12ème Séminaire Annuel du Centre de Recherche Saint‐Antoine

 12ème Séminaire Annuel du Centre de Recherche Saint‐Antoine 17 ‐ 18 novembre 2016 Château de Montvillargenne Organisateurs Véronique Béréziat François Delhommeau Thomas Falguières Romain Fontaine Christian Gespach Xavier Houard Nicolas Lafon Philippe Le Rouzic Michèle Sabbah Joelle Sobczak Ibrahima Thiam Partenaires commerciaux JEUDI 17 NOVEMBRE 2016 8h30 ‐ 9h15 ACCUEIL DES PARTICIPANTS, CAFÉ & VIENNOISERIES 9h15‐ 9h30 Ouverture du séminaire annuel : Bruno FEVE, directeur du CRSA SESSION 1 MODÉRATEURS : Thomas Falguières, Sarah Guégan 9h30 ‐ 10h10 Harriet CORVOL Présentation d’équipe : Mucoviscidose : physiopathologie et phénogenomique 10h10 ‐ 10h25 Florence SONNEVILLE (CRSA ‐ Équipe H. Corvol) Etude de la régulation du canal chlorure ANO1 par les microARN chez les patients atteints de mucoviscidose : approche fondamentale et thérapeutique 10h25 ‐ 10h40 Thomas ROUILLE (CRSA ‐ Équipe S. Aractingi / E. Daraï) Varying clonogenic and proliferative potential in NRAS‐mutated congenital melanocytic nevi according to size 10h40 ‐ 10h55 Virginie VAUTHIER (CRSA ‐ Équipe C. Housset) Identification of correcting molecules for defective ABCB4 mutants 10h55 ‐ 11h05 Johnathan LAI (Exiqon) Potent knock down of lncRNAs in vitro and in vivo with antisense LNA™ GapmeRs 11h05 ‐ 11h40 PAUSE CAFÉ & VISITE DES STANDS SESSION 2 MODÉRATEURS : Tounsia Aït‐Slimane, Joelle Sobczak‐Thépot 11h40‐ 11h50 Jan BRANTS (Merck Millipore) The CellAsic® Onix : Precision control of your cell culture environment for advanced live cell imaging and microscopy. 11h50 ‐ 12h05 Grigoris GEROTZIAFAS (CRSA ‐ Équipe A. Larsen / A. de Gramont) L'acquisition du phénotype de la résistance à la doxorubicine des cellules du cancer mammaire MCF7 est associée à l’amplification du potentiel pro‐coagulant 12h05 ‐ 12h20 Maria Luisa PEREZ LOZANO (CRSA ‐ Équipe F. Berenbaum) Mechanical stress as a stimulator of osteochondral angiogenesis in osteoarthritis 12h20 ‐ 12h35 Joëlle SOBCZAK‐THÉPOT (CRSA ‐ Équipe F. Praz / O. Rosmorduc) Role and fate of Mitotic Kinesin‐like protein 2 in Hepatocellular Carcinoma 12h35 ‐ 12h45 Jaen OLIVIER (Beckman Coulter) A new kind of detector in Flow Cytometer: Characteristic, Performance and Benefits 12h45 ‐ 14h20 DÉJEUNER CAFÉ & VISITE DES STANDS 2
SESSION 3 MODÉRATEURS : Michel Chignard, Céline Prunier 14h20 ‐ 15h00 Selim ARACTINGI Présentation d’équipe : Progéniteurs et cellules endothéliales pendant et après la grossesse 15h00 ‐ 15h15 A’dem BOKHARI (CRSA ‐ Équipe A. Duval) Etudes des conséquences cliniques et physiopathologiques de la chaperonne HSP110 dans le cancer colorectal 15h15 ‐ 15h30 Mathieu BOISSAN (CRSA ‐ Équipe F. Praz / O. Rosmorduc) AO interne 2014 : La sénescence cellulaire : un prérequis à l’invasion tumorale ? Rôle du suppresseur de métastase NM23 15h30 ‐ 15h40 Mourad FERHAT (Promega) Nouvelles approches pour le suivi du métabolisme cellulaire 15h40 ‐ 16h20 PAUSE CAFÉ & VISITE DES STANDS SESSION POSTERS 16h20 ‐ 17h45 Jury 1 (posters 1 à 10) Axelle Cadoret, Béatrice Gaugler, Loïc Guillot Jury 2 (posters 11 à 20) Laura Fouassier, Clémence Girardet, Laurence Levy SESSION TABLES RONDES EN PARALLELE 17h45 ‐ 19h15 Plateforme Animalerie Laurent Kappeler, Tatiana Ledent La structure du bien‐être animale au CRSA : son rôle et ses actions ; Demande IBiSA : Réflexion sur les développements technologiques potentiels ; Renouvellement de l’agrément de la PHEA 2017, les justificatifs à fournir par les équipes. Plasticité cellulaire Michèle Sabbah, Laura Fouassier, Corinne Vigouroux, Véronique Béréziat, Claire Lagathu, Christelle Mazurier, Xavier Houard Plasticité tumorale et résistance thérapeutique : Méthode d’identification de cellules souches tumorales dans une population totale de cellules tumorales dans les cancers du sein du sein, colon et cholangiocarcinomes ; Génération de cellules endothéliales à partir d’iPS : un traitement pour les laminopathies ; Caractérisation et différenciation des cellules souches mésenchymateuses ; L’articulation comme modèle d’étude de la plasticité des cellules mésenchymateuses. CONFERENCE D’OUVERTURE SCIENTIFIQUE 19h15 – 20h15 Hedi SOULA (Centre de Recherche des Cordeliers, Paris) Systems physiology: multiscale modelling approaches from channels to organism 20h15 ‐ 20h45 APÉRITIF 20h45 ‐ 22h30 DINER 22h30 ‐ 2h SOIRÉE DANSANTE 3
VENDREDI 18 NOVEMBRE 2016 SESSION 4 MODÉRATEURS : Claire Attali, Romain Fontaine 8h45 ‐ 9h25 François DELHOMMEAU Présentation d’équipe : Prolifération et différenciation des cellules souches : Application à la thérapie cellulaire hématopoïétique 9h25 ‐ 9h40 Laurence GUYONNEAU‐HARMAND (CRSA ‐ Équipe F. Delhommeau) Génération de cellules souches capables de greffes hématopoïétiques à partir de cellules souches pluripotentes induites 9h40 ‐ 9h55 Lauriane ROUX (CRSA ‐ Équipe A. Atfi) Modélisation de l'aniridie, pathologie oculaire congénitale des cellules souches limbiques 9h55 ‐ 10h10 Guillaume DOROTHEE (CRSA ‐ Équipe P. Aucouturier) Immunité cellulaire adaptative et maladie d'Alzheimer : rôle dans la physiopathologie et potentialités thérapeutiques 10h10 ‐ 10h25 Emilien LOEUILLARD (CRSA ‐ Équipe C. Housset) Impact of endoplasmique reticulum stress on portal myofibroblast functions 10h25 ‐ 11h05 PAUSE CAFÉ & VISITE DES STANDS SESSION TABLE RONDE PLENIERE 11h05 ‐ 12h35 Imagerie du petit animal par TEP‐Scan Aurélie Prignon, Marthe Moldes, Francis Berenbaum, Guillaume Dorothée L'imagerie moléculaire par TEP : un outil fonctionnel, non invasif et d'une très grande sensibilité ; Imagerie TEP et exploration fonctionnelle des tissus adipeux brun et « beige » ; Intérêts potentiels de l’imagerie TEP dans l’exploration des pathologies articulaires ; Imagerie TEP et maladie d'Alzheimer. 12h35 ‐ 14h00 DÉJEUNER CAFÉ & VISITE DES STANDS 4
SESSION 5 MODÉRATEURS : Xavier Houard, Olivier Tabary 14h00 ‐ 14h40 Irène NETCHINE Présentation d’équipe : Système IGF et croissance fœtale et post‐natale 14h40 ‐ 14h55 Walid ABI HABIB (CRSA ‐ Équipe Y. Le Bouc / I. Netchine) Genetic disruption of the oncogenic HMGA2‐PLAG1‐IGF2 pathway causes fetal growth restriction 14h55 ‐ 15h10 Malorie GREENE (CRSA ‐ Équipe A. Duval) Conséquences fonctionnelles de l’instabilité microsatellitaire dans la tumorigenèse colorectale : investigation du concept de gènes cibles d’instabilité 15h10 ‐ 15h25 Bruno FÈVE (CRSA ‐ Équipe B. Fève) NOV/CCN3 : une adipokine impliquée dans la résistance à l’insuline et la dépense énergétique 15h25 – 15h45 REMISE DES PRIX Présentation des posters primés CLOTURE DES JOURNÉES RECHERCHE Bruno FEVE 5
12ème séminaire annuel du
Centre de Recherche Saint-Antoine
17 et 18 novembre 2016 – Montvillargenne
Résumés des
communications orales
6
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne Session 1 Etude de la régulation du canal chlorure ANO1 par les microARN chez les patients atteints de mucoviscidose : approche fondamentale et thérapeutique Florence SONNEVILLE M. Ruffin, P. Le Rouzic, S. Blouquit‐Laye, C. Coraux, H. Corvol, O. Tabary CRSA ‐ UMR_S 938 Inserm UPMC ; Eq H. Corvol : Mucoviscidose : physiopathologie et phénogenomique Introduction : La mucoviscidose (CF pour Cystic Fibrosis) est la conséquence de la mutation du gène codant pour le canal chlorure CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator). A l’heure actuelle, près de 2000 mutations du gène CFTR ont été décrites et les stratégies thérapeutiques ne sont efficaces que sur un nombre restreint de patients. En 2008, un nouveau canal chlorure a été identifié au niveau des voies aériennes : le canal ANO1. Ce canal a alors été proposé comme cible thérapeutique pour restaurer les efflux chlorures chez le patient CF de façon indépendante des mutations de CFTR. Des travaux précédents du laboratoire ont montré que l’activité et l’expression d’ANO1 étaient diminuées chez les patients et les souris CF (Ruffin et al., 2013). Pour expliquer cette diminution, nous nous sommes intéressés aux microARN (miRNA), qui sont des régulateurs négatifs de l’expression des gènes. Méthodes : Par l’utilisation de bases de données bio‐informatiques et des analyses préliminaires, nous avons identifié le miR‐9 comme pouvant réguler l’activité d’ANO1. Afin de valider le lien entre ANO1 et ce miRNA, nous avons effectué des expériences de fonctionnalité en étudiant la liaison du miRNA candidat au 3’UTR d’ANO1 en condition de sur‐ ou sous‐expression du miRNA, et en quantifiant l’expression d’ANO1 dans ces mêmes conditions. Résultats : Nos travaux ont montré que le miR‐9 se fixe directement sur le 3’UTR d’ANO1 et induit une inhibition de l’expression et de l’activité d’ANO1. Dans le but de proposer une approche thérapeutique spécifique et utilisable chez le patient, nous avons fait synthétiser une molécule (Brevet N°PCT/FR2015/051850) qui va inhiber la fixation de miR‐9 sur l’ARN d’ANO1. Cette molécule permet de restaurer une expression et une activité « normales » d’ANO1 dans des cultures primaires de patients, mais également chez la souris après instillations intranasales. De plus, nous sommes capables de restaurer d’autres paramètres dérégulés chez les patients CF comme la migration cellulaire et la clairance mucociliaire. Conclusions : Nos résultats montrent clairement que miR‐9 est un des régulateurs négatifs de l’activité d’ANO1 dans la mucoviscidose et participe à la physiopathologie pulmonaire. Nos résultats présentent pour la première fois une nouvelle stratégie thérapeutique ciblant ANO1 qui pourrait être proposée à tous les patients atteints de mucoviscidose. 7
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne Session 1 Varying clonogenic and proliferative potential in NRAS‐mutated congenital melanocytic nevi according to size Thomas ROUILLÉ [1,2] N. Kadlub [4,5], A. Picard [4,5], C. Charbel [1,2], A. Coulomb‐L'Hermine [2,6], A.How‐Kit [7], S. Fraitag [8], S. Aractingi [1,4,9], S. Guégan [1,2,3,†], R. H. Fontaine [1,2,†] 1‐INSERM, U938, Saint‐Antoine Research Center, 75012 Paris, France. 2‐Université Pierre et Marie Curie‐Paris VI, 75005 Paris, France. 3‐Assistance Publique‐Hôpitaux de Paris, Hôpital Tenon, Department of Dermatology, 75020 Paris, France. 4‐Université René Descartes‐Paris V, 75005 Paris, France. 5‐APHP, Hôpital Necker‐Enfants‐Malades, Department of Maxillofacial and Plastic Surgery, 75015 Paris, France. 6‐Assistance Publique‐Hôpitaux de Paris, Hôpital Trousseau, Department of Pathology, 75012 Paris, France. 7‐Laboratory for Functional Genomics, Fondation Jean Dausset – CEPH, Paris, France 8‐APHP, Hôpital Necker‐Enfants‐Malades, Department of Pathology, 75015 Paris, France. 9‐APHP, Hôpital Cochin, Department of Dermatology, 75014 Paris, France. † Both authors contributed equally to this work as senior co‐authors. Congenital melanocytic nevi (CMN) are benign proliferations that may be associated with various consequences depending on their size. They are characterized by a specific molecular signature, namely a post‐zygotic somatic NRAS or BRAF mutation. We have recently reported that large CMN (lCMN), which are classically associated with an increased melanoma risk, harbor cell subpopulations with specific clonogenic and tumorigenic potential. We wished to ascertain whether cells displaying similar properties persisted postnatally in medium CMN (mCMN). Eighteen medium M1, nine large and one giant NRAS‐mutated CMN were prospectively included in the study. Subpopulations of mCMN cells expressed stem cell/progenitor lineage markers such as Sox10, Nestin, and Oct4, as was the case in lCMN. Nevertheless, conversely to lCMN, mCMN cells with clonogenic properties were rarer. In vitro, approximatively 1 in 1500 cells isolated from fresh mCMN formed colonies that could be passaged. In vivo, mCMN seemed to harbor cells with less proliferative potential than the larger lesions as lCMN biopsies displayed a three‐fold expansion compared to mCMN when xenografted in Rag2‐/‐ mice. Thus, our data revealed variations in clonogenicity and tumorigenic properties in NRAS‐mutated CMN according to size. 8
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne Session 1 Identification of correcting molecules for defective ABCB4 mutants Virginie VAUTHIER A.M. Durand‐Schneider, J‐L. Delaunay, T. Aït‐Slimane, C. Housset, T. Falguières CRSA ‐ UMR_S 938 Inserm UPMC ; Eq C. Housset : Pathologies métaboliques, billiaires et fibro‐inflammatoires du foie ABCB4 is a transmembrane protein belonging to the ABC (ATP Binding Cassette) transporter superfamily. It is exclusively expressed at the canalicular membrane of hepatocytes and ensures the translocation of phosphatidylcholine from the inner to the outer leaflet of the canalicular membrane in an energy‐dependent manner. Thereby phosphatidylcholine can interact and form mixed micelles with bile acids and cholesterol in the aqueous environment of bile, thus preventing the detergent action of free bile acids on biological membranes and the formation of cholesterol gallstones. ABCB4 mutations cause rare biliary diseases including Progressive Familial Intrahepatic Cholestasis (PFIC3) which is the most severe. PFIC3 is characterized by the early onset of cholestasis that frequently leads to cirrhosis and liver failure before adulthood. The unique proposed therapy for PFIC3 is the administration of UrsoDeoxyCholic Acid (UDCA), a therapeutic bile acid which partially reverts the symptoms of ABCB4 defects in patients. However, more than half of PFIC3 patients do not respond to UDCA and the only alternative is liver transplantation. Therefore, identification of new molecules with therapeutic potential is a major challenge in order to treat patients with ABCB4‐related diseases who do not or poorly respond to UDCA treatment. Our group proposed a classification of ABCB4 variations according to their functional defect (expression, traffic, activity, stability) (Delaunay et al., Hepatology, 2016). Class II misfolded mutants are retained in the endoplasmic reticulum and are good candidates for correction by pharmacological chaperones. Such compounds able to rescue the cell surface expression of ABCB4 will be sought using a high throughput screening approach on cell models expressing a misfolded ABCB4 mutant identified in PFIC3 patients. Ultimately, the development of new targeted therapies will be a promising alternative to liver transplantation for patients with biliary diseases related to molecular defects due to ABCB4 variations. Moreover, newly identified compounds might also benefit to patients with diseases related to variations in other ABC transporters. 9
