ECOLE DOCTORALE SCIENCE ET INGENIERIE De l`Université de

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ECOLE DOCTORALE SCIENCE ET INGENIERIE
De l’Université de Cergy-Pontoise
THESE
Présentée pour obtenir le grade de Docteur de l’Université de Cergy Pontoise
Spécialité : Biochimie-Biologie Intégrative
___________________________________________________________________________
Auto-assemblage de la fibronectine induit par l’adsorption
caractérisation expérimentale sur l’hydroxyapatite et étude par simulation numérique
___________________________________________________________________________
Par
Delphine Pellenc
Equipe de Recherche sur les Relations Matrice Extracellulaire Cellules
EA 1391
Soutenue le 21 octobre 2005
Devant le Jury composé de
Mr. Guy Daculsi
Mr. Bernard Senger
Mr. Olivier Gallet
Mr. Hugues Berry
Mme Karine Anselme
Mr. Paul Van Tassel
Mr. Eric Champion
Rapporteur
Rapporteur
Directeur de Thèse
Co-Directeur de Thèse
Examinatrice
Examinateur
Examinateur
Vous pouvez tout faire, penser ou croire,
posséder toute la science du monde, si vous
n'aimez pas, vous n'êtes rien
Marcelle Sauvageot (1900-1934)
Laissez-Moi
Introduction
Je remercie le Pr Guy Daculsi et le Dr Bernard Senger d’avoir acceptéde rapporter ce travail ainsi
que le Dr Karine Anselme, le Pr Paul Van Tassel et le Pr Eric Champion d’avoir bien voulu
l’examiner.
Je remercie le Pr Véronique Larreta-Garde de m’avoir accueillie au sein du laboratoire
ERRMECe lors de mon DEA puis lors de ces trois années de thèse.
L’hydroxyapatite utilisée dans ce travail a été synthétisée et caractérisée au sein du laboratoire
des Sciences des Procédés Céramiques et Traitements de surface de l’Université de Limoges. Je
remercie le Pr Eric Champion, ainsi que l’ensemble de son équipe, en particulier Mickael Palard,
pour leur aide et leur accueil chaleureux au sein de leur laboratoire.
Je remercie les Dr Olivier Gallet et Hugues Berry qui ont encadré ma thèse.
Merci à vous deux pour la grande marge de manœuvre, la critique mais aussi la prise en
compte de mon point de vue.
Olivier, merci d’avoir eu souvent confiance en moi, de m’avoir appris l’autonomie et la
débrouille, merci pour ton ouverture d’esprit, ton enthousiasme, merci enfin pour ta folie douce aussi
parfois…
Hugues, merci pour m’avoir appris à défendre mon point de vue mais aussi à en assurer la
rigueur par la persévérance et l’auto-critique… merci pour les débats électroniques – parfois animés –
et les séances de croquis par telephone...merci enfin pour ta grande disponibilité et ta passion
communicative de la science.
Je tiens également à remercier Remy Agniel pour son aide dans la réalisation de ce travail
Remy, merci pour toute l’aide dans le boulot et surtout pour l’écoute, le soutien et l’amitié
Un merci particulier au Dr Franck Carreiras, qui a eu la bonne idée un jour de 2002 de nous
suggérer l’utilisation de la fluorescence… Merci pour ca, Franck, et aussi pour ta droiture, ton soutien
et tes encouragements constants, en enseignement comme en recherche.
Merci à tous les membres du laboratoire ERRMECe et du département de Biologie de l’Université
de Cergy-Pontoise, et en particulier
Salima, pour la solidarité, les conseils, le modèle que tu donnes à suivre et l’amitie qui nous
lie
Bastien pour ton recul en recherche et ailleurs, ta patience, ton humour et…nos soirees de
décompression enivrees
Lucie, pour ton enthousiasme, ton envie d’échanger et tous les bons moments de non-science
que nous avons partagés
Elisa, pour l’amitié et l’écoute dans les moments de doute.
Bast, pour avoir sans cesse motivé les jeunes troupes à échanger des idées, des conseils, des
manips, des chopines, des blagues foireuses, des pin’s, des timbres, des…
Jo, pour l’écoute, l’empathie, la disponibilité, les conseils, les bulles et l’amitie récente
Manu, pour avoir, entre compétition et émulation, contribué au renforcement constant de ma
motivation, et pour les nombreux fous rires que nous avons partagés
Loraine, Julien, Edefia, pour votre bonne humeur, votre patience et votre aide
Caro, Karine, Stephanie, Mireille pour votre aide et votre soutien quotidiens
Maman, Papa, le jour de ma soutenance Véronique vous a félicité parce que, je cite, on fait
difficilement une thèse si les parents ne sont pas là. Je ne saurais dire, vous l’avez toujours été. Merci
de votre conviction qu’apprendre n’est pas un luxe, merci de me l’avoir transmise et de m’avoir
soutenue pour l’expérimenter toutes ces années.
Enfin, merci à Geoffrey qui a supporté toutes mes angoisses, a passé tant de temps dans les
transports ces trois ans, tout en réussisant à soutenir lui-même brillamment sa thèse…Merci pour ta
patience, ton soutien et ta compréhension.
Introduction
Symboles et abbréviations utilisées
AFM : Microscopie à Force Atomique
BMP : Bone Morphogenetic Protein
BMU: Basic Multicellular Unit
BSP : Bone Sialoprotein
Df : Dimension Fractale
DLA : Agrégation Limitée par la Diffusion
DRX : Diffraction de Rayons X
EDTA : Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
ELISA : Enzyme-linked Immunosorbent Assay
F70 : Fragment N-terminal de 70kDa de la fibronectine
Fn : Fibronectine
Fn-CBS : site de liaison aux cellules de la Fibronectine, module III10
FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfer
GAG : Glycosaminoglycane
GLA : γ-carboyglutamique
HA : Hydroxyapatite
IL : Interleukine
Ix : xème module de type I de la fibronectine
MEB : Microscopie Electronique à Balayage
MEC : Matrice Extracellulaire
MTT : Methylthiazole-tetrazolium
NaCl : Chlorure de Sodium
NDiff : Nombre de pas de Diffusion d’une Protéine
OC : Ostéocalcine
ON : Ostéonectine
OPG : Ostéoprotégérine
OPN : Ostéopontine
PA : Probabilité d’Adsorption
PAg : Probabilité d’Agrégation
PAGE : Polyacrylamide Gel Electrophoresis
PC : Probabilité de Dépliement d’une Protéine au contact d’une autre
PC/B : Probabilité de Dépliement au Contact d’une Protéine sous forme de Batonnet
PC/D : Probabilité de Dépliement au Contact d’une Protéine sous forme de Disque
PD : Probabilité de Dépliement
Introduction
PE : Polyethylène
PI : Probabilité de Dépliement d’une Protéine Isolée
PMMA: Polymethyl-metacrylate
PMSF : Phenyl-methyl-sulfonylfluoride
PNPP : paraNitro-Phenylphosphate
PTH : Parathyroid Hormone
RANK: Receptor Activator of Nuclear Factor Kappa B
RANKL : RANK Ligand
RGD: séquence peptidique Arginine-Glycine-Acide Aspartique
RLA : Agrégation Limitée par la Réaction
RSA : Adsorption Séquentielle Aléatoire
SDS : Sodium Dodecylsulfate
T50Nx : Tris 50mM, NaCl x mM
TCP : Tricalcium Phosphate
TGF : Transforming Growth Factor
ThT : Thioflavine T
Tris: Tris-Hydroxymethyl-aminomethane
TRITC: Tetramethyl-Rhodamine-Isothiocyanate
Vn : Vitronectine
Table des matières
Introduction ............................................................................................................................ 15
Etude Bibliographique........................................................................................................... 21
I. L'interaction protéine/hydroxyapatite, du tissu osseux aux matériaux bioactifs........................................ 23
I.1. Tissu osseux ........................................................................................................................................... 23
I.1.a. Introduction........................................................................................................................................ 23
I.1.b. Structure du tissu osseux................................................................................................................... 24
I.1.c. Dynamique de remodelage................................................................................................................ 30
I.1.d. Biominéralisation et Protéines non collagéniques............................................................................ 35
I.2. Biomatériaux hybrides ostéoinducteurs............................................................................................... 38
I.2.a. Pertes osseuses et nécessité d’un comblement prothétique.............................................................. 38
I.2.b. Matériaux de substitution.................................................................................................................. 39
I.2.c. Biomatériaux hybrides ostéoinducteurs ............................................................................................ 43
II. La fibronectine, protéine multifonctionnelle des matrices extracellulaires ............................................... 45
II.1. Introduction.......................................................................................................................................... 45
II.2. Structure modulaire et domaines d’affinités...................................................................................... 45
II.2.a. Unités structurales de la fibronectine : les modules ........................................................................ 46
II.2.b. Ligands de la fibronectine ............................................................................................................... 47
II.3. Conformation de la fibronectine......................................................................................................... 50
II.3.a. Conformation de la fibronectine en solution ................................................................................... 50
II.3.b. Fibrillogenèse de la fibronectine au sein de la matrice................................................................... 52
II.4. Fonctions de la fibronectine................................................................................................................ 58
II.4.a. Introduction ...................................................................................................................................... 58
II.4.b. Fibronectine et fonctions cellulaires................................................................................................ 59
II.4.c. Fibronectine et architecture de la matrice extracellulaire ............................................................... 62
III. Assemblages de protéines induits par l’adsorption, concepts et modèles d’études ................................. 65
III.1. Introduction ........................................................................................................................................ 65
III.2. Adsorption d’une protéine ................................................................................................................. 65
III.2.a. Les protéines, ni colloïdes ni polymères flexibles ......................................................................... 65
III.2.b. Dénaturation induite par l’adsorption ............................................................................................ 67
III.3. Assemblages protéiques induits par l’adsorption............................................................................. 72
III.3.a. Modèles d'adsorption séquentielle.................................................................................................. 72
III.3.b. Diffusion des particules adsorbées................................................................................................. 80
III.3.c. Modèles d’adsorption de colloïdes et changement de conformation ............................................ 83
Matériels et Méthodes............................................................................................................ 87
I. Matériaux............................................................................................................................................................. 88
I.1. Céramiques d’Hydroxyapatite .............................................................................................................. 88
I.1.a. Synthèse............................................................................................................................................. 88
I.1.b. Caractérisation................................................................................................................................... 88
I.2. Autres matériaux ................................................................................................................................... 89
I.3. Microscopie à force atomique............................................................................................................... 89
II. Fibronectine ....................................................................................................................................................... 91
II.1. Purification........................................................................................................................................... 91
II.2. Electrophorèses .................................................................................................................................... 92
II.2.a. SDS-PAGE....................................................................................................................................... 92
II.2.b. Native PAGE.................................................................................................................................... 93
II.3. Conditions d’adsorption ...................................................................................................................... 93
II.4. Dosages et marquages ......................................................................................................................... 94
II.4.a. Immunofluorescence........................................................................................................................ 94
II.4.b. Dosage de la Fibronectine adsorbée par ELISA ............................................................................. 95
II.4.c. Dosage de l’exposition du site de liaison aux cellules par ELISA ................................................. 96
II.4.d. Désorption ........................................................................................................................................ 96
Introduction
II.4.e. Marquage des fibres amyloïdes à la Thioflavine T ......................................................................... 96
III. Méthodes de simulation................................................................................................................................... 97
IV. Analyse fractale ................................................................................................................................................ 97
IV.1. Dimension fractale.............................................................................................................................. 98
IV.1.a. Définition ........................................................................................................................................ 98
IV.1.b. méthode de comptage des boites.................................................................................................... 99
IV.2. Traitement des images ....................................................................................................................... 99
V. Adhérence cellulaire........................................................................................................................................ 101
V.1. Culture cellulaire................................................................................................................................ 101
V.2. Tests d’adhérence ............................................................................................................................... 101
V.2.a. Test d’adhérence au MTT sur l’HA .............................................................................................. 101
V.2.b. Test d’adhérence par comptage direct sur différents matériaux................................................... 102
VI. Statistiques ...................................................................................................................................................... 102
Résultats – Discussion .......................................................................................................... 103
I. Hydroxyapatite.................................................................................................................................................. 104
I.1. Pureté du matériau et propriétés biologiques. ................................................................................... 104
I.2. Frittage d’HA commerciales............................................................................................................... 105
I.3. Synthèse par voie sèche....................................................................................................................... 106
I.4. Synthèse par voie humide. (SPCTS, Limoges) .................................................................................. 108
II. Structuration de la fibronectine sur l’hydroxyapatite : dépendance au temps et à la concentration... 109
II.1. Introduction........................................................................................................................................ 109
II.2. Agrégation en solution....................................................................................................................... 110
II.3. Quatre états morphologiques ............................................................................................................ 110
II.4. Séquence de l’assemblage ................................................................................................................. 113
II.5. Discussion........................................................................................................................................... 117
III. Fibrillation de la fibronectine sur l’HA : interactions mises en jeu......................................................... 120
III.1. Implication du domaine N-terminal................................................................................................ 120
III.2. Structures amyloïdes ........................................................................................................................ 121
III.3. Effet de la force ionique................................................................................................................... 123
III.4. Effet d’un surfactant non-ionique .................................................................................................. 126
III.5. Discussion ......................................................................................................................................... 128
IV. Processus de diffusion-agrégation : un modèle de l’assemblage de la fibronectine ? ............................ 132
IV.1. Introduction....................................................................................................................................... 132
IV.2. Conformations de la fibronectine .................................................................................................... 132
IV.2.a. Définitions .................................................................................................................................... 132
IV.2.b. Propriétés ...................................................................................................................................... 133
IV.3. Description du modèle ...................................................................................................................... 134
IV.4. Adsorption séquentielle aléatoire..................................................................................................... 136
IV.5. Changement de conformation et diffusion agrégation .................................................................. 137
IV.5.a. amas DLA à dépliement nul......................................................................................................... 137
IV.5.b. Effet du dépliement sur la morphologie des amas formés .......................................................... 138
IV.6. Discussion ......................................................................................................................................... 147
V. Pertinence du modèle dans l’adsorption de la Fibronectine sur l’HA ...................................................... 148
V.1. Dimension fractale des amas de fibronectine................................................................................... 148
V.2. Agrégats et structures fibrillaires denses .......................................................................................... 149
V.3. Coexistence des agrégats et des fibres............................................................................................... 151
V.4. Fibres isolées et direction de dépliement privilégiée ........................................................................ 153
V.5. Conclusion .......................................................................................................................................... 154
VI. Structuration de la fibronectine adsorbée: dépendance au matériau...................................................... 156
VII. Adhérence cellulaire..................................................................................................................................... 160
Conclusions et Perspectives ................................................................................................. 163
Références Bibliographiques............................................................................................... 171
Annexe 1 : Article I .............................................................................................................. 197
Annexe 2 : Article II............................................................................................................. 211
Annexe 3 : Code informatique ............................................................................................ 225
Introduction
Table des illustrations
Figure 1. Structure générale du tissu osseux illustrée sur un os long. .................................................................... 24
Figure 2. Arrangement des atomes dans la structure cristalline hexagonale de l’hydroxyapatite. ......................... 25
Figure 3. Organisation structurale de l’os (Rho, 1998). ........................................................................................... 26
Figure 4. Fibres de collagène au sein du tissu osseux observées en MEB. ........................................................... 26
Figure 5. Unité de remodelage du tissu osseux : Basic Multicellular Unit (BMU).................................................... 31
Figure 6. Représentation schématique des différentes phases du remodelage osseux......................................... 31
Figure 7. Interactions entre ostéoblastes et ostéoclastes :activation des ostéoclastes. ......................................... 33
Figure 8. Résorption de la matrice osseuse par un ostéoclaste .............................................................................. 33
Figure 9. Interactions entre ostéoblastes et ostéoclastes :phase d’inversion du remodelage. ............................... 34
Figure 10. Restauration du tissu osseux au contact d’un implant de titane (tiré de Bonel, 1998). ......................... 42
Figure 11. Structure modulaire de la fibronectine. ................................................................................................... 46
Figure 12. Principaux ligands de la fibronectine....................................................................................................... 47
Figure 13. Interactions hydrophobes sur le site d’affinité au collagène, entre Fn I6 et II2,. ..................................... 50
Figure 14. Conformation compacte de la fibronectine d’après (Johnson et al, 1999). ............................................ 51
Figure 15. Transition de conformation de la fibronectine induite par la force ionique. ............................................ 51
Figure 16. Ordres de grandeurs des dimensions de la fibronectine. ....................................................................... 52
Figure 17. Matrices de fibronectine assemblées par des ostéoblastes in vitro et in vivo........................................ 52
Figure 18. Coexistence de conformations compactes et dépliées de la fibronectine au sein de la matrice. .......... 55
Figure 19. Modulation des interactions entre modules par la tension exercée sur la fibronectine.......................... 56
Figure 20.Couplage mécanique de la matrice de fibronectine au cytosquelette via les intégrines......................... 57
Figure 21. Activation de la signalisation intracellulaire via la reconnaissance de la fibronectine par les intégrines.
................................................................................................................................................................ 59
Figure 22. Adhérence et étalement d’une cellule sur son substrat. ......................................................................... 60
Figure 23. Représentation schématique des étapes de la migration cellulaire. ...................................................... 61
Figure 24. Niveaux de structuration d’une protéine.................................................................................................. 66
Figure 25.a. Adsorption d’une sphère dure : entropie du solvant. ........................................................................... 68
Figure 25.b. Adsorption d’une sphère dure : interactions électrostatiques et volume exclu. .................................. 69
Figure 26. Adsorption d’une protéine flexible. .......................................................................................................... 70
Figure 27. Observation de la fibronectine adsorbée en microscopie à force atomique .......................................... 71
Figure 28. Effet de volume exclu lors de (a) l’adsorption de sphère et (b) l’adsorption d’ellipses. ......................... 75
Figure 29. Modélisation de l’adsorption de fibre d’après (Provatas et al, 2000)...................................................... 78
Figure 30. Longueur de surplomb de la surface d’une particule en contact avec une particule adsorbée ............. 79
Figure 31. Amas DLA de 3600 particules sur un réseau carré. Df~1.65 (Witten et Sander, 1981)......................... 80
Figure 32. Amas DLA formés à partir de deux particules origines d’après (Witten et Meakin, 1983)..................... 81
Figure 33. Effet de la probabilité d’agrégation sur la morphologie des amas formés par diffusion agrégation. ..... 82
Figure 34. Principe de fonctionnement de l’AFM ..................................................................................................... 90
Figure 35. Principe de l’immunomarquage fluorescent............................................................................................ 94
Figure 36. Spectres d’émission et d’absorption de la thioflavine T et du TRITC..................................................... 97
Figure 37. Principe d’estimation d’une dimension fractale par la méthode de comptage des boites. .................... 99
Figure 38. Exemples du traitement de deux images de fluorescence. .................................................................. 100
Figure 39. Influence de la composition de surface d’une céramique d’HA sur l’adsorption de la fibronectine et
l’adhérence cellulaire............................................................................................................................ 104
Figure 40. Profil de diffraction de rayons X (DRX) d’une poudre d’hydroxyapatite commerciale avant (courbe
inférieure) et après (courbe supérieure) frittage. ................................................................................. 106
Figure 41. Profil DRX de l’apatite synthétisée par voie sèche avant frittage. ........................................................ 107
Figure 42. Profil DRX de l’apatite synthétisée par voie sèche après frittage......................................................... 107
Figure 43. Profils DRX de céramiques d’HA réalisées par frittage de l’HA synthétisée par voie humide (SPCTS,
Limoges). .............................................................................................................................................. 108
Figure 44. Influence des conditions d’adsorption de la fibronectine sur son agrégation en solution. ................... 110
Figure 45. Etats morphologiques de la fibronectine observés sur l’hydroxyapatite par microscopie de
fluorescence. ........................................................................................................................................ 111
Figure 46. Exemple d’un agrégat de fibronectine d’environ 300µm de long. ........................................................ 112
Figure 47. Exemple d’une fibre de fibronectine d’environ 1.2 mm de long............................................................ 112
Figure 48. Séquence de l’assemblage de la fibronectine sur l’HA en fonction de la concentration en solution. .. 114
Figure 49. Adsorption de la fibronectine sur l’HA au cours du temps, en fonction de la concentration en solution
.............................................................................................................................................................. 115
Figure 50. Désorption de la fibronectine de l’HA en fonction du temps d’adsorption et de la concentration en
solution.................................................................................................................................................. 116
Figure 51. Modèle hypothétique de l’effet de la concentration en solution sur l’agrégation et la fibrillogénèse de la
fibronectine. .......................................................................................................................................... 118
Figure 52. Test d’inhibition de la fibrillation de la fibronectine par son fragment N-terminal F70.......................... 120
Figure 53. Marquage des structures amyloïdes par la thioflavine T. ..................................................................... 121
Figure 54. Effet de la force ionique sur l’assemblage de la fibronectine sur l’HA.................................................. 123
Figure 55. Fréquence d’apparitions des différents états de la fibronectine sur l’HA en fonction de la force ionique.
.............................................................................................................................................................. 124
Figure 56. Adsorption de la fibronectine sur l’HA en fonction de la force ionique. ................................................ 125
Figure 57. Exposition du segment central de liaison aux cellules de la fibronectine (Fn-CBS) en fonction de la
force ionique. ........................................................................................................................................ 125
Figure 58. Effet de la présence d’un surfactant sur l’organisation de la fibronectine sur l’HA en fonction de la force
ionique. ................................................................................................................................................. 126
Figure 59. Fréquence d’apparition des états de structuration de la fibronectine en présence d’un surfactant nonionique en fonction de la force ionique................................................................................................. 127
Figure 60. Effet de la présence d’un surfactant non-ionique sur l’adsorption de la fibronectine en fonction de la
force ionique. ........................................................................................................................................ 128
Figure 61. Schéma récapitulatif de l’effet de la force ionique et de la présence d’un surfactant sur l’organisation de
la fibronectine sur l’HA.......................................................................................................................... 129
Figure 62. Modèle des formes compactes et étendues de la fibronectine. ........................................................... 133
Figure 63. Dépliement de la fibronectine................................................................................................................ 134
Figure 64. Modèle d’adsorption de la fibronectine. ................................................................................................ 135
Figure 65. Exemples de configurations du réseau pour PD=0 et NDiff=0 après l’adsorption de 10, 100, 1000, 7000
et 38000 protéines sur la surface. ........................................................................................................ 136
Figure 66. Cinétique d’adsorption pour PU=0 et Ndiff=0.......................................................................................... 136
Figure 67. Effet du rapport entre la diffusion et l’adsorption, Ndiff/PA, sur la dimension fractale des amas à PD=0.
.............................................................................................................................................................. 137
Figure 68. Illustration de la détermination de la dimension fractale, Df, des amas protéiques, par la méthode de
comptage de boîtes .............................................................................................................................. 139
Figure 69. Dimension fractale Df des amas en fonction de la probabilité de dépliement PD dans le régime limité
par la diffusion (PAg=1). ........................................................................................................................ 141
Figure 70. Détails du réseau pour PD=10-3 dans le régime limité par la diffusion. ................................................ 142
Figure 71. Dimension fractale des amas en fonction de la probabilité de dépliement PD dans le régime limité par
la réaction (PAg=10-3). ........................................................................................................................... 144
Figure 72. Fraction de protéines dépliées par amas en fonction de la probabilité de dépliement PD. .................. 145
Figure 73. Calcul de la dimension fractale des amas de fibronectine. .................................................................. 148
Figure.74. Amas de fibronectine observés et simulés de dimension fractale ~1.8. .............................................. 149
Figure 75. Amas de fibronectine de dimension fractale moyenne 1.60................................................................. 150
Figure 76. Amas simulés par les modèles de DLA et RLA. ................................................................................... 150
Figure 77. Amas protéiques simulés de dimension fractale ~1.6 dans le cas du dépliement indépendant.......... 150
Figure 78. Dissociation de la probabilité de dépliement au contact PC, selon la conformation de la protéine
voisine................................................................................................................................................... 152
Figure 79. Amas de fibronectine de dimension fractale 1.35-1.45......................................................................... 153
Figure 80. Amas protéiques simulés de dimension fractale ~1.4 dans le régime limité par la diffusion. .............. 153
Figure 81. Choix de la direction de dépliement en fonction de la surface de contact avec la voisine. ................. 154
Figure 82. Marquage immunofluorescent de la fibronectine adsorbée sur le verre, l’acier et le polycarbonate... 156
Figure 83. Fréquence d’apparition (H) d’un revêtement homogène, (A) d’agrégats et (F.tot) de fibres de
fibronectine sur différents matériaux. ................................................................................................... 157
Figure 84. Adsorption de la fibronectine sur l’HA, l’acier, le polycarbonate et le verre. ........................................ 157
Introduction
Figure 85. Exposition du site de liaison aux cellules de la fibronectine (Fn-CBS) adsorbée sur l’HA, l’acier, le
polycarbonate et le verre. ..................................................................................................................... 158
Figure 86. Images de microscopie à force atomique de la surface de l’hydroxyapatite, de l’acier, du verre et du
polycarbonate. ...................................................................................................................................... 158
Figure 87. Adhérence des cellules MG63 sur l’HA, en fonction du temps et de la concentration d’adsorption de la
fibronectine. .......................................................................................................................................... 160
Figure 88. Exposition du domaine de liaison aux cellules de la fibronectine (Fn-CBS) en fonction du temps et de
la concentration d’adsorption de la fibronectine sur l’HA..................................................................... 160
Figure 89. Adhérence cellulaire sur l’HA après adsorption de la fibronectine à différentes forces ioniques, en
présence ou en absence de Tween ..................................................................................................... 161
Figure 90. Adhérence des MG63 sur différents matériaux nus ou après adsorption de la fibronectine 2h, 0.1 g/L.
.............................................................................................................................................................. 162
Introduction
Introduction
15
Introduction
Les protéines sont des polymères biologiques dont la fonction dépend directement de
la conformation. La conformation d’une protéine dépend de sa localisation et de son
environnement. Les changements de conformation des protéines constituent ainsi un moyen
de régulation fine de nombreux processus biologiques.
Les protéines peuvent être trouvées sous forme circulante, dans les fluides
physiologiques, où l’environnement physico-chimique module leur conformation. L’état
soluble et relativement dilué des protéines est en général le premier étudié in vitro et est
souvent invoqué comme leur état ‘natif’. Cependant, de nombreuses protéines se trouve
rarement dans cet état in vivo. L’environnement des cellules au sein des tissus, la matrice
extracellulaire (MEC), est par exemple un milieu très dense, constitué de nombreuses
protéines et sucres interagissant les uns avec les autres, et l’ensemble est assimilable à un gel.
Dans la MEC, la conformation, et donc la fonction, d’une protéine, dépendent par exemple
des forces mécaniques appliquées par les cellules, ou des interactions avec les autres
constituants matriciels.
Outre ces états tridimensionnels, dilué ou dense, les protéines peuvent également se
trouver en interactions avec des surfaces. On peut voir ces états comme des états de
dimension 2+1, les deux dimensions de la surface et la dimension d’interaction de la protéine
avec la surface, c'est-à-dire la dimension d’adsorption. Cet état adsorbé des protéines est en
fait implicitement étudié depuis longtemps. Lors d’expériences de biologie cellulaire in vitro,
la fonction biologique de certaines protéines est en effet classiquement évaluée par
l’ensemencement de cellules sur un revêtement de protéines adsorbées sur une surface. Si la
question de la pertinence de ces tests par rapport à l’environnement physiologique
tridimensionnel des cellules dans la MEC peut être posée (Zhang et al, 2005; Cukierman et al,
2002), cet état adsorbé des protéines a cependant un intérêt en tant que tel, autant du point de
vue fondamental qu’appliqué, et notamment dans le contexte du tissu osseux.
L'association étroite des protéines de la MEC à la matrice minérale au sein du tissu
osseux participe directement au contrôle de la morphologie et de la croissance du minéral au
cours de l'ostéogenèse. Cette interaction fait l'objet de nombreuses études, visant tant à
élucider les mécanismes fondamentaux de la minéralisation qu'à élaborer des matériaux
bioactifs de substitution du tissu osseux. Le tissu osseux est par ailleurs un tissu capable de se
régénérer partiellement, et l’élaboration de matériaux mimétiques, capables d’initier cette
16
Introduction
régénération dans le cas de pertes osseuses, constitue une voie majeure de recherche en
ingénierie tissulaire. La connaissance des mécanismes d'adsorption et de structuration de
protéines sur des surfaces minérales semble donc être un préalable tant à la compréhension de
certains phénomènes fondamentaux de la morphogenèse tissulaire qu’à l'élaboration de
matériaux de substitution.
L’interaction protéine-surface est l’un des premiers évènements suivant l’implantation
d’un matériau, ou l’introduction d’une sonde, dans l’organisme et suscite énormément
d’attention dans le domaine biomédical en général. L’adsorption protéique a même
récemment dépassé le contexte de l’ingénierie tissulaire pour atteindre celui des
nanotechnologies (Gray, 2004; Hamada et al, 2004).
Les fonctions des couches protéiques dépendent des propriétés structurales de la
molécule mais aussi de celles de l’assemblage lui-même. La plupart des protéines subissent en
effet des changements de conformation induits par leur adsorption. Ces changements peuvent
par exemple moduler l’exposition ou la conformation du site actif d’une enzyme, ou l’accès
aux domaines de reconnaissance des cellules de protéines de la matrice. La fonction des
protéines adsorbées dépend aussi de leur distribution sur la surface. Par exemple,
indépendamment de leur densité totale, le regroupement en amas de peptides est plus
favorable à l’adhérence cellulaire que leur distribution uniforme sur une surface (Maheshwari
et al, 2000). Si la conformation des protéines et la structure de leur assemblage jouent sur la
fonction d’une couche protéique, elles sont en outre interdépendantes, la conformation
pouvant également jouer sur les interactions protéine-protéine, et donc sur la structure de
l’assemblage.
L’étude des revêtements protéiques nécessite donc de considérer à la fois les
propriétés de la molécule unique, les interactions entre protéines, et leur distribution. L’étude
expérimentale de ces revêtements reste difficile, malgré le développement depuis une
vingtaine d’années de techniques microscopiques comme la microscopie à force atomique,
permettant, en conditions non dénaturantes, d’observer des protéines adsorbées à l’échelle de
la molécule. Une des raisons de la difficulté d’établir un lien entre la structure d’une protéine
et les propriétés de son organisation sur une surface pourrait notamment être due au caractère
en partie aléatoire, ou stochastique, du phénomène. Il n’est ainsi pas rare d’observer en même
temps non pas une mais plusieurs conformations d’une même protéine adsorbée sur une
surface (Antia et al, 2005; Bergkvist et al, 2003). Selon la surface, en général, l’une de ces
conformations prédomine dans la population mais le phénomène à l’échelle microscopique
17
Introduction
semble fluctuant. Des études de modélisation moléculaire prédisent par exemple que la
conformation d’une protéine peut dépendre de son orientation initiale lors du contact avec la
surface (Raffaini et Ganazzoli, 2004). En complément d’observations expérimentales, les
simulations apportent en particulier un moyen d’apprécier les conséquences macroscopiques
de changements dans le comportement de tels systèmes à l’échelle microscopique.
