Module 10 - PCR quantitative pour la détection d`OGM - EU

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Analyse d’échantillons alimentaires pour la
présence d’organismes génétiquement modifiés
Module 10
PCR quantitative pour la détection d’OGM
F. Weighardt
WORLD HEALTH ORGANIZATION
REGIONAL OFFICE FOR EUROPE
WELTGESUNDHEITSORGANISATION
REGIONALBÜRO FÜR EUROPA
ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE
BUREAU REGIONAL DE L’EUROPE
ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ
ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО
2
Table des matières
Module 10
INTRODUCTION
3
METHODES DE QUANTIFICATION PCR
4
HISTORIQUE DES TECHNIQUES DE PCR EN TEMPS REEL
7
PRINCIPES DE PCR EN TEMPS REEL
7
PRINCIPES DE QUANTIFICATION AVEC PCR EN TEMPS REEL
13
REFERENCES
20
Analyse d’échantillons alimentaires pour la présence d’organismes génétiquement modifiés
Module 10
3
Introduction
Lorsqu’un produit alimentaire est déterminé positif pour une ou plusieurs lignées GM
(soja Roundup Ready®, maïs Bt-176, maïs Bt-11, maïs MON810 et maïs T25), les
étapes analytiques suivantes consistent à évaluer la conformité avec la législation en
vigueur (Règlement (CE) 1829/2003, Règlement (CE) 1830/2003) en mesurant la
quantité de chaque lignée d’OGM présente dans chaque ingrédient (Figure 1).
Les règlements susmentionnés disposent que tous les produits contenant des OGM,
consistant en de tels organismes ou produits à partir d’OGM doivent être marqués en
conséquence.
L’étiquetage n’est pas requis pour les produits à base de matières contenant des
OGM, consistant en OGM ou produits à partir d’OGM dans une proportion ne
dépassant pas 0,9 % des ingrédients alimentaires pris individuellement, à condition
qu’une telle présence soit fortuite ou techniquement inévitable.
Tous les ingrédients (farine, huile, etc.) dérivés d’une espèce unique (par ex. maïs,
soja, colza, etc.) sont considérés collectivement en tant qu’ingrédient unique (par ex.
maïs).
Maïs GM 0,6%
Soja non GM
99,4%
Maïs non GM
99,4%
Soja GM 0,6%
Figure 1. Aucun marquage requis. La quantité de soja GM et de maïs GM est
inférieure au seuil autorisé.
Par exemple, si un ingrédient dérivé exclusivement du maïs contient moins de 0,9 %
de maïs GM, aucun étiquetage n’est nécessaire pour les aliments dérivés de ce
dernier. En revanche, s’il contient plus de 0,9 % de maïs GM, les produits
alimentaires dérivés doivent être étiquetés en conséquence. Cela vaut également si,
en tenant compte de l’ensemble des ingrédients dérivés de variétés différentes (par
ex. soja et maïs), la quantité relative de maïs GM tombe en dessous de 0,9 % dans
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le produit final. Si au moins deux variétés de maïs GM sont présentes, leurs
concentrations respectives doivent être ajoutées et le pourcentage total utilisé pour
déterminer l’exigence pour l’étiquetage (Figure 2). Si le résultat est inférieur à 0,9 %,
aucun étiquetage n’est requis.
Maïs Bt 176
0,6%
Soja non GM
100%
Maïs non GM
98,8%
Maïs Bt 11
0,6%
Figure 2. Etiquetage requis pour l’ingrédient maïs. Les sommes des lignées Bt-11
(0,6 %) et Bt-176 (0,6 %) dépassent le seuil de 0,9 % requis pour l’étiquetage.
La teneur relative en OGM (sous forme de pourcentage) est déterminée en divisant
le nombre de copies de séquences spécifiques de l’OGM par le nombre de copies de
gènes spécifiques d’une plante (par ex. lectine pour le soja et invertase ou zéine pour
le maïs). Le pourcentage d’OGM qui en résulte s’exprime par conséquent sous la
forme suivante : OGM (%) = ADN GM/ADN référence x 100.
Méthodes de quantification PCR
Un des inconvénients majeurs de la PCR classique réside dans le manque
d’informations quantitatives précises en raison de l’efficacité de l’amplification. Si
l’efficacité de la réaction pour chaque cycle d’amplification demeure constante, la
concentration d’ADN après la PCR serait directement proportionnelle à la quantité
d’ADN cible initiale. Malheureusement, l’efficacité de l’amplification varie en fonction
des diverses réactions, ainsi que dans les cycles consécutifs au cours d’une seule et
même réaction. En particulier, lors des derniers cycles de la PCR, les résultats de
l’amplification sont générés de manière non exponentielle à un rythme de réaction
inconnu.
