméotique
(Ph) (Faucheux et al., 2000).
Le gène Ph appartient au groupe des gènes Polycomb (PcG), dont les produits sont associés
à la chromatine et forment des complexes multiprotéiques répresseurs au niveau de gènes
cibles (Lund and van Lohuizen, 2004; Orlando, 2003; Otte and Kwaks, 2003; Pirrotta et al.,
2003). Parmi ces gènes cibles, se trouvent les gènes homéotiques dont la fonction participe à
la spécification de l’identité des segments de l’insecte au cours de son développement
précoce. La composition des complexes PcG est non seulement dynamique au cours du
développement, mais également variable d’un gène cible à l’autre. Leur ciblage sur les régions
régulatrices des gènes se fait au niveau d’éléments d’ADN, les PRE (Polycomb Response
Elements), d’une taille de l’ordre du kilobase et essentiellement définis fonctionnellement,
dans des approches par délétions génétiques ou par analyse de transgènes indicateurs. En
revanche, il n’a pas encore été possible de dégager une séquence consensus suffisamment
spécifique pour caractériser structurellement les PRE. Pour compliquer la situation, les PRE
sont les cibles d’un autre groupe de facteurs dont la fonction est activatrice – et donc
antagoniste de celle du PcG - et qui sont codés par les gènes du groupe Trithorax (TrxG). Les
PRE sont toujours également des TRE (Trithorax Response Element), et peuvent donc être
dénommés PRE/TRE. L’impossibilité de dissocier fonctionnellement les séquences impliquées
dans la répression et l’activation au niveau des PRE/TRE illustre bien les interrelations entre
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les PcG et les TrxG. Ces interrelations sont si fortes que, selon l’expérience génétique
réalisée et le phénotype observé, certains gènes peuvent être classés aussi bien comme
répresseurs, membres du PcG, que comme activateurs, membres du groupe TrxG, suggérant
qu’ils pourraient agir comme « pivot » entre les deux fonctions antagonistes (Brock and van
Lohuizen, 2001).
Nous avons entamé une collaboration étroite avec l’équipe de Laurent Théodore et
montré que la protéine Batman appartient non seulement PcG, mais présente également des
caractéristiques fonctionnelles du TrxG. La protéine Batman co-localise parfaitement avec le
membre du groupe Trithorax GAGA au niveau des chromosomes polytènes des glandes
salivaires. Des expériences d’interaction deux-hybrides dans la levure, de coimmunoprécipitation à partir d’extraits d’embryons et de retardement sur gel, ont démontré
que la protéine Batman interagit directement avec le facteur GAGA. Les résultats obtenus
suggèrent que la protéine Batman agit comme un pivot fonctionnel entre les protéines du
PcG maintenant la chromatine dans un état réprimé, et les protéines du TrxG, maintenant la
chromatine dans un état activé. Ils ouvrent aussi la perspective de pouvoir établir une
connexion fonctionnelle entre les mécanismes de modulation de la structure chromatinienne
mis en jeu par les membres des groupes Polycomb et Trithorax et le contrôle par les
protéines BR-C du programme génétique déclenché par l’ecdysone au début de la
métamorphose. Il faudrait pour cela tirer parti des transgènes permettant de contrôler
temporellement et tissulairement une interférence par l’ARN contre le gène Batman, de
façon à étudier l’effet de l’inactivation de la fonction de batman au moment de l’induction de
la métamorphose par l’ecdysone.
5. De la chromatine à retordre avec dGcn5.
5.1. « Flash-back »
L’idée d’étudier l’histone-acétyltransférase dGcn5 a pris corps en deux étapes, dont la
première est le stage post-doctoral que j’ai effectué dans le laboratoire de Hugues de Thé à
l’Hôpital Saint-Louis, en 1995-96. Durant cette période, j’ai commencé à m’intéresser aux
facteurs coactivateurs des récepteurs nucléaires, dont la caractérisation débutait chez les
vertébrés. L’équipe de Pierre Chambon et de Régine Losson venait de caractériser le facteur
TIF-1 (Transcriptional Intermediary Factor 1) en montrant qu’il agit, en présence du ligand
hormonal, comme un co-activateur du récepteur de l’acide 9-cis rétinoïque. De son côté,
l’équipe de Hugues avait cloné TIF-1 par homologie avec PML, une protéine dont la fusion
19
avec le récepteur de l’acide trans-rétinoïque est responsable de la leucémie aiguë
promyélocytaire chez l’homme. La protéine TIF-1 présentait une série de domaines
potentiels d’interaction protéine-protéine, ainsi que deux domaines évocateurs d’une
fonction dans la structuration de la chromatine : un domaine PhD, présent dans les protéines
Trithorax et Polycomb-like de drosophile, et un bromodomaine, retrouvé dans des facteurs
de remodelages de type SWI2/SNF2. À l’époque, l’hypothèse qui émergeait de ces données
était que la protéine TIF-1 sert à établir un lien entre des récepteurs nucléaires et d’autres
composants de la chromatine, participant ainsi à l’activation de gènes cibles par
« relâchement » de la structure chromatinienne. J’ai rejoint l’équipe d’Hugues avec le projet
de cloner l’homologue chez la drosophile du coactivateur TIF-1 de souris, et de tester le cas
échéant l’interaction de cet homologue avec le récepteur nucléaire de l’ecdysone. Cette
entreprise n’a pas abouti en utilisant les méthodes classiques de biologie moléculaire basées
sur l’homologie de séquence nucléotidique (Hybridation à basse force ionique, PCR « touch
down » ou « nested », etc…), à une époque où la séquence du génome de la drosophile
n’était pas encore déterminée. J’ai donc laissé de côté le projet pour rejoindre le laboratoire
de Jean-Antoine Lepesant avec la ferme intention de le reprendre un jour. Le travail sur
GATAb a alors commencé, ouvrant une longue parenthèse (voir la partie I).
Quelques années plus tard, et un génome complet de drosophile décrypté, l’équipe
d’Hugo Bellen a isolé par crible génétique un allèle mutant du gène bonus et montré que ce
gène est le plus proche homologue de TIF-1 (Beckstead et al., 2001). Un modeste degré de
similarité (30 à 40% en moyenne sur la séquence peptidique) explique probablement
pourquoi je n’ai pas réussi le clonage du gène de drosophile. Il ne semble pas que la protéine
Bonus soit un coactivateur spécifique du récepteur EcR/USP de l’ecdysone (Beckstead et al.,
2001) et voir la discussion dans (Gates et al., 2004). Cependant, il interagit probablement
avec d’autres récepteurs de cet insecte, et des travaux récents indiquent que Bonus est bien
un facteur modulant la structure chromatinienne (Beckstead et al., 2005) !
5.2. Un congrès important
En août 1998, j’ai participé au congrès « Transcription» organisé par l’EMBO à
Heidelberg. L’idée que la transcription des gènes chez les eucaryotes est modulée par la
conformation de la chromatine n’était pas nouvelle. Elle était, par exemple, déjà prise en
compte dans les premières hypothèses sur la fonction du facteur TIF-1. Le congrès était
pourtant l’occasion d’une mise en lumière du fait que l’enroulement de l’ADN autour des
nucléosomes, briques élémentaires de la chromatine, n’est pas seulement un frein passif à la
20
transcription chez les eucaryotes. Les analyses structurales présentées montraient que les
extrémités N-terminales des histones, dont la séquence est très conservée au cours de
l’évolution, se projettent à l’extérieur de la particule nucléosomale. Non seulement les
travaux pionniers des équipes de David Allis et Alan Wolf révélaient que ces domaines Nterminaux sont le substrat de modifications covalentes des lysines, arginines ou sérines,
comme des acétylations, des méthylations, des phosphorilation, mais en plus ces différentes
modifications semblaient associées à différents niveaux de transcription. Quelques mois plus
tard, David Allis et Strahl formulaient leur hypothèse du « code des histones » dans la revue
Nature, selon laquelle les modifications covalentes des histones agiraient comme un code
permettant de spécifier des cascades d’évènements spécifiques, comme le recrutement de
facteurs de transcriptions ou la modification de la structure chromatinienne (Strahl and Allis,
2000). En somme, un code « épigénétique » participant à la spécification de l’état
transcriptionnel des gènes. Je suis rentré du congrès d’Heidelberg avec l’idée qu’il était
désormais difficile d’étudier les mécanismes de régulation de la transcription chez les
eucaryotes sans s’intéresser de près aux modifications post-traductionnelles des histones et
à leurs fonctions. La caractérisation de l’histone-acétyltransférase Gcn5 avait tout
particulièrement attiré mon attention.
5.3. Gcn5, une HAT à multiples facettes.
5.3.1. Le membre fondateur d’une famille d’histone-acétyltransférases.
L’équipe de D. Allis avait montré au cours de l’année 1996 que le facteur de transcription
Gcn5 de S. cerevisiae présente une activité enzymatique histone-acétyltransférase, établissant
le premier lien fort entre activation transcriptionnelle et acétylation des histones H3 et H4
(Brownell et al., 1996; Kuo et al., 1996). La protéine yGcn5 est le membre fondateur d’une
famille de protéines GNAT (pour Gcn5-related N-acetyltransferases) portant des domaines
conservés de la levure jusqu’à l’homme (Fig. 3). Tous les membres de la famille GNAT
possèdent un domaine catalytique HAT, un domaine conservé d’interaction avec les facteurs
Ada, et un bromodomaine, initialement caractérisé dans les facteurs de remodelages de type
Swi2 et Brahma. Un module amino-terminal conservé, le « PCAF homology domain », est en
plus présent dans les protéines humaines Gcn5 et PCAF, ainsi que dans la protéine Gcn5 de
drosophile.
21
Figure 3. Structures et homologies des protéines de la famille des GNAT.
5.3.2. Une sous-unité d’un complexe d’initiation de la transcription
Les membres de la famille GNAT partagent la caractéristique d’être des sous-unités
essentielles au sein de différents gros complexes multiprotéiques de type « SAGA » (SAGA,
PCAF, TFTC, STAGA), isolés biochimiquement d’abord chez la levure et les mammifères, et
plus récemment chez la drosophile (Grant et al., 1997; Martinez et al., 2001; Ogryzko et al.,
1998; Wieczorek et al., 1998). En plus d’un membre de la famille GNAT, les complexes de
type SAGA contiennent (i) des protéines homologues aux adaptateurs de levures Ada2 et
Ada3, isolés pour leur interaction avec les activateurs transcriptionnels Gcn4 ou VP16 (ii)
des protéines Spt, isolées pour leur interaction avec TBP (TATA Binding Protein) (iii) des
facteurs TAF (TBP Associated Factors) trouvés également associés à la sous-unité TFIID de
l’ARN polymérase II (iv) et enfin le facteur Tra1, ou son orthologue TRRAP chez les
vertébrés. Comme pouvait le laisser supposer cette composition, plusieurs études ont
montré que le complexe SAGA présente les caractéristiques d’une complexe « basal »
d’initiation de la transcription, recruté par des activateurs transcriptionnels sur fixant à
l’ADN au niveau des régions cis-régulatrices des gènes. Dans le cas de Gcn4, p53 ou GAL4VP16, il est montré que le recrutement se fait par interaction directe avec les sous-unités
Ada ou Tra1. Chez la levure, le complexe SAGA présente une parenté fonctionnelle et
structurelle avec la sous-unité TFIID de l’ARN polymérase. Dans cet organisme, l’initiation
de la transcription d’environ 90% des gènes serait dépendante de l’activité de TFIID, tandis
que le complexe SAGA contrôlerait la transcription des 10% de gènes restants, pour la
plupart dans des situations de réponse à un stress (Huisinga and Pugh, 2004). Les complexes
contenant un facteur de la famille GNAT seraient ainsi des complexes d’initiation de la
transcription « spécialisés », recrutés par des facteurs de transcription contrôlant un
22
ensemble restreint de gènes (Bhaumik and Green, 2001; Larschan and Winston, 2001).
5.3.3. Des partenaires très en vue.
Au milieu des années 1990, l’équipe de P. Nakatani étudiait la fonction des protéines
paralogues p300 et CBP (Creb Binding Protein) dans le contrôle de la prolifération cellulaire.
En caractérisant le site d’interaction directe entre la protéine oncogénique E1A de
l’adénovirus et CBP, P. Nakatani proposa que l’effet oncogénique d’E1A résultait du
déplacement par compétition d’un partenaire de CBP, conduisant au disfonctionnement de la
protéine. Cet élégant raisonnement fut validé par l’isolement de la protéine PCAF
(P300/CBP Associated Factor), immédiatement reconnue pour son homologie avec la
protéine Gcn5 de levure (Yang et al., 1996). Le domaine d’interaction de PCAF avec CBP est
localisé dans la partie N-terminale de la protéine. Chez les mammifères, une isoforme de
Gcn5 orthologue de PCAF présente aussi ce domaine N-terminal d’interaction avec CBP et
p300, tout comme la protéine dGcn5 de drosophile (Fig. 3) En revanche, le domaine Nterminal est absent de la protéine Gcn5 de levure, et il n’existe pas d’homologue de la
protéine CBP dans cet organisme. Ainsi, l’interaction des membres de la famille GNAT avec
CBP semble être une fonction apparue secondairement au cours de l’évolution.
Le « poids » des protéines CBP est p300 est considérable, tant du point de vue de leur
masse moléculaire (environ 300 kDa), que de la masse de travaux et de publications qu’elles
ont suscités. Ces protéines présentent des interfaces d’interactions avec de multiples
facteurs de transcription, elle possèdent un bromodomaine capable de reconnaître
spécifiquement des résidus acétylés, et sont dotées d’une activité HAT. Ainsi, l’idée
communément admise est que ces « Shiva » fonctionnent comme de gros intégrateurs des
régulations transcriptionnelles. En accord avec cette vision, CBP et p300 interviennent dans
le contrôle de nombreux processus de régulation génique fondamentaux, et en particulier
dans le contrôle de la prolifération cellulaire, du développement et des principales voies de
signalisation cellulaires (Goodman and Smolik, 2000). L’altération de leur structure conduit à
des maladies génétiques et à des cancers. Il est vraisemblable que la pléiotropie fonctionnelle
des GNAT chez les vertébrés s’exerce au moins en partie au travers de leurs interactions
avec les protéines CBP et p300.
La protéine Gcn5 n’acétyle pas que les histones. Ainsi, l’acétylation de p53 ou de MyoD
par PCAF augmente leur affinité pour leurs séquences d’ADN cibles, tandis que celle des
facteurs chromatinien HMG-17 et HMG(Y) inhibe leur fixation aux nucléosomes. Par ailleurs,
L’acétylation de E2F1 par PCAF augmente sa stabilité, celle du facteur de transcription CIITA
23
induit son accumulation dans le noyau, et celle du transactivateur Tat du virus HIV-1 module
ses interactions avec la protéine CDK9 et l’ARN. A travers l’acétylation de facteurs de
transcription et ses effets moléculaires variés, on voit ainsi se dégager une nouvelle facette
de PCAF suggérant que la protéine peut agir dans de certaines situations comme un
effecteur allostérique.
5.3.4. Au club des coactivateurs des récepteurs nucléaires : acétylation
à tous les étages !
Une autre facette très étudiée des protéines GNAT chez les vertébrés est leur fonction
de coactivateurs des récepteurs nucléaires. L'activation de ces récepteurs aux hormones
stéroïdes, rétinoïdes ou tyroïdiennes, est liée à leur interaction, en présence du ligand
agoniste ad hoc, avec un complexe de plusieurs cofacteurs dont les protéines CBP ou p300,
les protéines de la famille p160 (SRC-1, ACTR et TIF-2) et les protéines P/CAF ou Gcn5
(pour des revues, voir Korzus et al., 1998; Leo and Chen, 2000). Tous ces facteurs
présentent une activité HAT ! Les protéines CBP/p300, ACTR et SRC-1 interagissent avec le
domaine de liaison à l'hormone des récepteurs nucléaires (LBD) par l'intermédiaire d'un
motif peptidique conservé LXXLL (McInerney et al., 1998). Cette interaction est
directement dépendante d'un changement conformationnel du LBD, provoqué par la liaison
du ligand. L'interaction de P/CAF avec un motif situé dans le domaine de liaison à l'ADN des
récepteurs nucléaires n'est en revanche pas dépendante in vitro de la présence du ligand
hormonal. Cependant, ce motif se trouve masqué in vivo par une interaction du récepteur
avec un complexe corépresseur comprenant les protéines NCoR (ou SMRT), Sin3A et
l'histone-désacétylase HDAC (Korzus et al., 1998). En présence d'hormone, ce complexe est
déplacé et la protéine P/CAF peut venir interagir avec le récepteur nucléaire. Il est à noter
qu'au sein du complexe coactivateur, les protéines CBP/p300, ACTR, SRC-1 et P/CAF
établissent non seulement des liaisons avec le récepteur nucléaire, mais également
interagissent les unes avec les autres (Korzus et al., 1998). Ces quatre protéines possèdent
ainsi le statut de coactivateurs agissant au sein d'un complexe possédant de multiples
activités HAT. Une étude récente a également révélé que le complexe TFTC, contenant la
protéine Gcn5 humaine, fonctionne également comme un complexe coactivateur des
récepteurs nucléaires.(Yanagisawa et al., 2002)
Étant donné mon intérêt pour le récepteur nucléaire de l’hormone stéroïde ecdysone
chez la drosophile, la présence de Pcaf au sein de complexes coactivateurs de récepteurs de
vertébrés a dès le début attiré mon attention. L’une des premières questions que je me suis
24
posé en apprenant l’existence d’un homologue dGcn5 chez la drosophile était bien ; « est-il
un coactivateur de récepteur de l’ecdysone ? ».
5.3.5. Un acteur au cœur de l’hypothèse du« code des histones ».
L’hypothèse du code des histones de B. Strahl et D. Allis propose que différents types de
modifications spécifiques des histones au niveau des gènes conditionnent leur état
d’activation ou de répression. Deux grands ensembles de données sont venus appuyer, si ce
n’est prouver cette hypothèse.
Tout d’abord, un éventail important de modifications covalentes des histones est
aujourd’hui bien caractérisé et il existe dans la plupart des cas une corrélation étroite entre
ces modifications et un état transcriptionnel – activé ou réprimé. Ainsi, les acétylation des
résidus lysines 9 et 14 de l’histone H3 (H3-AcK9 et H3-AcK14) et des résidus lysines 8 et 16
de l’histone H4 (H4-AcK8 et H4-AcK16) sont pratiquement toujours associées à une
activation transcriptionnelle, tout comme la phosphorilation de la sérine 10 (H3-phoS10) et
la méthylation de la lysine 4 (H3-meK4) de l’histone H3. Les méthylations des lysines 9 et 27
de l’histone H3 sont en revanche des marques de répression. Enfin, des modifications plus
récemment analysées comme l’ubiquitination (Sun and Allis, 2002) ou la sumoilation (Shiio
and Eisenman, 2003) sont également corrélées à la répression transcriptionnelle au niveau
des télomères. Au cours des deux dernières années, les méthodes d’immunoprécipitation de
chromatine couplées à une analyse sur puce à ADN (« Chip on chip ») ont permis des
analyses exhaustives des modifications covalentes des histones, à l’échelle du génome. En
général, ces analyses ont largement confirmé les correspondances exposées ci-dessus
(Schubeler et al., 2004). Dans leur version les plus élaborées, elles ont débouché sur la mise
en évidence des corrélations entre des combinaisons de modifications des histones et
l’activité transcriptionnelle (Harbison et al., 2004; Pokholok et al., 2005; Roh et al., 2005).
Ainsi le groupe de M. Grunstein montre que chez la levure, des groupes distincts de gènes
coexprimés se différencient par une combinatoire spécifique d’acétylation au niveau de 11
résidus lysines des queues N-terminales des histones (Kurdistani et al., 2004).L’idée poussée
par M. Grunstein, et qui avait été initialement proposée par Fischle (Fischle et al., 2003), est
que les combinaisons de modifications d’histones, entraînent la création d’interfaces
complexes au niveau de la chromatine, provoquant le recrutement spécifique de facteurs de
transcriptions.
25
Quand les enzymes responsables des modifications des histones ont été identifiées, il
existe une correspondance entre leur statut d’activateur ou répresseur transcriptionnel et le
statut de la modification d’histone qu’elles catalysent. Ainsi, une majorité des histoneacétyltransférases ont une fonction d’activateurs transcriptionnels. C’est en particulier le cas
pour les membres de la famille des GNAT, qui acétylent principalement les résidus H3-K9
et H3-K14. Les histone-déacétylases (HDAC) sont en revanche le plus souvent associées à
des complexes répresseurs de la transcription. Les facteurs de drosophile Ash1, TRX et
TRR méthylent spécifiquement le résidu H3-K4 et ont été identifiés dès l’origine comme des
activateurs transcriptionnels. À l’inverse, les protéines Su(Var)3-9 ou E(z) qui méthylent
respectivement les lysines H3-K9 et H3-K27 sont, comme attendu, des répresseurs
transcriptionnels impliqués respectivement dans l’hétérochromatinisation par recrutement
de la protéine HP1 ou dans le recrutement des complexes Polycomb. Quand cela a pu être
testé, l’activité enzymatique des facteurs de modification des histones est nécessaire à leur
fonction d’activateur ou répresseur transcriptionnel. Cette observation est très importante
car elle milite en faveur d’un rôle causal des modifications des histones dans la régulation de
la transcription, et rend moins vraisemblable l’hypothèse que ces modifications ne soient en
fait qu’une simple série de « marques », laissées par exemple après le passage de l’appareil de
transcription au niveau des gènes.
Lecture du code des histones
La découverte que le bromodomaine de la protéine PCAF présente une affinité spécifique
pour l’acétyl-lysine constitue une étape clé dans la validation de l’hypothèse du code des
histones (Dhalluin et al., 1999; Jacobson et al., 2000). Initialement reconnu dans les facteurs
Swi2 de levure et Brahma de drosophile, le bromodomaine est également retrouvé dans
toute une série de facteurs de transcription (16 protéines chez la drosophile), dont
principalement des facteurs de remodelage de la chromatine, et des HAT (Yang, 2004). Il est
également présent dans les 3 protéines à activité histone-méthyltransférase (HMT), Ash1,
RIZ et MLL. Les divergences de séquences entre les différents bromodomaines semblent
responsables d’un changement de spécificité dans la fixation de leur cible. Ainsi, le
bromodomaine de BRG1 fixe le résidu H4-AcK8, celui de Brd2 interagit avec le résidu H4AcK12, tandis que le double bromodomaine présent dans TAF-1 se fixe à l’histone H3
acétylé en K9 et K14 (Agalioti et al., 2002; Jacobson et al., 2000; Kanno et al., 2004). Ces
données appuient fortement l’idée que le bromodomaine serait un module protéique
permettant de « lire » les différentes acétylations des histones.
26
Un autre module protéique, le chromodomaine, présente une affinité pour les methyllysines. Ce domaine est présent dans les protéines HP1 et Polycomb et il est respectivement
responsable de leur ciblage au niveau des résidus H3 méthylés en K9 et K27 (Sims et al.,
2003). Comme dans le cas du bromodomaine, le chromodomaine est trouvé dans toute une
série de facteurs de transcription, dont des facteurs de remodelage, des histoneacétyltransférases et des histones methyltransférases.Très récemment l’équipe de D. Allis a
montré qu’un domaine comportant des répétitions WD40 (WD40 repeats) dans la protéine
humaine WDR5 lie spécifiquement les diméthyl-lysines K4 de l’histone H3 (H3-me2K4)
(Wysocka et al., 2005), tandis que les domaines à doigts à zinc de type « PhD » présents
dans la protéine Nurf301 reconnaissent ce résidu quand il est triméthylé (H3-me3K4) (D.
Allis, résultats non publiés).
L’allongement de la liste des modules protéiques liant des modifications spécifiques
d’histones vient asseoir l’hypothèse du code des histones, en lui associant un mécanisme de
lecture par recrutement ciblé de facteurs de transcription. Il est par ailleurs remarquable que
ces modules ne soient pratiquement retrouvés que dans des facteurs modulant la structure
chromatinienne (à l’exclusion par exemple des facteurs de transcription liant directement
l’ADN). Ceci suggère que le code des histones opère dans un cadre plus restreint que celui
proposé originellement par Strahl et Allis, en spécifiant un état chromatinien au niveau des
gènes cibles.
« Readers / Writers » : modifications d’histones en cascades.
Domaines de reconnaissance d’une modification d’histone et activité enzymatique
modifiant les nucléosomes peuvent se retrouver portés par un même acteur, ou présents au
sein d’un même complexe multiprotéique. Ceci laisse entrevoir un code des histones
s’établissant de façon dynamique, au cours d’une séquence de modifications/recrutements.
L’analyse de plusieurs modèles, basés sur la transcription de chromatine reconstituée in vitro,
montre qu’il existe en effet une séquence temporelle de modifications d’histone et une
hiérarchie de recrutement de facteurs de transcription au niveau des gènes cibles. Cette
hiérarchie semble dépendante du modèle génétique considéré. Par exemple, l’activation du
gène de l’interféron-β implique d’abord le recrutement de Gcn5 par des facteurs de
transcription se fixant au niveau d’un élément enhancer (Agalioti et al., 2002). L’acétylation
du nucléosome par l’HAT Gcn5 induit alors le recrutement de CBP, du complexe de
remodelage Swi/Snf et du complexe TFIID (ces deux complexes multiprotéiques contiennent
des facteurs à bromodomaine). L’événement d’activation initial par le récepteur nucléaire
RAR/RXR (Dilworth et al., 2000), par Gcn4 (Kuo et al., 2000)ou par la chimère GAL4-VP16
27
(Hassan et al., 2001) induit également d’abord l’acétylation des nucléosomes par
recrutement d’HAT, ce qui permet le recrutement subséquent du complexe de remodelage
SWI/SNF et l’accessibilité du promoteur à l’ARN polymérase. Dans d’autres cas cependant,
comme pour l’induction du gène HO de levure, l’action des complexes de remodelage est
nécessaire avant le recrutement du complexe d’acétylation (Cosma et al., 2001).
Deux exemples récents sont venus souligner à quel point « lecteurs » de modifications et
modificateurs d’histones peuvent se trouver intégrés dans un processus d’activation génique.
Ainsi, les équipe de D. Allis et de R. Roeder ont montré que le facteur WDR5, recruté au
niveau des résidus H3-me2K4, est associé au sein de différents complexes protéiques avec
l’histone triméthyl transférase MLL, fournissant ainsi un mécanisme de lecture-modification
pour passer d’un état diméthylé à un état triméthylé du résidus H3-K4 (Dou et al., 2005;
Wysocka et al., 2005). De plus, l’équipe de Roeder montre que le complexe qu’elle a purifié
à partir de cellules de mammifères contient également l’HAT MOF. Activités de
triméthylation du résidus H3-K4 et d’acétylation du résidu H4-K16 se trouvent ainsi
associées. De plus, les deux modifications agissent de façon synergique pour activer le locus
Hoxa9 (Dou et al., 2005). De son côté, l’équipe de D. Allis, vient de montrer que la
triméthylation du résidu H3-K4 par le facteur MLL est à son tour reconnue par les deux
domaines PhD du facteur Nurf301… qui contient également un bromodomaine (résultats
non publiés). Nurf 301 pourrait ainsi cibler l’activité du complexe de remodelage NURF au
niveau des nucléosomes portant la marque H3-me3K4, associée à une acétylation spécifique
qui reste à caractériser !
Ces exemples laissent entrevoir le degré de complexité qui peut être généré par une
combinatoire de modification d’histone associées à des processus de recrutements
séquentiels au niveau de la chromatine. Ils montrent également que nous n’avons pas
aujourd’hui une vision unifiée de l’effet des modifications des histone sur la cascade
d’événements conduisant à l’activation ou la répression transcriptionnelle. L’analyse détaillée
d’un plus grand nombre de gènes modèles permettra peut-être de dégager des règles qui
nous échappent encore. Il faut également considérer la possibilité que les modifications des
histones puissent avoir des conséquences différentes selon l’environnement chromatinien ou
le promoteur considéré.
5.4. La protéine Gcn5 de drosophile et les questions initiales.
Les protéines de la famille GNAT sont fascinantes car elles se trouvent à la croisée de
mécanismes de régulation de la transcription en apparence très variés. Tour à tour, on les
28
trouve (i) impliquées dans des complexes d’initiation de la transcription - apparemment
spécialisés dans la régulation d’un sous-ensemble de gènes (ii) recrutées par des facteurs de
transcription agissant au niveau des éléments enhancer (iii) sous-unités de complexes
coactivateurs de récepteurs nucléaires à activité HAT multiples, (iv) et enfin acteurs de la
modulation de la structure chromatinienne, leur activité enzymatique permettant le
recrutement de facteurs régulateurs au niveau des queues N-terminales des histones.
Pourtant, malgré cet éventail considérable d’aspects déjà analysés, il n’existait, au moment
où nous avons entamé notre travail, aucune information sur la fonction – et l’importance des protéines de la famille GNAT dans le contexte de la régulation du développement et/ou
de l’homéostasie d’un métazoaire. La drosophile offrait un modèle idéal pour aborder cet
aspect.