L’objectif du travail présenté ici est l’étude des propriétés d’assemblage d’une
protéine de la MEC, la fibronectine, sur un substitut osseux, l’hydroxyapatite.
L’hydroxyapatite est un matériau dont la structure est très proche de la phase minérale
osseuse, capable d’induire ou de favoriser la minéralisation, seul, ou en revêtement d’autres
matériaux. La fibronectine favorise non seulement l'adhérence de cellules osseuses à un
support mais régule également de nombreux comportements cellulaires vitaux. Le revêtement
de céramiques d’hydroxyapatite par cette protéine matricielle constitue donc une des voies
d'amélioration de l'activité biologique des biomatériaux osseux. La fibronectine est une
protéine flexible, capable d’adopter plusieurs conformations au sein des tissus. Ces
changements de conformation modulent l’exposition des différents domaines de la protéine et
donc sa reconnaissance par les cellules ou ses interactions avec les protéines de la matrice.
Les propriétés biologiques de la fibronectine sont non seulement liées à la conformation du
monomère mais dépendent également étroitement de l’association des molécules de
fibronectine entre elles pour former un réseau fibrillaire. La compréhension des fonctions de
la fibronectine apparaît donc indissociable de l’étude de ses propriétés d’assemblages.
Nous nous intéressons en particulier au lien entre les interactions entre les molécules
de fibronectine, à l’échelle mésoscopique, et les propriétés morphologiques des assemblages
de la protéine, à l’échelle microscopique. Notre étude est menée, d'une part à l'aide de
l'observation expérimentale de la structuration de la fibronectine sur des céramiques
d'hydroxyapatite, et d'autre part au travers du développement d'un modèle proposé
d'adsorption de la fibronectine, étudié par simulations numériques.
Le premier chapitre de ce manuscrit introduit, par une brève étude bibliographique, le
contexte de notre étude. La première partie de ce chapitre décrit les éléments constitutifs du
tissu osseux et leurs interactions dans un contexte physiologique. Elle aborde ensuite les
pathologies entraînant une perte osseuse et présente, de façon non exhaustive, des exemples
de voies de recherche abordées pour constituer des biomatériaux de substitution, en
18
Introduction
particulier, par l’utilisation de l’hydroxyapatite. Cette partie est suivie d’une présentation de la
fibronectine, de ses propriétés structurales et fonctionnelles au sein des tissus, et du lien étroit
entre les deux aspects. Enfin, les concepts et modèles de la littérature utilisés pour décrire et
modéliser l’adsorption de protéines sont exposés dans la troisième et dernière partie de ce
chapitre.
Le deuxième chapitre décrit les méthodes utilisées dans notre étude et en particulier
les protocoles nécessaires à la réalisation de la partie expérimentale, ainsi que les méthodes
utilisées pour le traitement des données expérimentales et numériques.
Le troisième chapitre de ce manuscrit présente et discute les résultats de notre étude.
Dans un premier temps, la stratégie d’obtention d’une céramique d’hydroxyapatite pure est
exposée. Ensuite, les observations expérimentales, de l’adsorption de la fibronectine sur l'HA
et de la dépendance de la structuration de la protéine aux conditions d'adsorption, sont
présentées. Ces résultats permettent de discuter d’un scénario plausible quant aux interactions
impliquées dans la formation des différents types morphologiques observés. L'impact des
propriétés de la molécule, et notamment de sa conformation, sur la morphologie des amas
supramoléculaires formés par adsorption, est ensuite étudié par simulation du modèle
d’adsorption proposé. Les résultats de ces simulations, décrits dans une quatrième partie, sont
discutés par rapport aux modèles de la littérature, puis, comparés aux résultats expérimentaux
dans une cinquième partie. La sixième partie des résultats présente ensuite l’adsorption et la
structuration de la fibronectine sur des matériaux différents de l’hydroxyapatite. Enfin, dans la
septième partie, l’influence de la structuration de la fibronectine sur l’adhérence de cellules
osseuses est évaluée.
Une discussion générale sur l’ensemble des résultats présentés, et les conclusions et
perspectives possibles de ce travail sont exposées dans le dernier chapitre.
19
Introduction
20
Etude Bibliographique
21
22
I.L'interaction protéine/hydroxyapatite, du tissu osseux
aux matériaux bioactifs
I.1.Tissu osseux
I.1.a. Introduction
Le tissu osseux est un tissu conjonctif particulier dont la matrice, comme celle des
dents, possède une phase minérale. C’est également un tissu capable de se régénérer
partiellement.
Il
possède
trois
fonctions
principales,
mécanique,
métabolique
et
hématopoïétique.
Le premier rôle du tissu osseux est une fonction de soutien du corps et de protection
des organes. L’ensemble des os forme le squelette qui constitue la charpente du corps et sert
d’ancrage aux tissus mous (tendon, muscle, ligament). Le tissu osseux est un tissu très
résistant capable de supporter d’importantes contraintes mécaniques. Cependant, loin d’être
un tissu statique, il subit un remodelage permanent sous l’action conjointe des ostéoclastes,
qui dégradent l’os ancien, et des ostéoblastes qui synthétisent la nouvelle matrice minéralisée.
Ce remodelage permet l’adaptation du tissu aux contraintes mécaniques de son
environnement. On observe ainsi une diminution de la masse osseuse chez les spationautes,
qui peut être limitée par l’application quotidienne de stimuli mécaniques pendant le vol
(Goodship et al, 1998).
Le remodelage du tissu osseux est également un moyen de réguler la libération ou le
stockage de minéraux et d’assurer ainsi, conjointement avec l'intestin et les reins, le contrôle
du métabolisme phosphocalcique. L’os contient en effet 98% du calcium de l’organisme dont
environ 1 % est échangeable avec les liquides extracellulaires. La densité de l’os de rats ayant
subit un régime carencé en calcium diminue ainsi par rapport à un régime normal. Cette
carence se traduit en effet par une augmentation du nombre de cellules osseuses différenciées
au sein du tissu (Seto et al, 1999).
Enfin, le tissu osseux, et en particulier les cellules de la moelle osseuse, fournissent un
support structural et fonctionnel aux cellules hématopoïétiques. Les os renferment en effet des
cavités, les espaces médullaires, contenant la moelle hématopoïétique, dont les cellules
souches, à l'origine des 3 lignées de globules du sang, se trouvent au voisinage des cellules
osseuses. Certaines d'entre elles sont des cellules souches pluripotentes, susceptibles de se
différencier dans de multiples lignages (fibroblastes, chondrocytes, ostéoblastes, adipocytes).
23
I.1.b. Structure du tissu osseux
1) Os compact et os spongieux
Le tissu osseux est constitué de deux types d’os, l’os trabéculaire, ou os spongieux, et
l’os cortical, ou os compact (fig.1). L’os compact représente environ 80% de la masse
osseuse. Il est organisé en ostéones ou cylindres de Havers. Ces unités structurales sont
formées de lamelles concentriques autour de canaux conjonctivo-vasculaires, les canaux de
Havers, reliés par des canaux perpendiculaires, les canaux de Volkmann. Ces canaux
permettent l’irrigation du tissu osseux. Le second type d’os est l’os trabéculaire ou spongieux.
Cet os, beaucoup moins dense que le précédent, est organisé en un réseau tridimensionnel de
travées anastomosées. Minoritaire dans le squelette adulte, il est pourtant à la base de tout le
tissu osseux. L’os subit en effet un remaniement permanent. Au cours du développement, le
premier os formé est spongieux. Il est ensuite dégradé puis remplacé par de l’os compact ou
trabéculaire selon sa localisation et sa fonction.
Figure 1. Structure générale du tissu osseux illustrée sur un os long.
L'os cortical remplit essentiellement la fonction mécanique du tissu osseux et l'os
spongieux la fonction métabolique. L’os croît par apposition de cellules et de matrice sur les
surfaces libres du tissu rigide. Cette croissance s’effectue par deux voies. L’ossification
membranaire des os plats (crâne, omoplate) procède directement d’une différenciation des
cellules mésenchymateuses en cellules osseuses, ostéoblastes ou ostéoclastes, tandis que dans
l’ossification endochondrale des os longs une matrice cartilagineuse est d’abord formée puis
remplacée par de l’os.
24
2) Matrice minérale
Le tissu osseux, comme les dents, est un tissu minéralisé. La phase minérale de l’os
représente environ 65% de son poids total. La phase cristalline s’apparente à l’hydroxyapatite
Ca10(PO4)6(OH)2 (fig.2), déposée sous forme de petites aiguilles hexagonales associées à la
matrice organique.
Figure 2. Arrangement des atomes dans la structure cristalline hexagonale de l’hydroxyapatite.
Dans l’os, d’autres éléments sont incorporés dans la structure de l’apatite et
notamment des carbonates, CO32-, substitués aux phosphates ou aux hydroxydes; des ions
fluorure F-, substitués à l’hydroxyde; ou encore des cations, magnésium ou sodium, qui
peuvent se substituer à l’ion calcium. L’hydroxyapatite stœchiométrique a un rapport Ca/P =
5/3 ≅ 1,67. Les tissus jeunes de l’organisme, en rapide renouvellement, contiennent de
l’hydroxyapatite mal cristallisée, relativement soluble, et riche en carbonates. Son rapport
Ca/P est faible et tend vers 1.33. Les tissus âgés, ou moins renouvelés, comme les os plats du
crâne, contiennent des apatites plus cristallisées, et leur rapport Ca/P tend vers celui de
l’hydroxyapatite (Sodek et al, 2000).
3) Matrice organique
Collagène I
Le collagène, protéine la plus abondante du corps humain et composant majoritaire
des matrices extracellulaires, constitue 90% de la matrice organique de l’os. Plusieurs types
de collagène ont été identifiés chez les vertébrés mais l’os est majoritairement constitué de
collagène de type I. Ce sont les cellules osseuses qui synthétisent la matrice osseuse et qui
contrôlent ensuite sa minéralisation. Le minéral est situé dans et autour de la fibre de
collagène (Su et al, 2003). Cette intrication confère à l’os des propriétés mécaniques
remarquables et adaptées à sa fonction de charpente. Les propriétés respectives du collagène
25
ou de l’hydroxyapatite laissent penser que la fibre de collagène confère plutôt au tissu osseux
une résistance à la traction tandis que le minéral apporte la résistance à la compression.
L’association des deux confère au tissu osseux des propriétés mécaniques dont les
mécanismes précis restent cependant à élucider (Hellmich et al, 2004; Rho et al, 1998). Le
collagène est organisé en fibres parallèles au sein de couches superposées et présentant une
alternance de l’orientation des fibres, ce qui donne un aspect lamellaire au tissu osseux. Le
collagène est composé de chaînes polypeptidiques enroulées en triples hélices, réticulées et
elles-mêmes enroulées en superhélices de pas droit au sein des fibres de collagène mature
dans la matrice. Au sein d’une fibre, les fibrilles de collagène sont ordonnées parallèlement,
chaque extrémité étant décalée de 67 nm par rapport l’extrémité des molécules voisines. Les
cristaux d’hydroxyapatite sont intercalés entre ces fibrilles au sein de la matrice (fig.3).
Figure 3. Organisation structurale de l’os (Rho, 1998).
L’arrangement des fibres entre elles dépend de leur emplacement dans l’os (fig.4).
Elles apparaissent ainsi orientées parallèlement près de l’endoste et de façon plus aléatoire au
niveau du périoste des os longs (Su et al, 2003).
Figure 4. Fibres de collagène au sein du tissu osseux observées en MEB.
Les fibres sont observées au niveau de (a) l’endoste et (b) du périoste d’un fémur humain. On peut distinguer
dans les deux cas la périodicité de l’alignement des fibrilles au sein des fibres, indiquée par l’alternance de zones
moins denses (d’après Su, 2003). Les fibres de l’endoste apparaissent plus ordonnées que celle du périoste.
26
En plus de ses fonctions mécaniques, le collagène stimule l’adhérence cellulaire
(Takeuchi et al, 1997) et participe à la régulation de la différenciation ostéoblastique
(Takeuchi et al, 1997; Suzuki et al, 1996).
Outre le collagène qui possède un rôle essentiel de structuration, la matrice
extracellulaire du tissu osseux est constituée de nombreuses protéines non collagéniques, qui,
si elles n’en représentent que 10% en masse, jouent un rôle majeur dans la régulation du
métabolisme du tissu osseux.
Ostéocalcine (OC, Bone Gla Protein)
L’ostéocalcine est la protéine non collagénique la plus abondante de l’os. Elle est
synthétisée principalement par les ostéoblastes. Petite protéine de 5.8 kDa, elle est structurée
en deux hélices α et possède un pont disulfure (Marque et al, 1996). L’une des deux hélices
possède trois résidus γ-carboxyglutamique (résidus GLA) exposés au solvant, et qui ont une
affinité importante pour les ions calcium. L’ostéocalcine est également capable de se lier au
collagène de type I, mais la fonction biologique d’une telle affinité est mal connue (Prigodich
et Vesely, 1997). L’ostéocalcine apparaît comme un inhibiteur de la minéralisation (Hunter et
al, 1996; Romberg et al, 1986; Romberg et al, 1985), cette activité dépendant de la présence
des résidus carboxyliques (Romberg et al, 1986). Malgré son abondance dans l’os, le rôle
exact de l’ostéocalcine est encore mal connu. Un étude récente, qui met en évidence les
propriétés angiogéniques de l’ostéocalcine, suggère qu’elle pourrait intervenir dans la
vascularisation au cours du remodelage ou de la réparation du tissu osseux (Cantatore et al,
2005).
Ostéonectine (ON)
Synthétisée par les ostéoblastes, l’ostéonectine est une protéine de 32 kDa qui serait à
l’origine de la liaison de l’hydroxyapatite avec le collagène (Termine et al, 1981).
L’interaction de l’ostéonectine avec l’hydroxyapatite s’effectuerait via son domaine Nterminal, riche en résidus d’acide glutamique (Fujisawa et al, 1996). Comme l’ostéocalcine,
l’ostéonectine serait un inhibiteur de la minéralisation (Romberg et al, 1986; Romberg et al,
1985).
Ostéopontine (OPN, Bone sialoprotein I)
L’ostéopontine est une protéine de la matrice extra-cellulaire d’environ 65kDa,
27
trouvée majoritairement dans l’os et dans le rein mais également dans de nombreux épithélia
ou dans l’urine, la salive, le lait et la bile. Elle est reconnue par de nombreux récepteurs
cellulaires d’adhérence et notamment les intégrines αvβ3 des ostéoclastes (Flores et al, 1996).
Elle possède également un domaine contenant une séquence d’acide aspartique répétée qui lui
confèrerait son affinité pour l’hydroxyapatite (Goldberg et al, 2001). L’ostéopontine est
également capable d’interagir avec le collagène (Kaartinen et al, 1999), l’ostéocalcine ou la
fibronectine (Giachelli et Steitz, 2000). Dans l’os, elle participe à la régulation de l’adhérence
des cellules osseuses (Grzesik et Robey, 1994) et de l’activité de résorption ostéoclastique
(Razzouk et al, 2002).
Elle possèderait également un rôle d’inhibition de la formation
osseuse. In vitro, l’ostéopontine inhibe en effet la formation et la croissance de
l’hydroxyapatite (Hunter et al, 1994; Boskey et al, 1993) ainsi que la prolifération et la
différenciation ostéoblastique (Huang et al, 2004). L’accumulation de l’ostéopontine dans le
cas de lésions athérosclérotiques ou de calculs rénaux par exemple, suggère enfin un rôle de
protection de l’ostéopontine contre la minéralisation dans les tissus mous (Wada et al, 1999).
Bone sialoprotein II (BSP)
La BSP est une protéine d’environ 33kDa, qui possède deux domaines poly-glutamate
qui lui confèrent son affinité pour l’hydroxyapatite (Fujisawa et al, 1997). Comme la plupart
des protéines de la matrice osseuse, la BSP possède un domaine d’affinité au collagène de
type I (Tye et al, 2005). Elle est également reconnue par les récepteurs d’adhérence des
cellules osseuses (Flores et al, 1996) ou de fibroblastes (Harris et al, 2000). La BSP est
capable d’induire la formation de l’hydroxyapatite in vitro (Harris et al, 2000) et possèderait
ainsi un rôle de nucléateur de la minéralisation in vivo, ce que suggère sa synthèse corrélée au
début de la minéralisation (Yao et al, 1994).
Vitronectine (Vn)
La vitronectine est une glycoprotéine de 75 kDa, ubiquitaire des matrices
extracellulaires, Elle stimule l’adhérence, la migration ou la prolifération de nombreuses
cellules (Schvartz et al, 1999). Elle favorise l’adhérence (Grzesik et Robey, 1994) et la
différenciation (Salasznyk et al, 2004) des ostéoblastes. Reconnue par le récepteur principal
des ostéoclastes, l’intégrine αVβ3 (Helfrich et al, 1992), elle pourrait également participer,
avec l’ostéopontine, à leur ancrage à la matrice.
28
Thrombospondines
Les thrombospondines sont des protéines multimériques de 400/500 kDa trouvées
dans la plupart des matrices extracellulaires conjonctives. Parmi les 5 thrombospondines
identifiées chez les vertébrés, les thrombospondine 1 et 2 sont les plus abondamment
synthétisée par les cellules osseuses (Carron et al, 1999). Ce sont des protéines trimériques
qui favorisent notamment l’adhérence et la prolifération cellulaire (Adams et Lawler, 2004) et
présentent des sites d’affinités pour le collagène, la fibronectine, et les récepteurs d’adhérence
cellulaire. Dans l’os elles sont fortement exprimées dans la matrice sécrétée par les
ostéoblastes lors de la formation osseuse, et est parfois détectées dans la matrice minéralisée
(Robey et al, 1989). Les thrombospondines 1 et 2 favoriserait la résorption ostéoclastique
(Hankenson et al., 2005; Carron et al, 1995)
Fibronectine (Fn)
La fibronectine est une protéine majeure des matrices extracellulaires, impliquées dans
de la régulation de nombreux processus cellulaires et dans l’organisation de la matrice. Dans
l’os elle possède notamment un rôle dans la différenciation et la survie des ostéoblastes. La
fibronectine est particulièrement exprimée au cours du développement endochondral de l’os
(Weiss et Reddi, 1981). Les nombreuses fonctions de la fibronectine au sein des matrices
extracellulaires des tissus conjonctifs, et du tissu osseux en particulier, seront présentées dans
le chapitre suivant.
4) Cellules
Ostéoblastes
Les ostéoblastes sont des cellules de 20 à 30 µm de diamètre. Ils sont généralement
disposés en rangées à la surface de la matrice organique qu’ils synthétisent. Leur
différenciation, à partir des cellules mésenchymateuses présentes dans le périoste et dans le
stroma de la moelle osseuse, est induite par des facteurs autocrines, les bone morphogenetic
proteins (BMP) (Canalis et al, 2003). Ces protéines sont ainsi capables d’induire une synthèse
d’os lorsqu’elles sont injectées dans un autre tissu conjonctif (Jane et al, 2002). Les
ostéoblastes matures adoptent une forme cuboïdale. Les ostéoblastes, responsables de la
formation de l’os, se caractérisent par une synthèse intense de protéines de la matrice et la
présence d’une phosphatase alcaline membranaire.
29
Ostéocytes et cellules bordantes.
Au fur et à mesure que la matrice est synthétisée et minéralisée, certains ostéoblastes
sont emprisonnés dans des cavités, les ostéoplastes. Ces cellules, appelées ostéocytes, sont
reliées aux ostéoblastes en surface et assurent la transmission de signaux ioniques, hormonaux
et mécaniques dans l’os. Ils synthétisent du collagène I, déposé dans l’ostéoplaste, et
joueraient ainsi un rôle de maintenance de la matrice osseuse (Knothe Tate et al, 2004).
Les cellules bordantes sont des ostéoblastes au repos, susceptibles, s'ils sont sollicités,
de redevenir des ostéoblastes actifs. Elles revêtent les surfaces osseuses qui, à un moment
donné, ne sont soumises ni à formation ni à résorption osseuse. Ce sont des cellules aplaties et
allongées, possédant peu d'organites et reliées entre elles et avec les ostéocytes voisins par des
jonctions communicantes.
Ostéoclastes
Les ostéoclastes sont, avec les odontoclastes de la dentine, les seules cellules capables
de résorber la matrice minérale. Les ostéoclastes sont formés à partir de la fusion de préostéoclastes issus de cellules hématopoïétiques de la moelle (Solari et al, 1996; Jotereau,
1985). Ce sont des cellules très volumineuses, de 20 à 100 µm de diamètre, plurinucléées
(entre 4 et 20 noyaux), capables de se déplacer à la surface des travées osseuses d'un site de
résorption à un autre.
I.1.c. Dynamique de remodelage
Environ 5 % de la masse osseuse totale sont renouvelés annuellement chez l’adulte. Ce
phénomène appelé remodelage osseux s’effectue dans des unités de remodelage
fonctionnellement indépendantes (fig.5) d’environ 100µm de diamètre, appelées, d’après
Frost, les Basic Multicellular Unit ou BMU (Parfitt, 2002).
30
Figure 5. Unité de remodelage du tissu osseux : Basic Multicellular Unit (BMU).
(d’après US Department of Health and Human Services, Bone Health and Osteoporosis: A Report of the
Surgeon General)
Au cours de la croissance de l’organisme, la phase de formation est supérieure à la
résorption, puis la balance se stabilise jusqu’aux environs de 35 ans. A partir de cet âge la
résorption devient supérieure à la formation, et l’organisme subit une perte osseuse, pouvant
aller jusqu’à 40% de perte chez une femme après la ménopause. Le remodelage de l’os est en
effet sous contrôle hormonal et notamment sous le contrôle de l’œstradiol. Un cycle de
remodelage dure quelques mois et commence par une phase de résorption osseuse d’une à
deux semaines, suivie d’une période de formation osseuse d’environ trois mois (fig.6).
Figure 6. Représentation schématique des différentes phases du remodelage osseux.
31
Quiescence
Des ostéoblastes quiescents, les cellules bordantes, recouvrent la surface osseuse et
empêchent ainsi son accès aux ostéoclastes. Environ 80% du tissu osseux se trouve dans cet
état. Suite à une stimulation, hormonale ou mécanique, le processus de remodelage va être
activé. On sait en effet que les cellules osseuses sont sensibles aux stimuli mécaniques
(Turner, 1998) qui modulent la signalisation intracellulaire (Granet et al, 2001). Leur activité
serait également régie par des facteurs endocrines et auto/paracrines (D'ippolito et al, 2002;
Karsenty, 2000). La localisation des BMU n’est d’ailleurs pas corrélée avec celle des microfractures de l’os. Cependant, ces BMU se déplacent une fois le remodelage initié et un modèle
mathématique, qui tient compte de ce déplacement à partir de la fracture d’origine, montre
ainsi qu’en moyenne les BMU se trouvent plutôt éloignées des fractures, indiquant qu’une
stimulation du remodelage exclusivement mécanique n’est pas improbable (Martin, 2002).
Certains auteurs suggèrent même que la localisation des BMU pourrait en fait résulter d’un
processus stochastique (Parfitt, 2002).
Activation
La phase d’activation du remodelage consiste en la migration de pré-ostéoclastes qui
vont fusionner pour donner les ostéoclastes. La rétraction des cellules bordantes permet
l’ancrage des ostéoclastes à la matrice par l’intégrine αvβ3 (Engleman et al, 1997; Lakkakorpi
et al, 1993). La sécrétion par les ostéoblastes de protéines matricielles, comme l’ostéopontine,
qui favorisent l’adhérence des ostéoclastes, participe à ce recrutement (Uemura et al, 2001).
La différenciation et l’activation des ostéoclastes requièrent également la présence de cellules
ostéoblastiques (Suda et al, 1997; Jimi et al, 1996). Les ostéoblastes produisent ainsi le mCSF (macrophage Colony Stimulating Factor), facteur de survie des précurseurs
ostéoclastiques (Fuller et al, 1993). L'interaction entre un récepteur membranaire des
ostéoclastes, RANK (Receptor Activator of Nuclear Factor Kappa B), et un ligand
membranaire des ostéoblastes, RANKL, stimule ensuite la différenciation de ces précurseurs
et leur fusion (fig.7). L'ostéoblaste sécrète enfin également un facteur soluble, l'OPG
(Ostéoprotégérine), qui, en se fixant au récepteur de RANK, inhibe l'interaction avec les
ostéoclastes et l'activation de leur différenciation. Les hormones et facteurs locaux, PTH,
vitamine D3, ou interleukines de la famille des IL-6, agissent sur l'ostéoblaste en augmentant
la balance RANKL/OPG et induisent donc le passage de la phase de formation à la phase de
résorption (Quinn et Gillespie, 2005).
32
Figure 7. Interactions entre ostéoblastes et ostéoclastes :activation des ostéoclastes.
(d’après le US Department of Health and Human Services, Bone Health and Osteoporosis: A Report of the
Surgeon General)
Résorption
Lorsqu'il est activé, l'ostéoclaste développe son appareil lysosomal et se polarise
fortement. Sa membrane plasmique se différencie en deux domaines séparés par un anneau
étanche de jonctions cellule-MEC, et le domaine basal développe une bordure en brosse au
contact de la surface osseuse (fig.8). La zone de contact de l’ostéoclaste avec la matrice
osseuse délimite un compartiment étanche, la lacune de résorption, dont l’acidification, via
une ATPase à protons vacuolaire des ostéoclastes, permet la dissolution de la phase minérale
de la matrice osseuse et l’activation des cathepsines et collagénases lysosomales, sécrétées par
l’ostéoclaste, qui dégradent la matrice protéique (Rousselle et Heymann, 2002; Lerner, 2000;
Väänänen et al, 1998).
Figure 8. Résorption de la matrice osseuse par un ostéoclaste
Inversion
Les ostéoclastes libèrent des facteurs de croissance, et notamment le TGF-β, qui active
le recrutement des pré-ostéoblastes (Bonewald et Dallas, 1994) et inhibe leur différenciation
33
(Alliston et al, 2001) induisant ainsi l’accumulation de pré-ostéoblastes à proximité de la zone
de résorption. Il induit également l’apoptose des ostéoclastes (Greenfield et al, 1999;
Roodman, 1999). La diminution du TGF-β qui s'ensuit permet alors au pool d’ostéoblastes
précédemment recrutés de poursuivre leur différenciation, et le remodelage bascule en phase
de formation osseuse (fig.9). En parallèle, l’afflux de calcium extracellulaire, résultant de la
dissolution de la phase minérale pourrait aussi contribuer à l’inhibition de la différenciation et
de l’activité ostéoclastique (Kanatani et al, 1999; Kameda et al, 1998).
Figure 9. Interactions entre ostéoblastes et ostéoclastes :phase d’inversion du remodelage.
Formation
Les ostéoblastes tapissent ensuite la lacune de résorption et sécrètent à la surface de la
couche matricielle existante une nouvelle matrice. Plusieurs hormones, notamment les
oestrogènes (Cao et al, 2003) et les androgènes (Notelovitz, 2002), ainsi que la vitamine D
(Bellows et al, 1999), régulent la production de cette matrice. La matrice néoformée, appelée
tissu ostéoïde, est ensuite rigidifiée par les dépôts de phosphate de calcium lors de la
minéralisation. La nouvelle matrice atteint ainsi environ 20µm d’épaisseur en un mois. Au
cours de cette formation osseuse, certains ostéoblastes restent piégés dans la matrice osseuse,
ils deviendront les ostéocytes. La minéralisation progressive du tissu ostéoïde s’effectue par
transfert du calcium et du phosphate, du milieu extra-cellulaire aux sites de nucléation
présents sur le collagène, à la fois par diffusion passive et par transport actif grâce aux
pompes à calcium de la membrane de l’ostéoblaste (Francis et al, 2002) et à des transporteurs
de phosphate sodium-dépendants (Veldman et al, 1997). Un autre mécanisme implique les
phosphatases alcalines membranaires de l’ostéoblaste, qui dégradent les pyrophosphates
inorganiques, inhibiteurs de la calcification, et augmente ainsi le taux de phosphates
nécessaires à la minéralisation (Hessle et al, 2002). Les protéines non collagéniques de la
34
matrice osseuse, possédant notamment des sites de liaison au calcium, participent également à
la mise en route et au contrôle de la minéralisation.
I.1.d. Biominéralisation et Protéines non collagéniques
1) Biominéralisation et hétéronucléation
Les mécanismes de régulation du processus de remodelage du tissu osseux dépendent
des interactions entre ostéoblastes et ostéoclastes. Au niveau moléculaire, la formation
osseuse, ou biominéralisation, nécessite l’intervention des protéines de la matrice
extracellulaire.
La synthèse in vitro d'hydroxyapatite (HA) requiert en effet des conditions de
température et de pression drastiques et très contrôlées (Raynaud et al, 2002b). La
minéralisation implique la formation puis la croissance de nuclei stables à partir des ions en
solutions. Les conditions de réalisation thermodynamique de cette formation minérale
dépendent notamment des concentrations et du produit de solubilité des ions considéré.
Lorsque la minéralisation est favorisée ou accélérée par l’addition d’éléments différents des
composants du cristal (et donc l’addition de protéines) on parle d’hétéronucléation (Ball et
Voegel, 2003).
La morphologie du cristal biologique présente des caractéristiques qui supposent un
contrôle fin (Cuisinier, 1996; Hunter, 1996). La synthèse et la localisation des protéines de la
MEC de l'os sont par ailleurs corrélées au processus de minéralisation (Sodek et al, 2000;
Sommer et al, 1996). Ces observations ont conduit depuis longtemps à penser que les
interactions entre les protéines de la MEC et la matrice minérale dans le tissu osseux sont à
l'origine du contrôle biologique de la morphologie et de la croissance du cristal au cours de la
biominéralisation chez les mammifères. Certaines activités de ces protéines sur la formation
et la croissance de l'hydroxyapatite ont ainsi été mises en évidence in vitro.
2) Activités régulatrices de la minéralisation in vitro
Le collagène 1 seul est incapable d’induire la minéralisation in vitro (Couchourel et al,
1999; Saito et al, 1997; Hunter et al, 1986). La Bone Sialoprotein 2 (BSP), en revanche,
entraîne la précipitation du calcium et du phosphate en solution, en conditions non saturantes,
et active ainsi la nucléation de l'hydroxyapatite (Harris et al, 2000; Hunter et Goldberg, 1993).
