BCR-ABL

Apport de la biologie moléculaire
en onco-hématologie : exemple
de la Leucémie Myéloïde
Chronique
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Historique LMC : découverte (1)
Alfred Velpeau (1795-1867)
Description 1ère patiente avec probable LMC (1827)
Symptômes
• Fièvre
• Fatigue
• Abdomen gonflé
Autopsie
• Hépatosplénomégalie
• Aspect du Sang :
« Epais comme du gruau, davantage semblable
à du pus qu’à du sang »
Alfred Donné (1808-1878)
1844 : Description d’un cas similaire (« sang semi-purulent ») + observations microscopiques.
La majorité des cellules sont « incolores » (globules blancs) et non rouges.
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Historique LMC : découverte (3)
Rudolf Virchow (1821-1902)
«Weisses Blut »  Leucémie
1845 Virchow, R. Frorieps Notizen, 36, 151-156
 La leucémie est une maladie autonome et progressive (=cancer ).
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Historique LMC : Contexte
Croyances du XIXème siècle :
Les globules rouges sont issus des globules blancs.
Les globules blancs sont produits par les ganglions lymphatiques ou par la rate.
Ernst Neumann (1834-1918)
• Les leucocytes sont produits dans la moelle osseuse
• Par une cellule unique capable d’auto-renouvellement
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Hematopoïèse
Moelle Osseuse
CSH
lymphopoïèse
Progéniteur Myéloïde
Commun
Myéloïde
…
Monocytaire
…
Mégacaryocytaire
Erythroïde
…
…
Thrombocytes
Erythrocytes
Sang
D
I
F
F
E
R
E
N
C
I
A
T
I
O
N
Granulocytes
Monocytes
Claire
Abbal/ARL-22.03.11
LMC : Caractérisation cellulaire du frottis sanguin
Paul Ehrlich
(prix Nobel 1908)
Frottis sanguin
LMC
Myélémie
Invention de la
coloration cellulaire
(1879)
+
Granulocytose
Claire Abbal/ARL-22.03.11
LMC et Chromosomes (1)
P. Nowell &
D. Hungerford
Découverte du chromosome de Philadelphie (Phi) (1960)
Image Cytogenetics Gallery: Pathology Department University of Washington
Claire Abbal/ARL-22.03.11
LMC , chromosomes et gènes
Janet D. Rowley
Découverte de la t(9;22) (1973)
• La translocation t(9;22) génère un gène de fusion : BCR-ABL
• Le BCR-ABL code pour une protéineClaire
chimérique
« fonctionnelle »
Abbal/ARL-22.03.11
Effets de la protéine chimérique BCR-ABL
BCR-ABL
Stimulation
Prolifération
Inhibition
Apoptose
Inhibition
suppresseurs
tumeur
Phénotype Malin
CANCER
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Adapté de DEININGER W.N. et al.,Blood,
2000, 96, 3343
Instabilité
génomique
Le BCR-ABL exerce ses effets via son activité Tyrosine Kinase (TK)
Proliferation
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Physiopathologie LMC
BCR-ABL
CSL
CSH
Prolifération, immortalité
Différenciation OK
Myélémie
S
a
Cellules
n
+
BCR-ABL
g
Cellule souche leucémique BCR-ABL+
Leucocytose
Cellule souche
hématopoïétique
Nombre élevé
Passage dans
le sang
Myélocytes
Promyélocytes
Métamyélocytes
Non
segmentés
Nombre élevé
Claire Abbal/ARL-22.03.11
D
I
F
F
E
R
E
N
C
I
A
T
I
O
N
LMC : prise en charge du prélèvement
Elimination
des érythrocytes
(choc hypotonique)
Sang
Périphérique
Lyse
préservant ARN
Lysat cellulaire
« ARN-stabilisé »
Cell. mononucléées
+ Granulocytes
Extraction
ARN
Transcription
inverse
BCR-ABL+
???
Polymerase Chain Reaction
(PCR)
Claire Abbal/ARL-22.03.11
ADNc
Détection du BCR-ABL au diagnostic
PCR : amplification enzymatique d’une séquence d’ADN délimitée par des amorces
homologues et spécifiques
521 pb
e1-a2
mBCR-ABL
P2 (e3)
P1 (e1)
342 pb
e13-a2
MBCR-ABL
P’1 (e12-e13)
417 pb
e14-a2
P’1 (e12-e13)
BCR-ABL
P2 (e3)
P2 (e3)
957 pb
e19-a2
P’1 (e12-e13)
Claire Abbal/ARL-22.03.11
P2 (e3)
Marqueurs de PM
50 bp 100 bp
Rare e19-a2 « BCR-ABL »
(960bp)
800
1000
800
K562 (e14-a2) in HL-60
400
200
150
e14-a2
(417 bp)
Claire Abbal/ARL-22.03.11
TRAITEMENTS (1980-2001)
• IFN- ± Ara-C : non curatif + problèmes de tolérance
• Greffe allogénique : risquée, réservée aux <55 ans.
Les Phases de la LMC
Durée
Chronique
Accélération
Blastique
5 ans
6 mois
3 mois
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Et si on bloquait spécifiquement le BCR-ABL ?
