Thème Etude microbiologique d`un produit laitier fermenté

Transcription

UNIVERSITE KASDI MERBAH OUARGLA
Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie
Département des Sciences Biologique
Mémoire En vue de l’obtention du diplôme de
MASTER ACADEMIQUE
Domaine : Science de la Nature et de la Vie
Filière
: Biologie
Spécialité : Microbiologie Appliquée
Présente par : Djouhri khadra
Madani Sabrina
Thème
Etude microbiologique d’un produit laitier fermenté
traditionnel (J’ben) : isolement et identification des
bactéries lactiques.
Soutenu publiquement
Le : 09/06/2015
Devant le jury :
Mme. BOUDJENAH S.
M.C.A
Président
UKM Ouargla
Mr BOURICHA M.
M.A. A
Encadreur
UKM Ouargla
Melle. SOUID W.
M.A.B
Examinatrice
UKM Ouargla
Année universitaire : 2014/2015
Au terme de ce modeste travail, nous tenndons à remercier "Allah" de nous donner le
courage, la volonté, et la patience pour accomplir ce travail.
Ce mémoire n’aurait pas pu être réalisé sans la contribution de nombreuses personnes que
nous tiens à remercier par ces quelques lignes.
Nous tenons à remercier notre encadreur, Monsieur Bouricha M’hamed maître de
assistant à l’université Kasdi Merbeh Ouargla, sans lui ce mémoire n’aurait jamais vu le
jour.
Nous tenons à remercier Monsieur Bensaci Messaoud Bachagha responsable de
spécialité
microbiologie
appliquée
et
maître
d'assistant
à
l’université
Kasdi
Merbah Ouargla.
Nous remercions aussi très vivement, M
me
boudjenah .s. Chef du département et
Maître de conférences à l’université Kasdi Merbah Ouargla. Vous nous faites le grand
honneur de présider ce jury. Je vous prie de bien vouloir recevoir le témoignage de notre
profond respect.
Un grand merci à M elle Souid wafa. Maître assistant à l’université
Kasdi merbah ;ouargla . Je vous remercie de nous faire l’honneur de juger ce modeste
travail.
Veuillez accepter mos chaleureux remerciements pour votre participation à ce jury.
Merci à tous ceux qui, d’une manière ou d’une autre ont contribué à la réalisation de ce
travail, et que je ne peux citer individuellement.
Djouhri, k
Madani, s
Dédicace
J’ai l’'honneur de dédier ce modeste travail réalisé grâce à l'aide de dieu
tout puissant;
* À la mémoire de mes grand- parents maternels et paternels;
* À la mémoire de mon pére;
* A Celle qui matant bercé, tant donné et tant enseigné, toi qui ma guidé
dans le droit chemin, toi qui ma appris que rien est impossible...A toi Ma
cher maman;
* À Mes chers soeurs : surtout mon adorable soeur saliha et
son mari lazhar et leurs enfants monsef, lidia, loai, dorsaf et
abd el basset;
* A Mes cher frères amar,abd el latif et sa famme hadjer
* À mon fiancé mahdi
* À mes oncles et tantes paternels et maternels
* Au reste de ma famille ;
* À mes amies surtout khadra, Fatima, isra, hadjer, sara,
hana, rachida, fatma, khadidja,madjda, hayet et amine pour
tous les bon moments que nous avons partagés
* A toute la promotion master II 2014-2015 /Option
Microbiologie Appliquée du Département des sciences
biologique, Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie,
Université Kasdi Merbah Ouargla.
Madani Sabrina
Je dédie ce travail à
Mon père Mr. Djouhri ahmed
Tu es un pilier solide et incontournable pour ma personne et mon parcours, que Dieu te
donne santé et longue vie.
Ma mére Mme. Dahbia
Que ce travail soit pour toi le témoignage de mon infinie reconnaissance pour ton aide
précieuse et toutes ces années de compréhension.
A mes sœurs
surtout koka et son mari brahim et leur enfants youssef , zakaria, yassine et son bébé
Ma soeur meriem et son mari et ses enfants fateh ,mohamed ,ahmed,et hiba.
Mes chér fréres bokhi et Ali, Tarek et Ahmed et ses enfants aoubida et abd elrahmen
A toute ma famille djouhri, Djeddi et Djelal.
A tous mes camarades de promotion,
surtout sabrina , fatima, Isra ,madjeda,fatma, khadidja, hayat, qui mon aidé dans la
réalisation de ce mimoire ,et rachida ,hadjer,sara , zineb, khira, Amine et farah .
Et plus particulièrement à Rym.
Tu as été pour moi durant ces années passées ensemble plus qu’un ami, un soeur. Toute
ma gratitude et ma sympathie pour ton soutien et son mari sedik et sa fille Ritage .
a mes cher amis
fatma , Mira , mordia ,laila,et rokaya ,Djamila ,khadra ,nahid ,meriem , hadjer, zineb .
khadra
Liste des abréviations
ADN: acide désoxyribonucléique
ADH : Arginine di hydrolase
ARNr 16s: acide ribonucléique ribosomique
Asp: Aspartate
B: Bacillus
Bb: Bifidobacterium
(b1): Théamine
(b2): Riboflavine
(b3): acide nicotinique
(b5): panthénique
(b6): pyroxene
(b8): biotine
BL: bactéries lactique
C: Carbone
C.: Carnobacterium
CPA: cellules présentatrices d’antigènes
E: Enterococcus
EPS: exopolysaccharides
FAO: Food and Agriculture Organization
GC: guanine et cytosine
GRAS: Generally Recognized As Safe
HDL: high density lipoprotein
IgA: immunoglobulines A
IgM: immunoglobulines M
L.: Listeria
Lb.: Lactobacillus
Lc.: Lactococcus
LDL: low density lipoprotein
Ln.: Leuconostoc
Lyse: lysine
MLST: Multi Locus Sequence Typing
Mg+: ion de magnésium
NAD: nicotinamide adénine dinucléotide
O: Oenococcus
OMS: l’Organisation Mondiale pour la Santé
P.: Pediococcus
S.: Staphylococcus
Sp: espèce non précisée
SSP: sous espèce
St: Streptococcus
T.: Tetragenococcus
UFC: unité forment de colonies
La liste des figures
N°
Titre de figure
page
Arbre phylogénétique des principaux genres de bactéries lactiques et 15
01
des genres associés, obtenu par analyse des ARNr 16S (Stiles et
Holzapfel, 2001).
02
Le
genre
Lactobacillus
(http://www.institut-rosell- 16
lallemand.com/uploads/images/souches/lactobacillus-R52_big.jpg).
Le genre Leuconostoc. (Michel fedrighi, 2005).
17
Le genre pediococcus (Michel fedrighi, 2005).
17
Le genre streptococcus. (Michel fedrighi, 2005).
18
Le genre entérococcus. (Michel fedrighi, 2005).
19
Le genre Bifidobacterium. (Michel fedrighi, 2005).
20
Produit laitiers traditionnel (J'ben).
26
03
04
05
06
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08
09
10
Le resultat de la recherche de staphylococcus aureus sur milieu
Chapman
Le resultat de la recherche recherche des coliformes totaux sur
milieux BCPL
Le resultat de la recherche des coliformes fécaux sur milieux BCPL
37
37
38
11
Le resultat de la recherche des bactéries sporulées sur milieu viande
12
13
foie
Résultat de la recherche des champignons sur milieu sabauroud
38
38
Le resultat de la recherche de la flore mésophile totale aérobies sur
14
milieu PCA
39
Observations macroscopiques de bactéries lactiques
15
16
Observations microscopiques de bactéries lactiques sous le
microscope optique
Résultats des tests physiologiques
17
40
40
46
Les résultats de la recherche de type farmentaire
18
Les résultats de test de sherman
47
47
Résultats de la recherche de profil fermentaire des isolates
48
Résultats de recherche de l'enzyme ADH
52
19
20
21
Résultats de recherche de la production des exopolysaccharides
53
Résultats de test de citrate
54
le différent genre lactiques présent dans le J'ben de lait de chèvre
54
les principaux genres lactiques présent dans le J'ben avec persil a
base de lait de chèvre(E2)
les principaux genres lactiques présent dans le J'ben salé a base de
lait de vache (E3).
les principaux genres lactiques présent dans le J'ben avec l’ail a base
de lait de chèvre(E4).
différents genre lactiques présent dans le J'ben de lait de vache
54
les principaux genres lactiques présent dans le J'ben salé a base de
lait de vache(E1).
les principaux genres lactiques présent dans le J'ben avec l’ail a base
de lait de vache(E5).
les principaux genres lactiques présent dans le J'ben avec persil a
base de lait de vache (E6).
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54
55
55
55
Liste des tableaux
N°
Titre de tableau
page
Composition typique du lait de vache (ALAIS C; 1984).
03
Caractéristiques physico-chimiques du lait (VEISSEYRE R., 1975)
05
Teneurs de différents laits en certains constituants (g /L) (ALAIS C ;
06
01
02
03
1984)
principales bactéries lactiques (sutrat et Federighi ; 1998)
14
le dénombrement de la flore aérobie mésophile totale
35
: les résultats de contrôle microbiologique de J'ben
36
les caractéristiques biochimiques et physiques des souches
42
04
05
06
07
49
08
le profil fermentaire des souches
Sommaire
Remerciement
Dédicace
Liste d’abréviation
Liste des tableaux
Liste des figures
Sommaire
Introduction……………………………………………………………………….......
01
Chapitre I: Synthèse bibliographique
I-Généralites sur le lait……………………………………………………………….
I-1-Définition de lait ………………………………………………………………......
I-2- Composition du lait …………………………………………………………........
I-3-caractères physico-chimique de lait ……………………………………………….
I-4- Variabilité de la composition ……………………………….……………………..
I-5Comparaison entre le lait de vache et de chévre……………………………………
I-6- Microflores du lait ……..………………………………………………………...
I-6-1 Flore originale ……………………………………………………………...…...
I-6-2 Flore pathogènes ……………………......……………………………………...
I-6-3 Flore psychrotropes ………………..………………………………………….
II- Les produits laitiers traditionnels ...……………………………………………...
II-1 Bouhazza ……………………………………………………………………….....
II-2 Lghaunane ………………….…………………………………………………….
II-3 Takammart …………………………………………………………………...…..
II-4 Le leben …………………………..………………………………………............
II-5La crème……………………….……………………………………………………
03
03
03
05
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06
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08
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II-6 La Klila ou caséine desséchée ……………………………………………………
II-7 Aoules …………………………………………………………..........……………
II-8Lebaa …………………………………………………………...………………….
II-9 Méchouna ………………………………………………………………………...
II-10 Madghissa ………………...……………………………………………………...
II-11-Fromages frais traditionnel (Jben) ……………………………………………..
II-11-1 Définition ……………………….…………………………………………...
II-11-3les Caractéristiques physiques et chimiques du J'ben ………… .……………
II-11-3-Microflore de J'ben…………………………………………………………….
II-11-3-1 Flore d'altération ……………………………………………………………
a)Flore thermorésistante ………………………………………………………………
b) Les coliformes ………………………………………………………………………
c) Les psychrotrophes …………………………………………………………………
d) Levures et moisissures ……………………………………………………………..
d.l) Les levures ……………………………………………………………………......
d.2) Les moisissures …………………………………………………………………..
II-11-3-2 Microflore lactique du J'ben ……………………………………………..
a-Définition des bacteries lactiques…………………………………………………..
b-Classification et taxonomie……………………………………………………........
c-Habitat et origine des bacteries lactiques……………………………………………
d-caractéristiques des principaux genres des bacteries lactiques……………………..
d-1 le genre Lactobacillus……………………………………………………………...
d-2 le genre Leuconostoc, Oenococcus et Weissella…………………………………..
d-3 le genre Pediococcus et Teteragenococcus………………………………………..
d-4 le genre Lactococcus et Streptococcus…………………………………………….
d-5 le genre Enterococcus et Vagococcus……………………………………………..
d-6 le genre Carnobacterium…………………………………………………………..
d-7 le genre Bifidobacterium…………………………………………………………..
e- la nutrition des bacteries lactiques…………………………………………………..
e-1 exigences en acides amines ……………………………………………………….
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e-2 exigences en vitamines ……………………………………………………………
e-3 exigences en bases azotées…………………………………………………………
e-4 exigences en cations ……………………………………………………………….
f-Les propriétés fonctionnelles et technologiques des bactéries lactiques ………………….
f-1 Activité acidifiante …………………..……………………………………………….
f-2 Activité protéolytique ……………………………..…………………………………
f-3 Activité lipolytique et formation de substances aromatiques………………………
f-4-Formation des exopolysaccharides …………………………………………………..
g- Propriété probiotique ……………………………………………….………………..
h- rôles des bactéries lactiques………………………………………………………..
h-1 Domaine alimentaire (sur la structure et la texture)……………………………….
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h-2 Role dans la conservation………………………………………………………….
h-2-1 Production de l'acide lactique……………………………………………………
24
h-2-2 Production des bactériocines…………………………………………………….
h-3 Role sur les caractéristiques organoliptiques……………………………………..
24
h-4- domaine de la santé ……………………………………………………………….
24
24
25
Chapitre II: Matériels et méthodes
I-Echantillonnage………………………………………………………………………………
26
I.1. Préparation de J'ben………………………………………………………………..
I.2 Matériel utilisé………………………………………………………………..........
I.2.1. Le lait et le J’ben……………………………………………………………….........
26
26
I.2.2 Les milieux de cultures………………………………………………………………..
I.2.3 Les solutions utilisées…………………………………………………………….
27
28
II- Control microbiologique des échantillons…………………………………………………
II.1 Mesure de pH………………………………………………………………………
II.2 Préparation des dilutions ………………………………………………………….
II.2.1-Préparation de la solution mère …………………………………………………
II.2.2-Préparation des dilutions décimales ……………………………………………
III-recherche de la flore contaminante…………………………………………………
III.1-la recherche de Staphylococcus aureus sur milieu Chapman ……………………
III.2-la recherche des coliformes fécaux et totaux sur milieu BCPL……………………
III.3-la recherche des bactéries sporulées Sur milieu VF………………………………
III.4- la recherche des champignons Sur milieu sabouraud………………………………
27
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29
III.5- la recherche de la flore mésophile aérobie totale…………………………………..
IV- L’isolement des bactéries lactiques……………………………………………………
IV.1-Purification………………………………………………………………………..
IV.2-Identification et caractérisation des isolats …………………………………………
IV.2.1-Test phénotypiques ………………………………………………………………….
IV.2.1.1-Examen Macroscopique…………………………………………………………..
IV.2.1.2-Examen microscopique (Coloration de Gram)………………………………
IV.2.1.3-Test catalase …………………………………………………………………
IV.2.2-Conservation des souches ……………………………………………………..
IV.2.2.1-Conservation de courte durée……………………………………………………
IV.2.2.2-Conservation de longue durée……………………………………………………
IV.2.3-Tests physiologiques………………………………………………………………..
IV.2.3.1-Croissance en différents concentration en NaCl, différents pH, différents
temperatures…………………………………………………………………………………..
IV.2.3.2 Thermorésistance………………………………………………………………….
IV.2.3.3 Type fermentaire ………………………………………………………………….
IV.2.3.4Test de lait de Sherman……………………………………………………………
IV.2.4Test biochimique ……………………………………………………………………
Profile fermentaire…………………………………………………………………………..