Il n’existe qu’un seul orthologue dGcn5 chez la drosophile, cloné par l’équipe de D. Allis
sur la base de son homologie avec la protéine PCAF humaine (Smith et al., 1998). Comme
évoqué précédemment, dGcn5, contrairement à son homologue de levure, présente le
domaine N-terminal (Pcaf homology domain), responsable chez la protéine humaine de son
association avec les facteurs CBP et p300, ainsi que de l’association avec le récepteur
nucléaire RAR. Des tests in vitro ont montré que dGcn5 acétyle de façon prépondérante
l’histone H3, et dans une moindre mesure l’histone H4 (Kusch et al., 2003; Smith et al.,
1998). En utilisant une approche de purification biochimique, deux équipes ont montré que
dGcn5 est présent dans des complexes macromoléculaires de 0.8 et 1.8 MD, tous les deux
dotés d’une activité d’acétylation des nucléosomes (Kusch et al., 2003; Muratoglu et al.,
2003). Le complexe de 1.8 MD contient les facteurs Ada2b et Ada3, des facteurs Spt, la
protéine dTra1 (homologue de la protéine humaine TRRAP), ainsi que des protéines Taf
(Taf5, 9 et 10). Des expériences d’immunoprécipitation à partir d’extraits nucléaires ont par
ailleurs révélé son interaction avec les activateurs transcriptionnels p53 et VP16. Ainsi, ce
complexe de 1.8 MD présente les caractéristiques d’un complexe de type SAGA/TFTC. La
protéine Ada2a, proche paralogue de la protéine Ada2b, semble elle associée avec la
protéine Ada3 au sein du complexe de 0.8 MD, dépourvu de Tra1 et de protéines Spt, et qui
présenterait ainsi des similarités avec le complexe Ada purifié chez la levure (Grant et al.,
1997). De façon intéressante, ce complexe de 0.8 MD semble plus spécifiquement associé
aux puffs qui apparaissent sur les chromosomes polytènes à la fin du troisième stade larvaire,
suggérant une possible connexion avec la réponse à l’ecdysone à ce stade du développement.
Hormis ces données, obtenues essentiellement par des approches biochimiques, il
n’existait pas d’information sur les fonctions in vivo de Gcn5 chez la drosophile. Une voie
29
était donc tracée et Dimitri Szymczak (1999), suivit bientôt par Clément Carré (2000), ont
rejoint le laboratoire pour entreprendre la caractérisation de ces fonctions à travers 4
questions focalisées :
(i)
L’invalidation génétique de dGcn5 allait-elle provoquer des défauts spécifiques du
développement, montrant le cas échant une fonction spécialisée de la protéine
dans la régulation de programmes génétiques spécifiques ? L’objectif pour aborder
cette question était d’isoler et d’analyser des allèles mutants du gène dGcn5. En
attendant que notre approche par génétique classique porte ses fruits, nous avons
par ailleurs développé une stratégie alternative d’invalidation par interférence par
l’ARN.
(ii)
La protéine dGcn5 agit-elle comme un coactivateur de récepteurs nucléaires de
drosophile, et en tout premier lieu comme un coactivateur du récepteur EcR/USP
de l’ecdysone ?
(iii)
Quelle est la spécificité de substrat in vivo de l’HAT dGcn5, et l’acétylation de ce
substrat peut-elle être reliée à une fonction spécifique dans la régulation du
génome ?
(iv)
Quels rôles jouent les différents domaines remarquables de dGcn5 dans la
fonction de la protéine ?
5.5. L’HAT dGcn5 est un acteur essentiel de la métamorphose de la
drosophile.
L’article qui suit est venu concrétiser le travail de Dimitri et de Clément. Les aspects
restant à élucider, ainsi que de nouvelles directions de recherche récemment ouvertes sont
abordées dans la section qui lui fait suite.
30
MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, Sept. 2005, p. 8228–8238
0270-7306/05/$08.00⫹0 doi:10.1128/MCB.25.18.8228–8238.2005
Copyright © 2005, American Society for Microbiology. All Rights Reserved.
Vol. 25, No. 18
The Histone H3 Acetylase dGcn5 Is a Key Player in
Drosophila melanogaster Metamorphosis
Clément Carré,† Dimitri Szymczak,†‡ Josette Pidoux, and Christophe Antoniewski*
Laboratory of Drosophila Genetics and Epigenetics, Department of Developmental Biology, CNRS URA 2578,
Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France
Received 20 April 2005/Returned for modification 20 May 2005/Accepted 22 June 2005
Although it has been well established that histone acetyltransferases (HATs) are involved in the modulation
of chromatin structure and gene transcription, there is only little information on their developmental role in
higher organisms. Gcn5 was the first transcription factor with HAT activity identified in eukaryotes. Here we
report the isolation and characterization of Drosophila melanogaster dGcn5 mutants. Null dGcn5 alleles block
the onset of both oogenesis and metamorphosis, while hypomorphic dGcn5 alleles impair the formation of adult
appendages and cuticle. Strikingly, the dramatic loss of acetylation of the K9 and K14 lysine residues of histone
H3 in dGcn5 mutants has no noticeable effect on larval tissues. In contrast, strong cell proliferation defects in
imaginal tissues are observed. In vivo complementation experiments revealed that dGcn5 integrates specific
functions in addition to chromosome binding and acetylation. Surprisingly, a dGcn5 variant protein with a
deletion of the bromodomain, which has been shown to recognize acetylated histones, appears to be fully
functional. Our results establish dGcn5 as a major histone H3 acetylase in Drosophila which plays a key role
in the control of specific morphogenetic cascades during developmental transitions.
Collectively, these data point to a causal role of histone acetylation in transcriptional activation. In support of this hypothesis, the acetylation of lysine 8 in histone H4 (H4-AcK8) and
lysine 14 in histone H3 (H3-AcK14) has been implicated in the
sequential recruitment of transcription factors leading to the
activation of the human beta interferon gene in vitro (1), and
distinct patterns of histone acetylation have been associated
with groups of coexpressed genes in genome-wide studies (36,
52).
The yeast adaptor Gcn5 was the first transcription factor
identified as a bona fide HAT (14, 35). It defines a family of
evolutionarily conserved Gcn5-related N-acetyltransferases
(GNATs) whose members were purified as essential subunits
of ADA and SAGA complexes in yeast and of PCAF, STAGA,
and TFTC complexes in mammals. The GNAT complexes
contain Ada transcriptional adapters, Spt proteins, and a set of
TATA-binding protein-associated factors, and they are structurally related, suggesting that they perform similar functions
in transcription (13, 65). In vitro, Gcn5 acetylates lysine 14 of
free, but not nucleosomal, histone H3. In contrast, Gcn5 acetylates an expanded set of lysines of nucleosomal histone H3
when copurified with native ADA or SAGA complexes (26),
suggesting that one function of these complexes in vivo is to
modulate the activity and specificity of Gcn5.
Two distinct genes, hGCN5 and hPCAF, encode Gcn5 homologues in humans. Both hGCN5 isoforms, GCN5S and
GCN5L, and hPCAF (P300/CBP-associated factor) share a
close similarity with the complete yeast Gcn5 sequence, including more matches within the HAT catalytic domain as well as
the bromodomain, which has been shown to bind acetylated
histone lysines (21, 30–32, 46, 47). PCAF and GCN5L share an
additional N-terminal domain (Pcaf homology domain) of
about 350 amino acids involved in binding to CBP/p300 and to
several nuclear receptors. While the GCN5 gene knockout
results in early embryonic lethality, the PCAF gene knockout
Gene expression in eukaryotes has to accommodate the
presence of nucleosomes and the packaging of DNA into higher-order chromatin structures. Nucleosomes are composed of
octamers of histone proteins H2a, H2b, H3, and H4, whose
N-terminal tails project outward from the nucleosomal core
and are subjected to covalent modifications such as acetylation,
methylation, phosphorylation, and ubiquitination. The variety
of these modifications and their association with distinct states
of gene transcription suggested that they may act as a combinatorial code to specify downstream events such as the recruitment of transcription factors or modifications of the chromatin
structure (23, 58).
The acetylation of lysine residues is one of the most studied
histone modifications and has long been linked to gene activation. For instance, a twofold up-regulation of transcription
from the male X chromosome in Drosophila melanogaster is
correlated with histone hyperacetylation (60), while gene silencing in heterochromatin or X chromosome inactivation in
mammals are correlated with histone hypoacetylation (27).
Numerous sequence-specific activators, such as the nuclear
receptors MyoD and CREB, have been shown to recruit coactivator complexes with histone acetyltransferase (HAT) activity, while transcriptional repressors have been found associated with corepressor complexes with histone deacetylase
activity (13). HAT activity is also associated with more general
transcription factors, such as TATA-binding protein-associated factor 1 (TAF1) and yeast elongation factor 3 (44, 63).
* Corresponding author. Mailing address: Laboratory of Drosophila
Genetics and Epigenetics, Department of Developmental Biology,
CNRS URA 2578, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724
Paris Cedex 15, France. Phone: 33 1 44 38 93 35. Fax: 33 1 40 61 39 18.
E-mail: [email protected].
† These authors contributed equally to this work.
‡ Present address: Laboratory of Polarity and Morphogenesis, Institut Jacques Monod, 75251 Paris Cedex 05, France.
8228
VOL. 25, 2005
dGcn5 IS REQUIRED FOR DROSOPHILA METAMORPHOSIS
has no detectable consequences on mouse development (66).
However, GCN5-PCAF double mutants die earlier than single
GCN5 mutants, indicating that PCAF and GCN5 functions are
not completely redundant.
Although the Gcn5 HAT has been clearly involved in the
control of Arabidopsis growth, development, and homeostasis
(8, 61), its contribution to the control of specific morphogenetic events during animal development remains poorly understood. There is only one Gcn5 homologue in Drosophila (56),
which thus provides a simplified model for the study of the
function of a GNAT in the context of a whole organism. Drosophila Gcn5 (dGcn5) has been isolated in at least two GNAT
complexes that contain distinct Ada2 variants (37, 45). A 1.8MDa SAGA-like complex includes the Ada2b variant, the
Ada3 and Spt3 homologues, and several TAFs. An Ada2b
loss-of-function mutation is lethal and suppresses the histone
H3 acetylation of polytene chromosomes (49), indicating that
the SAGA-like complex plays an essential role in gene expression in Drosophila. In addition, dGcn5 associates with the
Ada2a variant and with Ada3 in a 440-kDa non-SAGA-like
complex. Interestingly, Ada2a and Ada2b mainly localize to
different bands on polytene chromosomes, suggesting that
GNAT complexes may play distinct functions depending on
their composition.
In order to characterize the function of dGcn5 and GNAT
complexes during Drosophila development, we have undertaken two complementary approaches. We isolated dGcn5
loss-of-function mutants from a genetic screen, and we performed in vivo targeting of dGcn5-specific RNA interference
using inverted repeat transgenes. Here we show that dGcn5 is
the major HAT for the lysine residues K9 and K14 of histone
H3, while the acetylation of histone H4 involves other HATs.
Our data indicate that dGcn5 is required for larva-to-adult
metamorphosis and suggest an essential function of dGcn5 in
the control of the cell cycle in imaginal tissues. An analysis of
dGcn5 variant proteins revealed that the Pcaf homology domain, the domain of interaction with the Ada proteins, and the
catalytic domain are all required for the function of the dGcn5
protein. In contrast, the bromodomain appears to be dispensable.
MATERIALS AND METHODS
DNA constructs. An EcoRV-KpnI fragment encompassing the dGcn5 and
CG14121 genes was subcloned from the bacterial artificial chromosome
BACR48G06 into the pBluescript vector. Clones containing this fragment were
selected by colony hybridization with dGcn5 cDNA excised from the LD17356
expressed-sequence-tag clone (BDGP). The PL genomic rescue construct was
then generated by subcloning the CG14121-dGcn5 region as a 4.7-kb KpnI-NotI
fragment into the pCaSper-4 transformation vector.
pUAS-Gcn5 and its derivatives were all made by subcloning the dGcn5 cDNA
from the LD17356 expressed-sequence-tag clone into the pUAST vector. Deletions were generated by the excision of dGcn5 regions and cloning of the appropriate PCR-amplified fragments. Gcn5 variant constructs contained the following deletions: pUAS-Gcn5⌬Pcaf, deletion of the first 361 amino acids of the
dGcn5 peptide; pUAS-Gcn5⌬HAT, deletion of amino acids M554 to K595;
pUAS-Gcn5⌬Ada, deletion of amino acids F635 to P699; and pUASGcn5⌬Bromo, deletion of amino acids S703 to T788. The structure of all Gcn5
variant constructs was confirmed by DNA sequencing. The cloning procedures
and PCR primers used are available upon request.
Generation of dGcn5 mutants. Sixteen Df(3L)iro-2 noncomplementing P elements on chromosome III (a generous gift from Peter Maroy) were mapped by
inverse PCR. A P-element insertion, 1479/10, that was localized in the CG14121
gene, 521 bp upstream of the dGCN5 transcription start site, is homozygous
lethal at puparium formation. This P element was mobilized by crossing with a
8229
strain expressing transposase. Derived lines with both a lost white marker gene
and early embryonic lethality associated with chromosome III were analyzed
using combinations of PCR primers. The flanking regions of the sex204 deficiency were PCR amplified and sequenced.
Males isogenic for an FRT79D ebony marked chromosome were treated with
35 mM ethyl methanesulfonate (EMS) and mated en masse to TM3SerGFP/
TM6b virgin females at 25°C. F1 males (FRT79D ebony/TM6b or FRT79D ebony/
TM3SerGFP) were then pair mated with females with the deficiency sex204, and
crosses were scored for the absence of the F2 progeny class that was heterozygous for the mutagenized chromosome and the deficiency. If this class was
absent, stocks were established from FRT79D ebony/TM3SerGFP or TM6b flies.
We recovered 11 lethal mutations that failed to complement the sex204 deficiency from 6,000 fertile pair matings scored. Each of these mutations was placed
in complementation groups by complementation tests with all other mutations
and with the P-element insertions 1479/10 (a CG14121 allele) and KG01697 (a
Citron allele from BDGP). Four dGcn5 alleles were rescued in crosses with a
PL/PL; sex204/TM3TbSb line homozygous for the PL genomic transgene (Fig. 1)
and in crosses with a UAS-Gcn5/UAS-Gcn5; sex204/da-GAL4/TM3TbSb line
which constitutively expresses the dGcn5 cDNA. Six mutations were genetically
mapped in Citron. The remaining allele was mapped in CG14121 by noncomplementation with the P-element 1479/10 and was rescued with a short genomic
transgene encompassing only the CG14121 locus. We did not isolate a mutation
in CG10686 in our genetic screen because the loss of function of this gene is
likely not lethal. Six pairs of primers were used to PCR amplify the dGcn5 coding
region from flies heterozygous for dGcn5 mutations and a balancer chromosome.
We identified the dGcn5 alleles by comparison of the sequence from mutant
heterozygotes to that obtained from the homozygous parental strain upon which
the mutations were induced. The primer sequences used for this study are
available upon request.
Germ line transformations and fly strains. Transgenic lines were established
as described previously (11). The GAL4-UAS system (10) was used to express
dGcn5, dGcn5 variants, and the green fluorescent protein (GFP) reporter. The
da-GAL4 (GAL4daG32) driver line has been described previously (64). The
lio-GAL4P15 line (55) was provided by Jean-Maurice Dura, IGH, Montpellier,
France. The engrailed-GAL4 (en-GAL4) and UAS-GFP lines were provided by
Jean-Paul Vincent, MRC, London, United Kingdom. The vestigial-GAL4 (vgGAL4) driver line was provided by Fréderic Bernard, IJM, Paris, France. The
distal-less-GAL4 (dll-Gal4) and patch-GAL4 (ptc-GAL4) driver lines were obtained from the Bloomington Stock Center. The escargot-GAL4 (esg-GAL4, or
NP5153) line was obtained from Drosophila Genetic Resources, Japan (http:
//www.shigen.nig.ac.jp/fly/nigfly/).
Immunohistochemistry and Western blotting. Immunostaining of imaginal
disks dissected from mid-third-instar larvae was performed as described previously (20). Rabbit anti-dGcn5 (50) and anti-CBP (a gift from A. Mazo, Kimmel
Cancer Center, Philadelphia, Pa.) were used at a 1:1,000 dilution. Antibodies
against the histone tail modifications were obtained from Upstate and were used
at the follow dilutions: anti-Ac-H3K9, 1:1,000; anti-Ac-H3K14, 1:200; anti-PhH3S10, 1:1,000; anti-Ac-H4K8, 1:1,000; and anti-Ac-H3K9/K14, 1:1,000. Secondary antibodies were used at a 1/200 dilution (Jackson Laboratories). Preparations
were mounted in Citifluor AF1, and imaging was carried out using a Leica
TCS-SP confocal microscope.
Western blots were performed as described previously (11), using primary
antibodies at dilutions of 1:5,000 (anti-dGcn5), 1:1,000 (anti-Ac-H3K9), 1:1,000
(anti-Ac-H3K14), 1:1,000 (anti-Ac-H4K8), and 1:50,000 (anti-MBF-1; a gift of
Marek Jindra, Institute of Entomology, CAS, Ceske Budejovice, Czech Republic). A horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit secondary antibody (Vector) was used at a 1:5,000 dilution and detected using the SuperSignal West Pico
chemiluminescent substrate (Pierce).
Polytene chromosome staining. Glands from third-instar larvae raised at 18°C
were dissected in phosphate-buffered saline (PBS), fixed for 10 min in 50% acetic
acid–3.7% formaldehyde, and squashed on glass slides. Immunostaining of polytene chromosomes was performed essentially as described previously (67). The
primary antibodies used were mouse anti-GFP (1:200) from Roche to reveal the
H2b-YFP marker protein (4) and anti-Ac-H3K9 (1:100), anti-Ac-H3K14 (1:100),
anti-Ac-H3K9/K14 (1:100), anti-Ph-H3S10 (1:100), and anti-Ac-H4K8 (1:100)
from Upstate. The anti-HP1 antibody (a gift from S. Elgin, Washington University, St. Louis, Mo.) was used at a 1:500 dilution. The secondary antibodies were
Cy3-conjugated anti-rabbit (1:200) and fluorescein isothiocyanate-conjugated
anti-mouse (1:200) from Jackson Laboratories. Slides were mounted in Vectashield (Vector Laboratories) with 1.5 ␮g/ml DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole),
and imaging was carried out using a Zeiss Axiovert 200 M microscope with a
Roper Scientific Coolsnap HQ camera.
BrdU incorporation and terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated
8230
CARRÉ ET AL.
MOL. CELL. BIOL.
FIG. 1. dGcn5 is required for Drosophila metamorphosis. (A) Genetic map of the dGcn5 region. The Drosophila dGcn5 gene with its two
introns (white boxes) is depicted in black. The deletion sex204 was generated by imprecise excision of the 1479/10 P element (black triangle)
inserted in the CG14121 gene. dGcn5 alleles are indicated, as well as the position of the genomic fragment included in the PL transgenic construct.
(B) Impaired metamorphosis in Gcn5E333st mutants. (Left side) Homozygous Gcn5E333st animals failed to formal normal puparium compared to
Gcn5E333st/TM3 control animals. Salivary glands from control or Gcn5E333st late-third-instar larvae (top) were immunostained with a dGcn5
antibody. (Right side) Squashed salivary glands from wild-type (control) and homozygous Gcn5E333st (E333st) late-third-instar larvae. Brackets
indicate chromosomal regions corresponding to 2B (top) and 74EF-75B (bottom) early puffs, respectively. (C) Gcn5E333st/Gcn5C137T animals mostly
died as pharate adults with abnormally elongated metathoracic legs (black arrowhead), strong defects in abdominal cuticle deposition (open
arrowhead), and rough eyes. Note that the eye pigmentation was stronger in Gcn5E333st/Gcn5C137T animals than in Gcn5C137T/TM3 control animals
because of the presence of a FRT79D white⫹ marker on the mutagenized chromosomes. A metathoracic twisted and crooked leg (black arrow)
from a Gcn5E333st/Gcn5C137T adult escaper is shown to the right. The same defects and lethality were observed for the Gcn5E333st/Gcn5⌬T280-F285
heteroallelic combination (not shown). (D) Structures of the wild-type and variant dGcn5 proteins expressed from pUAST-derived transgenic
constructs. The N-terminal domain conserved in vertebrate Pcaf, the catalytic HAT domain, the Ada domain, and the bromodomain are indicated
as shaded boxes.
dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) experiments. For the BrdU (5-bromo2⬘-bromodeoxyuridine) incorporation procedure, imaginal disks from third-instar larvae were dissected in Schneider medium and incubated for 15 min in 75
␮g/ml BrdU at room temperature. Disks were washed twice with PBS and fixed
for 30 min at 4°C in PBS with 4% formaldehyde. Disks were then washed three
times for 10 min each time with 1⫻ PBS–0.3% Triton X-100 (PBT). DNAs were
denatured in 3 N HCl for 30 min and washed three times for 10 min each time
with PBT. The disks were blocked (three times for 10 min each time) in 1⫻
PBS–0.3% Triton X-100–1% bovine serum albumin (PBTA), incubated over-
night at 4°C with an anti-BrdU monoclonal antibody (Upstate) according to the
manufacturer’s instructions, and washed with PBTA. The disks were then incubated for 1 h at room temperature with a Cy3-conjugated anti-mouse secondary
antibody (Jackson ImmunoResearch) in PBTA, washed with PBT (three times
for 10 min each time), and mounted in Vectashield (Vector Laboratories).
TUNEL assays were performed using a TUNEL apoptosis detection kit (Upstate). Wing disks from wandering third-instar larvae were dissected and fixed in
PBS with 4% formaldehyde for 20 min at 4°C. The disks were washed with PBS
for 10 min, blocked in 1⫻ PBS–0.05% Tween 20–0.2% bovine serum albumin for
dGcn5 IS REQUIRED FOR DROSOPHILA METAMORPHOSIS
VOL. 25, 2005
10 min, and treated for the TUNEL reaction according to the manufacturer’s
instructions. The disks were washed three times with PBS and mounted in
Vectashield (Vector Laboratories).
RESULTS
Isolation of dGcn5 mutant alleles. We determined the insertion sequences of several P elements which cytologically
mapped close to the 69C4 position of dGcn5 on polytene
chromosomes and were lethal over the Df(3L)iro-2 deficiency
(P. Maroy, personal communication). The 1479/10 P element
was found inserted 521 bp upstream of the dGcn5 transcription
start site, in the coding sequence of the CG14121 gene (Fig.
1A). We used this insertion to generate deletions via transposase-mediated P-element excision and recovered the lethal
deficiency sex204 that removes a part of the CG14121 coding
sequence, the dGcn5 and CG10686 genes, and the transcription start site of the citron gene (Fig. 1A). To obtain dGcn5specific alleles, we screened for EMS-induced dGcn5 mutants
by noncomplementation of the sex204 deficiency. We recovered 11 mutants that failed to complement the sex204 deficiency for viability. Five mutants were rescued by a PL transgenic construct encompassing the dGcn5 and CG14121 genes
(Fig. 1A). Four of these alleles were fully rescued by a UASGcn5 cDNA transgene (Fig. 1D) expressed under the control
of the ubiquitous da-GAL4 driver, indicating that these alleles
specifically impair dGcn5 function. The remaining allele is a
mutation of the CG14121 gene (see Materials and Methods).
We sequenced the dGcn5 mutations and found that they all lie
within the first dGcn5 exon. Two of them are localized in the
Pcaf homology domain and result in a cysteine-to-tyrosine substitution (C137T) or a small deletion from tyrosine 280 to
phenylalanine 285 (⌬T280-F285). The two other mutations
generate stop codons (Q186st and E333st). Gcn5E333st mutants
were outcrossed and then rescued as homozygous by the PL
transgene, indicating that they do not bear other irrelevant
EMS-induced lethal mutations.
dGcn5 is required for metamorphosis and oogenesis. To
determine the lethal phase associated with the dGcn5 loss of
function, we maintained the Gcn5E333st allele over a GFPexpressing balancer chromosome. About 26% of eggs laid by
females from this stock did not reach the first larval instar, a
number attributable to embryonic lethality from the homozygous balancer chromosome. Nonfluorescent homozygous
Gcn5E333st larvae developed similarly to their GFP-expressing
fluorescent heterozygous siblings until the end of the third
larval instar, despite the absence of detectable dGcn5 protein
in mutant tissues at this stage (Fig. 1B and data not shown).
However, Gcn5E333st mutant larvae did not form their puparium at the normal time and continued to wander for 4 to 5
additional days. They eventually stopped moving but failed to
evert spiracles, formed abnormally long prepupae, and died
with partial separation of the posterior part of the prepupa
from the pupal case (Fig. 1B). Similar developmental arrest
and defects were observed with the heteroallelic null combination Gcn5Q186st/Gcn5E333st (not shown).
Puparium formation is triggered by a pulse of 20-hydroxyecdysone at the end of the third larval instar. This involves the
coordinated induction of a small number of early puff genes,
whose products in turn regulate the expression of a larger set
of late puff genes (3). Homozygous Gcn5E333st mutants were
8231
taken at various times during their extended wandering stage,
and polytene chromosomes from their salivary glands were
squashed (Fig. 1B, right panels). We observed a strong reduction of the size of the early puffs 2B, 74EF, and 75B in these
animals, indicating a failure of the ecdysone-controlled genetic
program in dGcn5 mutants.
Heteroallelic Gcn5C137T/Gcn5E333st and Gcn5E333st/
Gcn5⌬T280-F285 mutant larvae formed their puparium normally,
indicating that the Gcn5C137T and Gcn5⌬T280-F285 variant proteins retain partial function. However, these mutants failed to
elongate their metathoracic legs correctly, had rough eyes, and
displayed a partial to complete absence of abdominal cuticle
deposition (Fig. 1C). Both heteroallelic combinations gave rise
to rare adult escapers with misshapen wings, rough eyes, and
crooked and twisted metathoracic legs (Fig. 1C and data not
shown). These escapers died a few hours after eclosion. Altogether, these data point to an essential function of dGcn5 at
the onset of and during metamorphosis.
Since an important stock of dGcn5 protein is detected in
oocytes and presyncytial embryos (data not shown), this maternal contribution of dGcn5 may be sufficient to allow embryonic and larval development. To generate embryos lacking a
maternal contribution, we took advantage of the absence of
expression of the pUAST-derived construct UAS-Gcn5 in the
female germ line (10). We generated UAS-Gcn5/⫹;
Gcn5E333st/sex204 da-GAL4 rescued adults and found oogenesis in females to be arrested at stages 5 and 6 (data not
shown). This effect was due to the lack of UAS-Gcn5 expression in the germ line, since control females rescued by the
dGcn5 genomic construct (PL/⫹; Gcn5E333st/sex204) were fertile. With dGcn5 being required for oogenesis, we were not
able to analyze its contribution to embryonic development.
dGcn5 is required for cell proliferation. Imaginal disks from
homozygous Gcn5E333st mutant third-instar larvae are misshapen and severely reduced in size (Fig. 2A), suggesting that
a dGcn5 loss of function impairs the proliferation of imaginal
cells during larval instars. In a previous report, we made use of
the inverted-repeat transgenic construct UAS-IR[Gcn5] to target RNA interference (RNAi) against dGcn5 (50). To further
analyze the role of dGcn5 in the cell proliferation of imaginal
tissues, a UAS-IR[gcn5] transgenic line was crossed with enGAL4 UAS-GFP individuals expressing the GAL4 activator.
The en-GAL4 driver induced both GFP expression and specific
dGcn5 depletion in the posterior (P) compartments of imaginal disks of third-larval-instar progeny (compare Fig. 3A and
A⬘). In a control experiment, silencing of the unrelated CBP
protein was not observed (Fig. 3B). The dGcn5-depleted P
compartments often had a reduced size and appeared flatter
than anterior compartments, suggesting that cell proliferation
is slowed down in these compartments (most visible in Fig.
3B). Although dGcn5 RNAi in the P compartments of imaginal disks induced strong lethality during late pupal development, few animals survived until the adult stage. The posterior
part of their wings was reduced in size and displayed abnormal
veins and cross veins. In the most dramatic cases, a bubble
indicative of abnormal adhesion between the dorsal and ventral wing epithelial sheets was observed (Fig. 2B). The cell
density was not significantly changed in the silenced compartment (data not shown), indicating that the size reduction is due
to a reduction in the cell number. A vg-GAL4 driver triggered
8232
CARRÉ ET AL.
FIG. 2. dGcn5 is required for cell proliferation in imaginal tissues.
(A) Reduced and misshapen imaginal wing disks from homozygous
Gcn5E333st mutants compared to a wing disk from a Gcn5E333st/TM3
control third-instar larva. (B) Wings from control animals (⫹/⫹) and
en-GAL4/UAS-IR[Gcn5] adult escapers with vein and cross-vein defects (black arrows) in the smaller posterior compartment. (C) Wings
from vg-GAL4/UAS-IR[Gcn5] adult escapers. (D) Complete absence
of abdominal adult cuticle in esg-GAL4/UAS-IR[Gcn5] pharate adults
compared to a control animal (⫹/⫹).
dGcn5 RNAi in the wing margin and induced a strong reduction of this structure in silenced adults (Fig. 2C), while the
induction of dGcn5 RNAi using a dll-GAL4 driver led to a
reduction in the size of the distal part of the tarsus and wings
(not shown). Finally, the induction of dGcn5 RNAi by an
esg-GAL4 driver, which is strongly expressed in imaginal histoblasts, resulted in lethality of pharate adults, with a partial to
complete absence of the abdominal cuticle (Fig. 2D). Collectively, these data strongly suggested that dGcn5 RNAi limits
cell proliferation.