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne Session 2 Mechanical stress as a stimulator of osteochondral angiogenesis in osteoarthritis Maria‐Luisa PÉREZ D. Citadelle, A. Pigenet, S. van Eegher, F. Berenbaum, X. Houard. CRSA ‐ UMR_S 938 Inserm UPMC ; Eq F. Berenbaum : Métabolisme et maladies articulaires liées à l'âge Background: Excessive mechanical load is one of the main trigger of osteoarthritis (OA). The development of new vessels coming from the subchondral bone and reaching the cartilage are suspected to play a role in bone sclerosis and cartilage disappearance in OA. The increased vascular density in weight‐bearing joints suggests that mechanical loading of bone cells may stimulate their angiogenic potency. Hence, we investigated whether mechanical stress regulates the expression and secretion of angiogenic/angiostatic factors by osteoblasts. Methods: Primary cultures of osteoblasts isolated from the skulls of new born C57BL/6 mice were compressed or not at a mechanical strain of 1.67 MPa and a frequency of 1 Hz for 4 and 24 hours. The mRNA expression and protein secretion were assessed by real‐time quantitative PCR, ELISA and western‐blotting. Results: Mechanical compression of osteoblasts for 4 hours induced a general increase in the mRNA expression of both angiogenic and angiostatic factors. After 24 hours of compression, a downregulation of the mRNA expression of the angiostatic factors TSP‐1, TSP‐2 and PEDF was observed, as well as a decreased mRNA expression of angiogenic factors VEGF, bFGF and TGFβ1. However, mechanical stress upregulated the mRNA expression of the angiogenic factor Gremlin‐1 and its receptor VEGFR‐2. Conclusions: The results suggest that angiogenesis at the OA osteochondral junction may be affected by mechanical load and point into a role Gremlin‐1. 10
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne Session 2 The acquisition of the resistance to doxorubicine in associated with the enhancement of the procoagulant potential of the breast cancer cells MCF7. Grigoris T GEROTZIAFAS A. Khaterchi1, A. Rousseau1,3, P. Van Dreden3, A.K. Larsen1, I. Elalamy1,2 1 CRSA ‐ UMR_S 938 Inserm UPMC ; Eq. A. Larsen & A. de Gramont : Biologie et thérapeutiques du cancer ; Groupe Cancer Hémostase et Angiogenèse 2 Service d’Hématologie Biologique Hôpital Tenon, Hôpitaux Universitaires Est Parisien, AP‐HP, France. 3 Research and Development, Diagnostica Stago, Gennevilliers, France. Background Acquisition of properties rendering cancer cells resistant to the chemotherapy agents is among the main causes of treatment failure and patients with resistance to chemotherapy. Epithelial carcinoma breast cancer cells MCF7 are usually sensitive to several chemotheurapetic agents, but they can develop chemoresistance after prolonged exposure to cytostatic drugs, acquiring a more aggressive phenotype. Aims We investigated if the induction of chemo‐resistance phenotype at MCF7 cells, documented by MDR1‐Pgp expression, is associated with an enhancement of their procoagulant capacities. Methods Pre‐treatment of MCF‐7 cells for several weeks with increasing concentrations of doxorubicin, renders them chemo‐resistant. Tissue factor (TF) and MDR1‐Pgp expression by MCF7 cells were assessed by flow cytometry and Western Blot assays. Reverse transcriptase – polymerase chain reaction (RT‐PCR) for TF mRNA and electrophoretic analysis in agarose gels was also performed. TF activity (TFa) from cancer cells was measured with a clotting based assay (Diagnostica Stago). Thrombin generation of normal platelet poor plasma (PPP) in the presence of MCF7 cells was assessed with the Calibrated Automated Thrombinoscope assay (Diagnostica Stago). Results The acquisition of the chemo‐resistance phenotype by MCF7 was correlated with a significant acceleration of thrombin generation. Chemo‐resistant MCF7 cells expressed higher amounts of TF and showed marked TFa activity as compared to non resistant cells. Expression of TF by chemo‐resistant MCF7 was correlated with the expression of the MDR1/P‐gp. Conclusion The acquisition of the chemo‐resistance phenotype by the breast cancer cells is associated with enhancement of their procoagulant properties which are principally mediated by the TF expression. 11
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne Session 2 Role and fate of Mitotic Kinesin‐like protein 2 in Hepatocellular Carcinoma Joëlle SOBCZAK‐THÉPOT A. Karaiskou, F. Bourgain‐Guglielmetti, M. Boissan, S. Bally, F. Praz CRSA ‐ UMR_S 938 Inserm UPMC ; Eq F. Praz & O. Rosmorduc : Biologie et traitement des tumeurs hépatobiliaires Mitotic kinesin‐like protein 2 (MKlp2) is a microtubule‐associated motor required for cytokinesis, the final step of cell division. It also contributes to retrograde vesicular trafficking from the Golgi to the endoplasmic reticulum in interphase. In the adult, MKlp2 expression is barely detectable and restricted to proliferating tissues. We reported that MKlp2 only transiently accumulates in vivo during mouse liver regeneration after partial hepatectomy but is strongly and constantly overexpressed in preneoplastic and neoplastic mouse liver. Similarly, MKlp2 mRNA was strongly (10‐1000 fold) accumulated in a large series of human hepatocellular carcinomas (HCCs) with the highest expression in correlation with poor prognosis markers, such as TP53 mutation, chromosome instability and the presence of vascular invasion sites. These observations together with results published by other groups suggested that MKlp2 contributes to both normal and pathological hepatocyte proliferation, is linked to tumor aggressiveness in human HCCs and is associated with a decrease of disease free survival of patients. To further understand how MKlp2 is accumulated in cancer cells, we dissected the protein domains of MKlp2. We will present data showing that MKlp2 nuclear import is required for its degradation by the ubiquitin‐proteasome system while cytoplasmic retention promotes its stability. Interestingly in human HCCs, MKlp2 frequently accumulates in the cytoplasm, providing a mechanism for its stabilization. In addition, overexpression of this kinesin does not correlate with the mitotic index leading us to explore non‐mitotic functions of MKlp2 in the HCC context that could account for tumor aggressiveness. We will present preliminary data suggesting a role of the MKlp2 kinesin in cell‐cell and cell‐ECM adhesion, in cell motility and finally tumor cell invasion. 12
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne Session 3 Etudes des conséquences cliniques et physiopathologiques de la chaperonne HSP110 dans le cancer colorectal A’dem BOKHARI A. Lagrange, O. Buhard, M. Svrcek, A. Duval, A. Collura CRSA ‐ UMR_S 938 Inserm UPMC ; Eq A. Duval : Instabilité des microsatellites et cancers L'instabilité microsatellitaire (MSI) résulte d'une déficience du système de réparation des mésappariements au niveau de l'ADN, appelé MMR (Mismatch Repair), ce qui induit une instabilité génomique au niveau de séquences répétées de l’ADN, appelées microsatellites (insertions ou délétions de bases). Cette instabilité génétique est associée à un type tumoral fréquent chez l’Homme les cancers MSI, représentant entre 10 et 15 % des cancers coliques. L’objectif de mon projet de thèse se situe dans la continuité des travaux obtenus au laboratoire sur les conséquences cliniques et physiopathologiques de la chaperonne HSP110 (et son mutant HSP110DE9) dans les cancers coliques de type MSI. En 2011 le laboratoire a identifié HSP110 comme une nouvelle cible de mutations dans les CCR MSI ; nos travaux ont démontré que la délétion somatique du microsatellite T17 situé en amont du site accepteur d’épissage de l’intron 8, est observée à haute fréquence dans les cancers colorectaux (CCR) MSI. Cette délétion favorise un saut de l’exon 9 qui conduit à une forme mutante tronquée de la protéine (nommée HSP110DE9), à cause de l’apparition d’un codon stop prématuré dans l’exon 10. La protéine mutante HSP110DE9 interagit avec la protéine HSP110 sauvage et antagonise son activité (mutant dominant négatif). Elle a aussi un rôle pro‐apoptotique et chimiosensibilisant lorsque l’on force son expression dans des lignées de CCR traitées par 5‐Fluorouracil ou l’oxaliplatine (médicaments de chimiothérapie utilisés en routine chez les patients). En 2014, le laboratoire a démontré que les délétions somatiques de grandes tailles du microsatellite T17 (de 5 à 7 pb), sont observées dans 25% des CCR MSI et de manière remarquable, les patients avec une délétion de grande taille dans la tumeur montrent une excellente réponse au traitement par chimiothérapie, contrairement aux autres. Pour cela la mutation HSP110DE9 a été proposée comme facteur prédictif à la réponse à la chimiothérapie pour les patients atteint de cancers coliques MSI. Les objectifs de mon projet sont: (i) la caractérisation de l’impact de la mutation HSP110DE9 au cours du développement tumoral MSI (initiation et progression) ; (ii) le développement d’une approche thérapeutique innovante afin de potentialiser l’expression des mutants tel que HSP110DE9, délétères pour la carcinogénèse colique MSI; (iii) l’étude de l’expression nucléaire d’HSP110 et son impact sur la réponse à la chimiothérapie dans les CCR. Ce projet permettra d'améliorer nos connaissances sur les mécanismes impliqués dans la physiopathologie des cancers MSI avec des perspectives fondamentales mais également translationnelles et cliniques dans le but d’ouvrir à terme de nouvelles pistes thérapeutiques. 13
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne Session 3 La sénescence cellulaire : un prérequis à l’invasion tumorale ? Rôle du suppresseur de métastase NM23 Mathieu BOISSAN M. Auclair, M. Caron‐Debarle, M.‐L. Lacombe, D. Wendum, O. De Wever, C. Vigouroux CRSA ‐ UMR_S 938 Inserm UPMC ; Eq F. Praz & O. Rosmorduc : Biologie et traitement des tumeurs hépatobiliaires CRSA ‐ UMR_S 938 Inserm UPMC ; Eq B. Fève : Lipodystrophies génétiques et acquises NM23‐H1 est le premier gène suppresseur de métastase identifié codant une nucléoside diphosphate kinase, enzyme responsable de l'homéostasie intracellulaire des nucléosides di‐ et triphosphates. Nous avons montré que l’invalidation de NM23‐H1 induisait un « phénotype métastatique » dans des lignées épithéliales tumorales non‐invasives. Les mécanismes moléculaires impliquant NM23‐H1 dans le contrôle du potentiel métastatique et/ou régulant son expression restent largement inconnus. La maladie cancéreuse est aujourd’hui considérée comme une maladie du vieillissement encore appelé sénescence dont le principal inducteur est le stress oxydatif, également connu pour induire l’invasion tumorale. Une caractéristique majeure des cellules sénescentes est leur capacité à sécréter un très grand nombre de molécules telles que des cytokines, chimiokines, facteurs de croissance, et des métalloprotéases impliquées dans le remodelage des matrices extra‐cellulaires. Il a été montré que NM23‐H1 protégeait les cellules vis‐à‐vis d’un stress oxydatif aigu chez les plantes. Ainsi, notre projet a pour but de déterminer s’il existe une filiation entre stress oxydatif, sénescence cellulaire, et invasion tumorale sous la dépendance du suppresseur d’invasion et de métastase NM23‐H1. Nous montrons que NM23‐H1 régule négativement la production mitochondriale des espèces réactives de l’oxygène (ROS) associée à la peroxydation des phospholipides et à des dysfonctions mitochondriales dans différents contextes cellulaires tumoraux (surexpression/déplétion de NM23‐
H1). La surexpression de NM23‐H1 induit une réduction majeure de l’expression des marqueurs clés de sénescence cellulaire p16, p21, phospho‐p53 et prélamine A et inversement une augmentation des taux de zmpste24, métalloprotéase impliquée dans la maturation de la prélamine A en lamine A. Ces modifications sont associées à une réduction significative de l’activité béta‐galactosidase associée à la sénescence. De plus, nous observons dans les milieux conditionnés de ces cellules une diminution majeure de trois principaux constituants du sécrétome associé à la sénescence IL‐6, IL‐8 et MCP‐1. A l’inverse, la déplétion de NM23‐H1 par interférence ARN induit une augmentation majeure de l’expression de p16, p21, phospho‐p53, et prélamine A et inversement une répression de l’expression de zmpste24 ; ces modifications s’accompagnent d’une augmentation significative de l’activité béta‐
galactosidase associée à la sénescence et des taux d’IL‐6, IL‐8 et MCP‐1 dans les milieux conditionnés. Ainsi, NM23‐H1 module le processus de sénescence cellulaire et en particulier l’expression du tandem prélamine A/zmpste24 dans des cellules tumorales humaines. De plus, nous montrons que la modulation du processus de sénescence cellulaire par NM23‐H1 est contrôlée par le stress oxydatif via la voie de signalisation NFKB. De manière remarquable, l’invasion tumorale induite par la déplétion de NM23‐H1 à travers le collagène fibrillaire de type I natif est significativement diminuée en présence d’anti‐oxydants mais pas en présence d’inhibiteur pharmacologique de la voie NFKB. Enfin, nous observons une accumulation de p16, p21 et prélamine A dans les régions invasives et de « tumor budding » de tumeurs humaines colorectales comparativement à l’aire centrale des tumeurs qui expriment faiblement ces marqueurs de sénescence. En conclusion, nous proposons que le processus de sénescence induit par le stress oxydatif est contrôlé par NM23‐H1 et pourrait être un prérequis à l’invasion tumorale. 14
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne Session 4