IV.2.5 Testes technologiques…………………………………………………………..
IV.2.5.1 Recherche de l’Arginine déhydrolase (ADH) ………………………………
IV.2.5.2 La production des exo-polysaccharides…………………………………………
IV.2.5.3 Test de citrate ………………………………………………………………………
Chapitre III: Résultats et discussions
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I- Control microbiologique des échantillons……………………………………………………
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Mesure de pH de 6 échantillons de J'ben………………………………………………
II-recherche de la flore contaminante…………………………………………………..
III-Isolement des bactéries lactiques……………………………………………………….
III.1 Caractérisation morphologique ………………………………………………………
III.1.1 Résultat des tests macroscopiques………………………………………………….
II.1.2 Etude microscopique………………………………………………………………….
III.1.3 Test de catalase……………………………………………………………………….
III.2 Caractérisation physiologique et biochimique………………………………………
III.2.1 Tests physiologiques ………………………………………………………………..
III.2.1.1 Croissance en temperatu concentration en NaCl en temperatu pH et temperatu
temperatures……………………………………………………………………………………
III.2.1.2Thermorisistance…………………………………………………………………….
III.2.1.3Type fermentaire…………………………………………………………………….
III.2.1.4 Test de lait de Sherman (concernant les bactéries de forme cocci et
homolactiques)…………………………………………………………………………
III.2.1.5 Profile fermentaire …………………………………………………………...
III.3 Tests téchnologiques……………………………………………………………………
III.3.1 Recherche de l’Arginine dihydrolase (ADH) ……………………………………
III.3.2 La production des exopolysaccharides……………………………………………
III.3.3 Test de citrate …………………………………………………………………………
III-3-4 La diversité des bactéries lactiques étudiées…………………………………….
Conclusion………………………………………………………………………………
Références bibliographiques
Annexes
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33
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Introduction
Introduction
Introduction
Le lait représente un milieu biologique fortement altérable par voie microbienne en
raison de sa forte teneur en eau, de son pH voisin de sa neutralité et de sa richesse en
composants biodégradables (lactose, protéines et lipides) (Huyghebaert., 2006). Lorsqu’il est
prélevé dans de bonnes conditions, le lait cru contient peu de germes (103 germes par mL). Il
s’agit de germes saprophytes et parmi eux, on trouve les Streptocoques lactiques
(Lactococcus) et les Lactobacilles. Durant la traite et le stockage, le lait peut se contaminer
par une flore variée constituée essentiellement de bactéries lactiques appartenant aux genres
suivants : Streptococcus, Lactococcus, Enterococcus, Leuconostocs et Lactobacillus
(Bekhouche, 2006).
Le lait de chèvre joue un rôle essentiel dans l’alimentation humaine, le plus
consommée par la communauté rurale, alors qu’il est très peu disponible sur le marché.
Commercialement, le lait de chèvre est transformé en produits tels que Raib, Lben, klila, la
Crème, la Zebda ou beurre frais et le J'ben (produits traditionnelles locale) (Badis et al.,
2004). Plusieurs variétés de fromage à partir du lait de vache, de chèvre et de brebis sont
fabriquées à travers le monde, dans des fermes suivant des techniques traditionnelles, sans
addition intentionnelle de levains, et sont généralement conçues comme des "fromages
artisanaux". Les paramètres technologiques ont une grande influence sur les caractéristiques
finales du fromage et jouent un rôle important dans la composition microbienne qui est
considérée à la fois par les fabricants et les consommateurs comme une caractéristique
spéciale des fromages artisanaux (Randazzo et al., 2009; Bekhouche et Boulahrouf, 2005 ).
De nos jours, la fermentation lactique est une activité grandissante tant industrielle
qu'artisanale. Plusieurs microorganismes participent à la fabrication de produits laitiers
fermentés. Les bactéries lactiques (BL) homofermentaires composent majoritairement les
ferments utilisés pour transformer le lactose en acide lactique. Elles sont également
responsables, en partie, du goût et de la texture des produits laitiers fermentes (Johnson et
Steele, 2001).
La propriété des bactéries lactiques à produire des composés antagonistes tels que les
acides organiques (acide lactique et acide acétique), qui font baisser le pH dans le milieu, et
par la synthèse de bactériocines qui renforce la conservation (Bekhouche et Boulahrouf, 2005)
et la synthèse du peroxyde d’hydrogène est reconnue depuis très longtemps. Par cette
capacité, l’utilisation des bactéries lactiques permet de satisfaire les besoins de point de vue
sanitaire en industrie alimentaire, permet d’inhiber la prolifération des microorganismes
pathogènes et ainsi d’assurer une bonne conservation des aliments (Paul Ross et al., 2002).
1
Introduction
L’objectif de notre travail est d’isoler des bactéries indigènes à partir des produits
laitiers fermentés traditionnels (J’ben) préparés au laboratoire à base du lait cru de vache et de
chèvre et effectuer une identification classiques des isolats ainsi une étude des caractères
technologiques des bactéries lactiques isolées à partir de ce produit.
2
Chapitre I
Synthèse bibliographique
Chapitre I
I-Généralités sur le lait
I-1-Définition de lait
Selon le congrès international pour la répression des fraudes alimentaires, tenu à
Genève en 1908, « le lait est le produit intégral de la traite totale et ininterrompue d’une
femelle laitière ; (vache, jument, chèvre, brebis, etc.), bien portante, bien nourrie et non
surmenée. Il doit être recueilli proprement et ne doit pas contenir de colostrum » (Boudier J.
F. et al ; 1981).
Le lait est le produit le plus proche du concept « aliment complet» au sens
physiologique du terme, car il renferme la quasi-totalité des nutriments indispensables à
l'homme.
C’est un aliment nutritif pour les êtres humains, indispensable pour le nouveau-né,
comme il s’avère très bénéfique pour l’adulte. Il constitue un milieu propice pour la
croissance de nombreux micro-organismes, en particulier les bactéries pathogènes (Chye et
al., 2004). Le lait sans indication de l’espèce animale de provenance correspond au lait de
vache (Larpent et al., 1997). Le lait apparait comme un liquide opaque, blanc mat, plus moins
jaunâtre selon sa teneur en β-carotènes et en matière grasse, il a une odeur peu marquée mais
reconnaissable (Cniel, 2006).
I-2- Composition du lait
Tableau 0l : Composition typique du lait de vache (Alais C., 1984).
SUBSTANCES
Quantité en g par litre
ETAT
PHYSIQUE
DES
COMPOSANTS
Eau (ml/L)
905
Eau libre (solvant)
Eau liée (3,7 %)
Glucides : Lactose
49
Solution
Lipides:
35
Emulsion de globules
Matière grasse proprement 34
dite
0,5
Lécithine (phospholipide)
0,5
gras (3-5 µ)
3
Chapitre I
Partie insaponifiable (stérol,
carotène, to- cophérols)
Protides:
34
Suspension micellaire
Caséine
27
de phosphocaséinates de
Protéines solubles (globulines, 5,5
1,5
albumines)
Substances
azotées
calcium (0,08 à 0,12µ)
Solution colloïdale
Solution vraie
non
protéiques
Sels:
9
Solution ou état colJoï
Acide citrique
2
dal (P et Ca) (Sels de K,
Acide phosphorique (P20S)
1,6
Ca, Na, Mg, .. )
Acide chlorhydrique (NaCl)
1,7
Constituants divers:
Traces
Vitamines,
dissous
enzymes,
,Extrait
sec
gaz 127
total 92
(EST) , Extrait sec non gras
D'autres constituants sont présents mais en quantité minime. Cependant, certains
d'entre eux, du fait de leur activité biologique, revêtent une grande importance. Ce sont:
-
les enzymes: peroxydase, catalase, phosphatase
-
les· vitamines : facteurs A, D, C, BI, B2, B6, BI2, etc.
-
les lécithines (phospholipides)
-
.les nucléotides
-
les éléments cellulaires: leucocytes, cellules épithéliales, …etc.
Outre, ces constituants, le lait renferme aussi des micro-organismes en quantité
variable suivant l'état de santé de la femelle laitière, de l'hygiène de la traite et des
manipulations diverses subies par le lait (Alais C , 1984; Mollamadou D ,2001).
4
Chapitre I
I-3- Caractéristiques physico-chimiques du lait
Tableau 02: Caractéristiques physico-chimiques du lait (Veisseyre R., 1975).
Caractéristiques
Valeurs
Densité à 15°C
1,030 – 1,034
Chaleur spécifique
0,93
Point de congélation
- 0,55°C
pH
6,6 à 6,8
Acidité exprimée en degrés
16 à 18
Dornic
Indice de réfraction à 20°C
1,35
Point d’ébullition
100,16°C
I-4- Variabilité de la composition
La composition du lait des différentes espèces de mammifères est relativement
semblable. Mais des écarts peuvent apparaître quant à la composition centésimale tel ou tel
autre élément Cette variabilité peut trouver son explication dans les facteurs suivants:
- variations spécifiques: le lait des ruminants est «caséineux » alors que celui des carnivores
est «albumineux».
- variations physiologiques individuelles (stade de lactation et abondance de la sécrétion
'lactée).
- l'alimentation, l'âge et l'état sanitaire de la laitière….etc. (Alais C., 1984).
5
Chapitre I
I-5- La comparaison entre le lait de vache et lait de chèvre
Tableau III : Teneurs de différents laits en certains constituants (g /L) (Alais C., 1984).
Eau (ml/L)
Extrait
Vache
Chèvre
900-910
900
sec 125-135
140
total (E.ST.)
Matière grasse 35-45
45-50
g/L
30-36
35-40
Caséines
27-30
30-35
Protéines
4-5
6-8
Lactose
40-50
40-45
Matières
7,5-8,2
8-10
Matière
protéique
solubles
minérales
I-6 la microflore de lait
I-6-1 Flore originale
Lorsqu’il est prélevé dans de bonnes conditions, le lait contient essentiellement des
germes saprophytes du pis et des canaux galactophores : Microcoques, Streptocoques
lactiques et lactobacilles (Guiraud, 1998).
I-6-2 Flore pathogène
Elle présente un danger pour le consommateur c’est le cas de : Mycobacterium bovis,
M. tuberculosis, Bacillus cereus, et des représentants des genres Brucella et Salmonella
(Fukushima et al., 1984 in Bourgeois et al., 1996).
I-6-3 Flore psychrotrophe
6
Chapitre I
Il s’agit essentiellement de : Acinetobacteres, Clostridium, Pseudomonas et
Flavobacterium qui se développent à une température de 3 à 7°C (Hicks et al., 1985; Jooste et
al., 1985 in Leveau et Bouix, 1993). Listeria monocytogenes capable de se multiplier à une
température comprise entre 0°C et 10°C est qualifiée de ce fait de psychrotrophe (Rosset,
2001).
7
Chapitre I
II- Les produits laitiers traditionnels
C’est l’augmentation de la production du lait durant certaines saisons et la difficulté de
son préservation sous la forme fraîche a conduit au développement des technologies de
production traditionnel (Dharam et Narender 2007 in Lahsaoui., 2009). La consommation des
produits laitiers est également associée à des effets bénéfiques sur la santé en plus de leurs
valeurs nutritionnelles (Takahiro et al., 2007; Shan-na et al., 2011). La transformation du lait
de chèvre en produits laitiers traditionnels algériens, tels que Raib Lben et Jben est réalisée
via une fermentation spontanée sans l’ajout d’une entrée sélectionnée (Badis et al., 2004). Ces
produites sont partie intégrante d’héritage algérien et ont une grande importance culturelle
médicinale, et économique il ont être développée sur un longue période avec les compétences
culinaire de fermes en plus de la conservation des solide du lait pour plus longuement à
température ambiante (Lahsaoui., 2009).
II-1- Bouhazza
C’est un fromage typiquement fabrique à partir de lait cru non ensemencer ceci se
confirme par sa charge en flore mésophile et de streptocoque lactique, ces germes sont
responsables surtout de la diminution concomitante du pH et de l’augmentation de l’acidité
(Aissaoui et al., 2006 in Lahsaoui., 2009).
II-2 Lghaunane
Fromage fabriquée dans la région kabyle à partir du colostrum la préparation se fait
dans un tensilen Terre cruit en duit d’huile d’olive dans le quelle sera découpé et prêt à être
consommer (Agroligne, 2001 in Lahsaoui., 2009).
II-3 Takammart
Fromage de Hoggar ; sa fabrication se fait par introduction d’un morceau du caillette
de jeunes chevreaux dans lait, après quelque heures le caille est retiré à l’aide d’une louche.
II-4 Le leben
Le leben ; c’est du lait débarrassé de sa crème, et qui a subi ensuite une fermentation
lactique, l’acide lactique produit provient du dédoublement de la molécule de lactose par
8
Chapitre I
l’action du bacille lactique. L’acide lactique à la propriété, lorsqu’il se forme en excès,
d’amener la coagulation de la caséine du lait. Cette coagulation est d’autant plus active que la
température ambiante est plus élevée (Bendanou., 1981).
II-5 -La crème, la Zebda ou beurre frais
Selon la norme du Codex Alimentarius, le beurre est un «produit gras dérivé
exclusivement du lait et/ou de produits obtenus à partir du lait, principalement sous forme
d’une émulsion du type eau dans huile». Il est obtenu par barattage de la crème du lait
(Luquet et Corrieu., 2005). Elle contient presque la totalité des lipides du lait et de 2,7 g de
protéines pour 100 g. Le beurre est fabriqué à partir de la crème (le barattage) et il contient
0,8 g de protéines pour 100g (Vilain., 2010).
II-6 La Klila ou caséine desséchée
La Klila est un fromage ferment produit empiriquement dans plusieurs région de
l’Algérie, il est fabriquée par un chauffage relativement modérée (55 à 75C°) du Leben
jusqu’à ce que le Lben est caille (10 à 15 min), le caille est ensuite égouttée spontanément ou
presse à l’aide d’une pierre, le fromage obtenu est consommée tel qu’il est frais au après un
séchage il est utilisée comme un ingrédient après réhydratation dans les préparations culinaire
traditionnel.
II-7 Aoules
Il est fabriqué à partir du lait de chèvre qui est extrêmement aigre. Après une
coagulation intense, le fromage obtenu a une pâte dure (matière sèche représente 92%).
L'égouttage se fait dans une paille ensuite, il est reformé sous forme des boules plates séchées
au soleil, il peut être consommé en mélange avec les dates (Abdelaziz et aitkaci., 1992).
II-8 Lebaa
La matière première est le colostrum, parfois il est mélangé avec des œufs, il est salé
puis bouillit pendant 15 mn environ. Le produit obtenu est appelé lebaa (Lemouchi., 2008).
9
Chapitre I
II-9 Méchouna
Il est fabriqué à partir du lait cru qui est chauffé jusqu'à ébullition. Ensuite, on ajoute
de lait fermenté l’ben ou rayeb et du sel. En utilisant une gaze, le mélange est laissé égoutter.
Il est consommé frais ou avec la galette (Lemouchi., 2008).
II-10 Madghissa
Le fromage est connu dans la zone du chaouia coté Est du pays. Il est préparé avec la
klila Fraîche après salage et incorporation du lait frais. L'ensemble est porté à ébullition sur
feu Doux jusqu'à séparation du caillé et de lactosérum. Après refroidissement du mélange, la
Marmite est basculée pour éliminer le lactosérum. Le fromage ainsi préparé est une pâte jaune
Salée et élastique appelée madghissa (Aissaoui., 2003).