L'ostéopontine (OPN) inhibe la croissance du cristal (Hunter et al, 1996; Boskey et al, 1993),
35
tandis que l’ostéocalcine (OC) inhiberait la croissance (Romberg et al, 1986) et/ou la
nucléation (Hunter et al, 1996) de l’apatite. Le rôle de l’ostéonectine (ON) semble moins
clair. Selon les études elle inhibe (Romberg et al, 1986) ou ne modifie pas la croissance
(Hunter et al, 1996). L’effet des protéines sur la minéralisation dépend en fait de leur
concentration et de leur immobilisation. Ainsi, la Fibronectine en solution inhibe la nucléation
de l’HA mais pas sa croissance (Couchourel et al, 1999). Incluse dans un gel, elle ne montre,
comme le collagène I, aucun effet sur la nucléation du cristal mais favorise la croissance en
présence de cristaux d’HA déjà formés (Couchourel et al, 1999). Le fibrinogène en solution
inhibe également la formation d’hydroxyapatite alors que son adsorption sur une surface
hydrophobe permet d’activer la nucléation, suggérant une exposition de sites spécifiques de la
protéine à la surface (Tsortos et al, 1996).
L’activité des protéines sur la minéralisation des phosphates de calcium, et la
morphologie des cristaux formés dépendent également de la concentration de la protéine.
L’albumine favorise ainsi la croissance d’octacalcium phosphate à faible concentration et
l’inhibe à forte concentration (Combes et Rey, 2002). La confusion viendrait en fait de la
difficulté à différencier dans les systèmes expérimentaux utilisés, les phases de nucléation et
de croissance cristalline (Ball et Voegel, 2003; Combes et Rey, 2002). Une protéine peut ainsi
stabiliser les nuclei à faible concentration mais par là même défavoriser la croissance dans un
plan du cristal à plus forte concentration, lorsqu’elle est adsorbée sur la surface (Flade et al,
2001).
3) Un motif commun responsable de l’activité protéique?
Plusieurs équipes ont essayé de dégager des caractéristiques structurales communes
afin de prédire les activités des protéines sur la minéralisation et de comprendre les
mécanismes sous-jacents.
L’activité d’inhibition de la minéralisation de l’OPN nécessite la présence d’une
séquence poly-Asp ainsi que la phosphorylation de la protéine (Jono et al., 2000 ; Hunter et
al., 1994). L'une des hypothèses est en effet que l'accumulation locale de phosphate de
calcium serait dirigée par les séquences de polyacides des protéines. La distance entre 2
carboxyles dans une structure en hélice GLA de l’ostéocalcine correspond par exemple à la
distance entre les ions calcium (0,545 nm) dans le plan de croissance de l'HA (Flade et al,
2001). Des polymères d’acide aspartique inhibent ainsi la croissance de l’hydroxyapatite
(Hunter et al, 1994). Certaines protéines dont la structure est proche, comme l'ostéonectine et
36
la BSP, dont les séquences possèdent toutes deux un domaine poly-glutamate qui interagit
avec l'HA (Goldberg et al, 2001; Fujisawa et al, 1996), ont pourtant des rôles antagonistes sur
la minéralisation (Harris et al, 2000; Fujisawa et al, 1996). Par ailleurs, la BSP possède deux
motifs poly-Glu dont seul l’un favorise la nucléation de l’hydroxyapatite (Harris et al, 2000),
des séquences poly-glu isolées étant, elles, activatrices de la croissance de l'hydroxyapatite
(Fujisawa et al, 1996; Hunter et Goldberg, 1994). Les poly-Asp et les poly-Glu présentent une
affinité comparable pour l’hydroxyapatite (Tsortos et Nancollas, 1999) et la différence
d’activité entre les deux types d’acides pourrait en fait résider dans la morphologie des
cristaux formés (Eiden-Assmann et al, 2002; Matsumoto et al, 2002).
Cette interaction entre les acides glutamiques, γ-carboxyliques, aspartique ou
phosphoriques, et les phosphates de calcium pourrait cependant constituer un mécanisme
général d’interaction entre les protéines et l’HA (Kirkham et al, 2002; Hunter, 1996).
L’alignement de groupements carboxyliques en deux dimensions induit ainsi la formation
d’hydroxyapatite (Sato et al, 2001).
Les effets des protéines matricielles sur la minéralisation ne sont pas clairement
élucidés et semblent dépendre du système d'étude, de leur conformation, de leur concentration
et de la présence ou non d'autres molécules avec lesquelles elles peuvent interagir (Cuisinier,
1996; Hunter, 1996; Boskey, 1996). Devant l'incohérence apparente de certains résultats
expérimentaux, des auteurs ont suggéré que la stabilisation et l'orientation de la croissance des
amas de calcium et de phosphate ne dépendraient que des contraintes spatiales imposées par
les protéines matricielles et non pas d'interactions spécifiques avec le cristal (Cuisinier, 1996).
La stathérine est une protéine de la salive qui participe à la minéralisation du tissu
dentaire. Elle possède un motif commun avec l’ostéopontine (Asp-pSer-pSer-Glu-Glu), lieu
de son affinité pour l’HA. La stathérine, qui inhibe la croissance de l’hydroxyapatite (Raj et
al, 1992) interagit avec le cristal via ce domaine N-terminal dont la structuration en hélice
favoriserait l’alignement des groupements phosphates et aspartate sur le motif cristallin de
l’HA (Long et al, 2001; Long et al, 1998). Cette activité dépend de l’alignement de charges
négatives mais pas d’un motif particulier. La déphosphorylation des serines du domaine Nterminal de la stathérine résulte en effet en une perte de l’activité d’inhibition de la croissance,
mais leur substitution par des résidus aspartate permet de recouvrer cette activité (Raj et al,
1992). L’importance du nombre et de l’alignement de résidus porteurs de charges négatives
est confirmée par l’étude de peptides recombinants de l’ostéopontine qui montre que l’activité
inhibitrice de la croissance de l’HA varie en fonction du peptide, de l’organisation des résidus
au sein de la séquence, et de la phopshorylation des résidus Serine (Pampena et al, 2004).
37
Les constituants de la matrice extracellulaire semblent jouer un rôle important dans le
processus d’ossification en favorisant et en orientant la minéralisation. Les mécanismes par
lesquels les ions calcium et phosphate s'accumulent localement et selon un motif ordonné sont
cependant encore mal connus. La déficience en certaines protéines de la matrice
extracellulaire conduisant au développement d’un squelette normal à la naissance (Boskey et
al, 1998; Liaw et al, 1998) suggère en outre l’existence de mécanismes redondants ou de
compensation partielle des différentes activités au sein de la matrice. Si l’étude de
l’interaction protéines matricielles/hydroxyapatite est nécessaire à la compréhension de
certains mécanismes de la minéralisation, elle est également l’un des aspects de l’élaboration
de biomatériaux se substituant au tissu osseux.
I.2. Biomatériaux hybrides ostéoinducteurs
I.2.a. Pertes osseuses et nécessité d’un comblement prothétique
Certaines pathologies du tissu osseux entraînent un excès de formation osseuse, c’est
le cas de l’ostéopétrose, qui se traduit par une augmentation générale de la masse osseuse, un
épaississement des os, et donc une diminution de la cavité médullaire contenant les
précurseurs hématopoïétiques. Cette maladie, qui résulte de mutations de gènes impliqués
dans la résorption, et entraine une activité ostéoclastique réduite, reste cependant rare chez
l’homme (Bakeman et al, 1998). On trouve également des pathologies, comme la maladie de
Paget, dans lesquelles le remodelage osseux est excessif et désordonné et conduit à une
dysmorphie du squelette. Cette maladie est liée à une suractivité des ostéoclastes (jusqu’à
vingt fois la normale dans les cas les plus graves), qui accélère le remodelage et conduit les
ostéoblastes à former une matrice désorganisée (Roodman et Windle, 2005).
La cause la plus fréquente des troubles du tissu osseux reste cependant la perte
osseuse. Celle-ci peut-être d’origine traumatique, dans le cas de fractures accidentelles, ou
indirectement des suites d’un cancer, ou d’une pathologie très fréquente, et notamment chez la
femme âgée, l’ostéoporose.
Jusqu'à l'âge de 20 ans, la masse osseuse augmente progressivement. A cet âge, le
capital osseux est constitué ; il reste stable pendant quelques années, puis diminue lentement
avec l'âge, chez la femme comme chez l'homme, la résorption du tissu osseux l'emportant sur
la formation, à cause par exemple d’une insuffisance en vitamine D ou un défaut d’absorption
38
du calcium. Chez la femme, la perte osseuse s'accélère nettement à la ménopause, du fait de la
carence en œstrogènes. L’ostéoporose est une pathologie du tissu osseux dans laquelle le
comblement de la lacune de résorption, au cours de la phase de formation osseuse, est
insuffisant, ce qui induit une désorganisation de l’architecture du tissu osseux et le fragilise
(Seeman, 2002). L’ostéoporose augmente ainsi considérablement le risque de fracture, et est
notamment la cause majeure des fractures du col du fémur.
La présence de cellules cancéreuses dans l’os peut également conduire à l’apparition
de lésions osseuses localisées appelées ostéolyses. Certaines métastases libèrent en effet des
facteurs susceptibles de stimuler localement l’activité de résorption des ostéoclastes (Bendre
et al, 2003). Enfin, l’exérèse de ces métastases peut également conduire à une perte osseuse
importante (Langlais et al, 2005).
L’os est un tissu capable de se régénérer, du moins partiellement. Suite à la destruction
tissulaire et à l’hémorragie causées par une fracture, des signaux chémo-attractants et
d'angiogenèse attirent sur place les cellules impliquées dans les phases initiales du processus
de réparation. Les granulocytes neutrophiles et les macrophages éliminent localement les
débris cellulaires. Les cellules mésenchymateuses et les capillaires sanguins prolifèrent et
permettent la formation de tissu conjonctif puis de tissu cartilagineux qui forment un cal et
comblent le foyer de fracture. Parallèlement, les cellules ostéoprogénitrices (du périoste et de
l'endoste) prolifèrent et se différencient en ostéoblastes qui fabriquent du tissu ostéoïde qui
progressivement remplace l'ébauche cartilagineuse du cal qui se calcifie. Le cal osseux est
ensuite remodelé par les ostéoclastes pour restaurer la forme originale de l'os fracturé. Les
deux extrémités d’un os fracturé ont ainsi une tendance spontanée à se souder pour autant
qu’il y ait un contact entre eux et une immobilisation relative des fragments. La régénération
‘naturelle’ de l’os est insuffisante dans le cas de pertes importantes, ou d’une diminution de la
synthèse osseuse, comme dans le cas de l’ostéoporose. Le comblement de ces pertes nécessite
alors l’utilisation de matériaux prothétiques.
I.2.b. Matériaux de substitution
Un biomatériau se définit comme un matériau qui interagit avec les systèmes
biologiques pour traiter, renforcer ou remplacer un tissu. En plus d’être biocompatibles, c’est
à dire de ne pas induire de réaction inflammatoire de l’organisme, les biomatériaux doivent
résister à l’usure mécanique et à la corrosion. En orthopédie, on distingue essentiellement
39
quatre types de matériaux, les matériaux biologiques, les métaux, les polymères, et les
céramiques.
1) Matériaux biologiques : greffes osseuses et risques associés
Le comblement d’une perte osseuse peut s’effectuer à l’aide d’os provenant du patient
lui-même (autogreffe), d’un donneur d’organes (allogreffe) ou encore d’un individu d’une
espèce différente (xénogreffe). Le site de prélèvement d’une autogreffe est le plus souvent
l’os spongieux du bassin (os iliaque). Plus rarement, de l’os cortical, plus solide, est prélevé
sur la face interne du tibia. La greffe est utilisée pour sa qualité de support naturel à la
recolonisation osseuse en cas de perte de substance. Cependant, l’allogreffe pose des
problèmes évidents de compatibilité et de rejet, et l’autogreffe, de traumatismes et de risques
associés à un deuxième site d’opération chez le patient (fractures de la zone donneuse, pertes
sanguines, douleurs). Ainsi, l’autogreffe à partir de l’os iliaque peut-elle parfois entraîner de
graves complications, et, beaucoup plus fréquemment, des douleurs persistant à long terme
chez le patient (Russell et Block, 2000). C’est pourquoi la recherche s’est considérablement
développée afin d’élaborer des matériaux de synthèse répondant aux contraintes mécaniques
et fonctionnelles nécessaires à leur substitution du tissu osseux. L’impact du développement
de ces substituts osseux sur le plan économique est par ailleurs considérable puisque leur
utilisation, si elle réduit les risques pour le patient, permettrait également de réduire la durée
du séjour d’hospitalisation.
2) Implants métalliques : résistance mécanique
L’emploi de matériaux de substitution du tissu osseux a pour premier objet le
comblement de la fonction mécanique du squelette. Dans cette optique, les implants
métalliques en majorité à base de titane ou d’acier (Degasne et al,. 1999; Mc Donald et al.,
2002) sont largement utilisés. Ces matériaux biocompatibles ne possèdent cependant pas
d’activité biologique. En plus d’une certaine résistance intrinsèque, la stabilité mécanique des
implants dépend en effet d’une synthèse rapide d’os par le tissu environnant. Le tissu restauré
au contact d’une surface de titane, par exemple, forme une capsule fibreuse entourant
l’implant et l’isolant du tissu osseux. Cette capsule de tissu fibreux cause l’apparition de
micro mouvements provoquant à la longue le descellement des prothèses. Mis en contact avec
le milieu biologique, le métal peut également subir une corrosion et libérer des ions dans
40
l’organisme (Okazaki et al, 2004). Ces produits de corrosion peuvent être cytotoxiques,
entraîner l’ostéolyse, ou encore favoriser l’apparition de tumeurs selon la nature des métaux
(Sargeant et Goswami, 2005).
3) Implants polymères :mise en forme et résorbabilité
Il s’agit d’une famille de matériaux très diversifiée et dont les applications
thérapeutiques sont très variées. Ils sont le plus souvent utilisés comme matériel de suture ou
de comblement. Ainsi, le polyéthylène (PE) est implanté comme matériau de surface de
frottement dans les prothèses articulaires (Boileau et al, 2002). D’autres, le plus souvent
dérivés du polymethylmethacrylate (PMMA) (Moursi et al, 2002; Filmon et al, 2002; Wyre et
Downes, 2002; McFarland et al, 1999), sont employés comme ciments chirurgicaux, assurant
une adaptation morphologique des implants à l’os et leur conférant ainsi une stabilité
immédiate. Les implants de type polymères présentent cependant des limites dues à
l’observation de la contraction du ciment voire un endommagement des tissus dû au
dégagement de chaleur se produisant lors de réaction de polymérisation exothermique. La
faillite progressive de la fixation de la prothèse menace également l'évolution à long terme des
prothèses en particulier de celles qui sont cimentées. Les débris d’usure des polymères,
soumis à des contraintes excessives, entraînent alors une réaction macrophagique qui va
détruire l'os et desceller la prothèse (Eschbach, 2000). Cependant, outre leur facilité de mise
en forme, certains polymères, comme l’acide polylactique et ses dérivés, sont résorbables par
l’organisme. Ils favorisent l’ancrage et la synthèse de matrice organique par les ostéoblastes et
constituent l’une des voies d’amélioration des propriétés biologiques des polymères, dans le
domaine de l’ingénierie du tissu osseux (El Amin et al, 2003; El-Amin et al, 2002; Yang et al,
2001).
4) Hydroxyapatite (HA)
Les céramiques sont des matériaux solides, non métalliques et non organiques,
obtenus par compression à chaud (frittage). Certaines sont capables de liaison chimique avec
l’os. Elles sont utilisées en orthopédie soit comme en revêtement d’autres matériaux, soit
directement comme substituts osseux. Chimiquement stables, elles sont quasiment insensibles
à la corrosion. Différentes céramiques peuvent être utilisées, comme l’alumine ou la zircone,
mais les plus couramment utilisées sont des céramiques de phosphate de calcium, et
notamment d’hydroxyapatite (HA).
41
L’hydroxyapatite, constituant majoritaire de la phase minérale osseuse, présente,
contrairement à de nombreux autres matériaux, des propriétés d’ostéoconduction, c'est-à-dire
la capacité à recevoir la repousse osseuse par invasion vasculaire et cellulaire.
L’intégration des implants métalliques au tissu hôte peut ainsi être améliorée par
application d’hydroxyapatite en recouvrement des implants afin de combiner les propriétés
bioactives de la surface céramique à la résistance mécanique du métal sous-jacent (fig.10). Le
recouvrement par de l’hydroxyapatite d’un implant en titane permet ainsi d’établir une liaison
directe avec le tissu osseux sans apparition de tissu fibreux (Soballe et al, 1993).
Figure 10. Restauration du tissu osseux au contact d’un implant de titane (tiré de Bonel, 1998).
(a) Implant en titane dans un tissu osseux. La couche blanche (flèche) autour de l’implant correspond à du tissu
fibreux. (b) Implant en titane revêtu d’hydroxyapatite dans un tissu osseux.
L’hydroxyapatite améliore la stabilité mécanique de l’implant en favorisant
l’apposition de tissu osseux (Lind et al, 1999). Comme les métaux, le recouvrement des
polymères par de l’apatite améliore également significativement leurs propriétés biologiques.
L’association d’HA au PMMA stimule ainsi la prolifération, la différenciation et augmente le
degré de minéralisation ostéoblastiques (Moursi et al, 2002; Dalby et al, 2002a; Dalby et al,
2001). Son adjonction au PE stimule par ailleurs l’ancrage des ostéoblastes au polymère (Di
Silvio et al, 2002). Les essais cliniques chez l’homme ont en effet montré que le
recouvrement de prothèses de hanches par de l’hydroxyapatite favorise largement
l’intégration de l’implant (Geesink, 2002; Geesink, 1990).
L’hydroxyapatite peut également être employée seule, sous forme céramisée. A
topologie de surface égale, les céramiques de phosphates de calcium présentent en effet une
meilleure ostéoconduction que les métaux (Matsuura et al, 2000). L’association de
l’hydroxyapatite au titane à la surface d’implant favorise ainsi la différenciation
ostéoblastique (Ramires et al, 2001). Les céramiques d’hydroxyapatite sont non seulement
ostéoconductrices, mais également ostéoinductrices, c'est-à-dire capables d’induire la
formation osseuse. Ainsi, l’implantation d’HA dans le tissu musculaire induit-elle la
formation osseuse (Kurashina et al, 2002; Yuan et al, 2001; Yuan et al, 1999; Ripamonti,
1996).
42
L’intégration de l’hydroxyapatite au tissu osseux viendrait en fait de sa capacité
d’adsorption de protéines sériques adhésives (Kilpadi et al, 2001). La meilleure adhérence de
précurseurs ostéoblastiques sur l’hydroxyapatite par rapport au titane est ainsi directement
corrélée à une adsorption plus importante de fibronectine et de vitronectine sur la céramique,
cette adsorption impliquant la reconnaissance de récepteurs cellulaires spécifiques (Kilpadi et
al, 2001). De plus, l’inhibition compétitive de la reconnaissance de la fibronectine et de la
vitronectine diminue l’étalement cellulaire sur l’hydroxyapatite, mais pas sur le titane
(Matsuura et al, 2000), confirmant l’intervention de mécanismes cellulaires spécifiques à
l’origine de la meilleure biocompatibilité de l’hydroxyapatite.
I.2.c. Biomatériaux hybrides ostéoinducteurs
1) Ostéoinduction et Ingénierie tissulaire
La recherche en biomatériaux s’attache depuis une vingtaine d’années non plus
seulement à élaborer des matériaux capables d’assurer passivement les fonctions
essentiellement mécaniques de soutien ou de remplacement d’un tissu endommagé, mais
également à fonctionnaliser ces matériaux, à les rendre ‘bioactifs’, dans le but d’accélérer leur
intégration au tissu hôte mais également d’induire une fonction au sein de ce tissu.
Dans ce cadre, l’ingénierie du tissu osseux est particulièrement développée (Petite,
2002; Hardouin et al, 2000). Le développement de matériaux capables d’induire la synthèse
osseuse consiste en l’association d’éléments cellulaires et moléculaires au matériau afin
d’accélérer la synthèse du tissu ostéoïde et la minéralisation qui suit, on parle alors de
biomatériaux ‘hybrides’. Un biomatériau osseux idéal doit ainsi établir une liaison stable en
continuité avec le tissu environnant, favoriser l’activité ostéoblastique de formation osseuse
mais également l’activité ostéoclastique de remodelage complémentaire nécessaire à son
intégration parfaite au tissu hôte, pour finir par être entièrement substitué par le nouveau tissu
dont il aura initié la synthèse.
De nombreuses voies de recherche sont étudiées pour parvenir au développement de
tels matériaux, de l’association de facteurs de croissance comme les BMP qui doivent être
progressivement relargués dans le site d’implantation (Cowan et al, 2005), à la constitution de
matériaux mixtes, associant par exemple un polymère (Dalby et al, 2002b), ou un autre
phosphate de calcium, le phosphate tricalcique (TCP) (Daculsi et Malard, 2005; Daculsi,
1998; Gauthier et al, 1998; Piattelli et al, 1996) à l’HA afin respectivement d’améliorer les
propriétés mécaniques ou de favoriser la résorption de l’implant.
43
Une approche pour assurer la cellularisation d’un matériau consiste notamment en
l’association de protéines de la matrice extracellulaire au substitut osseux.
2) Traitement des céramiques par adsorption de fibronectine
La corrélation entre la compatibilité de l’hydroxyapatite et l’adsorption de protéines
permet d’envisager un traitement des biomatériaux par adsorption de ces protéines, dans le
but d’augmenter l’adhérence des cellules et par la même la vitesse de colonisation de
l’implant. L’adhérence cellulaire aux protéines de la matrice influe en effet directement sur la
prolifération et la différenciation et constitue l’étape critique de la colonisation d’un matériau
(Anselme, 2000).
L’incubation in vitro des biomatériaux en présence de protéines plasmatiques permet
d’accroître le nombre de cellules attachées et d’accélérer la prolifération et la différenciation.
L’adhérence des cellules ostéoprogénitrices dépend étroitement des protéines de la matrice sur
lesquelles elles sont ensemencées et pour lesquelles elles présentent différentes affinités. La
fibronectine favorise l’adhérence de nombreux types cellulaires sur des surfaces abiotiques :
des précurseurs ostéoblastiques sur le titane (Yang et al, 2003), de cellules endothéliales sur le
verre (Iuliano et al, 1993), d’explants osseux (McFarland et al, 1999), de cellules de moelle
osseuse (Yang et al, 2001), de chondrocytes (Wyre et Downes, 2002) ou de fibroblastes
(Barbucci et al, 2005) sur des surfaces polymères, ou encore de cellules de moelle osseuse sur
des céramiques de phosphate de calcium (Dennis et al, 1992). Sur des céramiques poreuses
d’hydroxyapatite, l’adsorption de fibronectine double le nombre de cellules retenues sur le
biomatériau et diminue significativement le temps d’apparition d’os néoformé lors de
l’implantation du biomatériau (Dennis et Caplan, 1993; Dennis et al, 1992).
L’intérêt de la fibronectine dans le cadre du développement de biomatériaux réside
non seulement dans sa capacité a promouvoir l’adhérence mais également dans ses fonctions
de régulation de nombreux processus cellulaires au sein des tissus conjonctifs en général et du
tissu osseux en particulier, détaillées dans le chapitre suivant.
44
II.La fibronectine, protéine multifonctionnelle des
matrices extracellulaires
II.1.Introduction
La fibronectine, première protéine non collagénique de la matrice à avoir été
caractérisée, est une glycoprotéine dimérique de 450 à 500 kDa, présente chez tous les
vertébrés. Elle est impliquée dans de très nombreux processus physiologiques comme
l'embryogenèse, la cicatrisation, et la coagulation.
La fibronectine peut être trouvée sous forme soluble, circulant dans le sang à une
concentration d'environ 300 mg/L. Cette forme soluble participe notamment au processus de
cicatrisation et de coagulation de par son affinité pour la fibrine et les plaquettes. La
fibronectine peut également être incorporée sous forme fibrillaire au sein des matrices extra
cellulaires des tissus conjonctifs, des membranes basales et des cellules en culture, où ses
interactions avec de nombreux autres composants matriciels en font un élément central du
maintien de l'intégrité tissulaire. Ses domaines de reconnaissance par des récepteurs
cellulaires transmembranaires lui confèrent également un rôle majeur dans des processus
comme l'adhérence, la migration ou la différenciation cellulaire. La forme plasmatique de la
fibronectine est synthétisée par les hépatocytes. Lorsqu'elle est sécrétée directement au sein
des matrices extracellulaires, par les ostéoblastes et fibroblastes notamment, on parle de
fibronectine cellulaire. Les fibronectines plasmatique et cellulaire, qui diffèrent peu
structuralement (Vuento et al, 1977), se retrouvent toutes deux incorporées au sein du réseau
matriciel conjonctif (Peters et al, 1990).
II.2.Structure modulaire et domaines d’affinités
La fibronectine est un dimère constitué de deux chaînes polypeptidiques reliées en leur
extrémité C-terminale par deux ponts disulfures. Chaque chaîne, qui possède une masse
moléculaire d'environ 220 kDa, est constituée d'une combinaison d'unités structurales, les
modules de type I, II et III (fig.11).
45
Figure 11. Structure modulaire de la fibronectine.
Les deux monomères de la fibronectine sont associés par deux ponts disulfures en leur extrémité C-terminale. La
combinaison de modules de type I, II et III est représentée pour un seul des deux brins du dimère. A l'intérieur
d'un type, chaque module est identifié par un numéro correspondant à sa position dans le monomère, en partant
de l'extrémité N-terminale. On notera ainsi I1 pour désigner le premier module de type I.
II.2.a. Unités structurales de la fibronectine : les modules
Chaque monomère contient 12 modules de type I, 2 modules de type II et entre 15 et
17 modules de type III. Une vingtaine d'isoformes de la fibronectine, résultats de l'épissage
alternatif d'un même gène, ont en effet été mises en évidence chez l'homme (Schwarzbauer,
1991). Cet épissage module ainsi la présence de deux modules de type III, EDA et EDB, et
d'un domaine variable V (ou IIICS). EDA et EDB ne sont présents que dans les isoformes de
fibronectine cellulaire. Chacun des trois types de modules de la fibronectine est retrouvé chez
de nombreuses autres protéines. Malgré des homologies de structure primaire qui peuvent être
faibles, notamment entre domaines de type III, l'arrangement des structures secondaires de
chaque type de module est très conservé (Potts et Campbell, 1996; Marque et al, 1996).
Les modules de type I comptent environ 45 acides aminés. Ils sont constitués de 2
feuillets β de 2 et 3 brins antiparallèles repliés sur un petit domaine hydrophobe. Deux ponts
disulfures, intra et inter feuillets, maintiennent la structure (Potts et Campbell, 1994; Baron et
al, 1990). Les modules de type II sont constitués d'une soixantaine d'acides aminés arrangés
en 2 courts feuillets beta antiparallèles de 2 brins chacun, reliés par une boucle irrégulière et
associés perpendiculairement l'un à l'autre. La structure des modules de type II, maintenue par
2 ponts disulfures, présente une zone hydrophobe partiellement exposée au solvant
(Constantine et al, 1992). Les modules de type III sont retrouvés dans de très nombreuses
protéines de la matrice extracellulaire. Ils comptent environ 90 acides aminés arrangés en 2
feuillets beta antiparallèles, de 3 et 4 brins chacun. Ces modules ne contiennent pas de pont
disulfure et la structure est maintenue par un cœur hydrophobe compact (Main et al, 1992).
46
II.2.b. Ligands de la fibronectine
La structure modulaire de la fibronectine lui confère, directement sur certains modules
ou via leur association en domaines, de l'affinité pour de très nombreux ligands de la matrice
extracellulaire (fig.12). C'est la résistance de ces domaines à la protéolyse qui a initialement
permis leur localisation le long de la chaîne polypeptidique (Ruoslahti et al, 1982; Hahn et
Yamada, 1979b).
Figure 12. Principaux ligands de la fibronectine.
Quand plusieurs sites d'affinité pour un même ligand sont présents, le signe + indique le site de plus forte
affinité.
1) Récepteurs cellulaires
Intégrines
La fibronectine présente plusieurs sites de reconnaissance des récepteurs cellulaires
transmembranaires, les intégrines. Ces sites sont majoritairement situés sur les modules de
type III et l'on parle ainsi du domaine III2-11 de la fibronectine, fragment de 120-140 kDa isolé
par clivage protéolytique par la thermolysine, comme du 'domaine central de liaison aux
cellules'.
L'un des feuillets du module III10 de la fibronectine présente une boucle flexible
saillant hors de la structure (Raj et al, 1992). Cette boucle contient la séquence tripeptidique
RGD, qui a été identifiée comme la séquence principale intervenant dans l’adhérence des
cellules à la fibronectine (Pierschbacher et Ruoslahti, 1984). La séquence RGD est en fait
commune à de nombreuses protéines matricielles, dont la vitronectine, l'ostéopontine, la
sialoprotéine osseuse, la thrombospondine-I ou le facteur von Willebrand (Ruoslahti et
Pierschbacher, 1987). Cependant, chaque type d'intégrine reconnaît spécifiquement un petit
47
groupe de protéines, indiquant qu’une liaison étroite au récepteur nécessite plus qu’une
simple séquence RGD. Les intégrines sont des glycoprotéines constituées de deux sous-unités
α et β qui présentent chacune de nombreuses isoformes. L'association d'un hétérodimère αβ
particulier confère au récepteur sa spécificité de reconnaissance des protéines matricielles.
L’intégrine α5β1 est ainsi un récepteur spécifique de la fibronectine mais nombreuses autres
intégrines peuvent interagir avec le module III10 de la fibronectine, notamment celles de la
famille αv, qui reconnaissent aussi la vitronectine (Pankov et Yamada, 2002; Marque et al,
1996).
D’autres modules de type III de la fibronectine interagissent spécifiquement avec des
intégrines, comme le domaine III5 avec les intégrines α4β1 et α4β7, via le motif KLDAPT
(Moyano et al, 1997). Ces mêmes intégrines reconnaissent également les séquences LDV et
REDV sur le domaine V (Aota et al, 1991). L’intégrine α5β1 interagirait également avec le
domaine III1 (Mercurius et Morla, 2001). Plus récemment, la séquence KNEED sur le
domaine III8 (Wong et al, 2002), a également été mise en évidence sur la fibronectine. Une
étude suggère qu’en fait tous les modules du domaine III1-10 seraient potentiellement capable
de participer à l’adhérence cellulaire (Chi-Rosso et al, 1997). Certains d’entre eux agissent de
façon synergique comme c’est la cas du domaine III9, via la séquence PHSRN (Aota et al,
1994), dont l’association au domaine III10 optimise l’adhérence (Mardon et Grant, 1994).
Si les interactions entre les intégrines et la fibronectine résident majoritairement au
sein des modules de type III, certaines études indiquent que le domaine N-terminal I1-5
participe également à la reconnaissance de la fibronectine par les cellules via l'intégrine α5β1
(Hocking et al, 1998; Dzamba et al, 1994; Dzamba et al, 1993).