+ Inhibiteur de Tyr Kinase (TKI)
Proliferation
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Apoptosis
Imatinib Mesylate (Glivec®; Novartis)
• Le Glivec normalise
La FS des patients LMC
En quelques semaines
• Mieux toléré que IFN
Edition du 28 Mai 2001
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Les inhibiteurs de tyrosine kinase (TKI) : une thérapie ciblée.
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Charge en cellules leucémiques (log10)
Suivi de la réponse au traitement
Dx
Cytogenetics
1-2-log reduction
FISH
RQ-PCR
RT-PCR
~5 log reduction
Mois de Traitement
Temps
© 2009 by American Society of Hematology (ASH). Reproduced with permission of ASH via Copyright Clearance Center.
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Dx, diagnosis; FISH, fluorescence in situ hybridization; RT-PCR, real-time polymerase chain reaction.
Radich JP. Blood. 2009;114:3376-3381.
Suivi de la réponse au traitement
La RQ-PCR mesure la quantité de BCR-ABL en nombre de copies.
PROBLEME
BCR-ABLmes. ≠ BCR-ABLréel
CAR
 Dégradation d’ARN (proportionnelle au temps)
 Efficacité des étapes d’extraction d’ARN, de RT …
 Imprécision de mesure (dosage ARN, RQ-PCR)
Imprécision du pipetage
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Suivi de la réponse au traitement
SOLUTION
Mesure simultanée de l’expression d’un gène « housekeeping » : ABL
Normalisation du BCR-ABL par l’ABL.
BCR-ABLmes =
BCR-ABLréel x F(err)
ABLmes
ABLréel
=
x F(err)
Comme ABL est constant (temps, individus), le s valeurs BCR-ABL peuvent être comparées:
 d’un point de suivi à un autre chez un même patient
 d’un patient à l’autre (études cliniques)
à condition que les analyses comparées aient été faites dans le même laboratoire.
Standardisation Internationale
(BCR-ABL/ABL)local x FClocal = BCR-ABL % IS
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Molecular Response (IS)
BCR-ABL %, IS
0
Diagnostic
1012
1011
1010
Major Molecular Response
109
108
107
106
RQ-PCR non detected
105
Complete Molecular Response
104
103
102
101
0
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Total Number of Leukaemia Cells
Decreasing residual
leukaemia
100
10
1
0.1
0.01
0.001
IRIS: Achievement of MMR by
18 Months Associated With Improved EFS
100
95%
90
86%
80
P = .01
Without Event, %
70
62%
58%
60
50
BCR-ABL % (IS)
40
≤ 0.1% (n = 164)
>0.1-1% (n = 47)
>1-10% (n = 25)
>10% (n = 13)
30
20
10
0
0
12
24
36
48
60
72
84
Months Since Start of Treatment
* MMR defined as BCR-ABL% (IS) ≤ 0.1.
EFS, event-free survival; MMR, major molecular response.
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Hughes TP, et al. Blood. 2008;112:129-130 [abstract 334] (oral).
Mme B, LMC, M
Nilotinib
100
1
Stop
Imatinib
(effets 2ndaires)
0.1
sang
0.01
moelle
seuil de détection
Claire Abbal/ARL-22.03.11
15.01.2009
26.06.2008
05.03.2008
14.11.2007
29.08.2007
08.01.2007
0.001
Cf commentaire
BCR/ABL %
10
M A, LMC
Imatinib (mg/j)
400
600
Dasatinib (mg/j)
800
600
10 m
6m
800
100
100
9m
2m
15 m
10
sang
moelle
1
seuil de détection
valeur corrigée
0.1
0.01
Claire Abbal/ARL-22.03.11
MRD18
MRD16
MRD14
MRD12
MRD10
MRD8
MRD6
MRD4
MRD2
0.001
Diag
BCR/ABL /ABL%
11 m
Mme S, LMC MBCR-ABL,
100
10
BCR/ABL %
1
0.1
0.01
sang
0.001
moelle
seuil de détection
Réfractaire au glivec, greffée en 2005
Claire Abbal/ARL-22.03.11
18.12.2008
03.11.05
24.08.05
23.06.05
23.05.05
30.03.05
05.01.05
11.11.04
13.10.04
03.08.04
0.0001
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Mutations in KD domain of BCR-ABL confer resistance to TKIs
Mise en évidence et identification d’une mutation
PCR de la portion génique codant pour le domaine KD du BCR-ABL et séquençage
Intérêt : une mutation résistante à un TKI peut être sensible à un autre TKI  adaptation thérapeutique selon
l’identité de la mutation
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Différents types de mutation
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Orientation clinique selon le type de mutation
T315I  greffe cell. souche allogénéique ou nouvelle molécule en test
Q252H, V299L, F317  Nilotinib plutôt que Dasatinib
Y253H, E255K/V, F359V/C  Dasatinib plutôt que Nilotinib
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Carole GERBEX
Frédéric Bauer
Marzia Terzaroli-Wirz
Stéphane Mathieu
Claire Abbal/ARL-22.03.11
Laboratoire
d’Hématologie
Moléculaire
BH18-632
Dr C. Abbal
Mme M. Terzaroli-Wirz
Mme C. Gerbex
M. Frédéric Bauer
M. Stéphane Mathieu
Claire Abbal/ARL-22.03.11