II-11-Fromages frais traditionnel (J'ben)
II-11-1 Définition
Selon la norme du Codex Alimentaires et la norme internationale FAO/OMS (2005),
le fromage frais ou non affiné est du fromage qui est prêt à la consommation peu de temps
après fabrication. Aux termes de la réglementation française, la dénomination «fromage» est
réservée à un produit fermenté ou non, obtenu par coagulation du lait, de la crème ou de leur
mélange, suivie d’égouttage. Tous les fromages frais ont une DLC de 24 jours (Luquet et
Corrieu., 2005).
J'ben est un fromage traditionnel frais obtenu par coagulation enzymatique (présure
extrait à partir de la caillette de veau). Le lait destiné à la fabrication est chauffé, une fois
tiède, un fragment de caillette bovine est macéré dans le lait. Après coagulation du lait et
égouttage, le caillé ainsi obtenu peut être salé ou additionné de quelques épices ou de plantes
aromatiques. (Lahsaoui., 2009).
II-11-2- Caractéristiques physiques et chimiques du J'ben
le fromage frais « J'ben » ne présente pas de caractéristiques définies à cause des
méthodes artisanales utilisées pour sa préparation reposant, essentiellement, sur les
connaissances acquises à partir d’une longue expérience (Salmeron et al., 2002). Les arômes,
10
Chapitre I
les propriétés organoleptiques et les caractéristiques physico-chimiques du fromage dépendent
de celles du lait cru qui à son tour dépend de la race des animaux et leur type d’alimentation
(Poznanski et al., 2004). Généralement, Le pH (< 4,2) et l'acidité titrable (> 0,9%) sont les
paramètres les moins variables du « J'ben ». Cependant, les matières solides totales du « J'ben
» sont le facteur le plus variable car ce dernier dépend de la durée d’égouttage. Étant donné
que les lipides, le lactose et les protéines constituent les principaux composants de l’ensemble
des matières solides en « J'ben », ils sont directement influencés par les variations des dites
matières solides (Benkerroum et Tamime., 2004). De nos jours, J'ben est également préparé à
partir de lait pasteurisé. Les caractéristiques finales d’un J'ben typique sont variables et
affectées par le préparation du fromage (Ouadghiri et al., 2005).
II-11-3-Microflore de J'ben
La composition microbiologique du fromage dépend de celle du lait de départ, du
processus de fabrication qu’il a subi et de l’âge du fromage (Ercolini et al., 2009).
Généralement, elle est dominée par les bactéries lactiques en l’occurence les Lactococcus et
les Enterococcus qui influencent les caractéristiques sensorielles du produit fini (Randazzo et
al., 2009).
II-11-3-1 Flore d'altération
Ce sont des bactéries ; champignons indésirables apportés par la contamination. Cette
flore regroupe les bactéries thermorésistantes, les coliformes, les psychrotrophès, les levures
et moisissures (Abdessalam A. D., 1984).
a) Flore thermorésistante
Les composantes de cette flore sont: Micrococcus, Microbactérium et Bacillus dont
l'espèce cereus produit une entérotoxine C'est la flore de contamination provenant le plus
souvent de la machine à traire ou du tank et non détruite par la chaleur. Clostridium
perfringens est l'une des causes de toxi-infection alimentaire. Après incubation de 8 à 22
heures, des troubles légers et passagers apparaissent : diarrhée profuse, aqueuse, ballonnement
et douleurs abdominales.
11
Chapitre I
b) Les coliformes
D'un point de vue technologique, certains coliformes sont lactiques et Fermentent le
lactose sur un mode hétérofermentaires. De plus, ces bactéries élaborent diverses substances
qui provoquent le gonflement précoce des produits laitiers dont le fromage. Un grand nombre
d'entre elles étant les hôtes habituels de l'intestin des mammifères, leur présence dans le lait
tout comme dans l'eau, est l'indice d'une contamination fécale. Cet indice est mis à profit dans
l'examen de la qualité des produits (Cisse S. A., 1997).
c) Les psychrotrophes
Le terme « psychrotrophe » désigne des micro-organismes qui ont la Faculté de se
développer à une température inférieure à +7°C, indépendamment de leur température de
croissance plus élevée. Parmi les micro-organismes qui composent ce groupe, nous pouvons
citer:
- Gram (-) : Pseudomonas, Aeromonas, Serratia, ... etc
- Gram (+) : Micrococcus, Corynebactérium, ... etc
En général dans lait et les produits laitiers ; c'est le genre Pseudomonas qui domine. Il
est fortement psychrotrophe et il se multiplie par 100 en 48 heures à +4°C. Ces germes
produisent des lipases et des protéases thermorésistantes ayant pour conséquence l'apparition
de goûts très désagréables dans les produits laitiers : goût amer, rance, putride... etc (Hicks et
al., 1985; Jooste et al., 1985 in Leveau et Bouix., 1993).
d) Levures et moisissures
Les levures et moisissures sont des cellules eucaryotes rattachées au règne végétal par
leur structure cellulaire. Regroupées sous le vocable de flore fongique, elles peuvent être
retrouvées aussi bien dans le lait cru, le lait en poudre que dans tous les autres produits laitiers
(Abdessalam A. D., 1984).
d-l) Les levures
De forme arrondie ou ovale, volumineuses ou unicellulaires, les levures sont utiles en
industrie laitière car elles peuvent servir comme agents d'aromatisation. Elles sont aérobies
12
Chapitre I
facultatives et se développent en surface formant les boutons de nature mycélienne (47). Par
contre, d'autres levures peuvent avoir des effets néfastes dans les aliments ; ce sont :
-
Kluyveromyces lacfis
-
Kluveromyces fragilis
-
Saccharomyces fragilis
-
Saccharomyces lactis.
Les levures supportent des pH de 3 à 8 avec un optimum de 4,5 à 6,)., ce qui explique
leur présence dans le lait cru comme dans le lait Caillé (8). Elles entraînent des altérations
rendant le produit final répugnant: aspect trouble, odeurs désagréable, gonflement des
produits ou de leur emballage (Hicks et al., 1985; Jooste et al., 1985 in Leveau et Bouix,
1993).
d-2) Les moisissures
Les moisissures sont en général plus complexes dans leur morphologie et dans leur
mode de reproduction. Elles se développent en surface ou dans les parties internes aérées.
Elles peuvent être utiles ou indésirables en industrie alimentaire à partir du lactose; cette
propriété leur confère une utilité incontestable en fromagerie. C'est ainsi que Penicillium
camemberti et Penicil{ium roqueforti sont utilisées dans la fabrication de divers types de
fromages (Hicks et al., 1985; Jooste et al., 1985 in Leveau et Bouix, 1993).
II-11-3-2 Microflore lactique du J'ben
a) Définition des bacteries lactique
La flore lactique est utilisée en industrie laitière, sous forme de ferment ou levain pour
la fabrication de produits laitiers fermentés. L’intérêt technologique des bactéries lactiques
réside dans la production de l'acide lactique par la fermentation du lactose. La production
d'acide lactique, en faisant baisser le pH, provoque une déstabilisation progressive de la
dispersion micellaire, ce qui rend le lait de moins en moins stable aux traitements thermiques
et peut entraîner sa coagulation, même à température ambiante. Lors de la fermentation, en
plus de l’acide lactique, certaines bactéries lactiques produisent du gaz carbonique ainsi que
divers composés qui contribuent à l'arôme des produits laitiers. Par leur production d'enzymes
13
Chapitre I
protéolytiques, les bactéries lactiques contribuent à l'affinage des fromages. Les bactéries
lactiques forment un groupe très hétérogène. Elles ont en commun les caractères suivants :
GRAM +, catalase –
de forme cocci ou bacille
micro-aérophiles ou anaérobies facultatifs
peu ou pas protéolytiques dans le lait (Micanel M. ; et al ; 1997).
b) Classification et taxonomie
La première classification des bactéries lactiques a été établie en 1919 par Orla-Jensen
sur divers critères morphologiques et physiologiques (activités catalase et nitrite réductase,
type de fermentation) (Stiles et Holzapfel., 1997).
Les critères phénotypiques permettant la classification des bactéries se sont ensuite
étendus à la composition de la paroi, le type d’acides gras cellulaires, le type de quinones
(accepteur d’électrons).
Cependant ces méthodes phénotypiques ne rendent pas compte des relations
phylogénétiques entre les groupes. En 1977, Woese et Fox introduisent la phylogénie
moléculaire basée sur la séquence des ARN ribosomiques. Cette méthode va révolutionner la
taxonomie des bactéries et la classification des BL va être profondément modifiée. D’autres
méthodes génotypiques (basés sur les acides nucléiques) sont aussi utilisées en classification,
comme le pourcentage en GC ou l’hybridation ADN:ADN (Stiles et Holzapfel., 2001).
Tableau IV : Principaux genres des bactéries lactiques (sutrat et Federighi., 1998).
Morphologie
Lactobacillus
Bacille
Fermentation
Homofermentation
Température
Nombra
d'optimisation
d'espèces
ou Thermophile ou G1:23 ;G2:16
heterofermentation
mesophile
G3: 22
Carnobacterium
Bacilles
Heterofermentaires
Psychrophiles
6
Lactobacoccus
Coque
Homofermentaires
Mésophiles
5
Streptococcus
Coques
Homofermentaires
Thermophile ou 19
mésophiles
14
Chapitre I
Enterococcus
Coques
Homofermentaires
Mésophiles
13
Vagococcus
Coques
Homofermentaires
Mésophiles
2
en Homofermentaires
Mésophiles
7
en Homofermentaires
Mésophiles
1
mobiles
Pediococcus
Coques
tétrades
Tetragenococcus
Coques
tétrades
Leuconostoc
Coques
Heterofermentaires
Mésophiles
11
Oenococcus
Coques
Heterofermentaires
Mésophiles
1
Befidobacterium
Forme
Acide
irréguliers
lactique
acétique
et Mésophiles
25
Figure 01 : Arbre phylogénétique des principaux genres de bactéries lactiques et des genres
associés, obtenu par analyse des ARNr 16S (Stiles et Holzapfel., 2001).
c- Habitat et origine des bactéries lactiques
Les bactéries lactiques sont très fréquentes dans la nature. Elles se trouvent
généralement associées à des aliments riches en sucres simples. Elles peuvent être isolées du
lait, du fromage, de la viande, des végétaux ou des aliments ensemencés par les végétaux.
15
Chapitre I
Elles se développent avec la levure dans le vin, la bière et le pain. Quelques espèces
colonisent le tube digestif de l’homme et des animaux (Leveau et Bouix., 1993 ; Hassan et
Frank., 2001).
d) Caractéristiques des principaux genres des bactéries lactiques
d-1-Le genre Lactobacillus
Il groupe de nombreuses espèces isolées d’habitats variés : cavité bucale, tractus
digestif, organe génitaux chez l’homme, produits végétaux, lait et produits laitiers, produits
carnés, poissons marinés ou fumés, eaux usées, sol….Ce sont des bacilles acidotolérants, dont
de nombreuses espèces sont impliquées dans des fermentations alimentaires.
L’hétérogénéité des espèces est illustrée par le contenu en G+C qui peut varier de 32
à53%. La classification rameniée par Kandler et Weiss les subdivise en 03 groupes selon leur
type
fermentaire:
homofermentaires
obligatoires,
hétérofermentaires
facultatives,
hétérofermentaires obligatoire (Fig 02).
Figure 02: 1a. Lactobacillus Rosell-11 observé au microscope électronique à transmission
(M.E.T.) (x 10000). (http://www.institut-rosell-lallemand.com/uploads/images/souches/lactobacillus-R52_big.jpg).
d-2- Le genre Leuconostocs, Oenococcus et Weissella
Ils rassemblent les coques lenticulaires en paires en chinettes, mésophiles, qui
possèdent un caractère hétérofermentaire marqué, avec production d’acide lactique (isomère
D), de CO2 et d’héthanol. Certaines espèces sont capables de fermenter le citrate ce qui leur
confère une activité aromatique importante. D’autres synthétisent des dextranes en présence
16
Chapitre I
de saccharose. Ce genre comporte 6 espèces présentes majoritairement dans les produits
végétaux, mais elles sont également isolées dans les produits laitiers. Ils participent à la
fermentation des produits végétaux (Michel fedrighi., 2005) (Fig. 03).
Figure 03 : le genre Leuconostoc (Michel fedrighi., 2005).
d-3- Le genre Pediococcus et Tetragenococcus
Les Pediococcus sont des coques homoentfmeraires dont la particularité est le
groupement s en tétrade ; ils sont mésophiles, et le plus souvent incapables d’utiliser le lactose
.par contre, certaines espèces se distinguent par leur capacité à se développer à des teneures en
sel très élevées, comme P.halophilus, renommé Tetragenococcus halophilus qui tolère
jusqu’à 18% de NaCl. Ils sont souvent présents dans la bière, le vin, les produites végétaux et
saumures (anchois salés) et participent à la fermentation des saucissons (Michel fedrighi.,
2005) (Fig. 4).
Figure 04: le genre pediococcus (Michel fedrighi., 2005)
17
Chapitre I
d-4-Le genre Lactococcus et Streptococcus
Ils rassemblent des coques homofermentaires, produisant en majorité de l’acide L-lactique.
Les éspeces initialement regroupées dans le genre Streptococcus ont été redistribuées au sien
de ces genres selon les homologies de leur ARN ribosomique 16S.
Le genre Lactococcus (streptocoques du groupe N) représente les streptocoques dites
(lactiques), car ils sont associés à de nombreuses fermentaires alimentaires et ne possèdent
aucun caractère pathogène. Ils sont mésophiles, se développent à 10°C et non à 45°C. Les
produites végétaux constituent leur réservoir principal, mais ils sont largement présents dans
le lait et les produits laitiers. L’éspeces Lc.lactis (et ses sous-espèce) intervient dans la plupart
des produits laitiers fermentés.
Le genre Streptococcus comprend essentiellement des espèces d’origine humaine ou
animale dont certaines sont pathogènes comme S.pyogenes et S.agalactiae ; d’autres sont
impliquées dans la formation de la plaque dentaire (S. mutans) ; ces espèces étant rarement
rencontrées dans les aliments. L’espèce thermophile Streptococcus thermophius se différencie
par son habitat (lait et produits laitiers), et son caractère non pathogène.Du fait de ses
propriétés technologiques seule cette espèce est considérée comme appartenant aux bactéries
lactiques (Michel fedrighi., 2005) (Fig. 05).
Figure 05: le genre streptococcus (Michel fedrighi., 2005).
d-5- Les genres Enterococcus et Vagococcus
Le genre Enterococcus rassemble la plupart des espèces du groupe sérologique D et
comprend notamment les espèces anciennement désignées sous le terme (Streptocoques
fécaux), comme Enterococcus faecalis et Enterococcus faecium. Ce sont également des
18
Chapitre I
coques homofermentaires qui se caractérisent par leur développement à 10 et 45C°, leur
aptitude croître en présence de 6,5% de NaCl, et à pH 9,6 , et leur grande résistance aux
facteurs de l’environnement, en particulier la température ( 30 min. à 60C°). Leur habitat est
très varié : intestin de l’homme et des animaux, produits végétaux, sol, produits laitiers. Au
sien des bactéries lactiques, les bactéries du genre Enterococcus ont une position particulière :
parfois utilisés comme indicateur de contamination fécale dans les aliments, ils peuvent aussi
être associés à la fermentation de certains fromages italiens .Certaines espèces de
Streptococcus et Lactococcus isolées de poisson et
d’eau douce et qui possèdent la
particularité d’être mobiles, ont été répertoriées dans le nouveau genre Vagococcus mais ne
concernent pas les aliments (Michel fedrighi, 2005) (Fig06).