Modélisation de l'aniridie, pathologie oculaire congénitale des cellules souches limbiques Lauriane ROUX I. Petit, O. Ferrigno, D. Aberdam CRSA ‐ UMR_S 938 Inserm UPMC ; Eq A. Atfi & C. Prunier : Laboratoire de signalisation cellulaire et carcinogenèse et Unité INSERM U976 (thèse en co‐direction) L'aniridie est une pathologie oculaire rare caractérisée par une absence partielle ou totale de l'iris. Cette malformation congénitale conduit à une cécité chez les patients adultes. L'opacification cornéenne est due à l'épuisement du stock de cellules souches limbiques (CSL) qui assurent le renouvellement de la cornée transparente. La plupart des aniridies sont dues à des mutations situées sur l'homéodomaine du gène PAX‐6, responsables d'une haploinsuffisance. Il n'existe ni traitement pour les patients atteints d'aniridie ni modèle mimant cette pathologie. L'objectif de ce projet de thèse est donc de développer un modèle in vitro afin de tester un outil thérapeutique potentiel. Pour cela, le système CRISPR‐Cas9 a été utilisé afin d'insérer une mutation non sens, retrouvée chez certains patients atteints d’aniridie, causant une haploinsuffisance de PAX‐6 dans des cellules limbiques. L'insertion de la mutation et le phénotype obtenu seront évalués à l'aide de différents paramètres : quantification et localisation de PAX‐6, prolifération cellulaire, adhésion, analyse du niveau d’expression de protéines régulées par PAX‐6… Nous essaierons également de réverter le phénotype de ce modèle à l’aide de protéine PAX‐6 recombinante purifiée. En effet, Il a récemment été montré que les homéoprotéines (HPs), dont PAX‐6, pouvaient être sécrétées et agir de façon paracrine. PAX‐6 pourrait donc être sécrétée par les cellules épithéliales et agir sur les cellules environnantes (action autocrine) et/ou sur les cellules stromales (action paracrine). Si ces hypothèses sont confirmées, cela suggèrerait que l’aniridie pourrait être due à un défaut de sécrétion de PAX‐6. Dans ce cas, nous essaierons également de mimer le phénotype de l’aniridie sur des cellules limbiques en utilisant des anticorps bloquants anti‐PAX‐6. Enfin, des souris aniridie (Pax‐6loxP/+/K5Cre) (collaboration avec R. Shalom‐Feuerstein, Technion) seront traitées à l'aide d'un collyre contenant des protéines recombinantes PAX‐6 purifiées. La régénération du limbe et la transparence de la cornée seront évaluées. 15
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne Session 4
Cellular adaptive immunity in Alzheimer’s disease: role in the pathophysiology and therapeutic potential Guillaume DOROTHEE CRSA ‐ UMR_S 938 Inserm UPMC ; Eq P. Aucouturier : Système immunitaire, neuroinflammation et maladies neurodégénératives Alzheimer’s disease (AD) is a neurodegenerative disorder characterized by progressive loss of memory and cognitive functions. AD neuropathology is defined by extracellular deposits of Aβ amyloid peptides into senile plaques, and neurofibrillary tangles consisting of intraneuronal fibrillar aggregates of hyper‐ and abnormally phosphorylated Tau proteins. Neuropathological lesions lead to activation of microglia and astrocytes, triggering a chronic neuroinflammatory innate immune response. Contribution of such neuroinflammation to the pathophysiology of AD remains controversial, with both beneficial impacts and detrimental effects that may promote the neurodegenerative process. Besides innate neuroinflammation, more recent data now also emphasize an instrumental role of cellular adaptive immunity in AD, although the impact on disease progression of T cell responses to the various pathological deposits involved in AD, i.e Aβ and Tau, is poorly defined. Whereas most existing studies have been related to amyloid pathology and remain contradictory, the interrelationship of T cell responses with Tau pathology is still totally elusive. Our data in mouse models of Alzheimer‐like pathology showed that regulatory T cells (Tregs) critically control the magnitude of Aβ‐specific CD4+ T cell responses, in both physiological and pathological settings. Interestingly, Tregs play a beneficial role in the pathophysiology of AD, at least in part by modulating microglial responses to Aβ deposition and delaying disease progression. Whereas Aβ‐specific CD8+ T cells do not trigger detrimental autoimmune neuroinflammatory processes in amyloid‐like pathology, hippocampal CD8+ T cell infiltration was selectively associated with the development of Tau pathology in a mouse model of Tauopathy. Such T cell responses contributed to amplify innate neuroinflammation and promote cognitive deficits triggered by pathological Tau proteins. Altogether, our works suggest a complex implication of T cells in the course of AD, with either beneficial or detrimental outcomes that may depend on the relative magnitude and functionality of different type of T cell responses to various disease‐related pathological deposits. Importantly, our studies highlight the therapeutic potential in AD of immunomodulatory approaches targeting Treg cells as key regulators involved in the control of cellular adaptive immunity. 16
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne Session 4
Génération de cellules souches capables de greffes hématopoïétiques à partir de cellules souches pluripotentes induites Laurence GUYONNEAU‐HARMAND1, 2 B. L’Homme3, B. Birebent2, C. Desterke4, N. Chevallier2, L. Garçon1, H. Lapillonne1,2, M. Benderitter3, T. Jaffredo5, A. Chapel1, 3 and L. Douay 1, 2 1 : CRSA ‐ UMR_S 938 Inserm UPMC ; Eq F. Delhommeau : Prolifération et différenciation des cellules souches : Application à la thérapie cellulaire hématopoiétique, 2 : EFS Ile de France, 3 : IRSN, 4 : UMS 33, 5 : UMR 7622 Etre capable de fabriquer de novo des CSH saines à partir d’iPS, générées par reprogrammation cellulaire, ouvrirait un nouveau paradigme de la greffe, soit en permettant la production de CSH universelles à partir de banques d’iPS triple homozygotes HLA A, B, DR, soit en générant des CSH saines autologues au diagnostic d’une hémopathie maligne comme les leucémies aigües (LA) ou les aplasies médullaires. A ce jour de multiples publications ont montré la capacité de produire à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSCs) des cellules sanguines matures comme les GR, les plaquettes les lymphocytes B ou les polynucléaires neutrophiles. D’autres ont rapporté la génération de progéniteurs unipotents (CFU‐G, CFU‐M, CFU‐e), bipotents (CFU‐GM) ou multipotents (CFU‐GEMM) et de diverses populations cellulaires exprimant le CD34, CD45 et CD38. D’autres encore ont montré que la surexpression de 5 transgènes (ERG, RORA, HOXA9, MYB et SOX4) dans des CD34+/45+ issues d’iPS leur confère une capacité de prolifération telle qu’ils peuvent reconstituer une hématopoïèse myéloïde et érythroïde in vivo à court terme (5 semaines). La capacité des hiPS à reconstituer une hématopoïèse multilignée à long terme a été récemment apportée en décrivant la sélection in vivo de CSH à partir de tératomes induits par injection sous cutanée d’hiPS à des souris immunodéficientes. Cette approche pionnière n’est toutefois pas compatible avec une application clinique. Nous basant sur cette littérature, nous avons fait l’hypothèse que la raison des échecs successifs résidait dans le fait que la récapitulation in vitro de l’hématopoïèse adulte à partir de cellules pluripotentes, embryonnaires ou adultes, ne mime pas parfaitement le déroulement ontogénique in vivo, les progéniteurs ciblés étant probablement trop tardifs. Nous avons développé avec succès notre propre protocole ciblant un progéniteur plus précoce et fait la première démonstration formelle de prise de greffe multilignée à long terme chez la souris Nod/Scid avec une population de progéniteurs générée in vitro à partir d’hiPSCs (Guyonneau‐Harmand et al, 2015, soumis pour publication). Nous avons aussi démontrée qu’une sous population isolable cliniquement contient les cellules capables de greffe. Ce travail est le rationnel pré‐clinique d’une nouvelle approche de l’autogreffe de CSH dans les aplasies médullaires et les hémopathies : l’autogreffe revisitée. 17
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne Session 4
Dual effects of endoplasmic reticulum stress on portal myofibroblast functions Emilien LOEUILLARD H. El Mourabit, C. Housset, A. Cadoret CRSA ‐ UMR_S 938 Inserm UPMC ; Eq. C. Housset : Pathologies métaboliques, billiaires et fibro‐inflammatoires du foie Background: Portal Myofibroblasts (PMFs) play a critical role in the progression of liver fibrosis of all causes. This subpopulation of myofibroblasts is predominant at early stages of biliary type liver fibrosis and is pro‐
angiogenic. Evidence suggests that endoplasmic reticulum (ER) stress is a major player in liver fibrosis. The aims of this study were to determine if ER stress occurred in PMFs and affected major functions in these cells. Methods: PMFs were obtained from control or bile duct‐ligated (BDL) rats. PMFs from BDL rats were used as a model of in vivo‐activated PMFs. In vitro, ER stress was induced or inhibited using tunicamycin and the PERK inhibitor GSK2656157, respectively. The degree of ER stress was determined using the markers CHOP, TRB3, GADD34. The effect of ER stress was evaluated on the myofibroblastic differentiation, angiogenic properties, proliferation and migration of PMFs. Results: In vivo‐activated PMFs obtained from BDL rats displayed reduced proliferation and migration compared to control PMFs obtained from sham‐operated rats. However, VEGF expression and secretion was increased in in vivo‐activated PMF and correlated wtih an increase of pro‐angiogenic capacity of these cells. These features were accompanied by an increased expression of ER stress markers of the PERK pathway. In vitro, tunicamycin‐induced ER stress had no effect on the expression of the markers of myofibroblastic differentiation, alpha‐smooth muscle actin and collagen 1, but significantly reduced proliferation and migration and increased VEGF expression and secretion in PMFs. GSK2656157 treatment of in vivo‐activated PMFs reduced ER stress, reduced VEGF expression and inhibited their angiogenic properties in matrigel plugs in vivo. GSK2656157 treatment also partially restored the proliferative and migratory capacities of these cells. Conclusion: PMFs display ER stress during their activation. ER stress stimulates their proangiogenic properties and thereby may promote fibrosis progression. However, ER stress also inhibits their proliferation and migration, and thereby may provide an incoherent feedback loop that restricts their expansion. 18
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne Session 5 Genetic disruption of the oncogenic HMGA2‐PLAG1‐IGF2 pathway causes fetal growth restriction Walid ABI HABIB F. Brioude, T. Edouard, J. T. Bennett, A. Lienhardt‐Roussie, F. Tixier, J. Salem, S. Azzi, Y. Le‐Bouc, M. D. Harbison, I. Netchine CRSA ‐ UMR_S 938 Inserm UPMC ; Eq. Y. Le Bouc & I. Netchine : Système IGF et croissance foetale et post‐natale Endocrine, Bone Diseases, and Genetics Unit, Children's Hospital, University Hospital Center, Toulouse, France; INSERM Unit 1043, Physiopathology Center of Toulouse Purpan (CTPT), Paul‐Sabatier University, Toulouse, France; Department of Pediatrics (Genetics), University of Washington, and Center for Integrative Brain Research, Seattle Children's Research Institute, Seattle, WA 98101, USA; Département de Pédiatrie Médicale, Centre Hospitalo‐Universitaire de Limoges, 87042 Limoges Cedex, France; Hôpital Debrousse, Département d'endocrinologie pédiatrique, Lyon, France; MAGIC Foundation, RSS/SGA Research & Education Fund, Oak Park, Illinois, USA; Icahn School of Medicine at Mount Sinai, Department of Pediatrics, New York, New York, USA. Background: Silver‐Russell syndrome (SRS) is characterized by intrauterine and postnatal growth retardation, a typical phenotype and feeding difficulties. IGF2, an imprinted gene encoding a major fetal growth factor, is implicated in the pathophysiology of SRS, as 50‐60% of patients display IGF2/H19 domain hypomethylation and diminished IGF2 expression. PLAG1, an upstream regulator of IGF2, and HMGA2 are oncogenes for which exist strong evidence of involvement in the physiological control of growth. Methods: We performed Whole‐Exome‐Sequencing (WES) then targeted high‐throughput sequencing of HMGA2, PLAG1, and IGF2 in 192 patients clinically suspected of having SRS but lacking molecular diagnosis. The expression of these genes was studied after the selective silencing of HMGA2 and PLAG1 with siRNA. Findings: After WES revealed a heterozygous single‐nucleotide deletion in the PLAG1 gene in affected patients from a family with SRS, targeted sequencing identified five out of 192 patients as having heterozygous frameshift/nonsense mutations in PLAG1, HMGA2, or IGF2. HMGA2 silencing with siRNA decreased the expression of PLAG1 and IGF2, whereas PLAG1 silencing lowered levels of IGF2 only. This diminished IGF2 expression specifically resulted from reduced activity of the P3 promoter, which harbors a PLAG1 binding site. Interpretation: Our findings demonstrate that HMGA2 regulates IGF2 expression through PLAG1. Defects of the HMGA2, PLAG1, and IGF2 gene can therefore lead to SRS, attesting to this pathway’s role in the regulation of fetal and potentially postnatal growth. These findings improve our understanding of the regulation of IGF2 expression and define new genetic causes of SRS, important for genetic counseling. 19
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne Session 5 Conséquences fonctionnelles de l’instabilité microsatellitaire dans la tumorigenèse colorectale : investigation du concept de gènes cibles d’instabilité Malorie GREENE V. Jonchere, L. Marisa*, A. Guilloux*, A. Collura, A. Duval CRSA ‐ UMR_S 938 Inserm UPMC ; Eq. A. Duval : Instabilité des microsatellites et cancers *Programme ‘Carte d’identité des Tumeurs’ et/ou Ligue Nationale Contre le Cancer L’instabilité des séquences répétées microsatellites du génome est une conséquence de l’inactivation du système MMR (MisMatch Repair) en charge de la réparation des erreurs produites au cours de la réplication de l’ADN. Cette instabilité est associée à un processus de transformation cellulaire original, observé chez l’homme dans des pathologies tumorales fréquentes (cancers MSI pour Microsatellite Instable). Les cancers MSI sont en particulier responsables de 15% des cancers colorectaux (CCR). Les CCR MSI ont un meilleur pronostic que les tumeurs non‐MSI (ou MSS pour MicroSatellite Stable, 85% des CCR) et leur potentiel métastatique est amoindri. En outre, ces tumeurs présentent une réponse différente aux agents de chimiothérapie chez les patients. Aujourd’hui, les mécanismes qui sous‐