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La quantification d’ADN basée sur une PCR classique repose sur des mesures de
valeurs limites pour obtenir une sensibilité optimale, lorsque l’amplification atteint le
rendement maximum (appelé « phase stationnaire »). A ce stade, la réaction a
dépassé la phase exponentielle, notamment en raison de la diminution des réactifs et
de l’inactivation thermique progressive de la polymérase utilisée. La corrélation
résultante entre la concentration de produit finale et le nombre de molécules cibles
initiales est ainsi limitée.
Afin de surmonter ce problème, des techniques telles que la PCR quantitative
compétitive et la PCR en temps réel ont été mises au point pour résoudre les
problèmes liés à l’établissement d’un rapport entre la concentration d’ADN cible et la
quantité de produit PCR résultant de l’amplification.
PCR quantitative compétitive
L’une des premières méthodes PCR quantitatives mises au point est celle de la PCR
quantitative compétitive (Giacca et al., 1994 ; Studer et al., 1998 ; Hardegger et al.,
1999). Cette méthode est basée sur la co-amplification de la matrice d’ADN cible et
de quantités données d’un ADN standard interne (compétiteur) portant les mêmes
sites de fixation d’amorces. Etant donné que la quantité initiale du compétiteur est
connue et que les niveaux d’amplification de la cible et de l’ADN compétiteur sont les
mêmes, la quantité des deux produits PCR, déterminée par ex. par électrophorèse
sur gel, est représentative du taux d’ADN cible et de compétiteur présents dans
l’échantillon de réaction avant l’amplification.
En règle générale, un compétiteur est un plasmide linéarisé porteur de la même
séquence de nucléotides que l’ADN cible, à l’exception d’une suppression ou d’une
insertion afin d’obtenir, après co-amplification, deux bandes de tailles distinctes après
électrophorèse sur gel standard.
ADN amplifié de la cible
ADN amplifié du compétiteur
Figure 3. Co-amplification d’une quantité fixe d’ADN cible avec différentes quantités
d’ADN compétiteur.
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La PCR compétitive a été mise en œuvre avec succès pour quantifier à la fois l’ADN
et l’ARN, mais sa plage dynamique est limitée à un taux cible/compétiteur situé
approximativement entre 1:10 et 10:1. En fait, pour obtenir une précision optimale, il
convient de trouver le point d’équivalence auquel le taux cible/compétiteur est de 1:1
(Figure 3). A cet effet, plusieurs dilutions doivent être testées pour obtenir un taux
cible/compétiteur approprié.
Un autre inconvénient de cette approche réside dans la nécessité de construire et de
caractériser un compétiteur différent pour chaque cible à quantifier. En fait, la
moindre différence au niveau de l’efficacité de l’amplification compromettra
sérieusement la précision d’une quantification par PCR quantitative compétitive.
Enfin, à la fin de la réaction, la PCR compétitive nécessite une quantification précise
des amplicons de la cible et du compétiteur, ce qui implique généralement des
étapes de traitement post-PCR laborieuses.
La PCR compétitive est une méthode semi-quantitative qui implique une
comparaison entre un standard (le compétiteur) et l’échantillon. Les résultats ne
peuvent indiquer qu’une valeur inférieure, égale ou supérieure à une concentration
standard donnée.
Le système de PCR compétitive comporte toutefois l’avantage suivant : les
laboratoires n’ont pas besoin d’acquérir un équipement spécialisé, étant donné qu’on
utilise généralement du matériel de laboratoire standard pour les processus PCR et
de biologie moléculaire.
PCR en temps réel
Il existe une technique de PCR quantitative plus précise et plus répandue : la PCR
en temps réel. Contrairement aux mesures de valeurs limites, les systèmes de PCR
en temps réel contrôlent la réaction en temps réel, au fur et à mesure qu’elle se
déroule. Avec ce type de système, la PCR est couplée à l’émission d’un signal
fluorescent proportionnel à la quantité de produit PCR généré au cours de cycles
consécutifs. Ce signal augmente proportionnellement à la quantité de produit PCR
généré au cours de chaque cycle de réaction successif. L’enregistrement de la
quantité d’émission fluorescente lors de chaque cycle permet de contrôler la PCR
durant sa phase exponentielle. La première augmentation de fluorescence majeure
correspond à la quantité initiale de matrice cible. (Ahmed, 2002)
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Historique des techniques PCR en temps réel
Higuchi et al. (1992, 1993) ont été les premiers à analyser la cinétique de la PCR en
mettant au point un système capable de détecter les produits PCR au fur et à mesure
de leur accumulation. Ce système « en temps réel » comprenait l’intercalant bromure
d’éthidium dans chaque mélange réactionnel. Les opérations étaient effectuées à
l’aide d’un thermocycleur approprié permettant d’irradier les échantillons de lumière
UV et de détecter la fluorescence résultante à l’aide d’une caméra CCD refroidie
(caméra à dispositif de transfert de charge) assistée par ordinateur. Lors du
processus d’amplification, des quantités croissantes d’ADN double brin généré et
intercalé en présence de bromure d’éthidium entraînaient un accroissement de la
fluorescence. En restituant graphiquement le rapport entre l’émission de lumière
fluorescente et le nombre de cycles, le système générait des graphiques
d’amplification donnant un tableau plus complet du processus de la PCR qu’une
analyse de l’accumulation du produit après un nombre de cycles fixe.