Surprisingly, however, a greater proportion of cells in S
phase (Fig. 3C) as well as a significantly larger number of cells
undergoing mitosis (Fig. 3D) was observed in the P compartments of wing disks silenced by UAS-IR[Gcn5] upon activation
by en-GAL4. Notably, we also detected a high level of apoptosis in imaginal disks from third-instar dGcn5 mutant larvae
(Fig. 3E) as well as in response to dGcn5 RNAi triggered by
either en-GAL4 (Fig. 3G) or ptc-GAL4 (Fig. 3H). Together,
MOL. CELL. BIOL.
these data suggest that the net effect of the dGcn5 loss of
function on the compartment size results from a deregulation
of the cell cycle coupled to cell death.
Histone H3 acetylation of polytene chromosomes depends
on dGcn5. To investigate the contribution of dGcn5 to histone
acetylation, we immunostained polytene chromosomes from
larval salivary glands using antibodies specific for the acetylation of various lysine residues of histones H3 and H4. In order
to compare their acetylation levels, polytene chromosomes
from wild-type and mutant larvae were squashed and stained
together on the same slide. The expression of a histone 2B
yellow fluorescent fusion protein (H2b-YFP) in wild-type larvae allowed us to distinguish their chromosomes from dGcn5
mutant chromosomes (Fig. 4B and data not shown). We detected the acetylation of the H3 K14 and K9 residues in numerous loci of wild-type polytene chromosomes (Fig. 4A and
C). In striking contrast, the acetylation of H3 K14 was undetectable and the acetylation of H3 K9 was barely detectable in
dGcn5 mutant chromosomes. Antibodies against the acetylated H4 K8 (Fig. 4D) and H4 K16 residues (data not shown)
revealed unchanged acetylation of these residues in dGcn5
mutants compared to that in wild-type animals. We then examined whether the loss of H3 K9 and K14 acetylation in
dGcn5 mutants affects other modifications of histone H3 residues. Like H3 K9 and H3 K14 acetylation, the phosphorylation of H3 S10 and di- and trimethylation of H3 K4 have been
associated with the transcriptional activation of target loci. We
found that global levels of these modifications are not affected
in dGcn5 mutant polytene chromosomes (Fig. 4E and F). On
the other hand, methylation of the H3 K9 residue acts as a
marker for the recruitment of the heterochromatin protein
HP1 and transcriptional silencing. The loss of H3 K9 acetylation in dGcn5 mutants could have favored ectopic H3 K9
methylation and the subsequent delocalization of HP1. However, we found that both H3 K9 methylation levels and HP1
localization in the pericentromeric regions of polytene chromosomes were unchanged in dGcn5 mutants (Fig. 4G and H).
We also analyzed the contribution of dGcn5 to histone acetylation in imaginal tissues by immunostaining of imaginal disks
in which dGcn5 was silenced in the P compartment by UASIR[gcn5] under the control of en-GAL4. The acetylation of H3
K9 and H3 K14 residues was strongly reduced in the nuclei of
the dGcn5-depleted imaginal cells (Fig. 5A and B), while the
acetylation of H4 K8 and H4 K16 residues was not affected
(Fig. 5C and D). As seen with polytene chromosomes of dGcn5
mutants, dGcn5 depletion did not affect the level of H3 K4 or
H3 K9 methylation in the nuclei of imaginal disks (Fig. 5E and
F). When expression of the UAS-IR[Gcn5] transgene was
driven by the ubiquitous da-GAL4 driver, animals arrested
their development at the onset of metamorphosis. Western
blot analysis of such late-third-instar larvae showed a strong
depletion of histone H3 acetylated at the K9 and K14 residues,
while the level of histone H4-AcK8 remained unchanged (Fig.
5G). Hence, the effect of the dGcn5 loss of function on polytene chromosomes, together with the results of our dGcn5
RNAi studies with imaginal disks and larval tissues, points to
dGcn5 as the major histone H3 K9 and H3 K14 acetyltransferase in Drosophila.
Functional analysis of dGcn5 domains. To analyze the functional requirement of the evolutionarily conserved domains of
VOL. 25, 2005
dGcn5 IS REQUIRED FOR DROSOPHILA METAMORPHOSIS
8233
FIG. 3. dGcn5 loss of function induces cell cycle defects and apoptosis. The results of a confocal analysis of GFP (green) and dGcn5 or CBP
(red) expression in wing disks from en-GAL4 UAS-GFP/UAS-IR[Gcn5] (A and B) or en-GAL4/UAS-GFP (A⬘) late-third-instar larvae are shown.
BrdU incorporation experiments (C) and anti-phospho(S10)-histone H3 immunostaining (D) revealed a greater proportion of cells in S phase and
at mitosis, respectively, in the dGcn5 silenced compartment from en-GAL4 UAS-IR[Gcn5] wing disks. The results of a TUNEL analysis of
Gcn5E333st/Gcn5E333st (E), Gcn5E333st/TM6 Tb (F), en-GAL4/UAS-IR[Gcn5] (G), and ptc-GAL4/UAS-IR[Gcn5] (H) wing disks are also shown.
UAS-IR[GFP] transgenes did not induce apoptosis in control experiments (not shown).
the dGcn5 protein, we established lines transgenic for dGcn5
variant genes under the control of the UAS promoter (Fig.
1D). The variant genes were designed in order to express
dGcn5 with a deletion of the Pcaf homology domain (⌬Pcaf),
the catalytic domain for acetylation (⌬HAT), the conserved
domain shown in yeast to be involved in interaction with the
Ada2 protein (⌬Ada), or the bromodomain (⌬Bromo). We
verified by Western blot analysis that the variant transgenes are
expressed in the presence of da-GAL4 at levels comparable to
that of the UAS-Gcn5 wild-type transgene (Fig. 6K) and then
tested their ability to rescue the dGcn5 function. In contrast to
the UAS-Gcn5 wild-type construct, the UAS-Gcn5⌬HAT construct did not rescue the lethal phenotype of the Gcn5E333st/
sex204 heteroallelic combination. As expected from the disruption of the catalytic acetyltransferase domain, the acetylation
of polytene chromosomes at the H3 K9 and K14 residues was
not restored by the Gcn5⌬HAT variant in the mutant animals
compared to the rescue of acetylation by the wild-type dGcn5
protein (Fig. 6A and C). However, it should be noted that the
Gcn5⌬HAT variant still localized to the interbands of the
polytene chromosomes in a manner similar to that of the wildtype dGcn5 protein expressed under the control of the daGAL4 driver (Fig. 6B and D).
It was recently shown that the dAda2b component of the
Drosophila SAGA-like complex directly interacts with dGcn5
and is required for the acetylation of histone H3. This result
suggested that the interaction with dAda2b is essential either
for the HAT activity of dGcn5 or for its targeting to chromatin
(49). To our surprise, the Gcn5⌬Ada protein appeared normally distributed on polytene chromosomes and restored histone H3 acetylation in dGcn5 mutants (Fig. 6E and F). However, dGcn5 mutants were not rescued by Gcn5⌬Ada and still
arrested at puparium formation (not shown).
The Gcn5⌬Pcaf variant protein also appeared to be normally distributed at the interbands of polytene chromosomes
and to restore the acetylation of histone H3 (Fig. 6G and H).
8234
MOL. CELL. BIOL.
CARRÉ ET AL.
dGcn5 protein (not shown). The only observed defect was
female sterility, a result expected from the absence of activity
of the UAS promoter in the female germ line. We were not
able to examine the chromosomal localization of the
Gcn5⌬Bromo protein because our dGcn5 antibody was prepared against the dGcn5 bromodomain (Fig. 6J). Nevertheless,
the full phenotypic rescue by this variant strongly suggests that
its localization to chromosomes was restored.
DISCUSSION
FIG. 4. dGcn5 is required for acetylation of histone H3 K9 and H3
K14 residues in polytene chromosomes. Polytene chromosomes from a
Gcn5E333st/sex204 mutant and a lio-GAL4/UAS-H2b-YFP wild-type
animal were squashed together and costained with DAPI (blue), antiGFP (green), and an antibody (red) against acetylated H3 K14 (A),
acetylated H3 K9 (C), acetylated H4 K8 (D), phosphorylated H3 S10
(E), dimethylated H3 K4 (F), dimethylated H3 K9 (G), or HP1 (H).
Panels A and B show the same field through the red channel (acetylated H3 K14) and the green channel (H2b-YFP), respectively. The
H2b-YFP signal in the green channel is not shown for immunostaining
of the other histone modifications.
In addition, about half of the dGcn5 mutant animals expressing
Gcn5⌬Pcaf formed their puparium and completed metamorphosis but died before eclosion as pharate adults, while the
other half gave rise to adult flies (Fig. 7). However, rescued
adults displayed held-out, misshapen wings, legs with a severe
femur kink, and rough eyes. They died a few hours after eclosion, indicating that the UAS-Gcn5⌬PCAF construct only partially rescues dGcn5 mutants.
Strikingly, the Gcn5⌬Bromo variant protein not only restored histone H3 acetylation (Fig. 6I) but also restored complete viability of the dGcn5 mutants. Adult flies were indistinguishable from dGcn5 mutant flies rescued by the full-length
GNAT complexes are essential actors of transcriptional
gene regulation in eukaryotes. Their structure and composition
have been conserved throughout evolution from yeast to humans, and they are thought to exert their function through the
catalytic activity of an HAT component belonging to the
GNAT family. Vertebrate Gcn5 and Pcaf proteins have been
involved in many biological processes, including the response
to steroid/retinoid hormones, cell proliferation, and cell differentiation. However, how the function of these HATs is integrated in higher organisms to control development has still to
be defined.
In an extensive EMS-based genetic screen, we isolated and
characterized mutations of dGcn5, the unique Drosophila
member of the GNAT family. dGcn5 mutants have no discernible phenotype before the onset of metamorphosis. The considerable dGcn5 maternal stock (37; our unpublished data)
may be sufficient to fulfill dGcn5 functions in mutant embryos.
However, the dGcn5 protein is undetectable in dGcn5 mutant
mid-third-instar larvae, and the proliferation of imaginal disks
is already strongly impaired in such mutants at this stage. In
addition, mutant larvae keep wandering when control animals
have already formed a puparium, dramatically extending the
duration of their third larval instar by 4 to 5 days before they
die. Ada2b mutants die during pupal development (49), while
Ada2a mutants fail to form a puparium in a manner very
similar to that of dGcn5 mutant larvae (47a). Together with
these observations, our results strongly suggest that the function of the GNAT complexes is not required for Drosophila
larval life.
The absence of normal induction of the three early puffs at
2B, 74EF, and 75B in dGcn5 mutants is indicative of a major
failure in the regulatory hierarchy controlled by the steroid
hormone ecdysone at the end of the third larval instar. The
extended duration of this stage in dGcn5 null mutants is also
characteristic of defects in pathways controlled by ecdysone.
For instance, it is observed with EcR-B1-specific alleles of the
ecdysone receptor gene (6, 53) and with mutant alleles of the
broad gene (5). The Pcaf homology domain has been involved
in interactions of human Pcaf with various nuclear receptors
(9, 41, 54). Two dGcn5 hypomorphic alleles isolated in this
work change amino acids in the Pcaf homology domain, resulting in a partial loss of function of the protein. In heteroallelic
combination with the null Gcn5E333st allele, they led to impaired metamorphosis, with strong defects in adult appendage
formation. dGcn5 adult mutant escapers rescued by the
Gcn5⌬Pcaf variant consistently display very similar defects of
leg elongation and blistered wings. These defects are also
highly suggestive of an impaired ecdysone regulatory cascade
during metamorphosis (17, 18, 19). From these observations,
VOL. 25, 2005
dGcn5 IS REQUIRED FOR DROSOPHILA METAMORPHOSIS
8235
FIG. 5. dGcn5 RNA interference depletes imaginal disks of acetylated H3 K9 and H3 K14 residues. The results of a confocal analysis of GFP
(green) and acetylated H3 K9 (A), acetylated H3 K14 (B), acetylated H4 K8 (C), acetylated H4 K16 (D) dimethylated H3 K4 (E), or dimethylated
H3 K9 (F) in wing disks from en-GAL4 UAS-GFP/UAS-IR[Gcn5] late-third-instar larvae are shown. (G) Western blot of da-GAL4/UASIR[Gcn5] (IR[Gcn5]) and ⫹/UAS-IR[Gcn5] (WT) late-third-instar larvae probed with antibodies against dGcn5, H3-AcK9, H3-AcK14, and
H4-AcK8, as indicated.
we propose that dGcn5 acts as a nuclear receptor coactivator at
metamorphosis. The finding that the EcR protein is coimmunoprecipitated from embryonic nuclear extracts with dGcn5 in
an ecdysone-dependent manner (A. Mazo, personal communication) points to the ecdysone receptor itself as a dGcn5
target. However, we did not detect interactions between our
dGcn5 alleles and EcR mutant alleles in a trans-heterozygous
genetic test. Although these results do not rule out a functional
interaction between dGcn5 and the ecdysone receptor, they
may also indicate that dGcn5 acts in the metamorphic ecdysone regulatory hierarchy through interactions with other Drosophila nuclear receptors.
We have shown that the lack of dGcn5 in the female germ
line arrests oogenesis at an early stage. In addition, somatic
dGcn5 mutant clones in ovarian follicles induce the formation
of compound egg chambers indicative of an oocyte packaging
defect (J. R. Huynh, personal communication). Together,
these results indicate a strict requirement for dGcn5 during
oogenesis, in both the germ line and the somatic line. In light
of the role of dGcn5 during ecdysone-triggered metamorphosis, it is noteworthy that ecdysone regulatory hierarchies have
also been shown to regulate Drosophila oogenesis (33).
dGcn5 mutant imaginal disks, as well as imaginal tissues
silenced by dGcn5 RNAi, display slower cell proliferation. The
role of CBP in the cell cycle has been documented for vertebrates (39), and a domain of interaction of CBP with the Gcn5
homologue Pcaf is targeted by viral and cellular factors to
regulate cell cycle progression (51). The acetylation of E2F1 by
Pcaf also results in cell cycle modulation (43). In yeast, Gcn5
regulates genes required for mitotic exit (34). Together, these
data suggest that functions of Gcn5 in cell cycle regulation
have been conserved throughout evolution. Interestingly, a
mouse knock-in mutant for Trrap, a conserved component of
GNAT complexes, results in aberrant mitosis (29, 40). Similarly, the higher mitotic index, together with the increased
BrdU incorporation, of dGcn5-silenced imaginal cells suggests
that they undergo an aberrant cell cycle. We have shown that
apoptosis induced in imaginal tissues by the loss of dGcn5
function may contribute to the net reduction in cell number.
The Drosophila SAGA-like complex interacts in vitro with
Dmp53 (37), and several authors reported a role of dAda2b in
DNA damage-induced Dmp53-dependent apoptosis (49, 47a).
However, this is the first time that apoptosis in a mutant with
a deletion of a component of the Drosophila SAGA-like complex has been observed in the absence of X-ray-induced DNA
damage. Strikingly, Gcn5 mouse mutants also display apoptosis
in the absence of any exogenous inducers (66). Although further analysis is required to understand the complex roles of
dGcn5 in cell proliferation, we propose that apoptosis in the
dGcn5 mutant might be a consequence of cell cycle defects.
Our data demonstrate that dGcn5 is the major acetylase for
two distinct histone residues, H3 K9 and H3 K14, in Drosophila. In contrast, its contribution to histone H4 acetylation could
not be detected in our global analysis. The loss of Ada2b
results in a partial loss of H3 K9 and H3 K14 acetylation on
polytene chromosomes, while the loss of Ada2a has no detectable effect on chromosome acetylation (49, 47a). In light of our
results, these data suggest that the Drosophila GNAT complexes may retain partial dGcn5 HAT activity in the absence of
the Ada2 components. Alternatively, dGcn5 could exert its
HAT activity in other complexes which remain to be characterized. The substrate specificities of Drosophila and yeast
Gcn5 proteins appear to be identical (26). However, it is interesting that in contrast to what we found for Drosophila, both
the Gcn5 and Elp3 HATs must be invalidated in yeast to
significantly impair histone H3 K9 and K14 acetylation (62).
Recent studies have extensively documented the relationship
between histone H3 acetylation and gene transcription (7, 36,
52), but whether or not patterns of histone modification constitute a true code for the control of gene activity in eukaryotes
is still a matter of debate. In either case, our results strongly
suggest that specific histone acetylation profiles may be estab-
8236
CARRÉ ET AL.
MOL. CELL. BIOL.
FIG. 7. Gcn5⌬Pcaf variant restores the viability of dGcn5 mutants.
(A) Gcn5E333st/sex204 da-GAL4 adult fly heterozygous for the UASGcn5 transgene. Rescued animals are indistinguishable from wild-type
animals as well as from fully rescued UAS-Gcn5⌬Bromo/⫹ Gcn5E333st/
sex204 da-GAL4 animals (not shown). (B) Gcn5E333st/sex204 da-GAL4
adult fly heterozygous for the UAS-Gcn5⌬Pcaf transgene. Rescued
adults displayed held-out, notched wings (white arrow), rough eyes,
and crooked legs (black arrow).
FIG. 6. Complementation of histone acetylation and dGcn5 chromosome binding in dGcn5 mutants. Polytene chromosomes from
Gcn5E333st/sex204 da-GAL4 third-instar mutant larvae heterozygous
for the indicated transgenes were stained with an antibody directed
against acetylated H3 K9 and H3 K14 residues (A, C, E, G, and I) or
an antibody against the bromodomain of the dGcn5 protein (B, D, F,
H, and J). A Western blot of da-GAL4 late-third-instar larvae heterozygous for the indicated dGcn5 variant transgenes (K) was probed
with an antibody raised against the dGcn5 bromodomain. The asterisk
indicates a degradation product of the Gcn5⌬HAT protein.
lished in vivo through the activity of a very limited set of
substrate-specific enzymes. The observation that dGcn5 mutant larvae survive for several days without detectable acetylation of H3 K9 and H3 K14 residues is striking and suggests that
transcriptional regulation in larval versus embryonic or adult
insect tissues involves distinct mechanisms.
Numerous data indicate that histone modifications can influence each other (24). The loss of H3 K9 and H3 K14 acetylation in imaginal disks or salivary glands had no detectable
effect either on the levels of H3 S10 phosphorylation and H3
K4 methylation, both of which have been associated with transcriptional activation, or on the level of H3 K9 methylation,
which marks HP1 recruitment and silencing. These results
suggest that histone H3 acetylation is either a terminal or
independent process in the cascade of histone H3 modifications.
Using transgenic dGcn5 variants, we investigated the functions of the conserved regions in the dGcn5 protein. The deletion of the HAT domain completely abolished the ability of
dGcn5 to acetylate histones and to rescue dGcn5 mutant larvae. This result provides the first demonstration that Gcn5 in
metazoans exerts its regulatory function during development
through its histone acetylase activity. As discussed above, defects displayed by dGcn5 mutant adults rescued by the
Gcn5⌬Pcaf variant suggest a role of dGcn5 in the ecdysone
regulatory hierarchy during metamorphosis, possibly through
interactions with nuclear receptors. However, it is noteworthy
that Gcn5⌬Pcaf retains important functions. The variant protein was distributed along polytene chromosomes similarly to
the dGcn5 wild-type protein and provided apparently normal
H3 K9 and K14 acetylation. This suggests that the core functions of chromatin binding and substrate acetylation may be
performed by the ancestral portion of Gcn5, which has been
conserved throughout evolution from yeast to humans, and
that the Pcaf homology domain has evolved to perform more
specific functions in metazoans. The Ada2 interaction domain
has been mapped in Gcn5 to an evolutionarily conserved region between the HAT domain and the bromodomain (15, 16,
42). A direct interaction in vitro between dGcn5 and Ada2b
VOL. 25, 2005
dGcn5 IS REQUIRED FOR DROSOPHILA METAMORPHOSIS
was recently shown for Drosophila (49). The finding that the
Gcn5⌬Ada variant was completely unable to rescue the lethality of the dGcn5 mutants at the time of puparium formation
provides strong evidence that the interaction of dGcn5 with
Ada2 proteins is crucial for the function of the Drosophila
GNAT complexes. Strikingly, however, in dGcn5 mutants
Gcn5⌬Ada could bind to polytene chromosomes and restore
H3 K9 and H3 K14 acetylation patterns that were indistinguishable from those provided by the wild-type dGcn5 protein.
This result is at odds with the finding that histone H3 acetylation is strongly reduced in Ada2b null mutant polytene chromosomes (49). It is possible that the loss of interaction between Ada2b and dGcn5 is deleterious for a specific function
of the multiprotein SAGA-like complex but is not sufficient to
disrupt the architecture of this complex as well as its ability to
acetylate histones.
The bromodomain is conserved in a large number of transcription factors and has been shown to bind to acetylated
lysines on histone tails. The yeast Gcn5 bromodomain has been
shown to be involved in the stabilization of the SWI/SNF
remodeling complex through interactions with acetylated nucleosomes at the PHO5 promoter (59). The bromodomaincontaining complexes SWI/SNF and TFIID have been shown
to be targeted to acetylated histone H3 and H4 tails on the beta
interferon promoter in vitro (1, 2). Collectively, these findings
suggest that the bromodomain is essential for targeting a large
set of transcription factors to acetylated nucleosomes. In this
context, the apparently normal chromosome acetylation by the
Gcn5⌬Bromo variant, and most significantly, the complete rescue of dGcn5 mutant viability by this protein, raises a number
of questions. We cannot exclude the possibility that the overexpression of the Gcn5⌬Bromo variant may overcome the lack
of an essential dGcn5 function or that Gcn5⌬Bromo may be
unable to supply an essential function under particular stress
conditions. However, our observations clearly indicate that the
dGcn5 bromodomain is not as strictly required as the other
domains of the protein, since variants with truncations of these
domains were expressed under the same conditions. Interestingly, others have reported a minor contribution of the bromodomain to the functions of various transcription factors.
Notably, in yeast the deletion of the bromodomain of dGcn5
has little consequence on its transcriptional activity (16, 57),
while deletion of the bromodomain of Swi2/Snf2 (38) or Spt7
(25) has no phenotypic effect. Similarly, the Brahma protein
with a deletion of its bromodomain binds normally to chromosomes in Drosophila and fully rescues brahma null mutants
(22). The apparent lack of requirement for the bromodomain
in dGcn5 may be due to a functional redundancy of various
components of dGcn5 complexes in targeting chromatin. This
role has been proposed for the Spt7 factor and the large Tra1
protein, which are both components of the SAGA complex (12,
28). The recent demonstration that a chromodomain of the
yeast SAGA component Chd1 interacts with methylated lysine
4 of histone H3 (48) also raises the interesting possibility that
different factors in GNAT complexes interact with different
histone modifications.
In summary, the deletion of the HAT domain in dGcn5
abolished both its HAT activity and its ability to rescue dGcn5
mutants. dGcn5 variants deleted in either the Pcaf homology
domain or the Ada2 interaction domain acetylated chromo-
8237
somes. However, Gcn5⌬Pcaf was able to partially rescue the
dGcn5 mutants, while Gcn5⌬Ada was not. Finally, the deletion
of the dGcn5 bromodomain had no noticeable consequences.
This remarkable variety of effects revealed in our complementation experiments strongly suggests that dGcn5 integrates
multiple functions during development.
ACKNOWLEDGMENTS
We are grateful to P. Maroy for the gift of the 1479/10 line, to N.
Dos-Santos, E. Scola, A. Ikmi, D. Cohen, and J.-R. Huynh for their
technical help, and to the Institut Pasteur Dynamic Imaging Platform
for assistance and advice. We thank I. Boros, L. Tora, and A. Mazo for
sharing data before publication, T. Grange and J. A. Lepesant for
helpful discussions during the course of this work, and M. Buckingham, D. Fagegaltier, H. Thomassin, and L. Théodore for critical readings of the manuscript.
This work was supported by the Pasteur Institute and the C.N.R.S.
(URA 2578) and by grants from the A.R.C. (7742/4383/3202). D.S. and
C.C. were supported by the University of Paris VI and the Ministère de
la Recherche.
REFERENCES
1. Agalioti, T., G. Chen, and D. Thanos. 2002. Deciphering the transcriptional
histone acetylation code for a human gene. Cell 111:381–392.
2. Agalioti, T., S. Lomvardas, B. Parekh, J. Yie, T. Maniatis, and D. Thanos.
2000. Ordered recruitment of chromatin modifying and general transcription
factors to the IFN-beta promoter. Cell 103:667–678.
3. Ashburner, M., C. Chihara, P. Meltzer, and G. Richards. 1974. Temporal
control of puffing activity in polytene chromosomes. Cold Spring Harbor
Symp. Quant. Biol. 38:655–662.
4. Bellaiche, Y., M. Gho, J. A. Kaltschmidt, A. H. Brand, and F. Schweisguth.
2001. Frizzled regulates localization of cell-fate determinants and mitotic
spindle rotation during asymmetric cell division. Nat. Cell Biol. 3:50–57.
5. Belyaeva, E. S., M. G. Aizenzon, V. F. Semeshin, I. I. Kiss, K. Koczka, E. M.
Baritcheva, T. D. Gorelova, and I. F. Zhimulev. 1980. Cytogenetic analysis of
the 2B3-4–2B11 region of the X-chromosome of Drosophila melanogaster. I.
Cytology of the region and mutant complementation groups. Chromosoma
81:281–306.
6. Bender, M., F. B. Imam, W. S. Talbot, B. Ganetzky, and D. S. Hogness. 1997.
Drosophila ecdysone receptor mutations reveal functional differences among
receptor isoforms. Cell 91:777–788.
7. Bernstein, B. E., M. Kamal, K. Lindblad-Toh, S. Bekiranov, D. K. Bailey,
D. J. Huebert, S. McMahon, E. K. Karlsson, E. J. Kulbokas III, T. R.
Gingeras, S. L. Schreiber, and E. S. Lander. 2005. Genomic maps and
comparative analysis of histone modifications in human and mouse. Cell
120:169–181.
8. Bertrand, C., C. Bergounioux, S. Domenichini, M. Delarue, and D. X. Zhou.
2003. Arabidopsis histone acetyltransferase AtGCN5 regulates the floral
meristem activity through the WUSCHEL/AGAMOUS pathway. J. Biol.
Chem. 278:28246–28251.
9. Blanco, J. C., S. Minucci, J. Lu, X. J. Yang, K. K. Walker, H. Chen, R. M.
Evans, Y. Nakatani, and K. Ozato. 1998. The histone acetylase PCAF is a
nuclear receptor coactivator. Genes Dev. 12:1638–1651.
10. Brand, A. H., and N. Perrimon. 1993. Targeted gene expression as a means
of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development
118:401–415.
11. Brodu, V., B. Mugat, J. Y. Roignant, J. A. Lepesant, and C. Antoniewski.
1999. Dual requirement for the EcR/USP nuclear receptor and the dGATAb
factor in an ecdysone response in Drosophila melanogaster. Mol. Cell. Biol.
19:5732–5742.
12. Brown, C. E., L. Howe, K. Sousa, S. C. Alley, M. J. Carrozza, S. Tan, and
J. L. Workman. 2001. Recruitment of HAT complexes by direct activator
interactions with the ATM-related Tra1 subunit. Science 292:2333–2337.
13. Brown, C. E., T. Lechner, L. Howe, and J. L. Workman. 2000. The many
HATs of transcription coactivators. Trends Biochem. Sci. 25:15–19.
14. Brownell, J. E., J. Zhou, T. Ranalli, R. Kobayashi, D. G. Edmondson, S. Y.
Roth, and C. D. Allis. 1996. Tetrahymena histone acetyltransferase A: a
homolog to yeast Gcn5p linking histone acetylation to gene activation. Cell
84:843–851.
15. Candau, R., and S. L. Berger. 1996. Structural and functional analysis of
yeast putative adaptors. Evidence for an adaptor complex in vivo. J. Biol.
Chem. 271:5237–5245.
16. Candau, R., J. X. Zhou, C. D. Allis, and S. L. Berger. 1997. Histone acetyltransferase activity and interaction with ADA2 are critical for GCN5 function in vivo. EMBO J. 16:555–565.
17. D’Avino, P. P., and C. S. Thummel. 1998. Crooked legs encodes a family of
zinc finger proteins required for leg morphogenesis and ecdysone-regulated
8238
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
CARRÉ ET AL.
gene expression during Drosophila metamorphosis. Development 125:1733–
1745.
D’Avino, P. P., and C. S. Thummel. 2000. The ecdysone regulatory pathway
controls wing morphogenesis and integrin expression during Drosophila
metamorphosis. Dev. Biol. 220:211–224.
Davis, M. B., G. E. Carney, A. E. Robertson, and M. Bender. 2005. Phenotypic analysis of EcR-A mutants suggests that EcR isoforms have unique
functions during Drosophila development. Dev. Biol. 282:385–396.
Dequier, E., S. Souid, M. Pal, P. Maroy, J. A. Lepesant, and C. Yanicostas.
2001. Top-DER- and Dpp-dependent requirements for the Drosophila fos/
kayak gene in follicular epithelium morphogenesis. Mech. Dev. 106:47–60.
Dhalluin, C., J. E. Carlson, L. Zeng, C. He, A. K. Aggarwal, and M. M. Zhou.
1999. Structure and ligand of a histone acetyltransferase bromodomain.
Nature 399:491–496.
Elfring, L. K., C. Daniel, O. Papoulas, R. Deuring, M. Sarte, S. Moseley, S. J.
Beek, W. R. Waldrip, G. Daubresse, A. DePace, J. A. Kennison, and J. W.