tendent ces caractéristiques phénotypiques et cliniques des tumeurs MSI restent encore à élucider. Depuis la mise en évidence d'un lien entre l’inactivation du système MMR et les tumeurs MSI, des dizaines de gènes contenant des séquences répétées codantes – dits gènes cibles d’instabilité, ont été identifiés comme porteurs de mutations au niveau de ces répétitions dans des CCR MSI. L'accumulation de mutations ‘frameshift’ à leur niveau (insertions/délétions de +1/‐1 pb) est le principal mécanisme moléculaire par lequel les cellules MSI acquièrent des changements fonctionnels. Ces modifications affectent des gènes ayant un rôle dans la carcinogenèse humaine en étant sélectionnées de façon positive dans les tumeurs MSI (gènes transformators). Cependant, il est également proposé qu'un certain nombre de mutations ne soient pas ou peu observées dans ces tumeurs malignes étant donné que l’expression normale de ces gènes cibles d’instabilité serait essentielle à la survie cellulaire (gènes survivors). Mon travail de thèse vise à établir la preuve de concept que la tumorigénèse MSI est un processus complexe résultant de la sélection et de la contre‐sélection d’évènements mutationnels survenant dans les gènes transformators ou survivors respectivement des cellules tumorales. Pour cela, j’utilise des données générées à partir de l’analyse Exome d’une série de carcinomes primaires humains MSI du côlon et de la muqueuse colique saine appariée. De manière originale, les données générées montrent qu’un nombre limité de gènes contenant un microsatellite codant sont exempts de mutations dans l’ADN des CCR MSI, attestant de la contre‐sélection d’un processus d’instabilité génétique au niveau des répétitions de l’ADN qu’ils contiennent. Mon but principal est de valider le rôle fonctionnel et crucial de certains de ces gènes pour l’homéostasie de la cellule tumorale en effectuant un criblage fonctionnel afin de valider l’hypothèse que l’inactivation de ces gènes est délétère pour les cellules. 20
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne Session 5 NOV/CCN3: une adipokine impliquée dans la résistance à l’insuline et la dépense énergétique Bruno FEVE M. Garcia, TTH Do, B Antoine, M. Moldes, G. Dorothée, C. Kazakian, M. Auclair, M. Buyse, T. Ledent, P.O. Marchal, M. Fesatidou, A. Beisseiche, H. Keseki, S. Hiraoka, S.E. Chadjichristos, B. Blondeau, R. Denis, R.G. Denis, S. Luquet, C. Martinerie CRSA ‐ UMR_S 938 Inserm UPMC ; Eq B. Fève : Lipodystrophies génétiques et acquises L’identification de nouvelles adipokines faisant le lien entre obésité et insulino‐résistance représente un enjeu majeur. Nous avons montré récemment que NOV/CCN3, une protéine matricellulaire multifonctionnelle, est synthétisée et sécrétée par le tissu adipeux, avec des taux plasmatiques corrélés avec l’IMC. NOV a été antérieurement impliquée dans les processus de réparation tissulaire, la fibrose, les maladies inflammatoires, et le cancer. Cependant, son rôle dans l’homéostasie énergétique restait inconnu. Nous avons ainsi étudié le phénotype de souris NOV‐/‐ soumises à un régime normal ou hyperlipidique (HFD). De façon très nette, le poids des souris NOV‐/‐ est nettement plus faible que celui des souris témoins, mais seulement en HFD. Ceci est lié à une réduction de masse grasse, avec des adipocytes plus petits, et une plus forte expression des acteurs de la thermogenèse au sein des dépôts adipeux blancs, et en particulier d’UCP1. Ceci va de pair avec une dépense énergétique accrue des souris invalidées. Les souris NOV‐/‐ en HFD améliorent par ailleurs leur tolérance au glucose et leur sensibilité à l’insuline. De façon remarquable, les animaux NOV‐/‐ ont un changement de phénotype macrophagique (M1 vers M2) et lymphocytaire dans leur tissu adipeux épididymaire, associé à une chute d’expression des cytokines proinflammatoires. Les animaux invalidés ont également une amélioration de leur signalisation insulinique in vivo. L’ensemble de ces données montre que NOV est une nouvelle adipokine impliquée dans la résistance à l’insuline associée à l’obésité. 21
12ème séminaire annuel du
Centre de Recherche Saint-Antoine
17 et 18 novembre 2016 – Montvillargenne
Résumés des
communications affichées
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne Posters Poster n°1 Caractérisation de WWP1, une E3 ubiquitine ligase impliquée dans la progression tumorale liée au TGFβ Nawel KAABI C. Prunier CRSA ‐ UMR_S 938 Inserm UPMC ; Eq. A. Atfi & C. Prunier : Laboratoire de signalisation cellulaire et carcinogenèse Le TGFβ (Transforming Growth Factor beta) a un rôle suppresseur de tumeur dans les stades précoces de la cancérogenèse, mais dans les stades tardifs, il favorise la cancérogenèse en induisant un remodelage du cytosquelette et la formation de métastases. Des altérations (mutations, délétions et sous/surexpression) ont été identifiées pour plusieurs éléments participant à la signalisation du TGFβ, cependant, ces anomalies n’expliquent pas la plupart des dérégulations de cette voie observées dans les cancers. Notre laboratoire a donc cherché à identifier de nouveaux régulateurs de la signalisation TGFβ qui pourraient être la cible d’altérations dans les cancers. Dans ce contexte, il a identifié une nouvelle protéine inhibitrice de la signalisation TGFβ, WWP1. WWP1 est une E3 ubiquitine ligase qui induit notamment la polyubiquitination et la dégradation du récepteur au TGFβ. De plus, le gène WWP1 est amplifié dans plus de 20% des tumeurs cancéreuses mammaires, prostatiques ou hépatiques, suggérant que WWP1 pourrait jouer un rôle clé dans les processus de cancérogenèse. Notre laboratoire cherche maintenant à comprendre les mécanismes d’action de WWP1 et particulièrement ceux qui l’impliquent dans le remodelage de l’architecture du cytosquelette d’actine. Dans ce contexte, il a identifié dans un crible double‐hybride chez la levure la Synaptopodine (SYNPO), une protéine capable de se lier à l’actine, comme un nouveau partenaire potentiel de WWP1. Mon projet consiste à caractériser ce nouveau complexe WWP1/SYNPO et à établir si celui‐ci a un rôle lors de la progression néoplasique liée au TGFβ. Nos travaux ont permis de confirmer et de caractériser l’association entre WWP1 et SYNPO dans différentes lignées cellulaires. En ce qui concerne le rôle du complexe SYNPO/WWP1, il semble que WWP1 ne puisse pas ubiquitiner la protéine SYNPO. SYNPO serait plutôt un adaptateur de WWP1, nécessaire à son activité ubiquitine ligase envers un substrat. Nos recherches visent maintenant à identifier le ou les substrats de ce complexe WWP1/SYNPO, grâce à un crible protéomique basé sur la technologie de «Snapshot Proteomics », puis à déterminer les conséquences fonctionnelles de cette interaction moléculaire entre WWP1 et SYNPO lors de la progression tumorale liée au TGFβ. 23
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne Posters Poster n°2 Etude des produits avancés de glycation et implication de la glyoxalase‐1 dans l’arthrose liée au vieillissement : une approche phénotypique de la physiopathologie de l’arthrose Sabine TRELLU A. Courties, S. Jaisson, B. Guidet, X. Houard, F‐P. Ekhirch, C. Jacques, F. Berenbaum, J. Sellam CRSA ‐ UMR_S 938 Inserm UPMC ; Eq. F. Berenbaum : Métabolisme et maladies articulaires liées à l'âge En 2016, nous séparons les arthroses en fonction de phénotypes définis par les facteurs de risque principaux d’arthrose : arthrose post‐traumatique, arthrose métabolique, et arthrose liée au vieillissement. Avec l’âge, apparait un état d’inflammation chronique de bas grade, appelé par certains ‘inflammaging’. Cette inflammation chronique est impliquée dans les maladies liées au vieillissement (cardiovasculaires, neuro‐dégénératives, néoplasiques), et possiblement dans le phénotype d’arthrose liée au vieillissement. Les produits de glycation avancés (AGEs) issus de la réaction non enzymatique entre un sucre et une protéine sont générés au cours du vieillissement tissulaire. Ces AGEs sont connus pour modifier les propriétés biomécaniques du cartilage et induire l’acquisition par les chondrocytes d’un phénotype pro‐inflammatoire et pro‐dégradatif. La glyoxalase‐1 (Glo‐1) est la principale enzyme participant à l’élimination des précurseurs des AGEs, particulièrement de la carboxyméthyllysine (CML). Objectifs : 1) quantifier la CML dans des cartilages arthrosiques humains 2) étudier la régulation de Glo‐1 dans les chondrocytes articulaires murins et le cartilage articulaire arthrosique humain suite à un stress inflammatoire. Méthodes et Résultats : Ex vivo, les explants de cartilage de patients opérés d’une prothèse de genou ont été utilisés. La carboxyméthyllysine (CML), mesurée par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse, augmente dans le cartilage des patients arthrosiques avec l’âge des patients (coefficient de corrélation CML/âge : r=0,78). Parallèlement à cette augmentation de la CML, l’expression protéique (WB) et l’activité enzymatique de Glo‐1 (mesurée par l’absorbance à 240nm à 10 min du produit de réaction de Glo‐1) diminuent dans les explants de cartilage stimulés par IL‐1β avec l’âge des patients (WB : r=‐0,63 et activité enzymatique r=‐0,21). In vitro, dans des cultures primaires de chondrocytes murins (issus de C57B6), nous avons observé à 72h une diminution dose‐dépendante de l’ARNm (x 0,67), de la quantité protéique (x 0,54) et de l’activité enzymatique de Glo‐1 (x 0,65) en présence d’IL‐1β (10 ng/mL) (n=4). En présence de L‐NAME, inhibiteur de la NO synthase, et de MitoTEMPO, inhibiteur des ROS mitochondriaux, l’expression de Glo‐1 en présence d’IL1 β est restaurée (n=4). Conclusion : Dans le cartilage arthrosique humain, en situation inflammatoire, le mécanisme adaptatif d’augmentation de Glo‐1 pour limiter la synthèse d’AGE (CML) est perdu avec le vieillissement. In vitro, le stress inflammatoire par IL‐1β, via le stress oxydant, diminue l’expression de Glo‐1. 24
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne Posters Poster n°3 Consequences of hypertrophic chondrocyte differentiation on osteochondral angiogenesis in osteoarthritis Sandy VAN EEGHER M.‐L. Perez‐Lozano, D. Citadelle, A. Pigenet, F. Berenbaum*, X. Houard CRSA ‐ UMR_S 938 Inserm UPMC ; Eq. F. Berenbaum : Métabolisme et maladies articulaires liées à l'âge * Department of Rheumatology and “Inflammation‐Immunopathology‐Biotherapy” (DHU i2B), AP‐HP Saint‐
Antoine Hospital, F‐75012 Paris, France Background. Osteochondral angiogenesis is an important step in the remodeling of the cartilage/subchondral bone junction in osteoarthritis (OA). Cellular and molecular stimuli of osteochondral angiogenesis in OA are largely unknown. We hypothesize that osteochondral angiogenesis in OA is controlled by the hypertrophic differentiation of chondrocytes, as it occurs in the endochondral ossification process during development and growth. Methods. Chondrocyte hypertrophy was detected by osteocalcin immunostaining in human OA knee tissues. OA was evaluated by modified Mankin score and osteochondral angiogenesis by the number of vascular channels reaching the non‐calcified cartilage. The expression of angiogenic/angiostatic factors and chondrocyte markers was determined by RTqPCR, ELISAs and immunoblotting in an original model of hypertrophic differentiation of primary cultures of mouse articular chondrocytes. Results. Osteochondral angiogenesis (ρ=0.252, p=0.017, n=105) and chondrocyte hypertrophy (ρ=0.833, p= 0.002, n=15) were linked to OA progression. Hypertrophic chondrocytes and osteochondral angiogenesis were positively correlated (ρ=0.604, p= 0.024, n=15). Expression of chondrocyte markers sox9, aggrecan and col2A1 dropped with hypertrophic differentiation in vitro, whereas runx2, osteocalcin and osterix mRNAs levels significantly increased. Hypertrophic chondrocytes were also characterized by strong matrix calcifications. Hypertrophic differentiation also stimulated the expression of angiogenic factors, including VEGF and bFGF. Angiostatic factors showed distinct expression patterns with a drop in chondromodulin‐1 mRNA level and a biphasic curve for TSP‐
1 and ANGPTL‐4 with the strongest expression observed in prehypertrophic cells. Conclusions. Together, these results suggest a pivotal role of chondrocyte hypertrophy in osteochondral angiogenesis and thus in the remodeling of the cartilage/subchondral bone junction in OA. 25
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne Posters Poster n°4 Characterization of Adipose‐derived Mesenchymal Stem Cells from multiple myeloma patients Christelle MAZURIER C. Mazurier*, M Auclair*, I. Toillon, I. Tihy, T. Marie, S. Jolly, N. Ferrand, F. Delhommeau, A.K. Larsen, L. Douay, B. Feve, M. Sabbah*, V. Béréziat*, L. Garderet* * Co auteurs AO interne 2015 CRSA ‐ UMR_S 938 Inserm UPMC ; Eq. F. Delhommeau : Prolifération et différenciation des cellules souches : Application à la thérapie cellulaire hématopoiétique CRSA ‐ UMR_S 938 Inserm UPMC ; Eq B. Fève : Lipodystrophies génétiques et acquises CRSA ‐ UMR_S 938 Inserm UPMC ; Eq. A. Larsen & A. de Gramont : Biologie et thérapeutiques du cancer Multiple myeloma, a clonal plasma cell disorder, is characterized by lytic bone lesions due to a permanent uncoupling of the osteoblast/osteoclast balance. Since a decennia studies have particularly focus on the role of bone marrow mesenchymal stromal cells (BM‐MSC) in lytic bone lesions. Studies reported that BM‐MSC in MM are abnormal mainly due to a lack of osteoblastic differentiation capacity, overexpress genes implicated in the tumour support or angiogenesis and have an abnormal “secreting” profile for growth factors, cytokines and chemokines. In this study, we have evaluated in vitro and in vivo the osteoblastic potential of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue, by hypothesizing that mesenchymal cells from an extra hematopoietic tissue were “normal” and a putative source for innovative cell therapy treatment of MM bone disease. Our datas suggests that ADSC‐MM share the same impairement that their medullar counterparts and that MM disease is not restricted to hematopoëitic tissue 26