Héparine et glycosaminoglycanes membranaires
La
fibronectine
présente
également
plusieurs
sites
d'affinité
pour
des
glycosaminoglycanes (GAGs) comme l’héparine, l’héparane-, le dermatane- et la
chondroïtine-sulfate. Le site de plus forte affinité pour ces GAGs est situé à l’extrémité Cterminale de la protéine, sur le domaine III12-14. Deux autres sites de plus faible affinité, I1-5 et
III1, sont également retrouvés sur la fibronectine (Smith et Furcht, 1982; Yamada et al, 1980).
Les GAGs sont présents sur des protéines membranaires orientées vers la matrice
extracellulaire et sont impliqués dans certaines interactions entre les cellules et la matrice. Ces
interactions participeraient ainsi notamment à l’adhérence d’ostéoblastes sur la fibronectine
(Sim et al, 2004).
48
L’interaction du module III1 avec l’héparane et le dermatane sulfate de ces
protéoglycanes membranaires pourrait ainsi médier l’interaction fibronectine-cellule et
participer à l’activation de voies de signalisation intracellulaires, au même titre que les
intégrines (Mercurius et Morla, 2001).
2) Ligands matriciels
Fibrine
La fibronectine présente deux sites d’affinité pour la fibrine situés sur les domaines I4-5
et I10-12 (Rostagno et al, 1999). Cette interaction fibronectine-fibrine participe notamment à
l’incorporation de la fibronectine aux caillots sanguins lors des processus de cicatrisation et
de coagulation. L’incorporation de fibronectine est en effet nécessaire à la migration des
fibroblastes au sein du caillot de fibrine lors de la cicatrisation (Greiling et Clark, 1997; Knox
et al, 1986).
Collagène
La fibronectine est capable d’interagir avec le collagène de type I, et particulièrement
avec sa forme dénaturée, la gélatine (Hahn et Yamada, 1979a) via le domaine I6-II1-2-I7-9
(Skorstengaard et al, 1984). Le rôle de cette affinité n’est pas clair, aucune interaction directe
n’ayant été mise en évidence dans la matrice entre la fibronectine et le collagène. La plus forte
affinité de la fibronectine pour la forme dénaturée du collagène a fait émettre l’hypothèse que
cette liaison pourrait participer à l’élimination de fragments du collagène dénaturé lors
remodelage tissulaire physiologique ou pathologique, lors de brûlures par exemple. La
fibronectine est capable d’interagir avec de nombreux fragments du collagène I (Ingham et al,
2002) et aucune séquence spécifique de reconnaissance n’a été mise en évidence à ce jour.
3) Sites d'auto-association
Plusieurs interactions entre les domaines de la fibronectine eux-mêmes ont été mises
en évidence. L’extrémité N-terminale I1-5 de la protéine montre ainsi de l’affinité pour les
deux autres sites de liaison à l’héparine situés sur les domaines III1 (Aguirre et al, 1994;
Hocking et al, 1994) et III12-14 (Bultmann et al, 1998). Le domaine III2-3 d’une sous-unité
interagirait également avec le domaine III12-14 de l’autre (Johnson et al, 1999). Ces
interactions entre sous-unités sont directement impliquées dans la structure tridimensionnelle
49
de la fibronectine en solution.
II.3.Conformation de la fibronectine
II.3.a. Conformation de la fibronectine en solution
La fibronectine est sous une forme compacte dans le plasma (Rocco et al, 1984) et à la
surface des cellules (Baneyx et Vogel, 1999). Cette conformation est maintenue par des
interactions entre modules distants dans la séquence de la protéine.
1) Interactions hydrophobes
L'arrangement entre modules voisins peut faire intervenir des interactions
hydrophobes, comme cela a été montré pour la paire I4-I5 (Williams et al, 1982), ce qui limite
les rotations entre modules autour de l’axe de la chaîne peptidique. De telles interactions
peuvent également être trouvées entre modules distants dans la séquence primaire (fig.13).
C’est ainsi le cas du domaine I6-II1-II2 au niveau du site d’affinité pour le collagène (Pickford
et al, 2001).
Figure 13. Interactions hydrophobes sur le site d’affinité au collagène, entre Fn I6 et II2,.
D’après (Pickford et al, 2001)
2) Interactions électrostatiques
La conformation compacte de la fibronectine (fig.14) est maintenue par des
interactions électrostatiques entre ses deux sous-unités (Benecky et al, 1991). C’est
l’interaction entre les modules III2-3 d’une sous-unité et III12-14 de l’autre qui participerait
directement à ce maintien (Johnson et al, 1999).
50
Figure 14. Conformation compacte de la fibronectine d’après (Johnson et al, 1999).
La forme compacte de la fibronectine est maintenue par des interactions entre le domaine III2-3 d’une sous-unité
et le domaine III12-14 de l’autre. Le domaine I6II1-2 est ici représenté replié selon l’hypothèse de (Pickford et al,
2001). Ce repliement du domaine de liaison au collagène pourrait également faciliter une interaction entre les
domaines I1-5 et III1. L’une des sous-unités est grisée afin de faciliter la distinction entre les deux chaînes de la
fibronectine. La représentation des modules est la même que pour la figure 12. Les modules ayant de l’affinité
pour un autre domaine de la fibronectine sont représentés en rose, les sites principaux de reconnaissance des
intégrines en bleu.
L’augmentation du rayon de giration de la protéine à forte force ionique est associée à
la rupture de ces interactions inter-chaînes et au dépliement de la forme compacte vers une
forme étendue de la fibronectine, comme illustré sur la figure 15 (Benecky et al, 1991;
Erickson et Carrell, 1983; Tooney et al, 1983; Williams et al, 1982).
Figure 15. Transition de conformation de la fibronectine induite par la force ionique.
La forme étendue présente l’interaction hydrophobe mise en évidence par Pickford, qui résiste à de fortes forces
ioniques. La représentation des modules est la même qu’à la figure 12.
3) Ordres de grandeur
La conformation de la fibronectine en solution n’est pas résolue à ce jour. Cependant,
les techniques de sédimentation, de diffusion de lumière, et de microscopies, électronique et à
force atomique, permettent d’estimer les ordres de grandeur des différentes formes de la
protéine (fig.16). Ainsi la forme compacte aurait un rayon de giration d’environ 10 à 15nm,
celui de la forme étendue serait environ le double. La longueur de contour d’une chaîne de
modules repliés est de l’ordre de 60-70nm, tandis qu’une chaîne polypeptidique dans laquelle
les modules sont entièrement déroulés atteindrait 600nm.
51
Figure 16. Ordres de grandeurs des dimensions de la fibronectine.
Les valeurs données reflètent une moyenne des valeurs de la littérature, qui varient selon les auteurs et
techniques utilisées. Dimensions des conformations compacte et étendue d’après (Benecky et al, 1991; Rocco et
al, 1984; Erickson et Carrell, 1983; Williams et al, 1982; Koteliansky et al, 1981) ; longueurs de contours d’un
monomère d’après (Erickson et Carrell, 1983; Tooney et al, 1983; Erickson et al, 1981) et d’un monomère dans
lequel les modules sont dépliés d’après (Oberdörfer et al, 2000).
II.3.b. Fibrillogenèse de la fibronectine au sein de la matrice
Lorsqu’elle est incorporée dans la matrice extracellulaire, la fibronectine est organisée
en un réseau dense de fibres interconnectées et entourant les cellules. De nombreuses cellules
sont capables d’assembler la fibronectine en un réseau fibrillaire, au sein des tissus
conjonctifs ou en culture (fig.17).
Figure 17. Matrices de fibronectine assemblées par des ostéoblastes in vitro et in vivo.
(a) Assemblage de la fibronectine en un réseau fibrillaire par des ostéoblastes de rat en culture (Yang, 2002).
Après 4 jours de culture, les cellules sont fixées et la fibronectine est marquée par immunofluorescence (champ
100x100µm). (b) Matrice de fibronectine sur une section d’os spongieux chez le rat (Weiss,1981). La
fibronectine est présente de façon importante dans toute la matrice extracellulaire. On distingue le réseau
fibrillaire autour des ostéoblastes (flèche). (champ 15x15µm).
Ce réseau fait intervenir des formes multimériques maintenues par des ponts disulfures
(McKeown-Longo et Mosher, 1984). La fibrillation procède en plusieurs étapes: La
fibronectine est sécrétée sous forme d’un dimère. Cette forme associée aux cellules est
52
initialement soluble puis la multimérisation de la fibronectine s’accompagne progressivement
d’une insolubilisation de la matrice formée, correspondant à l’établissement de ponts
disulfures inter-chaînes. (Choi et Hynes, 1979). L’établissement de ces ponts est lié à un
changement de conformation de la protéine, les groupements thiols libres étant enfouis dans
sa conformation native (Williams et al, 1982).
1) Domaines impliqués
De très nombreuses études ont essayé de mettre en évidence le mécanisme
d’assemblage de la fibronectine au sein de la matrice, et notamment les interactions entre
domaines de la protéine qui initient la fibrillation. Le fragment N-terminal de 70 kDa (F70),
incluant les 9 premiers domaines de type I et les modules de type II, inhibe ainsi de façon
compétitive l’incorporation de fibronectine à la matrice (Quade et McDonald, 1988;
Chernousov et al, 1987; Chernousov et al, 1985). Cette inhibition est essentiellement liée au
domaine I1-5 (Quade et McDonald, 1988). L’activité inhibitrice des domaines I9-III1 (Zhong et
al, 1998; Chernousov et al, 1991), ou III1-III2 (Morla et Ruoslahti, 1992) laisse penser que
parmi les modules du F70, le module III1 joue également un rôle clef dans la fibrillogénèse de
la fibronectine. Cette inhibition pourrait être liée à son affinité pour le fragment F70 lui-même
(Hocking et al, 1994), le module III10 (Hocking et al, 1996), ou d’autres modules de type III
(Ingham et al, 2002). Certains résultats sont contradictoires, ainsi, un anticorps anti-III1 inhibe
la formation d’une matrice de fibronectine (Hocking et al, 1996) alors que la délétion de ce
module au sein d’une protéine recombinante ne la modifie pas (Sechler et al, 2001). D’autres
travaux suggèrent enfin que les modules de type III de la fibronectine ne seraient pas
essentiels à son incorporation au sein de la matrice. Ainsi, l’association, au sein de protéines
recombinantes, des seules extrémités N-ter et C-ter de la protéine suffit en fait à leur
incorporation au sein de la matrice de fibronectine (Sechler et Schwarzbauer, 1998; IchiharaTanaka et al, 1992), la délétion d’une partie des modules de type III conduisant toutefois à
l’assemblage d’une matrice dont la morphologie diffère de celle de la protéine entière
(Sechler et Schwarzbauer, 1998).
De nombreux modules de la fibronectine présentent une affinité pour un ou plusieurs
autres modules de la protéine. Si on admet l’hypothèse que les fibres de fibronectine sont
constituées par un alignement des chaînes parallèle à l’axe de la fibre (hypothèse suggérée par
les plus petits diamètres observés, de l’ordre de 5nm), il ne semble pas étonnant que de
multiples interactions entre modules s’établissent tout le long des molécules afin de stabiliser
53
la structure. Dans ce contexte, il est difficile de d’établir le rôle initiateur de certains domaines
de la protéine, sans compter que certaines modules peuvent établir plusieurs interactions
simultanément, comme c’est la cas du domaine III1, capable d’interagir en même temps avec
le fragment N-terminal F70 et le domaine III10 (Hocking et al, 1996).
La difficulté d’établir les interactions s’établissant entre molécules de fibronectine au
cours de la fibrillogénèse vient également du fait que celles-ci peuvent varier selon l’état de
repliement des modules. Les modules dont la dénaturation entraîne l’apparition d’affinités
nouvelles par rapport à la conformation native de la protéine, sont qualifiés de sites
cryptiques.
2) Sites cryptiques d’auto-association
La participation des modules de la fibronectine à son auto-association, dépendrait de
leur état de dénaturation. Une forte affinité du fragment N-terminal de 70kDa apparaît ainsi
pour le module III1 lorsque celui-ci est dénaturé (Hocking et al, 1994). Le domaine III1 luimême ne reconnaît le module III10 que dénaturé (Hocking et al, 1996). Ces interactions
permettent d’envisager un mécanisme séquentiel dans lequel un changement de conformation
du III1 suite à sa liaison au III10 optimiserait la liaison du III1 au F70 et permettrait la
formation d’un triptyque (Hocking et al, 1996). Le domaine III1 dans sa conformation native
n’exprime enfin de l’affinité pour les modules III7 et III15 que si ceux-ci ont préalablement été
dénaturés (Ingham et al, 1997).
La pertinence physiologique de telles associations est mise en évidence par plusieurs
observations qui suggèrent un dépliement partiel des modules au sein des fibres de
fibronectine de la matrice extracellulaire de cellules en culture.
3) Fibrillogénèse et transition de conformation
Coexistence de formes compactes et dépliées au sein des fibres
Le marquage de la fibronectine par deux fluorophores dont le spectre d’émission de
l’un des deux (fluorophore ‘accepteur’) recouvre en partie le spectre d’absorption de l’autre
(fluorophore ‘donneur’) permet de distinguer différentes conformations de la fibronectine au
sein de la matrice. Les fluorophores accepteurs sont spécifiquement situés sur les modules III7
et III15 et les donneurs sont aléatoirement répartis le long de la molécule. Le transfert
d’énergie entre les deux peut s’effectuer lorsque ceux-ci sont séparés d’une distance environ
54
inférieure à 10 nm ce qui permet de détecter le dépliement des modules de type III (Baneyx et
al, 2001). Cette technique de fluorescence à transfert d’énergie de résonance (FRET) permet
d’observer la coexistence de formes compactes de la fibronectine, situées à la surface des
cellules, et de formes étendues au sein des fibres de la matrice, dont des formes ‘hyperétendues’, dans lesquelles au moins l’un des modules de type III est déplié (Baneyx et al,
2002). Ces résultats suggère que le dépliement partiel de la fibronectine est un préalable à sa
fibrillation (fig.18).
Figure 18. Coexistence de conformations compactes et dépliées de la fibronectine au sein de la matrice.
Les différentes conformations de la fibronectine sont mises en évidence par la technique du FRET (cf. texte)
entre 1h et 24h après l’ensemencement des cellules. La fluorescence rouge indique des formes compactes de la
fibronectine localisées à la périphérie des cellules, tandis que les fibres de fibronectine, qui fluorescent en vert,
sont constituées de molécules de fibronectine dépliées. La présence d’amas jaunes (indiqués par des flèches à 1,
4 et 24h), à la surface des cellules, indique une conformation intermédiaire de la protéine. (Baneyx et al., 2001).
Exposition des sites d’association par une tension mécanique
L’exercice d’une force mécanique sur la fibronectine permet de déplier ses modules de
façon séquentielle. Des études d’étirement moléculaire sur la fibronectine en microscopie à
force atomique, montrent en effet un dépliement successif des modules de type I, puis II et III
au fur et à mesure de l’étirement de la molécule (Oberdörfer et al, 2000). Le dépliement des
modules de même type serait également séquentiel, le module III10 étant par exemple trois
fois moins résistant à l’étirement que le module III1 (Oberhauser et al, 2002). Un étirement
mécanique de la fibronectine pourrait donc permettre de réguler les interactions entre modules
(fig.19).
Au sein de la matrice les fibres de fibronectine sont en effet soumises à d’importantes
55
forces de tension, comme le montre leur rétraction rapide et importante suite à leur rupture
(Ohashi et al, 1999). Ces forces de tension pourraient donc permettre l’exposition des sites
d’assemblage comme le suggère l’augmentation de l’incorporation au sein de la matrice de la
fibronectine, du fragment F70 ou du module III1, suite à l’étirement mécanique de cette
matrice (Zhong et al, 1998).
Figure 19. Modulation des interactions entre modules par la tension exercée sur la fibronectine.
Exemple d’une modulation possible des interactions du module III1 à l’état (a) replié ou (b) dénaturé selon la
tension exercée sur la fibre. D’après (Hocking, 1994 et 1996), (Ingham,1997), (Zhong,1998) et (Baneyx,2002).
Couplage mécanique du réseau de fibronectine et du cytosquelette
L’organisation du cytosquelette d’actine est étroitement liée à celle de la matrice de
fibronectine. La partie intracellulaire des récepteurs transmembranaires que sont les intégrines
est associée, via un complexe protéique, aux filaments du cytosquelette. L’inactivation d’une
protéine impliquée dans l’assemblage des filaments d’actine du cytosquelette inhibe ainsi
l’incorporation de fibronectine à la matrice. Cette inactivation diminue également l’exposition
du module III1 (Zhong et al, 1998), suggérant que le lien entre le cytosquelette et la
fibronectine permettrait l’exposition de sites d’auto-association par changement de
conformation des modules, ce que confirme le repliement des modules de type III observé
suite à la rupture de la tension du cytosquelette d’actine (Baneyx et al, 2002).
Les tensions exercées par les cellules sur la fibronectine pourraient donc résulter d’un
couplage mécanique entre le cytosquelette et la protéine via les intégrines. L’inhibition de
l’assemblage des filaments d’actine est ainsi corrélée à une diminution de l’activation des
intégrines de la famille β1, récepteurs de la fibronectine (Zhong et al, 1998).
L’incorporation de fibronectine à la matrice extra-cellulaire nécessite un dépliement de
la molécule de sa forme compacte vers une forme étendue, dans laquelle les modules sont
56
exposés. L’initiation de la fibrillogénèse requiert l’intervention des intégrines α5β1 [Wu,1993]
et l’interaction entre les deux partenaires pourrait également déclencher l’ouverture de la
molécule, via un couplage mécanique au cytosquelette (fig.20) (Wierzbicka-Patynowski et
Schwarzbauer, 2003; Pankov et al, 2000).
Figure 20.Couplage mécanique de la matrice de fibronectine au cytosquelette via les intégrines.
L’interaction de la fibronectine avec les intégrines membranaires pourrait favoriser l’ouverture de la forme
compacte de la protéine via un couplage mécanique au cytosquelette. Les tensions exercées induiraient
l’exposition de sites d’auto-association sur la protéine, initiant ainsi la fibrillogénèse. Cette hypothèse, non
démontrée, est suggérée par de nombreux résultats expérimentaux dont (Baneyx,2001; Pankov,2000 ;
Zhong,1998).
Ce couplage mécanique de la fibronectine et des cellules serait en fait réciproque. Des
études de modélisation moléculaire montrent en effet que l’étirement du module III10, porteur
du site principal de reconnaissances des intégrines, la boucle RGD, provoque un changement
de conformation de cette boucle et diminue ainsi son accès par les intégrines α5β1 (Krammer
et al, 1999). Cette déformation pourrait en fait, via une modulation de la distance entre la
boucle RGD et le site synergique PHSRN situé sur le module III9, entraîner le recrutement
d’autres types d’intégrines, insensibles à cette synergie (Krammer et al, 2002).
Rôle possible des lipides membranaires
La technique du FRET a récemment permis de mettre en évidence que la transition de
conformation de la fibronectine, de sa forme compacte à sa forme étendue, pouvait être
induite par son adsorption à la surface de liposomes de phosphatidylcholine (Halter et al,
2005). La phosphatidylcholine est le composant majoritaire des lipides de la membrane
plasmique. Ces résultats suggèrent donc que la fibrillogénèse de la fibronectine pourrait en
fait s’effectuer via un dépliement induit par la membrane et non pas par les intégrines. Ce
changement de conformation initial pourrait ensuite faciliter l’interaction avec les intégrines,
57
et la poursuite de l’extension de la molécule et de la fibrillation.
Si tous les mécanismes n’en sont pas identifiés, l’auto-assemblage de la fibronectine
au sein de la matrice implique très vraisemblablement des changements de conformation de la
protéine, initiés par son association aux cellules. Les nombreuses interactions possibles entre
les modules, et l’interdépendance observée entre la fibronectine et le cytosquelette, suggèrent
par ailleurs que la fibrillogénèse de la fibronectine est un processus dynamique, sujet à de
nombreuses régulations. Le maintien de l’intégrité de la matrice requiert par exemple une
incorporation continue de fibronectine (Sottile et Hocking, 2002).
II.4. Fonctions de la fibronectine
II.4.a. Introduction
La relation entre les cellules et leur matrice est étroite et réciproque. Les cellules
sécrètent et participent à l’assemblage des protéines de la matrice, tandis que le réseau
matriciel transmet aux cellules des informations positionnelles et environnementales qui
modulent le comportement cellulaire. Les senseurs de ces informations sont principalement
les intégrines. La liaison des cellules aux protéines extracellulaires, via les intégrines,
transmembranaires, génère un signal intracellulaire affectant l’état du cytosquelette, initiant
l’assemblage des filaments d’actine et des plaques d’adhésion focale et influençant ainsi
l’étalement des cellules sur leur substrat (fig.21). Cette liaison initie également une cascade de
réactions cellulaires aboutissant à la synthèse de facteurs de transcription de nombreuses
protéines (Bottaro et al, 2002; Stupack et Cheresh, 2002; Yamada, 1997; LaFlamme et Auer,
1996). L’interaction des cellules avec leur environnement, la matrice extracellulaire, affecte
ainsi de nombreux aspects du comportement cellulaire. Cette interaction est non seulement
nécessaire à la vie, mais aussi à la survie, cellulaires. La disjonction des interactions entre les
cellules et leur matrice extracellulaire peut ainsi induire une mort cellulaire par apoptose,
l’anoikis (Frisch et Francis, 1994).
58
Figure 21. Activation de la signalisation intracellulaire via la reconnaissance de la fibronectine par les
intégrines.
L’interaction de la fibronectine avec les intégrines entraîne une cascade de réactions intracellulaires modulant la
survie, la prolifération ou la différenciation cellulaire. L’activation des voies de signalisation par la matrice est
ici représentée de façon simplifiée, des interactions entre plusieurs récepteurs pouvant notamment également être
mises en œuvre. Cette signalisation de la matrice vers la cellule est appelée ‘outside-in’. Une signalisation
‘inside-out’ peut par ailleurs s’établir de la cellule vers la matrice. C’est cette dernière qui interviendrait par
exemple dans la polymérisation de la fibronectine (cf. II.3.b)
Parmi les protéines de la matrice extracellulaire des tissus conjonctifs, la fibronectine
participe à la régulation de très nombreux processus physiologiques au sein des tissus
conjonctifs en général et du tissu osseux en particulier. La plupart de ces fonctions dépendent
non seulement de l’exposition des différents domaines de la molécule isolée, mais également
des caractéristiques des assemblages supramoléculaires de fibronectine au sein du réseau
matriciel.
II.4.b. Fibronectine et fonctions cellulaires
1) La cellule dans l’espace
Adhérence
La fibronectine participe à l’ancrage des cellules à leur support via sa reconnaissance
par les intégrines et notamment par l’hétérodimère α5β1 (fig.22). La disposition de patchs de
fibronectine sur une surface non adhésive dirige ainsi sélectivement l’adhérence de cellules
endothéliales sur ces patchs, indépendamment de la topologie du substrat (Mrksich et al,
1996). Cette stimulation de l’adhérence est l’une des premières propriétés de la fibronectine à
avoir été mise en évidence sur des hépatocytes (Hook et al, 1977). On sait depuis que la
fibronectine stimule l’adhérence de très nombreux types cellulaires, notamment des
59
fibroblastes (Grinnell et al, 1980), des cellules endothéliales (Iuliano et al, 1993), osseuses
(Yang et al, 2003; Yang et al, 2001; McFarland et al, 1999; Dennis et al, 1992), ou
cartilagineuses (Wyre et Downes, 2002). Par ailleurs, la dénaturation des structures
secondaires de la fibronectine (Barbucci et al, 2005) ou une exposition différente de certains
de ses sites au solvant (Iuliano et al, 1993) , modulent l’adhérence à un substrat, suggérant
une dépendance plus importante à la conformation de la protéine qu’à sa quantité.
Incidemment, une même quantité de fibronectine adsorbée peut induire différentes réponses
en terme d’adhérence (McFarland et al, 1999).
Figure 22. Adhérence et étalement d’une cellule sur son substrat.
La reconnaissance entre ls intégrines transmembranires et la fibronectine (en rouge) permet l’ancrage initial de la
cellule au substrat. Puis, l’interaction est consolidée par l’étalement de la cellule et l’augmentation du nombre de
lien intégrine-fibronectine.
Etalement et Migration
L’ancrage de fibroblastes sur la fibronectine n’est sensible à l’action d’agents
inhibiteurs que pendant la phase initiale d’adhérence. La consolidation de l’interaction entre la
cellule et son support, est en partie liée à la capacité d’étalement de la cellule (Carter et al,
1981). L’ancrage initial d’une cellule à la matrice, via les intégrines, entraîne en effet une
réorganisation du cytosquelette conduisant à l’émission d’extensions cytoplasmiques et à
l’étalement cellulaire. L’adhérence à la fibronectine permet ainsi l’étalement de fibroblastes
en 1 heure, via l’activation de voies de signalisation intracellulaires intégrine-dépendantes
(Price et al, 1998). Cette liaison de la cellule à la fibronectine peut également favoriser sa
migration. La fibronectine permet ainsi de guider les cellules au cours de l’embryogenèse
(Beauvais-Jouneau et al, 1997; Winklbauer et al, 1996) ou lors de la cicatrisation (Greiling et
Clark, 1997). Certains fragments de la fibronectine favorisent aussi la migration de cellules
cancéreuses lors de l’invasion tumorale (Margolis et al, 1996). La migration et l’étalement
font en effet appel à des processus similaires. Comme l’étalement, la migration cellulaire
procède par une stabilisation de l’interaction cellule/substrat par des regroupements
coopératifs des récepteurs, en coordination avec la réorganisation du cytosquelette.
60
Cependant, au cours de la migration cette réorganisation se produit de manière asymétrique.
Elle entraîne ainsi une extension cytoplasmique vers un coté de la cellule, le front de
migration (fig.23). Le regroupement de récepteurs au niveau de ce front permet à la cellule de
se ‘hisser’ vers lui, puis de libérer les interactions avec son substrat à l’arrière du front de
migration avant de projeter de nouveau des extensions vers l’avant (Mitchison et Cramer,
1996). La migration est ainsi un phénomène cyclique d’établissement/disjonction des
interactions entre la matrice, les récepteurs cellulaires et le cytosquelette (Palecek et al, 1998;
Palecek et al, 1996). C’est pourquoi la migration ne peut se produire que pour une valeur
optimale de la force de l’interaction avec la matrice, suffisante pour supporter la traction de la
cellule, mais réversible pour permettre la disjonction et donc le déplacement (Palecek et al,
1997).
Figure 23. Représentation schématique des étapes de la migration cellulaire.
La cellule envoie une projection cytoplasmique vers l’avant, stabilise la prise par un regroupement des
récepteurs, puis exerce une traction sur cette prise afin de se hisser vers elle, avant de libérer les prises arrières et
de procéder à un nouveau cycle extension/glissement/rétraction.
2) La cellule dans le temps
Prolifération et cycle cellulaire
L’addition de fibronectine exogène dans le milieu de culture de cellules ne la
synthétisant pas, augmente la prolifération de ces cellules d’un rapport 2 à 5. L’inhibition
spécifique de l’assemblage de la fibronectine en une matrice fibrillaire annule cet effet,
suggérant que la stimulation de la prolifération cellulaire est directement corrélée à
l’organisation supramoléculaire de la protéine (Sottile et al, 1998). L’assemblage d’une
matrice morphologiquement différente de la fibronectine native par délétion du domaine III1-7
provoque ainsi un retard de croissance en bloquant le passage en phase S du cycle cellulaire
(Sechler et Schwarzbauer, 1998). La distribution de la fibronectine, et donc des sites de
reconnaissance des cellules, influerait directement sur les contraintes tridimensionnelles
exercées sur le réseau d’actine, ce qui modulerait les voies de transduction du signal. En
présence d’une matrice de fibronectine irrégulière, l’inactivation d’une étape initiale de l’une
des voies de transduction intégrine-dépendantes confirme ce rôle majeur de l’agencement de
la matrice de fibronectine sur la signalisation intracellulaire (Sechler et Schwarzbauer, 1998).
61
Différenciation
Au cours de l’ostéogenèse, la fibronectine est synthétisée et déposée majoritairement
dans les régions de recrutement des précurseurs des ostéoblastes (Weiss et Reddi, 1981). La
fibronectine jouerait en effet un rôle dans les étapes précoces de l'ostéogenèse et en particulier
dans la différenciation des ostéoblastes à la surface de la matrice osseuse. L’inhibition de la
reconnaissance de la fibronectine par les cellules empêche ainsi totalement la minéralisation
par les ostéoblastes en culture (Moursi et al, 1996), en prévenant leur différenciation (Moursi
et al, 1997). L’induction de la différenciation ostéoblastique par la fibronectine passerait par
une signalisation via l’intégrine α5β1 (Stephansson et al, 2002; Moursi et al, 1997). La
fibronectine serait en fait un signal non seulement de différenciation des ostéoblastes mais
aussi de survie une fois ces cellules différenciées, son absence entraînant l’apoptose (Globus
et al, 1998). La capacité d’induction de la différenciation cellulaire par la fibronectine dépend
de son substrat d’adsorption, ce qui indique une nouvelle fois un lien étroit entre la
conformation et la fonction de la protéine (Stephansson et al, 2002).
II.4.c. Fibronectine et architecture de la matrice extracellulaire
1) Matrice organique
La fibronectine module non seulement le comportement cellulaire mais apparaît
également comme un support de l’organisation de la matrice extracellulaire.
Le collagène, et en particulier le collagène de type I, est la protéine majoritaire des
tissus conjonctifs. Son organisation en fibres au sein des matrices extra-cellulaires confère
aux tissus leurs propriétés mécaniques d’élasticité ou de résistance. La capacité du collagène à
polymériser in vitro a longtemps laissé penser que l’organisation du collagène in vivo était un
processus d’auto-assemblage, indépendant des autres constituants matriciels, et fournissant la
charpente nécessaire à leur propre assemblage. Certaines cellules ne forment ainsi que de
courtes et éparses fibres de fibronectine en l’absence de collagène I (Dzamba et al, 1993).
D’autres résultats suggèrent cependant que l’interaction avec le collagène n’est pas nécessaire
à la fibrillation de la fibronectine (McDonald et al, 1982). Sans fibronectine, des fibroblastes
sont également incapables d’organiser le réseau de collagène de type I et III. L’addition de
fibronectine, rapidement assemblée en un réseau fibrillaire, suffit à promouvoir la
62
fibrillogénèse des deux types de collagène (Velling et al, 2002). Si l’expression des intégrines
α11β1 et α2β1, récepteurs du collagène, potentialise cette fibrillogénèse, leur seule présence ne
permet, en l’absence de fibronectine, que de produire de courtes fibres non connectées de
collagène. La stimulation de la fibrillogénèse du collagène, par la fibronectine, qui ne provient
pas d’une stimulation de son expression, pourrait être directement liée à une interaction entre
les deux protéines (Velling et al, 2002).