Tamkun. 1998. Genetic analysis of brahma: the Drosophila homolog of the
yeast chromatin remodeling factor SWI2/SNF2. Genetics 148:251–265.
Felsenfeld, G., and M. Groudine. 2003. Controlling the double helix. Nature
421:448–453.
Fischle, W., Y. Wang, and C. D. Allis. 2003. Histone and chromatin crosstalk. Curr. Opin. Cell Biol. 15:172–183.
Gansheroff, L. J., C. Dollard, P. Tan, and F. Winston. 1995. The Saccharomyces cerevisiae SPT7 gene encodes a very acidic protein important for
transcription in vivo. Genetics 139:523–536.
Grant, P. A., A. Eberharter, S. John, R. G. Cook, B. M. Turner, and J. L.
Workman. 1999. Expanded lysine acetylation specificity of Gcn5 in native
complexes. J. Biol. Chem. 274:5895–5900.
Grunstein, M. 1997. Histone acetylation in chromatin structure and transcription. Nature 389:349–352.
Hassan, A. H., P. Prochasson, K. E. Neely, S. C. Galasinski, M. Chandy,
M. J. Carrozza, and J. L. Workman. 2002. Function and selectivity of bromodomains in anchoring chromatin-modifying complexes to promoter nucleosomes. Cell 111:369–379.
Herceg, Z., W. Hulla, D. Gell, C. Cuenin, M. Lleonart, S. Jackson, and Z. Q.
Wang. 2001. Disruption of Trrap causes early embryonic lethality and defects
in cell cycle progression. Nat. Genet. 29:206–211.
Hudson, B. P., M. A. Martinez-Yamout, H. J. Dyson, and P. E. Wright. 2000.
Solution structure and acetyl-lysine binding activity of the GCN5 bromodomain. J. Mol. Biol. 304:355–370.
Jacobson, R. H., A. G. Ladurner, D. S. King, and R. Tjian. 2000. Structure
and function of a human TAFII250 double bromodomain module. Science
288:1422–1425.
Kanno, T., Y. Kanno, R. M. Siegel, M. K. Jang, M. J. Lenardo, and K. Ozato.
2004. Selective recognition of acetylated histones by bromodomain proteins
visualized in living cells. Mol. Cell 13:33–43.
Kozlova, T., and C. S. Thummel. 2000. Steroid regulation of postembryonic
development and reproduction in Drosophila. Trends Endocrinol. Metab.
11:276–280.
Krebs, J. E., C. J. Fry, M. L. Samuels, and C. L. Peterson. 2000. Global role
for chromatin remodeling enzymes in mitotic gene expression. Cell 102:587–
598.
Kuo, M. H., J. E. Brownell, R. E. Sobel, T. A. Ranalli, R. G. Cook, D. G.
Edmondson, S. Y. Roth, and C. D. Allis. 1996. Transcription-linked acetylation by Gcn5p of histones H3 and H4 at specific lysines. Nature 383:269–
272.
Kurdistani, S. K., S. Tavazoie, and M. Grunstein. 2004. Mapping global
histone acetylation patterns to gene expression. Cell 117:721–733.
Kusch, T., S. Guelman, S. M. Abmayr, and J. L. Workman. 2003. Two
Drosophila Ada2 homologues function in different multiprotein complexes.
Mol. Cell. Biol. 23:3305–3319.
Laurent, B. C., I. Treich, and M. Carlson. 1993. The yeast SNF2/SWI2
protein has DNA-stimulated ATPase activity required for transcriptional
activation. Genes Dev. 7:583–591.
Lehrmann, H., L. L. Pritchard, and A. Harel-Bellan. 2002. Histone acetyltransferases and deacetylases in the control of cell proliferation and differentiation. Adv. Cancer Res. 86:41–65.
Li, H., C. Cuenin, R. Murr, Z. Q. Wang, and Z. Herceg. 2004. HAT cofactor
Trrap regulates the mitotic checkpoint by modulation of Mad1 and Mad2
expression. EMBO J. 23:4824–4834.
Li, X., J. Wong, S. Y. Tsai, M. J. Tsai, and B. W. O’Malley. 2003. Progesterone and glucocorticoid receptors recruit distinct coactivator complexes
and promote distinct patterns of local chromatin modification. Mol. Cell.
Biol. 23:3763–3773.
Marcus, G. A., N. Silverman, S. L. Berger, J. Horiuchi, and L. Guarente.
1994. Functional similarity and physical association between GCN5 and
ADA2: putative transcriptional adaptors. EMBO J. 13:4807–4815.
Martinez-Balbas, M. A., U. M. Bauer, S. J. Nielsen, A. Brehm, and T.
Kouzarides. 2000. Regulation of E2F1 activity by acetylation. EMBO J.
19:662–671.
Mizzen, C. A., X. J. Yang, T. Kokubo, J. E. Brownell, A. J. Bannister, T.
Owen-Hughes, J. Workman, L. Wang, S. L. Berger, T. Kouzarides, Y. Na-
MOL. CELL. BIOL.
katani, and C. D. Allis. 1996. The TAF(II)250 subunit of TFIID has histone
acetyltransferase activity. Cell 87:1261–1270.
45. Muratoglu, S., S. Georgieva, G. Papai, E. Scheer, I. Enunlu, O. Komonyi, I.
Cserpan, L. Lebedeva, E. Nabirochkina, A. Udvardy, L. Tora, and I. Boros.
2003. Two different Drosophila ADA2 homologues are present in distinct
GCN5 histone acetyltransferase-containing complexes. Mol. Cell. Biol. 23:
306–321.
46. Ornaghi, P., P. Ballario, A. M. Lena, A. Gonzalez, and P. Filetici. 1999. The
bromodomain of Gcn5p interacts in vitro with specific residues in the N
terminus of histone H4. J. Mol. Biol. 287:1–7.
47. Owen, D. J., P. Ornaghi, J. C. Yang, N. Lowe, P. R. Evans, P. Ballario, D.
Neuhaus, P. Filetici, and A. A. Travers. 2000. The structural basis for the
recognition of acetylated histone H4 by the bromodomain of histone acetyltransferase Gcn5p. EMBO J. 19:6141–6149.
47a.Pankota, T., O. Komonyi, L. Bodai, Z. Újfaludi, S. Muratoglu, A. Ciurciu, L.
Tora, J. Szabad, and I. Boros. 2005. The homologous Drosophila transcriptional adaptors ADA2a and ADA2b are both required for normal development but have different functions. 25:●●●–●●●.
48. Pray-Grant, M. G., J. A. Daniel, D. Schieltz, J. R. Yates III, and P. A. Grant.
2005. Chd1 chromodomain links histone H3 methylation with SAGA- and
SLIK-dependent acetylation. Nature 433:434–438.
49. Qi, D., J. Larsson, and M. Mannervik. 2004. Drosophila Ada2b is required
for viability and normal histone H3 acetylation. Mol. Cell. Biol. 24:8080–
8089.
50. Roignant, J. Y., C. Carre, B. Mugat, D. Szymczak, J. A. Lepesant, and C.
Antoniewski. 2003. Absence of transitive and systemic pathways allows cellspecific and isoform-specific RNAi in Drosophila. RNA 9:299–308.
51. Schiltz, R. L., and Y. Nakatani. 2000. The PCAF acetylase complex as a
potential tumor suppressor. Biochim. Biophys. Acta 1470:M37–M53.
52. Schubeler, D., D. M. MacAlpine, D. Scalzo, C. Wirbelauer, C. Kooperberg,
F. van Leeuwen, D. E. Gottschling, L. P. O’Neill, B. M. Turner, J. Delrow,
S. P. Bell, and M. Groudine. 2004. The histone modification pattern of active
genes revealed through genome-wide chromatin analysis of a higher eukaryote. Genes Dev. 18:1263–1271.
53. Schubiger, M., A. A. Wade, G. E. Carney, J. W. Truman, and M. Bender.
1998. Drosophila EcR-B ecdysone receptor isoforms are required for larval
molting and for neuron remodeling during metamorphosis. Development
125:2053–2062.
54. Sharma, D., and J. D. Fondell. 2000. Temporal formation of distinct thyroid
hormone receptor coactivator complexes in HeLa cells. Mol. Endocrinol.
14:2001–2009.
55. Simon, A. F., I. Boquet, M. Synguelakis, and T. Preat. 1998. The Drosophila
putative kinase linotte (derailed) prevents central brain axons from converging on a newly described interhemispheric ring. Mech. Dev. 76:45–55.
56. Smith, E. R., J. M. Belote, R. L. Schiltz, X. J. Yang, P. A. Moore, S. L. Berger,
Y. Nakatani, and C. D. Allis. 1998. Cloning of Drosophila GCN5: conserved
features among metazoan GCN5 family members. Nucleic Acids Res. 26:
2948–2954.
57. Sterner, D. E., P. A. Grant, S. M. Roberts, L. J. Duggan, R. Belotserkovskaya, L. A. Pacella, F. Winston, J. L. Workman, and S. L. Berger. 1999.
Functional organization of the yeast SAGA complex: distinct components
involved in structural integrity, nucleosome acetylation, and TATA-binding
protein interaction. Mol. Cell. Biol. 19:86–98.
58. Strahl, B. D., and C. D. Allis. 2000. The language of covalent histone
modifications. Nature 403:41–45.
59. Syntichaki, P., I. Topalidou, and G. Thireos. 2000. The Gcn5 bromodomain
co-ordinates nucleosome remodelling. Nature 404:414–417.
60. Turner, B. M., A. J. Birley, and J. Lavender. 1992. Histone H4 isoforms
acetylated at specific lysine residues define individual chromosomes and
chromatin domains in Drosophila polytene nuclei. Cell 69:375–384.
61. Vlachonasios, K. E., M. F. Thomashow, and S. J. Triezenberg. 2003. Disruption mutations of ADA2b and GCN5 transcriptional adaptor genes dramatically affect Arabidopsis growth, development, and gene expression.
Plant Cell 15:626–638.
62. Wittschieben, B. O., J. Fellows, W. Du, D. J. Stillman, and J. Q. Svejstrup.
2000. Overlapping roles for the histone acetyltransferase activities of SAGA
and elongator in vivo. EMBO J. 19:3060–3068.
63. Wittschieben, B. O., G. Otero, T. de Bizemont, J. Fellows, H. ErdjumentBromage, R. Ohba, Y. Li, C. D. Allis, P. Tempst, and J. Q. Svejstrup. 1999.
A novel histone acetyltransferase is an integral subunit of elongating RNA
polymerase II holoenzyme. Mol. Cell 4:123–128.
64. Wodarz, A., U. Hinz, M. Engelbert, and E. Knust. 1995. Expression of
crumbs confers apical character on plasma membrane domains of ectodermal epithelia of Drosophila. Cell 82:67–76.
65. Wu, P. Y., C. Ruhlmann, F. Winston, and P. Schultz. 2004. Molecular
architecture of the S. cerevisiae SAGA complex. Mol. Cell 15:199–208.
66. Xu, W., D. G. Edmondson, Y. A. Evrard, M. Wakamiya, R. R. Behringer, and
S. Y. Roth. 2000. Loss of Gcn5l2 leads to increased apoptosis and mesodermal defects during mouse development. Nat. Genet. 26:229–232.
67. Zink, D., and R. Paro. 1995. Drosophila Polycomb-group regulated chromatin inhibits the accessibility of a trans-activator to its target DNA. EMBO J.
14:5660–5671.
5.6. Les futurs du projet dGcn5
5.6.1. Beau temps… après dissipation des brumes matinales : Gcn5 estil un coactivateur du récepteur EcR/USP de l’ecdysone ?
Nous avons montré que la perte de fonction zygotique de dGcn5 provoque un arrêt du
développement au moment de la formation du puparium, période qui caractérise le début de
la métamorphose induite par l’ecdysone. Cette interruption tardive du développement
pourrait cependant simplement refléter l’épuisement progressif de l’important stock
maternel de dGcn5 déposé dans l’embryon (Kusch et al., 2003; Smith et al., 1998) et D.
Szymczak, résultats non publiés), provoquant par exemple un défaut général de la
transcription sans qu’une ou plusieurs fonctions requises à la métamorphose ne soient
spécifiquement mises en défaut. Plusieurs arguments viennent contredire cette
interprétation. Tout d’abord, une analyse en « western blot » d’extraits de larves mutantes
dGcn5 ne permet plus de détecter la protéine dGcn5 pendant le troisième stade larvaire (D.
Szymczak, résultats non publiés). De plus, les formes acétylés des résidus K9 et K14 de
l’histone H3 sont absentes pendant cette période (Carre et al., 2005), confirmant que la
fonction enzymatique de dGcn5 est effectivement abolie. Pour autant, les larves mutantes
dGcn5 survivent pendant une longue période, étendant la durée de leur troisième stade
larvaire, qui passe de 2 jours à 6, voire 7 jours à 25°C. Parallèlement à cette manifestation
spectaculaire du défaut de fonction de dGcn5, on observe que les disques imaginaux ont subi
un retard de prolifération très important, donnant ainsi un indice supplémentaire de
l’épuisement du stock maternel de la protéine dGcn5 bien avant la létalité des mutants.
Ensemble, ces observations militent fortement en faveur d’un rôle spécifique de la
protéine dGcn5 dans l’engagement de la métamorphose, et au moins deux possibilités non
exclusives peuvent être envisagées. D’une part, la prolifération insuffisante dans les disques
imaginaux des mutants dGcn5 pourrait limiter le déroulement de la métamorphose, bloquant
le développement au moment de la formation du puparium. D’autre part, la perte de
fonction de dGcn5 pourrait abolir l’expression de gènes spécifiquement impliqués dans le
déclenchement de la métamorphose. On pense ici bien sûr à notre hypothèse de travail
initiale et au rôle possible de dGcn5 comme coactivateur du récepteur EcR/USP de
l’ecdysone.
Les données dont nous disposons aujourd’hui pour évaluer cette hypothèse sont très
contradictoires. Des expériences de co-immunoprécipitations réalisées par Alex Mazo à
42
partir d’extraits d’embryonnaires montrent une interaction entre dGcn5 et la protéine EcR,
dépendante de l’ecdysone (Fig. 4). De plus, des expériences d’immunoprécipitation de
chromatine de cellules Schneider en culture indiqueraient un recrutement, en présence
d’ecdysone, de dGcn5 au niveau des régions transcrites des gènes cibles du récepteur de
l’ecdysone Broad et hedgehog (A. Mazo, communication personnelle).
Figure 4.Coimmunoprecipitation des protéines EcR et dGcn5 à partir d’une extrait
embryonnaire, en présence d’un anticorps anti-EcR. L’immunoprécipitation n’intervient qu’en présence
d’ecdysone, quand elle ajoutée à l’extrait.
De notre côté, nous observons dans les mutants dGcn5 une apparition incomplète des
puffs précoces 2B5, 74EF et 75C, normalement induits par l’ecdysone (Carre et al., 2005),
même si l’interprétation de ce défaut est compliquée par le fait que la structure des
chromosomes polytènes des mutants Gcn5 est affectée de façon assez générale. Ensemble,
ces données militent en faveur d’une fonction de dGcn5 comme coactivateur de EcR/USP.
Cependant plusieurs autres observations contredisent vigoureusement cette interprétation.
Tout d’abord, l’inactivation par RNAi du gène EcR dans les glandes salivaires de larves ne
provoque pas de défaut visible du recrutement de la protéine Gcn5 au niveau des
chromosomes polytènes. De même, nous n’observons pas dans ces conditions de variation
du niveau d’acétylation des chromosomes polytènes, et en particulier pas de variations au
niveau des régions cibles du récepteur EcR/USP (Nicolas Dos Santos, résultats non publiés).
Nous avons par ailleurs analysé en détail l’expression d’un échantillon de gènes
représentatifs de la réponse à l’ecdysone dans différentes combinaisons alléliques dGcn5-.
L’expression des transcrits précoces E74A, E74B, sgs4 et Fbp1, bien que très différée, se
produit avec une séquence comparables aux animaux contrôles (Fig. 5). Enfin, nous ne
sommes jamais parvenus, malgré le test de plusieurs combinaisons alléliques et de plusieurs
conditions d’interférence par l’ARN, à observer une interaction génétique entre les allèles
mutants de dGcn5 et ceux du gène EcR (voir la discussion dans (Carre et al., 2005). Au total,
les données dont nous disposons aujourd’hui laissent finalement peu de place à une fonction
43
de dGcn5 comme coactivateur du récepteur EcR/USP à la fin du troisième stade larvaire. Il
est possible que les résultats obtenus par l’équipe d’Alex Mazo reflète une fonction de ce
type plus précocement au cours du développement embryonnaire. Il n’en reste pas moins
que la formation du puparium est bloquée dans les mutants dGcn5 et nous allons donc
maintenant tester si dGcn5 ne pourrait pas fonctionner comme coactivateur d’autres
récepteurs nucléaires à ce stade de développement, et en particulier des récepteurs DHR3
et βFTZ-F1, impliqués dans le déclenchement de la deuxième cascade de réponse à
l’ecdysone durant la période prépupale (voir Fig. 2).
Figure 5.Analyse de la réponse transcriptionnelle à l’ecdysone à la fin du troisième stade
larvaire dans des mutants homozygotes dGcn5. Les profils d’expression des gènes E74, Fbp1 et sgs4 ont été
analysés par northern blot, 18, 8, 4 et O heures avant la formation du puparium (évertion des spiracles). Noter que la
transition E74BE74A, caractéristique de la réponse larvaire à l’ecdysone se produit de façon similaire dans les mutants
dGcn5 et dans les larves contrôle.
5.6.2. Les gènes cibles de dGcn5 : une analyse globale par puces à ADN.
Afin de caractériser de façon globale les gènes cibles de dGcn5 à la fin du troisième stade
larvaire, nous avons entrepris une analyse du transcriptome dans les mutants dGcn5 par
hybridation d’ADNc sur puces Affymetrix®. Nous avons choisi de comparer des animaux
dGcn5E333st/sex204 avec des animaux hétérozygotes dGcn5E333st/+, au moment de l’éversion
44
des spiracles qui signale la fin du 3ème stade larvaire et la formation du puparium. Trois
échantillons indépendants d’ARN de mutants ont été comparés à trois échantillons d’ARN
d’animaux contrôles. Dans les animaux mutants, 200 gènes sont réprimés (< x0.2, avec un
seuil de signification p<0.1, test T) et 130 gènes sont surexprimés (> x5, avec un seuil de
signification p<0.1, test T). Ainsi, environ 3-4 % des gènes de drosophile exprimés à la
formation du puparium semblent affectés par la perte de fonction de dGcn5. Nous analysons
actuellement plus en profondeur les données issues de cette expérience, mais 4 éléments
marquants émergent d’ores et déjà.
En premier lieu, aucun des gènes cibles de l’ecdysone ne semble affecté dans les mutants
dGcn5 à la fin du troisième stade larvaire, à l’exception des gènes sgs3 et sgs5 qui semblent
modestement sous-exprimés Nous avons donc là une confirmation à large échelle des
conclusions discutées précédemment.
Par ailleurs, l’expression de 10 gènes codants des constituants de la cuticule larvaire se
trouve très fortement réduite dans les larves mutantes dGcn5. Le « cluster » 44D en
particulier, codant les protéines LCP-1 à –5 (Charles et al., 1998) est pratiquement
silencieux. L’enveloppe externe du puparium, la case pupale, est formée par l’apolyse et le
tannage de la cuticule larvaire. Notre observation suggère donc que l’absence de formation
d’un puparium résistant et tanné chez les larves mutantes dGcn5 (Carre et al., 2005) est lié à
un sévère défaut de composition de la cuticule des larves de troisième stade.
En troisième lieux, un échantillon significatif de gènes impliqués dans la réponse
immunitaire humorale se trouvent soit fortement réprimés, soit fortement induits. Cette
observation pourrait refléter une fonction spécifique de dGcn5 dans les cascades génétiques
de réponses aux infections microbiennes, et nous allons analyser cet aspect plus en détail.
Cependant, il nous faudra éliminer l’hypothèse d’un effet indirect d’une cuticule anormale
chez les mutants dGcn5, qui pourrait être responsable d’une susceptibilité accrue aux
microbes et déclencher d’importantes réponses immunitaires chez ces mutants.
Finalement le niveau d’expression basal du complexe génique hsp70B (localisation
cytologique 87A-C) et d’autres gènes hsp est réduit d’un facteur 10 dans les mutants dGcn5.
Cette observation nous intéresse particulièrement car les gènes de choc thermique
constituent des modèles d’induction transcriptionnelle déjà largement disséqués, qui peuvent
être analysés in vivo, en particulier au niveau des chromosomes polytènes des glandes
salivaires. Il est par exemple possible de visualiser directement l’apparition des puffs en
réponse à un choc thermique, et de suivre par immunocoloration le recrutement de facteur
de transcription au niveau de ces loci (voir par exemple (Smith et al., 2004). Nous allons
45
donc dans un premier temps préciser si l’induction par un choc thermique des gènes hsp70
est affectée par la perte de fonction de dGcn5, et tenter de visualiser le cas échéant le
recrutement de dGcn5 au niveau des puffs 87A et 87C sur le chromosomes polytènes.
Les conclusions présentées ici sont préliminaires. Nous devons analyser en détail la masse
de données générées par l’expérience sur puces Affymetrix, en gardant à l’esprit que
l’ensemble des gènes dérégulés dans les mutants dGcn5 à la fin du troisième stade larvaire est
finalement assez restreint et que l‘arrêt de développement observé à cette période pourrait
n’être imputable qu’à quelques-uns seulement de ces gènes.
Nous avons entamé une collaboration avec les équipes de Imre Boros (Szeged, Hongrie)
et de Laslo Tora (Strasbourg, France), afin de regrouper nos données avec des données
d’hybridation sur puces Affymetrix obtenues à partir de mutants dAda2a et dAda2b, analysés
au même stade de développement. Notre objectif est double. D’une part, nous souhaitons
augmenter la pertinence de l’analyse de nos gènes cibles en croisant nos résultats : les
protéines dAda2 interagissant fonctionnellement avec dGcn5 nous attendons en particulier
que des gènes affectés par la perte de fonction de dGcn5 soient également affectés par la
perte de fonction de l’une ou l’autre des protéines dAda2. Nous espérons d’autre part que
les mutations des gènes dAda2a et dAda2b vont affecter des sous-ensembles distincts de
gènes régulés par dGcn5, ce qui serait un premier argument fort pour un rôle fonctionnel
spécifique des complexes GNAT de drosophile de 0.8 et 2 MDa, contenant respectivement
les protéines dAda2a et dAda2b.
5.6.3. Interactions fonctionnelles entre dGcn5 et dCBP.
La caractérisation de dCBP a montré que cette protéine est impliquée chez la drosophile
dans l’acétylation du résidu H4-K8 (Ludlam et al., 2002), mais également celle des résidus
H3-K9 et H3-K14 (Smith et al., 2004). Cette donnée est apparemment contradictoire avec
nos résultats : si dCBP était capable d’acétyler les résidus H3-K9 et H3-K14 in vivo, nous
devrions voir subsister cette acétylation dans nos mutants dGcn5, ce qui n’est pas le cas.
Pour éclaircir cette contradiction, nous nous sommes procuré une souche de drosophile
transgénique exprimant un ARN double-brin dCBP, sous le contrôle du promoteur UAS
inductible par GAL4 (Kumar et al., 2004), et nous avons ciblé cet ARN double-brin dans les
glandes salivaires des larves par croisement avec le pilote lio-GAL4. Nous observons
effectivement dans ces conditions une perte de la fixation de dCBP aux chromosomes
polytènes, attestant de l’inactivation par RNAi de dCBP . Nous observons également une
perte de l’acétylation H4-K8… ainsi qu’une perte de l’acétylation des résidus H3-K9 et H346
K14 (Fig. 6) ! En revanche, une inactivation de dGcn5 par RNAi dans les mêmes conditions
ne supprime que l’acétylation de l’histone H3 (non montré). Ainsi, il semble y avoir une
relation d’épistasie entre dGcn5 et dCBP pour l’acétylation de l’histone H3, la fonction de
dCBP étant nécessaire à celle de dGcn5. L’analyse par western blot du stock de dGcn5 dans
les glandes salivaires soumises à une interférence par l’ARN ciblée sur dCBP fournit une
première explication à cette observation : en l’absence de dCBP, l’expression de dGcn5 est
considérablement réduite (Fig. 7A), suggérant que dCBP est soit nécessaire l’activité du
promoteur de dGcn5, soit nécessaire à la stabilité de la protéine dGcn5. Pour distinguer ces
deux possibilités, nous sommes en train d’analyser la transcription de l’ARNm de dGcn5 dans
les glandes salivaires de larve déplétées de la protéine dCBP. Cependant, une autre
expérience indique qu’un deuxième mécanisme pourrait également opérer, renforçant
encore la relation d’épistasie observée entre les fonctions de dGcn5 et dCBP. Par
croisement génétique, nous avons exprimé en même temps l’ARN double-brin ciblé contre
dCBP et le cDNA de dGcn5, les deux constructions étant placées sous le contrôle du pilote
lio-GAL4. Nous avons vérifié que dans ces conditions la protéine dGcn5 est bien exprimée,
même en l’absence de dCBP. Pourtant, elle ne semble pas se fixer au niveau des
chromosomes polytènes (Fig. 7B). Ainsi dCBP serait nécessaire non seulement à l’expression
de dGcn5 mais également à son ciblage au niveau de la chromatine.
Plusieurs possibilités peuvent être envisagées. Tout d’abord il convient de rappeler que
dGcn5 ne se fixe pas seul au niveau de la chromatine, mais au sein d’un – ou de plusieurs –
complexes de type SAGA. On peut donc imaginer que la perte de fonction de dCPB
empêche l’expression d’autres composants de ces complexes (les protéines dAda, spt, Tra1,
etc…), provoquant leur dissociation. Nous allons tester cette hypothèse en effectuant une
analyse de l’expression de ces composants par PCR quantitative en condition RNAi CBP.
Par ailleurs, une interaction directe a été décrite de longue date entre les protéines
humaines CBP ou p300 et l’homologue hPCAF de dGcn5 (Yang et al., 1996). Cette
interaction pourrait avoir été conservée chez la drosophile et être requise pour son ciblage
sur la chromatine. Nous allons tester si une telle interaction peut être révélée dans des
expériences de co-immunoprécipitations.
47
Figure 6. Une interférence par ARN contre dCBP induit une perte d’acétylation des résidus H4K8, et H3-K9 et H3-K14. La colonne de gauche montre des squashs de chromosomes polytènes de glandes
salivaires contrôles et la colonne de droite montre des squashs de chromosomes polytènes de glandes salivaires
soumises à un RNAi contre dCBP. Les anticorps utilisés, dirigés contre le résidus H4-AcK8 ou les résidus H3-AcK9 et
H3-AcK14 (Pan H3-Ac), colorent les chromosomes en rouge. Une coloration des chromosomes en DAPII est visualisée
en bleu.
Figure 7. A. Expression de dGcn5 sous différentes condition de RNAi et de surexpression. B.
perte de la localisation chromosomique de dGcn5 (rouge), , exprimée sous contrôle de GAL4 en
absence de dCBP
48
Enfin, on pourrait spéculer que l’acétylation de l’histone H4-K8 par dCBP constitue une
marque de recrutement des complexes GNAT contenant dGcn5. Bien que séduisante, cette
hypothèse n’est pas si facile à assumer : nous avons montré que l’expression d’une protéine
dGcn5 tronquée de son bromodomaine se fixe normalement aux chromosomes (C. Carré,
résultats non publiée), et restaure l’acétylation des histones H3 au niveau des chromosomes
polytènes ainsi que la viabilité des mutants dGcn5 (Carre et al., 2005). Ce bromodomaine
n’est donc apparemment pas requis pour le ciblage de dGcn5 sur la chromatine, et à fortiori
au niveau des résidus H4-K8. Reste quand même que le ciblage de dGcn5 dépourvu de son
bromodomaine pourrait être assuré par un autre composant des complexes dans lesquels il
est engagé. C’est par exemple ce qui a été suggéré chez la levure, où le facteur à
bromodomaine Spt7 est capable de compenser fonctionnellement la délétion du
bromodomaine de yGcn5 et d’assurer le ciblage du complexe SAGA sur les histones acétylé
(Hassan et al., 2002). À la condition qu’un tel facteur existe chez la drosophile avec une
fonction équivalente, la question du recrutement de dGcn5 par acétylation préalable par
dCBP reste donc ouverte…
Finalement, si une interaction, directe ou indirecte, entre dCBP et dGcn5 existe chez la
drosophile, elle doit pouvoir être observée fonctionnellement dans des approches
génétiques. Sur ce point essentiel, des résultats obtenus récemment sont encourageants. La
perte de fonction de dGcn5 dans l’œil par induction de clone mitotiques provoque une
malformation sévère des omatidies, qui se trouve encore aggravée dans un contexte
hétérozygote mutant pour le gène nejire qui code pour dCBP. Nous sommes actuellement en
train d’analyser d’autres croisements génétiques pour confirmer cette interaction
fonctionnelle dans d’autres tissus, et en particulier dans l’aile où la perte de fonction de
dCBP entraîne des défauts de formation des veines.