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne Posters Poster n°5 Rôle du récepteur aux glucocorticoïdes du tissu adipeux dans la lipodystrophie induite par la corticosterone. Héloïse DALLE M. Garcia, T. Ledent, H. DO, M. Buyse, B. Fève, M. Moldes CRSA ‐ UMR_S 938 Inserm UPMC ; Eq. B. Fève : Lipodystrophies génétiques et acquises Les glucocorticoïdes (GC) font partie des médicaments les plus prescrits en raison de leurs propriétés anti‐inflammatoires et immunosuppressives. A fortes doses, ils sont à l’origine d’effets secondaires comprenant un diabète cortico‐induit et une lipodystrophie caractérisée par une hypertrophie du tissu adipeux viscéral aux dépens du tissu adipeux sous‐cutané. Les GC exercent des actions pléïotropes sur la physiologie et la pathologie du tissu adipeux, cependant, les mécanismes moléculaires des effets différentiels des GC ne sont pas encore élucidés. Nous formulons l’hypothèse que le récepteur aux glucocorticoïdes (GR) des tissus adipeux participe au phénotype de lipodystrophie et au développement d’une résistance à l’insuline. Pour étudier le rôle du GR adipocytaire, nous avons généré un modèle murin d’invalidation spécifique et inductible dans les tissus adipeux (GR‐KOadipoqCreERT2). Les souris ont été soumises ou non à un traitement par la corticostérone (10 g/mL dans l’eau de boisson) pendant 4 semaines. Les résultats préliminaires montrent une expansion de tous les tissus adipeux chez les souris GR‐KO par rapport aux souris témoins, accompagnée d’une augmentation de la sensibilité à l’insuline et de la tolérance au glucose. Allant dans ce sens, les souris GR‐KO sécrètent moins d’insuline que leurs homologues témoins. Ces premiers résultats suggèrent que malgré une adiposité accrue, l’homéostasie énergétique des animaux GR‐KO est améliorée, validant l’hypothèse de départ, à savoir l’implication du GR adipocytaire dans le développement de l’insulino‐résistance. L’objectif de ce travail est de poursuivre le phénotypage métabolique des animaux GR‐KO et de déterminer les cibles moléculaires de la voie de signalisation du GR de l’adipocyte. 27
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne Posters Poster n°6 Modélisation de l’atteinte vasculaire dans le syndrome lipodystrophique de Dunnigan grâce à l’étude de cellules souches induites à la pluripotence Matthieu MANTECON1 A.‐C. Guénantin1, N. Briand1,5, E. Capel1, M. Garcia1, R. Morichon2, D. Jeziorowska3, R. Hajjar4, B. Fève1, J. Capeau1, P. Collas5, J.‐S. Hulot3,4, C. Vigouroux1 1CRSA ‐ UMR_S 938 Inserm UPMC ; Eq. B. Fève : Lipodystrophies génétiques et acquises, 2UMS30 Plateforme imagerie Lumic, 3UPMC Inserm UMR_S1166 ICAN, 4Cardiovascular Research Center Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York; 5Norwegian Center for Stem Cell Research, Oslo University Hospital Les mutations du gène LMNA, qui code les lamines de type A, sont responsables de plusieurs maladies appelées laminopathies, comprenant en particulier des syndromes lipodystrophiques et des syndromes de vieillissement accéléré (Progéria ou syndromes progéroïdes), dont la physiopathologie reste mal connue. Le syndrome de Dunnigan (FPLD2) est une laminopathie due à la mutation LMNA p.R482W caractérisée par une lipodystrophie partielle se compliquant de diabète très insulino‐résistant, de dyslipidémie avec hypertriglycéridémie majeure, de stéatose hépatique et d'une athérosclérose particulièrement précoce et sévère. Il a été précédemment montré que la surexpression des lamines A mutées p.R482W dans des cellules endothéliales coronaires humaines induit une augmentation du stress oxydant et de l’inflammation et une dysfonction endothéliale. Par ailleurs, plusieurs travaux suggèrent que le syndrome de Dunnigan pourrait être lié à des anomalies de la différenciation, de la maintenance du phénotype différencié et/ou de la sénescence de certains lignages cellulaires mésodermiques. Nous avons exploré plus avant l’hypothèse physiopathologique d’une altération de la différenciation endothéliale dans cette maladie en utilisant les cellules souches induites à la pluripotence humaine (hiPSC) que nous avons obtenues par reprogrammation de fibroblastes de patients FPLD2 et de témoins. Des hiPSCs FPLD2 corrigées pour la mutation par la méthode des nucléases spécifiques (TALENs) ont également été utilisées comme contrôles. Un protocole de différenciation endothéliale efficace des hiPSCs a été mis au point au laboratoire. Nos résultats montrent que la mutation LMNA p.R482W induit des défauts de la différenciation endothéliale des cellules souches, avec un défaut d’acquisition des marqueurs de l’endothélium et des perturbations de la fonctionnalité des cellules. Nos résultats renforcent l’hypothèse selon laquelle les laminopathies auraient une origine développementale, le syndrome de Dunnigan étant probablement secondaire à un défaut de différenciation de plusieurs tissus d’origine mésodermique. Nos résultats suggèrent que les défauts de la différenciation endothéliale des cellules souches contribuent aux complications vasculaires du syndrome de Dunnigan. 28
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne Posters Poster n°7 Characterization of molecules derived from marine microorganisms, acting on metastatic breast cancer cells Ambre DEZAIRE1,2 N. Ferrand1, M. Vallet2, M. Sabbah1, A. K. Larsen1, S.Prado2, A. Escargueil1 1
2
CRSA ‐ UMR_S 938 Inserm UPMC ; Eq. A. Larsen & A. de Gramont : Biologie et thérapeutiques du cancer UMR 7245, MCAM, CNRS, Muséum National d’Histoire Naturelle, 63 Rue Buffon, 75005 Paris, France Breast cancer is the leading cause of cancer death in women. At the in situ carcinoma stage the tumor can be surgically removed, but in later stages tumor cells can undergo epithelial‐to‐mesenchymal transition (EMT),1 become, invasive and chemoresistant.2 Thus there is a need for new drugs acting on metastatic breast cancer cells. To date, natural products still constitute the major source of our drugs.3 Particularly, marine biodiversity, from which microorganisms,4 already led to several drugs on the market,5 especially in oncotherapy. Our experimental strategy is to isolate and characterize molecules extracted from 70 fungal strains associated to brown algae and cultivated in two conditions. Extracts and molecules are selected on their ability to inhibit tumor cell migration and invasion. A first viability assay has shown that 16 strains have high cytotoxicity (IC50 < 10 µg / mL). A strain from the marine fungus Paradendryphiella arenaria was particularly efficient with an IC50 of 0.37 µg / mL on MCF7 epithelial cancer cell lines and 0.19 µg / mL on MCF7‐Sh‐WISP26 invasive cancer cell lines. The chemistry of this fungus is poorly studied. An ongoing purification and dereplication step, have already allowed for isolation of a strong bioactive molecule (IC50 of 0.07 µg / mL on MCF7 cells and 0.046 µg / mL on MCF7‐Sh‐WISP2), an epidithiodioxopiperazine, as well as new pentanorlanostane derivatives. These experiments let us bring out, yet, non‐studied marine fungal crude extracts that have an anticancer activity, not only on non‐invasive mammary cancer cells, but also on invasive ones, which constitute their strong therapeutic potential. [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] Radisky DC. J Cell Sci 2005, 118:4325‐6 Thomson S et al. Cancer Res 2005, 65: 9455‐62. Chua KN e et al. P. PLoS One 2012, 7:e33183 Mueller MM, Fusenig NE. Nat Rev Cancer 2004, 4:839‐49. Charytonowicz E, et al. J Clin Invest 2012, 122:886‐98. Debbab A, Aly AH, Proksch P. Fungal Div 2012, 57:45‐83 Gerwick WH, Fenner AM. Microb Ecol 2013, 65:800‐806 Ferrand N, et al. PLoS One 2014, 9:e87878. 29
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne Posters Poster n°8 Effect of Nutrition during Lactation on IUGR Mice Sarah SAGET L. Decourtye1, R.Cong1, M. Moldes1, M.‐L. Endale2, L. Dinard1, D. Tregouet2, B. Fève1,3, Y. Le Bouc1,4, L. Kappeler1 1‐ CRSA ‐ UMR_S 938 Inserm UPMC ; IHU ICAN, Eq. Y. Le Bouc & I. Netchine : Système IGF et croissance foetale et post‐natale; 2‐ UMR S1166, INSERM‐UPMC, IHU ICAN, Paris, France ; 3‐ AP‐HP, Hôpital Saint Antoine, Paris, France ; 4‐ AP‐HP, Hôpital Armand Trousseau, Paris, France ; Introduction: Intrauterine Growth Retardation (IUGR) affects around 5% of human births in France and is associated with long terms effects like cardiovascular and metabolic diseases. We generated an IUGR mouse model and studied effects of different regimen in lactation in the induction of adult metabolic pathologies. Materials and Methods: Pregnant mice were fed by E15.5 with a low protein diet to induce growth retardation of fetuses. At birth, IUGR newborns were cross‐fostered to a normally fed dam who gave birth the same day, and litter size were normalized at 3, 6 or 10 pups per dam to induce overfeeding, normal feeding or restriction during lactation. Results: We observed that food normalization in lactation induce a fast catch‐up growth, and is associated latter on with an increased weight gain and body mass index, similarly to overfed mice. As adult, these mice also present with glucose intolerance while restricted IUGR’s seem more sensitive compared with control mice, normally fed during both fetal and early postnatal periods. Discussion/conclusion: In agreement with the Predictive Adaptive Response, our model shows the importance of a coherent nutrition during the entire perinatal period, between both the pre‐ and the post‐natal periods, for the emergence of adult metabolic pathologies. 30
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne Posters Poster n°9 Role of SMAP1 on EGFR/HER3 signaling upon stimulation with various receptor ligands in different human hepatocellular carcinoma cell lines. Yuanhui LIU C. Calmel, C. Desbois‐Mouthon, F. Praz CRSA ‐ UMR_S 938 Inserm UPMC ; Eq. F. Praz & O. Rosmorduc : Biologie et traitement des tumeurs hépatobiliaires Background & Aims. Abnormal regulation of the signaling pathways governed by EGFR is a frequent event in hepatocellular carcinoma (HCC) development. EGFR can form heterodimer with other members of the HER family, like HER2 and HER3. Upon ligand binding, EGFR is dimerized, phosphorylated and internalized mainly through clathrin‐mediated endocytosis (CME), followed by recycling for sustained signaling or degradation for signal down‐regulation. Our aim is to explore the role of SMAP1 in EGFR signaling. Yet, SMAP1 has been reported to regulate Arf6‐dependent CME of the transferrin receptor and E‐cadherin. In addition, we have unpublished data showing that SMAP1 is expressed at higher levels in some HCC cell lines and tumor samples compared to adenomas and normal liver. Methods. We have used the Hep3B, HepG2, HuH6 and PLC/PRF5 HCC cell lines that highly express SMAP1. SMAP1 expression was inhibited by siRNA, and a non‐targeting siRNA was used as a control. Various EGFR ligands, namely EGF, amphiregulin (AR), Heparin‐Binding EGF‐like growth factor (HB‐EGF) and heregulin (HRG) have been used at 10 nM to stimulate cells for various times ranging from 5 to 60 min. Total and phosphorylated EGFR, HER2, HER3, AKT, STAT3 and ERK levels have been evaluated by Western Blots using the ChemiDoc Imaging System. Results. The level of HER3 phosphorylation was decreased upon inhibition of SMAP1 in all cell lines when stimulated with AR, EGF or HB‐EGF, but remained unchanged upon stimulation with HRG. Interestingly, HER3 phosphorylation sites controlled by SMAP1 were cell line‐specific: mainly pHER3‐
Y1197 in HepG2 and pHER3‐Y1289 in Hep3B or HuH6; changes in HER3 phosphorylation levels were small in PLC/PRF5 cells. Upon SMAP1 inhibition, EGFR‐Y1068 phosphorylation decreased in HepG2 cells, increased in HuH6 and PLC/PRF5 cells, and remained unchanged in Hep3B cells. The impact of SMAP1 upon downstream EGFR signaling, including pSTAT3, pAKT and pERK, was also cell line‐ and ligand‐specific. Conclusions. The regulation of HER signaling in HCC by SMAP1 appears to be a complex process that depends not only on the receptor ligand, but also on the characteristics of the tumor cell lines. More investigations are needed to get better insights in the role of SMAP1 in HER signaling. 31
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne Posters Poster n°10 Insulin/IGF‐1 receptors mediate acquired resistance to anti‐EGFR therapy in human cholangiocarcinoma cells Javier VAQUERO C. Lobe, S. Tahraoui, A. Clapéron, M. Mergey, D. Wendum, F. Merabtene, C. Desbois‐Mouthon, F. Praz, L. Fouassier CRSA ‐ UMR_S 938 Inserm UPMC ; Eq. F. Praz & O. Rosmorduc : Biologie et traitement des tumeurs hépatobiliaires Background and aims: Cholangiocarcinoma (CCA) is a tumor that arises from biliary epithelial cells. CCA has a very poor prognosis due to its late clinical presentation and the lack of effective non‐surgical therapies. Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR), a tyrosine kinase receptor, is overexpressed in CCA tumors and plays a major role in CCA progression. Thus, EGFR has been envisaged as a molecular target for CCA therapy. However, clinical trials using the tyrosine kinase inhibitor (TKI) erlotinib, did not provide a therapeutic benefit in patients with CCA, suggesting the emergence of resistance mechanisms. In the present study, we intend to unravel the underlying cellular and molecular mechanisms involved in acquired resistance to erlotinib in CCA. Methods: Cell pools resistant to erlotinib were obtained by treating four human CCA cell lines with increasing concentrations of erlotinib for at least 6 months. Cell viability was determined by MTT. Signaling pathways were analyzed by phosphoprotein arrays and WB. BMS‐536924 and linsitinib, were used to inhibit both the insulin/insulin‐like growth factor‐1 receptors (IR/IGF1R). Adhesion and migratory ability of cells were evaluated by xCELLigence and videomicroscopy, respectively. Cell clonogenicity was evaluated by colony and sphere formation assays. Nude mice were used for in vivo xenografted experiments. Results: The four erlotinib resistant (R) CCA cells showed reduced sensitivity to erlotinib toxicity compared to their parental (WT) counterparts. All EGFR family members were inhibited, whereas IR and IGF1R were activated and their ligand, IGF2, was overexpressed in R cells compared to WT cells. Phenotypically R cells displayed a scattered phenotype, which was accompanied by a disruption of the adherens junctions as attested by the decreased expression of E‐cadherin and/or β‐catenin at the plasma membrane. In R cells, the expression of EMT‐inducing transcription factors (EMT‐TFs), as well as mesenchymal markers, was induced, along with an increase of adhesion and migratory properties of the cells. Additionally, the expression of CSC markers was also up‐regulated in R cells. Consistenly, R cells showed increase clonogenicity than WT cells in presence of erlotinib. Treatment with BMS536924 and linsitinib restored the sensitivity to erlotinib, reduced the expression of EMT‐TFs, and reduced the clonogenicity of R cells. In EGI‐1 xenografted mice, treatment with linsitinib restored the sensitivity to erlotinib of R tumors to WT levels. Conclusions: The activation of the IGF signaling axis contributes to erlotinib resistance through the regulation of an EMT program and stemness in CCA cells. 32