Figure 06: le genre entérococcus (Michel fedrighi., 2005).
d-6-Le genre Carnobacterium
Des études menées sur les produits carnés ont conduit à isoler des bactéries lactiques
décrites comme des Lactobacillus atypiques, peu acidifiants. Une étude taxonomique de ces
différentes souches a permis de les regrouper après hybridation ADN-ADN, dans un nouveau
genre, Carnobacterium. Morphologiquement proche des Lactobacillus, ils s’en différencient
par leur tendance psychrotrophe et leur production majoritaire de l’isomère L de l’acide
lactique .De même leur peptidoglycane est constitué d’acide meso-diaminopimelique alors
qu’il est caractérisé par le peptide Lyse-Asp chez la plupart des Lactobacillus.
Les carnobactéries sont phylogénétiquement plus proche du genre Enterococcus.
Ce genre comprend 4 espèces fréquemment associées aux aliments C.pisciola (ou
maltaromicus), C.mobile et C.gallinarum
19
Chapitre I
Ils sont isolés de produits carnés le plus souvent conditionnés sous atmosphère
modifiée, ou de produits de la mer, saumon fumé notamment mais également du contenu
intestinal ou du tissu rénal de salmonidés. Certains ont également été isolés de fromages. Les
Carnobacterium
n’interviennent pas dans les fermentations alimentaires, ils tolèrent
difficilement un pH inférieure à 5, en revanche ils sont souvent producteurs de substances
inhibitrices. Deux espèces non associées aux aliments, isolées de l’eau d’un lac d’Antarctique,
C.funditum et C.alterfunditum ont été récemment décrites.
d-7-Le genre Bifidobacterium
Les cellules de Bifidobacterium se caractérisent par leur forme très irrégulière, souvent
en V, mais pouvant être coccoides.
Elles se différencient des autres bactéries lactiques par leur caractère anaérobies, leur
G+C% élevé, et la présence d’une enzyme, la fructose-6-phosphate phosphocétolase. Celle –
ci leur permet de fermenter les hexoses en produisant de l’acide acétique et l’acide lactique,
ainsi qu’en moindre proportion de l’éthanol et d’autres acides organiques. Cette fermentation
(lactique) a conduit à les rapprocher du groupe des bactéries lactiques. Leur température
optimale de croissance est comprise entre 37C° et 41°C ; ils se développent à pH supérieure à
5.
Ils sont isolés de l’homme et des animaux, et sont utilisés pour leurs propriétés
nutritionnelles (Michel fedrighi, 2005) (Fig. 07).
Figure 07: Le genre Bifidobacterium. (Michel fedrighi., 2005).
20
Chapitre I
e)La nutrition des bactéries lactiques
Les bactéries lactiques ont une faible aptitude biosynthétique et sont en principe
incapables d'assimiler directement les principaux précurseurs de leur environnement, elle sont
considérées comme un groupe bactérien le plus exigeant du point de vue nutritionnel ,car elles
requièrent non seulement des substrats complexes carbonés, azotes, phosphates et soufrés
mais aussi des facteurs de croissance comme les vitamines et les oligoéléments dont le role
des coenzymes est plus important (Lenoire et al., 1992).
e-1- Exigences en acides amminés
Les bactéries lactiques sont en principe incapable d'effectuer la synthèse des acides
aminés, et doivent par conséquent faire appel à des sources exogènes pour assurer leur
métabolisme (luquet, 1986).
Les exigences en acides amines des streptococcus sont différentes de celles des
lactobacillus, ils ont besoin d'acide glutamique, d'histidine, de cystéine, de méthionine et aussi
de valine, de leucine, da tryptophane ou de tyrosine.les lactobacilles ont besoin d'aspartate,
d'histidine, de lysine, da leucine, de méthionine et de valine (lenoir et al., 1992).
e-2-exigences en vitamines
Les bactéries lactiques sont incapables de synthétisé les vitamines qui jouent un role
irremplaçable de coenzymes dans le métabolisme cellulaire.
Streptococcus thermophillus à une exigence absolue en acide panthénique (b5) et en
riboflavine (b2) et à moindre degré en théamine (b1), en nicotinamide ou en acide nicotinique
(b3) et en biotine (b8) .la pyroxène ou ses dérives (b6) stimulent fortement sa croissance
(Desmazeaud M., 1983).
e-3-exigences en bases azotées
Les bases puriques et pyrimidiques ne sont pas vraiment essentielles au métabolisme
des bactéries lactiques (Desmazeaud M., 1983).
21
Chapitre I
e-4- exigences en cations
Boyaval et al (1988) ont montré le rôle précis des cations dans la résistance à
l'oxygène, dans les différentes réactions métaboliques et dans la nutrition des bactéries
lactiques. Amouzou et al 1985 ont montré le rôle de mg+ sur Streptococcus thermophilus. La
forme ionisée entraine une activation de la fermentation lactique par une meilleure utilisation
des sucres (Desmazeaud M., 1983).
f) Les propriétés fonctionnelles et technologiques des bactéries lactiques
Le champ d’application des bactéries lactiques est large et plusieurs de leurs propriétés
sont importantes et influentes sur la qualité finale des produits alimentaires. Il permet
d’assurer la qualité sensorielle des produits et de mieux maîtriser le processus de fermentation
(Casaburi et al., 2007; Muthukumarasamy et al., 2006).
L’utilisation des bactéries lactiques ou probiotiques pour une application industrielle
donnée est déterminée par leurs propriétés fonctionnelles et technologiques. Celles-ci
recouvrent les propriétés suivantes : Activité acidifiante : Propriétés enzymatiques : les
activités protéolytique et peptidasique. L’activité lipolytique.
f-1- Activité acidifiante
L’activité acidifiante est l’une des principales fonctions des bactéries lactiques, les
bactéries lactiques provenant des matières premières ou de l’environnement sont responsables
de la production d’acide lactique résultant de l’utilisation des hydrates de carbone. Dans la
fermentation homolactique, l’acide lactique est le produit prépondérant (plus de 95%). Il
provient de la réduction de l’acide pyruvique catalysée par la lactate déshydrogénase. Cette
activité est faible chez le genre de Leuconostoc lorsqu’il sont croitre a des base pH (Badis et
al., 2004).
f-2- Activité protéolytique
La fermentation, au cours de laquelle plusieurs transformations physiques,
biochimiques et microbiologiques se déroulent, est une étape cruciale dans le processus de
fabrication des saucisses fermentées. En général, les bactéries lactiques ont une faible
propriété protéolytique sur les protéines myofibrillaires. Des peptidases issues de ces bactéries
22
Chapitre I
lactiques hydrolysent des oligopeptides et de ce fait, produisent les substances responsables
de la flaveur et de la texture des produits fermentés (Ammor et al., 2005).
f-3- Activité lipolytique et formation de substances aromatiques
La lipolyse à été largement étudiée dans le domaine alimentaire. Elle joue un rôle
important dans la formation des substances aromatiques des produits transformés. L’addition
des lipases exogènes augmente significativement et rapidement la concentration en acide gras
libre des produits fermentés, réduisant de ce fait la durée de leur maturation mais sans en
améliorer systématiquement leur saveur (Zalacain et al., 1996).
f-4- Formation des exopolysaccharides
La plupart des microorganismes synthétisent les polysaccharides. Certains se trouvent
à l’intérieur de la cellule. D’autres sont des composants de la paroi. Un troisième groupe de
polysaccharides est excrété à l’extérieur de la cellule d’où vient le terme "exopolysaccharide"
(EPS) ou "polysaccharide exocellulaire". Deux types d’EPS, soit excrété dans le milieu
environnant, soit lié à la surface de la cellule sous forme de capsule, peuvent être produits par
certaines bactéries lactiques (Ai et al., 2008).
g) Propriétés probiotiques
Lors de la sélection des ferments probiotiques, outre les caractéristiques précédentes, il
faut prendre en compte certaines spécificités liées à leur activité probiotique. Ces spécificités
correspondent essentiellement à des propriétés de résistance lors du passage dans l'estomac,
dans le duodénum et dans l'intestin (Wildman, 2007; Remacle et Reusens, 2004). Les
probioiques possèdent d’énormes bienfaits sur la santé (Mattila-Sandholm et Saarela, 2003;
Hofman et Thonart, 2002). Beaucoup de travaux ont discuté les bienfaits des probiotiques sur
la santé (Smith et Charter, 2010; Nollet et Toldrá, 2010; Trivedi, 2009; Gibson et Williams,
2000). Selon Drouault et Corthier (2001), les principales propriétés recherchées sont les
suivantes :
-
Résistance aux acides (acides gastriques) ;
-
Résistance aux sels biliaires ;
-
Stabilité en milieu acide ;
23
Chapitre I
-
Aptitude à adhérer aux parois intestinales (adhésion in vitro aux cellules
épithéliales) ;
-
Production de substances antimicrobiennes (bactériocines) ;
-
Activité immunostimulante ;
-
Activité antioxydante.
h) Rôle des bactéries lactiques
h-1 Domaine alimentaire (sur la structure et la texture)
Dans les laits fermentés l’acidification provoque la formation d’un caillé plus au
moins ferme selon les bactéries lactiques présentes selon les produits, la texture recherchés est
ferme (yaourt ferme) ou onctueuse (yaourt brassé, kéfir) pour obtenir une croissance
déterminée L’utilisation de souches plus ou moins acidifiantes peut être combinée à celle de
souches productrices de polysaccharide (Sutro et Federighi., 1998).
h-2 Role dans la conservation
h-2-1 Production de l'acide lactique
Les bactéries lactiques ont un role important dans l’inhibition des flores non lactiques
h-2-2 Production des bactériocines
Ces peptides antimicrobiennes sont synthétisés par un très grand nombres des souches
de bactéries lactiques, il sont généralement thermorésistantes actifs uniquement sur les
bactéries à Gram positif (Sutro et Federighi ., 1998).
h-3 Role sur les caractéristiques organoleptiques
Par production en dehors de l’acide lactique d’autres produits tels que le diacétyle et
l’acétaldéhyde qui sont responsable des flaveur caracteristique (Sutro et Federighi., 1998).
24
Chapitre I
h-4- domaine de la santé
Les bactéries lactiques assurent :
-
l'amélioration de la digestibilité du lactose.
-
l'abaissement du taux de cholestérol sanguine.
-
des effets sur l'activation du système immunitaire.
- l'inactivation de composes toxiques et la protection contre certains infections intestinales
(Laurant et al., 1998).
25
Chapitre II
Matériel et méthodes
Chapitre II
Matériels et méthodes
Matériel et méthodes
Notre travail a été effectué au niveau des laboratoires de microbiologie et de biochimie
de la faculté des sciences de la nature et de la vie (Université Kasdi Merbah Ouaregla), dans
lesquels nous avons réalisé un ensemble d’analyses microbiologiques et biochimiques sur les
différentes souches de bactéries lactiques isolées à partir de fromage traditionnel (J’ben) à
base de lait de vache et de chèvre. Pour but d’étudier la qualité microbiologique de ce produit,
ainsi l'étude écologique de la flore lactique.
I- Echantillonnage
I-1 Préparation de J'ben
Au niveau du laboratoire de microbiologie, six échantillons d’un produit laitier
traditionnel (J'ben) sont préparés à partir du lait cru de vache et de chèvre collectés à partir
d'une ferme dans la région de HBA (Wilaya de Ouargla) (voir l'annexe 01). L’échantillon
(J'ben) à été conservée dans une température ambiante au laboratoire jusqu'à l'utilisation.
Figure 08: Produit laitiers traditionnel (J'ben).
I-2 Matériel utilisé
Pour la réalisation des différentes parties expérimentales, on s’est servi du matériel suivant:
26
Chapitre II
I-2-1 Le lait et le j’ben
Deux types de lait cru ont été utilisés lors de cette étude : le lait de chèvre et le lait de
vache. Ils ont été collectés au niveau des fermes d’élevage situées dans la région Ouargla. Le
lait a été destiné à la fabrication du J’ben traditionnel au laboratoire, afin d'étudier la
microflore de ce produit.
Echantillon 1 :J'ben de lait de vache additionné au sel.
Echantillon 2 : J'ben de lait de chèvre additionné au persil.
Echantillon 3 : J'ben de lait de chèvre additionné au sel.
Echantillon 4 : J'ben de lait de chèvre additionné à l'ail.
Echantillon 5 : J'ben de lait de vache additionné à l'ail.
Echantillon 6 : J'ben de lait de vache additionné au persil.
I-2-2 Les milieux de cultures
Milieu Chapman: la recherche des staphylococcus aureus.
Milieu BCPL (Bouillon Lactosé au Pourpre de Bromocrésol): la recherche des coliformes
totaux et fécaux.
Milieu PCA (Plat Count Agar): la recherche de la flore mésophile totale.
Milieu Sabouraud: la recherche des champignons.
Milieu viande foie : la recherche des bactéries sporulées.
Milieu M17: l'isolement des lactocoques.
MRS (Man, Regosa et Sharpe) gélose: l'isolement et purification des bactéries lactiques
Bouillon MRS : purification des bactéries lactiques
MRS BCP (MRS au pourpre de bromocrésol) : la réalisation de test des sucres.
Milieu MSE (Mayeux,Sandine et Elliker) : la recherche des exopolysaccharides
Milieu KMK (Kempler et Mc Kay): la recherche de citrate
27
Chapitre II
Milieu M16 BCP: la recherche de l'ADH
Milieu lait écrémé: pour la réalisation de test de Sherman
I-2-3 Les solutions utilisées
L'eau physiologique
II- Control microbiologique des échantillons
II-1 Mesure de pH
Le pH des échantillons a été déterminé en utilisant un pH-mètre numérique (WTW
INOLOB pH720) ; avant d’entreprendre les mesure ; l’électrode du pH-mètre est rincé avec
de l’eau distillée et séché avec du papier buvard .La mesure se fait par l’introduction du bout
de l’électrode dans le produit laitier jusqu’à la stabilisation de la valeur du pH qui s’affiche
sur l’écran. Avant d’entreprendre une autre mesure l’électrode doit être à nouveau nettoyée
puis rincée comme précédemment (Owusu-Kwarteng et al., 2012).
II-2 Préparation des dilutions
II-2-1 Préparation de la solution mère
01g de l’échantillon (J'ben) a été homogénéisé à l’aide du vortex avec 09 ml d’eau
physiologique Cette suspension constitue alors la dilution mère (DM) qui correspond à la
dilution 1/10 Ou 10-1 (Lebres et al., 2002).
II-2-2 Préparation des dilutions décimales
01ml de la dilution (10-1) est prélevé aseptiquement à l’aide d’une pipette stérile et
Introduit dans un tube à essai contenant 09 ml d’eau physiologique. On obtient ainsi la
dilution 10-2 et ainsi jusqu'à la dilution 10-6 (Arrêté 11 septembre 2004, JORA n° 70 du 7
novembre 2004 ; Guiraud., 2003).