5.6.4. Le complexe de remodelage NURF.
L’une des fonction du complexe SAGA chez la levure est le recrutement au niveau de la
chromatine du complexe de remodelage contenant l’ATPase SWI2/SNF2. Chez la
drosophile, le premier complexe de remodelage à avoir été isolé contient le membre du
groupe Trithorax Brahma, qui est l’homologue de SWI2/SNF2 (Tamkun et al., 1992). Depuis,
3 autres complexes de remodelage de composition variable ont été caractérisés, ACF,
CHRAC et NURF, qui contiennent tous la même sous-unité à activité ATPase ISWI (Ito et
al., 1997; Tsukiyama et al., 1995; Varga-Weisz et al., 1997). Ces complexes sont capables de
déplacer les nucléosomes sur une matrice de chromatine reconstituée in vitro, suggérant une
49
fonction dans l’activation de la transcription. Ils contiennent tous au moins un facteur à
bromodomaine, le facteur Acf1 dans les cas des complexes ACF et CHRAC, et le facteur
Nurf301 dans le cas du complexe NURF. La reconnaissance de résidus d’histones acétylés
pourrait ainsi prendre part au ciblage de ces complexes sur la chromatine, comme c’est le
cas du complexes SWI2/SNF2 chez la levure.
L’HAT Gcn5 pourrait-elle être impliquée dans le ciblage à la chromatine d’un complexe
de remodelage ? Deux observations faites récemment au laboratoire ont dirigé notre
attention sur le complexe NURF. Tout d’abord, le chromosome X des mâles mutant dGcn5
présente une structure anormale fortement décondensée (phénotype de « X bloated »), qui
n’est pas observé chez les femelles. Par ailleurs, environ 50% des larves homozygotes pour la
mutation dGcn5E333st présentent d’importantes tumeurs mélanotiques qui deviennent
particulièrement visibles à la fin du troisième stade larvaire. Les deux défauts sont observés
dans des larves mutantes pour le gène Iswi (Deuring et al., 2000), ainsi que dans des larves
mutantes pour le gène nurf301, codant un composant spécifique du complexe NURF
(Badenhorst et al., 2002).
Une hypothèse de travail est que l’acétylation par dGcn5 pourrait être nécessaire pour le
recrutement ou la stabilisation du complexe NURF sur des gènes cibles, via une interaction
du bromodomaine de Nurf301 au niveau des résidus H3-AcK9 et H3-AcK14. Cette
interaction pourrait être nécessaire pour le contrôle des voies de signalisation TOLL et/ou
JAK/STAT, dont la dérégulation induit une prolifération anormale des hémocytes et
l’apparition de tumeurs mélanotiques (Hou et al., 1996; Qiu et al., 1998).
Figure 8. Les mutants dGcn5 présente un chromosome X décondensé chez les mâles, et des
tumeurs mélanotiques importantes. Pour comparaison, le phénotype des mutants nurf301 est présentée sur la
partie gauche.
50
Elle pourrait également être impliqué dans le contrôle de la structure des chromosomes
polytènes. Le défaut de structure chromosomique observé dans les mutants dGcn5 comme
dans les mutants nurf301 touche principalement le chromosome X des mâles.Ceci est
évocateur d’une connexion avec le complexe de compensation de dose qui permet de cibler
l’histone acétyltransférase MOF sur l’unique chromosome X des mâles drosophile, induisant
une hyperacétylation spécifique au niveau des résidus H4-K16 et un doublement global de
l’expression des gènes sur ce chromosome. Il n’est pas facile de proposer un modèle
d’action directe expliquant comment la perte de fonction de dGcn5 ou de nurf301 induirait
une décondensation spécifique du chromosome X, dans la mesure où ces gènes semblent
plutôt impliqués tous les deux dans un mécanisme d’ouverture de la chromatine. On peut
cependant proposer que dGcn5 et nurf301 agissent pour permettre le recrutement au
niveau du chromosome X du mâle d’un facteur nécessaire pour limiter l’ouverture
chromatinienne médiée par MOF. Il est à noter par ailleurs que des mutations affectant la
kinase Jil-1 (Wang et al., 2001) ou le facteur su(Var)3-7 (Delattre et al., 2004) provoquent
des défauts de structure de tous les chromosomes polytènes, qui sont nettement amplifiés
au niveau du chromosome X du mâle. Ainsi, la structure particulière de ce chromosome
soumis à la compensation de dose pourrait le rendre plus sensible à un défaut général des
fibres chromosomiques polyténisées (Deng et al., 2005). Dans ce sens, on peut aussi
imaginer que dGcn5 et nurf301 agissent de concert sur l’expression d’un facteur structurant
tous les chromosomes.
Quoiqu’il en soit notre plan est de tester les interactions fonctionnelles entre dGcn5 et
Nurf301 en analysant l’effet de combinaisons génétiques d’allèles mutants de ce gène sur les
deux phénotypes évoqués ci-dessus, l’apparition de tumeur mélanotiques et la
décondensation du chromosome X des mâles. Nous allons également tester si des mutations
de dGcn5 affectent l’expression des acteurs des voies de signalisation TOLL et JAK/STAT.
Enfin, nous allons tester si le ciblage du complexe NURF au niveau des chromosomes
polytènes est affectés par des mutations de dGcn5, et le cas échéant si l’effet observé est
spécifique du chromosome X des mâles.
51
6. Un monde de petits ARNs
6.1. Les vertus d’une machine à café.
J’ai appris l’existence du phénomène d’interférence par l’ARN à côté d’une machine à café
que nous partagions avec l’équipe de Marianne Félix à l’Institut Jacques Monod. Marianne
rentrait en 1998 d’un congrès consacré à son modèle expérimental, le nématode, et raconta
aux « drosophilistes » les expériences de l’équipe de C. Mello qui montraient que l’injection
d’ARN double-brin dans C. elegans induit l’inactivation spécifique du gène de séquence
correspondante. J’ai d’abord suivi la caractérisation de cet effet (Fire et al., 1998) en simple
spectateur, fasciné par son aspect paradoxal. Les années 90 avaient vu fleurir de nombreux
essais d’inactivation génétique par ARN antisens, sur l’idée que son appariement avec
l’ARNm cible pourrait inhiber la traduction. Il était donc très inattendu que l’effet recherché
se manifeste avec une bien plus grande efficacité en utilisant un ARN double-brin, à priori
peu efficace dans un tel modèle !
Entre 1998 et 2000 les expériences d’interférence par injection d’ARN double-brin ont
été reproduites avec succès dans de nombreux organismes modèles, et en particulier dans
des embryons de drosophile (Kennerdell and Carthew, 1998). Puis l’équipe de M. Driscoll a
montré qu’un transgène permettant d’exprimer chez C. elegans une séquence d’ARN en
« épingle à cheveux » induit une interférence par ARN efficace (Tavernarakis et al., 2000). La
publication de ce travail, et une autre conversation autour de la machine à café avec
Constantin Yanicostas, a constitué le signal de départ d’un projet que j’ai d’abord conçu
comme un développement technologique. L’idée était de reproduire chez la drosophile les
expériences de Tavernakis, en tirant parti du système UAS/GAL4, permettant d’exprimer
sélectivement un transgène dans un tissu ou à un stade particulier du développement. Nous
espérions pouvoir contrôler de façon très précise la synthèse d’un ARN double-brin en
épingle à cheveux à partir d’une séquence clonée en répétition inverse (IR), et provoquer
ainsi une inactivation génétique tissu- ou stade-spécifique.
Les expériences ont été entamées par Bruno Mugat, Clément Carré et Dimitri Szymczak
pendant l’hiver 2000. Nous avons d’abord choisi de cibler les isoformes A et B1 du
récepteur EcR, le gène dGcn5 (dont nous n’avions pas encore de mutants !), ainsi que les
séquences de la GFP. Encouragés par les résultats obtenus qui montraient que les transgènes
IR permettent une inactivation génétique, Jean-Yves Roignant s’est joint au projet en
complétant le petit répertoire de gènes ciblés par le gène batman. L’article qui suit retrace
52
les données obtenues et montre comment le projet, initialement conçu comme un
développement méthodologique, nous a conduit à aborder des problématiques ayant
directement trait aux mécanismes biologiques du RNAi.
6.2. Des transgènes IR pour contrôler l’interférence par l’ARN chez la
drosophile :
Roignant, J. Y., Carre, C., Mugat, B., Szymczak, D., Lepesant, J. A., and Antoniewski, C.
(2003). Absence of transitive and systemic pathways allows cell-specific and isoform-specific
RNAi in Drosophila. Rna 9, 299-308.
53
Absence of transitive and systemic pathways allows
cell-specific and isoform-specific RNAi in Drosophila
JEAN-YVES ROIGNANT,1 CLÉMENT CARRÉ,1 BRUNO MUGAT,1,2 DIMITRI SZYMCZAK,1
JEAN-ANTOINE LEPESANT,1 and CHRISTOPHE ANTONIEWSKI1
1
Institut Jacques Monod, Unité Mixte de Recherche 7592, Centre National de la Recherche Scientifique, Université Paris 6 et Université Paris
7. 75251 Paris cedex 05, France
ABSTRACT
RNA interference (RNAi) designates the multistep process by which double-stranded RNA induces the silencing of homologous
endogenous genes. Some aspects of RNAi appear to be conserved throughout evolution, including the processing of trigger
dsRNAs into small 21–23-bp siRNAs and their use to guide the degradation of complementary mRNAs. Two remarkable features
of RNAi were uncovered in plants and Caenorhabditid elegans. First, RNA-dependent RNA polymerase activities allow the
synthesis of siRNA complementary to sequences upstream of or downstream from the initial trigger region in the target mRNA,
leading to a transitive RNAi with sequences that had not been initially targeted. Secondly, systemic RNAi may cause the
targeting of gene silencing in one tissue to spread to other tissues. Using transgenes expressing dsRNA, we investigated whether
transitive and systemic RNAi occur in Drosophila. DsRNA-producing transgenes targeted RNAi to specific regions of alternative
mRNA species of one gene without transitive effect directed to sequences downstream from or upstream of the initial trigger
region. Moreover, specific expression of a dsRNA, using either cell-specific GAL4 drivers or random clonal activation of a GAL4
driver, mediated a cell-autonomous RNAi. Together, our results provide evidence that transitive and systemic aspects of RNAi
are not conserved in Drosophila and demonstrate that dsRNA-producing transgenes allow powerful reverse genetic approaches
to be conducted in this model organism, by knocking down gene functions at the resolution of a single-cell type and of a single
isoform.
Keywords: Drosophila melanogaster; RNA interference; ecdysone receptor; batman
INTRODUCTION
RNA interference (RNAi) results in targeted down-regulation of gene expression (Fire et al. 1998). It is triggered by
double-stranded RNAs (dsRNAs) that are processed into
small 21–23-bp dsRNAs (siRNAs) by a dsRNA-specific
RNase DICER (Bernstein et al. 2001). In subsequent steps,
siRNAs act as guides for specific degradation of their
complementary mRNA (Zamore et al. 2000). RNAi may be
achieved upon injection of dsRNA in various organisms,
including Caenorhabditis elegans and Drosophila melanogaster (Fire et al. 1998; Kennerdell and Carthew 1998; Hammond et al. 2001b; Schmid et al. 2002). Expression of snapback dsRNA using transgenes with inverted repeats of target
Reprint requests to: Christophe Antoniewski, Institut Jacques Monod,
UMR 7592, CNRS, Université Paris 6 et Université Paris 7. 2, place Jussieu,
75251 Paris cedex 05, France; e-mail: [email protected].
Present address: 2Institut de Génétique Humaine, CNRS 141, rue de la
Cardonille, 34396 Montpellier cedex 5, France.
Article and publication are at http://www.rnajournal.org/cgi/doi/10.1261/
rna.2154103.
gene sequences (IR transgenes) has also been successfully
employed to induce RNAi, first in plants (Chuang and Meyerowitz 2000) and C. elegans (Tavernarakis et al. 2000), and
more recently in D. melanogaster (Fortier and Belote 2000;
Kennerdell and Carthew 2000; Lam and Thummel 2000;
Martinek and Young 2000; Billuart et al. 2001; Keisman and
Baker 2001; Piccin et al. 2001; Giordano et al. 2002; Kalidas
and Smith 2002). The ability to control spatially and temporally the expression of such IR transgenes in Drosophila
opens the possibility to inactivate any given single gene in a
tissue- and/or stage-specific manner. However, two features
of RNAi must be taken into account in using these new
genetic tools.
First, an RNA-dependent RNA polymerase (RdRP) may
be involved in an amplification step of RNAi (Cogoni
and Macino 1999; Dalmay et al. 2000; Smardon et al.
2000). Using cell-free extracts of Drosophila embryos,
Lipardi et al. (2001) showed that a synthetic siRNA may
prime the 5⬘ → 3⬘ elongation of an antisense RNA using its
target mRNA as a template. Degradation of dsRNA generated by such a mechanism may give rise to secondary
RNA (2003), 9:299–308. Published by Cold Spring Harbor Laboratory Press. Copyright © 2003 RNA Society.
299
Roignant et al.
siRNAs directed to sequences upstream of the initial trigger
region on the target mRNA. Secondary siRNAs may thus
target other mRNA species that contain these upstream sequences. Although this so-called transitive RNAi phenomenon was not observed in Drosophila cultured cells (Celotto
and Graveley 2002), it clearly occurs in vivo in C. elegans
(Sijen et al. 2001). Transitive RNAi is also observed in
plants. In that case, siRNA are found both 5⬘ and 3⬘ of the
initial trigger region, leading RNAi to spread from this region into both the adjacent upstream and downstream regions of the target gene (Vaistij et al. 2002). Spreading of
siRNAs downstream from the initial target region may involve an unprimed RdRP activity.
Another remarkable feature of RNAi in C. elegans and
plants is that it involves a systemic response, the injection—
or the expression—of a dsRNA into one tissue leading to
gene silencing in other tissues (Palauqui et al. 1997; Fire et
al. 1998; Voinnet et al. 1998; Winston et al. 2002). In contrast, tissue-specific expression of IR transgenes in Drosophila was shown to cause localized morphological defects
in adults or localized cellular defects in larvae (Billuart et al.
2001; Giordano et al. 2002; Kalidas and Smith 2002). Although these studies suggested that spatially restricted expression of IR transgenes results in spatially restricted
RNAi, clear conclusions concerning the absence of systemic
RNAi in Drosophila awaited the direct demonstration that
IR transgene expression patterns and inactivation patterns
of targeted genes strictly overlap.
If systemic and transitive aspects of RNAi are conserved
in Drosophila, they may considerably limit the use of IR
transgenes to control specific gene inactivation: transitive
RNAi may lead to inactivation of mRNA species that were
not targeted by the initial trigger sequence of the IR, and
systemic RNAi may cause the genetic inactivation in one
tissue to spread to other tissues. We investigated these issues
and demonstrated here that IR transgenes can target RNAi
to specific regions of mRNA species without a transitive
effect directed to sequences downstream from or upstream
of the initial trigger region of the IR. Moreover, we provide
strong evidences that RNAi mediated by Drosophila IR
transgenes is as a cell-autonomous process.
RESULTS
RNAi mediated by IR transgenes remains restricted to
the initial trigger region
The batman gene is expressed ubiquitously throughout Drosophila development and encodes a BTB/POZ domain transcription factor involved in the regulation of Hox genes
(Faucheux et al. 2003). To inactivate batman by RNAi, we
cloned an inverted repeat of a 615-bp fragment of the batman cDNA downstream from the GAL4 UAS regulatory
sequences (Fig. 1). A transgenic line carrying this UASIR[batman] construct was crossed with the daughterless300
RNA, Vol. 9, No. 3
FIGURE 1. Structure of the UAS-IR constructs. (A) Strategy for generation of transgenic RNAi. A portion of the coding sequence of a gene
is dimerized in a head-to-head orientation and placed in the pUAST
expression vector under the control of UAS transcription elements.
(B) Maps of the batman, batman-GFP, and EcR (Talbot et al. 1993)
genes depict the arrangement of the exons. Exons common to all three
EcR isoforms are numbered 3–6. Specific exons of the EcR isoforms
are designated by greek letters. The positions of the cDNA fragments
cloned in the UAS-IR constructs for dsRNA expression are indicated
by black arrows. The position of the probes used for the RNase protection assays are indicated by solid black bars.
GAL4 (da-GAL4) driver strain that expresses GAL4 in most
tissues throughout development (Wodarz et al. 1995). A
Northern blot analysis using either a sense or an antisense
batman probe revealed the presence of 23-bp batman-specific siRNAs in mid-third instar larvae emerging from this
cross (Fig. 2A, left panel). The batman siRNAs were also
readily detected in an RNase protection assay using the
sense batman probe (Fig. 2A, right panel). Although the
measured size of siRNAs is subject to imprecision of a few
nucleotides due to incomplete digestion of the unprotected
probe by RNAse (compare left and right panels in Fig. 2A),
the RNase protection assay provided maximally sensitive
detection of small RNAs. The Batman protein was undetectable in the UAS-IR[batman] da-GAL4 larvae (Fig. 2B),
which eventually died at the beginning of the pupal phase
(not shown). Together, these results indicate that the batman gene can be readily inactivated by RNAi, using the
UAS-IR[batman] construct.
To test whether transitive RNAi directed to sequences
upstream of the IR trigger sequence may occur in Drosophila, we first took advantage of a transgenic line carrying
a UAS-batman-GFP fusion gene that fuses the full-length
GFP coding region to the last codon of the full-length batman coding region (Fig. 1B). We established new transgenic
lines for a UAS-IR[GFP] construct carrying the GFP coding
sequence in an inverted repeat orientation (Fig. 1B) and
Cell- and isoform-specific RNAi in Drosophila
with the batman-GFP fusion gene. GFP
fluorescence was lost and the BatmanGFP fusion protein was undetectable in
UAS-batman-GFP; da-GAL4 larvae carrying the UAS-IR[GFP] insertions #1,
#5, or #6 (Fig. 2D,E and data not
shown). In contrast, expression of the
Batman-GFP fusion protein was reduced but still detectable in UAS-batman-GFP; da-GAL4 larvae carrying the
UAS-IR[GFP] insertions #2, #3, or #4.
The lower efficiency of the genetic interference mediated by these three insertions is likely to be due to position effects at the genomic insertion site of the
UAS-IR[GFP] construct, as already discussed for other RNAi mediating Drosophila IR transgenes (Fortier and Belote
2000; Martinek and Young 2000).
An RNase protection assay using GFP
sense probes gfp1 and gfp2 (Fig. 1B)
showed that GFP-specific siRNAs were
present in samples from UAS-batmanGFP; da-GAL4; UAS-IR[GFP]#1 larvae
but not in UAS-batman-GFP; da-GAL4
control larvae (Fig. 2C). In contrast, the
batman sense probe bat did not detect
any siRNA targeted to the batman sequences immediately upstream of the
GFP sequences. Consistently, the level of
the endogenous Batman protein remained unchanged in UAS-batmanGFP; da-GAL4; UAS-IR[GFP] larvae
(Fig. 2D). These data indicate that RNA
interference with the GFP sequences of
the batman-GFP fusion gene is not asFIGURE 2. Specific inactivation of batman and batman-GFP. (A) Analysis of small RNAs from sociated with a significant spreading of
da-GAL4/+ (control) and UAS-IR[batman]/da-GAL4 (UAS-IR[batman]) third instar larvae.
(Left panel) siRNAs were analyzed by Northern blot using the bat probe (see Fig. 1B) of sense RNA targeting to the upstream batman
or antisense polarity as indicated. (Right panel) siRNAs were analyzed by RNase protection sequences.
assay using the bat probe of sense polarity. (B) Western blot analysis of Batman in da-GAL4/+
The Ecdysone Receptor gene provided
(control) and UAS-IR[batman]/da-GAL4 mid-third instar larvae. Immunodetection of the us with another model gene to explore
MBF-1 protein was used as a loading control. (C) Analysis of small RNAs from da-GAL4,
UAS-batman-GFP/+ (control) and da-GAL4, UAS-batman-GFP/UAS-IR[GFP] (UAS-IR- the possibility of a transitive RNAi in
[GFP]) third instar larvae. RNase protection assays were performed as indicated using the bat, Drosophila. It encodes three nuclear regp1, and gfp2 probes (all of sense polarity, see Fig. 1B). (D) Western blot analysis of late-third ceptor isoforms, EcR-A, EcR-B1, and
larval instar extracts from control w1118 larvae (WT), da-GAL4, UAS-batman-GFP/+ larvae EcR-B2, which share a common C-ter(+), and da-GAL4, UAS-batman-GFP/UAS-IR[GFP] (UAS-IR[GFP]) larvae using an antiBatman specific antibody (several independent UAS-IR[GFP] transgenic insertions were minal DNA-binding and ligand-binding
tested). The Batman-GFP protein (39 kD) was undetectable or strongly reduced, but the levels region, but completely differ by their Nof the Batman (14 kD) and MBF-1 (16 kD) proteins remained unchanged. (E) GFP fluores- terminal domain (Talbot et al. 1993).
cence in da-GAL4, UAS-batman-GFP/+ control larvae (left panel) and da-GAL4, UAS-batmanWe made two UAS-IR constructs with
GFP/UAS-IR[GFP] larvae (right panel).
inverted repeat sequences designed to
target the three 5⬘ EcR-A-specific exons
␣0,
␣1,
and
␣2
(UAS-IR[EcR-A])
and the 5⬘ EcR-B1-specrossed them to a recombinant homozygous UAS-batmancific
exon
␤2
(UAS-IR[EcR-B1]),
respectively (Fig. 1B).
GFP, da-GAL4 strain. In the progenies of these crosses, the
Here
we
present
a
detailed
analysis
of
a representative transUAS-IR[GFP] insertions were expressed under the control
genic
line
for
each
of
these
constructs.
of the da-GAL4 driver and mediated genetic interference
www.rnajournal.org
301
Roignant et al.
Both UAS-IR[EcR-A] and UAS-IR[EcR-B1] lines driven
by da-GAL4 developed normally during the larval period.
However, the UAS-IR[EcR-B1] third instar larvae did not
pupariate normally. They occasionally everted their spiracles but failed to shorten and never formed a tanned
pupal case (Fig. 3A). This phenotype is very similar, if not
identical, to the phenotype of EcR-B1 null mutant larvae
(Bender et al. 1997). In contrast, the UAS-IR[EcR-A] animals entered into the pupal phase and died as pharate
adults (Fig. 3A). Although no EcR-A-specific alleles have
been isolated yet, it should be noted that the previously
described EcRk06210 allele that results both in the downregulation of EcR-B1 and the absence of detectable EcR-A
isoform leads to a phenotype identical to that of UASIR[EcR-A] larvae (D’Avino and Thummel 2000).
The presence of specific siRNAs in UAS-IR[EcR-A] and
UAS-IR[EcR-B1] mid-third instar larvae was analyzed in an
RNase protection assay using different probes. In UASIR[EcR-A] larvae, a strong siRNA signal was observed with
a probe A specific for the EcR-A IR trigger sequence (Fig.
3B, lane 2). In contrast, siRNAs were not detected with a
probe C specific for the immediately downstream common
EcR sequence (Fig. 3B, lane 3) or with a probe A-UP specific for the upstream EcR-A sequence (Fig. 3B, lane 1).
Symmetrically, a probe B1 specific for the EcR-B1 trigger
sequence revealed a strong siRNA signal in UAS-IR[EcRB1] larvae (Fig. 3B, lane 5), but siRNAs were not detected in
these larvae using either the probe C specific for the downstream common EcR sequence or a probe B1-UP specific
for the upstream EcR-B1 sequence (Fig. 3B, lanes 4,6). As
UAS-IR[EcR-A] and UAS-IR[EcR-B1] transgenes do not
induce the presence of detectable siRNAs corresponding to
the common EcR region downstream from the targeted
regions, they should not induce transitive RNAi directed to
the untargeted isoform. Indeed, the EcR-A isoform was undetectable in UAS-IR[EcR-A] larvae whereas the level of the
EcR-B1 isoform remained unchanged in these animals (Fig.
3C). Conversely, the EcR-B1 isoform was strongly reduced
in UAS-IR[EcR-B1] larvae, whereas the level of the EcR-A
isoform remained unchanged.
Taken together, these results provide strong evidence that
Drosophila IR transgenes can specifically target unique exonic sequences without transitive RNAi directed to sequences either upstream of or downstream from the initial
trigger IR sequences.
UAS-IR transgenes induce cell-autonomous
RNA interference
We next asked whether IR transgenes induce a systemic
RNAi or whether RNAi remains localized to the cells where
dsRNA had been expressed. We took advantage of the ubiquitous expression of batman throughout development (Faucheux et al. 2003) and set up an experiment to visualize
batman inactivation by the UAS-IR[batman] construct
302
RNA, Vol. 9, No. 3
FIGURE 3. Specific inactivation of EcR isoforms. (A) Pharate adult
from a cross of the da-GAL4 driver line with the UAS-IR[EcR-A]
construct line (left panel) and late-third instar larvae from a cross of
the da-GAL4 driver line with the UAS-IR[EcR-B1] construct line
(right panel). Arrowheads point to necrotic tissues. (B) Analysis of
small RNAs from da-GAL4/+ (control), da-GAL4/UAS-IR[EcR-A]
(UAS-IR[EcR-A]), and da-GAL4/UAS-IR[EcR-B1] (UAS-IR[EcR-B1])
third instar larvae. RNase protection assays were performed using the
indicated sense probes (see Fig. 1B). (C) Western blot analysis of
mid-third larval instar extracts from control da-GAL4/+ (+) and
transgenic lines expressing the UAS-IR[EcR-A] and UAS-IR[EcR-B1]
constructs. MBF-1 level was unchanged in the samples.
when expressed under the control of cell-specific drivers.
The IR[batman] line was crossed with a strain homozygous
Cell- and isoform-specific RNAi in Drosophila
for both an engrailed-GAL4 driver (en-GAL4) and a UASGFP transgene reporter for GAL4 activation. The en-GAL4
driver induced GFP expression in the posterior compartment of wing discs of third larval instar progeny from this
cross, whereas no expression was detected in the anterior
compartment (Fig. 4A, panels a). Immunostaining revealed
that the Batman protein was completely absent from the
posterior compartment of the wing disc, but still present in
the anterior compartment. Confocal microscopy showed
that the cellular boundary of the area of batman inactivation
perfectly colocalized with that of UAS-IR[batman] expression, as visualized by GFP fluorescence. No spreading of
batman inactivation was detected in the anterior compartment of the wing disc or other larval or imaginal tissues
where the en-GAL4 driver is not active (Fig. 4A, panel a,
and data not shown). Consistently, adults flies emerging
from the UAS-IR[batman] × en-GAL4; UAS-GFP cross all
harbored a strong morphological defect restricted to the
posterior compartment of the wing.
Neuronal tissues in C. elegans and stomata in plants are
excluded from systemic spread of RNAi. Therefore, the absence of batman RNAi spreading outside from the posterior
compartments of discs could reflect a particular property of
these compartments. To test this possibility, we first repeated a similar batman inactivation experiment, using a
distal-less-GAL4 driver whose expression is specified in the
presumptive distal axis of appendages in leg and antennal
imaginal discs (Diaz-Benjumea et al. 1994; Gorfinkiel et al.
1997) and extends across the dorsoventral border in the
wing imaginal discs. The UAS-IR[batman] line was crossed
with a distal-less-GAL4, UAS-GFP line. As expected, the
distal-less-GAL4 driver induced GFP expression along both
sides of the wing margin in the wing discs and in the central
part of the antennal and leg discs (Fig. 4A, panels b, c, d,
respectively). Induction of the UAS-IR[batman] construct
in these territories completely eliminated the Batman protein. However, no spreading of batman inactivation was
detected outside from the distal-less-GAL4 expression areas.
In good agreement with these observations, adult flies
emerging from the cross harbored morphological defects
restricted to the antennas, the legs, and the wings (Fig. 4A,
right panels). In a second experiment, we used the “flipout” GAL4 driver Act5C>>GAL4 to coactivate expression
of the UAS-GFP and UAS-IR[batman] transgenes (Fig. 4B).
This technique employs heat-shock induction of the FLP
recombinase to fuse an Act5C promoter to GAL4, generating random clones of GAL4-expressing cells. First and second instar larvae emerging from a cross between hs-FLP;
Act5C>>GAL4, UAS-GFP males and UAS-IR[batman] females were heat-shocked and allowed to develop until the
end of the third larval instar. Tissues from late third instar
larvae were dissected and clones of cells expressing GAL4
were visualized by monitoring induction of the GFP fluorescence under confocal microscopy. The Batman protein
was undetectable in all GAL4-expressing clones in imaginal
discs and larval tissues immunostained with the Batman
antibody (Fig. 4B and data not shown). In striking contrast,
spreading of batman inactivation was never detected outside from the GAL4 expressing clones.
In a last set of experiments, we tested whether UAS-IR
transgenes can induce RNAi with other genes than batman
with the same absence of detectable systemic effect. Using a
fat-body specific Lsp2-GAL4 driver and the UAS-IR[EcRB1] transgenic construct, we were able to specifically inactivate the EcR-B1 isoform in the fat body of late third instar
larvae. No spreading of EcR-B1 inactivation was observed in
the salivary glands attached to the fat body or in other larval
or imaginal tissues (Fig. 5A and data not shown). Likewise,
a UAS-IR[Pcaf] transgenic construct mediated a strictly tissue-specific inactivation of the ubiquitously expressed histone-acetyltransferase Pcaf gene (Smith et al. 1998), when
driven by the distal-less-GAL4 driver (Fig. 5B). Together,
our results provide strong evidence that RNAi induced by
UAS-IR transgenes is cell autonomous and does not spread
outside from the tissues where the transgene was expressed.