Principes de la PCR en temps réel
La spécificité d’une méthode de PCR en temps réel dépend à la fois des principes
chimiques utilisés pour générer et contrôler la réaction d’amplification et l’équipement
utilisé pour contrôler le signal. Divers principes chimiques ont été mis au point à cet
effet : intercalants (bromure d’éthidium, SYBR Green I) et sondes d’hybridation
(sondes TaqMan, sondes de transfert d’énergie entre molécules fluorescentes,
balises moléculaires, sondes Scorpion et sondes TaqMan MGB).
PCR en temps réel à base de colorant SYBR Green I
La première application de la PCR en temps réel est directement dérivée des
expériences de Higuchi et al. (1992, 1993), consistant à remplacer le bromure
d’éthidium par un agent intercalant d’ADN double brin fluorescent moins toxique, plus
spécifique et plus sensible (de 10 à 25 fois), le SYBR Green I (Haugland, 2002).
Le colorant SYBR Green I se lie au petit sillon de l’ADN double brin, mais pas à
l’ADN simple brin. Suite à cette liaison, la fluorescence (excitation env. 488 nm et
254 nm ; émission env. 560 nm) augmente considérablement (de 800 à 1000 fois
env.). Au début de la PCR, la quantité croissante d’ADN nouvellement synthétisé
génère un signal fluorescent croissant (Figure 4). Une limitation du système de
détection de séquence à base de SYBR Green I est représentée par son mode de
reconnaissance d’ADN non spécifique. En fait, chaque molécule d’ADN double brin
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présente dans une PCR est quantifiée, y compris donc les produits PCR non
spécifiques et les dimères d’amorce. Afin de surmonter le problème et de soustraire
l’élément de quantification dû aux ADN non spécifiques et aux dimères d’amorce sur
certains dispositifs, il est possible d’effectuer une analyse de la courbe de fusion.
Après l’étape finale de la PCR, les produits sont dissociés lentement et les données
relatives à la fluorescence sont recueillies. Étant donné que chaque ADN double brin
possède une température de fusion spécifique, il est possible de quantifier les
éléments ayant différentes températures de fusion dans un seul et même mélange
réactionnel, et par conséquent d’éliminer les éléments non spécifiques de la
quantification.
Méthodes de PCR en temps réel basées sur des sondes spécifiques de la
séquence
Le problème de la spécificité de détection par fluorescence des amplicons a été
résolu par l’utilisation de sondes spécifiques des séquences avec un marquage
fluorescent conçu à l’intérieur de la paire d’amorces PCR. Le processus d’hybridation
des sondes (et leur dégradation finale) n’interfère généralement pas avec
l’accumulation exponentielle du produit de la PCR. Plusieurs principes différents sont
maintenant utilisés pour réaliser des réactions de quantification basées sur une PCR
en temps réel spécifique.
Sondes de transfert d’énergie entre molécules fluorescentes
Le transfert d’énergie entre molécules fluorescentes (FRET) est basé sur le transfert
d’énergie d’un fluorophore donneur à un fluorophore accepteur (Figure 4) (Haugland,
2002). Les conditions de base pour le FRET sont les suivantes :
•
Les molécules donneuses et accepteuses doivent être proches l’une de l’autre
(généralement 10 à 100 Å).
•
Le spectre d’absorption de l’accepteur doit chevaucher le spectre d’émission de
fluorescence du donneur.
•
Les orientations des dipôles de transition du donneur et de l’accepteur doivent être à
peu près parallèles.
Si le fluorophore donneur et le fluorophore accepteur sont proches l’un de l’autre,
l’excitation du donneur avec de la lumière bleue génère un transfert d’énergie vers
l’accepteur, qui peut alors émettre une longueur d’onde lumineuse plus importante.