Outre le collagène, l’incorporation d’autres protéines à la matrice extracellulaire
nécessite également la présence d’une matrice de fibronectine. Lorsque la matrice de
fibronectine est désassemblée, la thrombospondine, comme le collagène de type I, sont
présents sous forme disséminée dans la matrice extracellulaire. Lorsque la polymérisation de
la fibronectine est maintenue, la thrombospondine et le collagène, sous forme fibrillaire,
montrent une nette colocalisation avec la fibronectine (Sottile et Hocking, 2002).
2) Matrice Minérale
La fibronectine possèderait également une activité de contrôle de la minéralisation. Sa
présence en solution régule en effet in vitro la formation de cristaux de phosphate de calcium.
Celle-ci est activée par la fibronectine en solution concentrée à moins de 18µg/ml et inhibée
pour des concentrations supérieures (Couchourel et al, 1999). Incluse dans un gel, la
fibronectine ne favorise la cristallisation qu’en présence de cristaux déjà formés (Daculsi et
al, 1999). La fibronectine soluble plasmatique inhiberait donc la précipitation en solution
mais favoriserait la minéralisation dans le tissu osseux où elle s’adsorberait sur l’apatite. Le
mécanisme de cette régulation reste à élucider. Une hypothèse est que la fibronectine qui
possède 28 sites potentiels de fixation du calcium (Amphlett et Hrinda, 1983) appauvrirait le
milieu et donc inhiberait la précipitation avec le phosphate en solution. Au niveau de l’os, en
présence d’hydroxyapatite, cette liaison modifierait localement le rapport Ca/P et induirait la
formation de nouveau cristal (Couchourel et al, 1999).
63
64
III.Assemblages de protéines induits par l’adsorption,
concepts et modèles d’études
III.1.Introduction
La modification, induite par l’adsorption, de leur structure peut entraîner une
diminution importante de l’activité d’enzymes (Karajanagi et al, 2004; Norde et Zoungrana,
1998). Dans le cas de protéines matricielles comme la fibronectine, l’adsorption module
l’exposition des différents domaines de la protéine (Yu et al, 1997) et peut en particulier,
selon la surface, favoriser ou non l’accessibilité aux sites de reconnaissance cellulaire (Baugh
et Vogel, 2004; Iuliano et al, 1993). Les propriétés d’une monocouche protéique dépendent
non seulement de la conformation de la protéine, mais également de la distribution des
molécules sur la surface. La distribution de fibronectine sur une surface peut ainsi prévaloir,
en terme d’adhérence cellulaire, sur la topologie du substrat (Mrksich et al, 1996).
L’étalement cellulaire est également corrélé à la géométrie du revêtement de fibronectine
(Kam et Boxer, 2001). Enfin, à densité de surface égale, le regroupement en amas de peptides
RGD, favorisant l’adhérence cellulaire, organise différemment le cytosquelette et est plus
favorable à la migration cellulaire, que la distribution uniforme des peptides sur la surface
(Maheshwari et al, 2000).
Etant donnée l’étroite relation entre la structure et la fonction d'un revêtement
protéique, de nombreux travaux se sont consacrés à l’étude des propriétés des protéines
adsorbées, tant au niveau de la conformation du monomère que de la configuration de
l’ensemble des protéines les unes par rapport aux autres sur la surface.
III.2.Adsorption d’une protéine
III.2.a. Les protéines, ni colloïdes ni polymères flexibles
La difficulté d’établir des comportements génériques des protéines aux interfaces tient
au fait que la majorité des protéines se situent entre les deux extrêmes que sont les particules
colloïdales rigides, et les polymères neutres flexibles.
Dans le premier cas, la structure fait intervenir de très fortes interactions entre les
domaines de l’objet (à l’extrême exclusivement covalentes dans le cas d’une particule solide)
65
et la particule ne peut adopter qu’une seule conformation, très stable par rapport aux
variations physico-chimiques de son environnement.
A l’inverse, un polymère neutre flexible peut adopter un très grand nombre de
configurations, limité seulement, en solution diluée, par des interactions de volume exclu,
c'est-à-dire par le volume de la chaîne elle-même (deux monomères ne pouvant se trouver au
même endroit au même moment), et par sa longueur de persistance (la longueur au-delà de
laquelle l’orientation du nième motif ne dépend plus de l’orientation du premier motif) qui
reflète la rigidité intrinsèque (de Gennes, 1993).
La plupart des protéines se situent entre ces deux limites. Une chaîne polypeptidique
est constituée de résidus d’acides aminés polaires, acides, basiques ou apolaires. De
nombreuses interactions s’exercent entre ces acides aminés, voisins ou distants dans la
séquence de la protéine. Une protéine est ainsi structurée selon quatre niveaux (fig.24) : La
séquence d’acides aminés constitue la séquence primaire, et fait intervenir des liaisons
covalentes. Des liaisons hydrogènes peuvent s’établir entre ces acides aminés, les organisant
en élément de structure secondaire, hélice α ou feuillet β. Ces éléments de structure
secondaire sont enfin positionnés les uns par rapport aux autres dans l’espace pour former la
structure tertiaire de la protéine, qui fait majoritairement intervenir des liaisons ioniques ou
des interactions hydrophobes entre les chaînes latérales de résidus distants dans la séquence
primaire de la protéine. Les interactions hydrophobes constituent ce que l’on appelle le cœur
hydrophobe, à l’intérieur de la structure, dans lequel les résidus apolaires sont protégés d’une
exposition au solvant aqueux. Enfin, pour certaines protéines, plusieurs chaînes
polypeptidiques peuvent s’assembler entre elles pour former les sous-unités de structures
quaternaires.
Figure 24. Niveaux de structuration d’une protéine
(d’après Lehninger et Nelson, Principles of Biochemistry).
66
Les interactions entre acides aminés d’une protéine conduisent à l’établissement d’une
conformation particulière, dans laquelle, selon les protéines, certains domaines sont
hautement ordonnés, comme dans le cas d’éléments de structures secondaires, et d’autres
pouvant rester relativement flexibles. Le nombre de configurations accessibles d’une protéine,
par rapport au nombre de configurations possibles, est ainsi relativement petit. La
conformation adoptée in vitro par une protéine purifiée, en solution, dans des conditions
physiologiques de force ionique et de température, est appelée sa conformation ‘native’.
Contrairement aux colloïdes solides, les interactions qui maintiennent cette conformation
native sont faibles et peuvent être modifiées, notamment dans le cas de l’interaction d’une
protéine avec une surface lors de l’adsorption. Pour comprendre les forces qui gouvernent
l’adsorption d’une protéine, et les changements de conformation induits par cette adsorption,
il est nécessaire de faire appel à quelques notions de thermodynamique.
III.2.b. Dénaturation induite par l’adsorption
1) Rappels de thermodynamique
Du point de vue énergétique, l’évolution d’un système, à température et pression
constantes, est gouvernée par les contraintes enthalpiques et entropiques associées à un
changement d’état selon la fonction de Gibbs qui définit la variation d’enthalpie libre, ∆G, par
∆G = ∆H-T∆S,
où H est l’enthalpie, T, la température et S l’entropie du système.
A pression et volume constants, le terme enthalpique, ∆H, représente essentiellement
la variation des potentiels chimiques des éléments du système et reflète ainsi notamment
l’énergie associée à l’établissement (ou à la rupture) de liaisons entre ces éléments. La
variation de l’enthalpie libre du système dépend également de la variation d’entropie ∆S. Du
point de vue statistique, l’entropie, S, est définie par l’expression
S = k ln Ω ,
où Ω représente le nombre de configurations microscopiques possibles d’un système
et k est la constante de Boltzmann. On considère ainsi que l’entropie reflète ‘l’état d’ordre’ du
système.
Les lois de la thermodynamique impliquent la tendance d’un système à aller
spontanément vers les états de plus basse enthalpie libre. Toute autre chose égale par ailleurs,
une transition qui augmente l’entropie ou diminue l’enthalpie sera donc énergétiquement
67
favorable.
La conformation d’une protéine est le résultat de la balance entre l’enthalpie et
l’entropie dans un environnement donné. Le repliement d’une protéine, et en particulier
l’établissement des structures secondaires, maintient la conformation dans un état d’ordre, et
est donc un processus entropiquement défavorable. Cependant, l’établissement de nombreuses
liaisons faibles entre les acides aminés de la protéine peut compenser la perte entropique par
une diminution suffisante de l’enthalpie et donc de l’enthalpie libre. Lorsqu’elle arrive au
contact d’une surface, ce sont les variations d’enthalpie et d’entropie qui vont également
favoriser ou non l’adsorption de la protéine et éventuellement la réorganisation de sa
structure.
2) Adsorption d’une sphère dure
Energies mises en jeu
Dans le cas de sphères dures, la conformation, maintenue par des liaisons covalentes
n’est pas modifiée par l’interaction avec une surface. L’adsorption, n’entraîne donc pas de
variation d’entropie conformationnelle pour la protéine. Elle peut cependant être favorisée par
une augmentation d’entropie, non pas de la particule, mais du solvant (fig.25.a). La libération
de contre-ions ou de molécules d’eau de la sphère de solvatation de la protéine et de la surface
induit en effet une restructuration des molécules d’eau qui peut être entropiquement plus
favorable (induire un plus grand ‘désordre’ des molécules d’eau) que lorsque la protéine est
en solution.
Figure 25.a. Adsorption d’une sphère dure : entropie du solvant.
Avant l’adsorption, les molécules de solvant (ici l’eau, représentée en noir et blanc) sont ordonnées sur la surface
et autour de la protéine. L’adsorption entraine une réorganisation des ces molécules et peut ainsi augmenter
l’entropie du solvant.
Dans le cas de particules chargées, l’adsorption est majoritairement gouvernée par les
interactions à longues portées de type électrostatique (fig.25.b). Elle est également alors, de
fait, limitée par les répulsions qui s’exercent entre particules.
68
Figure 25.b. Adsorption d’une sphère dure : interactions électrostatiques et volume exclu.
Les particules chargées peuvent être soumises à des interactions électrostatiques répulsives entre elles et
attractives ou répulsives avec la surface. La sphère autour de l’une des particules adsorbées (représentées en
projection sur la surface) représente la sphère de volume exclu, c'est-à-dire la distance minimale à laquelle le
centre d’une autre particule peut se trouver, au vu des contraintes stériques et électrostatiques.
Protéines assimilables à des sphères dures
Certaines petites protéines compactes, comme le lysozyme ou la ferritine, qui
subissent peu de changements de forme suite à leur adsorption, ont un comportement qui peut
être approché par celui de sphères rigides (Ravichandran et Talbot, 2000; Stenberg et Nygren,
1991). Cependant, si l’adsorption de ces protéines induit peu de changements de compacité,
observables en microscopie électronique ou à force atomique, elle peut induire des
changements importants de structures secondaires comme c’est le cas du lysozyme par
exemple (Sethuraman et Belfort, 2005; Sethuraman et al, 2004).
3) Adsorption d’une protéine flexible
Gain entropique et dépliement
Si on prend le cas simple d’une surface dont la chimie permet d’établir des liaisons
avec la protéine qui compensent exactement les liaisons présentes dans la conformation native
de la protéine, on peut considérer nulle la variation d’enthalpie au cours de l’adsorption
(fig.26). Ce cas permet (si on néglige par ailleurs les variations d’enthalpie libre du solvant)
de comprendre comment l’adsorption d’une protéine, qui établit des liaisons avec la surface,
conduit à son dépliement, l’entropie de la protéine étendue étant plus importante que
l’entropie de la forme compacte (Fernandez et Ramsden, 2001).
69
Figure 26. Adsorption d’une protéine flexible.
Dans le cas simple représenté ici, l’enthalpie d’adsorption est nulle, et l’adsorption est favorisée par
l’augmentation d’entropie qu’induit le dépliement de la protéine.
A chaque protéine son mécanisme d’adsorption ?
Si les contributions thermodynamiques de l’adsorption de différents types d’acides
aminés sur des surfaces hydrophobes, hydrophiles neutres ou chargées peuvent être
approchées par le calcul (Latour et Hench, 2002), la contribution de l’ensemble de ces acides
aminés dans l’adsorption d’une protéine reste difficile à prédire. Dans le cas général, les
liaisons qui peuvent s’établir entre une protéine et une surface dépendent de la chimie de la
surface et de la composition en acides aminés de la protéine, mais également des liaisons
intramoléculaires dans la conformation native de la protéine, de l’accessibilité des acides
aminés au solvant, et du solvant lui-même. Tous ces paramètres vont modifier non seulement
les états d’équilibre conformationnels de la protéine adsorbée, mais également la stabilité de
la conformation native de la protéine par rapport aux interactions qui peuvent s’établir avec la
surface, c’est-à-dire la possibilité pour une protéine de basculer d’un état à l’autre. La balance
entre les effets entropiques et enthalpiques lors de l’adsorption est donc très subtile et la façon
dont une protéine s’adsorbe sur une surface semble en fait dépendante de chaque triptyque
protéine/surface/solvant donné.
Ainsi, l’adsorption d’une protéine ne conduit-elle pas systématiquement à la perte de
structures secondaires. L’adsorption sur une même surface peut induire la formation ou la
disparition d’hélices α selon la protéine considérée (Norde et Zoungrana, 1998). La
conformation de la protéine adsorbée peut par ailleurs dépendre de l’orientation de la protéine
au moment du contact avec la surface (Raffaini et Ganazzoli, 2004) et plusieurs
conformations d’une même protéine peuvent être trouvées sur une surface au cours de la
même expérience d’adsorption (Bergkvist et al, 2003). Malgré la difficulté de déterminer
70
précisément les comportements de protéines aux interfaces, certains mécanismes communs
ont été identifiés.
Surface hydrophobe versus surface hydrophile
De nombreuses protéines s’adsorbent de façon plus importante sur une surface
hydrophobe que sur une surface hydrophile (Tunc et al, 2005; Kim et Somorjai, 2003; Norde
et Zoungrana, 1998). Les fluides physiologiques sont des solvants aqueux et la majorité des
protéines connues est notamment structurée de manière à prévenir l’exposition des
groupements apolaires au solvant, c'est-à-dire via l’enfouissement de ces groupements au
cœur de la structure. La déshydratation des groupements hydrophobes de la protéine lors de
l’adsorption, induisant une réorganisation du solvant plus importante que lors de
l’établissement d’interactions ioniques entre la protéine et une surface hydrophile, serait ainsi
énergétiquement favorable. De même, le dépliement nécessaire à l’exposition des
groupements polaires, conduit, en général, à l’observation d’une plus grande dénaturation des
structures secondaires de la protéine, sur une surface hydrophobe (Tunc et al, 2005; Norde et
Zoungrana, 1998). Enfin, l’adsorption peut entraîner des modifications importantes de la
structure tertiaire des protéines. On observe ainsi, pour des protéines de haute masse
moléculaire, une conformation plus compacte lorsqu’elles sont adsorbées sur une surface
hydrophobe que sur une surface hydrophile. C’est le cas du fibrinogène (Tunc et al, 2005), du
facteur Von Willebrand (Raghavachari et al, 2000) ou de la fibronectine, illustré sur la figure
27 (Baugh et Vogel, 2004; Bergkvist et al, 2003).
Figure 27. Observation de la fibronectine adsorbée en microscopie à force atomique
La fibronectine est adsorbée a) une surface hydrophile et b) une surface hydrophobe (Bergkvist, 2003). Chaque
image, qui représente un champ de 750x750 nm, illustre la conformation de la fibronectine majoritaire sur
chaque surface, étendue sur la surface hydrophile, et compacte sur la surface hydrophobe.
71
III.3.Assemblages protéiques induits par l’adsorption
Les processus d'organisation de particules sur une surface font l'objet de nombreux
modèles que l'on peut séparer en deux types d'approches : l'adsorption séquentielle de
particules en solution sur une surface et la croissance d'amas par diffusion/agrégation sur la
surface.
III.3.a. Modèles d'adsorption séquentielle
1) Adsorption hors équilibre
Modèle de Langmuir
Le premier modèle utilisé pour décrire la cinétique d'adsorption de particules sur une
surface est le modèle de Langmuir. Ce modèle suppose un système à l'équilibre pour lequel,
dans des conditions données d'interactions entre la surface et les particules, la variation de la
quantité de particules adsorbée ne dépend que de la concentration en solution. Ce modèle
permet de caractériser des systèmes expérimentaux lorsque les temps d'expérience sont
suffisamment longs pour que l'équilibre à la surface s'établisse ou lorsque l'échange de
particules est très rapide entre le solvant et la surface. Selon le modèle de Langmuir, la
cinétique d’adsorption est définie par
dθ
= kaC0 (θ ∞ − θ ) − kdθ ,
dt
où θ représente la fraction de surface occupée par les particules adsorbées, C0, la
concentration initiale en solution, ka et kd, les constantes respectivement d’adsorption et de
désorption, et θ∞, la densité de surface maximale. A chaque instant l’adsorption n’est donc
limitée que par la fraction totale de surface libre, ce qui suppose un temps caractéristique de
diffusion le long de la surface très faible devant le temps caractéristique d’adsorption.
De nombreux systèmes d'adsorption de particules expérimentaux sont hors équilibre,
les temps de relaxation étant largement supérieurs aux temps d'observation. C’est notamment
le cas des protéines.
Adsorption irréversible des protéines
Les liaisons qui se forment entre une protéine et une surface sont des liaisons faibles,
pouvant faire intervenir des forces de van der Waals, des interactions hydrophobes ou
électrostatiques, ou encore des liaisons hydrogènes. Toutes ces interactions permettent
d’établir des liaisons dont l’énergie est comprise entre 1 et 40 kJ/mole environ (une liaison
72
covalente correspondant à ~300kJ/mole). Les protéines peuvent cependant établir des dizaines
de liaisons faibles avec une surface. A une température donnée, la probabilité de rupture
simultanée de ces liaisons (et donc de désorption de la protéine) varie comme une loi de
puissance de la probabilité de rupture d’une seule liaison. Par exemple, la fréquence de
rupture d’une liaison, p, peut être estimée par
p= e-E/kT/J,
où E est l’énergie de la liaison, e-E/kT la probabilité associée, donnée par la distribution
des états d’énergie de Boltzmann, et J la période de vibration atomique en secondes, c'est-àdire que les atomes ont une chance d’être séparés toutes les J secondes.
Avec J~10-13s, E~40 kJ/mol pour une liaison ionique, et kT~2,576 kJ/mol à 37°C, il
vient
p ~1,8.106 s-1.
Si on considère maintenant une protéine ayant établi 10 liaisons ioniques avec la surface, la
probabilité de rupture simultanée de ces 10 liaisons est alors
p = e-10E/kT/J ~3,6.10-55.s-1
La force de l’interaction avec la surface augmente ainsi très vite avec la taille de la
particule adsorbée et conduit à une adsorption certainement irréversible dans le temps de
l’expérience pour les protéines. Cette approximation n’est bien sûr vérifiée que pour des
protéines dont l’adsorption n’induit que la formation de liaisons avec la surface, sans
changement majeur de conformation (donc de l’état d’énergie conformationnel) mais elle
donne un aperçu du fossé qui sépare l’adsorption de protéines (et les colloïdes en général) de
celle d’ions par exemple. Le temps de désorption d’une protéine, s’il n’est pas infini, est
cependant largement supérieur au temps d’adsorption. Cette irréversibilité, partielle ou totale,
implique une adsorption hors équilibre et donc une dépendance de la cinétique d'adsorption à
l'histoire du processus. Une telle dépendance a par exemple été mise en évidence pour
l'adsorption de la fibronectine sur le titane (Tie et al, 2003) ou de la sérumalbumine sur
l'hydroxyapatite (Mura-Galelli et al, 1991). Les cinétiques dites de Langmuir ne permettent
pas d’expliciter cette dépendance, au contraire des modèles d’adsorption séquentielle.
Adsorption séquentielle
L'adsorption séquentielle sur un réseau 2D s'établit suivant le schéma général suivant :
Un site est aléatoirement choisi sur la surface, puis, l'adsorption d'une particule sur ce site est
acceptée ou rejetée en fonction d'un certain nombre de règles selon le système considéré et en
73
particulier selon le type d'interactions entre les particules. De façon générale, dans ce type de
modèle l'interaction attractive entre un objet et la surface est supposée très grande devant
l'interaction entre deux particules. Cette caractéristique des modèles de SA se traduit par une
adsorption irréversible et l’impossibilité pour une particule de diffuser dans le plan de la
surface une fois adsorbée. La structuration des particules adsorbées ne dépend donc que des
interactions entre les particules avant l'adsorption, et éventuellement des mécanismes de
transport de la solution à la surface: gravité, mouvement brownien1 ou interactions
électrostatiques.
2) Interactions de volume exclu : Random Sequential Adsorption (RSA)
Le plus simple de ces modèles, l'adsorption séquentielle aléatoire (RSA), consiste en
l'adsorption immédiate sur le site choisi si celui-ci est libre et le rejet de toute adsorption sur
un site déjà occupé. Ce modèle ne prend donc en compte que les interactions de volume exclu
entre deux particules et conduit à une densité limite de recouvrement de la surface de l'ordre
de 55% pour des particules isotropes (Feder, 1980). Cette valeur est très proche des résultats
expérimentaux pour des particules colloïdales sphériques rigides (Onoda et Liniger, 1986). La
cinétique initiale du processus est proche de celle décrite par le modèle de Langmuir, l’effet
de l’encombrement stérique étant limité à faible densité de surface (Schaaf et Talbot, 1989a;
Schaaf et Talbot, 1989b), mais dévie largement à l’approche de la saturation où l’écart à la
densité maximale varie comme une puissance -½ du temps, en deux dimensions.
Les effets de volume exclu sont naturellement sensibles à la forme des particules
adsorbées. Pour des particules de forme très étirée, la densité de saturation de la surface varie
ainsi comme une loi de puissance du rapport longueur/largeur des particules considérées (Viot
et al, 1992). La forme elliptique des particules adsorbées ralentit également la cinétique
d’adsorption à l’approche de la saturation, les effets d’orientation exclue s’ajoutant aux effets
de volume exclu (fig.28) et augmentant les échecs des tentatives d’adsorption (Talbot et al,
1989).
1
En 1827, le botaniste écossais Robert Brown observe le mouvement rapide et désordonné de grains de pollens
en suspension dans l’eau. On appelle depuis mouvement brownien le mouvement aléatoire de petites particules
solides sous l'impact des molécules d'un fluide (gaz ou liquide), possédant une énergie cinétique microscopique
liée à la température. Le mouvement brownien est ainsi parfois confondu dans l’appellation avec l’agitation
thermique qui le provoque.
74
Figure 28. Effet de volume exclu lors de (a) l’adsorption de sphère et (b) l’adsorption d’ellipses.
Dans le cas d’ellipses, outre la surface exclue de l’adsorption, du fait de l’encombrement des voisines, certaines
orientations sont également exclues. Dans l’exemple, pour une protéine centrée sur la même position,
l’orientation (b.1) résulte en un échec et (b2) en la réussite de l’adsorption de la protéine.
Dans le cas de protéines, sphères non parfaites et déformables, comme la ferritine
(Feder, 1980) ou la transferrine (Ramsden, 1993), la densité maximale de recouvrement
prédite par un modèle de RSA de disques, sous-estime les données expérimentales. A partir
du modèle de RSA simple, ont donc été développées différentes approches pour retrouver les
caractéristiques observées d'un certain nombre de systèmes expérimentaux.
3) Interactions attractives/répulsives entre particules
Flocculation/rejection model
L'une de ces approches, développée par Provatas et coll. (Provatas et al, 2000;
Asikainen et Ala-Nissila, 1999) tient compte des interactions attractives ou répulsives entre
deux particules plus proches voisines. Un site est choisi aléatoirement puis l'adsorption d'une
particule sur ce site est testée selon deux types de règles: dans le modèle de rejet (Asikainen et
Ala-Nissila, 1999), si le site est occupé la particule a une probabilité p de s'adsorber. Si le site
est libre, l'adsorption est immédiate. Ce modèle permet de simuler des interactions répulsives
entre particules d'autant plus fortes que p est petite. La densité maximale de recouvrement est
inférieure à la limite en RSA.
Dans le modèle de floculation, au contraire, si le site est occupé, l'adsorption est
immédiate et si le site est libre, la particule a une probabilité d'adsorption q. L'adsorption par
floculation favorise l'adsorption dans des zones où une adsorption a déjà eu lieu, en
permettant les chevauchements entre particules, et entraîne ainsi la formation d’amas. Ce
modèle permet de décrire des interactions attractives entre un objet en solution et un objet
adsorbé mais également des systèmes dans lesquels des amas sont formés en solution avant
l'adsorption proprement dite. Dans le cas où q=0, seule l'adsorption de particules en contact
est acceptée et entraîne la formation d'un amas unique à partir d'une particule initialement
déposée.
75
Répulsions électrostatiques entre objets chargés
Cette approche prend en compte les interactions électrostatiques entre une nouvelle
particule et les particules déjà adsorbées. Si l'énergie résultante est supérieure à un seuil,
l'adsorption sur un site libre est rejetée. La barrière de potentiel à franchir pour atteindre la
surface est fonction de la répulsion avec les autres particules et de l'attraction qu'exerce la
surface. Pour chaque configuration et chaque site choisi, il existe une hauteur à laquelle
l'énergie d'interaction est maximale. Si les particules déjà adsorbées sont très éloignées du site
choisi, cette hauteur est nulle et la barrière correspond alors à l'énergie d'interaction
électrostatique calculée en 2D (Oberholzer et al, 1997). Ce modèle est appliqué à l'étude de
l'adsorption de sphères de polystyrène chargées positivement sur une surface de mica
négative. La densité de sphères de polystyrène adsorbées, mesurée par AFM, augmente avec
la force ionique, et donc l'écrantage des répulsions entre particules, ce que décrit correctement
le modèle d'Oberholzer. Ce modèle décrit également correctement l’adsorption de billes de
latex (Johnson et Lenhoff, 1996). Il semble, en revanche, que la description de l’effet des
interactions électrostatiques sur l’adsorption de petites protéines, comme la ferritine, nécessite
de tenir compte de l’écrantage de l’attraction entre les protéines et la surface, concomitant à
l’écrantage des répulsions entre particules (Johnson et al, 2000). Par ailleurs, dans le cas de
protéines assimilables à des sphères rigides, l’asymétrie de la distribution des charges
intervient dans la dynamique d’adsorption. Ainsi, la surface du lysozyme est constituée d’une
combinaison de domaines de charges négatives et positives et malgré une charge nette
positive, l’adsorption du lysozyme, qui peut avoir lieu sur une surface chargée positivement,
dépend de l’orientation de la protéine et donc de sa diffusion rotationnelle en solution
(Ravichandran et al, 2001).
4) Transport des particules vers la surface
Diffusion aléatoire des particules en solution
Le choix aléatoire d'un site d'adsorption ne tient pas compte de la façon dont les
molécules diffusent de la solution vers la surface. Une façon de la considérer est de faire
suivre à chaque particule une marche aléatoire en 3D sur un réseau cubique à partir d'une
position aléatoirement choisie dans un plan parallèle à la surface. Si la particule passe par un
plan supérieur prédéterminé, on considère qu'elle s'est échappée à l'infini et une nouvelle
particule est choisie. Si la particule se trouve en contact avec la surface, elle est
76
irréversiblement adsorbée. Par rapport au modèle original de RSA, dans ce modèle, en cas de
chevauchement de protéines lors d’un essai d’adsorption, un nouveau site n’est pas choisi au
hasard mais la particule peut continuer de diffuser à partir de sa position précédente. Ce
modèle donne en fait des résultats identiques au modèle RSA en terme de densité de surface
maximale et de configuration de particules adsorbées (Senger et al, 1991). Seule la cinétique
d'établissement varie, plus lente en considérant la diffusion à l'approche de la saturation
(Schaaf et al, 1991). La diffusion d’une particule à partir de sa position précédente, en cas de
chevauchement, introduit également une corrélation spatiale entre les sites d’adsorption,
d’autant plus importante que la diffusion en solution est lente, mais ces effets, qui augmentent
la densité de saturation et modifient la cinétique en une dimension apparaissent cependant
négligeables en deux dimensions (Luthi et al, 1997).
Effet de la gravité (BD, Ballistic Deposition)
Dans certains cas, la densité des particules en solution est suffisamment supérieure à
celle du solvant, pour que l’effet de la diffusion puisse être négligée devant l'effet de la
gravité sur les trajectoires des particules vers la surface qui sont alors considérées toutes
verticales. Ce type d'adsorption est dit "balistique". Un site est choisi aléatoirement sur la
surface. L'adsorption d'une nouvelle particule est immédiate si le site est libre. Si seule la
formation d’une monocouche est autorisée, l'objet peut "rouler" sur la particule avec laquelle
il entre en contact pour atteindre la surface si l'un des sites plus proches voisins est libre. Le
mécanisme de "rolling" conduit à la formation d'amas connectés de différentes tailles et à une
densité maximale de recouvrement de 61 % en 2D (Jullien et Meakin, 1992). Viot et coll. ont
généralisé adsorption séquentielle et dépôt balistique (Viot et al, 1993) en considérant p, la
probabilité d’adsorption sur un site libre et q, la probabilité d’adsorption sur la surface atteinte
après que la particule a roulé si le site choisi est occupé. Avec a =q/p = 0, on retrouve le
modèle de RSA, avec a=1, le modèle balistique.
Généralisation: Extended RSA (ERSA)
Lavalle et coll. ont développé un modèle permettant d'envisager les effets conjugués
de la gravité et de la diffusion sur l'adsorption (Lavalle et al, 1999): L'adsorption est
immédiate si le site aléatoirement choisi est libre. Si le site est occupé, un nouveau site est
choisi à une distance comprise entre 0 et dS du premier site, où dS représente la diffusion de la
77
particule. Si le site est à nouveau occupé, l'étape précédente est répétée. Le nombre maximal
d'essais d'adsorption, nS, est prédéterminé. Lorsque nS tends vers l'infini et dS vers zéro, l'effet
de la gravité est maximal et on retrouve le modèle balistique. Pour nS = 1, on retrouve le
modèle de RSA. L'ajustement des paramètres dS et nS permet notamment de retrouver les
caractéristiques d'adsorption irréversible de billes de polystyrène de différentes tailles sur du
verre.
5) Formation de multicouches
Modèle d'adsorption de fibres: 3D RSA
Ce modèle a été initialement appliqué au dépôt de fibres de cellulose dans la
constitution de feuilles de papier (Provatas et al, 2000). Les fibres ont une flexibilité
maximale finie, correspondant à une différence d'altitude maximale entre 2 sites consécutifs
d’une fibre (fig.29). Toutes les fibres sont initialement orientées dans le plan perpendiculaire
à la direction de l'adsorption et sont déposées aléatoirement. Lorsqu'un de leur segment se
trouve en contact avec une ou plusieurs fibre(s) déjà adsorbée(s), elles sont déformées pour
que chaque segment soit à l'altitude minimale en respectant la contrainte de flexibilité.