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne Posters Poster n°11 Knee and hip intra‐articular adipose tissues (IAATs): a new source of local inflammatory mediators in osteoarthritis Xavier HOUARD F. Eymard1, 2, A. Pigenet1, D. Citadelle1, J. Tordjman3, L. Foucher1, C. Rose1, C.‐H. Flouzat Lachaniette4, K. Clément3, F. Berenbaum1, 2, 5, X. Chevalier2 and X. Houard1 1
Sorbonne University, UPMC Univ Paris 06, INSERM, CRSA ‐ UMR_S 938 Inserm UPMC ; Eq. F. Berenbaum : Métabolisme et maladies articulaires liées à l'âge , Paris, France ; 2 Department of Rheumatology, AP‐HP Henri Mondor Hospital, Créteil, France ; 3 Sorbonne University, UPMC Univ Paris 06, INSERM UMR_S1166, Pitié‐
Salpêtrière Hospital, Paris, France; 4 Department of Orthopedic Surgery, AP‐HP Henri Mondor Hospital Créteil, France ; 5 Department of Rheumatology, Inflammation–Immunopathology–Biotherapy Department (DHU i2B), AP‐HP Saint‐Antoine Hospital, Paris, France. Objectives. As compared to subcutaneous adipose tissue (SCAT), infrapatellar fat pad (IFP), the main knee intra‐articular adipose tissue (IAAT), has an inflammatory phenotype in patients with osteoarthritis (OA). We phenotyped suprapatellar fat pad (SPFP) and hip acetabular fat pad (AFP), two other IAATs, to determinate the unique inflammatory signature of IAATs compared to SCAT. Methods. IFP, SPFP, AFP and autologous SCAT were obtained from OA patients during total knee (n=38) or hip replacement (n=5). Fibrosis and adipocyte area were analyzed by histology and vascularization and leukocyte and mast cell infiltration were analyzed by immunohistochemistry for von Willebrand factor, CD45 and tryptase, respectively. Secretion of IL‐6, IL‐8 and PGE2 was assessed by ELISA. The mRNA expression of adipocyteassociated genes (ATGL, LPL, PPAR‐γ, FABP4 and CD36) and developmental genes (SFRP2, HoxC9 and EN1) was determined. The inflammatory response of isolated fibroblastlike synoviocytes (FLS) to IFP and SPFP was analyzed. Results. Fibrosis, vascularization, and leukocyte and mast cell infiltration were greater in IAATs than SCAT, and levels of IL‐6, IL‐8 and PGE2 were greater in all IAATs than SCAT. IFP and SPFP induced a similar inflammatory response to FLS. Adipocyte area was smaller in IAATs than SCAT. Adipocyte‐
associated and developmental genes showed a similar gene expression pattern in all IAATs, different from SCAT. Conclusions. IFP but also SPFP and AFP (gathered under the term “IAAT”) may play a deleterious role in OA by affecting joint homeostasis because of their inflammatory phenotype and their close interaction with synovium in the same functional unit. 33
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne Posters Poster n°12 Implication du miR‐199 dans l’inflammation bronchique chez les patients atteints de mucoviscidose Pauline BARDIN E. Marchal‐Duval, F. Sonneville, P. Le Rouzic, S. Blouquit‐Laye, H. Corvol, O. Tabary CRSA ‐ UMR_S 938 Inserm UPMC ; Eq. H. Corvol : Mucoviscidose : physiopathologie et phénogenomique Introduction : La mucoviscidose (CF) est une maladie monogénique due à une mutation du gène qui code pour le canal chlorure CFTR. Le déséquilibre ionique causé par le dysfonctionnement de ce canal résulte au niveau pulmonaire par un épaississement important du mucus des voies aériennes. De plus, cette pathologie est caractérisée au niveau pulmonaire par des infections persistantes, mais également par une inflammation chronique, l’ensemble de ces éléments participant à la diminution de la fonction ventilatoire des patients CF. D’un point de vue moléculaire, il a été montré que la voie de signalisation principale de cette inflammation était NF‐κB sans que l’origine soit vraiment identifiée (Tabary et al. 1998). Dans la littérature, il a été montré, que cette voie pouvait être régulée par les microARNs (miRNAs) dont le rôle reste peu étudié dans la mucoviscidose. Méthodes : Par des analyses globales de miRNAs, nous avons mis en évidence que le miR‐199a était diminué dans les cellules épithéliales bronchiques de patients CF et que celui avait pour cible prédite le 3’UTR d’IKK , une des protéines de la voie NF‐ B. Résultats : Dans cette étude, nous avons pu montrer sur des explants bronchiques issus de patients, que miR‐199a est retrouvé comme étant diminué chez les patients CF par rapport aux patients non CF. Dans des études in vitro, nous avons montré que miR‐199a modulait l’expression de IKK et que cette modulation ciblait directement le site 3’UTR d’IKKβ. Dans des expériences de surexpressions d’IKK , nous avons confirmé que miR‐199a diminuait l’expression de la protéine IKKβ entrainant une diminution de l’activation de NF‐κB et de la sécrétion d’IL‐8 dans les surnageants de culture. Conclusions : Nous avons donc montré que le miR‐199a a un rôle de régulateur négatif de la voie NF‐
κB et que sa faible expression chez les patients CF participait à cette inflammation chronique. 34
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne Posters Poster n°13 Titre : Rôle de CHAC1 dans la modulation de la réponse des cellules épithéliales bronchiques CF (Cystic Fibrosis) infectées par Pseudomonas aeruginosa. Lea PERRA V. Balloy, H. Petat, S. Fedele, H. Corvol, M. Chignard, L. Guillot CRSA ‐ UMR_S 938 Inserm UPMC ; Eq. H. Corvol : Mucoviscidose : physiopathologie et phénogenomique Pneumologie pédiatrique, AP‐HP, Hôpital Trousseau, Paris. Introduction. Dans la mucoviscidose (CF : Cystic Fibrosis), Pseudomonas aeruginosa (Pa) colonise les voies respiratoires inférieures, aboutissant à une inflammation chronique de l’épithélium bronchique responsable de dommages tissulaires. Une analyse transcriptomique a permis à notre équipe d’identifier les gènes différentiellement exprimés dans des cellules épithéliales bronchiques primaires humaines (HBEC) CF et non CF au cours d’une infection par Pa. Parmi les gènes les plus différentiellement exprimés, CHAC1, une protéine qui dégrade le glutathion et qui est impliquée dans le stress du réticulum endoplasmique et l’apoptose, a été sélectionnée. L’objectif de cette étude est de comprendre son rôle dans la physiopathologie de la mucoviscidose notamment dans la réponse inflammatoire et l’apoptose. Méthodes. Les lignées cellulaires NCI‐H292, A549 et les HBEC ont été stimulées par Pa (souche PAK) et deux facteurs de virulence, le lipopolysaccharide (LPS) et la flagelline. L’expression de CHAC1 a été mesurée par qPCR et par Western Blot. Un siARN de CHAC1 et des cellules A549 transfectées de façon stable avec un plasmide contenant le promoteur de NF‐kB couplé à la luciférase, ont été utilisés pour déterminer le rôle de CHAC1 dans la réponse inflammatoire. Un anticorps anti‐PARP a été utilisé pour déterminer le rôle de CHAC1 dans l’apoptose. Résultats. En accord avec le transcriptome, nous avons confirmé par qPCR que CHAC1 est surexprimé dans les cellules non CF comparées aux cellules CF au niveau basal et au cours de l’infection. Des données préliminaires indiquent que la flagelline et le LPS sont capables d’induire l’expression de CHAC1. Toutefois, une réduction de l’expression de CHAC1 par siARN est associée à une augmentation de la réponse inflammatoire induite par le LPS et la flagelline (IL‐8, IL‐6, activité NF‐kB), alors que la surexpression de CHAC1 par Pa est associée à un clivage de PARP. Conclusion. Ces résultats suggèrent que CHAC1 est impliqué dans l’inflammation et l’apoptose des cellules bronchiques au cours de l’infection par Pa et qu’ainsi son absence dans les cellules CF pourrait participer à la réponse inflammatoire chronique observée chez les patients atteints de mucoviscidose. Ce travail est financé par les Associations Vaincre la Mucoviscidose et Grégory Lemarchal. 35
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne Posters Poster n°14 Etude des serpines A1 (α1‐antitrypsine) et A6 (corticosteroid‐binding globulin) dans le contexte de la mucoviscidose Anastasia TCHOUKAEV1,2 J. Taytard1,2,3, C. Rebeyrol1,2, F. Sonneville1,2, D. Debray1, N. Rousselet1,2, S. Blouquit‐Laye4, M.‐P. Moisan5, L. Guillot1,2, H. Corvol1,2,3, N. Chignard1,2, O. Tabary1,2, P. Le Rouzic1,2 1
UMR_S938 Inserm, Paris 2Univ. Pierre et Marie Curie, Paris 3Hôpital Armand Trousseau, Paris 4Univ. Versailles, Saint‐Quentin en Yvelines 5UMR INRA 1286, Univ. Bordeaux Introduction : La mucoviscidose (CF pour cystic fibrosis) est une maladie caractérisée par une inflammation pulmonaire chronique définie notamment par un recrutement important de neutrophiles qui libèrent des taux élevés d’élastase. Plusieurs serpines (serin protease inhibitors) produites majoritairement par le foie mais également par le poumon semblent intéressantes car elles permettent de lutter contre l’inflammation : la serpine A1 (α1‐antitrypsine ou AAT) qui inhibe l’élastase, et la serpine A6 (corticosteroid‐binding globulin ou CBG) protéine d’adressage des glucocorticoïdes sur le site de l’inflammation. L’objectif du travail est d’étudier la régulation de ces deux serpines dans le contexte inflammatoire de la mucoviscidose. Méthodes : 1) Biopsies de foies et de poumons de patients CF et non CF : analyse des transcrits CBG et AAT et Western Blot ; 2) Plasmas de patients cirrhotiques CF ou non CF : dosage de la CBG et de l’AAT ; 3) Culture de lignées hépatocytaires et bronchiques : étude de l’expression de CBG dans un contexte inflammatoire et anti‐inflammatoire. Résultats : Nous montrons une surexpression des transcrits et de la protéine CBG dans les foies de patients CF indépendamment de la cirrhose. Les études menées in vitro sur la lignée hépatocytaire Hep3B suggèrent que la CBG est régulée dans un contexte inflammatoire. Au niveau pulmonaire, l’expression bronchique et bronchiolaire de CBG diminue alors que l’expression de l’AAT augmente dans les différentes parties du poumon étudiées. L’étude de lignées bronchiques issues de patients CF et non CF montre une expression de CBG régulée par l’inflammation. Conclusions : L’ensemble des résultats montre une augmentation spécifique de l’expression de la CBG hépatique chez le patient CF qui pourrait être liée à l’inflammation. Les analyses en cours visent à confirmer cette augmentation dans le plasma de patients CF cirrhotiques et non cirrhotiques. Au niveau pulmonaire, plus d’AAT et moins de CBG exprimées localement suggèrent une résolution de l’inflammation, ce que l’on n’observe pas chez le patient. 36
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne Posters Poster n°15 Genomic Landscape and Prognosis in Pediatric Acute Myeloid Leukemia: A Study on the French ELAM02 Trial Hélène LAPILLONNE A. Marceau‐Renaut1,2*, N. Duployez1,2*, A. Petit3,4,5,, M. Figeac6*, M. Labopin4,7*, G. Leverger3,4*, C. Preudhomme1,2 and H. Lapillonne 1
Hematology laboratory, CHRU of Lille, Lille, France ; 2U1172, INSERM, Lille, France; 3Pediatric Department of Oncology and Hematology, Trousseau Hospital, HUEP, APHP, Paris, France; 4UMRS_938, Paris, France; 5
UMRS_938, GRC MyPAC, Sorbonne Universités, UPMC Univ Paris 06, Paris, France; 6Université de Lille 2, Lille, France; 7EBMT Paris study office / CEREST‐TC / Saint Antoine Hospital, Paris, France. Background. Acute Myeloid Leukemia (AML) is a rare and genetically heterogeneous disease that constitutes 15 to 20% of childhood leukemia. Despite major treatment improvement pediatric AML remains a challenging disease with poor outcome. Molecular analysis pointed out the prognostic impact of gene mutation such as FLT3‐ITD, NPM1 or CEBPA; and new categories of regulators like epigenetic modifiers. Nevertheless cytogenetic and mutational profiles are quite different between adult and pediatric AML. Extensive genomic studies have not been reported to date in pediatric AML. In this context it is of importance to identify additional genetic or molecular abnormalities to better understand leukemogenesis and also to predict outcome and serve as novel therapeutic targets. Methods. We performed a mutational analysis on diagnostic samples from patients enrolled in the French National Multicenter ELAM02 trial. 438 patients with de novo AML (except AML3) were enrolled between march 2005 and December 2011 (median age: 8,22yrs [0‐18.61]; median WBC: 15.4G/l [0.4‐575]; cytogenetic subgroups: CBF‐AML[n=97], NK‐AML [n=109], MLL‐AML[n=95], MRC2 other[n=77], MRC3 [n=55], failure [n=5]). Diagnostic samples were prospectively collected and 386 of the 438 patients (88%) were studied by next‐