La formation de produits PCR peut être contrôlée en utilisant deux sondes
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oligonucléotidiques spécifiques de la séquence avec un marquage fluorescent,
appelées sondes d’hybridation, en plus des amorces PCR. Les sondes d’hybridation
sont conçues en tant que paire, l’une des sondes étant marquée avec le donneur (3’fluorescéine) et l’autre avec l’accepteur (5’-Red 640 ou 5’-Red 705). Étant donné que
le FRET est proportionnel à l’inverse de la puissance 6 de la distance, les sondes
d’hybridation doivent être conçues de manière à s’hybrider avec les régions
adjacentes de l’ADN matrice (elles sont généralement séparées par un intervalle de
1 à 5 nucléotides). Si les deux sondes s’hybrident, les deux colorants sont
rapprochés et le FRET vers le colorant de l’accepteur se traduit par un signal
mesurable par fluorimétrie.
Sondes de dégradation (principe TaqMan)
L’essai TaqMan exploite l’activité exonucléase 5’-3’ de l’ADN polymérase Taq pour
cliver une sonde de dégradation durant la PCR (Lie et Petropoulos, 1998). La sonde
de dégradation (ou TaqMan) est généralement un oligonucléotide d’une longueur de
20-30 bases (habituellement avec une température de fusion de 10 °C plus élevée
que celle des amorces) contenant un colorant fluorescent rapporteur à l’extrémité 5’
et un colorant d’extinction de fluorescence à l’extrémité 3’ (Figure 4). Étant donné
que l’extrémité 3’ est bloquée, la sonde ne peut être prolongée comme une amorce.
Durant la PCR, en présence d’une cible, la sonde s’hybride spécifiquement entre les
sites d’hybridation des deux amorces. Lorsque la sonde est intacte, la proximité du
colorant rapporteur par rapport au colorant d’extinction de fluorescence entraîne la
suppression de la fluorescence du rapporteur essentiellement par transfert d’énergie
de type Forster (Forster, 1948 ; Lakowicz, 1983). Pendant la réaction, l’activité
exonucléase 5’-3’ de l’ADN polymérase Taq dégrade la sonde entre le colorant
rapporteur et le colorant d’extinction de fluorescence seulement si la sonde s’hybride
avec la cible. Cela entraîne un accroissement de la fluorescence au fur et à mesure
de l’amplification. L’accumulation de produit PCR est détectée en contrôlant
l’augmentation de fluorescence du colorant rapporteur. Ce processus survient durant
chaque cycle et n’interfère pas avec l’accumulation exponentielle de produit.
Contrairement aux sondes FRET, les sondes de dégradation libèrent des
fluorochromes à chaque cycle, ajoutant un nouveau colorant au colorant libéré
précédemment. Par conséquent, le signal fluorescent augmente considérablement à
chaque cycle. Dans l’essai TaqMan, on utilise des paramètres de cycles thermiques
et des conditions de réaction PCR universels. Une exigence spécifique applicable
aux sondes fluorogéniques est qu’il ne peut y avoir de G à l’extrémité 5’. Un « G »
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adjacent au colorant rapporteur éteint la fluorescence du rapporteur, même après
division.
Figure 4. Différents
principes de PCR en
temps réel.
I. Vert SYBR I.
II. Sondes de transfert
d’énergie de résonance
par fluorescence.
III. Sondes de
dégradation TaqMan
5`-3`.
Balises moléculaires
Les balises moléculaires sont des sondes d’ADN conçues pour contenir une
structure en forme d’épingle à cheveux. La séquence de la boucle est
complémentaire de la cible spécifique de la sonde et les séquences des bras sont
conçues de manière à être complémentaires l’une de l’autre (Figure 5) (Tyagi et
Kramer, 1996). Les extrémités 5’ et 3’ de la sonde sont liées de façon covalente à un
fluorophore et à un extincteur. Lorsque la structure en épingle à cheveux est fermée,
le fluorophore et l’extincteur sont rapprochés. Dans ce cas, tous les photons émis par
le fluorophore sont absorbés par l’extincteur. En présence d’une séquence
complémentaire, la sonde se déploie et s’hybride avec la cible. Le fluorophore est
déplacé par l’extincteur et la sonde commence à fluorescer.
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Figure 5. Principe des balises moléculaires.
Scorpions
La
famille
des
sondes
appelées
« Scorpions »
constitue
une
évolution
supplémentaire. Une sonde Scorpion comprend une séquence de sonde spécifique
avec une structure en épingle à cheveux (Figure 6) (Thelwell et al., 2000).
Un fluorophore fixé à l’extrémité 5’ émet un signal fluorescent qui est désactivé dans
la configuration en épingle à cheveux par une fraction attachée à l’extrémité 3’.