Aucune interaction entre les fibres n’étant considérée, le réseau formé est désordonné.
Figure 29. Modélisation de l’adsorption de fibre d’après (Provatas et al, 2000).
(a) Les fibres sont modélisées par des enchaînements de Lf segments de taille 1. Tf représente la flexibilité d’une
fibre, c'est-à-dire la différence d’altitude maximale entre deux segments consécutifs d’une fibre. (b) Exemple
d’un réseau simulé de fibres.
Généralisation BD, RSA et formation de multicouches
Une généralisation des modèles de RSA et de BD permet d'inclure la formation de
multicouches (Yang et al, 1998). Deux paramètres sont définis initialement, δ1, le paramètre
d'adsorption et δ2 le paramètre de ‘rolling’. L'adsorption est immédiate sur un site libre. Si le
78
site est occupé par tout ou partie d'une particule adsorbée, on calcule δ la longueur de
surplomb de la surface par la particule en contact avec une particule adsorbée :
δ
Figure 30. Longueur de surplomb de la surface d’une particule en contact avec une particule adsorbée
(d’après Yang, 1998).
Si cette longueur est inférieure à δ1, la particule s'adsorbe sur le site de contact. Si δ
est comprise entre δ1 et δ2, un autre site est choisi. Enfin, si δ est supérieure à δ2, la particule
"roule" pour atteindre la surface. Pour δ1=0, on retrouve le modèle balistique, tandis que
δ1=δ2=1 correspond au modèle de formation de multicouches par RSA.
Modèle balistique
La formation de multicouches par dépôt balistique donne des structures plus ou moins
compactes selon que l'adsorption d'une particule ne peut se faire que par contact vertical avec
une autre, ou qu'un contact latéral suffit à maintenir la particule à une hauteur donnée. Dans le
premier cas, si le site choisi est occupé par une particule, et est un maximum local (aucune
première voisine n'a une hauteur supérieure), la nouvelle particule roule sur ses voisines
jusqu'à atteindre un minimum local (aucune des particules premières voisines n'à une hauteur
inférieure). Lorsque ce minimum local est atteint, la particule s'y adsorbe. La particule
pouvant rouler sur les autres sans limite de distance, les structures résultantes sont très
compactes. Dans le second cas, une position est aléatoirement choisi sur la surface initiale,
puis la hauteur attribuée à une nouvelle particule sur ce site correspond au maximum des
hauteurs des particules adsorbées sur les sites premiers voisins du site choisi, ce qui conduit à
des structures très ramifiées (Meakin et Jullien, 1990).
Les différents modèles d'adsorption séquentielle permettent de simuler la formation de
multicouches, l'effet de la gravité et/ou de la diffusion brownienne des particules en solution
sur le transport jusqu'à la surface. Si les modèles balistique et de floculation produisent des
structures réellement connectées, aucun réarrangement après l'adsorption n'est considéré. Le
degré d'ordre de certaines structures observées expérimentalement laisse supposer ce
réarrangement, envisagé par des modèles incluant une diffusion des particules adsorbées le
79
long de la surface.
III.3.b. Diffusion des particules adsorbées
1) Agrégation limitée par la diffusion (DLA)
Le modèle de diffusion-agrégation a initialement été développé par Witten et Sander
(Witten et Sander, 1981). Leur modèle est basé sur la croissance d'amas par agrégation de
marcheurs aléatoires. Une particule origine est positionnée et fixée au départ de la croissance.
A chaque étape du modèle une particule est introduite à une distance très grande de l'amas
déjà formé. Cette particule suit une marche aléatoire sur la surface jusqu'à s'échapper vers
l'infini ou rencontrer l'amas. Dans ce dernier cas, elle reste fixée au point de contact et un
nouveau diffuseur est introduit. La probabilité pour une particule d’atteindre l’intérieur de
l’amas décroît au fur et à mesure de la croissance de l’amas. Les structures formées sont donc
peu denses et ont un aspect dendritique (fig.31). Ces amas ont une dimension non entière,
inférieure à la dimension de l’espace, ce sont des structures fractales. Leur dimension fractale,
Df, est d’environ 1.7 en deux dimensions.
Figure 31. Amas DLA de 3600 particules sur un réseau carré. Df~1.65 (Witten et Sander, 1981).
Si une seule particule origine est présente dans ce premier modèle, Witten a par la
suite étudié l'effet de plusieurs origines sur la surface au départ de la croissance dans deux
cas: Dans le premier, toutes les particules sont déposées sur la surface puis diffusent. Dans le
second, chaque particule déposée diffuse jusqu'à rencontrer un amas ou une particule origine
avant que ne soit introduite une nouvelle particule (Witten et Meakin, 1983). Dans les deux
cas, toute particule qui rencontre un amas connecté à une particule origine, ou l'une des
80
particules origines, reste irréversiblement positionnée au site de contact. Les amas formés
autour des sites initiaux de croissance sont très similaires aux structures obtenues en diffusion
agrégation avec un seul site de croissance. La connexion des amas formés autour de chaque
particule requiert une forte densité de surface de particules dans le premier modèle et est peu
probable dans le second, la séparation entre deux amas étant finalement aussi peu
probablement accessible par une particule qui diffuse aléatoirement que l'est ‘l'intérieur’ d'un
amas dans le modèle initial de Witten (fig.32).
Figure 32. Amas DLA formés à partir de deux particules origines d’après (Witten et Meakin, 1983).
Les deux particules origines sont initialement séparées par 9 sites. Au fur et à mesure de la croissance des amas,
la zone de séparation (entourée en rouge) devient inaccessible, comme l’est l’intérieur d’un seul amas dans le
modèle original (fig.31).
Dans le cas d’interactions des particules adsorbées avec la surface suffisamment
faibles devant les interactions entre les particules elles-mêmes, la diffusion des amas sur la
surface peut également être envisagée, ce qui conduit à des structures de dimension fractale
inférieure aux amas DLA (Meakin, 1983). Un tel modèle permet ainsi de générer des amas
ramifiés et disséminés, comparables aux observations expérimentales d’acides biliaires en
microscopie électronique (Shen et al, 2003).
2) Interactions entre particules
Le modèle de DLA, initialement développé pour décrire la formation d’amas de
particules métalliques autour d’électrodes, s’est avéré refléter un mécanisme universel
permettant la description de nombreux phénomènes d’agrégation. Le modèle initial suppose
une agrégation immédiate en cas de contact entre deux particules. La prise en compte de
différents types d’interactions entre particules permet de décrire des comportements
spécifiques d’adsorption de protéines. Par exemple, lorsque l’agrégation de deux particules
nécessite plusieurs contacts avant de se produire, le phénomène n’est plus limité par la
diffusion mais par la réaction (RLA). En pratique cela revient à associer à l’agrégation une
81
probabilité inférieure à 1. Les particules ayant la possibilité de visiter un plus grand nombre
de sites, ont la possibilité de pénétrer les amas. Ceux-ci sont donc plus compacts que les amas
DLA et leur dimension tend alors vers la dimension de l’espace (fig.33). Ce type de modèle
permet par exemple de simuler l’agrégation de particules soumises à des interactions
répulsives à courte portée, qui doivent franchir une barrière énergétique avant de pouvoir
s’agréger (Weitz et al, 1985).
Figure 33. Effet de la probabilité d’agrégation sur la morphologie des amas formés par diffusion
agrégation.
Les amas générés pour une probabilité d’agrégation Pag=1 correspondent au modèle DLA. A partir et en deçà
d’une probabilité d’agrégation de 10-3, les amas sont très compacts (images tirées du site
http://www.physics.uc.edu/~pinskia/dla/DLA.html, d’Andrew Pinski).
La diffusion agrégation réversible permet par ailleurs de décrire la formation d'amas
de ferritine. Dans ce modèle, l'association et la dissociation possibles d'une particule et d'un
agrégat sont dépendantes des interactions latérales avec les particules voisines ce qui génère
des amas concordant avec les observations en microscopie électronique d'agrégats de ferritine
(Stenberg et Nygren, 1991).
Kim et coll. ont simulé la formation d'agrégats de deux types de particules de charge
opposée en 3D (Kim et al, 2003). Les particules sont initialement positionnées aléatoirement
puis diffusent. La diffusion de chaque particule à chaque pas de temps tient compte de la force
thermique
aléatoire
et
de
la
force
électrostatique
résultant
des
interactions
attractives/répulsives entre les particules deux à deux. Les structures résultantes sont des amas
hétérogènes ramifiés dans lesquels les particules positives et négatives sont disposées en
alternance. Si la dimension des agrégats simulés est supérieure a celle des observations
expérimentales d'agrégation de sphères de polystyrène chargées, les structures sont néanmoins
qualitativement similaires.
Enfin, les processus de diffusion-agrégation pourraient être impliqués dans la
croissance d’amas fibrillaire de collagène. Un modèle, dans lequel l’agrégation entre deux
82
particules n’est permise que si le recouvrement de ces deux particules correspond à un
multiple d’une fraction de la longueur de la particule, permet ainsi de générer des amas dont
la morphologie apparaît proche des amas fibrillaires observés expérimentalement (Parkinson
et al, 1994).
3) Diffusion des particules adsorbées séquentiellement
L'observation expérimentale de structures connectées et d’un recouvrement supérieur à
la limite des modèles d’adsorption séquentielle a conduit à l’établissement de modèles dans
lesquels les particules peuvent diffuser dans le plan de la surface, une fois adsorbées.
La modulation du rapport entre le flux d’adsorption et le coefficient de diffusion d’une
particule permet de passer de façon continue de l’adsorption séquentielle simple (longueur de
diffusion nulle) à la génération d’amas de DLA (la longueur de diffusion moyenne d’une
particule excède la taille du système et un seul amas est constitué) (Jensen et al, 1995; Jensen
et al, 1994).
Ce modèle peut être adapté à l’adsorption de particules chargées, l'adsorption d'une
nouvelle particule sur un site dépendant alors de l'énergie résultant des interactions
électrostatiques avec les particules déjà adsorbées, comme dans le modèle développé par
Oberholzer et coll. (cf. III 1.a). Une augmentation de la force ionique se traduit par une
diminution des interactions répulsives entre particules et donc une augmentation de la densité
de particules adsorbées. Ce modèle est appliqué à l'adsorption du lysozyme et les
configurations simulées de particules adsorbées résultantes mettent en évidence la formation
d’amas et de chaînes, à forte force ionique et à faible concentration. Ceci correspond aux
observations expérimentales d'augmentation d'ordre, avec l'écrantage ou avec la diminution de
la concentration de protéines en solution (Ravichandran et Talbot, 2000).
III.3.c. Modèles
d’adsorption
de
colloïdes
et
changement
de
conformation
La plupart des protéines subissent une dénaturation suite à leur adsorption (cf. IV.2.b).
Cette dénaturation conduit dans certains cas à la modulation des interactions entre protéines
ou à la modification de leur structure tridimensionnelle. Dans les deux cas ces changements
83
de structures peuvent donc influer sur la cinétique d’adsorption et la morphologie des
monocouches formées.
1) Cinétique d’adsorption
En terme cinétique, la dépendance des processus d’adsorption aux changements de
conformation induits par l’adsorption avait été observée lors des premières mesures
expérimentales de processus d’adsorption séquentielle. L’adsorption de la ferritine est ainsi
correctement prédite par un modèle de RSA mais pour des faibles concentrations de protéines
(Ramsden, 1993). Lorsque la concentration augmente, la déviation par rapport aux prédictions
du modèle de Schaaf et Talbot (Schaaf et Talbot, 1989b) laisse ainsi supposer que la surface
de contact entre la surface et la protéine (‘l’empreinte’ de la protéine sur la surface) varie, du
fait de l’encombrement stérique sur la surface. Effectivement, un modèle d’adsorption
séquentielle qui tient compte de ce dépliement des protéines à la surface, limité par
l’encombrement stérique lorsque la densité de surface augmente, parvient à approcher plus
justement la cinétique d’adsorption de la ferritine (Van Tassel et al, 1996).
Le développement de modèles d’adsorption séquentielle incluant un changement de
conformation prédit également correctement les cinétiques d’adsorption de la fibronectine sur
le titane. Dans ce modèle, la fibronectine est considérée comme une sphère de rayon 20nm
dont le rayon triple après étalement sur la surface. La fraction de fibronectine dans une
conformation étendue diminue avec l'augmentation de la concentration de la protéine en
solution, et donc du taux d'adsorption (Brusatori et Van Tassel, 1999; Van Tassel et al, 1998).
Les modèles plus récents, qui incluent la possibilité de multiples états conformationnels d’une
protéine, mettent en évidence une dépendance non monotone de la densité de protéines et du
recouvrement de la surface en fonction de la concentration par exemple (Szöllosi et al, 2004).
Ce type de comportement reste à démontrer expérimentalement, d’autant que les observations
d’adsorption de protéines sur des surfaces montrent en général 1 ou 2 états distincts ce qui
suppose que la maximisation de la surface de contact est relativement rapide.
2) Morphologie des amas formés
Si plusieurs auteurs se sont intéressés à l’effet du dépliement sur la cinétique
d’adsorption d’une protéine, peu d’informations sont disponibles sur l’effet de ce dépliement
sur la morphologie des monocouches protéiques résultantes. La plupart des modèles
84
d’adsorption séquentielle considèrent une adsorption irréversible ou une faible désorption de
la protéine. Pourtant, la diffusion d’une protéine à la surface est énergétiquement plus
favorable que sa désorption et a un effet majeur sur la morphologie des amas, comme le
montre les modèles de diffusion-agrégation. Par ailleurs, la fibronectine serait susceptible de
diffuser suite à son adsorption. En effet, lors d’une expérience d’adsorption de la fibronectine
sur un oxyde de titane, le remplacement de la solution de protéines par une solution de
rinçage entraîne une désorption. Après ce rinçage, l’adsorption de la fibronectine est plus
rapide que l’adsorption initiale, laissant supposer un regroupement des molécules à la surface
et donc une possible réorganisation en amas par diffusion (Tie et al, 2003).
85
86
Matériels et Méthodes
87
I.Matériaux
I.1. Céramiques d’Hydroxyapatite
I.1.a. Synthèse
L’obtention d’une céramique d’hydroxyapatite pure a nécessité de tester des poudres
d’hydroxyapatite de diverses origines (cf. partie Résultats I).
Les céramiques d’hydroxyapatite commerciales initialement testées proviennent de la
société Biocétis et les poudres d’hydroxyapatite des sociétés Biorad, Sigma-Aldrich, et Acros
Organics.
La poudre d’hydroxyapatite, finalement utilisée pour l’ensemble des expériences
d’adsorption de la fibronectine présentées, provient du laboratoire de Science des Procédés
Céramiques et Traitement de Surface (SPCTS UMR CNRS 6638, Université de Limoges,
France). C’est une apatite synthétisée par voie humide (Raynaud et al, 2002b). Brièvement,
une solution de diammonium phosphate est incorporée à une solution de nitrate de calcium
dans un rapport molaire final Ca/P de 10/6. Pendant la réaction, qui se déroule sous
atmosphère d’argon, le pH est maintenu à 9 par addition d’ammoniaque, et la température à
90°C. Après incorporation de la totalité du phosphate, la maturation de la réaction se déroule
pendant 15 à 20 minutes. L’ammoniaque est éliminé par centrifugation et séchage.
L’hydroxyapatite est ensuite calcinée 2h à 750°C.
La poudre d’hydroxyapatite ainsi obtenue est mise en forme par pressage à l’aide
d’une presse isostatique. Les pastilles sont formées par pression entre deux enclumes en acier
de 13mm de diamètre, pendant 15 secondes sous 75 MPa de pression. Enfin, les pastilles sont
frittées 2h à 1200°C, la vitesse de chauffe étant de 50°C.min-1 (Four Nabetherm B130 ).
La veille d’une expérience d’adsorption de la fibronectine, les céramiques sont
immergées à 37°C dans le tampon d’adsorption pour permettre l’équilibration thermique et
chimique de la surface.
I.1.b. Caractérisation
La synthèse d’hydroxyapatite peut conduire à la présence de deux contaminants
principaux. Si le rapport Ca/P de départ est légèrement au-dessus de 10/6 la phase secondaire
formée est de la chaux CaO, si ce rapport est inférieur à 10/6 la phase secondaire est le
88
phosphate tricalcique, TCP, Ca3(PO4)2 (Wang et al, 2003). La présence de chaux, qui diminue
l’acidité du milieu, est détectée par virage d’un indicateur coloré, la phénolphtaléine. La
présence de TCP est vérifiée par diffraction de rayons X. Le profil de diffraction est enregistré
pour un angle 2θ compris entre 27 et 34°, par pas de 0.04° (Siemens D5000 diffractometer,
Germany) avec la radiation Cu Kα. L’hydroxyapatite utilisée ne présente ni chaux ni TCP en
quantités détectables.
I.2.Autres matériaux
Les pastilles d’acier inoxydable, de polycarbonate et de verre sont des disques de
12,7mm de diamètre et de 3mm d’épaisseur (BioSurfaces Technologies Corp., USA).
Contrairement aux céramiques d’hydroxyapatite, les pastilles de ces matériaux sont nettoyées
et réutilisées. Les pastilles sont nettoyées à l’aide d’un détergent, puis trempées 15 minutes
dans de l’acide chlorhydrique 0.2N. Elles sont ensuite nettoyées aux ultra-sons dans de l’eau
distillée 15min à 60°C (Ultrasonic cleaner 2510, Branson Ultrasonics Corp, USA), et enfin
rincées à l’alcool à 70°. L’inox ne tolérant pas l’acide subit le même nettoyage à l’exception
du bain d’acide chlorhydrique.
I.3.Microscopie à force atomique
Le principe de la microscopie à force atomique est basé sur la détection des forces
inter-atomiques (électrostatiques, van der Waals, frictions) s'exerçant entre une pointe
associée à un levier de constante de raideur fixe, le cantilever, et la surface d'un échantillon
(Binning et Quate, 1986). La pointe est placée à quelques nanomètres de la surface de
l'échantillon. Elle est solidaire d'un dispositif qui guide son déplacement. Grâce à un système
de transducteurs piézoélectriques (céramiques), elle peut être finement déplacée par rapport à
l'échantillon dans les trois dimensions de l'espace. La position de la sonde est mesurée par
l'intermédiaire d'un laser focalisé à l'extrémité du cantilever (au dessus de la pointe). La
réflexion de ce signal laser, collectée sur un photodétecteur, permet de détecter les variations
locales des forces. Le principe de la mesure de la déflection de la pointe balayant l’échantillon
est illustré sur la figure 34.
89
Figure 34. Principe de fonctionnement de l’AFM
(Schéma tiré du site de Molecular Imaging, www.molec.com )
L’observation des surfaces des matériaux utilisés dans notre étude est réalisée en mode
résonnant, ou mode ‘tapping’, à amplitude constante. La pointe oscille à une fréquence
donnée, elle ne touche la surface que par intermittence et le signal enregistré est la variation
d’amplitude de l’oscillation. Cette variation est utilisée comme signal d'asservissement afin
de corriger le déplacement en z, pour conserver l'amplitude constante et ainsi suivre la
morphologie de surface. L’image résultante correspond à la cartographie en fausses couleurs
des déplacements de la pointe en z (image ‘hauteur’).
Les images sont réalisées sur un microscope à force atomique Dimension 3100
(Digital Instruments, USA). Les surfaces des matériaux sont imagées avec une pointe en
nitrure de silicium Si3N4 (Micromash Serie) de fréquence de résonance ~300kHz et de
constante de raideur 14N/m. Le nitrure de silicium est couramment utilisé en AFM pour sa
dureté et son inertie chimique. La rugosité d’une surface est évaluée par l’écart type de la
distribution des hauteurs mesurées (Nanoscope IIIa software).
90
II.Fibronectine
II.1.Purification
La fibronectine est purifiée à partir de cryoprécipité de plasma sanguin humain (don
du Laboratoire du Fractionnement et des Biotechnologies, Les Ulis, France) d’après le
protocole mis au point au sein du laboratoire ERRMECe (Poulouin et al, 1999). Ce protocole
permet l’obtention de grandes quantités de fibronectine, pure à plus de 95% en masse. Le
protocole de purification par chromatographie est basé sur l’affinité de la fibronectine pour la
gélatine et l’héparine. Les domaines principaux d’affinité de la fibronectine pour l’héparine et
la gélatine sont respectivement situés à l’extrémité C-terminale et N-terminale de la protéine.
Le passage successif sur colonne de gélatine et d’héparine permet ainsi de purifier une
protéine à la structure primaire complète. Cette combinaison de deux colonnes permet par
ailleurs de ne pas co-purifier avec la fibronectine des protéases possédant également de
l’affinité pour la gélatine.
Le cryoprécipité, conservé à –50°C, est solubilisé 3 heures dans un tampon Tris 50
mM (Trishydroxymethylaminomethane, Research Organics, USA), NaCl 150mM (Research
Organics, USA), pH 7.4, contenant 1mM d’EDTA (Ethylene Diamine Tétraacetic Acid,
Research Organics, USA), chélateur de cations divalents inhibant les métalloprotéases à zinc
et à calcium, et 1 mM de PMSF (Phenyl-methyl-sulfonylfluoride, Sigma-Aldrich, USA),
inhibiteur des protéases à serine. Le cryoprécipité, solubilisé dans un rapport de 30g pour
150mL de tampon, est ensuite centrifugé 10 minutes à 10 000 g et le surnageant conservé.
La purification sur chromatographie d’affinité se déroule à 8°C, afin de minimiser les
éventuelles dégradations protéolytiques, tout en évitant la précipitation de la fibronectine à
4°C. Le surnageant de centrifugation est chargé sur une colonne de gélatine-cellufine (Chisso
Corp., Japon). L’élution est réalisée par un Tampon Tris 50mM, EDTA 1mM (Tampon TE),
contenant de l’Urée 3M et du NaCl 250mM. L’éluat est ensuite dialysé contre du TE, afin
d’éliminer l’urée, puis chargé sur une colonne d’héparine-cellufine (Chisso Corp., Japon).
Après un rinçage au TE-250mM NaCl, l’élution de la fibronectine s’effectue par un tampon
TE contenant 500mM NaCl. Enfin, la fibronectine est à nouveau chargée sur une colonne de
gélatine, éluée avec du TE-Urée 3M-NaCl 250mM, puis l’urée et le sel sont éliminés par
dialyse.
91
La fibronectine purifiée est filtrée à l’aide d’un filtre 0.2 µm sous atmosphère stérile,
et conservée plusieurs mois à 8°C dans un tampon Tris 50mM, à une concentration de 1.5
g/L. Une gamme de quantité de fibronectine de 0.5 à 5 µg est déposée sur gel
d’électrophorèse. L’analyse densitométrique de gels SDS-PAGE colorés au nitrate d’argent
(voir III.2), sur lesquels sont déposés une gamme de quantités de fibronectine de 0.5 à 5 µg,
permet de déterminer la quantité de contaminants. Cette analyse est effectuée à l’aide du
logiciel d’analyse de gels d’électrophorèse One-DScan (Scanalytics, USA). La pureté de la
fibronectine est de 95 à 98% selon les préparations. Préalablement à chaque série
d’expérience, la fibronectine est à nouveau filtrée sur un filtre 0.2 µm.
II.2.Electrophorèses
II.2.a. SDS-PAGE
L’électrophorèse sur
gel de
polyacrylamide (PAGE : PolyAcrylamide
Gel
Electrophoresis) permet de séparer des protéines en fonction de leur masse et de leur charge.
Son principe repose sur les différences de vitesse de migration des protéines à travers les
mailles d’un gel, sous l’influence d’un champ électrique. En SDS-PAGE, les protéines sont
préalablement dénaturées par du Sodium Dodecylsulfate (SDS), qui, en s’associant aux
protéines, leur confère une charge négative. Le SDS permet ainsi de s’affranchir des
différences de migration dues aux différences de charge des protéines et de ne séparer les
protéines qu’en fonction de leur taille.
Les gels de concentration contiennent 10% de polyacrylamide et sont préparés dans un
tampon Tris 0.2M-Glycine0.1M-SDS 0.4%-Glycérol 5%, pH 8.3. Les gels de séparation
contiennent 4% de polyacrylamide et sont préparés dans un tampon Tris 50mM-SDS 0.1%,
pH 6.8. Les échantillons de protéines sont dilués dans un tampon Tris 50mM contenant du
Bleu de Bromophénol 0.04%, du SDS 1.7%, du Glycérol 25% et du β-mercaptoéthanol 5%.
Le β-mercaptoéthanol permet de réduire les ponts disulfures et donc notamment de séparer les
deux sous-unités de la fibronectine. L’intensité du champ de migration est de 20mA par gel et
la migration s’effectue dans un tampon Tris 0.1M-Glycine 0.15M-SDS 0.1%, pH 8.3. Les
bandes protéiques sont ensuite révélées par coloration au nitrate d’argent (Silver Stain kit,
Biorad) selon le protocole du fabricant. Les poids moléculaires sont déterminés par référence
à des marqueurs (High molecular weight standards, Sigma).
92
II.2.b. Native PAGE
Au contraire de la SDS-PAGE, lors d’une électrophorèse en conditions natives (native
PAGE) les protéines ne sont pas dénaturées par le SDS ou le β-mercaptoéthanol et leur
migration est alors fonction du rapport taille/charge. Cette technique nous permet ainsi de
visualiser les multimères de fibronectine qui pourraient s’être formés en solution dans les
différentes conditions d’adsorption. A l’exception de l’absence de SDS et de βmercaptoéthanol, le protocole de préparation et de révélation des gels est similaire à la SDSPAGE, le gel de migration ne contenant cette fois que 4% de polyacrylamide pour permettre
la migration et la séparation de hautes masses moléculaires.
II.3.Conditions d’adsorption
L’ensemble des expériences d’adsorption se déroule à 37°C, et, sauf mention contraire,
dans un tampon Tris 50mM, pH 7.4 (tampon ‘T50’).
L’influence de la force ionique sur l’assemblage de la fibronectine est testée par
adsorption dans des tampons Tris 50mM, pH 7.4, contenant différentes quantités de NaCl. La
composition des différents tampons et les forces ioniques correspondantes, sont résumées
dans le tableau ci-dessous. La force ionique est calculée pour un pH 7.4 et une concentration
en fibronectine de 0.1 g/L, sachant qu’une molécule de fibronectine apporte 518 charges.
Tampon
T50
T50N2
T50N5
T50N15
T50N20
T50N50 T50N150 T50N500
NaCl (mM)
0
2
5
15
20
50
150
500
Force
ionique (M)
0.048
0.050
0.053
0.063
0.068
0.098
0.198
0.548
L’influence de la présence d’un surfactant non-ionique sur l’assemblage de la
fibronectine est testée par adsorption dans des tampons Tris contenant du Tween 20®
(monolaurate de polyoxyethylensorbitane, Sigma-Aldrich, USA). Le Tween est ajouté
extemporanément aux solutions de fibronectine, dans un rapport molaire Tween/fibronectine
final compris entre 0.1 et 100, la plus forte concentration de Tween utilisée, de 25mg/mL,
restant en deçà de la concentration micellaire critique du surfactant de 60mg/mL.
L’effet sur l’adsorption de la fibronectine de la présence de son fragment N-terminal est
évalué à l’aide du fragment N-terminal de 70kDa (F70) (F0287, Sigma-Aldrich, USA). Le
93
fragment est ajouté à la solution de fibronectine au début de l’adsorption. La concentration en
fibronectine est constante et le rapport molaire Fn/F70 est ajusté entre 0.1 et 1.
II.4.Dosages et marquages
II.4.a. Immunofluorescence
1) Marquage
La détection in situ de la fibronectine adsorbée est réalisée par immunofluorescence.
Ce marquage repose sur l’affinité spécifique d’un anticorps, l’anticorps primaire, pour le
ligand d’intérêt, ici la fibronectine. Le signal de reconnaissance du ligand est ensuite amplifié
par un anticorps secondaire, reconnaissant l’anticorps primaire. L’anticorps secondaire est
couplé à une molécule permettant la visualisation du complexe ligand/anticorps. Dans le cas
d’un marquage immunofluorescent, il est couplé à un fluorochrome qui permet sa
visualisation en microscopie à épifluorescence. Le principe général d’un immunomarquage
est illustré sur la figure 35.
Figure 35. Principe de l’immunomarquage fluorescent.
Suite à l’adsorption de la fibronectine, les surfaces sont saturées 1h à 37°C dans le
tampon d’adsorption contenant 3% de lait écrémé (tampon de saturation). Les échantillons
sont ensuite incubés 1 heure avec un anticorps polyclonal du lapin anti-Fn plasmatique
94
(Anticorps F-3648, Sigma-Aldrich) dilué au 1/1000 dans le tampon de saturation. Ils sont
ensuite rincés trois fois 10 minutes dans le tampon de saturation et incubés 45 minutes en
présence d’un anticorps de chèvre anti-IgG du lapin couplé au TRITC (Anticorps T6778,
Sigma-Aldrich) dilué au 1/500 dans le tampon de saturation. Enfin, ils sont rincés deux fois
10 minutes dans le tampon de saturation puis maintenus immergés dans le tampon
d’adsorption jusqu’au moment de l’observation. La fluorescence du TRITC est observée à
l’aide d’un filtre de bande passante centrée sur 570nm. Les photos sont prises à l’aide d’un
appareil photo numérique (Powershot S50, Canon) connecté au microscope à fluorescence
(Leica Microsystems, Germany).
2) Fréquence des états morphologiques
Entre 5 et 20 champs indépendants de microscopie sont aléatoirement photographiés
sur chaque échantillon. La fréquence d’occurrence de chaque état morphologique de la
fibronectine est le rapport entre le nombre de champs présentant cet état et le nombre total de
champs. Les résultats sont présentés comme la moyenne de cette fréquence sur l’ensemble des
échantillons d’une condition d’adsorption donnée.
Le comptage des fibres connectées prévaut sur les fibres isolées lorsque les deux sont
présentes et la proportion totale de fibres ne contient ainsi pas de doublon. Quelques fibres
montrent un changement de direction marquée pouvant laisser supposer que plusieurs fibres
sont présentes mais seules les jonctions d’au moins trois fibres sont considérées comme des
connexions, c'est à dire quand aucun doute n’est possible quant à la présence de plusieurs
fibres jointes.
II.4.b. Dosage de la Fibronectine adsorbée par ELISA
La technique de dosage ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) repose sur le
même principe que l’immunomarquage fluorescent, c’est à dire l’affinité spécifique d’un
anticorps pour son antigène. Dans l’ELISA, l’anticorps secondaire est couplé à une enzyme,
la phosphatase alcaline. Ce couplage permet une quantification indirecte du ligand d’intérêt,
ici la fibronectine, par dosage du produit coloré d’un substrat de la phosphatase, le PNPP.