DISCUSSION
Genetic analysis has demonstrated that RNA-dependent
RNA polymerases are required for RNAi in plants (Dalmay
et al. 2000; Mourrain et al. 2000), fungi (Cogoni and
Macino 1999), and nematodes (Smardon et al. 2000). Evidence for the involvement of RdRP activities in RNAi came
from the observation that RNAi targeting a specific region
of an mRNA is accompanied by the production of secondary siRNA corresponding to sequences of the transcript upstream of (Sijen et al. 2001) or even downstream (Vaistij et
al. 2002) from the region originally targeted. This RdRPdependent siRNA spreading is reflected in the transitivity of
RNAi in these organisms: The secondary siRNA target other
RNAs with sequences contained within the spreading area
(Sijen et al. 2001; Vaistij et al. 2002).
Although Lipardi et al. (2001) provided evidence for an
RdRP activity in Drosophila embryonic extracts, a number
of observations suggested that such an RdRP activity is not
necessarily involved in the Drosophila RNAi pathway. To
date, the use of crude or fractionated Drosophila extracts
only pointed to essential roles of DICER and RISC complexes with endonuclease activities for efficient in vitro
RNAi (Bernstein et al. 2001; Hammond et al. 2001a; Nykanen et al. 2001) and no member of the RdRP family has
been found by BLAST searching of the D. melanogaster
genome. An experiment designed to monitor the in vitro
degradation of a labeled mRNA did not reveal any cleavage
upstream of the target sequence present in the trigger
dsRNA, as would have been expected if an RdRP mediated
the spreading of siRNAs (Zamore et al. 2000). Moreover,
the integrity of the siRNA 3⬘ hydroxyl group is not required
for RNAi in Drosophila embryo lysates or in cultured human cells, indicating that RNAi may occur in these organwww.rnajournal.org
303
Roignant et al.
FIGURE 4. UAS-IR[batman] induces cell-autonomous inactivation of the batman gene. (A) Confocal analysis of GFP (green) and
Batman (red) expression in wing discs from en-GAL4, UAS-GFP/
UAS-IR[batman] larvae (a) or in wing discs (b), eye-antennal discs
(c), and leg discs (d) from dll-GAL4, UAS-GFP/UAS-IR[batman]
larvae. Adult structures in control and inactivated flies are shown
in the right panels. The size of the posterior compartment of the
wings is reduced in en-GAL4, UAS-GFP/UAS-IR[batman] flies and
contains a bubble indicative of abnormal adhesion between dorsal
and ventral epithelial sheets (a). In dll-GAL4, UAS-GFP/UAS-IR[batman] flies, wings are abnormally curved (b), third antennal
segments are reduced in size, unpigmented, and devoid of bristles
(c, black arrow), the size of aristas is greatly reduced (c, white
arrow), and the size of the bristles is greatly reduced on the legs (d).
(B) Confocal analysis of GFP (green) and Batman (red) in FLP/
FRT mediated cell clones coexpressing the UAS-GFP and UASIR[batman] transgenes. Clones are shown in a wing disc (a), the fat
body (b), the gut (c), and the malpigian tubules (d).
304
RNA, Vol. 9, No. 3
Cell- and isoform-specific RNAi in Drosophila
FIGURE 5. UAS-IR[EcR-B1] and UAS-IR[Pcaf] induce cell-autonomous RNAi. (A) Fat body specific inactivation of EcR-B1 in late-third
instar larvae. A Lsp2-GAL4 driver line that expresses GAL4 specifically
in the third larval instar fat body was crossed with the w1118 control
line (upper panel) or a UAS-IR[EcR-B1] transgenic line (lower panel).
EcR-B1 antibody staining (brown) of late-third larval instar tissues
showed that EcR-B1 isoform was undetectable in the fat body (FB) but
remained at the same level in salivary glands (SG) as well as other
larval tissues (not shown). (B) Confocal analysis of GFP (green) and
P/CAF (red) expression in leg discs (a), and wing discs (b) from
distal-less-GAL4, UAS-GFP/UAS-IR[Pcaf] larvae.
isms independently from an RdRP activity (Chiu and Rana
2002; Schwarz et al. 2002). Finally, a recent report demonstrated that transfection of cultured Schneider cells with a
dsRNA corresponding to an alternatively spliced exon only
mediates the degradation of mRNA isoforms that contain
this exon (Celotto and Graveley 2002). This suggested that
spreading of RNAi along the target mRNA and resulting
transitive RNAi do not occur in vivo in Drosophila.
Using IR transgenes to target three distinct mRNA sequences (GFP, EcR-A, and EcR-B1), we showed that RNAi
is accompanied by the readily detectable accumulation in
animals of siRNAs complementary to the initial trigger regions. However, in all three cases, siRNAs complementary
to sequences immediately upstream of these regions were
not detected. This suggest that RNAi in Drosophila is not
associated with a significant spreading of secondary siRNAs
upstream of the initial target sequence. The finding that the
targeting of RNAi to the GFP moiety of the Batman-GFP
fusion transgene had no transitive effect directed to the
endogenous batman gene strongly support this conclusion.
RNAi targeting of the EcR-A and -B1 isoforms also offered
the opportunity to test the possibility of siRNA spreading
downstream from the trigger IR sequences. In both these
cases, we did not detect the accumulation of siRNAs
complementary to immediately downstream exons shared
by all EcR isoforms. This absence of significant siRNA
spreading downstream from the target sequence was confirmed by the finding that UAS-IR[EcR-A] and UASIR[EcR-B1] mediates specific RNAi with EcR-A and -B1
isoforms, respectively, without any detectable transitive effect directed to the other isoform.
Altogether, our results provide direct evidence that RNAi
mediated by IR transgenes in Drosophila does not involve
the RdRP-dependent synthesis of secondary siRNAs.
Cosuppression in Drosophila resulting from the transcription of multiple transgene copies dispersed in the genome
has been shown to be a RNAi-related mechanism that involves the production of siRNAs homologous to the silenced gene (Pal-Bhadra et al. 2002). However, the mechanism by which antisense strands of siRNAs are generated in
this case remains to be elucidated. One possibility is that the
RdRP activity identified by Lipardi et al. (2001) is involved
in cosuppression rather than in IR transgene-mediated
RNAi in Drosophila.
We show, using both specific GAL4 drivers and a somatic
recombination system, that batman gene inactivation remains strictly localized to the cells in which batman RNAi
has been triggered. Likewise, we were able to inactivate both
EcR-B1 and Pcaf in a tissue-specific manner without any
detectable RNAi spreading. Therefore, our results demonstrate for three distinct genes the cell autonomy of RNAi in
Drosophila. This situation is in striking contrast with the
situation encountered in C. elegans and plants, in which a
remarkable feature of RNAi is its ability to spread over long
distances throughout the organism (Palauqui et al. 1997;
Fire et al. 1998; Voinnet et al. 1998; Winston et al. 2002).
How may this divergence be explained?
Systemic RNAi requires a system to pass a specific signal
from cell to cell (Hamilton and Baulcombe 1999; Klahre et
al. 2002). Although the nature of this system is currently
unknown, dsRNAs or siRNAs themselves constitute obvious candidates for the role of molecules acting as specific
signals. Systemic RNAi may involve additional components
such as transporters to export the signal from cells undergoing RNAi process and receptors for importing the signal
in other cells. A first possibility is that one or several of these
components are lacking in Drosophila. The lack in Drosophila of an homolog of the sid-1 gene that encodes a
transmembrane protein involved in systemic RNAi in C.
elegans supports this hypothesis (Winston et al. 2002). Systemic RNAi may also involve a system to amplify the signal
and generate the de novo synthesis of silencing RNA molecules in distant cells (Sijen et al. 2001; Klahre et al. 2002;
Vaistij et al. 2002). Therefore, it is tempting to propose that
the absence of detectable systemic RNAi in Drosophila simwww.rnajournal.org
305
Roignant et al.
ply reflects the absence of the de novo synthesis step of RNA
silencing molecules found in plants and C. elegans. In this
respect, it is interesting to note that the lack of systemic
RNAi in Drosophila correlates with the lack of detectable
transitive RNAi, another feature that involves the de novo
synthesis of silencing RNAs molecules.
Together our results show that dsRNA-producing IR
transgenes offer the opportunity to perform reverse genetic
studies in Drosophila by controlling gene inactivation in
single tissues or cells, at the resolution of a single isoform.
This exquisite precision opens a new possibility to analyze
gene functions in specific tissues or at specific developmental stages. Studies designed to determine whether systemic
and transitive RNAi do or do not operate in other higher
organisms such as vertebrates will be required because similar reverse genetic approaches based on the use of DNA
vectors to induce in vivo the expression of siRNAs have
started to emerge in these organisms (Tuschl 2002, and
references therein).
MATERIALS AND METHODS
IR constructs
cDNA fragments were amplified by using PCR with primers containing restriction sites and cloned in the pUAST vector (Brand
and Perrimon 1993) in two consecutive steps, first in a reverse
orientation between BglII and KpnI, then in a direct orientation
between EcoRI and BglII. Recombinant UAS-IR constructs were
transformed in Sure® (Stratagene) competent bacteria to minimize DNA recombination, and screened using appropriate restriction enzyme digestions. Transgenic flies for UAS-IR constructs
were generated as previously described using a w1118 strain as a
recipient stock (Rubin and Spradling 1982).
UAS-IR constructs include the following cDNA fragments repeated in a head-to-head arrangement (Fig. 1). UAS-IR[Batman]:
a 615-bp fragment between positions 104 and 719 relative to the
batman cDNA sequence (GenBank accession number AF308476);
UAS-IR[EcR-B1]: a 597-bp fragment between positions 1110 and
1707 relative to the EcR-B1 cDNA sequence (GenBank accession
number M74048); UAS-IR[EcR-A]: a 646-bp fragment between
positions 424 and 1070 relative to the EcR-A-specific exon sequence (GenBank accession number S63761); UAS-IR[GFP]: a
604-bp fragment between positions 28 and 632 relative to the
translation start codon in the EGFP cDNA (Clontech); and UASIR[Pcaf]: a 850-bp fragment between positions 1203 and 2053
relative to the Pcaf cDNA sequence (GenBank accession number
NM140329).
Fly strains
The da-GAL4 driver line refers to GAL4daG32 as described in
Wodarz et al. (1995). The hs-GAL4 and en-GAL4 driver lines were
gifts from Andrea Brand, Welcome/CRC Institute, University of
Cambridge, U.K., and the UAS-GFP reporter line was provided by
Jean-Paul Vincent, National Institute for Medical Research, Medical Research Council, London. The distal-less-GAL4 driver line was
306
RNA, Vol. 9, No. 3
obtained from the Bloomington Drosophila Stock Center. The
Lsp2-GAL4 driver line was a gift from Bassem Hassan, Department
of Human Genetics, Flanders Interuniversity Institute of Biotechnology, Leuven, Belgium. The UAS-batman-GFP transgene is a
fusion between the complete batman ORF to the EGFP ORF
(Clontech).
Generation of GAL4 expressing clones
GAL4-expressing clones were induced by the FRT “flip out”
method (Struhl and Basler 1993; Pignoni and Zipursky 1997) by
crossing hs-FLP, Act5c>>CD2>>GAL4, UAS-GFP flies (Neufeld
et al. 1998) with the UAS-IR[batman] line. Larvae were heatshocked 2 h at 37°C during first and second larval instar. Dissected
discs and larval tissues were fixed and immunostained as described
below.
Detection of siRNAs
Total RNAs were extracted from larvae using Trizol (GIBCO BRL)
and treated with RNase-free DNase I. Northern blot analyses of
siRNAs were performed as described (Hamilton and Baulcombe
1999). RNase protection assays were chosen to provide maximally
sensitive detection of small RNAs and were performed using the
Roche RNase Protection kit in accordance with the manufacturer’s
instructions. Our 32P-labeled RNA probes were generated by in
vitro transcription with T7 polymerase using PCR-amplified fragments as templates. Probes used were: bat (365–653 relative to the
batman cDNA sequence), gfp1 and gfp2 (1–300 and 293–518 relative to the translation start codon in the EGFP cDNA, respectively), a-up and a (108–395 and 478–786 relative to the EcR-Aspecific exon sequence, respectively), b1-up, b1, and c (762–1026,
1203–1523, and 1768–2004 relative to the EcR-B1 cDNA sequence,
respectively).
Western blotting and immunohistochemistry
Larvae were staged (Andres and Thummel 1992) and reared at
25°C. Western blot analyses were conducted as described in Brodu
et al. (1999) using the monoclonal anti-EcR-B1 AD4.4 and antiEcR-A 15G1a (a gift of C. Thummel, University of Utah, Salt Lake
City, UT, USA) antibodies, the affinity-purified rabbit anti-Batman polyclonal antibody (Faucheux et al. 2003), and the rabbit
polyclonal anti-MBF-1 (a gift of M. Jindra, Institute of Entomology, CAS, Ceske Budejovice, Czech Republic) directed against the
constitutively and ubiquitously expressed Drosophila Multiprotein
Bridging Factor 1 (M. Jindra, pers. comm.). The polyclonal PCAF
antibody was prepared against the bacterially expressed Drosophila
PCAF bromodomain and affinity purified.
For immunofluorescence assays, imaginal discs were dissected
from mid-third instar larvae, fixed in the Brower fixation buffer
(Sullivan et al. 2000) for 2 h, and antibody stained as described in
Dequier et al. (2001). Anti-Batman, Anti-P/CAF, and fluorescent
Cy3-conjugated secondary antibodies (Jackson Immunoresearch)
were used at 1:500, 1:1000, and 1:300 dilutions, respectively. Imaging was carried out using a Leica TCS-SP confocal microscope.
Immunostainings of larval tissues were performed as described
(Brodu et al. 1999).
Cell- and isoform-specific RNAi in Drosophila
ACKNOWLEDGMENTS
We thank R. Schwartzmann and C. Lefebvre for access to confocal
microscopy facilities and technical advice and P. Zamore, D. Yanicostas, I. Becam, M. Felix, A.-M. Pret, and L. Théodore for
discussions and critical reading of the manuscript. This work was
supported by the Centre National de la Recherche Scientifique and
the Association pour la Recherche contre le Cancer. J.-Y. Roignant
is a predoctoral fellow of the Ministère de la Recherche.
The publication costs of this article were defrayed in part by
payment of page charges. This article must therefore be hereby
marked “advertisement” in accordance with 18 USC section 1734
solely to indicate this fact.
Received October 2, 2002; accepted December 9, 2002.
REFERENCES
Andres, A.J. and Thummel, C.S. 1992. Hormones, Puffs and flies: The
molecular control of metamorphosis by ecdysone. Trends Genet.
8: 132–138.
Bender, M., Imam, F.B., Talbot, W.S., Ganetzky, B., and Hogness, D.S.
1997. Drosophila ecdysone receptor mutations reveal functional
differences among receptor isoforms. Cell 91: 777–788.
Bernstein, E., Caudy, A.A., Hammond, S.M., and Hannon, G.J. 2001.
Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA
interference. Nature 409: 363–366.
Billuart, P., Winter, C.G., Maresh, A., Zhao, X., and Luo, L. 2001.
Regulating axon branch stability: The role of p190 RhoGAP in
repressing a retraction signaling pathway. Cell 107: 195–207.
Brand, A.H. and Perrimon, N. 1993. Targeted gene expression as a
means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.
Development 118: 401–415.
Brodu, V., Mugat, B., Roignant, J.Y., Lepesant, J.A., and Antoniewski,
C. 1999. Dual requirement for the EcR/USP nuclear receptor and
the dGATAb factor in an ecdysone response in Drosophila melanogaster. Mol. Cell. Biol. 19: 5732–5742.
Celotto, A.M. and Graveley, B.R. 2002. Exon-specific RNAi: A tool for
dissecting the functional relevance of alternative splicing. RNA
8: 718–724.
Chiu, Y.L. and Rana, T.M. 2002. RNAi in human cells. Basic structural
and functional features of small interfering RNA. Mol. Cell
10: 549–561.
Chuang, C.F. and Meyerowitz, E.M. 2000. Specific and heritable genetic interference by double-stranded RNA in Arabidopsis thaliana.
Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 4985–4990.
Cogoni, C. and Macino, G. 1999. Gene silencing in Neurospora crassa
requires a protein homologous to RNA-dependent RNA polymerase. Nature 399: 166–169.
Dalmay, T., Hamilton, A., Rudd, S., Angell, S., and Baulcombe, D.C.
2000. An RNA-dependent RNA polymerase gene in Arabidopsis is
required for posttranscriptional gene silencing mediated by a
transgene but not by a virus. Cell 101: 543–553.
D’Avino, P.P. and Thummel, C.S. 2000. The ecdysone regulatory pathway controls wing morphogenesis and integrin expression during
Drosophila metamorphosis. Dev. Biol. 220: 211–224.
Dequier, E., Souid, S., Pal, M., Maroy, P., Lepesant, J.A., and Yanicostas, C. 2001. Top-DER- and Dpp-dependent requirements for the
Drosophila fos/kayak gene in follicular epithelium morphogenesis.
Mech. Dev. 106: 47–60.
Diaz-Benjumea, F.J., Cohen, B., and Cohen, S.M. 1994. Cell interaction between compartments establishes the proximal-distal axis of
Drosophila legs. Nature 372: 175–179.
Faucheux, M., Roignant, J.-Y., Netter, S., Charollais, J., Antoniewski,
C., and Théodore, L. 2003. batman interacts with Polycomb and
trithorax group genes and encodes a BTB/POZ protein that is
included in a complex containing GAGA factor. Mol. Cell. Biol. (in
press).
Fire, A., Xu, S., Montgomery, M.K., Kostas, S.A., Driver, S.E., and
Mello, C.C. 1998. Potent and specific genetic interference by
double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391: 806–
811.
Fortier, E. and Belote, J.M. 2000. Temperature-dependent gene silencing by an expressed inverted repeat in Drosophila. Genesis 26: 240–
244.
Giordano, E., Rendina, R., Peluso, I., and Furia, M. 2002. RNAi triggered by symmetrically transcribed transgenes in Drosophila melanogaster. Genetics 160: 637–648.
Gorfinkiel, N., Morata, G., and Guerrero, I. 1997. The homeobox gene
Distal-less induces ventral appendage development in Drosophila.
Genes & Dev. 11: 2259–2271.
Hamilton, A.J. and Baulcombe, D.C. 1999. A species of small antisense
RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science 286:
950–952.
Hammond, S.M., Boettcher, S., Caudy, A.A., Kobayashi, R., and Hannon, G.J. 2001a. Argonaute2, a link between genetic and biochemical analyses of RNAi. Science 293: 1146–1150.
Hammond, S.M., Caudy, A.A., and Hannon, G.J. 2001b. Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA. Nat. Rev.
Genet. 2: 110–119.
Kalidas, S. and Smith, D.P. 2002. Novel genomic cDNA hybrids produce effective RNA interference in adult Drosophila. Neuron
33: 177–184.
Keisman, E.L. and Baker, B.S. 2001. The Drosophila sex determination
hierarchy modulates wingless and decapentaplegic signaling to deploy dachshund sex-specifically in the genital imaginal disc. Development 128: 1643–1656.
Kennerdell, J.R. and Carthew, R.W. 1998. Use of dsRNA-mediated
genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act
in the wingless pathway. Cell 95: 1017–1026.
——— 2000. Heritable gene silencing in Drosophila using doublestranded RNA. Nat. Biotechnol. 18: 896–898.
Klahre, U., Crete, P., Leuenberger, S.A., Iglesias, V.A., and Meins Jr.,
F. 2002. High molecular weight RNAs and small interfering RNAs
induce systemic posttranscriptional gene silencing in plants. Proc.
Natl. Acad. Sci. 99: 11981–11986.
Lam, G. and Thummel, C.S. 2000. Inducible expression of doublestranded RNA directs specific genetic interference in Drosophila.
Curr. Biol. 10: 957–963.
Lipardi, C., Wei, Q., and Paterson, B.M. 2001. RNAi as random degradative PCR: siRNA primers convert mRNA into dsRNAs that are
degraded to generate new siRNAs. Cell 107: 297–307.
Martinek, S. and Young, M.W. 2000. Specific genetic interference with
behavioral rhythms in Drosophila by expression of inverted repeats.
Genetics 156: 1717–1725.
Mourrain, P., Beclin, C., Elmayan, T., Feuerbach, F., Godon, C., Morel, J.B., Jouette, D., Lacombe, A.M., Nikic, S., Picault, N., et al.
2000. Arabidopsis SGS2 and SGS3 genes are required for posttranscriptional gene silencing and natural virus resistance. Cell
101: 533–542.
Neufeld, T.P., de la Cruz, A.F., Johnston, L.A., and Edgar, B.A. 1998.
Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing.
Cell 93: 1183–1193.
Nykanen, A., Haley, B., and Zamore, P.D. 2001. ATP requirements
and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway. Cell 107: 309–321.
Palauqui, J.C., Elmayan, T., Pollien, J.M., and Vaucheret, H. 1997.
Systemic acquired silencing: Transgene-specific post-transcriptional silencing is transmitted by grafting from silenced stocks to
non-silenced scions. EMBO J. 16: 4738–4745.
Pal-Bhadra, M., Bhadra, U., and Birchler, J.A. 2002. RNAi related
mechanisms affect both transcriptional and posttranscriptional
transgene silencing in Drosophila. Mol. Cell 9: 315–327.
Piccin, A., Salameh, A., Benna, C., Sandrelli, F., Mazzotta, G., Zordan,
M., Rosato, E., Kyriacou, C.P., and Costa, R. 2001. Efficient and
www.rnajournal.org
307
Roignant et al.
heritable functional knock-out of an adult phenotype in Drosophila
using a GAL4-driven hairpin RNA incorporating a heterologous
spacer. Nucleic Acids Res. 29: E55–5.
Pignoni, F. and Zipursky, S.L. 1997. Induction of Drosophila eye development by decapentaplegic. Development 124: 271–278.
Rubin, G.M. and Spradling, A.C. 1982. Genetic transformation of
Drosophila with transposable element vectors. Science 218: 348–353.
Schmid, A., Schindelholz, B., and Zinn, K. 2002. Combinatorial RNAi:
A method for evaluating the functions of gene families in Drosophila. Trends Neurosci. 25: 71–74.
Schwarz, D.S., Hutvagner, G., Haley, B., and Zamore, P.D. 2002. Evidence that siRNAs function as guides, not primers, in the Drosophila and human RNAi pathways. Mol. Cell 10: 537–548.
Sijen, T., Fleenor, J., Simmer, F., Thijssen, K.L., Parrish, S., Timmons,
L., Plasterk, R.H., and Fire, A. 2001. On the role of RNA amplification in dsRNA-triggered gene silencing. Cell 107: 465–476.
Smardon, A., Spoerke, J.M., Stacey, S.C., Klein, M.E., Mackin, N., and
Maine, E.M. 2000. EGO-1 is related to RNA-directed RNA polymerase and functions in germ-line development and RNA interference in C. elegans. Curr. Biol. 10: 169–178.
Smith, E.R., Belote, J.M., Schiltz, R.L., Yang, X.J., Moore, P.A., Berger,
S.L., Nakatani, Y., and Allis, C.D. 1998. Cloning of Drosophila
GCN5: Conserved features among metazoan GCN5 family members. Nucleic Acids Res. 26: 2948–2954.
Struhl, G. and Basler, K. 1993. Organizing activity of wingless protein
in Drosophila. Cell 72: 527–540.
Sullivan, W., Ashburner, M., and Hawley, R.S. 2000. Drosophila pro-
308
RNA, Vol. 9, No. 3
tocols. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY.
Talbot, W.S., Swyryd, E.A., and Hogness, D.S. 1993. Drosophila tissues
with different metamorphic responses to ecdysone express different ecdysone receptor isoforms. Cell 73: 1323–1337.
Tavernarakis, N., Wang, S.L., Dorovkov, M., Ryazanov, A., and
Driscoll, M. 2000. Heritable and inducible genetic interference by
double-stranded RNA encoded by transgenes. Nat. Genet. 24: 180–183.
Tuschl, T. 2002. Expanding small RNA interference. Nat. Biotechnol.
20: 446–448.
Vaistij, F.E., Jones, L., and Baulcombe, D.C. 2002. Spreading of RNA
targeting and DNA methylation in RNA silencing requires transcription of the target gene and a putative RNA-dependent RNA
polymerase. Plant Cell 14: 857–867.
Voinnet, O., Vain, P., Angell, S., and Baulcombe, D.C. 1998. Systemic
spread of sequence-specific transgene RNA degradation in plants is
initiated by localized introduction of ectopic promoterless DNA.
Cell 95: 177–187.
Winston, W.M., Molodowitch, C., and Hunter, C.P. 2002. Systemic
RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein
SID-1. Science 295: 2456–2459.
Wodarz, A., Hinz, U., Engelbert, M., and Knust, E. 1995. Expression
of crumbs confers apical character on plasma membrane domains
of ectodermal epithelia of Drosophila. Cell 82: 67–76.
Zamore, P.D., Tuschl, T., Sharp, P.A., and Bartel, D.P. 2000. RNAi:
Double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of
mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell 101: 25–33.
6.3. Un super « joker » ! les lignées transgéniques UAS-IR[EcR-core].
Au cours de notre travail publié dans « RNA », nous avons également généré des lignées
transgéniques pour une construction UAS-IR[EcR-core], dirigée contre les exons communs à
toutes les isoformes EcR. Nous n’avons pas inclus la caractérisation de l’effet de cette
construction dans notre manuscrit, car elle n’apportait pas d’arguments à la ligne que nous
souhaitions défendre alors : la spécificité du RNAi permet d’inactiver sélectivement une
isoforme donnée. C’est par la suite, que cette construction s’est révélée être un outil
puissant.
Le gène EcR est situé dans la région cytogénétique 42A, c’est-à-dire très proche du
centromère du chromosome II. Cette caractéristique rend très difficile la génération, par
recombinaison mitotique, d’animaux mosaïques comportant des clones cellulaires mutants
pour le gène EcR (pour une revue sur la méthode, voir (St Johnston, 2002). Ainsi, l’analyse
par cette approche des fonctions de ce gène dans des tissus particuliers au cours de la
métamorphose est très difficile à réaliser, et ce d’autant plus qu’il est requis précocement
dès l’embryogenèse.
Margrit Schubiger a utilisé la construction UAS-IR[EcR-core] en combinaison avec une
série de pilotes GAL4 s’exprimant sélectivement dans des compartiments des disques
imaginaux d’ailes. Elle a pu observer que l’inactivation du récepteur de l’ecdysone dans ces
compartiments induit une différenciation prématurée de deux groupes de neurones
sensoriels au niveau de la marge, ou de la troisième veine de l’aile. Ses expériences ont
permis de démontrer que le récepteur de l’ecdysone fonctionne en l’absence d’hormone
comme un répresseur de la différenciation neuronale dans l’aile (Schubiger et al., 2005).
De son côté, l’équipe de Pierre Léopold a mis à profit la construction UAS-IR[EcR-core]
pour inactiver partiellement le gène EcR en utilisant un pilote exprimant faiblement
l’activateur GAL4. De façon inattendue, un abaissement modéré du niveau d’expression du
récepteur de l’ecdysone conduit à une augmentation de la taille des adultes. Cet effet est
également observé si on limite l’inactivation d’EcR à un seul tissu pendant la période larvaire,
le corps gras. Les expériences réalisées par l’équipe de Pierre montrent ainsi que l’hormone
stéroïde ecdysone agit dans une boucle de régulation endocrine antagoniste de la voie de
stimulation de la croissance cellulaire insulinodépendante (Colombani et al., 2005).
Ces travaux en collaboration illustrent bien comment la capacité de moduler à la fois le
niveau et le profil spatio-temporel de l’inactivation d’une cible font des transgènes IR des
64
outils désormais pratiquement incontournables dans l’arsenal des outils d’analyse génétique
chez la drosophile.
6.4. Les années glorieuses des petits ARN : petit rappel bibliographique.
Au cours des trois dernières années, l’interférence par l’ARN, et d’une manière plus
générale les petits ARN non codants ont représenté l’un des champs de recherche les plus
actifs de la biologie (pour des revues détaillées, voir (Tomari and Zamore, 2005; Zamore and
Haley, 2005). Les découvertes, brièvement résumées ci-après, se sont succédées à un
rythme extrêmement soutenu sur deux fronts, révélant à la fois les mécanismes moléculaires
élémentaires par lesquels les petits ARN exercent leur action, et la diversité de leur cibles
biologiques et de leurs fonctions.
6.4.1. Les différentes classes de petits ARN
Les petits ARN de 21-27 pb impliqués dans les mécanismes de répression génétique
dérivent tous d’un précurseur plus long d’ARN double-brin (ARN db).
siRNA et rasiRNA
Nous avons vu que les siRNA, médiateurs du RNAi, dérivent de longues molécules
d’ARN db, à extrémités franches, ou en « épingle à cheveux » si elles sont exprimées in vivo
à partir de transgènes IR. De longues molécules d’ARN db peuvent également être générées
de façon endogène, par transcription bidirectionnelle de certains locus. C’est le cas par
exemple pour les régions péricentromériques répétées chez les plantes et S. pombe (Volpe
et al., 2002; Zilberman et al., 2003). Ce mode de production d’ARN db péricentromérique
n’est en revanche pas encore clairement identifié chez l’homme, ou chez la drosophile,
même si des arguments indirects suggèrent qu’il pourrait également exister dans ces
organismes (Aravin et al., 2003; Pal-Bhadra et al., 2002; Pal-Bhadra et al., 2004). Il existe en
revanche chez la drosophile un cas bien caractérisé, celui du « cluster » Suppressor of Stellate
porté sur le chromosome Y, dont la transcription bidirectionnelle génère des ARN db
impliqués dans la répression en trans du gène Stellate, de séquence très similaire et porté par
le chromosome X (Aravin et al., 2004; Aravin et al., 2001). Dans tous les cas mentionnés cidessus, les longs précurseurs d’ARN db sont clivés en siRNA ou rasiRNA (repeat-associated
siRNA) par l’enzyme Dicer (Dicer-2 chez la drosophile), associée à un cofacteur (R2D2 chez
la drosophile, et RDE-4 chez C. elegans) (Fig. 9).