L’épingle à cheveux est liée à l’extrémité 5’ d’une amorce. Après l’élongation de
l’amorce Scorpion, durant l’amplification, la séquence de sonde spécifique est
capable de se lier à son complément dans le même brin d’ADN. Cette hybridation
ouvre la boucle en épingle à cheveux, de telle sorte que la fluorescence n’est plus
désactivée et un accroissement du signal est observé. Un stoppeur PCR entre
l’amorce et la séquence des bras évite la translecture de la boucle en épingle à
cheveux, ce qui pourrait entraîner l’ouverture de celle-ci en l’absence de la séquence
cible spécifique. La nature monomoléculaire de l’hybridation comporte des avantages
par rapport aux systèmes de sondes homogènes. Contrairement aux balises
moléculaires, aux essais TaqMan ou FRET, les essais Scorpion ne nécessitent pas
de sonde séparée en plus des amorces.
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Figure 6. Principe des sondes Scorpion.
Sondes MGB TaqMan
Une sonde MGB (Minor Groove Binder) est une petite molécule en forme de
croissant qui s’insère parfaitement dans le petit sillon de l’ADN double brin (Kutyavin
et al., 2000). Dans les sondes TaqMan, le groupe MGB est attaché à l’extrémité 3’
avec le colorant d’extinction de fluorescence (Figure 7). Lorsque la sonde TaqMan
s’hybride, le MGB stabilise l’hybridation en se déployant dans le petit sillon de l’ADN
double brin créé entre la sonde et la séquence cible. La stabilisation est beaucoup
plus efficace lorsque les doubles brins sont parfaitement appariés (c’est-à-dire
lorsqu’il n’y a pas de mésappariement de séquence). Outre le pouvoir discriminant
accru, la plus grande stabilité signifie que les sondes TaqMan MGB sont très courtes
(généralement 13 à 20 mer) par rapport aux sondes TaqMan standard (généralement
18 à 40 mer), tout en satisfaisant aux exigences de conception. Les sondes TaqMan
MGB présentent plusieurs avantages en ce qui concerne la PCR quantitative,
notamment pour les essais multiplex. La performance spectrale améliorée permet
une précision et une cohérence accrues entre les essais individuels et la spécificité
d’hybridation accrue assure une plus grande discrimination des cibles. Par ailleurs, la
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sonde plus petite peut faciliter la conception des essais en offrant plus de possibilités
dans des régions cibles plus courtes, telles que les « fenêtres » de consensus de
conservation ou de divergence de séquence. La taille des amplicons peut être
réduite au maximum en utilisant des sondes MGB plus courtes pouvant améliorer
davantage la cohérence inter-essais.
Figure 7. Principe des sondes MGB.
Principes de quantification par PCR en temps réel
Quantification relative
La teneur en OGM d’un échantillon peut être exprimée comme étant la quantité de
matière génétiquement modifiée dans la quantité de matière totale. Pour déterminer
cette valeur dans un système PCR en temps réel, il faut évaluer le nombre de
séquences d’ADN d’un gène de référence endogène (en vue d’une utilisation en tant
que « normalisateur ») ainsi que le nombre de séquences d’ADN cible spécifique de
l’OGM. Le gène de référence doit être sélectionné de manière à ce qu’il soit
spécifique de l’espèce, présent en copie unique par génome haploïde, stable au sein
de différentes lignées de la même espèce et ayant les mêmes propriétés
d’amplification que les OGM analysés (bien que cela soit plutôt dû à une bonne
conception des sondes d’amorces). Un problème dans la quantification relative
résulte de l’interprétation du pourcentage de teneur en OGM non stipulé par la
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législation ; par conséquent, la teneur en OGM (en pourcentage) peut être
considérée comme étant le poids de l’ingrédient modifié divisé par rapport au poids
total de l’ingrédient pur (par ex. poids du maïs GM divisé par le poids total de
l’ensemble du maïs contenu dans l’échantillon). Du point de vue analytique, il
convient de calculer le pourcentage d’OGM en termes de nombre de copies d’ADN
cible par rapport au nombre de copies spécifiques de taxon cible, mais cette
définition ne tient pas compte de certaines caractéristiques importantes des lignées
d’OGM ; par conséquent, les paramètres suivants doivent être soigneusement pris
en compte lors de l’interprétation des résultats :
a. la ploïdie de la lignée. Il est possible que la ploïdie de la lignée GM soit différente
de celle de la lignée wt (par ex. tétraploïde au lieu de diploïde) ;
b. la zygotie de la lignée. La caractéristique GM pourrait être homozygote ou
hétérozygote ;
c. le nombre d’insertions par génome haploïde d’une construction génique artificielle
unique. Une construction pourrait être insérée en une seule copie par génome
haploïde ou en plusieurs copies.