Les surface sont saturées 1h à 37°C dans le tampon de saturation. Les échantillons sont
ensuite incubés 1 heure à 37°C avec un anticorps polyclonal du lapin anti-Fn plasmatique
(Anticorps F-3648, Sigma-Aldrich) dilué au 1/5000 dans le tampon de saturation, rincés trois
95
fois 10 minutes dans le tampon de saturation, incubés 1h à 37°C en présence d’un anticorps
de chèvre anti-IgG du lapin conjugué à la phosphatase alcaline (Anticorps A3687, SigmaAldrich) dilué au 1/15000 dans le tampon de saturation, puis rincés trois fois 10 minutes dans
le tampon de saturation. Finalement, les échantillons sont incubés 1h à 37°C dans une solution
de PNPP (ParanitroPhenylPhosphate) dilué à 0.3% p/v dans de la diethanolamine. Le produit
d’hydrolyse du PNPP est détectée par spectrophotométrie à 405 nm.
II.4.c. Dosage de l’exposition du site de liaison aux cellules par ELISA
Afin d’évaluer si les différentes conditions d’adsorption de la fibronectine modulent la
conformation de la fibronectine, l’exposition du module III10, ou ‘site central de liaison aux
cellules’ (Fn-CBS), est sondé par un anticorps monoclonal spécifiquement dirigé contre ce
site. La reconnaissance de la fibronectine adsorbée par cet anticorps est évaluée par ELISA,
selon un protocole similaire à celui décrit précédemment. Dans ce cas, l’anticorps primaire est
un anticorps monoclonal de souris anti-Fn-CBS (Chemicon MAB1933) utilisé dilué au
1/1000, et l’anticorps secondaire est un anticorps de mouton anti-IgG de souris conjugué à la
phosphatase alcaline (Sigma A5324) utilisé dilué au 1/15000.
II.4.d. Desorption
Pour évaluer la desorption de la fibronectine des céramiques d’hydroxyapatite, celles-ci
sont immergées 24 heures à 37°C dans le tampon d’adsorption. La quantité de protéine
désorbée est ensuite mesurée dans le surnageant par dosage colorimétrique (Biorad protein
assay) selon les instructions du fabricant.
II.4.e. Marquage des fibres amyloïdes à la Thioflavine T
La thioflavine T est un marqueur fluorescent des feuillets β intermoléculaires présents
dans les fibres de type amyloïdes (Krebs et al, 2005; LeVine, 1993). La thioflavine T (SigmaAldrich, USA) est diluée à 1mM dans un tampon Tris 50mM pH 7.4 puis filtrée trois fois sur
un filtre 0.2µm. Cette solution est conservée quelques jours à 4°C et à l’obscurité.
Préalablement à l’adsorption sur l’hydroxyapatite, la thioflavine est ajoutée à la fibronectine
dans un rapport molaire final ThT/Fn=55. Après élimination du surnageant d’adsorption,
l’échantillon est rincé puis un immunomarquage fluorescent de la fibronectine est réalisé
selon le protocole décrit précédemment. L’observation des échantillons au microscope est
96
effectué à l’aide d’un filtre de bande passante centrée sur 480nm ou sur 570nm afin d’isoler
respectivement l’émission de fluorescence de la ThT et du TRITC respectivement (figure 36).
Figure 36. Spectres d’émission et d’absorption de la thioflavine T et du TRITC.
III.Méthodes de simulation
Le modèle d’adsorption (cf. partie Résultats III) est décrit selon un processus
stochastique, c'est-à-dire un processus dépendant de variables aléatoires, chaque évènement
élémentaire (adsorption, dépliement d’une protéine…) ayant une probabilité donnée de se
réaliser. Ceci traduit les fluctuations à l’échelle microscopique. Par exemple, si, en moyenne,
une protéine se déplie en un temps t sur une surface donnée, pour chaque protéine le
dépliement est soumis à des fluctuations résultant de l’agitation thermique, de l’orientation de
la protéine au moment du contact, etc. Sur l’ensemble de la population au cours du temps, la
fréquence observée de dépliement va effectivement converger vers 1/t, mais le temps de
dépliement de chaque protéine est lui a priori inconnu.
La traduction de la réalisation d’un évènement dans le modèle est ainsi la suivante :
Un évènement E se produit avec une probabilité p=x. La réalisation de E dépend du tirage
aléatoire, suivant une loi uniforme, d’un nombre entre 0 et 1. Si ce nombre est supérieur à x,
l’évènement ne se produit pas, s’il est inférieur, l’évènement est réalisé.
L’implémentation du modèle est réalisée en langage C++ (cf. code source en Annexe
3) et les programmes sont exécutés sur un cluster Beo Wulf. Le générateur de nombres
aléatoires du compilateur (g++) est réinitialisé à chaque exécution du programme.
IV.Analyse fractale
97
IV.1.Dimension fractale
IV.1.a. Définition
Les objets fractals sont des objets présentant des discontinuités dans l’espace, dont la
distribution et la taille est invariante par changement d’échelle. Ainsi, grossièrement, un objet
fractal présente des ‘trous’, et la taille de ces ‘trous’ est distribuée de telle manière que l’objet
est vu de la même façon de près ou de loin. Cette caractéristique d’auto-similarité des objets
fractals conduit à une relation en loi de puissance entre la masse et la taille d’un objet.
Par exemple, un cube est un objet de dimension 3, une ligne un objet de dimension 1.
Dans le premier cas,
M ∝ R3,
et dans le second
M ∝ R,
où M représente le nombre de parties de l’objet (la masse) de taille R (la dimension
linéaire).
Le cube et la ligne sont des objets non fractals. En revanche, une fibre de fibronectine
ou un amas formé par diffusion-agrégation sont des objets définis dans un espace de
dimension 2, la surface, mais dont la dimension propre est inférieure à 2. Elle est un nombre
non entier, une ‘fraction’ de la dimension entière, une dimension ‘fractale’. Ainsi, pour ces
objets,
M ∝ RDƒ
où Dƒ est la dimension fractale et
Dƒ < d,
où d est la dimension de l’espace.
Les fractales mathématiques déterministes sont des auto-similaires vraies et n’ont pas
d’échelle propre. En revanche, pour les fractales ‘naturelles’, issues de processus aléatoires,
l’auto-similarité est une propriété statistique (il y a des fluctuations) et elle n’est vérifiée que
pour un certain domaine d’échelle spatiale. En effet l’auto-similarité est d’abord
naturellement bornée par la taille de l’objet lui-même qui n’est pas infini. Elle est aussi bornée
par la taille de son élément constitutif, dans notre cas la taille d’une protéine. La dimension
fractale est donc estimée entre ces deux bornes.
98
IV.1.b. Méthode de comptage des boites
Nous venons de voir que les objets fractals auto-similaires présentent une relation
masse/distance en loi de puissance dont l’exposant est la dimension fractale. Cette propriété
permet d’estimer leur dimension fractale par la ‘dimension de boites’. L’espace est recouvert
d’un réseau carré de pas R et on compte le nombre de carrés (le nombre de ‘boites’), N,
nécessaires pour recouvrir l’objet dont on cherche la dimension (cf. fig.37). Ce processus est
itéré pour des tailles de boites variables. N variant avec R selon la relation
N ∝ R-Dƒ,
la représentation en log-log de N en fonction de R permet de déterminer la dimension
fractale par régression linéaire.
Figure 37. Principe d’estimation de la dimension fractale par la méthode du comptage des boites.
La dimension de boites est déterminée grâce au logiciel Fractal Dimension 1.1,
librement téléchargeable sur le site du Center for Polymer Studies, Boston University,
http://polymer.bu.edu/ogaf/html/software.htm.
IV.2.Traitement des images
La détermination de la dimension fractale des structures fibrillaires et agrégatives de
fibronectine observées nécessite une transformation des images de fluorescence en couleur en
images en noir et blanc.
Une image en couleur est codée selon trois composantes, rouge, verte et bleue (image
‘RGB’). L’intensité de chaque composante est représentée par un nombre compris entre 0 et
255 inclus. A chaque position (x,y) de l’image, c'est-à-dire à chaque pixel, correspond donc
99
un triplet de valeurs d’intensité. L’image est d’abord convertie en niveaux de gris, ce qui
consiste à représenter l’image selon une seule composante (‘échelle de gris’), dont la valeur
est la moyenne des trois valeurs de l’image RGB.
Les niveaux de l’image en gris sont ensuite ajustés afin d’améliorer le contraste. Par
exemple, si les intensités d’une image sont comprises entre 30 et 200, on va ré-échelonner les
niveaux entre 0 et 255 par une simple transformation linéaire. Ensuite l’image est seuillée,
c'est-à-dire transformée en noir et blanc : à tous les pixels inférieurs à une certaine intensité
est attribuée la valeur 0 (noir), la valeur 255 (blanc) étant attribuée aux autres. Après cette
étape, l’image est éventuellement filtrée afin d’éliminer les bruits de taille en général
inférieure à 5 pixels (images 2592x1944 pixels). Toutes ces opérations sont réalisées à l’aide
du logiciel Photoshop 7.0.1 (Adobe, USA). Le traitement réalisé est illustré pour deux images
sur la figure 38.
Figure 38. Exemples du traitement de deux images de fluorescence.
Les images originales en couleur (col. gauche) sont passées en niveaux de gris et contrastées (col. milieu) avant
d’être seuillées pour obtenir l’image en noir et blanc finale sur laquelle les couleurs ont été inversées (col.droite).
Les structures observées de fibronectine sont très irrégulières et les images de qualité
variable. La méthode décrite ci-dessus n’a ainsi pas pu être appliquée à toutes. Cette méthode
comporte en outre une part de subjectivité (choix du seuil, taille du filtre…) et reste
relativement longue (méthode essai/erreur sur chaque image). Une analyse systématique
requerrait donc l’amélioration et l’automatisation du traitement. Une collaboration avec
l’Ecole Nationale Supérieure de l’Electronique et de ses Applications de Cergy-Pontoise a été
mise en place en ce sens mais n’a pour l’instant pas permis d’obtenir de résultats satisfaisants
de traitement des images de fluorescence, et n’a donc pas pu être appliquée ici.
100
V.Adhérence cellulaire
V.1.Culture cellulaire
Les cellules MG-63 utilisées lors de cette étude sont des cellules ostéoprogénitrices
dérivées de lignée cellulaire d'ostéosarcome humain (ATCC). Elles sont cultivées dans le
milieu de HAM F 12 (Eurobio 010218), complété avec 10%(v/v) de sérum de veau fœtal,
1%(v/v) de glutamine et 1%(v/v) de pénicilline et de streptomycine. Les cellules sont
cultivées à 37°C, sous atmosphère humide à 5% de CO2. Leur temps de doublement en phase
exponentielle sur le polystyrène traité pour la culture est d’environ 18 heures. Lorsque les
cellules sont à confluence, elles sont décrochées par 1ml pour une monocouche cellulaire de
25cm² (boites Falcon™ T25) d'une solution de trypsine 0.5 g/L -EDTA 0.2 g/L (Eurobio
CEZTDA00-0U) pendant 5min à 37 °C. L’enzyme est diluée par ajout de 10 ml de milieu de
culture. Les cellules sont ensuite culotées par centrifugation à 200g pendant 5 minutes. Elles
sont ensuite resuspendues dans le milieu de culture lors des repiquages, ou dans du milieu
sans sérum pour les tests d’adhérence.
V.2.Tests d’adhérence
V.2.a. Test d’adhérence au MTT sur l’HA
Suite à l’adsorption de la fibronectine dans les différentes conditions testées, les
cellules sont ensemencées sur les céramiques, à raison de 100 000 cellules par pastille, dans
du milieu sans sérum, puis placées 2 heures à 37 °C. Les cellules n’ayant pas adhéré sont
aspirées puis les échantillons sont rincés au TBS (Tris buffer Saline : Tampon Tris50mM,
NaCl 150mM, pH 7.4). 500µL de MTT (MethylThiazoleTetrazolium, Sigma M5655), dilué à
0,5 mg/ml dans du milieu sans sérum ni antibiotiques, sont ensuite déposés dans les puits, et
les plaques de cultures sont placées à 37°C pendant 3 heures au bout desquelles la solution de
MTT est éliminée par aspiration. Les cellules sont lysées par 1 ml d’ HCl 0,1N dans de
l’isopropanol anhydre libérant ainsi le MTT réduit par les déshydrogénases mitochondriales.
La densité optique à 570 nm est alors proportionnelle au nombre de cellules vivantes ayant
adhéré aux différents substrats.
101
L’effet du revêtement de fibronectine sur l’adhérence cellulaire est évalué par
comparaison avec l’hydroxyapatite nue. Les résultats sont donc normalisés en pourcentage de
l’adhérence sur l’HA nue, la densité optique mesurée lors d’un marquage sans
ensemencement de cellules, DO0HA nue, constituant la référence d’adhérence nulle:
% d’adhérence i : 100 x (DOi - DOHA nue) / (DOHA nue - DO0HA nue)
V.2.b. Test d’adhérence par comptage direct sur différents matériaux
Lors des tests d’adhérence sur différents matériaux, l’acier ne supportant pas le milieu
acide utilisé pour lyser les cellules lors du test au MTT, l’adhérence est mesurée par comptage
direct des cellules décrochées à la trypsine pour l’ensemble des matériaux. Les cellules sont
comptées au microscope optique inversé (Leica DMIL) sur une cellule de Malassez. La
viabilité est estimée par comptage en présence d’un colorant vital, le bleu trypan. Le
pourcentage d’adhérence correspond alors simplement au nombre de cellules adhérentes
divisé par le nombre de cellules adhérentes sur l’HA nue.
Les test d’adhérence réalisés sur le polystyrène de culture et l’hydroxyapatite nue en
utilisant en parallèle la méthode du MTT et le comptage des cellules décrochées à la trypsine
ne montrent pas de différence significative dans les adhérences relatives des deux matériaux.
Les pourcentages d’adhérence déterminés par les deux méthodes apparaissent ainsi
directement comparables.
VI.Tests statistiques
Les moyennes sont comparées à l’aide d’un test de Student, choisi selon le résultat
d’un test de Fischer de comparaison des variances préalable. Le risque de première espèce
correspondant est indiqué dans chaque cas.
102
Résultats-Discussion
Résultats – Discussion
103
I.Hydroxyapatite
I.1.Pureté du matériau et propriétés biologiques.
L’hydroxyapatite est un phosphate de calcium proche de la matrice minérale osseuse,
couramment utilisé comme matériau de substitution des tissus osseux et dentaires (voir partie
I). La pureté de la phase synthétisée est primordiale tant pour la stabilité du matériau que pour
ses propriétés de biocompatibilité.
Nos premières études d’adsorption de la fibronectine sur l’hydroxyapatite, réalisées
sur des céramiques commercialisées, ont ainsi mis en évidence l’influence majeure de la
composition de surface sur l’adsorption de la fibronectine et l’adhérence cellulaire (Pellenc et
al, 2005). Il est en effet apparu que la présence d’autres phosphates de calcium, les
phosphates tricalciques (TCP, Ca3(PO4)2) α et β, à la surface de céramiques
d’hydroxyapatite, diminuait d’environ 30% l’adsorption de la fibronectine et de moitié
l’adhérence des cellules MG63 sur le matériau (fig.39).
Figure 39. Influence de la composition de surface d’une céramique d’HA sur l’adsorption de la
fibronectine et l’adhérence cellulaire.
L’adhérence des cellules MG63 sur l’hydroxyapatite pure (barres noires) ou contenant du TCP en surface (barres
blanches) avant (barres pleines) ou après adsorption de fibronectine (barres rayées) est représentée en % de
l’adhérence sur du polystyrène de culture (TCPS). Différence significative entre le matériau pur et le matériau
contenant du TCP : ** p<0.01. Différence significative entre le matériau nu et la matériau revêtu de
fibronectine : ++ p<0.01.
Insert : quantité de fibronectine en mg/m² adsorbée sur la céramique d’HA contenant du TCP (barre blanche), ou
sur l’HA pure (barre noire).
104
Les phosphates tricalciques sont plus solubles que l’hydroxyapatite (Lin et al. 2001;
Langstaff et al., 2001). La différence d’adhérence entre les phosphates tricalciques et
l’hydroxyapatite pourrait ainsi provenir d’une plus grande instabilité de la surface des
premiers, qui déstabiliserait l’adhérence cellulaire, comme certains auteurs l’ont suggéré
(Suzuki et al., 1999; Suzuki et al., 1997).
Ces travaux ont non seulement mis en évidence l’effet de la présence d’une seconde
phase sur les propriétés biologiques des céramiques d’hydroxyapatite, mais également le
défaut de qualité de certains matériaux commercialisés. La première étape de notre étude de
l’interaction fibronectine/hydroxyapatite a donc consisté à s’assurer de la pureté du matériau
utilisé.
I.2. Frittage d’HA commerciales
La synthèse d’une céramique d’HA fait intervenir deux étapes, la synthèse de
l’hydroxyapatite elle-même, puis le frittage, c'est-à-dire le traitement thermique de
densification du matériau, ou céramisation. La présence de TCP à la surface de l’HA peut
provenir, soit d’une seconde phase présente dès la synthèse, soit d’une décomposition de
l’hydroxyapatite lors de ce frittage (Kwon et al, 2003; Raynaud et al, 2002a; Petrov et al,
2001).
Nous avons dans un premier temps procédé au frittage de poudres d’hydroxyapatite
commerciales. Plusieurs poudres d’origines différentes ont ainsi été testées (Sigma, Acros
Organics, Biorad). Toutes conduisent à l’apparition de TCP après frittage, comme illustré
pour l’une d’elles sur la figure 40. Dans ce cas, la poudre de départ est essentiellement
constituée d’hydroxyapatite, mais peu cristallisée, comme le montre l’élargissement des pics
(fig.40. courbe inf.). Après frittage, la céramique est majoritairement constituée de β-TCP
(fig.40.courbe sup.)
105
Figure 40. Profil de diffraction de rayons X (DRX) d’une poudre d’hydroxyapatite commerciale avant
(courbe inférieure) et après (courbe supérieure) frittage.
Les lignes verticale indiquent les positions des principaux pics caractéristiques de l’HA (en rouge) et du β-TCP
(en bleu). L’hydroxyapatite peu cristallisée avant frittage, est quasiment entièrement décomposée en TCP dans la
pastille après céramisation.
Outre la décomposition thermique lors du frittage, la pureté du matériau synthétisé est
étroitement dépendante du rapport molaire Ca/P de départ (Wang et al, 2003; Raynaud et al,
2002a). L’apparition de β-TCP peut ainsi être le résultat de la synthèse d’une hydroxyapatite
déficiente en calcium (Ca10-x(PO4)6-x(HPO4)x(OH)2-x). Le frittage de poudres commerciales
conduisant vraisemblablement à une décomposition de l’HA, il est finalement apparu que le
contrôle du matériau utilisé nécessitait de synthétiser la poudre d’hydroxyapatite de départ.
I.3. Synthèse par voie sèche
L’hydroxyapatite peut être synthétisée par différentes méthodes. Notre première
approche a consisté en une synthèse dite par voie sèche. Des sels de calcium et de phosphate
sont mélangés dans un rapport molaire Ca/P de 10/6, puis portés à haute température. Nous
avons utilisé des poudres de carbonate de calcium, CaCO3, et de phosphate d’ammonium
dibasique, NH4H2PO4. Ce mélange est porté à 1200°C par paliers de 200°C. La poudre est
ensuite lavée à l’eau puis à nouveau portée à 1200°C. L’observation des profils de diffraction
de rayons X indique que la poudre synthétisée de cette manière montre une très grande
variabilité de composition du matériau avant frittage (fig.41).
106
Figure 41. Profil DRX de l’apatite synthétisée par voie sèche avant frittage.
Les profils de poudres résultant de cinq synthèses différentes sont illustrées de haut en bas. Les lignes verticales
indiquent les positions des pics caractéristiques de l’HA (en rouge), du β-TCP (en bleu) et de l’α-TCP (en
jaune).
Le frittage des poudres synthétisées par cette méthode conduit ainsi à des céramiques
majoritairement constituées d’α− et de β-TCP (fig.42).
Figure 42. Profil DRX de l’apatite synthétisée par voie sèche après frittage.
Les résultats de deux synthèses différentes sont illustrés. Les lignes verticales indiquent les positions des pics
caractéristiques de l’HA (en rouge), du β-TCP (en bleu) et de l’ α-TCP (en jaune).
La synthèse d’hydroxyapatite par voie sèche peut dépendre d’une part de
l’homogénéité du mélange de départ, mais également du type de sel utilisé (Silva et al 2003),
ce qui pourrait expliquer la faillite de notre utilisation de cette méthode.
.
107
I.4.Synthèse par voie humide. (SPCTS, Limoges)
L’échec des approches utilisées pour obtenir un matériau pur et constant, nous a
conduit à faire appel au laboratoire de Sciences des Procédés Céramiques et Traitements de
Surface (Université de Limoges, France) qui nous a fourni une poudre d’hydroxyapatite
synthétisée par voir humide (Raynaud et al, 2002b). Cette poudre est synthétisée par addition
de diammonium phosphate dans une solution de nitrate de calcium en milieu basique (voir
Materiels et Méthodes)
Le frittage de cette poudre conduit à des céramiques d’hydroxyapatite pure (fig.43),
sur lesquelles l’ensemble des expériences présentées ci-après ont été réalisées.
Figure 43. Profils DRX de céramiques d’HA réalisées par frittage de l’HA synthétisée par voie humide
(SPCTS, Limoges).
Les lignes rouges indiquent les positions des pics caractéristiques de l’HA.
108
II.Structuration de la fibronectine sur l’hydroxyapatite :
dépendance au temps et à la concentration
II.1.Introduction
L’hydroxyapatite est un matériau ostéoconducteur, dont les propriétés biologiques
peuvent être améliorées par le revêtement par des protéines adhésives matricielles, et
notamment par la fibronectine. La fibronectine favorise non seulement l'adhérence de cellules
osseuses à un support, mais régule également de nombreux comportements cellulaires (voir
Etude Biblio II).
Les propriétés biologiques de la fibronectine en revêtement d’un biomatériau ne
dépendent pas seulement de la quantité de protéine adsorbée. Ainsi, une même quantité de
fibronectine adsorbée sur des céramiques d’hydroxyapatite conduit-elle à des comportements
de cellules souches de la moelle osseuse différents, en termes d’adhérence et d’étalement,
selon qu’un peptide stimulant l’adhérence a été préalablement adsorbé sur le matériau ou non.
Les différences observées, notamment en fonction de la concentration en peptide, suggèrent
une primauté de l’organisation de la fibronectine sur la quantité adsorbée (Sawyer 2005). Sur
un même matériau, les conditions d’adsorption de la fibronectine peuvent également entrainer
des réponses différentes en terme d’adhérence cellulaire. Par exemple, sur le titane,
l’adhérence de cellules mésenchymateuses ostéoprogénitrices dépend du temps et de la
concentration d’adsorption de la fibronectine, et ne montre pas de corrélation directe avec la
quantité adsorbée (Yang, 2003). Ceci confirme d’une part l’effet majeur de l’organisation de
la protéine par rapport à la quantité adsorbée, et indique d’autre part une dépendance de
l’organisation de la protéine aux conditions d’adsorption.
Au sein des matrices extracellulaires, les propriétés de la fibronectine dépendent
étroitement de son organisation en des assemblages supramoléculaires. Les conditions
d’adsorption de la fibronectine sur un biomatériau, en particulier sur l’hydroxyapatite,
peuvent ainsi moduler les propriétés biologiques résultantes, via la modulation de
l’organisation ou de la répartition de la protéine sur la surface.
La sensibilité de l’organisation de la fibronectine aux conditions d’adsorption est ainsi
suivie par microscopie de fluorescence, cette technique nous permettant de visualiser, à
l’échelle d’une cellule, l’éventuelle apparition d’assemblages supramoléculaires de
fibronectine sur l’hydroxyapatite.
109
II.2.Agrégation en solution
Notre étude de l’organisation de la fibronectine adsorbée sur l’hydroxyapatite
implique des conditions d’adsorptions variées, de temps, de concentration en fibronectine, de
force ionique et de concentration en un surfactant non ionique, le Tween 20® (Tween).
Pour s’assurer que l’observation des différents états de la fibronectine résulte de son
adsorption sur l’hydroxyapatite et non pas d’une agrégation ou d’une dénaturation de la
protéine préalablement induite en solution, une électrophorèse en conditions non-dénaturantes
(native-PAGE) de la fibronectine dans chacune des conditions d’adsorption testées est
réalisée. Après 15h à 37°C, ni la présence de Tween, ni la présence de sel, ni l’association des
deux aux plus fortes concentrations utilisées, n’induisent la multimérisation ou la dégradation
de la fibronectine en solution (fig.44). L’agrégation de la fibronectine ne semble pas non plus
induite après 15heures à 37°C à la plus forte concentration utilisée de 1g/L.
Figure 44. Influence des conditions d’adsorption de la fibronectine sur son agrégation en solution.
Gel native-Page de la fibronectine après incubation à 37°C dans différentes conditions, indiquées au dessus de
chaque puits: de haut en bas, la présence de Tween (+), la concentration en fibronectine en g/L, la composition
du tampon (T50 : tampon Tris 50mM pH 7.4 ; T50N500 : tampon Tris 50mM, NaCl 500mM, pH 7.4.) et le
temps d’incubation.
II.3.Quatre états morphologiques
Afin d’élucider si l’adsorption de la fibronectine sur l’hydroxyapatite (HA) induit une
organisation particulière de la protéine, le revêtement de la fibronectine adsorbée est observé
par microscopie de fluorescence. Dans des conditions de température et de pH physiologiques
(37°C, pH 7.4), le marquage immunofluorescent de la fibronectine révèle ainsi que la simple
adsorption de la fibronectine sur l’HA induit l’auto-organisation de la fibronectine.
110
Figure 45. Etats morphologiques de la fibronectine observés sur l’hydroxyapatite par microscopie de
fluorescence.
La fibronectine, diluée à 1g/L dans un tampon Tris 50mM, pH 7.4 (T50), est adsorbée à 37°C sur
l’hydroxyapatite puis marquée par immunofluorescence. Dans cette condition, on peut observer 4 morphologies
distinctes : revêtement homogène (a), agrégats (b), fibres isolées (c, d) ou connectées (e, f). Dans certains cas les
fibres de fibronectine sont connectées en de larges amas denses (g, h). Les astérisques en (e) et (f) indiquent des
exemples de nœuds ou connexions entre fibres. Les flèches en (e) et (g) pointent vers des structures fibrillaires
épaisses suggérant des interactions latérales entre fibres. Fibres et agrégats peuvent fréquemment coexister,
comme c’est le cas en (d), (f) et (h). L’échelle est la même sur les huit champs représentés, la barre en (a)
représentant 100 µm.
111
Cette fibrillation dépend des conditions d’adsorption et nos observations mettent en
évidence différents états de structuration de la protéine.
Toutes conditions d’adsorption confondues, quatre morphologies distinctes sont ainsi
identifiées : revêtement homogène, agrégats, fibres isolées et fibres connectées, illustrés sur la
figure 45.
Le revêtement de fibronectine est qualifié d’homogène lorsque le marquage
immunofluorescent présente une intensité uniforme sur toute la surface et qu’aucune autre des
trois structures n’est observée (fig.45a). Dans ce cas, à l’échelle de la résolution optique, la
fibronectine semble uniformément distribuée sur la surface.
L’adsorption sur l’hydroxyapatite induit l’agrégation de la fibronectine. Les agrégats
sont de petites structures compactes, disséminées sur la surface et de forme irrégulière
(fig.45b). Leur diamètre est compris entre quelques micromètres et quelques dizaines de
micromètres. Dans de rares cas, de très gros agrégats, de longueur de l’ordre de la centaine de
micromètres, peuvent également être observés (figure 46).
Figure 46. Exemple d’un agrégat de fibronectine d’environ 300µm de long.
Adsorption de la fibronectine à 0.01 g/L dans un tampon T50, pendant 15h (barre d’échelle : 100 µm).
L’adsorption de la fibronectine sur l’HA peut également donner lieu à la formation de
structures fibrillaires. Ces fibres, de forme tortueuse ou linéaire (fig.45,c,d) ont une longueur
en général comprise entre quelques dizaines et quelques centaines de micromètres mais qui
peut parfois atteindre le millimètre (figure 47).
Figure 47. Exemple d’une fibre de fibronectine d’environ 1.2 mm de long.
Adsorption de la fibronectine à 1g/L dans un tampon T50 pendant 30 min (barre d’échelle : 100µm).
Les fibres de fibronectine peuvent être isolées (fig.45.c,d) ou connectées (fig.45.e,f,g
et h) les unes aux autres. Certaines fibres montrent un changement d’orientation très marqué,
pouvant résulter de la jonction de deux fibres. Seuls les points d’où émergent au moins trois
112
fibres sont cependant considérés comme des connexions, ou nœuds du réseau (cf. astérisques
fig.45.e,f), c'est-à-dire quand aucun doute n’est permis quant à la présence de plusieurs fibres.
Dans certains cas, ces connexions forment des amas fibrillaires très denses (fig.45.g,h) dont la
structure est similaire à celle du réseau de fibronectine de la matrice extra-cellulaire (voir
Etude Biblio.III.3.b). Certaines structures fibrillaires épaisses suggèrent enfin l’existence
d’interactions latérales entre fibres individuelles au sein de ces amas connectés (cf. flèches
fig.45.e,g).
II.4.Séquence de l’assemblage
Certains des états de la fibronectine peuvent coexister à la surface d’un échantillon. La
probabilité d’occurrence de ces états semble cependant dépendre des conditions d’adsorption.
L’évolution de la structuration de la fibronectine peut ainsi être évaluée par la fréquence
d’apparition, dans une condition donnée, de chacun des 4 états morphologiques
précédemment décrits. L’assemblage de la fibronectine est en effet un processus tempsdépendant, dont la séquence d’établissement, en fonction de la concentration de la protéine en
solution, est présentée sur la figure 48.
A faible concentration en solution (fig.48.a), des agrégats de fibronectine apparaissent
sur la surface dès 5 minutes et persistent au cours du temps, leur proportion restant constante
jusqu'à 15h d’adsorption de la fibronectine. A contrario, quasiment aucune fibre n’est
présente sur la surface 5 minutes après le début de l’adsorption. La proportion totale de fibres
augmente ensuite significativement après 30 minutes d’adsorption mais demeure environ trois
fois inférieure à celle des agrégats. A cette concentration, les fibres sont majoritairement
isolées les unes des autres, la proportion de fibres connectées restant inférieure à 10% à tous
les temps.
113
Figure 48. Séquence de l’assemblage de la fibronectine sur l’HA en fonction de la concentration en
solution.