28
Chapitre II
III-recherche de la flore contaminante
III-1 la recherche de Staphylococcus aureus sur milieu Chapman
Une quantité de 0,1 ml de chaque dilution a été inoculée à la surface de deux boîtes de
gélose Chapman et étalée avec un étaleur en métal. Les boîtes ont été incubées à 37° C
pendant 48 h. le résultat positif se manifeste par la présence des colonies dorés ou bien
blanche avec le changement de couleur du milieu.
III-2 la recherche des coliformes fécaux et totaux sur milieu BCPL
Le bouillon de culture utilisé était le bouillon lactosé au pourpre de bromocrésol à 2 p.
100 (BCPL). Trois dilutions successives ont été inoculées dans deux séries de trois tubes
contenant le BCPL à 2 p 100 et une cloche de durham. Les tubes ont été placés dans un
incubateur à 37° C pour les coliformes totaux et à 45,5° C pendant 48 h pour les coliformes
fécaux. La présence de coliformes totaux dans les tubes positifs se traduit par la présence d’un
trouble, le changement de couleur du milieu au jaune et la présence du gaz dans la cloche.
III-3 la recherche des bactéries sporulées Sur milieu VF
Les clostridiums sulfitoréducteurs sont dénombrés sur le milieu de culture VF Agar
en tubes pour favoriser les conditions d’anaérobiose, avec un traitement thermique 10 min à
80°C afin d’activer les spores des clostridies : elles peuvent persister sous forme latente dans
le lait, germer dès que les conditions sont favorables et sécréter des substances toxiques. Les
tubes sont incubés 48 h à 37°C. Seules les colonies noires sont comptées. (Rhiatm et al .,
2011).
III-4 la recherche des champignons Sur milieu sabouraud
Afin de détecté la présence de champignons on a effectué un ensemencement par stries
sur le milieu Sabouraud incliné.
L'incubation à 37C° pendant 24 heures.
29
Chapitre II
III-5 la recherche de la flore mésophile aérobie totale
La recherche de la flore mésophile aérobie totale est effectuée sur gélose PCA, une
prise d’essai de 100µl des dilutions décimales (de 10-4 à 10-6) à été ensemencé par étalement
avec l'étaloire.
Incuber à 30°C pendant 24 à 48 heures. (Lebres et al., 2002).
IV- L’isolement des bactéries lactiques
L’isolement des bactéries lactiques a été réalisé sur le milieu MRS et M17 solide.
L'ensemencement se fait en profondeur.
L'incubation se fait pendant 24 heures à 30 °C. (Kacem et Karam, 2006; Cheriguene et al.,
2007).
IV-1 Purification
. La purification des bactéries lactiques est réalisée alternativement sur le milieu MRS
solide et liquide afin de s’assurer de la pureté des cultures (colonie identique). (Badis et al .,
2005).
IV-2 Identification et caractérisation des isolats
IV-2-1 Test phénotypiques
IV-2-1-1 Examen Macroscopique
Cette étude est basée sur l’observation visuelle de la culture des isolats sur milieu
MRS solide et liquide ; pour caractériser la taille, la forme et la couleur des colonies ainsi
l'aspect du trouble dans le milieu liquide (Badis et al., 2005).
IV-2-1-2 Examen microscopique (Coloration de Gram)
Cette étude est pour écarter tout ce qui ne peut pas être une bactérie lactique, les isolats
ont été soumis à la coloration de Gram (voir annexe 05),
Cette étude permet de différencier les bactéries à Gram positif de celles à Gram négatif,
30
Chapitre II
les bâtonnets, les coques et le mode de regroupement (Singleton., 1999).
IV-2-1-3 Test catalase
Pendant leur respiration aérobie certaines bactéries produisent du peroxyde
d’hydrogène (H2O2) celui-ci est très toxique et certaines bactéries sont capable de le dégrader
grâce aux enzymes qu’elles synthétisent et notamment la catalase. Cette enzyme est capable
de décomposer l’eau oxygénée selon la réaction :
Catalase
2H2O2
2H2O + O2
Ce test a pour but de différencier les bactéries lactiques (catalase-) des autres bactéries
(catalase +). Une colonie est mise en suspension avec une ou deux gouttes de solution de
peroxyde d'hydrogène (10 volumes) sur une lame propre. La réaction positive se traduit par
un dégagement immédiat de bulles de gaz (O2) (Marchal et al., 1991).
Les bactéries Gram positives et catalase négatives sont présumées des bactéries
lactiques. (Belarbi Fatima., 2011).
IV-2-2 Conservation des souches
Tous les isolats suspects des bactéries lactiques (gram positif et catalase négatif) sont
conservés Deux types de conservation de nos souches sont à noter. Une de courte durée et
l’autre à longue durée.
IV-2-2-1 Conservation de courte durée
Les souches pures étaient ensemencées dans des tubes de gélose inclinée, après
l’incubation à 30°C, les tubes sont placés à +4°C et le renouvellement des souches se fait
toutes les 04 semaines.
IV-2-2-2 Conservation de longue durée
les cellules des isolats purifiés sont conservées à la présence du glycerol à raison de
30%(voir annexe 07) (Samelis et al., 1994).
31
Chapitre II
IV-2-3 Tests physiologiques
Ces tests sont important car ils permettent de distinguer les lactocoques des
entérocoques, ainsi d'étudier le rôle probiotiques des isolats.
IV-2-3-1 Croissance en différents concentration en NaCl, différents pH, différents
températures
On teste la croissance de nos isolats en présence de différente concentration de NaCl
(2% ,4%, 6,5% et 10%), différent valeur de pH4,5, 6,5 et 8 et la croissance en différentes
température4°C ;15°C ;37°C et 42oC°(Badis et al., 2005).
IV-2-3-2 Thermorésistance
Des tubes contenant 10 ml de MRS liquide sont inoculés par les souches isolées,
ensuite les tubes sont déposés dans un bain-marie à 63,5°C pendant 30 minutes, après
refroidissement brusque, elles sont incubées à 30°C±1°C pendant 48 à 72h. Un résultat positif
se traduit par un trouble (Badis et al., 2005).
IV-2-3-3 Type fermentaire
Ce test permet de s’avoir le type du métabolisme (homofermentaire ou
heterofermentaire) par le quel le substrat carboné est transformé, et la production du gaz à
partir la dégradation du glucose.
Ce test est effectuer par l’ensemencement des souches dans un milieu MRS liquide
glucosé contenant la cloche de durham est l’incubation à 300C pendant 24h à 48h. Le
développement d’une bactérie hétérofermentaire se manifeste par l’apparition de gaz dans la
cloche de durham qui est absent chez les bactéries homofermentaires. (Bourgeois et al .,
1991).
IV-2-3-4 Test de lait de Sherman
Nous avons ensemencé les isolats ayant une forme cocci dans deux séries de tubes
contenants 10ml de lait écrémé additionné à 100µl de bleu de méthylène(1%) pour la
première série, et à 100µl de bleu de méthylène (3%) pour la deuxième.
32
Chapitre II
Le bleu de méthylène tire sa couleur grâce à l'oxygène, ce test port toujours sur le
systéme respiratoire des lactocoques, car vu que se sont micro-aérophiles, ils ne vont utilisés
qu'un faible partie de l'oxygène présent dans le bleu de méthylène (3%) et de ce fait la couleur
de lait (bleu) ne virera que légèrement ver le blanc et ce contrairement entérocoque (aérobies)
qui utilisent tout l'oxygène du bleu de méthylène (Larpent et al., 1990)
IV-2-4 Test biochimique
Profile fermentaire
Ce test permet d’apprécier la capacité des souches à fermenter quelques sucres. Pour
ce faire, le milieu MRS BCP sans sucre additionnés des sucres à étudier a été ensemencé par
les cultures bactériennes. Une couche suffisante de l’huile de paraffine stérile a été versée à la
surface du milieu pour favoriser l’anaérobiose. Après 24h d’incubation, le développement de
la culture et le virage de l’indicateur coloré traduit la fermentation du sucre testé.
On utilise la plaque d'Eliza pour la réalisation de test de sucre par l'addition dans
chaque puits 100 μl milieu MRS BCP l et 100μl de suspension bactérien et les différents
sucres (sources de carbone) 1-arabinose- 2- maltose- 3- rhamnose 4-sorbitole 5-Lactose 6glucose 7-sucrose 8- xylose 9-saccharose 10-tréhalose (voir l'annexe 06)
La lecture des résultats se fait après 24 et 48 heures d’incubation
Après incubation pendant 24 à 48 heurs le développement de la culture et le virage au
jaune de l’indicateur coloré dû à l’acidification du milieu traduit la fermentation du sucre.
(Badis et al., 2005)
IV-2-5 Testes technologiques
IV-2-5-1 Recherche de l’Arginine déhydrolase (ADH)
La recherche de l’arginine déhydrolase (ADH) est étudiée sur le milieu M16 BCP
(Thomas, 1973). Ce milieu contient du lactose et de l’arginine) et un indicateur de pH le
pourpre de bromocrésol Les bactéries lactiques utilise le lactose en acidifiant le milieu, les
colonies donnant ainsi une coloration jaunâtre. D’autres bactéries lactiques sont capables
33
Chapitre II
d’utiliser l’arginine et ré-alcalinisent le milieu, leurs colonies apparaissent blanchâtres. La
couleur de l’indicateur de pH demeure inchangée.
On à réaliser des ensemencements sur milieu M16BCP par des préculture de 18h et
incuber à 300C pendant 24h à48h (Guiraud., 2003).
IV-2-5-2 La production des exo-polysaccharides
La production des exo-polysaccharides à partir du saccharose est mise en évidence sur
milieu solide MSE (Mayeux et al., 1962). Les souches productrices des exo-polysaccharides
sont caractérisées par la formation de colonies larges, visqueuses et gluantes
On à réaliser des ensemencements sur milieu MSE par des pré-cultures de 18h et
incuber à 300C pendant 24h à48h (Guiraud., 2003).
IV-2-5-3 Test de citrate
L’utilisation du citrate est étudiée sur milieu Kempler et Mc Kay (1980) (Kihal et al ,
1996 ; Moulay, 2006). Ce milieu contient une solution de ferricyanide de potassium et une
solution de citrate ferrique. La présence du citrate dans le milieu inhibe la réaction entre l’ion
ferrique et le potassium ferricyanide. Les colonies qui fermentent le citrate lancent la réaction
entre ces ions il en résulte la formation de colonies bleues ou ayant un centre bleu (après 18 h72 h d’incubation). Les colonies incapables de fermenter le citrate restent blanches. (Marchal
et al., 1991).
34
Chapitre III
Résultats et discussions
Résultats et discussion
I- Control microbiologique des échantillons
Mesure de pH des échantillons de J'ben
Le J'ben est un produit laitier préparé par des méthodes traditionnelles, utilisant le lait
de vache, le lait de chèvre ou également le lait de brebis cru. Les résultats de mesure du pH
montrent que le J'ben possède un pH acide.
Donc le pH des échantillons de J'ben étudies varies de 4.5 à 5.4.
Certaines normes françaises imposent généralement un pH inférieur à 4,5 ou 4,6 pour
le lait fermenté (Luquet et Corrieu., 1998). La différentiation des valeurs du pH de J'ben par
rapport aux autres produits peuvent être dues à la méthode de préparation, au type de lait, à la
date de préparation ou peuvent être liées au type d’alimentation donnée aux animaux
(Ouadghiri., 2009) L’activité acidifiante est l’une des principales fonctions des bactéries
lactiques, les bactéries lactiques provenant des matières premières ou de l’environnement sont
responsables de la production d’acide lactique résultant de l’utilisation des hydrates de
carbone.
II-recherche de la flore d’altération (contaminante)
On a effectué un contrôle de qualité microbiologique aux échantillons à étudier pour
déterminer leur qualité hygiénique, ainsi l'influence des additifs (l'ail, persil et le NaCl) contre
les bactéries contaminante.
Les résultats sont résumés dans le tableau 06.
Tableau 05: le dénombrement de la flore aérobie mésophile totale.
Echantillons
Nombre de colonies (UFC /g)
E(1)
Indénombrable
E(2)
Indénombrable
E(3 )
288×105
E(4)
140×105
E(5)
299×104
E(6)
172×106
35
Chapitre III
Tableau 06: les résultats de contrôle microbiologique de J'ben.
Bactérie
Milieux
Type
utilisés
d’ensemencement
Incubation
Résultats après
incubation
T (ºC)
Durée
(h)
PCA
FAMT
En surface (100u.l)
30°C
24h
Présence des colonies
de couleur blanche
différente taille
Coliformes
BCPL
100u.l
37°C
24h
Présence de trouble
virage de couleur en
totaux
jaune présence de gaz
dans les cloches
Coliformes
BCPL
100u.l
42°C
En surface (100 ul)
37°C
24h
Absence de croissance
fécaux
Staphylococcus Chapman
24h/48h
aureus
Bactéries
Viande foie
Stries
37°C
24h
Sabouraud
Stries
37°C
24h
Présence de colonie
sporulantes
Champignon
Lait d'un animal parfaitement sain, trait de façon aseptique, est normalement dépourvu
des microorganismes. A la sortie de la mamelle, le nombre des germes est très faible
généralement inférieur à 500/millilitre. Ils proviennent de l'extérieur et pénètrent dans la
mamelle par le canal du trayon.
Dans le cas d'infections de la mamelle, le nombre des germes augmente Mais ils sont
en majorité constitués des bactéries pathogènes notamment Staphylocoques et streptocoques ;
ainsi, hormis les maladies de la mamelle, la contamination se fait au cours des diverses
manipulations, dont il est l'objet à partir de la traite.
Le niveau de contamination est étroitement dépendant des conditions d'hygiène dans
lesquelles sont effectuées ces manipulations, à savoir l'état de propreté de l’animal et
particulièrement celui des mamelles, du milieu environnant (étable, local de traite), du trayon,
du matériel de récolte du lait (bidons, cuves, tanks). (Isra, D., 1985).
36
Chapitre III
Selon Guiraud 1998 le fromage frais ou J’ben doit rependre aux critères microbiologique
suivant ,Fromages frais (fromages non affinés) à base de lait cru ou thermisé Les critères
microbiologiques sont les suivants (arrête du 30 mars 1994) :
-
Escherichia coli <104/g (plan à 3classes :n=5 ;c=2 ; m=104 ;M=105).
-
Staphylococcus aureus <103 /g (plan à 3classes : n=5 ;c=2 ;m=104 ;M=105 .en cas de
dépassement de M, il faut rechercher l’entérotoxine ).
-
Absence de Salmonella et de Listeria monocytogenes dans 25g (plan à 2 clases : n=5 ;
c=0) .
-
Absence d’autres germes pathogènes et de toxines, On peut y ajouter éventuellement.
-
Nombre de germes indologénes et putrides <10 /g.
Figure 09: Résultat de la recherche de staphylococcus aureus sur milieu Chapman.
E1
E2
E3
E4
E5
T
Figure 10: résultat de la recherche des coliformes totaux sur milieux BCPL.
37
Chapitre III
Figure 11:Résultat de La recherche des coliformes fécaux sur milieux BCPL.
E1
E2
E3
Figure 12: Résultat de La recherche des bactéries sporulées sur milieu viande foie.
E
1
E
1
E2
E
2
E
3
E3
E
4
E
4
E
5
E
5
Figure 13: Résultat de La recherche des champignons sur milieu sabauroud.