Le point c. peut être contourné en concevant le système de sonde-amorce à la limite
de l’insertion de la construction dans le génome. Étant donné que les séquences
flanquantes sont uniques, cela confère au système le double avantage d’être
spécifique à la lignée et d’exclure de la quantification les insertions multiples de la
même construction. On contourne les points a. et b. empiriquement en utilisant des
matériaux de référence homogènes avec l’échantillon (par ex. matériaux de
référence sous forme de farine de maïs pour quantifier la farine de maïs).
Alternativement, des étalons de référence différents des matériaux de référence
certifiés (par ex. séquences d’ADN clonées ou mélanges d’ADN génomiques)
peuvent être calibrés par rapport à ces matériaux de référence certifiés afin de
corriger les divergences moléculaires dans la quantification. Une solution courante
aux problèmes liés aux points a. et b. consiste à exprimer le pourcentage d’OGM en
termes de génomes haploïdes.
Dans tous les cas, cet aspect de la quantification doit être pris en compte lors de la
mise au point d’une méthode, étant donné que la limite de détection et la limite de
quantification sont influencées par le nombre effectif de copies à quantifier.
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Conception d’une expérience de quantification d’OGM en temps réel
La conception d’une analyse PCR en temps réel doit inclure les éléments suivants :
- Un système PCR capable de détecter une séquence d’ADN cible spécifique de
l’OGM.
- Un second système PCR capable de détecter une séquence de référence
endogène, préférentiellement spécifique de l’espèce, mais pouvant être utilisée en
tant que « normalisateur » dans les calculs des concentrations relatives d’OGM.
- Les courbes d’étalonnage pour la cible et la référence endogène. Pour chaque
échantillon expérimental, la quantité de cible et de référence endogène est
déterminée à partir de la courbe d’étalonnage correspondante. La quantité de cible
est normalisée avec la quantité de référence endogène pour obtenir la concentration
relative de la cible. Pour qu’elles répondent aux exigences statistiques, les courbes
d’étalonnages doivent comprendre au moins 4 points de concentration différents.
Chaque point de la courbe d’étalonnage, ainsi que l’échantillon, doivent être chargés
au moins en trois exemplaires.
En outre, un contrôle négatif (NTC – contrôle sans matrice) doit être ajouté tant pour
la quantification du gène de référence et que pour celle des OGM. D’autres contrôles
peuvent être utilisés (par ex. contrôle ADN cible négatif, contrôle ADN cible positif).
Enfin, la quantification du gène de référence et la quantification de la séquence
spécifique de l’OGM doivent être effectuées au cours de la même opération PCR
(co-amplification) et non en plusieurs opérations, afin d’éviter toute fluctuation
statistique entre différentes expériences.
PCR multiplexe en temps réel
En fonction des propriétés chimiques et de l’appareillage utilisé pour la quantification,
il est possible de concevoir des PCR en temps réel pour effectuer la quantification
des séquences de référence et d’OGM séparément dans des tubes distincts ou dans
les mêmes tubes en tant que réaction « multiplexée ».
Les deux options présentent à la fois des avantages et des inconvénients : les
réactions multiplexées permettent d’économiser du temps et des réactifs (il est
possible d’analyser le double d’échantillons en une seule et même expérience),
d’éviter les erreurs de configuration entre la mesure de la référence et du gène cible
de l’OGM, étant donné qu’elles ont lieu dans le même tube, mais elles sont moins
sensibles (en termes de limite de quantification) en raison de l’interférence entre les
deux réactions et des différences de consommations de réactifs entre les deux
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réactions. D’un autre côté, des réactions séparées pour mesurer le gène de
référence et le gène cible de l’OGM sont plus sensibles en termes de limite de
quantification, mais nécessitent deux fois la quantité de réactifs et de tubes
réactionnels sur l’appareillage de PCR en temps réel et sont plus exposées par ex.
aux risques d’erreur de pipetage lors de la mesure d’un échantillon. La disponibilité
de colorants rapporteurs multiples pour les sondes TaqMan permet de détecter
l’amplification de plusieurs cibles dans le même tube. Le colorant rapporteur (FAM)
se distingue de l’autre (VIC) car ils ont des longueurs d’onde d’émission maximale
différentes. Par exemple, la disponibilité de colorants multiples ayant des longueurs
d’onde d’émission distinctes (FAM, TET, VIC et JOE) permet d’effectuer des essais
TaqMan multiplex. Le colorant TAMRA est utilisé comme extincteur sur la sonde et le
colorant ROX comme référence passive dans le mélange réactionnel. Pour obtenir
les meilleurs résultats, la combinaison FAM (cible) et VIC (contrôle endogène) est
recommandée, étant donné qu’ils présentent la plus grande différence en termes
d’émission maximale. D’un autre côté, il convient de ne pas combiner JOE et VIC.