65
miRNA
Contrairement aux siRNA, les miRNA dérivent de la transcription, par l’ARN
polymérase II, de précurseurs pri-miRNA qui présentent une ou plusieurs répétitions
inverses imparfaites d’environ 70 pb, permettant un repliement local de type « tige-boucle »
(Fig. 9). Ces structures secondaires d’environ 70 pb, les pré-miRNA, sont excisées sous
l’action d’un complexe « microprocessor » qui contient la RNase Drosha (Lee et al., 2003),
associé au partenaire Pasha chez la drosophile (Denli et al., 2004), ou à son homologue
DGCR8 chez l’homme (Gregory et al., 2004). Le premier gène codant pour un miRNA, lin-4,
a été découvert par l’équipe de V. Ambros, qui a montré dès 1993 que cet ARN non codant
peut s’apparier par homologie de séquence au niveau de la région 3’ non traduite de l’ARN
cible lin-14, provoquant ainsi la répression de son expression (Lee et al., 1993). La connexion
fonctionnelle entre miRNA et RNAi n’a pourtant été établie que bien plus tard (Grishok et
al., 2001; Hutvagner et al., 2001), au moment où l’on a découvert que l’enzyme responsable
de la dernière étape de maturation du miRNA, au cours de laquelle la boucle du pré-miRNA
est excisée pour générer un petit ARN db de structure similaire à celle d’un siRNA, n’est
autre que Dicer (Dicer-1 chez la drosophile). Une différence majeure entre miRNA et
siRNA subsiste pourtant encore à cette étape : contrairement aux siRNA qui par définition
sont parfaitement complémentaires à leurs cibles, l’appariement des miRNA avec le 3’ UTR
de leurs messagers cibles est le plupart du temps imparfait.
66
Figure 9. Modèle d’action des petits ARN chez les animaux
6.4.2. Des machines pour faire taire… par tous les moyens.
Complexes RISC, clivage ou inhibition de la traduction de l’ARN cible.
Après maturation par Dicer, siRNA et miRNA sont incorporés dans des complexes RISC
(RNA induced silencing complexe) de compositions très similaires. Un composant principal
de ces complexes est une protéine Argonaute, membre d’une famille de protéines
caractérisées par la présence simultanée d’un domaine PAZ et d’un domaine PIWI (Tomari
and Zamore, 2005). Chez la drosophile comme chez l’homme, les siRNA sont incorporés
spécifiquement dans un complexe RISC contenant la protéine Ago-1, tandis que les miRNA
semblent agir via un complexe RISC contenant la protéine Ago-2. Dans sa version activée
(RISC*), un seul brin du petit ARN (miRNA comme siRNA) subsiste associé au complexe
RISC, servant de guide pour une association spécifique avec une cible de séquence
67
complémentaire. Une différence essentielle entre siRNA et miRNA existe à cette étape du
mécanisme. Le complexe RISC associé aux siRNA induit un clivage de l’ARNm cible, tandis
que le complexe RISC associé aux miRNA semble induire une inhibition de la traduction. On
sait aujourd’hui que le domaine PIWI peut fonctionner comme un domaine catalytique
RNase. C’est le cas des domaines PIWI présents dans les protéines Argonaute-2 de
drosophile et d’homme, et l’on comprend ainsi comment les complexes RISC associés aux
siRNA sont capables de cibler la dégradation de leurs ARNm cibles (Liu et al., 2004; Song et
al., 2003; Song et al., 2004; Yuan et al., 2005). De façon intéressante, le domaine PIWI de la
protéine humaine Ago-1 ne possède pas cette activité RNase (Liu et al., 2004; Meister et al.,
2004), suggérant que la différence entre les modes d’actions des siRNA et miRNA (clivage
ou inhibition de la traduction) pourrait simplement résider dans les caractéristiques
fonctionnelles des protéines Argonautes auxquelles ils s’associent dans le complexe RISC.
Pourtant, une étude récente montre que la protéine Ago-1 de drosophile associée dans le
complexe RISC à un miRNA est également capable d’induire un clivage de sa cible, si celle-ci
lui est parfaitement complémentaire (Miyoshi et al., 2005). Ainsi, les raisons pour lesquelles
siRNA et miRNA ont un mécanisme d’action différent restent assez mystérieuses, même si il
est clair que cette différence est liée au degré d’appariement entre le petit ARN simple brin
et sa cible.
Complexe RITS : répression par hétérochromatinisation.
Chez S. pombe, les petits ARN produits par Dicer à partir de la transcription
bidirectionnelle des régions péricentromériques sont directement liés à la formation de
l’hétérochromatine.Ces petits ARN sont incorporés dans un complexe RITS (RNA-induced
Initiator of Transcriptional gene silencing), qui contient la protéine Argonaute-1, la protéine
à chromodomaine Chp1, et la protéine Tas3 de fonction inconnue. On ne sait pas encore
clairement si le complexe RITS est ciblé au niveau des séquences d’ADN correspondantes
aux petits ARN, ou au niveau des transcrits primaires synthétisés à partir de ces séquences.
Quoi qu’il en soit, ce ciblage induit le recrutement de l’histone méthyltransférase Clr4 et la
méthylation du résidu K9 de l’histone H3, marque d’une l’hétérochromatinisation (Noma et
al., 2004; Verdel et al., 2004). Chez les plantes, les petits ARN sont également impliqués dans
le ciblage de la méthylation H3-K9, au niveau des régions hétérochromatinisées (Zilberman
et al., 2003). Ils sont aussi impliqués dans la méthylation de l’ADN lui-même, aboutissant à
une répression transcriptionnelle quand celle-ci est dirigée vers les séquences régulatrices de
gènes cibles (Aufsatz et al., 2004; Pelissier and Wassenegger, 2000). Les complexes
moléculaires médiateurs de ces effets n’ont pas encore été caractérisés. Chez la drosophile
68
enfin, des indications indirectes suggèrent très fortement que les petits ARN pourraient
servir de guides pour l’hétérochromatinisation, mais ceci n’a pas été encore formellement
démontré (Pal-Bhadra et al., 2002; Pal-Bhadra et al., 2004).
Pour conclure, l’on voit comment un thème récurrent émerge de la caractérisation des
machineries moléculaires liées aux petits ARNs. Ceux-ci sont utilisés pour cibler des
complexes avec diverses activités enzymatiques, soit au niveau de l’ADN ou des histones,
soit au niveau de l’ARN, permettant une répression de l’activité génétique au niveau
transcriptionnel ou post-transcriptionnel.
6.4.3. Les miRNA : une nouvelle classe de régulateurs de l’expression
génétique.
Des approches par clonages de petits ARN ou par analyse bioinformatique ont permis de
caractériser un nombre considérable de miRNA. On estime actuellement que le génome de
la drosophile comporterait plus de 120 miRNA (78 actuellement répertoriés), et celui de
l’homme plusieurs centaines (Du and Zamore, 2005). L’analyse des cibles des miRNA est
grandement compliquée par le fait qu’elles ne comportent qu’une homologie imparfaite avec
leur séquence. Les récentes analyses informatiques suggèrent qu’un miRNA donné pourrait
avoir jusqu’à plusieurs dizaines de cibles différentes, tandis qu’un même ARNm serait le plus
souvent la cible de plusieurs miRNA (Lai, 2005). Finalement, les miRNA présentent le plus
souvent un profil d’expression spécifique, restreint à la fois spatialement et temporellement
au cours du développement (pour un bel exemple, voir (Wienholds et al., 2005). Ces seules
observations pointent sur un rôle essentiel des miRNA comme régulateurs du
développement chez les métazoaires. Les « années glorieuses » des petits ARN sont aussi
celles qui ont vu cet aspect envahir massivement la littérature scientifique. On peut citer
brièvement les rôles des miRNA dans le contrôle temporel des transitions larvaires chez C.
elegans, dans l’embryogenèse précoce, dans la différenciation et l’organogenèse, et dans le
contrôle de la croissance cellulaire et de l’apoptose (pour une revue, voir (Alvarez-Garcia
and Miska, 2005). On peut enfin souligner que la machinerie des miRNA est strictement
requise pour la division et la maintenance de cellules souches, et en particulier chez la
drosophile pour la division des cellules souches germinales chez la femelle (Forstemann et
al., 2005; Hatfield et al., 2005).
69
6.5. Des outils pour analyser les fonctions des petits ARN chez la
drosophile.
Nous souhaitons tirer parti de l’expérience acquise au laboratoire pour aborder
maintenant l’étude des mécanismes et des fonctions des petits ARN au cours du
développement de la drosophile. Pour cela, nous avons d’abord développé 3 outils essentiels
à nos projets : (i) des systèmes transgéniques pour inhiber l’activité des petits ARN (ii) des
systèmes transgéniques « indicateurs » permettant de mesurer in vivo cette activité (iii) des
puces à LNA permettant d’analyser de façon globale les profils temporels d’expression des
miRNA chez la drosophile.
6.5.1. Inhibiteurs du RNAi et des miRNA.
Chez les plantes, le RNAi induit par des intermédiaires de réplication double-brin joue est
la principale défense contre les virus (VIGS, Viral Induced Gene Silencing). Pour contrer
cette défense de l’hôte, les virus de plantes codent des facteurs, initialement caractérisés
comme des facteurs de virulence, capables d’inhiber les mécanismes de RNAi. On trouve
également de tels inhibiteurs chez les insectes (la protéine B2 du Flock House Virus) et chez
les mammifères (la protéine Tas du Foami Virus), suggérant qu’induction et suppression du
RNAi sont des aspects conservés des interactions hôte/virus chez les animaux (Voinnet,
2005). Un des aspects les plus attractifs des inhibiteurs viraux est qu’ils semblent pouvoir
fonctionner non seulement dans leur hôte naturel, mais également dans une très large
gamme d’autres organismes. De plus ces inhibiteurs n’agissent pas forcément sur les mêmes
étapes mécanistiques des voies du RNAi et des miRNA. Tous ces aspects font des
inhibiteurs viraux des outils sans équivalent pour perturber et analyser l’action des siRNA ou
miRNA dans un processus donné. Nous avons collecté les cDNA de plusieurs inhibiteurs
décrits dans la littérature, issus de virus de plante (P15, P19, P21, P25, P38 and Hc-Pro),
d’insectes (B2) ou de mammifères (Tas). Tous ces inhibiteurs ont été clonés dans le système
Gateway (Invitrogen) et transférés, fusionnés à différentes étiquettes, dans des vecteurs de
transgenèse de drosophile. Nous établissons actuellement les lignées transgéniques pour
cette collection d’inhibiteurs. Des résultats préliminaires indiquent sans ambiguïté que les
protéines P19 et B2 fonctionnent bien comme de puissants inhibiteurs de RNAi chez la
drosophile.
70
6.5.2. Systèmes transgéniques indicateurs.
Trois types de systèmes transgéniques ont été établis pour mesurer l’activité in vivo de
siRNA et de miRNA. Des lignées transgéniques « sensor » exprimant la GFP fusionnée à des
sites cibles des miRNA miR277 et bantam (Brennecke et al., 2003; Forstemann et al., 2005)
ont été obtenues et combinées par croisement génétiques avec des pilotes GAL4. Ces
lignées sont donc désormais prêtes pour tester par simple croisement l’effet de l’expression
de différents inhibiteurs viraux (voir ci-dessous) sur l’activité des miRNA.
Pour des systèmes indicateurs de l’activité des siRNA, nous avons à nouveau tiré parti de
notre construction UAS-IR[EcR-core]. En effet, des lignées établies exprimant cette
construction sous le contrôle du pilote GMR-GAL4 présentent de forts défauts de
développement au niveau de l’œil qui apparaît dépourvu de lentille et de cuticule (Fig. 10).
Ce défaut peut donc être facilement utilisé comme témoin de l’activité des siRNA. (Il est à
noter qu’il mérite en lui-même une étude détaillée car il atteste d’une fonction encore
inconnue du récepteur de l’ecdysone au cours de la morphogenèse tardive de l’œil). Nous
avons également combiné une construction RNAi GMR-IR[w] induisant une très forte
inactivation du gène white, avec le pilote GMR-GAL4. Comme dans le cas des constructions
« sensors » de l’activité des miRNA, ces deux constructions sont maintenant directement
utilisables pour tester l’expression des inhibiteurs viraux sur l’activité des siRNA.
Bien que plusieurs gènes nécessaires au RNAi aient aussi été impliqués dans la répression
transcriptionnelle ou chromatinienne chez la drosophile, les preuves directes d’un rôle des
petits ARN dans le ciblage de modifications des histones n’ont pas encore été fournies. Nous
avons construit une troisième série de transgènes IR permettant la production d’un ARN db
ciblé contre les promoteurs des gènes dGcn5 et white et contre l’élément régulateur bxd du
gène Ubx. Nous allons tester prochainement si des ARN db dirigés contre ces régions non
transcrites peuvent induire une répression génique. Le cas échéant, nos constructions
constitueront des systèmes indicateurs idéaux de l’activité des petits ARN dans le noyau et
au niveau de la chromatine.
6.5.3. Des puces à LNA pour analyser les profils d’expression des
miRNAs.
En collaboration avec la génopole de Pasteur et la société Exiqon nous avons entamé la
construction de puces pour détecter les profils d’expression de tous les miRNA dans une
approche globale. Nous avons choisi de fixer de courts oligonucléotides LNA (Locked
Nucleic Acids) d’une séquence de 21-23 pb complémentaire aux miRNA. Pour l’hybridation,
71
les miRNA sont purifiés sur un système d’électrophorèse dédié (Flash PAGE) et directement
marqué par fluorescence (Ambion®). Le couplage des oligonucléotides sur le support de
verre ainsi que les conditions d’hybridation avec les sondes sont maintenant optimisés et
nous allons spotter le jeu complet des miRNA de drosophile connus à ce jour en Janvier
prochain.
6.6. Projet
En nous appuyant sur les outils présentés ci-dessus, nous souhaitons maintenant
développer un programme de recherche axé sur :
- l’analyse de la fonction – encore peu caractérisée - des siRNA et rasiRNA endogènes de
la drosophile
- l’identification et la caractérisation des miRNA impliqués dans le contrôle de la cascade
génétique déclenchée par l’ecdysone à la métamorphose.
6.6.1. Analyse de la fonction des siRNA endogènes de la drosophile
Les approches génétiques et biochimiques conduites chez la drosophile au cours des
derniers mois ont révélé que les voies d’inhibition par les siRNA et miRNA mettent en jeu
des mécanismes partiellement recouvrants. Les suppresseurs viraux, qui agissent souvent par
compétition en capturant les petits ARN, fournissent un moyen unique d’interférer
sélectivement avec leurs fonctions cellulaires (Voinnet, 2005). En tirant avantage des
systèmes transgéniques indicateurs que nous avons établis (voir section précédente), nous
allons tester la capacité de notre collection de suppresseurs viraux à inhiber les fonctions de
miRNA et siRNA et analyser biochimiquement leur effet les longs ARN db, les siRNA, les
pré-miRNA et miRNA. Nous allons également tester l’effet de l’expression d’une protéine
Drosha que nous avons mutée au niveau des domaines catalytiques RNase et dont nous
espérons qu’elle se comportera comme un suppresseur de la maturation des pri-miRNA.
Nous caractériserons également plus en détail à quel niveau les inhibiteurs fonctionnent, en
réalisant des tests génétiques d’épistasie par croisement avec les différents mutants des voies
RNAi et miRNA (Dcr-1 et –2, Ago-1 et –2, Drosha, etc…).
Nous avons déjà au laboratoire des résultats très encourageants qui montrent que P19, et
surtout B2, agissent comme attendu comme de puissants inhibiteurs d’une interférence par
l’ARN induite par un transgène UAS-IR (Fig. 10).
72
Figure 10. Systèmes transgéniques indicateurs de RNAi, et inhibition par la protéine B2 du virus
FHV. Dans la partie supérieure de la figure, un œil de drosophile (à gauche) de génotype P{GMR-IR[w]}/+ ; P{GMRGAL4, w+}/P{UAS-GFP, w+} montre une très forte dépigmentation attestant de l’interférence par l’ARN produite par
le transgène P{GMR-IR[w]}. En revanche dans œil de génotype P{GMR-IR[w]}/+ ; P{GMR-GAL4, w+}/P{UAS-B2, w+}, le
RNAi est fortement inhibé et la pigmentation de l’œil est restaurée. Dans la partie inférieure de la figure, un œil de
drosophile (à gauche) de génotype GMR-GAL4,UAS-IR[EcR-core]/UAS-GFP montre de sévères défauts de lentille et de
cuticule. En présence de la protéine B2, dans un œil de génotype GMR-GAL4,UAS-IR[EcR-core]/UAS-B2, l’interférence
par l’ARN contre EcR est abolie est une structure presque normale des ommatidies est restaurée.
Nous pouvons donc d’ores et déjà aborder les 3 questions spécifiques concernant les
fonctions des siRNA endogène de drosophile.
- Des siRNA sont-ils mis en jeu lors d’une infection de drosophiles adultes par un virus à ARN ?
Pour répondre à cette question, nous avons entamé une collaboration avec plusieurs équipes
de virologues et nous allons tester si des lignées de drosophile exprimant le suppresseur B2
deviennent plus susceptibles à une infection par le virus C de drosophile (DCV), le virus
Sinbis, ou le virus VSV (Vesicular Stomatis Virus). Nous rechercherons dans chaque cas si la
drosophile produit des siRNA spécifiques du génome viral en réponse à l’infection, et si ces
siRNA se trouvent capturés par nos suppresseurs lors de l’infection virale.
- Quelles sont les dérepressions génétiques induites par les suppresseurs viraux ?
L’on attend que l’inhibition des siRNA endogènes par les suppresseurs B2 et P19 interfère
avec la fonction du gène Suppressor of Stellate, qui contrôle négativement le gène Stellate.
Nous savons déjà que les adultes exprimant les supresseurs P19 et B2 sont très peu fertiles,
ce qui s’accorde bien avec une dérégulation du système Stellate/Suppressor of Stellate. Nous
allons cependant analyser plus en détail cette prédiction en mesurant le niveau d’expression
du gène Stellate par RT-PCR et western blot. Nous souhaitons surtout tirer un plus large
parti des suppresseurs en analysant de façon exhaustive quels sont les gènes dont
73
l’expression est modifiée en présence des inhibiteurs de RNAi. Nous réaliserons cette
analyse en utilisant des puces à ADN Affymetrix®, et nous confirmerons pour les candidats
dérégulés qu’il existe bien un pool de siRNA ciblant normalement leur répression. Nous
espérons par cette approche évaluer le nombre de gènes qui sont, de façon similaire à
Stellate, contrôlés par RNAi.
- Rôle des siRNA (rasiRNA) dans le contrôle de la structure chromatinienne.
Contrairement à la situation rencontrée chez les plantes et S. pombe, l’implication des
petits ARN dans une répression au niveau transcriptionnel (TGS) ou dans une modulation de
la structure chromatinienne n’est pas encore appuyée par des arguments directs. De façon
très intéressante, le ciblage de la protéine P19 dans le noyau, par fusion à une séquence nls
d’adressage nucléaire, induit une inhibition du TGS chez la plante Arabidopsis (Papp et al.,
2003). Nous pensons donc qu’une protéine de fusion nls-P19 pourrait nous aider à mettre
en évidence de façon directe un phénomène de TGS guidé par petits ARN chez la
drosophile. Nous avons déjà établi des lignées transgéniques pour cet inhibiteur ciblé dans le
noyau, et nous sommes en train actuellement d’étudier si son expression dans les glandes
salivaires modifie les localisations cytogénétiques des résidus d’histones H3-meK9 et H3meK27, ou de la protéine HP1, marqueur de l’hétérochromatine. Dans une approche
complémentaire, nous envisageons de comparer à l’aide de puces à ADN des animaux
contrôle avec des animaux exprimant l’inhibiteur nls-P19. Si cette protéine inhibe la
répression transcriptionnelle de locus endogènes, nous devrions observer leur réactivation.
En parallèle à ces expériences, nous allons maintenant tester les transgènes UAS-IR que
nous avons ciblés contre des régions régulatrices de Gcn5 et Ubx (voir section précédente).
La répression de ces cibles apporterait une autre preuve de l’existence d’un mécanisme
de répression transcriptionnelle guidée par des siRNA. Nous testerions le cas échéant si elle
s’accompagne de modifications au niveau des histones, d’un recrutement de HP1, et bien sûr
si cette répression est affectée par les suppresseurs de RNAi et en particulier par la protéine
nls-P19.
6.6.2. Identification et la caractérisation des miRNA impliqués dans la
métamorphose.
Bien que les approches par clonage/séquençage ou par bioinformatique aient permis
d’isoler un nombre significatif de miRNA, des études récentes suggèrent que le nombre de
miRNA est encore sous-estimés à l’heure actuelle, chez les vertébrés comme chez la
drosophile. Par ailleurs, l’identification des cibles des miRNA est une tache très difficile, car
74
ils ne s’apparient pas parfaitement avec celles-ci. Ces aspects font que les rôles des miRNA
dans la régulation de nombreux processus biologiques, bien qu’anticipés, restent encore à
démontrer. Nous avons choisi d’aborder le rôle des miRNA dans notre processus favori,
celui du déclenchement de la métamorphose par l’hormone ecdysone. Les approches que
nous avons entreprises pour isoler les miRNA impliqués dans la réponse à l’ecdysone à la fin
du troisième stade larvaire et identifier leurs cibles génétiques sont résumées ci-après.
- le « miRNome » à la transition larvo-pupale.
Nous allons utiliser nos puces LNA pour analyser en détail les profils d’expression des
miRNA à la fin du troisième stade larvaire et durant les 10 heures de la phase prépupale.
Nous rechercherons en particulier (i) les miRNA dont l’expression est induite par les pics
d’ecdysone qui interviennent pendant cette période (ii) les miRNA dont l’expression suit
l’induction des régulateurs précoces E74, E75, DHR3 et bFTZ-F1, activés au cours de la
cascade ecdysone (Fig. 2). Une analyse comparative avec des animaux dans lesquels nous
avons inhibé la réponse à l’ecdysone (par exemple en utilisant nos lignées UAS-IR[EcR]), ou
dans des cellules cultivées en présence ou en absence d’ecdysone sera entreprise avec de
valider et de caractériser les miRNA candidats. Il est à noter qu’étant directement impliqué
dans la fabrication des puces LNA à l’Institut Pasteur, nous pouvons facilement mettre à jour
le jeu de miRNA analysables, pour y intégrer de nouvelles espèces identifiées par clonage
(voir ci-dessous) ou analyse bioinformatique.
- Des inhibiteurs pour capturer des miRNA dans des tissus particuliers ?
L’affinité de la protéine P19 pour les petits ARN double-brin a déjà été utilisé pour
immunoprécipiter des miRNA, avant leur dissociation en simple brin dans le complexe RISC,
à partir de lysats de cellules de mammifère (Dunoyer et al., 2004). Nous allons déterminer si
ce suppresseur peut également être utilisé comme « piège à miRNA » chez la drosophile. Le
cas échéant cette caractéristique pourrait être utilisée pour diriger P19 dans un tissu
particulier de l’animal au moment de la métamorphose et capturer les miRNA exprimés dans
ce tissu. Ces espèces pourraient alors être marquées par fluorescence et utilisées comme
sonde dans une hybridation avec nos puces à LNA. Cette procédure pourrait ouvrir la
possibilité d’analyses du miRNome ciblées à un seul tissu pendant la métamorphose. Les
miRNA capturés pourraient également être directement clonés et séquencés, permettant
l’identification d’espèces de miRNA qui ont jusque-là échappé aux méthodes standard de
clonage à partir d’ARN totaux, parce qu’ils sont exprimés dans un ensemble trop restreint
de tissus.
75
- Une alternative possible pour caractériser les cibles des miRNA.
Une étude récente est venue remettre en cause le « dogme » selon lequel les miRNA
agiraient en inhibant la traduction de leurs cibles. En effet, la transfection et l’expression dans
des cellules de mammifères de deux miRNA différents, miR-1 et miR-124, induit de façon
très significative la dégradation d’un ensemble spécifique de transcrits cibles, associée
respectivement à une différenciation musculaire ou neuronale (Lim et al., 2005). Cette étude
a ainsi apporté une preuve supplémentaire et élégante du rôle des miRNA dans
l’établissement de l’identité cellulaire.
Une approche similaire dans des drosophiles transgéniques pourrait fournir des données
essentielles pour identifier les cibles des miRNA et caractériser leur fonction au cours du
développement et de la différenciation. Ainsi, les miRNA remplissant une fonction au cours
de la métamorphose seront clonés dans un vecteur de transgenèse permettant leur
expression conditionnelle en présence du facteur GAL4. L’effet phénotypique de cette
surexpression permettra évidemment d’ajouter des éléments de compréhension à la
fonction de ces miRNA, comme cela a déjà été montré par exemple dans le cas de la
surexpression du miRNA bantam. Mais il sera également possible d’effectuer une analyse à
large échelle de l’effet de cette surexpression sur le transcriptome. S’il se confirme chez la
drosophile que les miRNA agissent également en déstabilisant leurs cibles et en provoquant
leur dégradation, cette approche pourrait permettre une identification directe de ces cibles,
permettant de valider les prédictions déjà réalisées par méthodes informatiques in silico.
76
7. Références Bibliographiques
Adams, M. D., and Sekelsky, J. J. (2002). From sequence to phenotype: reverse genetics in Drosophila
melanogaster. Nat Rev Genet 3, 189-198.
Agalioti, T., Chen, G., and Thanos, D. (2002). Deciphering the transcriptional histone acetylation code for a
human gene. Cell 111, 381-392.
Alvarez-Garcia, I., and Miska, E. A. (2005). MicroRNA functions in animal development and human disease.
Development 132, 4653-4662.
Andres, A. J., Fletcher, J. C., Karim, F. D., and Thummel, C. S. (1993). Molecular analysis of the initiation of
insect metamorphosis: a comparative study of Drosophila ecdysteroid-regulated transcription. Dev Biol
160, 388-404.
Andres, A. J., and Thummel, C. S. (1992). Hormones, Puffs and flies : the molecular control of metamorphosis
by ecdysone. Trends Genet 8, 132-138.
Antoniewski, C., Laval, M., Dahan, A., and Lepesant, J. A. (1994). The ecdysone response enhancer of the Fbp1
gene of Drosophila melanogaster is a direct target for the EcR/USP nuclear receptor. Mol Cell Biol 14,
4465-4474.
Antoniewski, C., Laval, M., and Lepesant, J.-A. (1993). Structural features critical to the activity of an ecdysone
receptor binding site. Insect Biochem Molec Biol 23, 105-114.
Aravin, A. A., Klenov, M. S., Vagin, V. V., Bantignies, F., Cavalli, G., and Gvozdev, V. A. (2004). Dissection of a
natural RNA silencing process in the Drosophila melanogaster germ line. Mol Cell Biol 24, 6742-6750.
Aravin, A. A., Lagos-Quintana, M., Yalcin, A., Zavolan, M., Marks, D., Snyder, B., Gaasterland, T., Meyer, J., and
Tuschl, T. (2003). The small RNA profile during Drosophila melanogaster development. Dev Cell 5, 337350.
Aravin, A. A., Naumova, N. M., Tulin, A. V., Vagin, V. V., Rozovsky, Y. M., and Gvozdev, V. A. (2001). Doublestranded RNA-mediated silencing of genomic tandem repeats and transposable elements in the D.
melanogaster germline. Curr Biol 11, 1017-1027.
Ashburner, M. (1972). Pattern of puffing activity in the salivary gland chromosomes of Drosophila. VI. Induction
by ecdysone in salivary glands of D. melanogaster cultured in vitro. Chromosoma 38, 255-281.
Aufsatz, W., Mette, M. F., Matzke, A. J., and Matzke, M. (2004). The role of MET1 in RNA-directed de novo and
maintenance methylation of CG dinucleotides. Plant Mol Biol 54, 793-804.
Badenhorst, P., Voas, M., Rebay, I., and Wu, C. (2002). Biological functions of the ISWI chromatin remodeling
complex NURF. Genes Dev 16, 3186-3198.
Bayer, C. A., von Kalm, L., and Fristrom, J. W. (1997). Relationships between protein isoforms and genetic
functions demonstrate functional redundancy at the Broad-Complex during Drosophila metamorphosis.
Dev Biol 187, 267-282.
Beckstead, R., Ortiz, J. A., Sanchez, C., Prokopenko, S. N., Chambon, P., Losson, R., and Bellen, H. J. (2001).
Bonus, a Drosophila homolog of TIF1 proteins, interacts with nuclear receptors and can inhibit betaFTZ-F1dependent transcription. Mol Cell 7, 753-765.