38
Chapitre III
Figure 14: Résultat de la recherche de la flore mésophile totale aérobies sur milieu PCA
Selon FAO 2005, les résultats obtenu indique que les échantillons étudier sont altérés
par les coliformes totaux et les champignons, et absence d'autres flores contaminant
(coliformes fécaux, St. aureus et bactéries sporulées) qui peut être néfaste a cause de leur role
d'altération qui peut détruire la qualité organoleptique et hygiénique et même peut être
pathogène.
III-Isolement des bactéries lactiques
Pour l’isolement de la flore lactique, nous avons utilisé deux milieux : MRS pour
l’isolement des bactéries lactiques et M17 pour l’isolement des bactéries lactiques forme
cocci. À la température d’incubation de 30°C.
III-1 Caractérisation morphologique
III-1-1 Résultat des tests macroscopiques
L'observation macroscopique nous a permis de décrire les colonies obtenues
sur milieu solide (de petit taille, couleur blanchâtre et de forme rond ou l ent i cul ai re ).
Le repiquage successif sur milieu MRS solide a révélé des colonies rondes avec une
couleur blanchâtre et d’un pourtour régulier. En milieu liquide on a remarqué présence du
trouble fumeux surmonté d’une zone claire. Il s’accentue au fur et à mesure de la
purification des souches, ceci traduit le caractère micro-aérophile des bactéries lactiques.
39
Chapitre III
Les bactéries lactique sur milieu MRS
Les bactéries lactique sur milieu M17
Zone claire
Trouble au de tube
de forme fumé
Aspect des bactéries lactique dans MRS liquide
Figure 15: l'aspect macroscopique des bactéries lactiques sur milieu MRS et M17 solide et
MRS liquide
II-1-2 Etude microscopique
La caractérisation microscopique est basée sur la coloration de Gram. Nous avons
gardé que les bactéries à Gram positives leur mode d’association les résultats sont résumés
dans le (tableau 07)
1cm
Figure 16: Observations microscopiques des bactéries lactiques avec un grossissement (G :
10x100)
40
Chapitre III
III-1-3 Test de catalase
La recherche de la catalase se fait par la mise en contact des colonies avec
quelques gouttes d’eau oxygénée à 10V. Le dégagement gazeux traduit l’activité
positive de cette enzyme. Lorsqu’on a un milieu liquide, on ajoute 1ml d’H2O2 à 3% à une
culture de 18 à 24h. Nous avons éliminé toutes les souches catalase positives (Marchal et al.,
2001).
Les souches étudiées sont catalase négative car on n’a pas obtenu des bulles d’air
après le dépôt de l’eau oxygénée sur la colonie cible, qui est conforme aux résultats trouvés
par Carr et al., (2002), ce qui nous orient à déduire que les souches isolées sont des bactéries
lactiques.
III-2 Caractérisation physiologique et biochimique
L’analyse de ces résultats a montré que tous les isolats sont avérés à gram positif et
catalase négative ce qui est caractéristique des bactéries lactiques. (Voir le tableau 07)
41
Chapitre III
Tableau 07 : résultats physiologiques et technologiques des isolats
Gram
Catalase
Tests
Forme des cellules
Et
Regroupement
Type
fermentaire
Test physiologique et lait de Sherman
Lait de
Sherman
PH
Na cl
Test biochimiques
Températures
42°C
62°C
+
+
+
-
+
+
1%
3%
4
9
2%
4%
6%
4°C
15°C
37°C
ADH
Production
deEPS
+
+
+
/
+
+
+
+
+
+
/
+
+
/
/
/
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-
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-
+ +
+
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-
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+
-
-
-
-
+
-
Souches
Les caractéristiques physiologiques et technologiques
de 20 souches E1 MRS
S1
- Cocci; Chaînette
- Cocci;Chaînette
- Cocci ; isolé
- Cocci ; isolé
- Cocci ; isolé
- Cocci ; isolé
- Cocci; Chaînettes
- Cocci; Chaînettes
- Cocci ; isolé
- Cocci;Chaînettes
- Cocci- isolé
- cocci
- Cocci ; isolé
- Cocci ; isolé
- Cocci ; isolé
- cocci
- Cocci- diplocoque
- Cocci- diplocoque
- Cocci ,isolé
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
S2
S3
S4
S7
S8
S9
S10
S13
S14
S16
S17
S18
S19
S21
S22
S23
S24
S25
Les caractéristiques
physiologiques et
technologiques des
souches suite (E2 ;
MRS)
S34
+
S35
Homoferment-aire
Homoferment-aire
Homoferment-aire
Homoferment-aire
Homoferment-aire
Hétérofermetaires
Homofermentaire
Homofermentaire
Homofermentaire
Homofermentaire
Homoferment-aire
Homoferment-aire
Homoferment-aire
Homoferment-aire
Homoferment-aire
Homoferment-aire
Homoferment-aire
Homoferment-aire
Hétérofermentaire
-
Cocci ;
Hétérofermentaire
-
Cocci ;Chaînetes
Homoferm-entaire
Cocci ; isolé
Hétérofermentaire
S46
+
+
+
Homoferm-entaire
S48
+
-
Cocci isolé ;
diplocoque
Cocci ; isolé
+
+
+
Homoferm-entaire
+
S39
Dégradation
de
citrate
-
42
Chapitre III
S50
Les caractéristiques physiologiques et
technologiques des souches suite (E2 ; M17)
S26
+
-
Les caractéristiques physiologiques et technologiques des souches suite
(E3 ; M17 ; MRS)
Les
cara
ctéri
stiq
ues
phy
siol
ogiq
ues
S53
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
S54
+
-
S55
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
-
+
+
+
+
+
-
S27
S28
S29
S30
S31
S32
S33
S34
S35
S36
S50
S56
S57
S59
S60
S61
S62
S63
S67
S68
S73
S74
S59 M17
S60M17
S74M17
S78
S79
Cocci ; isolé
Hétérofermentaire
Cocci ; isolé
Hétérofermentaire
Cocci ; isolé
Hétérofermentaire
Cocci ; isolé
Hétérofermentaire
Cocci ; isolé
Hétérofermentaire
Cocci ; isolé
Hétérofermentaire
Cocci ; isolé
Hétérofermentaire
Cocci ; isolé
Homofermentaire
Cocci ; isolé
Homofermentaire
Cocci ; isolé
Hétérofermentaire
Cocci ; isolé
Homofermentaire
Cocci ; isolé
Homofermentaire
Cocci ; isolé
Hétérofermentaire
Cocci
;isolé ;chaînette
cocci ;
Chaînette
Cocci ;Chaînette
Homofermentaire
+
+
/
+
+
/
+
+
+
+
+
+
+
Homofermentaire
+
+ + +
+
+
+
-
+
+
+
+
+
-
-
Homofermentaire
Cocci ;Chaînette
Homofermentaire
Couque- isolé
Homofermentaire
Cocci ; isolé
Homofermentaire
Cocci ; isolé ;chainette
Homofermentaire
Cocci ;Chaînette
Homofermentaire
Cocci ;Chaînette
Homofermentaire
Cocci ;Chaînette
Homofermentaire
diplocoque ;isolé
Homofermentaire
Cocci ;
Chaînette
grappe
Homofermentaire
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
Cocci ;isolé ;grappe
Homofermentaire
+
+
- + +
- + +
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
-
diplocoque ; Chaînette
Homofermentaire
Cocci ;Chaînette
Homofermentaire
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
Cocci ;Chaînette
Homofermentaire
Homofermentaire
Cocci ; diplocoque
Homofermentaire
Cocci ; Chaînette
Homofermentaire
+
/
+
+
/
+
+
-
+
+
/
+
/
+
+
+
+
+
+
+
/
+
/
+
+
+
+
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+
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+
+
/
+
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+
+
+
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+
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-
-
/
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/
+
+
+
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+
+
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-
+
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/
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+
+
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+
+
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+
/
-
+
/
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
43
Chapitre III
S82
+
+
+
+
-
Cocci - isolé
Homofermentaire
Cocci - isolé
Homofermentaire
grappe
Homofermentaire
-
Hétérofermentaire
+
+
+
-
Cocci ; diplocoque ;
chaînette
Grappe /isolé
-
Cocci ;diplocoque
Homoferm-entaire
-
Cocci; diplocoque
+
+
+
-
grappe
Hétérofermentaire
Homofermentaire
Cocci ; Chaînette
Homofermentaire
Cocci - isolé
Homofermentaire
-
Couque- isolé
Homofermentaire
S76
+
+
S77
+
-
S78
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
-
S83
S85
S86
S87
S88
S89
S94
S96
S99
S100
Les caractéristiques physiologiques et
technologiques des souches suite (E4 ; MRS)
S79
S80
S81
S84
S85
S87
S88
S89
Les caractéristiques
physiologiques et technologiques
des souches suite (E5;M17)
S113
S115
S116
S119
S120
S122
S124
S125
Hétérofermentaire
+
+
+
+ + +
+ - +
- + +
+ - +
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
-
-
+
+
- - - + +
+ + +
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
/
+
+
+
+
/
-
+
+
+
+
+
+
+
-
+
-
/ /
- +
- +
+
+
+
+
+
+
+
+
+
/
+
/
+
/
+
+
-
/
+
+
+
+
+
+
-
Cocci;
Chaînette
Coqcci ;
Chaînette
Cocci
Homofermentaire
+
+
- - +
- + +
+
-
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
-
Homofermentaire
+
+
-
-
+
-
-
+
+
+
-
-
+
+
-
Homofermentaire
Coqcci ;
Chaînette
Cocci
Homofermentaire
+
+
+
+
-
-
+
+
+
-
-
+
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
-
Cocci
Homofermentaire
+
+
+
+
- - + / /
- + +
- + +
+ - -
+
/
+
+
+
+
/
+
+
+
/
+
+
-
+
/
+
-
+
/
+
/
/
+
/
+
+
+
+
/
+
+
+
/
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
/
+
+
+
/
/
+
+
+
/
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
/
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
/
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
/
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
Homofermentaire
Cocci
Homofermentaire
-
Cocci ;grappe
Homofermentaire
-
Coqcci ;
Chaînette
diplocoque
Homofermentaire
Cocci ;isolé
Homofermentaire
Cocci ;Chaînette
Hétérofermentaire
Cocci ;isolé
Homofermentaire
Homofermentaire
Cocci ;isolé
Homofermentaire
Cocci ;
Chaînette 2à3
Cocci ;isolé
Hétérofermentaire
Cocci
Hétérofermentaire
Cocci ;isolé
Homofermentaire
Cocci ;isolé
Homofermentaire
Hétérofermentaire
44
Chapitre III
S102
Les caractéristiques physiologiques et technologiques
des souches suite (E5;E6.MRS)
S129
+
+
+
+
+
-
S132
+
-
S133
+
-
S134
+
-
S135
+
-
S145
+
+
+
-
S115
S116
S128
S148
S149
Cocci ;Chaînette
HétérofErmentaire
Cocci ;Chaînette
Hétérofermentaire
Cocci ;isolé
Hétérofermentaire
Cocci ;Chaînette +7
Homofermentaire
Cocci ;
Chaînette +4
Cocci ;
Chaînette 2à3
Cocci ;
Chaînette 5à7
Cocci ;
Chaînette 3à5
Cocci ;
Chaînette >5
Cocci ;diploco-que
Hétérofermentaire
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
/
+
+
+
+
/
+
+
+
/
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
-
+
+
+
-
+
+
+
+
-
Hétérofermentaire
+
+ + +
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
-
Homofermentaire
+
+ + +
+
+
-
-
+
+
+
-
-
+
-
Homofermentaire
+
+ + +
+
+
-
-
+
+
+
-
-
+
-
Homofermentaire
+
+
- +
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
-
Hétérofermentaire
Cocci ;diploco-que
Hétérofermentaire
Cocci ;
Chaînette
Homofermentaire
+
+
+
+
+
+
- +
- +
- +
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
-
+
+
+
+
+
+
-
+
-
-
-
-
(+): résultat positif
(-): résultat négatif
(/): non déterminer
45
Chapitre III
III-2-1 Test physiologiques
III-2-1-1 Croissance en différents concentration en NaCl en différents pH et
différents températures
Ces
tests sont réalisé dans le but de différencier les lactocoques des
entérocoques ainsi d'étudier le rôle probiotiques des isolats, Il nécessite l’emploi de quatre
milieux MRS liquide : l’un contenant respectivement (2% ,4%, 6,5% et 10%) de Na-Cl et
différent valeur de pH4,5, 6,5 et 8 et autres séries de MRS avec incubation en
4°C ;15°C ;37°C et 42oC°; dans lesquels on a ensemencé les souches à tester. Après
culture,(Roiussat et al.,2006) (tableau 07).
III-2-1-2Thermorisistance
La plus part des souches ne sont pas thermorésistantes, où nous observons que il n'ya
pas de croissance sur le bouillon MRS après un traitement thermique pendant 30 minutes à
62°C. (Badis et al., 2005 )
Figure 17: Résultat des tests physiologique (déférents pH)
III-2-1-3Type fermentaire
Dans des tubes à essais, menus de cloches de Durham et contenant le milieu MRS
pH 6.2, on a ensemencé les souches à tester, pour différencier entre les souches
homolactiques et hétérolactiques. Les souches hétérofermentaires vont produire, en plus de
l’acide lactique, l’acide acétique et le CO2. La production de gaz se manifeste par le
flottement de la cloche qui est vider du milieu (Kheddid et al., 2009).
46
Chapitre III
Absence du gaz
Présence du gaz
Figure 18: Type fermentaire sur milieu MRS liquide glucosé contenant la cloche de durham.
III-2-1-4 Test de lait de Sherman (concernant les bactéries de forme cocci et
homolactiques)
Nous avons ensemencé les souches isolées dans deux séries de tubes : la première
avec un pourcentage de 0 . 1% de bleu de méthylène et l’autre avec 0 . 3% de bleu de
méthylène. Le principe de ce test est basé sur le mode respiratoire des souches
ensemencées, si elles sont aérobies (cas des entérocoques) elles vont tirés leurs oxygène
depuis le bleu de méthylène présent dans le lait, donc ce dernier va perdre sa couleur,
si c’est le cas contraire, cas des lactocoques qui sont microaérophiles, elles vont
utiliser une petite quantité d’oxygène qui ne peut pas changer la couleur du lait donc il
reste bleu (Larpent et al., 1990).
1% de bleu de méthylène
S
1
S
2
S
3
S
4
3 % de bleu de méthylène
S
5
S
1
S
2
S
3
S
4
S
5
T
1
1
1
Figure 19: Le test de lait de Sherman
Bleu: négative
Blanc: positive
47
Chapitre III
III-2-1-5 Profile fermentaire
L'identification de l'espèce bactérienne des souches isolées a été réalisée par l'étude du
profil fermentaire des sucres, réside essentiellement dans leur capacité à fermenter les sucres
en acide lactique et autres acides organiques. L’analyse des profils fermentaires révèle une
grande diversité métabolique des carbohydrates chez les isolats retenu
sont: 1-arabinose- 2- maltose-
Les sucres utilisés
3- rhamnose 4-sorbitole 5-Lactose 6-glucose 7-sucrose 8-
xylose 9-saccharose 10-tréhalose (Badis et al., 2005) Les résultats obtenus sont résumés dans
le (tableau 08).
T
Lactococcus lactis subsp crémoris
Lactococcus lactis subsp lactiss
S
U
U
R
X
M
G
L
S
A
S
Weissella sp
Entérococcus durans
Figure 20: Résultats de profil fermentaire :
Couleur jaune dégradation du sucre.