Les essais TaqMan multiplex peuvent être effectués sur les systèmes de détection
de séquence ABI PRISM 7700, 7900, 7500, 7300 et 7000 en raison de leur capacité
à détecter des colorants multiples ayant des longueurs d’ondes d’émission distinctes.
Analyse graphique des données de la PCR en temps réel
Au cours d’une PCR en temps réel, les données de fluorescence (valeurs Rn)
recueillies permettent de tracer un graphique représentant la quantité de signal par
rapport au nombre de cycles (ou au temps). En général, le graphique est tracé sur
une échelle semi-logarithmique. Dans la PCR en temps réel, on peut distinguer trois
phases différentes : une première phase de « retard » avec de légères fluctuations
des courbes correspondant au signal de fond ; une seconde phase exponentielle
avec des courbes parallèles croissantes, et une troisième phase où les courbes ont
tendance à atteindre un palier (Figure 8).
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Figure 8. Graphique de PCR en temps réel. Les phases typiques de PCR en temps
réel sont mises en relief.
La force de la PCR en temps réel réside dans le fait que la quantification survient non
pas à la phase terminale de la PCR (palier), mais à l’étape où la croissance
exponentielle de la quantité d’ADN amplifié (valeur Rn) atteint un point
significativement plus élevé que le signal résiduel. Cette technique de mesure
augmente considérablement la précision de la quantification, étant donné qu’il y a
une corrélation directe entre la quantité de matrice initiale et la phase durant laquelle
l’amplification commence à devenir exponentielle. Dans la PCR en temps réel, un
cycle seuil (CT) est défini à titre expérimental comme le cycle auquel le signal de
fluorescence atteint la moyenne des signaux de fluorescence mesurés entre le
troisième et le quinzième cycle plus dix écarts types. Plus la quantité initiale d’ADN
génomique est élevée, plus le produit accumulé est détecté rapidement dans le
processus PCR, et plus la valeur CT est basse. En pratique, le choix de la ligne de
seuil dans la détermination de la valeur CT incombe souvent à l’opérateur,
représentant l’un des éléments subjectifs de la PCR en temps réel. La ligne de seuil
doit être placée au-dessus de toute activité de base et dans la phase d’augmentation
exponentielle, qui paraît linéaire dans la transformation logarithmique (toutes les
courbes sont parallèles). Dans tous les cas, la ligne de seuil doit être placée au
niveau auquel les courbes des répliquâts commencent à coïncider le plus. En fait, il
arrive parfois que les répliquâts présentent, dans la toute première partie de la phase
exponentielle, une légère divergence qui diminue ou disparaît totalement alors que la
réaction se poursuit.
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Calcul de la teneur en OGM
Le rendement de la PCR en temps réel est une valeur ∆Rn, qui correspond à la
différence entre Rn+ (le signal de fluorescence comprenant l’ensemble des éléments)
et Rn- (le signal de fond de la réaction – référence ou lecture d’un échantillon NTC).
La teneur en OGM d’un échantillon peut être déterminée de deux manières
différentes :
1. Tracé de deux courbes standard sur la base de différentes quantités d’ADN :
- la première courbe avec un système de quantification spécifique du gène de
référence ;
- la seconde courbe avec un système de quantification spécifique de la cible GM.
Pour chaque échantillon, les quantités de cible spécifique et de gène de référence
sont déterminées par interpolation avec la courbe standard. La teneur en ADN des
OGM (sous forme de pourcentage) est ensuite calculée comme étant le rapport entre
la quantité de séquence cible GM et la quantité de séquence du gène de référence
(GM/référence * 100).
Il convient de noter que les échantillons analysés doivent forcément se situer entre
les limites supérieure et inférieure des deux courbes standard. Les valeurs
aberrantes doivent être exclues, étant donné qu’elles sont sujettes à des erreurs de
quantification.
2. La méthode CT comparative (∆∆CT) : cette méthode n’utilise pas une quantité
connue de standards mais compare la quantité relative de la séquence cible d’OGM
à la séquence du gène de référence. La courbe standard est obtenue en chargeant
une série d’échantillons à différentes concentrations connues d’OGM (par ex.
matériaux de référence certifiés de l’IRMM). Le résultat est une courbe standard de
valeurs ∆∆CT (∆CT = CT gène de référence - CT
OGM).
La valeur de la teneur en OGM est
obtenue en calculant la valeur ∆CT de l’échantillon et en la comparant aux valeurs
obtenues avec les standards.