generation sequencing (Miseq, Illumina with haloplex librairy and ion Proton, thermofischer with ampliseq librairy) including 36 genes frequently reported in myeloid malignancy. Two different technologies of next generation sequencing (NGS) were used, allowing direct validation. Results. We identified 579 driver mutations involving 36 genes or regions in 386 patients (mean 1.5 per case), with at least 1 driver mutation in 291 patients (75%) and 2 or more driver mutations in 44% of samples. The number of mutation identified at diagnosis in cytogenetic subgroup is significantly lower in MLL‐AML (0.44 mutation/patient; p<10‐4). Mutations involving genes from the tyrosine kinase pathways (i.e RAS, FLT3, KIT, PTPN11, JAK2, MPL, CBL) were the most frequent and represent 56.3% of all aberrations. Among them N‐RAS was detected in 26.4% of all cases, followed by FLT3‐ITD, KIT and K‐RAS in 14.8%, 12.4% and 12.2% respectively. We identified 64 driver mutations in the group of transcription factors (CEBPA, RUNX1, GATA, ETV6), 60 in the combined group of chromatin modifier (ASXL1, EZH2, BCOR) and DNA methylation (DNMT3A, IDH, TET2), 59 in the group of tumor suppressor genes (WT1, PHF6, TP53) 36 mutations in NPM1 gene, and few mutations in cohesion and spliceosome sub‐groups. Among the 438 patients, 398 (91%) were in complete remission (CR) after two courses (induction and first consolidation), the 5‐year overall survival (OS) is 71.5% [65‐78] and the 5‐year leukemia free survival (LFS) is 56.6% [49.7‐63.5]. In univariate analysis, we found that FLT3‐ITD, mutations in RUNX1, WT1 and PHF6 were associated with reduced LFS (p=0.0003 for FLT3‐ITD, p=0.01 for RUNX1, p=0.02 for WT1 and p=0.025 for PHF6) and reduced OS (p=0.0003 for FLT3‐ITD, p=0.0003 for RUNX1, p=0.015 for WT1 and p=0.04 for PHF6). Mutations in NPM1 is associated with an improved 5‐yr LFS (p=0.014) and 5‐yr OS (p=0.005). Multivariate analysis revealed that FLT3‐ITD, RUNX1 and PHF6 were independently associated with an adverse outcome and NPM1 with an improved outcome. Conclusions. We performed an extensive mutational study in de novo pediatric AML enrolled in the ELAM02 trial. We described the genomic landscape of 386 patients and showed the frequency of different mutations according cytogenetics. Interestingly we found mutations in genes involved in constitutional or pre‐leukemic disease such as PTPN11, RUNX1, MPL or ETV6. We found that FLT3‐ITD, RUNX1 and PHF6 mutations predict poor outcome although NPM1 mutations predict a better outcome. Mutational profiling reveals useful information for risk stratification and therapeutic decisions. 37
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne Posters Poster n°16 L’architecture clonale des leucémies aiguës myéloïdes avec mutations de TP53 suggère différents mécanismes d’initiation et d’évolution Hannah MOATTI P. FLANDRIN, P. HIRSCH, R. TANG, N. ABERMIL, C. BILHOU‐NABERA, F. DELHOMMEAU CRSA ‐ UMR_S 938 Inserm UPMC ; Eq. F. Delhommeau : Prolifération et différenciation des cellules souches : Application à la thérapie cellulaire hématopoiétique Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) résultent de l’acquisition successive de différentes lésions génétiques. Les LAM mutées pour le gène suppresseur de tumeur TP53 sont associées à un caryotype complexe et un mauvais pronostic. Notre travail a étudié l’architecture clonale de LAM mutées pour TP53 en distinguant les LAM de novo, les LAM induites (t‐AML) et les LAM secondaires (s‐AML) à un syndrome myéloprolifératif (SMP), par le biais de séquençage standard et d’analyse génotypique de colonies issues de progéniteurs. Nous avons observé plusieurs profils d’architecture clonale, qui suggèrent que l’amplification du clone muté pour TP53 est permise par la chimiothérapie pour les t‐
AML et par l’acquisition de mutations de régulateurs épigénétiques comme DNMT3A ou TET2 pour les LAM de novo. Les s‐AML faisant suite à un SMP peuvent avoir un profil proche des t‐AML, avec des mutations de TP53 isolées, ou un profil proche des LAM de novo. Supposant que la forte fréquence des mutations de TP53 dans les s‐AML pouvait être due à une sélection de cellules mutées par le traitement, nous avons recherché des petits clones mutés pour TP53 dans une série de SMP par séquençage de haute sensibilité, en distinguant les patients traités ou non par cyto‐réducteur. Nous avons observé de nombreux clones mutés à la fois chez les patients traités (5/12) et chez les patients non traités (2/5). Ces données doivent être complétées par l’étude de 26 patients supplémentaires et par la confirmation des variants en PCR digitale. En conclusion, les LAM mutées pour TP53 suivent plusieurs modèles d’architecture clonale, où l’expansion du clone muté pour TP53 semble nécessiter un second événement, constitué par un traitement ou une mutation d’un régulateur de l’épigénétique impliqué dans l’hématopoïèse clonale liée à l’âge. 38
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne Posters Poster n°17 Syndrome de Lynch : mise au point d’un test diagnostique basé sur la caractérisation fonctionnelle de tolérance à la méthylation des variants MMR (Mismatch Repair) identifiés par séquençage chez les patients Delphine BOUVET 1, 2 A. MUNIER3, M. SVRCEK1, 2, 4, A. DUVAL1, 2 et M. MULERIS1, 2 1 : INSERM UMRS 938 – CRSA, Equipe « Instabilité des Microsatellites et Cancer » ; 2 : UPMC ; 3 : UMS30‐LUMIC, Plateforme de Cytométrie en Flux CISA, UPMC ; 4 : AP‐HP, Hôpital Saint‐Antoine, Service d’Anatomie et Cytologie Pathologiques. Le syndrome de Lynch est la première cause de forme familiale de cancer colorectal. Il est dû à une mutation germinale hétérozygote d’un des gènes du système de réparation des mésappariements (MMR pour MisMatch Repair) et le diagnostic est basé sur l’analyse génétique de ces gènes. Les altérations détectées sont classées de 1 (clairement neutres) à 5 (clairement pathogènes). Une proportion significative des altérations identifiées demeurent toutefois des variants pour lesquels le lien de causalité avec la pathologie n’est pas établi avec certitude, et qui ne pouvent donc pas être utilisés pour poser le diagnostic. Les variants représentent une problématique clinique majeure puisque leur nombre ne peut qu’augmenter avec l’avènement des techniques de séquençage à haut débit. Le MMR participe à la signalisation des lésions de l’ADN dues à la méthylation. Ainsi, les cellules MMR déficientes ne reconnaissent pas de telles lésions et sont par conséquent capables d’échapper à l’apoptose (phénotype de tolérance à la méthylation). Notre objectif est de développer un test fonctionnel de caractérisation des variants MMR, basé sur la tolérance à la méthylation des cellules MMR déficientes afin d’améliorer le diagnostic du syndrome de Lynch. Notre stratégie expérimentale est de tester la capacité de variants du gène MLH1, transfectés dans la lignée de cancer colorectal HCT116 (MLH1 déficiente), à complémenter la déficience MMR. Une restauration de la sensibilité à la méthylation (caractéristique des cellules MMR compétentes) suggèrerait que le variant est non pathogène alors qu’une conservation de la tolérance à la méthylation indiquerait que le variant est délétère. Une approche similaire a été mise au point récemment dans l’équipe pour le diagnostic d’une forme pédiatrique du syndrome de Lynch1. Au cours d’une étude de preuve de concept, nous avons déterminé les paramètres expérimentaux qui permettent le mieux de discriminer la lignée HCT116 transfectée par le gène MLH1 sauvage ou par une séquence aléatoire (contrôle). Dans une deuxième étape, nous testons actuellement des altérations clairement délétères ou neutres afin de valider la méthode. Notre objectif est de développer un test fonctionnel permettant de discriminer les variants MMR pathogènes et non pathogènes afin de prendre en charge les familles de la façon la plus adaptée. 1 : Bodo et al., Gastroenterology 2015, 149, 1017‐29. 39
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne Posters Poster n°18 Impact des protéines du VIH, Tat et Nef, et de certains ARV sur la sénescence, la différenciation, et le remodelage de la matrice extracellulaire des cellules souches mésenchymateuses du tissu adipeux (ASC) Jennifer GORWOOD T. Ejlamanesh, B. Fève, J. Capeau, V. Béréziat*, C. Lagathu* (*Co‐direction) CRSA ‐ UMR_S 938 Inserm UPMC ; Eq. B. Fève : Lipodystrophies génétiques et acquises Certains patients infectés par le VIH sous traitement antirétroviral (ARV) présentent une prévalence accrue de comorbidités classiquement liées au vieillissement, avec des atteintes cardio‐métaboliques associées à une accumulation tronculaire de tissu adipeux (TA). Malgré des combinaisons thérapeutiques actuelles moins agressives sur le TA, certains patients présentent une lipohypertrophie abdominale dont la physiopathologie reste mal comprise. Des données préliminaires du laboratoire suggèrent un rôle différentiel de certaines protéines du VIH et des ARV dans le remaniement de la matrice extracellulaire (MEC) et l’inflammation du TA sous‐cutané (TASC) et viscéral hypertrophiques de ces patients. De façon intéressante, le vieillissement physiologique est également associé à une redistribution du TA, des dysfonctions adipocytaires et une inflammation. Ces données évoquent la survenue d’un vieillissement prématuré du TA qui participerait aux atteintes cardio‐métaboliques observées chez les patients infectés par le VIH et sous ARV. L’objectif de notre étude a été de déterminer l’impact de certaines protéines du VIH (Tat, Nef) ou des ARV fréquemment utilisés en clinique (Inhibiteurs de protéase IPs et d’intégrase INIs) sur la sénescence des ASC. Pour cela, les ASC humaines sont cultivées pendant 30 jours, et tous les 5 jours, nous avons étudié la sénescence, la capacité proliférative, le stress oxydant et les dysfonctions mitochondriales. Le traitement chronique avec IPs et les INIs, et dans une moindre mesure Tat et Nef, provoquent une diminution de la capacité de prolifération des ASC, avec une aggravation progressive jusqu’à 30 jours. L’exposition aux ARV et aux protéines du VIH conduit à une augmentation du stress oxydant, provenant en partie de la mitochondrie, de l’activité de la Senesence‐Associated‐β‐galactosidase, de l’expression des protéines d’arrêt du cycle cellulaire, et de composants de la MEC, suggérant la mise en place d’une sénescence précoce. A l’issue de ces 30 jours, nous avons évalué leur capacité de différenciation adipocytaire. De façon intéressante, la sénescence des ASC est associée à un stress oxydant résiduel dans les ASC en cours de différenciation, conduisant à une altération de la différenciation adipocytaire tardive, caractérisée par une baisse de l’accumulation de triglycérides et des marqueurs adipocytaires. L’ensemble de ces résultats permet une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans les dysfonctions adipocytaires contribuant aux atteintes cardio‐métaboliques observées lors du vieillissement des patients infectés par le VIH et sous traitement ARV. Pour compléter ces données, nous mettrons en place la culture 3D des ASC, technique innovante qui permettra de révéler/accentuer l’effet des protéines du VIH et/ou des ARV sur la MEC du TA et sur l’adipogénèse. 40
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne Posters Poster n°19 Functional Defect of Variants in the ATP‐binding Sites of ABCB4 and their Rescue by the CFTR Potentiator, Ivacaftor (VX‐770) Alix BRUNEAU A. Bruneau1, J.‐L. Delaunay1, B. Hoffmann2, A.‐M. Durand‐Schneider1, V. Barbu1, E. Jacquemin3, M. Maurice1, C. Housset1, I. Callebaut2 and T. Aït‐Slimane1 CRSA ‐ UMR_S 938 Inserm UPMC ; Eq. C. Housset : Pathologies métaboliques, billiaires et fibro‐inflammatoires du foie Background: ABCB4 (MDR3) is an ATP‐binding cassette (ABC) transporter expressed at the canalicular membrane of hepatocytes where it mediates phosphatidylcholine (PC) secretion. Variations in the ABCB4 gene are responsible for several biliary diseases, including progressive familial intrahepatic cholestasis type 3 (PFIC3), a rare disease that can be lethal in the absence of liver transplantation. Methods: We have investigated the effect and potential rescue of ABCB4 missense variations that reside in the highly conserved motifs of ABC transporters, involved in ATP binding. Five disease‐causing variations in these motifs have been identified in ABCB4 (G535D, G536R, S1076C, S1176L and G1178S), three of which are homologous to the gating mutations of cystic fibrosis transmembrane regulator (CFTR or ABCC7), (i.e. G551D, S1251N and G1349D), previously shown to be function‐defective and corrected by ivacaftor (VX‐770, Kalydeco®), a clinically approved CFTR potentiator. Results: Molecular modeling predicted that all five ABCB4 variants would disrupt critical interactions in ATP binding and thereby interrupt ATP‐induced nucleotide‐binding domains (NBDs) dimerization, likely resulting in a defect in ABCB4 function. This prediction was confirmed by expression in cell models, which showed that the ABCB4 mutants were normally processed and targeted to the plasma membrane, whereas their PC secretion activity was dramatically decreased. As also hypothesized on the basis of this prediction, PC secretion activity of the mutants was rescued by the CFTR potentiator ivacaftor (VX‐770). Conclusion: Disease‐causing variations in the ATP‐binding sites of ABCB4 lead to impairment of PC secretion, which can be rescued by ivacaftor. These results provide the first experimental evidence that ivacaftor is a potential therapeutic drug for selected patients who harbor mutations in the ATP‐
binding sites of ABCB4. 41
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne Posters Poster n°20 Breast cancer cell adaptation to hypoglycemic stress Antonin PRUNET1,2 M. Zaoui1, A. K. Larsen1, T. Lorenzi3, N. Ferrand1, L. Neves de Almeida2 et M. Sabbah1 1 CRSA ‐ UMR_S 938 Inserm UPMC ; Eq. A. Larsen & A. de Gramont : Biologie et thérapeutiques du cancer 2 UMR 7598, Laboratoire Jacques‐Louis Lions 3 School of Mathematics and Statistics, University of St Andrews Cancer and metabolism are two very linked topics. Cancer is characterized by a deregulation of the cells death and proliferation mechanisms. The excessive proliferation of cells is correlated with an intense consumption of energy. But since the medicine Nobel prize Otto Heinrich Warburg, we know that although cancer cells may be in an aerobic environment, most of these cells generate ATP through glycolysis only (degrading glucose into pyruvate, which is then turned into lactic acid by fermentation). The yield of ATP molecules produced for one molecule of glucose by this metabolic pathway is very low compared to what we can obtain with the Krebs cycle and the respiration chain. This is why, cancer cells need to have a very intense consumption of glucose in order to sustain their metabolic activity. But what happens when those cells are submitted to a deprivation of glucose? In this work, we try to look at the way mesenchymal and epithelial breast cancer cells react to glucose deprivation. We are especially interested in the regulation processes of the cell cycle. To do so, we have built a model (a time‐inhomogeneous Markov Chain) in which the population of cells is discretized into 3 subpopulations corresponding to the phases of the cell cycle they are in (G0/G1, S or G2). Each of these phases has a transition rate that enables the cells to jump into the next phase of the cycle. Cells dividing during mitosis, after the G2 phase, give two daughter cells. We also consider cellular death in the model. On the experimental side, cells that are initially seeded at 4.5 g/L glucose are then grown in mediums with restricted concentrations of glucose (from 0 to 4.5 g/L). We stop their growth each day up to day 4 and look at several kinds of measures. First, we count the number of cells to have an estimate of the proliferation. Then we us the FACS to analyze the repartition of the cells in the different phases of the cell cycle. And finally we look at the way cells are dying by using Annexin V. The combination of those three measures enables us to have an estimate of the transition rates in the model. A statistical study finally tries to show whether there exists or not a correlation between those transition rates and environmental factors. This mathematical model gives us some insight on the way glucose can have an effect on the regulation of the cell cycle. 42