Couleur bleue résultat négatif.
48
Chapitre III
Tableau 08 : résultats de profil fermentaire des isolats
rhamnose
xylose
maltose
glucose
lactose
saccharose
arabinose
Sorbitole
le profil fermentaire de 6
souches (E2 MRS) (suit)
Sucrose
le profil fermentaire de 19 souches (E1)
le
profil
ferme
ntaire
de 12
souch
Tréhalose
Les souches
Souche 1
_
_
+
_
_
_
_
+
+
_
Lactococcus lactis
Souche 2
+
+
+
_
+
_
_
_
_
+
Lactococcus lactis
Souche 3
_
_
_
_
+
_
_
_
_
+
Lactococcus lactis subsp lactis
Souche 4
+
+
_
+
+
_
_
_
+
+
Souche 7
+
+
+
+
_
_
_
_
+
+
Lactococcus
lactis
subsp
hordiniae
Souche 8
+
+
+
_
_
+
_
_
_
+
Leuconostoc mesonteroide
Souche 9
+
+
+
+
_
_
_
_
+
+
Souche 10
+
+
_
+
_
_
_
_
+
+
Souche 13
_
+
_
+/-
+/-
_
_
_
+
_
Lactococcus crémoris
Souche 14
+
+
+/-
+/-
+
+
+
+
+
_
Lactococcus raffinolactis
Souche 16
+
+
+/-
+/-
+
+
+
+
+
+
Souche 17
+
+
_
_
+
+
+
+
+
+
Souche 18
_
+
_
_
+
+
+
+
+
+
Souche 19
_
+
_
_
+
+
+
+
+
+
Souche 21
+
+
_
_
+
+
+
+
+
_
Lactococcus raffinolactis
Souche 22
_
+
_
_
+
+
+
+
+
_
souche 23
_
_
+
_
+
+
+
+
_
_
Souche 24
+
+
_
_
_
_
+
_
_
_
Souche 25
+
_
_
+
_
+
+
_
+
+
Leuconostoc sp
Souche 34
+
+
_
_
+
+
_
+
_
+
Pediococcus sp
Souche 35
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
Pediococcus pentosaceus
Souche 39
_
_
_
_
+
+
_
+
_
_
Souche 46
_
_
+
_
_
_
+
+
_
_
Entérococcus feacalis
Souche 48
_
_
_
+
_
_
_
_
+/-
+/-
Souche 50
_
+
_
+
_
+
+
+
_
_
Carnobactéruim piscicola
Souche 26
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
Souche27
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
Weissella halotolerans
Souches identifié
49
Chapitre III
_
_
_
+
_
_
_
+
_
_
Entérococcus
Souche 29
+
+
_
+
_
_
+
_
_
+
Souche 30
_
+
_
+
_
_
+
_
+
+
Weissella sp
Souche 31
_
_
_
_
+
+
+
_
_
_
Souche 32
+
_
_
_
_
_
_
_
_
_
Leuconostoc
mesonteroide
subsp crémoris
Souche 33
+
_
_
_
_
_
_
_
+
_
Souche 34
_
_
_
_
+
+
+
_
+
_
Weissella sp
Souche 35
_
_
_
_
_
_
_
+
_
_
Entérococcus
Souche 36
_
_
_
+
_
_
+
_
_
+
Souche 50
+
+
_
+
_
+
+
_
_
_
Carnobactéruim mobile
Souche 53
+
+
_
+
+
_
_
+
+
+
Souche 54
+
_
+
_
_
+
+
+
+
+
Lactococcus
crémoris
entérococcus
Souche 55
+
+
+
_
_
+
+
+
+
+
Souche 56
+
+
_
_
_
+
+
_
_
_
Lactococcus diacelilactis
Souche 57
_
_
+
_
+
+
+
+
_
_
Souche 59
_
+
+
+
+
+
+
+
_
_
Souche 60
+
_
+
+
+
_
+
_
_
_
Souche 61
+
+
+
+
+
+
_
+
+
+
Lactococcus
lactis
subsp
crémoris
Lactococcus
lactis
subsp
crémoris
Lactococcus
lactis
subsp
crémoris
Lactococcus diacelilactis
Souche 62
_
_
+
+
_
_
+
+
_
_
Souche 63
_
_
_
_
_
_
_
_
_
+
Pediococcus acidilactici
Souche 67
+
+
+/-
+
+
_
_
_
_
_
Souche 68
+
_
+/-
+
+
+
_
_
_
+
Streptococcus sp
Souche 73
+
_
+/-
+
+
_
+
+
+
_
Souche 74
+
_
+/-
_
+
_
_
+
+
+
le profil
fermentaire
de 03
souches (E3
M17) (suit)
Souche 59
_
_
+/-
+
+
+
_
+
+
+
Pediococcus acidilactici
Souche 60
+
+
+/-
+
+
+
_
+
+
+
Souche 74
+
_
_
+
_
_
_
_
_
+
Lactococcus sp
le profil
fermentaire
de 13
souches (E4
M17)
Souche 78
/
_
_
_
_
_
le profil fermentaire de 14 souches (E3 MRS) (suit)
Souche 28
+
_
_
_
lactis
Lactococcus diacetilactis
Souche 79
/
_
_
_
_
_
_
_
_
_
Lactococcus lactis
Souche 82
/
+
-
+
_
_
_
_
_
_
Souche 83
/
+
+
_
_
+
_
_
_
_
Leuconostoc lactis
50
subsp
Chapitre III
Souche 85
/
+
-
-
-
+
-
-
-
+
Souche 86
/
+
-
-
+
+
+
-
+
+
Leuconostoc crémoris
Souche 87
+
-
-
+
+
-
+
-
-
+
Leuconostoc sp
-
+
-
+
+
-
-
+
+
_
Lactobacillus brevis
Souche 94
_
_
+
+
+
_
+
+
+
+
Souche 96
_
_
+
_
_
_
+
+
+
_
Lactococcus
lactis
subsp
crémoris
_
_
_
+
+
_
+
_
+
_
_
+
_
_
_
_
+
+
_
_
Souche 89
Souche 99
Souche 100
_
_
+
_
_
_
+
_
_
_
Lactococcus fermentum
Souche 77
+
_
+
_
+
_
+
_
+
_
Souche 78
+
_
_
+
+
_
_
_
_
_
Souche 79
+
+
+
_
_
_
_
_
+
+
Lactococcus lactis
Souche 80
_
+
_
_
_
_
+
+
_
+
Lactococcus lactis
Souche 81
_
_
+
_
+
_
_
+
+
_
Lactococcus lactis
Souche 84
+
+
_
+
+
_
_
+
+
+
Lactococcus lactis
Souche85
+
_
+
+
+
_
_
+
_
+
Lactococcus lactis
Souche 87
_
+
_
+
_
_
+
+
+
_
Lactobacillus fermentatum
Souche 89
+
+
_
_
+
_
_
_
+
+
Lactococcus lactis
le profil fermentaire de 07 souches (E5
M17) (suit)
Souche 113
_
_
_
+
+
+
_
+
_
_
Souche 115
+
+
_
_
_
+
+
+
_
_
Souche 119
_
+
_
+
+
_
_
+
_
+
Carnobactéruim sp
Souche 120
_
+
_
+
+
+
_
_
_
_
Souche 122
_
+
+
_
+
_
_
_
_
_
Souche 124
_
+
+
_
+
_
+
+
_
_
Carnobactéruim sp
Souche 125
_
+
+
+
+
_
_
+
+
+
Weissella sp
le profil
fermentaire
de 03
souches (E5
MRS)
Souche 102
_
+
_
+
_
_
+
_
_
_
Souche 115
_
+
+
+
+
_
+
_
_
_
Entérococcus faecuim
Souche 116
_
+
_
+
+
_
+
_
_
_
Souche 126
+
_
+
_
_
+
+
_
+
+
Souche 127
_
_
_
_
_
+
_
+
_
_
Lactococcus lactis subsp
crémoris
le profil fermentaire de 10 souches (E4 MRS)
Souche 76
le profil
fermenta
ire de 12
souches
(E6
MRS)
51
Chapitre III
Souche 128
_
+
_
_
_
_
_
_
_
_
Souche 129
_
+
_
+
_
_
+
_
+
_
Souche 132
_
+
_
_
+
_
_
_
_
_
Entérococcus faecuim
Souche 133
_
_
_
_
_
_
_
+
_
_
Souche 134
+
_
_
_
+
+
_
_
_
_
Souche 135
_
_
+
+
+
+
_
_
_
+
Souche 145
_
_
_
_
+
+
+
+
_
+
Lactococcus
lactis
crémoris
Lactococcus
lactis
crémoris
Lactococcus
lactis
crémoris
Leuconostoc lactis
Souche 146
_
_
_
_
_
_
+
+
_
+
Souche 148
_
_
+
+
_
_
_
+
_
+
Souche 149
_
_
_
_
_
+
_
_
+
+
(+): résultat positif
(-): résultat négatif
(/): non déterminer
III-3 Tests téchnologiques
III-3-1 Recherche de l’Arginine dihydrolase (ADH)
La production de l’acide lactique acidifie le milieu de culture (M16 BCP), qui
contient un indicateur de pH, et la couleur de ce dernier va virer vers le jaune. Les
bactéries possédant l’ADH vont realcalinisé le milieu et sa couleur reviendra mauve, les
souches qui ne possèdent pas cette enzyme leur milieu va rester jaune. Les souches testées
sont ensemencées par un multipoint, après incubation à 30°C, (Kheddid et al, 2006) les
résultats sont résumés dans le (tableau 07)
Figure 21: Résultat du test d’hydrolyse de l’arginine
52
subsp
subsp
subsp
Chapitre III
III-3-2 La production des exopolysaccharides
La production des exopolysaccharides a été détectée sur milieu MSE dont les souches
productrices de ce polysaccharide sont caractérisées par la formation de colonies gluantes La
production de exopolysaccharides sur milieu saccharosé MSE est un critère important pour
différencier entre les éspeces de bacteries lactiques(Kheddid et al, 2006). les résultats sont
résumé dans le (tableau 07) qui montre que touts les isolats incapable de produire les
exopolysaccharide à partir de dégradation de saccharose.
Figure 22:Résultat de production des exopolysaccharides sur milieu MSE
III-3-3 Test de citrate
Le milieu KMK différencié entre les bactéries qui utilisent le citrate pour donner des
produits aromatiques et les bactéries qui n’utilisent pas le citrate. Dans le premier cas les
résultats se manifestent par des colonies de couleur bleus contrairement les résultats négatif
donnent des colonies de couleur blanche (figure 22).
Sur milieu KMK (1980) qui est utilisé pour savoir le pouvoir des bactéries de dégrader le
citrate, ce dernier qui se trouve en faible concentration dans le lait mais il est constitue
néanmoins une substance clé dans l’élaboration des produits laitiers fermentés (François,
1986 ; Sanchez et al, 2005). Le métabolisme du citrate génère des aromes notamment
diacétyle. Le milieu utilisé contient du citrate de fer et du ferrocyanure de potassium. Les
souches capables de fermenter le citrate permettant la réaction entre l’ion ferrique et le
potassium ferricyanide de cette façon résulte la formation des colonies bleues (Marchal et al.,
2001) (résultats dans le tableau 07).
53
Chapitre III
Figure 23: Résultat du dégradation de citrate sur milieu KMK
Colonie de couleur blanche : résultat négatif
Colonie de couleur bleu : résultat positif
III-3-4 La diversité des bactéries lactiques étudiées
Les résultats de la répartition des bactéries lactiques isolées à partir des échantillons et
identifiées phénotypiquement sont montrés dans les secteurs si dessue.
Figure 24: Le différent genre lactiques présent dans le J'ben de lait de chèvre
Figure25 : Les principaux
genres lactiques présent
dans le J'ben avec persil a
base de lait de chèvre(E2).
genres lactiques présent dans
le J'ben salé a base de lait de
vache (E3).
genres lactiques présent dans le
J'ben avec l’ail a base de lait
de chèvre(E4).
54
Chapitre III
Figure 28: Différents genre lactiques présent dans le J'ben de lait de vache
Figure 31: Les principaux
genres lactiques présent
dans le J'ben salé a base de
lait de vache(E1).
genres lactiques présent dans
le J'ben avec l’ail a base de
lait de vache(E5).
genres lactiques présent dans le
J'ben avec persil a base de lait
de vache (E6).
L’identification des souches au niveau de l’espace a été établie par l’étude du profile
fermentaire à l’aide des galeries biochimiques classiques. Les bactéries lactiques isolées ont
été clairement dominées par le genre Lactococcus, qui ont été divisé en trois groupes, le
premier étaient composés des isolats qui ne pouvaient pas se développer dans le boillon
contenant 4 % de NaCl et n’ont pas été capable d’hydrolyser l’arginine appartiennent à
l’éspéce Lactococcus lactis subsp lactis. Les isolats du deuxième groupe sont arginine positif
elles poussent en présence de 4% de NaCl appartiennent à l'éspéce Lactococcus lactis subsp
diacetyllactis, et le troisième groupe arginine positif ne pouvaient pas se développer dans le
bouillon contenant 4% de NaCl qui appartiennent à l’éspece Lactococcus lactis subsp
cremoris.
Le rôle des Lctococcus sp dans les produits laitiers est sa participation à l’acidification, par
conséquent elle est probablement l’espèce de bactéries lactique la plus isolée à partir des
produits laitiers. (Cogan et al., 1997)
Les bactéries lactiques hétérofermentaires avec formes ovoïdes qui sont souvent
disposées en longues chaines et qui sont incapable à hydrolyser l’arginine appartiennent au
55
Chapitre III
genre Leuconostoc, les espèces de ce genre sont souvent détectées dans de nombreuses
variétés de fromages et produits laitiers fermentés (Samolada et al., 1998 ; Beukes etal.,
2001 ; Ostlie et al., Randazzo et al., 2006) bien qu’elles ont une faible activité acidifiantes,
elles contribuent à la formation de l’arome des produits laitiers en produisant de diacétyle.
L’acétate et l’éthanol ( Hemme et Foucaud-Scheunemann, 2004).
On a remarquer la présence du genre Lactobacillus, Weissilla, Pedicoccus,
Enterococcus et Carnobacterium.
Les lactobacilles ont un role tres important dans l'industrie agroalimentaire, elles ont
utilisées dans la fabrication des produits laitiers fermentés tel que le yaourt, ainsi elles ont un
role dans la conservation des produits alimentaires (produit carnés….) à cause de leur capacité
de produire des substances antimicrobienne qui inhibent la croissance la flore d'altération
alimentaire (Maghnia, D. 2011)
56
Conclusion
Conclusion
Conclusion
Le lait est l’aliment essentiel pour tous les mammifères à cause de sa richesse en
matières nutritionnels, pour la prolongation de ça conservation le lait est utilisé sous d’autre
formes (L'ben, Raib, Yoghourt, Fromage…etc.).
J’ben est l’un de ces produits, préparé à l’artisanat ou bien traditionnellement à partir
de lait cru de vache, de chèvre ou bien de brebis, parfois utilisé à l’état frai, parfois on l’ajoute
du sel, de l’ail, du persil…etc. soi pour améliorer le gout soi pour la conservation.
Cette étude a permis de déterminer la qualité microbiologique de six échantillons du
J’ben préparés au laboratoire (J'ben de lait de vache ou de chèvre avec le sel, l'ail et le persil).