Pour que cette méthode soit fructueuse, les efficacités d’amplification des systèmes
PCR cible et de référence doivent être semblables. À cet effet, une méthode sensible
de contrôle consiste à examiner la manière dont ∆CT (la différence entre les deux
valeurs CT de deux PCR pour la même quantité de matrice initiale) varie en fonction
de la dilution de la matrice. Si les efficacités des deux amplicons sont
approximativement équivalentes, la représentation graphique logarithmique de la
quantité d’entrée par rapport à ∆CT serait une ligne presque horizontale (pente
<0,10). Cela signifie que les deux PCR ont la même efficacité dans la plage de
quantités de matrice initiales. Si le graphique montre une efficacité inégale, la
méthode de la courbe standard doit être utilisée pour la quantification des OGM. La
Module 10
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plage dynamique doit être déterminée à la fois pour (1) les concentrations minimale
et maximale des cibles pour lesquelles les résultats sont exacts et (2) les rapports
minimum et maximum de deux quantités de gènes pour lesquelles les résultats sont
exacts. Dans la PCR en temps réel compétitive classique, la plage dynamique est
limitée à un rapport cible/compétiteur d’environ 10:1 à 1:10 (la précision optimale est
obtenue pour un rapport de 1:1). La PCR en temps réel est capable de générer une
plage dynamique beaucoup plus importante.
Module 10
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Références
Règlement (CE) n° 1829/2003 du Parlement Européen et du Conseil du 22
septembre 2003 concernant les denrées alimentaires et les aliments pour
animaux génétiquement modifiés. JO L 268, 18.10.2003, pp. 1-23.
Règlement (CE) n° 1830/2003 du Parlement Européen et du Conseil du 22
septembre 2003 concernant la traçabilité et l’étiquetage des organismes
génétiquement modifiés et la traçabilité des produits destinés à l’alimentation
humaine ou animale produits à partir d’organismes génétiquement modifiés, et
modifiant la Directive 2001/18/CE. JO L 268, 18.10.2003, pp 24-28.
Ahmed, F.E. (2002). Detection of genetically modified organisms in foods.
Trends in Biotechnology 5, 215-23.
Forster, T. (1948). Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann
Phys (Leipzig) 2, 55-75.
Giacca, M., Zentilin, L., Norio, P., Diviacco, S., Dimitrova, D., Contreas, G., Biamonti,
G., Perini, G., Weighardt, F., Riva, S. and Falaschi, A. (1994). Fine mapping of a
replication origin of human DNA. Proceedings of the National Academy of
Science USA 91, 7119-23.
Hardegger, M., Brodmann, P. and Hermann, A. (1999). Quantitative detection of the
35S promoter and the nos terminator using quantitative competitive PCR.
European Food Research Technology 209, 83–87.
Haugland, R.P. (2002). The Handbook of Fluorescent Probes and Research
Products,
Ninth
Edition.
Molecular
Probes,
Inc.
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/References/Molecular-Probes-TheHandbook.html (Dernière connection Janvier 2010).
Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P.S. and Griffith, R. (1992). Simultaneous
amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology 10, 413–
417.
Module 10
21
Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G. and Watson, R. (1993). Kinetic PCR: Real-time
monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology 11, 1026–1030.
Kutyavin, I.V., Afonina, I.A., Mills, A., Gorn, V.V., Lukhtanov, E.A., Belousov, E.S.,
Singer, M.J., Walburger, D.K., Lokhov, S.G., Gall, A.A., Dempcy, R., Reed, M.W.,
Meyer, R.B. and Hedgpeth, J. (2000). 3'-minor groove binder-DNA probes
increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Nucleic Acids
Research 28, 655-61.
Lakowicz, J.R. (1983). Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press, New
York, chapter 2.
Lie, Y. S. and Petropoulos, C. J. (1998). Advances in quantitative PCR technology: 5'
nuclease assays. Current Opinion Biotechnol 9, 43-48.
Studer, E., Rhyner, C., Lüthy, J. and Hübner, P. (1998). Quantitative competitive
PCR for the detection of genetically modified soybean and maize. Zeitschrift für
Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung A 207, 207–213.
Thelwell, N., Millington, S., Solinas, A., Booth, J. Zeitschrift für LebensmittelUntersuchung und -Forschung A and Brown, T. (2000). Mode of action and
application of Scorpion primers to mutation detection. Nucleic Acids Research 28,
3752-3761.
Tyagi, S. and Kramer, F.R. (1996). Molecular Beacons: Probes that fluoresce upon
hybridisation. Nature Biotechnology 14, 303-308.
Vaïtilingom, M., Pijnenburg, H., Gendre, F. and Brignon, P. (1999). Real-time
quantitative PCR detection of genetically modified Maximizer maize and Roundup
Ready soybean in some representative foods. Journal of Agricultural Food
Chemistry 47, 5261–5266.
Module 10

Module 10 - PCR quantitative pour la détection d`OGM - EU

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