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne
LISTE DES PARTICIPANTS 2016 ABI HABIB AIT SLIMANE ARACTINGI ATFI ATTALI AUCLAIR AUCOUTURIER BADI BANGA BAHIEDDINE BALLOY BARDIN BASTARD BENABOU BERENBAUM BÉRÉZIAT BERTRAND BESSON‐LESCURE BLAISE BOISSAN BOKHARI BOUVET BRUNEAU CADORET CALMEL CAPEL CHAIGNEAU CHAPEL CHIGNARD CORVOL COULAIS COURTIES COURTY DALLE DE VASSOIGNE DELAUNAY DELHOMMEAU DEZAIRE DONG DOROTHEE DUVAL FALGUIÈRES FALKENRECK FELLAHI FERRAND FERRIGNO FÈVE FONTAINE FOUASSIER GARCIA GAUGLER GEROTZIAFAS GESPACH Walid Tounsia Selim Azeddine Claire Martine Pierre Gloria Samia Viviane Pauline Jean‐Philippe Eva Francis Véronique Romane Bernadette Annick Mathieu A’dem Delphine Alix Axelle Claire Emilie Thomas Alain Michel Harriet Timothé Alice Emilie Héloïse Frédéric Jean‐Louis Fançois Ambre Yuan Guillaume Alex Thomas Dina Soraya Nathalie Olivier Bruno Romain Laura Marie Béatrice Grigoris Christian CRSA ‐ Eq. Le Bouc / Netchine CRSA ‐ Eq. Housset CRSA ‐ Eq. Aractingi / Daraï CRSA ‐ Eq. Atfi CRSA ‐ Eq. Berenbaum CRSA ‐ Eq. Fève CRSA ‐ Eq. Aucouturier CRSA ‐ Eq. Le Bouc / Netchine CRSA ‐ Eq. Mohty CRSA ‐ Eq. Corvol CRSA ‐ Eq. Corvol CRSA ‐ Eq. Fève CRSA ‐ Eq. Praz / Rosmorduc CRSA ‐ Eq. Berenbaum CRSA ‐ Eq. Fève CRSA ‐ Eq. Duval UMS 30 ‐ Lumic CRSA ‐ Eq. Le Bouc / Netchine CRSA ‐ Eq. Praz / Rosmorduc CRSA ‐ Eq. Duval CRSA ‐ Eq. Duval CRSA ‐ Eq. Housset CRSA ‐ Eq. Housset CRSA ‐ Eq. Praz / Rosmorduc CRSA ‐ Eq. Fève CRSA ‐ Eq. Aucouturier CRSA ‐ Eq. Delhommeau CRSA ‐ Eq. Corvol CRSA ‐ Eq. Corvol CRSA ‐ Serv. PHEA CRSA ‐ Eq. Berenbaum CRSA ‐ Eq. Fève CRSA ‐ Eq. Fève CRSA ‐ Eq. Mohty CRSA ‐ Eq. Housset CRSA ‐ Eq. Delhommeau CRSA ‐ Eq. Larsen / de Gramont CRSA ‐ Eq. Aucouturier CRSA ‐ Eq. Aucouturier CRSA ‐ Eq. Duval CRSA ‐ Eq. Housset UMS 30 ‐ Lumic CRSA ‐ Eq. Fève CRSA ‐ Eq. Larsen / de Gramont CRSA ‐ Eq. Atfi CRSA ‐ Eq. Fève CRSA ‐ Eq. Aractingi / Daraï CRSA ‐ Eq. Praz / Rosmorduc CRSA ‐ Eq. Fève CRSA ‐ Eq. Mohty CRSA ‐ Eq. Larsen / de Gramont CRSA ‐ Serv. Adm. walid.abi‐[email protected] tounsia.ait‐[email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] jean‐[email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] bernadette.besson‐[email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] frederic.de‐[email protected] jean‐[email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] marie‐[email protected] [email protected] [email protected] [email protected] 43
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne
GIRARDET GORWOOD GREENE GROMAT GUEGAN GUILLOT GUYONNEAU‐HARMAND HEBERT HOUARD HOUSSET JERU JOLLY KAABI KAPPELER KEMGANG KOBARI LAFON LAGATHU LAMARTHÉE LAPILLONNE LARSEN LE ROUZIC LEDENT LEFORESTIER LEVY LIU LOEUILLARD MAGASSA MANTECON MARIE MAZURIER MECHIGHEL MESINELE MEUNIER‐BRUNEL MILLERAND MOLDES MORICHON MULERIS MUNIER NANA NETCHINE NOISETTE PEREZ LOZANO PERRA PIGENET POINTOUT PRAZ PRIGNON PRUNET PRUNIER ROUILLE ROUX SABBAH SABOT Clémence Jennifer Malorie Sandrine Sarah Loic Laurence Nicolas Xavier Chantal Isabelle Séverine Nawel Laurent Astrid Ladan Nicolas Claire Baptiste Hélène Annette Philippe Tatiana Erwan Laurence Yuanhui (Benoit) Emilien Salimata Matthieu Tiffany Christelle Patricia Julie Nadège Marion Marthe Romain Martine Annie Maryse Irène Arnaud Maria Luisa Léa Audrey Quentin Françoise Aurelie Antonin Céline Thomas Lauriane Michèle Julie CRSA ‐ Eq. Le Bouc / Netchine CRSA ‐ Eq. Fève CRSA ‐ Eq. Duval CRSA ‐ Serv. Adm. CRSA ‐ Eq. Aractingi / Daraï CRSA ‐ Eq. Corvol CRSA ‐ Eq. Delhommeau CRSA ‐ Eq. Delhommeau CRSA ‐ Eq. Berenbaum CRSA ‐ Eq. Housset CRSA ‐ Eq. Fève CRSA ‐ Eq. Delhommeau CRSA ‐ Eq. Atfi CRSA ‐ Eq. Le Bouc / Netchine CRSA ‐ Eq. Housset CRSA ‐ Eq. Delhommeau CRSA ‐ Serv. Adm. CRSA ‐ Eq. Fève CRSA ‐ Eq. Mohty CRSA ‐ Eq. Delhommeau CRSA ‐ Eq. Larsen / de Gramont CRSA ‐ Eq. Corvol CRSA ‐ Serv. PHEA CRSA ‐ Serv. Adm. CRSA ‐ Eq. Atfi CRSA ‐ Eq. Praz / Rosmorduc CRSA ‐ Eq. Housset CRSA ‐ Eq. Aucouturier CRSA ‐ Eq. Fève CRSA ‐ Eq. Delhommeau CRSA ‐ Eq. Delhommeau CRSA ‐ Serv. Adm. CRSA ‐ Eq. Corvol UMS 29 ‐ Omique CRSA ‐ Eq. Berenbaum CRSA ‐ Eq. Fève UMS 30 ‐ Lumic CRSA ‐ Eq. Duval UMS 30 ‐ Lumic CRSA ‐ Serv. Adm. CRSA ‐ Eq. Le Bouc / Netchine CRSA ‐ Serv. Adm. CRSA ‐ Eq. Berenbaum CRSA ‐ Eq. Corvol CRSA ‐ Eq. Berenbaum CRSA ‐ Serv. PHEA CRSA ‐ Eq. Praz / Rosmorduc UMS 28 ‐ LIMP CRSA ‐ Eq. Larsen / de Gramont CRSA ‐ Eq. Atfi CRSA ‐ Eq. Aractingi / Daraï CRSA ‐ Eq. Atfi CRSA ‐ Eq. Larsen / de Gramont CRSA ‐ Eq. Berenbaum [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] ladan.kobari‐[email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] philippe.le‐[email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] 44
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne
SAGET SAÏDI SBEIH SELLAM SOBCZAK‐THÉPOT SOBRIER SONNEVILLE SOULA STARY STEUNOU SUDRE TABARY TAHRAOUI TCHOUKAEV THIAM THIBOUT TRISMERCIN VAN EEGHER VAQUERO VATIER VAUTHIER VIGOUROUX WANHERDRICK YE ZAOUI ZOUALI Sarah Alhamid Maria Jérémie Joëlle Marie‐Laure Florence Hedi Anne Virginie Laure Olivier Sylvana Anastasia Ibrahima Hélène Olguine Sandy Javier Camille Virginie Corinne Kristell Yishan Maurice Habib CRSA ‐ Eq. Le Bouc / Netchine CRSA ‐ Serv. Adm. CRSA ‐ Eq. Aractingi / Daraï CRSA ‐ Eq. Berenbaum CRSA ‐ Eq. Praz / Rosmorduc Biobanques – US13 CRSA ‐ Eq. Corvol CR Cordeliers CRSA ‐ Eq. Praz / Rosmorduc CRSA ‐ Eq. Le Bouc / Netchine CRSA ‐ Eq. Berenbaum CRSA ‐ Eq. Corvol CRSA ‐ Eq. Praz / Rosmorduc CRSA ‐ Eq. Corvol CRSA ‐ Serv. Adm. CRSA ‐ Serv. Adm. CRSA ‐ Serv. Adm. CRSA ‐ Eq. Berenbaum CRSA ‐ Eq. Praz / Rosmorduc CRSA ‐ Eq. Fève CRSA ‐ Eq. Housset CRSA ‐ Eq. Fève CRSA ‐ Eq. Duval CRSA ‐ Eq. Mohty CRSA ‐ Eq. Larsen / de Gramont CEPHB [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] marie‐[email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] sandy.van‐[email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] 45
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne
Partenaires 2016 Exposants ‐ Jeudi et vendredi Beckman Coulter France S.A.S. Paris‐Nord 2 22, Avenue des Nations B.P. 54359 ‐ Villepinte 95942 Roissy CDG Cedex www.beckmancoulter.com Exiqon Skelstedet 16 DK‐2950 Vedbaek Denmark www.exiqon.com MerckMillipore MERCK ‐ SIGMA ALDRICH Merck Millipore – BP 307 78054 Saint Quentin Yvelines CEDEX – France Merck Millipore is a division of Merck KGaA, Darmstadt, Germany. www.merckmillipore.com PEPROTECH 12, rue Paul Chatrousse 92200 Neuilly‐sur‐Seine www.peprotech.com Mettler‐Toledo SAS 18/20 avenue de la Pépinière 78222 Viroflay cedex www.mt.com Promega France 24, chemin des Verrières 69260 Charbonnières‐les‐Bains www.promega.com Exposants ‐ Jeudi eBIOSCIENCES ‐ AFFYMETRIX eBioscience GmbH Eysseneckstral3e 4, 60322 Frankfurt/Main, Germany Now part of Thermo Fisher Scientific www.ebloscience.affymetrix.com PromoCell GmbH Sickingenstrasse 63/65 69126 Heidelberg | Germany www.promocell.com www.promokine.info www.promocell‐academy.com Envigo 15, av. des Portes Occitanes CS 30001 03800 Gannat www.envigo.com Support matériel ou financier sans stand DUTSCHER s.a. 30, rue de l'industrie BP 62 67172 Brumath, France www.dutscher.com Inovarion SAS Tour Onyx 10 rue Vandrezanne 75013 Paris www.inovarion.com 46
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne
Présentations de nos partenaires commerciaux Jeudi 17 novembre – 10h55 – 11h05 EXIQON Potent knock down of lncRNAs in vitro and in vivo with antisense LNA™ GapmeRs Johnathan Lai, PhD Senior Scientist, Exiqon While long non‐coding RNAs (lncRNAs) are believed to exceed protein coding RNAs in numbers, only very few have been characterized in any detail. One of the most basic yet powerful approaches to study lncRNAs is loss of function analysis, but since many lncRNAs are nuclear retained or have long residence time in the nucleus, these are hard to target by RNAi based methods. We have developed single stranded LNA™‐enhanced antisense oligonucleotides (ASOs, also known as LNA™ GapmeRs) that catalyze RNaseH dependent degradation of both mRNAs and lncRNA. Since RNaseH is almost exclusively present in the nucleus, all RNAs are potentially sensitive to LNA™ GapmeR knock down. The LNA™ GapmeRs are designed by our empirically derived algorithm to provide ASOs that achieve potent target knockdown with a high hit‐rate. Off‐targets are a relevant concern for all antisense strategies. To address potential off targets located in either exons or introns, our LNA™ GapmeR design algorithm searches both spliced and unspliced transcriptomes in the Ensembl database, to provide maximal target specificity. LNA™ GapmeRs applied to knock down multiple different RNA targets in vitro demonstrates that both mRNA and lncRNA targets residing in either cytoplasmic or nuclear compartments are equally efficiently silenced irrespective of the type of RNA target and its subcellular localization. We also report highly efficient and long lasting knockdown of a nuclear retained lncRNA in a broad range of tissues in mice subjected to systemic administration of a LNA™ GapmeR. LNA™ GapmeRs are therefore excellent tools for lncRNA loss of function analysis in vitro and in vivo and provide an excellent platform for therapeutic targeting of lncRNA. 47
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne
Jeudi 17 novembre – 11h40 – 11h50 MERCK MILLIPORE The CellAsic® Onix : Precision control of your cell culture environment for advanced live cell imaging and microscopy. Jan Brants Merck KGaA. Life is dynamic. Live cell analysis yields necessary and unique insight into living processes that are rapidly changing. While collecting data from a moment in time with classical endpoint analyses has value, the increasingly common practice of observation and measuring cellular changes over extended periods of time reveals more about the true behavior of biological systems. The challenge has been in creating a dynamic cell culture environment that is controllable, manipulatable and reproducible. The ability to grow and manipulate complex culture requires precision control over the cell culture environment. The CellAsic® Onix2 microfluidic system is an integrated microincubator controller which controls flow rates, gaz, temperature shifts, standing gradients, nutriment/drug additions and media changes. It is a powerful, automated platform for precise manipulation of multiple key cell culture. It can be integrated with a broad range of inverted microscopes to allow for continuous, high magnification observation of live cells. The CellAsic® Onix2 system turns your microscope into a powerful live cell culture and imaging system. 48
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne
Jeudi 17 novembre – 12h35 – 12h45 BECKMAN COULTER FRANCE S.A.S. A new kind of detector in Flow Cytometer: Characteristic, Performance and Benefits Jaen Olivier PhD, Field Marketing Manager, France and Belgium Beckman Coulter Flow Cytometry is widely used in different kind of analysis, starting from routine application such as CD4 counting, Leukemia Lymphoma phenotyping till fundamental research. Classical Flow Cytometers are using simple photodiodes (PD) and or photomultiplier tube detectors (PMT). Despite these devices are efficient, the avalanche photodiode (APD) have been introduced into biosciences. This detector has a more linear response when changing gains that allows to recalculate automatically compensations fluorescence’s. Furthermore, APD has a better Quantum Yield from 500 nm up to 1300 nm compare to PMT. This characteristic clearly helps to better detect dimly expressed antigens. 8 peaks beads measurement shows that on every classical channels the sensitivity is clearly better. As a consequence, the resolution and accuracy of detected signals are better compare to conventional detection devices. The APD is a semi‐conductor device created after the Second World War, and it was used in spatial imaging but also in telecommunication. During this presentation we will explain how APD work, their characteristic, performance and benefits in biological samples research. 49
12ème Séminaire annuel du CRSA ‐ 17 et 18 novembre 2016 – Château de Montvillargenne
Jeudi 17 novembre – 15h30 – 15h40 PROMEGA Nouvelles approches pour le suivi du métabolisme cellulaire Mourad FERHAT PhD, Product Manager, Cellular analysis and Proteomics Promega De nombreuses études indiquent que des perturbations du métabolisme cellulaire sont associées à certaines conditions pathologiques (cancer, diabète …). Comprendre le fonctionnement de ces voies métaboliques permettrait de découvrir de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les approches actuelles pour étudier le métabolisme souffrent de nombreuses limites (problèmes de sensibilité, reproductibilité…). Nous présenterons de nouvelles approches hautement sensibles basées sur la bioluminescence permettant d’obtenir une réponse rapide sur l’état métabolique des cellules. 50