Et l’isolement des souches de bactéries lactiques afin d’étudier leurs caractères
technologiques.
Les résultats obtenu on montrés que les produits préparé sont altérés par les coliformes
totaux et les champignons, ce qui est due à une contamination lors la préparation ou bien
l’allaitement (Federicci-Mathieu. C;2000), mais on a remarqué l’absence des coliforme
fécaux, St. aureus, les bactéries sporulées tel que Clostridium qui peuvent être pathogènes
(Federicci-Mathieu. C., 2000.)
L’isolement des bactéries lactiques sur le milieu MRS et M17 a permis d’étudier les
caractères physiologiques et biochimiques de 95 souches dont l’ensemble font partie des
genres: Lactococcus qui est le genre le plus dominant dans les 6 echantillons, Leuconostoc,
Pediococcus, Entérococcus, Carnobactéruim, Weissella, Streptococcus.
Ces bactéries qui peuvent être appliqué à la technologie laitière à cause de leurs
pouvoirs technologiques ‘ acidifiant, degradation des protenies , hydrolyse des sucres, la
production de substances aromatiques) et le pouvoir entimicrobien.
Ces observations ouvrent des Perspectives futures:
 Etude de l'aptitude technologique de nos isolats (Protéolyse, lipolyse).
 La capacité de produire des substances antimicrobiennes.
 Etude de cinétique de croissance et d'acidification.
 Identification moléculaire des isolats.
57
56
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Annexe 01 : Préparation d’un produit laitier traditionnel (Procédé de fabrication du Jben).
Lait cru
Fermentation spontanée T° ambiant 24-72h
Lait caillé
Coagulation
Maturation
Egouttage
Salage
Jben
salé
Ail
Persil
Sel
Annexe 02 : Composition des diluants (g/l)
-
Eau physiologique peptonée
Peptone ............................................................... 0 ,5g
Chlorure de sodium ........................................... 8,5g
Eau distillée ............................................... 1000 ml
pH = 7,0
Autoclavage 120°C pendant 20 minutes.
-
Eau physiologie 9 /ml
NaCl ................................................................... 9g
Eau distillée ................................................ 1000 m
Annexe 03 : Composition des milieux de cultures (g/l)
-
Milieux solides
*Gélose nutritive standard Plate Count Agar (P.C.A)
Hydrolysat trypsique de caséine ........................ 2,5g
Extrait de viande .................................................. 5g
Glucose ............................................................... 1g
Extrait de la levure ............................................ 2,5g
Agar .................................................................. 15g
Eau distillé q.s.p ......................................... 1000 ml
pH=7±0.2 à 37°C
-
Milieu MRS (de Man Rogosa et Sharpe, 1960)
Extrait de levure .................................................. 5g
Peptone ............................................................ 10 g
Acétate de sodium................................................ 5g
Citrate de sodium ................................................. 2g
Glucose ............................................................. 20g
KH2PO4 ............................................................. 2g
MgSO4............................................................ 0.1 g
MnSO4.......................................................... 0.05 g
Agar .................................................................. 12g
Tween80 .......................................................... 1 ml
Eau distillée q.s.p ........................................ 1000 ml
pH=6.5±0.2 à 37°C
Autoclavage : 121°C /15min
-
Milieu M-17
Extrait de levure .............................................. 2, 5g
Peptone de caséine ........................................... 2, 5g
Peptone de viande ............................................ 2, 5g
Peptone de soja .................................................... 5g
Peptone de soja .................................................... 5g
Acide ascorbique ............................................. 0, 5g
Β-glycérophosphate de sodium ........................... 19g
Agar ............................................................ 12, 75g
Sulfate de magnésium ..................................... 0.25g
Eau distillée q.s.p ........................................ 1000 ml
pH=7.1±0.2 à 37 °C
Autoclavage : 121°C pendant 15min
MRS -Bouillon
Peptone .............................................................. 10g
Extrait de viande ............................................... 8g
Extrait de levure ................................................ 4g
Glucose ............................................................ . 20g
Acétate de sodium trihydraté ........................... .5,0 g
Citrate d'ammonium .......................................... 2,0 g
Tween 80 ..............................................................1,0 ml
Hydrogénophosphate de potassium ....................2,0 g
Sulfate de magnésium heptahydraté .................. 0,2 g
Sulfate de manganèse tétrahydraté .................... 0,05 g
pH = 6.2
Milieu MSE (Mayeux, Sandine et Elliker, 1962)
Tryptone ……………………………………………..20 g
Gélatine……………………………………………… 2.5 g
Extrait de levure ………………………………… 5 g
Saccharose …………………………………………. 100 g
Glucose ………………………………………………… 5 g
Citrate de sodium ……………………………… 1 g
Azide de sodium……………………………….. 0.075 g
Agar-Agar …………………………………………… 15 g
Eau distillée …………………………………………….1000 ml
pH= 6,8
Autoclavage 120°C/ 20 minutes
Milieu KMK (Kempler et Mc Kay, 1980)
Extrait de levure …………………………………. 3 g
Biopolytone ……………………………………… 2,5g
Glucose……………………………………………. 5 g
Agar ………………………………………………. 15 g
Eau distillée………………………………………1000 ml
pH= 6.6
Milieu M16 BCP (Thomas, 1973)
Extrait de levure ………………………………………..
Extrait de viande………………………………………..
2,5 g
5g
Peptone………………………………………………… 10 g
Acide ascorbique ……………………………………… 0,5 g
Lactose …………………………………………………2 g
L-arginine ………………………………………………… 4 g
Pourpre de Bromocrésol …………………………………. 0,05 g
Agar-Agar ……………………………………………… . 15 g
Eau distillée……………………………………………… 1000 ml
pH = 6,8
Autoclavage 120°C pendant 20 minutes
Milieu MRS BCP
MRS (milieu liquide) moins l’extrait de viande et sans sucre…………. 1000 ml
Pourore de Bromocrésol …………………………………………………0,025 mg
pH= 7.0
Autoclavage 120°C/ 20 minutes
Annexe 04:
On calcule les nombres de micro-organismes par ML à laide de la formule suivante :
∑C
(n1+0,1n2) d
Annexe 05: Les étapes de coloration de Gram
Les étapes de coloration de Gram
Un frottis fixé à la chaleur est coloré pendant une minute au violet de cristal; il est ensuite
rincé rapidement à l'eau courante, traité pendant une minute par une solution de Lugol, et de
nouveau rincé rapidement. On soumet alors le frottis coloré à une étape de décoloration en le
traitant avec l'éthanol 95%. Il s'agit de l'étape critique: la lame est maintenue inclinée et en fait
couler le solvant sur le frottis pendant 2 à 3 secondes seulement jusqu'à ce que le colorant
cesse de s'échapper librement du frottis. Celui-ci est alors immédiatement rincé à l'eau
courante. À ce stade les cellules gram- seront incolores, les cellules gram+ violettes. On
soumet ensuite le frottis à une contre coloration de 30 secondes à la fushine pour colorer les
cellules gram- présentes. Après un bref rinçage, on sèche le frottis au buvard et on l'examine à
l'objectif à immersion (grossissement Х 1000) (Singleton, 1999).
Annexe 06: Les étapes de test de sucre
Les étapes de test de sucre
Les solutions de sucres sont préparé par l'addition des 01 g de sucre à 100 ml de l'eau
distillé et stérillé au bain marie 10 min à 100 C°.
Une culture de 18 heures de la souche appropriée est centrifugée à 8000 tr/mn pendant
5 min. Le culot ainsi récupéré et rincé avec l'eau distillé stérile puis recentrifugé aux mêmes
conditions pour le débarrasser des restes du milieu de culture et obtenir un culot cellulaire pur.
A ce culot, le milieu MRSBCP est additionné pour former la solution cellulaire
On utilise la plaque Eliza pour la réalisation de test de sucre par l'addition de milieu
MRS BCP 100 μl et les différents sucres (sources de carbone) et 100μl de suspension
bactérien la lecture des résultats se fait après 24 et 48 heures d’incubation
Après incubation pendant 24 à 48 heurs le développement de la culture et le virage au
jaune de l’indicateur coloré dû à l’acidification du milieu traduit la fermentation du sucre.
(Belarbi Fatima.2011)
Annexe 07: Conservation longue durée
Conservation longue durée
A partir de jeunes cultures (18-48 h) sur milieu liquide, les cellules sont récupérées par
centrifugation à 8000 t / min pendant 05 min. Une fois le surnageant éliminé, on ajoute le
milieu de culture de conservation sur le culot. Le milieu de conservation contient du lait
écrémé, 0,2% d’extrait de levure et 30% de glycérol. Les cultures sont conservées en
suspension dense et en tubes eppendorfs à –20 °C. Accolas et al. (1977) indiquent que des
suspensions très concentrées résistent mieux à la congélation. En cas de besoin, les cultures
sont repiquées dans du lait écrémé à 0,5 % d’extrait de levure, avant utilisation
Annexe 08: liste de matériels utilisés
autoclave
Balance
Vortex
microscope optique
pH mètre
plaque chauffante
centrifigeuse
étuve
Résumé
En Algérie J’ben, produit laitier fermenté traditionnel est le plus souvent consommé (à cause de ça richesse en
matières nutritionnels : protéines, matières grasse, glucides, sels minéraux, vitamines….etc.) soi dans son état frai ou
bien après séchage pour allonger ça durée de conservation (à cause de ça richesse en bactéries bénéfiques productrices
de substances antimicrobienne)
Ce travail nous a permis d’étudier la qualité hygiénique et microbiologique de six échantillons du J’ben
préparer à partir du lait cru de vache et de chèvre au niveau du laboratoire de microbiologie (université Kasdi Merbah
Ouargla).
Afin d’étudier la biodiversité des bactéries lactiques et évaluer leur potentiel technologique pour l’usage dans
l’industrie laitières un totale de 95 souches ont été isolés et purifiés, la caractérisation physiologique et biochimique a
révélé qu’elles appartiennent à huit genres : Lactococcus (51,57%); Leuconostoc (7,36%) ; Lactobacillus (2.1%);
Enterococcus (21.05%), Pediococcus (8,42%), weissella (3,15%), Carnobactéruim (4.21%) Streptococcus (1.05%).
Avec la dominance du genre Lactococcus L’identification des souches au niveau de l’espace a été établie par l’étude du
profil fermentaire à l’aide de la galerie biochimique classique.
Le pouvoir technologique des isolats a été mis en évidence sur des milieux spécifique tel que : KMK pour
étudier le pouvoir de produire des substances aromatiques (le diacétyl), le MSE pour étudier le pouvoir de produire les
exo-polysaccharides et la dégradation de l'arginine qui a été mis en évidence sur le milieu M16BCP.
Mots clé : J’ben ; bactéries lactiques, potentiel technologiques,
Abstrat
In Algeria J'ben traditional fermented dairy product is often consumed (because of this wealth
nutritional substances: proteins, fatty materials, carbohydrates, minerals, vitamins ... etc) it self in its
spawning condition or after drying to extend that shelf life (because of that wealth-producing beneficial
bacteria to antimicrobial substances)
This work allowed us to study the hygienic and microbiological quality of J'ben six samples
prepared from raw milk cow and goat at the microbiology laboratory (University Kasdi Merbah Ouargla).
To study the biodiversity of lactic acid bacteria and assess their technological potential for use in the
dairy industry a total of 95 strains were isolated and purified, physiological and biochemical characterization
revealed that they belong to hight genera Lactococcus ; Leuconostoc; Lactobacillus; Enterococcus;
Carnobactéruim; Weissella; Streptococcus; Pediococcus The identification of strains at the space was
established by studying the fermentation profile using classical biochemical gallery.
The technological power of the isolates was demonstrated on specific areas such as: KMK to study
the power to produce aromatic substances, the MSE to study the power to produce the exopolysacharides.
Keywords: J'ben; lactic acid bacteria, technological characteristics,
‫ملخص‬
‫إر ٌسخٕي‬.‫فً اندضائش ٌعخبش اندبٍ يُخح نبًُ حقهٍذي زٍث ٌخى اعخٓالكّ إيب غبصخب أ خبفب ٔبزنك ًٌكٍ زفظّ نًذة اغٕل‬
‫ ٔ إَخبج األزًبض انعطشٌت يثم ثُبئى‬،‫عهى بكخٍشٌب زًط انهبٍ انخً حغبْى فً حخًش انعذٌذ يٍ انًُخدبث انسٍٕاٍَت ٔ انُببحٍت‬
. ‫ببنُغبت نًُخدبث األنببٌ انًخخهفت‬. ‫األعخٍم ٔانغكشٌبث انًشبسكت فً انًهًظ ٔانًظٓش ٔانُكٓت‬
‫نغج عٍُبث يٍ اندبٍ انًسعشة يٍ زهٍب انبقش ٔانًبعض‬.‫ٌغًر ْزا انعًم بذساعت اندٕدة انصسٍت ٔانًٍكشٔبٍٕنٕخٍت‬
)‫انثٕو ٔانبقذَٔظ‬, ‫انطبصج ٔ انًصُٕع بطشٌقت حقهٍذٌت ٔ بإظبفبث يخُٕعت( يهر‬
ِ‫ حى دساعت انخُٕع انبٍٕنٕخً نبكخٍشٌب زًط انهبٍ نٓز‬,)‫فً يخبش عهى األزٍبء انًدٓشٌت (خبيعت قبصذي يشببذ ٔسقهت‬
‫انًُٕ فً ٔعػ ٌسخٕي عهى‬.‫االَٕاع يٍ اندبٍ إر حى حسذٌذ األخُبط بذساعت انخصبئص انًظٓشٌت ٔ انفٍضي ٔنٕخٍت ( َٕع انخخًٍش‬
‫انًُٕ فً أٔعبغ بذسخبث زًٕظت يخخهفت ٔكزنك انًُٕ فً دسخبث زشاسة يخخهفت إظبفت انى‬.‫كهٕسٌذ انصٕدٌٕو بخشاكٍض يخخهفت‬
,ٍٍُ‫( انقذسة عهى اعخعًبل انغكشٌبث إخخببس اعخعًبل االسخ‬. ،‫دساعت انًقبٔيت انسشاسٌت) ٔانخصبئص انبٍٕكًٍٍبئٍت انخكُٕنٕخٍت‬
‫) عالنت يعضٔنت يٍ ْزا‬95 ( ‫إخخببس انًُٕ فً ٔعػ زهٍب شٍشيبٌ) نًئت‬,expolysacchrides ‫إَخبج‬, ‫اخخببس اعخعًبل انغٍخشاث‬
Lactococcus ; Leuconostoc ; Lactobacillus ; Enterococcus
: ‫اندبٍ إر يكُُب يٍ حسذٌذ االخُبط انخبنٍت‬
ٍ‫ إر حى اَخٓبء انذساعت ببٌ اندبٍ انًسعش حقهٍذٌب ي‬Streptococcus Pediococcus; Weissella; Carnobactéruim.
.‫زهٍب انًبعض كبٌ األكثش عذدا ٔ األكثش حُٕعب يٍ زٍث أصُبف انبكخٍشٌب انهبٍُت‬
،‫ انخصبئص انخكُٕنٕخٍت‬،ٍ‫ بكخٍشٌب زًط انهب‬.ٍ‫ اندب‬:‫الكلمات المفتاحية‬

Thème Etude microbiologique d`un produit laitier fermenté

Transcription

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