Beckstead, R. B., Ner, S. S., Hales, K. G., Grigliatti, T. A., Baker, B. S., and Bellen, H. J. (2005). Bonus, a
Drosophila TIF1 homolog, is a chromatin-associated protein that acts as a modifier of position-effect
variegation. Genetics 169, 783-794.
Bhaumik, S. R., and Green, M. R. (2001). SAGA is an essential in vivo target of the yeast acidic activator Gal4p.
Genes Dev 15, 1935-1945.
Brennecke, J., Hipfner, D. R., Stark, A., Russell, R. B., and Cohen, S. M. (2003). bantam encodes a
developmentally regulated microRNA that controls cell proliferation and regulates the proapoptotic gene
hid in Drosophila. Cell 113, 25-36.
Broadus, J., McCabe, J. R., Endrizzi, B., Thummel, C. S., and Woodard, C. T. (1999). The Drosophila beta FTZF1 orphan nuclear receptor provides competence for stage-specific responses to the steroid hormone
ecdysone. Mol Cell 3, 143-149.
Brock, H. W., and van Lohuizen, M. (2001). The Polycomb group--no longer an exclusive club? Curr Opin
Genet Dev 11, 175-181.
Brodu, V., Mugat, B., Fichelson, P., Lepesant, J. A., and Antoniewski, C. (2001). A UAS site substitution
approach to the in vivo dissection of promoters: interplay between the GATAb activator and the AEF-1
repressor at a Drosophila ecdysone response unit. Development 128, 2593-2602.
Brodu, V., Mugat, B., Roignant, J. Y., Lepesant, J. A., and Antoniewski, C. (1999). Dual requirement for the
EcR/USP nuclear receptor and the dGATAb factor in an ecdysone response in Drosophila melanogaster.
Mol Cell Biol 19, 5732-5742.
77
Brownell, J. E., Zhou, J., Ranalli, T., Kobayashi, R., Edmondson, D. G., Roth, S. Y., and Allis, C. D. (1996).
Tetrahymena histone acetyltransferase A: a homolog to yeast Gcn5p linking histone acetylation to gene
activation. Cell 84, 843-851.
Burtis, K. C., Thummel, C. S., Jones, C. W., Karim, F. D., and Hogness, D. S. (1990). The Drosophila 74EF early
puff contains E74, a complex ecdysone-inducible gene that encodes two ets-related proteins. Cell 61, 85-99.
Carre, C., Szymczak, D., Pidoux, J., and Antoniewski, C. (2005). The Histone H3 Acetylase dGcn5 Is a Key
Player in Drosophila melanogaster Metamorphosis. Mol Cell Biol 25, 8228-8238.
Charles, J. P., Chihara, C., Nejad, S., and Riddiford, L. M. (1998). Identification of proteins and developmental
expression of RNAs encoded by the 65A cuticle protein gene cluster in Drosophila melanogaster. Insect
Biochem Mol Biol 28, 131-138.
Colombani, J., Bianchini, L., Layalle, S., Pondeville, E., Dauphin-Villemant, C., Antoniewski, C., Carre, C., Noselli,
S., and Leopold, P. (2005). Antagonistic Actions of Ecdysone and Insulins Determine Final Size in
Drosophila. Science.
Cosma, M. P., Panizza, S., and Nasmyth, K. (2001). Cdk1 triggers association of RNA polymerase to cell cycle
promoters only after recruitment of the mediator by SBF. Mol Cell 7, 1213-1220.
Crossgrove, K., Bayer, C. A., Fristrom, J. W., and Guild, G. M. (1996). The Drosophila Broad-Complex early
gene directly regulates late gene transcription during the ecdysone-induced puffing cascade. Dev Biol 180,
745-758.
Delattre, M., Spierer, A., Jaquet, Y., and Spierer, P. (2004). Increased expression of Drosophila Su(var)3-7
triggers Su(var)3-9-dependent heterochromatin formation. J Cell Sci 117, 6239-6247.
Deng, H., Zhang, W., Bao, X., Martin, J. N., Girton, J., Johansen, J., and Johansen, K. M. (2005). The JIL-1 kinase
regulates the structure of Drosophila polytene chromosomes. Chromosoma 114, 173-182.
Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., and Hannon, G. J. (2004). Processing of primary
microRNAs by the Microprocessor complex. Nature 432, 231-235.
Deuring, R., Fanti, L., Armstrong, J. A., Sarte, M., Papoulas, O., Prestel, M., Daubresse, G., Verardo, M.,
Moseley, S. L., Berloco, M., et al. (2000). The ISWI chromatin-remodeling protein is required for gene
expression and the maintenance of higher order chromatin structure in vivo. Mol Cell 5, 355-365.
Dhalluin, C., Carlson, J. E., Zeng, L., He, C., Aggarwal, A. K., and Zhou, M. M. (1999). Structure and ligand of a
histone acetyltransferase bromodomain. Nature 399, 491-496.
DiBello, P. R., Withers, D. A., Bayer, C. A., Fristrom, J. W., and Guild, G. M. (1991). The Drosophila BroadComplex encodes a family of related proteins containing zinc fingers. Genetics 129, 385-397.
Dilworth, F. J., Fromental-Ramain, C., Yamamoto, K., and Chambon, P. (2000). ATP-driven chromatin
remodeling activity and histone acetyltransferases act sequentially during transactivation by RAR/RXR In
vitro. Mol Cell 6, 1049-1058.
Dou, Y., Milne, T. A., Tackett, A. J., Smith, E. R., Fukuda, A., Wysocka, J., Allis, C. D., Chait, B. T., Hess, J. L.,
and Roeder, R. G. (2005). Physical association and coordinate function of the H3 K4 methyltransferase
MLL1 and the H4 K16 acetyltransferase MOF. Cell 121, 873-885.
Du, T., and Zamore, P. D. (2005). microPrimer: the biogenesis and function of microRNA. Development 132,
4645-4652.
Dunoyer, P., Lecellier, C. H., Parizotto, E. A., Himber, C., and Voinnet, O. (2004). Probing the microRNA and
small interfering RNA pathways with virus-encoded suppressors of RNA silencing. Plant Cell 16, 1235-1250.
Falb, D., and Maniatis, T. (1992a). A conserved regulatory unit implicated in tissue-specific gene expression in
Drosophila and man. Genes Dev 6, 454-465.
Falb, D., and Maniatis, T. (1992b). Drosophila transcriptional repressor protein that binds specifically to
negative control elements in fat body enhancers. Mol Cell Biol 12, 4093-4103.
Faucheux, M., Netter, S., Bloyer, S., Moussa, M., Boissonneau, E., Lemeunier, F., Wegnez, M., and Théodore, L.
(2000). Advantages of a P-element construct containing MtnA sequences for the identification of patterning
and cell determination genes in Drosophila melanogaster. Mol Gen Genomics 265, 14-22.
Faucheux, M., Roignant, J. Y., Netter, S., Charollais, J., Antoniewski, C., and Theodore, L. (2003). batman
Interacts with Polycomb and trithorax Group Genes and Encodes a BTB/POZ Protein That Is Included in a
Complex Containing GAGA Factor. Mol Cell Biol 23, 1181-1195.
Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., and Mello, C. C. (1998). Potent and specific
genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-811.
Fischle, W., Wang, Y., and Allis, C. D. (2003). Binary switches and modification cassettes in histone biology and
beyond. Nature 425, 475-479.
Forstemann, K., Tomari, Y., Du, T., Vagin, V. V., Denli, A. M., Bratu, D. P., Klattenhoff, C., Theurkauf, W. E.,
and Zamore, P. D. (2005). Normal microRNA Maturation and Germ-Line Stem Cell Maintenance Requires
Loquacious, a Double-Stranded RNA-Binding Domain Protein. PLoS Biol 3, e236.
78
Gates, J., Lam, G., Ortiz, J. A., Losson, R., and Thummel, C. S. (2004). rigor mortis encodes a novel nuclear
receptor interacting protein required for ecdysone signaling during Drosophila larval development.
Development 131, 25-36.
Goodman, R. H., and Smolik, S. (2000). CBP/p300 in cell growth, transformation, and development. Genes Dev
14, 1553-1577.
Grant, P. A., Duggan, L., Cote, J., Roberts, S. M., Brownell, J. E., Candau, R., Ohba, R., Owen-Hughes, T., Allis,
C. D., Winston, F., et al. (1997). Yeast Gcn5 functions in two multisubunit complexes to acetylate
nucleosomal histones: characterization of an Ada complex and the SAGA (Spt/Ada) complex. Genes Dev
11, 1640-1650.
Gregory, R. I., Yan, K. P., Amuthan, G., Chendrimada, T., Doratotaj, B., Cooch, N., and Shiekhattar, R. (2004).
The Microprocessor complex mediates the genesis of microRNAs. Nature 432, 235-240.
Grishok, A., Pasquinelli, A. E., Conte, D., Li, N., Parrish, S., Ha, I., Baillie, D. L., Fire, A., Ruvkun, G., and Mello,
C. C. (2001). Genes and mechanisms related to RNA interference regulate expression of the small
temporal RNAs that control C. elegans developmental timing. Cell 106, 23-34.
Harbison, C. T., Gordon, D. B., Lee, T. I., Rinaldi, N. J., Macisaac, K. D., Danford, T. W., Hannett, N. M., Tagne,
J. B., Reynolds, D. B., Yoo, J., et al. (2004). Transcriptional regulatory code of a eukaryotic genome. Nature
431, 99-104.
Hassan, A. H., Neely, K. E., and Workman, J. L. (2001). Histone acetyltransferase complexes stabilize swi/snf
binding to promoter nucleosomes. Cell 104, 817-827.
Hassan, A. H., Prochasson, P., Neely, K. E., Galasinski, S. C., Chandy, M., Carrozza, M. J., and Workman, J. L.
(2002). Function and selectivity of bromodomains in anchoring chromatin-modifying complexes to
promoter nucleosomes. Cell 111, 369-379.
Hatfield, S. D., Shcherbata, H. R., Fischer, K. A., Nakahara, K., Carthew, R. W., and Ruohola-Baker, H. (2005).
Stem cell division is regulated by the microRNA pathway. Nature 435, 974-978.
Hou, X. S., Melnick, M. B., and Perrimon, N. (1996). Marelle acts downstream of the Drosophila HOP/JAK
kinase and encodes a protein similar to the mammalian STATs. Cell 84, 411-419.
Huisinga, K. L., and Pugh, B. F. (2004). A genome-wide housekeeping role for TFIID and a highly regulated
stress-related role for SAGA in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell 13, 573-585.
Hutvagner, G., McLachlan, J., Pasquinelli, A. E., Balint, E., Tuschl, T., and Zamore, P. D. (2001). A cellular
function for the RNA-interference enzyme Dicer in the maturation of the let-7 small temporal RNA.
Science 293, 834-838.
Ito, T., Bulger, M., Pazin, M. J., Kobayashi, R., and Kadonaga, J. T. (1997). ACF, an ISWI-containing and ATPutilizing chromatin assembly and remodeling factor. Cell 90, 145-155.
Jacobson, R. H., Ladurner, A. G., King, D. S., and Tjian, R. (2000). Structure and function of a human TAFII250
double bromodomain module. Science 288, 1422-1425.
Kanno, T., Kanno, Y., Siegel, R. M., Jang, M. K., Lenardo, M. J., and Ozato, K. (2004). Selective recognition of
acetylated histones by bromodomain proteins visualized in living cells. Mol Cell 13, 33-43.
Karim, F. D., Guild, G. M., and Thummel, C. S. (1993). The Drosophila Broad-Complex plays a key role in
controlling ecdysone-regulated gene expression at the onset of metamorphosis. Development 118, 977988.
Karim, F. D., and Thummel, C. S. (1991). Ecdysone coordinates the timing and amounts of E74A and E74B
transcription in Drosophila. Genes Dev 5, 1067-1079.
Karim, F. D., and Thummel, C. S. (1992). Temporal coordination of regulatory gene expression by the steroid
hormone ecdysone. EMBO J 11, 4083-4093.
Kennerdell, J. R., and Carthew, R. W. (1998). Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that
frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell 95, 1017-1026.
Koelle, M. R., Talbot, W. S., Segraves, W. A., Bender, M. T., Cherbas, P., and Hogness, D. S. (1991). The
drosophila EcR gene encodes an ecdysone receptor, a new member of the steroid receptor superfamily.
Cell 67, 59-77.
Kumar, J. P., Jamal, T., Doetsch, A., Turner, F. R., and Duffy, J. B. (2004). CREB binding protein functions during
successive stages of eye development in Drosophila. Genetics 168, 877-893.
Kuo, M. H., Brownell, J. E., Sobel, R. E., Ranalli, T. A., Cook, R. G., Edmondson, D. G., Roth, S. Y., and Allis, C.
D. (1996). Transcription-linked acetylation by Gcn5p of histones H3 and H4 at specific lysines. Nature 383,
269-272.
Kuo, M. H., vom Baur, E., Struhl, K., and Allis, C. D. (2000). Gcn4 activator targets Gcn5 histone
acetyltransferase to specific promoters independently of transcription. Mol Cell 6, 1309-1320.
Kurdistani, S. K., Tavazoie, S., and Grunstein, M. (2004). Mapping global histone acetylation patterns to gene
expression. Cell 117, 721-733.
Kusch, T., Guelman, S., Abmayr, S. M., and Workman, J. L. (2003). Two Drosophila Ada2 homologues function
in different multiprotein complexes. Mol Cell Biol 23, 3305-3319.
79
Lai, E. C. (2005). miRNAs: whys and wherefores of miRNA-mediated regulation. Curr Biol 15, R458-460.
Lam, G. T., Jiang, C., and Thummel, C. S. (1997). Coordination of larval and prepupal gene expression by the
DHR3 orphan receptor during Drosophila metamorphosis. Development 124, 1757-1769.
Larschan, E., and Winston, F. (2001). The S. cerevisiae SAGA complex functions in vivo as a coactivator for
transcriptional activation by Gal4. Genes Dev 15, 1946-1956.
Laval, M., Pourrain, F., Deutsch, J., and Lepesant, J. A. (1993). In vivo functional characterization of an ecdysoneresponse enhancer in the proximal upstream region of the Fbp1 gene of D. melanogaster. Mech Dev 44, 123138.
Lee, R. C., Feinbaum, R. L., and Ambros, V. (1993). The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small
RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell 75, 843-854.
Lee, Y., Ahn, C., Han, J., Choi, H., Kim, J., Yim, J., Lee, J., Provost, P., Radmark, O., Kim, S., and Kim, V. N.
(2003). The nuclear RNase III Drosha initiates microRNA processing. Nature 425, 415-419.
Lepesant, J. A., Kejzlarovà-Lepesant, J., and Garen, A. (1978). Ecdysone-inducible functions of larval fat bodies in
Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA 75, 5570-5574.
Lepesant, J. A., Maschat, F., Kejzlarovà-Lepesant, J., Benes, H., and Yanicostas, C. (1986). Developmental and
ecdysteroid regulation of gene expression in the larval fat body of Drosophila melanogaster. Arch Insect
Biochem Physiol s1, 133-141.
Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P., Grimson, A., Schelter, J. M., Castle, J., Bartel, D. P., Linsley, P. S., and
Johnson, J. M. (2005). Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of
target mRNAs. Nature 433, 769-773.
Liu, J., Carmell, M. A., Rivas, F. V., Marsden, C. G., Thomson, J. M., Song, J. J., Hammond, S. M., Joshua-Tor, L.,
and Hannon, G. J. (2004). Argonaute2 is the catalytic engine of mammalian RNAi. Science 305, 1437-1441.
Ludlam, W. H., Taylor, M. H., Tanner, K. G., Denu, J. M., Goodman, R. H., and Smolik, S. M. (2002). The
acetyltransferase activity of CBP is required for wingless activation and H4 acetylation in Drosophila
melanogaster. Mol Cell Biol 22, 3832-3841.
Lund, A. H., and van Lohuizen, M. (2004). Polycomb complexes and silencing mechanisms. Curr Opin Cell Biol
16, 239-246.
Martinez, E., Palhan, V. B., Tjernberg, A., Lymar, E. S., Gamper, A. M., Kundu, T. K., Chait, B. T., and Roeder, R.
G. (2001). Human STAGA complex is a chromatin-acetylating transcription coactivator that interacts with
pre-mRNA splicing and DNA damage-binding factors in vivo. Mol Cell Biol 21, 6782-6795.
Maschat, F., Roux, J., Benes, H., Pictet, R., Jami, J., and Lepesant, J. A. (1986). Hormonal and developmental
specificities of transcription lie within a 1.5 kb region 5' to the inducible Drosophila P1 gene. EMBO J 5, 583588.
Meister, G., Landthaler, M., Patkaniowska, A., Dorsett, Y., Teng, G., and Tuschl, T. (2004). Human Argonaute2
mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs. Mol Cell 15, 185-197.
Miyoshi, K., Tsukumo, H., Nagami, T., Siomi, H., and Siomi, M. C. (2005). Slicer function of Drosophila
Argonautes and its involvement in RISC formation. Genes Dev 19, 2837-2848.
Mugat, B., Brodu, V., Kejzlarova-Lepesant, J., Antoniewski, C., Bayer, C. A., Fristrom, J. W., and Lepesant, J. A.
(2000). Dynamic expression of broad-complex isoforms mediates temporal control of an ecdysteroid target
gene at the onset of drosophila metamorphosis [In Process Citation]. Dev Biol 227, 104-117.
Muratoglu, S., Georgieva, S., Papai, G., Scheer, E., Enunlu, I., Komonyi, O., Cserpan, I., Lebedeva, L.,
Nabirochkina, E., Udvardy, A., et al. (2003). Two different Drosophila ADA2 homologues are present in
distinct GCN5 histone acetyltransferase-containing complexes. Mol Cell Biol 23, 306-321.
Noma, K., Sugiyama, T., Cam, H., Verdel, A., Zofall, M., Jia, S., Moazed, D., and Grewal, S. I. (2004). RITS acts in
cis to promote RNA interference-mediated transcriptional and post-transcriptional silencing. Nat Genet 36,
1174-1180.
Ogryzko, V. V., Kotani, T., Zhang, X., Schlitz, R. L., Howard, T., Yang, X. J., Howard, B. H., Qin, J., and
Nakatani, Y. (1998). Histone-like TAFs within the PCAF histone acetylase complex. Cell 94, 35-44.
Orlando, V. (2003). Polycomb, epigenomes, and control of cell identity. Cell 112, 599-606.
Otte, A. P., and Kwaks, T. H. (2003). Gene repression by Polycomb group protein complexes: a distinct
complex for every occasion? Curr Opin Genet Dev 13, 448-454.
Pal-Bhadra, M., Bhadra, U., and Birchler, J. A. (2002). RNAi related mechanisms affect both transcriptional and
posttranscriptional transgene silencing in Drosophila. Mol Cell 9, 315-327.
Pal-Bhadra, M., Leibovitch, B. A., Gandhi, S. G., Rao, M., Bhadra, U., Birchler, J. A., and Elgin, S. C. (2004).
Heterochromatic silencing and HP1 localization in Drosophila are dependent on the RNAi machinery.
Science 303, 669-672.
Papp, I., Mette, M. F., Aufsatz, W., Daxinger, L., Schauer, S. E., Ray, A., van der Winden, J., Matzke, M., and
Matzke, A. J. (2003). Evidence for nuclear processing of plant micro RNA and short interfering RNA
precursors. Plant Physiol 132, 1382-1390.
80
Patient, R. K., and McGhee, J. D. (2002). The GATA family (vertebrates and invertebrates). Curr Opin Genet
Dev 12, 416-422.
Pelissier, T., and Wassenegger, M. (2000). A DNA target of 30 bp is sufficient for RNA-directed DNA
methylation. Rna 6, 55-65.
Pirrotta, V., Poux, S., Melfi, R., and Pilyugin, M. (2003). Assembly of Polycomb complexes and silencing
mechanisms. Genetica 117, 191-197.
Pokholok, D. K., Harbison, C. T., Levine, S., Cole, M., Hannett, N. M., Lee, T. I., Bell, G. W., Walker, K., Rolfe,
P. A., Herbolsheimer, E., et al. (2005). Genome-wide map of nucleosome acetylation and methylation in
yeast. Cell 122, 517-527.
Qiu, P., Pan, P. C., and Govind, S. (1998). A role for the Drosophila Toll/Cactus pathway in larval
hematopoiesis. Development 125, 1909-1920.
Rehorn, K. P., Thelen, H., Michelson, A. M., and Reuter, R. (1996). A molecular aspect of hematopoiesis and
endoderm development common to vertebrates and Drosophila. Development 122, 4023-4031.
Reinking, J., Lam, M. M., Pardee, K., Sampson, H. M., Liu, S., Yang, P., Williams, S., White, W., Lajoie, G.,
Edwards, A., and Krause, H. M. (2005). The Drosophila nuclear receptor e75 contains heme and is gas
responsive. Cell 122, 195-207.
Richards, G. (1976a). Sequential activation by ecdysone in polytene chromosomes of Drosophila melanogaster.
IV. The mid prepupal period. Dev Biol 54, 264-275.
Richards, G. (1976b). Sequential activation by ecdysone in polytene chromosomes of Drosophila melanogaster. V.
The late prepupal period. Dev Biol 54, 264-275.
Roh, T. Y., Cuddapah, S., and Zhao, K. (2005). Active chromatin domains are defined by acetylation islands
revealed by genome-wide mapping. Genes Dev 19, 542-552.
Schubeler, D., MacAlpine, D. M., Scalzo, D., Wirbelauer, C., Kooperberg, C., van Leeuwen, F., Gottschling, D.
E., O'Neill, L. P., Turner, B. M., Delrow, J., et al. (2004). The histone modification pattern of active genes
revealed through genome-wide chromatin analysis of a higher eukaryote. Genes Dev 18, 1263-1271.
Schubiger, M., Carre, C., Antoniewski, C., and Truman, J. W. (2005). Ligand-dependent de-repression via
EcR/USP acts as a gate to coordinate the differentiation of sensory neurons in the Drosophila wing.
Development, 5239-5248.
Segraves, W. A., and Hogness, D. S. (1990). The E75 ecdysone-inducible gene responsible for the 75B early puff
in Drosophila encodes two members of the steroid receptor superfamily. Genes Dev 4, 204-219.
Shiio, Y., and Eisenman, R. N. (2003). Histone sumoylation is associated with transcriptional repression. Proc
Natl Acad Sci U S A 100, 13225-13230.
Sims, R. J., 3rd, Nishioka, K., and Reinberg, D. (2003). Histone lysine methylation: a signature for chromatin
function. Trends Genet 19, 629-639.
Smith, E. R., Belote, J. M., Schiltz, R. L., Yang, X. J., Moore, P. A., Berger, S. L., Nakatani, Y., and Allis, C. D.
(1998). Cloning of Drosophila GCN5: conserved features among metazoan GCN5 family members. Nucleic
Acids Res 26, 2948-2954.
Smith, S. T., Petruk, S., Sedkov, Y., Cho, E., Tillib, S., Canaani, E., and Mazo, A. (2004). Modulation of heat shock
gene expression by the TAC1 chromatin-modifying complex. Nat Cell Biol 6, 162-167.
Song, J. J., Liu, J., Tolia, N. H., Schneiderman, J., Smith, S. K., Martienssen, R. A., Hannon, G. J., and Joshua-Tor,
L. (2003). The crystal structure of the Argonaute2 PAZ domain reveals an RNA binding motif in RNAi
effector complexes. Nat Struct Biol 10, 1026-1032.
Song, J. J., Smith, S. K., Hannon, G. J., and Joshua-Tor, L. (2004). Crystal structure of Argonaute and its
implications for RISC slicer activity. Science 305, 1434-1437.
St Johnston, D. (2002). The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nat Rev Genet 3, 176188.
Stowers, R. S., Garza, D., Rascle, A., and Hogness, D. S. (2000). The L63 gene is necessary for the ecdysoneinduced 63E late puff and encodes CDK proteins required for Drosophila development. Dev Biol 221, 2340.
Strahl, B. D., and Allis, C. D. (2000). The language of covalent histone modifications. Nature 403, 41-45.
Sun, Z. W., and Allis, C. D. (2002). Ubiquitination of histone H2B regulates H3 methylation and gene silencing
in yeast. Nature 418, 104-108.
Tamkun, J. W., Deuring, R., Scott, M. P., Kissinger, M., Pattatucci, A. M., Kaufman, T. C., and Kennison, J. A.
(1992). Brahma: a regulator of Drosophila homeotic genes structurally related to the yeast transcriptional
activator SNF2/SWI2. Cell 68, 561-572.
Tavernarakis, N., Wang, S. L., Dorovkov, M., Ryazanov, A., and Driscoll, M. (2000). Heritable and inducible
genetic interference by double-stranded RNA encoded by transgenes. Nat Genet 24, 180-183.
Thummel, C. S. (1997). Dueling orphans--interacting nuclear receptors coordinate Drosophila metamorphosis.
Bioessays 19, 669-672.
Tomari, Y., and Zamore, P. D. (2005). Perspective: machines for RNAi. Genes Dev 19, 517-529.
81
Tsukiyama, T., Daniel, C., Tamkun, J., and Wu, C. (1995). ISWI, a member of the SWI2/SNF2 ATPase family,
encodes the 140 kDa subunit of the nucleosome remodeling factor. Cell 83, 1021-1026.
Varga-Weisz, P. D., Wilm, M., Bonte, E., Dumas, K., Mann, M., and Becker, P. B. (1997). Chromatin-remodelling
factor CHRAC contains the ATPases ISWI and topoisomerase II. Nature 388, 598-602.
Verdel, A., Jia, S., Gerber, S., Sugiyama, T., Gygi, S., Grewal, S. I., and Moazed, D. (2004). RNAi-mediated
targeting of heterochromatin by the RITS complex. Science 303, 672-676.
Voinnet, O. (2005). Induction and suppression of RNA silencing: insights from viral infections. Nat Rev Genet 6,
206-220.
Volpe, T. A., Kidner, C., Hall, I. M., Teng, G., Grewal, S. I., and Martienssen, R. A. (2002). Regulation of
heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi. Science 297, 1833-1837.
Wang, Y., Zhang, W., Jin, Y., Johansen, J., and Johansen, K. M. (2001). The JIL-1 tandem kinase mediates histone
H3 phosphorylation and is required for maintenance of chromatin structure in Drosophila. Cell 105, 433443.
White, K. P., Hurban, P., Watanabe, T., and Hogness, D. S. (1997). Coordination of Drosophila metamorphosis
by two ecdysone-induced nuclear receptors. Science 276, 114-117.
Wieczorek, E., Brand, M., Jacq, X., and Tora, L. (1998). Function of TAF(II)-containing complex without TBP in
transcription by RNA polymerase II. Nature 393, 187-191.
Wienholds, E., Kloosterman, W. P., Miska, E., Alvarez-Saavedra, E., Berezikov, E., de Bruijn, E., Horvitz, H. R.,
Kauppinen, S., and Plasterk, R. H. (2005). MicroRNA expression in zebrafish embryonic development.
Science 309, 310-311.
Wright, L. G., Chen, T., Thummel, C. S., and Guild, G. M. (1996). Molecular characterization of the 71E late
puff in Drosophila melanogaster reveals a family of novel genes. J Mol Biol 255, 387-400.
Wysocka, J., Swigut, T., Milne, T. A., Dou, Y., Zhang, X., Burlingame, A. L., Roeder, R. G., Brivanlou, A. H., and
Allis, C. D. (2005). WDR5 associates with histone H3 methylated at K4 and is essential for H3 K4
methylation and vertebrate development. Cell 121, 859-872.
Yanagisawa, J., Kitagawa, H., Yanagida, M., Wada, O., Ogawa, S., Nakagomi, M., Oishi, H., Yamamoto, Y.,
Nagasawa, H., McMahon, S. B., et al. (2002). Nuclear receptor function requires a TFTC-type histone acetyl
transferase complex. Mol Cell 9, 553-562.
Yang, X. J. (2004). Lysine acetylation and the bromodomain: a new partnership for signaling. Bioessays 26,
1076-1087.
Yang, X. J., Ogryzko, V. V., Nishikawa, J., Howard, B. H., and Nakatani, Y. (1996). A p300/CBP-associated factor
that competes with the adenoviral oncoprotein E1A. Nature 382, 319-324.
Yao, T. P., Forman, B. M., Jiang, Z., Cherbas, L., Chen, J.-D., McKeown, M., Cherbas, P., and Evans, R. M. (1993).
Functional ecdysone receptor is the product of EcR and Ultraspiracle genes. Nature 336, 476-479.
Yin, V. P., and Thummel, C. S. (2005). Mechanisms of steroid-triggered programmed cell death in Drosophila.
Semin Cell Dev Biol 16, 237-243.
Yuan, Y. R., Pei, Y., Ma, J. B., Kuryavyi, V., Zhadina, M., Meister, G., Chen, H. Y., Dauter, Z., Tuschl, T., and
Patel, D. J. (2005). Crystal structure of A. aeolicus argonaute, a site-specific DNA-guided endoribonuclease,
provides insights into RISC-mediated mRNA cleavage. Mol Cell 19, 405-419.
Zamore, P. D., and Haley, B. (2005). Ribo-gnome: the big world of small RNAs. Science 309, 1519-1524.
Zilberman, D., Cao, X., and Jacobsen, S. E. (2003). ARGONAUTE4 control of locus-specific siRNA
accumulation and DNA and histone methylation. Science 299, 716-719.
82