La fréquence d’apparition de chacun des 4 états morphologiques (cf. figure 1) est suivie entre 5 minutes et 15
heures, pour des concentrations en fibronectine de (a) 0.01 g/L, (b) 0.1 g/L et (c)1 g/L. (H) revêtement
homogène, (A) agrégats, (F.isol.) fibres isolées, (F. connect.) fibres connectées, (F.tot.) ensemble des fibres
isolées et connectées.
La fréquence d’un état correspond à la moyenne sur l’ensemble des échantillons du nombre de champs
présentant cet état par rapport au nombre de champs total. Les résultats sont la moyenne de 9 expériences; les
écarts-types ne sont pas représentés par souci de clarté de la figure. Pour chaque concentration et chaque état,
l’évolution temporelle est testée par rapport à la fréquence observée à 5 minutes : t : p<0.05 ; tt : p<0.01. La
significativité de l’augmentation de la concentration est testée, pour chaque état et à chaque temps, par rapport à
la fréquence observée pour une concentration de 0.01 g/L : augmentation + :p<0.05, ++ : p<0.01, +++ : p<0.001,
ou diminution : - :p<0.05, - - : p<0.01 significative de la fréquence.
114
L’augmentation de la concentration en fibronectine de 0.01 g/L à 0.1 g/L résulte en un
doublement de la proportion de fibres isolées (fig.48.b). Une seconde augmentation de la
concentration d’un facteur 10 déplace l’effet vers les fibres connectées (fig.48.c). Dans ce
dernier cas, à 1 g/L, l’augmentation est significative aux temps courts, mais conduit à la
même proportion totale de fibres qu’à 0.1 g/L après 15h d’adsorption, suggérant une
accélération du processus plutôt qu’une augmentation des fibres formées. La concentration de
fibronectine montre un effet inverse sur les agrégats, son augmentation diminuant
significativement leur proportion à la surface, et ce d’autant plus que le temps d’adsorption
est long.
Afin d’établir si l’organisation de la fibronectine dépend de la quantité adsorbée, le
dosage de la fibronectine adsorbée sur l’HA est réalisé par ELISA. A faible concentration,
malgré des changements d’organisation de la protéine à la surface, et en particulier
l’émergence de fibres, la quantité de fibronectine adsorbée sur l’HA n’évolue pas
significativement au cours du temps (fig.49. 0,01 g/L). Etonnamment, ce dosage indique en
outre que plus la concentration et le temps d’adsorption augmentent, moins la quantité de
fibronectine adsorbée est importante (fig.49).
Figure 49. Adsorption de la fibronectine sur l’HA au cours du temps, en fonction de la concentration en
solution
L’adsorption de la fibronectine est évaluée par dosage ELISA. Les résultats, exprimés en densité optique (DO) à
405nm, sont la moyenne de 4 expériences. Pour chaque concentration, l’évolution de la quantité dans le temps
est testée par rapport au temps 5 minutes: t: p<0.05. Pour chaque temps, l’effet de la concentration est testé par
rapport à la densité optique observée pour une concentration de 0.01 g/L: diminution significative: -: p<0.05; - -:
p<0.01.
La fibronectine adsorbée est quantifiée par un dosage ELISA dont la réalisation
implique plusieurs heures d’incubation des échantillons dans différentes solutions (cf.
Matériels et Méthodes). La faible quantité de fibronectine détectée sur l’HA, notamment audelà de 30 minutes à 1 g/L, pourrait résulter autant d’une plus faible adsorption que d’une
115
plus importante désorption de la fibronectine lors du dosage. Afin d’élucider cette question,
suite à l’adsorption de la fibronectine, les échantillons d’HA sont immergés dans le tampon
d’adsorption pendant 24 heures après lesquelles la fibronectine éventuellement désorbée est
dosée dans le surnageant.
Figure 50. Désorption de la fibronectine de l’HA en fonction du temps d’adsorption et de la concentration
en solution.
La fibronectine désorbée des pastilles d’HA est dosée par dosage Bradford. Les résultats sont la moyenne de
trois expériences. Dans certaines conditions, l’absence d’écart type indique que les dosages n’ont pu être réalises
que sur deux échantillons. Différence par rapport au temps 5 minutes pour une concentration donnée : * :
p<0.05.
La désorption de la fibronectine est environ quatre fois plus importante après 15h
d’adsorption à 1g/L que pour l’ensemble des autres conditions de temps et de concentration
(fig.50). Aucune différence significative n’est cependant observée entre ces dernières, alors
qu’elles présentent des différences de quantité de fibronectine détectée à la surface de l’HA
(fig.49). La quantité de fibronectine détectée aux temps longs à 0.1 g/L décroît de 50% en
moyenne au cours du temps et est ainsi significativement inférieure à la quantité détectée pour
0.01 g/L aux temps longs (fig.49) alors que la désorption observée reste faible et du même
ordre de grandeur entre ces deux concentrations (fig.50). Si la faible quantité de fibronectine
détectée à forte concentration résulte vraisemblablement de la désorption de la protéine, elle
n’est probablement pas la seule raison, et des différences lors de l’adsorption peuvent
également être en partie impliquées.
Le dosage ELISA de la quantité de fibronectine adsorbée est similaire au marquage
immunofluorescent, en terme de tampons utilisés et de temps d’incubation dans ces tampons.
Il semble donc raisonnable de supposer que, s’il y a désorption de la fibronectine lors de ces
expériences, elle est du même ordre de grandeur. L’adsorption de la fibronectine quantifiée
reste ainsi pertinente pour discuter de la structuration observée par immunofluorescence.
116
II.5. Discussion
A faible concentration, les agrégats de fibronectine apparaissent dans les premières
minutes à la surface de l’HA, alors que la proportion de fibres augmente lentement au cours
du temps (fig.48.a). Ce délai entre l’émergence des deux types de structures pose la question
de savoir si les agrégats précèdent seulement les fibres ou s’ils en sont les précurseurs, en
d’autres termes, si les deux états morphologiques appartiennent ou non à la même voie
d’organisation de la fibronectine adsorbée.
Si les fibres étaient formées à partir des agrégats, la persistance de ces derniers au
cours du temps, à faible concentration, impliquerait une augmentation simultanée de
l’adsorption de la fibronectine. Nos résultats indiquent pourtant que, dans ces conditions, la
quantité de fibronectine sur l’HA reste constante au cours du temps (fig.49). Une hypothèse
alternative est que les fibres seraient formées de la réorganisation de molécules de
fibronectine adsorbées dès les premières minutes, alors que les agrégats demeureraient des
structures amorphes, persistant au cours du temps. En contradiction avec ce point de vue, à
forte concentration en solution, la formation de fibres plus rapide est concomitante d’une
diminution de la proportion d’agrégats (fig.48.c). Cette diminution ne semble cependant pas
résulter directement de la plus forte désorption, puisque alors celle-ci se produirait également
à faible concentration.
Nos données suggèrent donc un scénario potentiel de fibrillation de la fibronectine
plus complexe. L’augmentation de la proportion de fibres induite par l’augmentation de la
concentration est majoritairement due à l’apparition de fibres connectées plutôt qu’isolées.
Excepté de rares cas, dans lesquels le réseau de fibronectine recouvre entièrement la surface,
les fibres connectées sont organisées en des amas isolés les uns des autres. Ceci suggère que
les connexions entre fibres résultent d’un mécanisme de branchement, c'est-à-dire que les
fibres connectées ont pour origine commune le nœud qui les réunit, plutôt que d’une jonction
de fibres indépendantes, qui requerrait en effet une forte densité de surface en fibres. La
diminution de la proportion en agrégats pourrait en fait être directement corrélée à l’apparition
des nœuds, les premiers constituant l’origine de ces derniers. En accord avec cette hypothèse,
les agrégats sont souvent – mais pas exclusivement – positionnés à l’intersection de fibres
connectées quand les deux états sont présents à la surface (fig.45.f,g). Une hypothèse possible
est donc que différents types d’agrégats de fibronectine soient formés à faible et à forte
concentration, les derniers constituant des centres de nucléation de la fibrillogénèse de la
fibronectine sur l’hydroxyapatite. Cette hypothèse est résumée sur la figure 51.
117
Figure 51. Modèle hypothétique de l’effet de la concentration en solution sur l’agrégation et la
fibrillogénèse de la fibronectine.
La discontinuité de notre observation de la structuration de la fibronectine en fonction
du temps ne permet pas d’affirmer que les agrégats nucléant les fibres seraient favorisés à
forte concentration. De nombreuses données de la littérature appuient cependant l’hypothèse
qu’un tel mécanisme pourrait être à l’œuvre dans l’assemblage de la fibronectine sur
l’hydroxyapatite.
Nos résultats indiquent que les agrégats formés à faible et à forte concentration
seraient de natures différentes, et ceci pourrait en fait dépendre de la densité de surface. La
plupart des protéines subissent des changements de conformation suite à leur adsorption
(Sharp et al, 2002; Engel et al, 2002). Du fait de l’encombrement stérique, ces dénaturations
induites par l’adsorption sont réduites lorsque la concentration en solution, et donc la densité
de surface, augmentent (Kim et Somorjai, 2003; Kondo et Fukuda, 1998; Kondo et al, 1996).
Par ailleurs, des travaux sur l’adsorption de la fibronectine sur un matériau à base de titane
montrent une plus importante désorption de la protéine à plus forte concentration d’adsorption
(Wittmer et Van Tassel, 2005), en accord avec nos propres observations de la désorption de la
fibronectine de l’HA. Cette plus forte désorption résulterait d’une plus faible surface de
contact entre la fibronectine et la surface (Wittmer et Van Tassel, 2005). De simples effets de
volume exclu pourraient ainsi expliquer comment différentes formes de fibronectine
pourraient être trouvées sur l’HA, en fonction de la concentration lors de l’adsorption. Si les
mécanismes moléculaires sous-jacents restent à élucider, nous pouvons émettre l’hypothèse
que la forme de la fibronectine capable de former des fibres serait favorisée à plus forte
concentration, du fait d’une plus grande flexibilité des molécules, résultant de leur plus faible
contact avec la surface. A faible densité de surface, la fibronectine présente ainsi une plus
118
grande rigidité qu’à forte densité de surface comme le montrent de récents travaux de mesures
des forces d’étirement de la fibronectine, en microscopie à force atomique (Meadows et
Walker, 2005). Cette flexibilité pourrait ainsi permettre la réorganisation des agrégats de
fibronectine, nécessaire à l’émergence des fibres.
119
III.Fibrillation de la fibronectine sur l’HA : interactions
mises en jeu
III.1.Implication du domaine N-terminal
L’auto-association de la fibronectine au sein de la matrice extracellulaire fait
intervenir des interactions entre des domaines particuliers de la protéine, et notamment le
domaine N-terminal de 70 kDa ou F70 (Bultmann, 1998 ; Aguirre, 1994 ; voir Etude Biblio.
III.3.b). La présence de ce fragment de la fibronectine inhibe en effet de manière dosedépendante l’incorporation de fibronectine à la matrice (Quade et McDonald, 1988;
Chernousov et al, 1987). L’effet inhibiteur de ce fragment sur la fibrillation de la fibronectine
sur l’hydroxyapatite est testé par addition de quantités croissantes du fragment F70,
préalablement à l’adsorption sur l’HA (figure 52).
Figure 52. Test d’inhibition de la fibrillation de la fibronectine par son fragment N-terminal F70.
Le fragment F70 est ajouté à la fibronectine 0.1g/L dans un rapport molaire Fn:F70 compris entre 1 et 10. Le
tampon d’adsorption est du T50. (H) revêtement homogène, (A) agrégats, (F.isol.) fibres isolées, (F.connect.)
Fibres connectées, (F.tot.) total des fibres. Différence significative avec la fréquence observée de l’état sans F70:
*: p<0.01; **: p<0.001.
La présence du domaine N-terminal n’affecte significativement ni la proportion des
agrégats ni celle des fibres. Malgré une diminution significative de l’occurrence des fibres
isolées, la proportion observée de fibres connectées est sensiblement identique en présence ou
en absence du fragment, et la diminution de la proportion totale de fibres n’apparaît
finalement pas significative (figure 52).
120
Une interaction spécifique impliquant le domaine N-terminal de la fibronectine ne
semble pas mise en jeu dans l’agrégation de la fibronectine à la concentration testée de 0.1
g/L. Les résultats sur la fibrillation ne sont pas concluants mais l’inhibition partielle suggère
une possible implication de ce domaine. Les faibles quantités disponibles du fragment n’ont
pas permis de tester d’autres conditions, et notamment d’augmenter le rapport molaire
fragment/protéine. D’autres expériences apparaissent néanmoins nécessaires afin d’exclure
toute participation de ce domaine dans la fibrillogénèse de la fibronectine sur
l’hydroxyapatite.
III.2.Structures amyloïdes
La thioflavine T (ThT) est un marqueur fluorescent des structures amyloïdes,
structures protéiques agrégatives, possédant des feuillets β intermoléculaires (LeVine, III,
1993), et impliquées dans de nombreuses maladies neuro-dégénératives (Stefani et Dobson,
2003). La fibronectine possèderait un potentiel amyloïdogénique (Litvinovich SV et al, 1998)
et l’apparition de fibres amyloïdes, qui suppose une dénaturation partielle des protéines
(Scheibel et al, 2004; Modler et al, 2003), peut être induite par l’adsorption (Zhu et al, 2002).
Afin d’examiner la présence de telles structures sur l’hydroxyapatite, la thioflavine T est
ajoutée à la fibronectine avant l’adsorption. La fluorescence de la thioflavine est observée en
microscopie de fluorescence, en comparaison avec le marquage immunofluorescent réalisé
après l’adsorption. Ce marquage est réalisé aux trois concentrations de fibronectine étudiées et
pour des temps d’adsorption de 5 minutes à 15 heures. Les résultats pour la concentration
1g/L, sont illustrés sur la figure 53.
Figure 53. Marquage des structures amyloïdes par la thioflavine T.
La fibronectine, concentrée à 1g/L, est adsorbée 5 minutes, 30 minutes ou 15 heures sur l’HA, en présence de
thioflavine T (ThT). La fibronectine est observée par immunofluorescence (champs a-d) en parallèle de
l’observation de la fluorescence de la ThT (champs e-h). La barre d’échelle sur l’image h représente 100µm.
121
A forte concentration, excepté aux temps courts (fig.53.a,e), la plupart des agrégats de
fibronectine incorporent la thioflavine T (fig.53.b, f). Le marquage des fibres de fibronectine
montre une plus grande variabilité, et, dans les mêmes conditions d’adsorption, certaines
structures fibrillaires incorporent (fig.53.g) ou non (fig.53.h) la thioflavine T. A plus faible
concentration d’adsorption de la fibronectine, la marquage est dans l’ensemble moins intense
et montre autant de variation d’un échantillon à l’autre (résultats non présentés).
Aucune corrélation évidente n’apparaît entre l’observation de structures de type
amyloïdes et le temps, ou la concentration, d’adsorption de la fibronectine. Ceci pourrait
laisser supposer, soit, le développement en parallèle de structures morphologiquement
proches mais constituées de différentes interactions intermoléculaires, soit, une réorganisation
de la conformation de la fibronectine au sein des fibres et des agrégats, postérieure à leur
constitution. Cependant, si la thioflavine T est un indicateur de la présence de structures
amyloïdes largement utilisées, le croisement avec d’autres techniques est nécessaire, le
marquage à la ThT pouvant révéler de faux négatifs ou de faux positifs. Les premiers
résulteraient d’une diminution de l’accessibilité du marqueur aux fibres, dans le cas de
structures très compactes. Les seconds viendraient du mécanisme même d’incorporation de la
ThT au sein de fibres amyloïdes. C’est la liaison de la ThT aux feuillets β intermoléculaires
des fibres amyloïdes qui provoque une augmentation de la fluorescence. La ThT peut
cependant également s’intercaler au sein de protéines possédant des feuillets β dans leur
conformation native, comme c’est le cas de la fibronectine. La fluorescence serait alors moins
intense, du fait de contraintes stériques différentes (Krebs et al, 2005). Si la différence
d’intensité peut être mesurée par spectroscopie de fluorescence en solution, elle est plus
difficile à percevoir en microscopie à épifluorescence sur une surface, la fluorescence
dépendant de l’orientation des fibres, à moins de faire appel à des techniques particulières
comme la microscopie de fluorescence à réflexion interne (Sokolowski et al, 2003).
L’absence de résultats clairs, quant à l’incorporation de la thioflavine T ou la
participation du domaine N-terminal de la fibronectine, suggère que la création de feuillets β
intermoléculaires ou l’association spécifique de certains domaines de la fibronectine ne sont
pas les mécanismes prépondérants à l’œuvre dans la fibrillation de la fibronectine sur
l’hydroxyapatite. L’étude de ces mécanismes est poursuivie par l’évaluation de l’implication
d’autres types d’interactions, et notamment électrostatiques, sur la structuration de la
fibronectine sur l’HA.
122
III.3.Effet de la force ionique
Les expériences précédemment décrites ont été réalisées dans un tampon d’adsorption
de faible force ionique (Tris 50mM, force ionique I=0.048M). Les interactions
électrostatiques peuvent influencer la structure tertiaire de la protéine mais également sa
liaison avec l’hydroxyapatite. Une faible augmentation de la force ionique, de 0.02M,
provoque ainsi la disparition des fibres de fibronectine à la surface de l’HA, et seuls de petits
agrégats disséminés, de taille et de forme relativement régulières, sont observés (fig.54.
T50N20). En revanche, une augmentation plus importante, de 0.048 à 0.548, entraîne à
nouveau l’apparition de fibres et d’agrégats (fig.15, T50N500), les fibres ne présentant pas de
différence morphologique avec les fibres observées à faible force ionique (fig.54, T50 et
fig.45).
Figure 54. Effet de la force ionique sur l’assemblage de la fibronectine sur l’HA.
La fibronectine, concentrée à 0.1 g/L, est adsorbée 2 heures à 37°C dans un tampon T50NX (Tris 50mM, NaCl
XmM, pH 7.4). Trois illustrations des structures observées dans chaque condition sont présentées. Barre
d’échelle : 100µm.
Afin d’examiner plus précisément la variation de la structuration de la fibronectine en
fonction de la force ionique, la fréquence d’apparition de chaque état morphologique est
suivie sur une gamme de force ionique entre 0.048 et 0.548 M (figure 55).
123
Figure 55. Fréquence d’apparitions des différents états de la fibronectine sur l’HA en fonction de la force
ionique.
La fibronectine, concentrée à 0.1 g/L, est adsorbée 2 heures à 37°C dans un tampon T50Nx (Tris 50mM, NaCl x
mM, pH 7.4). Les résultats sont la moyenne de 7 expériences, les écarts-types ne sont pas représentés par souci
de clarté. Différence significative par rapport à la fréquence de l’état dans le tampon de plus faible force ionique
T50: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001.
Les proportions d’agrégats et de fibres de fibronectine évoluent de façon non
monotone avec l’augmentation de la force ionique du milieu. Une augmentation des agrégats
et une diminution des fibres sont initialement observées, les fibres disparaissant complètement
de la surface pour une force ionique comprise entre 0.063 M et 0.198 M. Cette première phase
est suivie d’une inversion des sens de variation, les fibres augmentant à nouveau tandis que
les agrégats diminuent, jusqu’à la plus forte force ionique testée de 0.548 M (fig.55).
L’augmentation de la force ionique en solution conduit par ailleurs à une augmentation
de la quantité de fibronectine adsorbée (ou une diminution de la désorption, comme discuté
précédemment), qui atteint un plateau à partir de I=0.068 (fig.56).
124
Figure 56. Adsorption de la fibronectine sur l’HA en fonction de la force ionique.
La fibronectine adsorbée est dosée par ELISA. Les conditions d’adsorption sont identiques à celles de la figure
55. Les résultats sont la moyenne de 4 expériences. Différence significative par rapport à la densité optique
observée lors de l’adsorption dans le T50 : * p<0.05 ; ** : p<0.005.
Enfin, l’augmentation de la force ionique est également corrélée avec une modification
de l’exposition du segment central de liaison aux cellules, le module III10 de la fibronectine,
dont l’accessibilité aux anticorps passe du simple au double à partir d’une force ionique de
0.068M (fig.57).
Figure 57. Exposition du segment central de liaison aux cellules de la fibronectine (Fn-CBS) en fonction de
la force ionique.
La fibronectine adsorbée est dosée par ELISA à l’aide d’un anticorps monoclonal dirigé contre le module III10
(CBS) de la fibronectine. Les conditions d’adsorption sont identiques à celles de la figure 55. Les résultats sont
la moyenne de 4 expériences. Différence significative par rapport à la densité optique observée lors de
l’adsorption dans le T50 : * p<0.05 ; ** : p<0.005.
125
III.4. Effet d’un surfactant non-ionique
La morphologie des structures de fibronectine formées à la surface de l’HA, en
présence d’un surfactant non-ionique, le Tween 20®, est présentée sur la figure 58, pour deux
concentrations de Tween et trois forces ioniques différentes.
Figure 58. Effet de la présence d’un surfactant sur l’organisation de la fibronectine sur l’HA en fonction
de la force ionique.
La fibronectine, concentrée à 0.1 g/L est adsorbée 2 heures sur l’HA en présence de Tween, pour un rapport
molaire Tween/Fn 1 ou 100, et dans trois tampons T50Nx (Tris 50mM, NaCl x mM, pH 7.4) de forces ioniques
différentes. Barre d’échelle : 100µm.
A faible force ionique, pour un rapport surfactant/fibronectine équimolaire, la
morphologie des fibres de fibronectine n’est pas modifiée par rapport à l’adsorption sans
surfactant, alors qu’une quantité de Tween 100 fois plus importante résulte en la complète
disparition des fibres de fibronectine et seuls de petits agrégats sont observés (fig 58.T50N0).
Dans ces conditions, les proportions de fibres et d’agrégats évoluent de manière opposée par
rapport à la concentration en Tween, la proportion d’agrégats augmentant subitement à faible
concentration, tandis que celle des fibres diminue pour atteindre zéro pour un rapport
tween/Fn de 100 (fig.59.a). A force ionique intermédiaire, la présence du surfactant n’a
d’effet ni sur la morphologie des agrégats (fig.58) ni sur leur proportion (fig.59.b). A forte
force ionique, l’addition d’un surfactant ne modifie pas significativement la proportion de
fibres, mais augmente celle des agrégats, de la même manière qu’à faible force ionique
(fig.59.c). De façon générale, la présence d’un surfactant favorise l’agrégation de la
fibronectine et défavorise sa fibrillation à faible force ionique.
126
Figure 59. Fréquence d’apparition des états de structuration de la fibronectine en présence d’un
surfactant non-ionique en fonction de la force ionique.
La fibronectine, concentrée à 0.1 g/L, est adsorbée 2 heures à 37°C en présence de Tween, pour différents
rapports Tween/Fn compris entre 0 et 100, et dans trois tampons T50Nx (Tris 50mM, NaCl x mM, pH 7.4) de
forces ioniques différentes. Les résultats sont la moyenne de 3 expériences. Les écarts-types ne sont pas
représentés par souci de clarté. Différence significative par rapport à la fréquence de l’état observée en l’absence
de Tween : augmentation + :p<0.05 ; ++ : p<0.01 ou diminution de la fréquence : - :p<0.05 ; - - : p<0.01.
127
La présence d’un surfactant a également tendance à favoriser l’adsorption de la
fibronectine sur l’HA, et ce d’autant plus que la force ionique est faible (figure 60). Quelle
que soit la force ionique, l’adsorption de la fibronectine atteint en effet la même valeur pour
un rapport molaire Tween/Fn de 100.
Figure 60. Effet de la présence d’un surfactant non-ionique sur l’adsorption de la fibronectine en fonction
de la force ionique.
La fibronectine adsorbée est dosée par ELISA. Les conditions d’adsorption sont identiques à celles de la figure
20. Les résultats sont la moyenne de 3 expériences. Différence significative par rapport à la densité optique
observée lors de l’adsorption sans Tween: p<0.05 ; ** : p<0.005, et par rapport à l’adsorption dans le tampon
T50N0 : §§ : p<0.01 ; §§§ : p<0.001.
III.5.Discussion
A faible force ionique, la fibronectine est sous une forme compacte, stabilisée par des
interactions électrostatiques entre les deux sous-unités (Johnson et al, 1999). De plus, à pH
7.4, la fibronectine, qui est une protéine acide dont le pHi est de 5.5, possède une charge nette
négative. Dans ces conditions, les interactions répulsives entre molécules prédominent et la
forme qui s’adsorbe initialement est compacte. Une première augmentation de la force
ionique va donc diminuer les répulsions entre les molécules adsorbées et les molécules
approchant la surface, ainsi que les répulsions entre les molécules adsorbées elles-mêmes, ce
qui pourrait respectivement expliquer, l’augmentation de l’agrégation à la surface d’une part,
et l’augmentation de l’adsorption de la fibronectine, d’autre part (fig.61). Cette première
phase correspond par ailleurs à une absence totale de formation de fibres de fibronectine sur la
surface. L’agrégation de la fibronectine sur l’HA est un processus très rapide, les agrégats
étant observés dès 5 minutes d’adsorption. Dans l’hypothèse de la formation de deux types
d’agrégats sur l’HA (voir III.1), on peut donc supposer que les agrégats formés à force
ionique intermédiaire sont des agrégats ‘amorphes’, par opposition aux agrégats nucléants des
128
fibres, lesquels auraient vraisemblablement donné naissance à des fibres après 2 heures
d’adsorption. Nous ne pouvons cependant pas exclure l’hypothèse que la formation des fibres
dans ces conditions nécessite plus de temps, une étape qui ne serait alors que retardée.
Figure 61. Schéma récapitulatif de l’effet de la force ionique et de la présence d’un surfactant sur
l’organisation de la fibronectine sur l’HA.
Nos résultats suggèrent que les fibres formées à faible et forte force ionique sont différentes (cf. Discussion). Les
premières sont ainsi indiquées ici comme étant de ‘type I’ et les secondes de ‘type II’.
Une seconde augmentation de la force ionique, au-delà de 0.068M, n’augmente pas
plus l’adsorption de la fibronectine, suggérant une possible saturation de la surface, mais
favorise la formation de fibres. La transition de conformation de la fibronectine d’une forme
compacte vers une forme étendue peut être provoquée par une augmentation de la force
ionique (Benecky et al, 1991; Rocco et al, 1983; Tooney et al, 1983; Williams et al, 1982),
cette transition s’accompagnant de changements minimaux dans la structure tertiaire des sousunités (Benecky et al, 1991). Les domaines de la fibronectine qui seraient impliqués dans le
maintien de la conformation compacte (Johnson et al, 1999; Homandberg et Erickson, 1986)
sont également impliqués dans l’auto-association de la fibronectine (Bultmann et al, 1998;
Aguirre et al, 1994). Au-delà d’une concentration en NaCl de 50mM, la fibrillogénèse de la
fibronectine pourrait donc être favorisée par l’extension des molécules en solution, entraînant
une adsorption des molécules dans une conformation dans laquelle les domaines d’autoassociation seraient déjà exposés. De manière similaire, l’induction de la fibrillogénèse de la
fibronectine par son adsorption sur une surface polymère chargée résulterait ainsi
d’interactions électrostatiques entre les domaines chargés de la protéine, impliqués dans la
129
conformation compacte, et la surface. L’extension de la protéine et son adsorption sous une
forme ‘fibrillo-compétente’ seraient ainsi favorisées (Pernodet et al, 2003). Le site de liaison
aux cellules de la fibronectine est situé dans la région centrale de la protéine (voir Etude
Biblio. III.2.b). L’augmentation rapide de son accessibilité aux anticorps tend non seulement à
confirmer l’extension de la fibronectine aux fortes forces ioniques, mais implique également
que les fibres formées à forte et à faible forces ioniques ont une structure différente.
Confirmant cette idée, l’addition d’un surfactant non-ionique n’altère la formation de fibres
qu’à faible force ionique.
Des interactions répulsives sont très certainement impliquées dans les interactions
fibronectine/fibronectine. Les interactions entre la fibronectine et l’hydroxyapatite sont moins
claires. Si des interactions de type hydrophobes étaient présentes entre la fibronectine et l’HA,
la présence de Tween n’aurait pas d’effet sur l’adsorption de la fibronectine, ou entraînerait
éventuellement une diminution par adsorption compétitive (Fainerman et al, 2004; Wahlgren
et al, 1995). L’addition de Tween augmente au contraire l’adsorption sur l’HA. Elle favorise
également l’agrégation de la fibronectine sur la surface. Si les mécanismes n’en sont pas
élucidés, certains auteurs pensent que le dépliement d’une protéine pourrait être favorisée en
présence de surfactant non-ionique via la pénétration de la queue hydrophobe dans la région
apolaire. Cette pénétration, exposant les zones hydrophobes, pourrait ainsi promouvoir
l’interaction avec une surface (Kamande et al, 2000) ou les interactions entre protéines
(Kerstens et al, 2005). Une étude récente suggère même que l’inhibition de l’agrégation d’une
protéine en présence d’un surfactant non-ionique serait liée à la stabilisation de petits
agrégats, ralentissant ainsi la suite de la croissance, plutôt qu’à une inhibition totale de
l’agrégation (Mahler et al, 2005). Des régions hydrophobes ont été mises en évidence au sein
(Potts et Campbell, 1994; Main et al, 1992) et entre (Pickford et al, 2001; Williams et al,
1993) les modules de la fibronectine. Ces régions pourraient supporter des interactions avec la
queue hydrophobe du surfactant. L’augmentation de l’adsorption de la fibronectine semble
être liée à une promotion de l’interaction fibronectine-hydroxyapatite et non pas à une
agrégation induite en solution. En effet, aucune agrégation de la fibronectine n’est détectée
après plusieurs heures en présence de Tween comme le montre l’électrophorèse de la protéine
en conditions natives (fig.44).
L’ensemble de nos résultats suggère l’existence non seulement de différents types de
fibres mais aussi de différents types d’agrégats de fibronectine formés sur l’HA, une
caractéristique partagée par d’autres protéines (Kad et al, 2003; Gast et al, 2003; Khurana et
130
al, 2001). La forte variabilité de l’exposition du domaine CBS et de l’incorporation de la ThT
suggère par ailleurs que différents mécanismes pourraient simultanément être à l’œuvre sur la
surface.
Les conditions d’adsorption peuvent modifier les interactions Fn/Fn, en solution et sur
la surface, mais aussi l’interaction Fn/HA, et finalement, la conformation de la protéine
adsorbée. Tous ces paramètres se compensent les uns les autres lors de l’adsorption et si nos
résultats suggèrent des mécanismes possibles, ceux précisément impliqués dans la
fibrillogénèse de la fibronectine sur l’hydroxyapatite restent à élucider.
131
IV.Processus de diffusion-agrégation : un modèle de
l’assemblage de la fibronectine ?
IV.1.Introduction
La fibronectine se trouve sous forme compacte dans le plasma et à la surface des
cellules, et sous forme dépliée au sein de fibres de la matrice (voir Etude Biblio.II.3b). Le
dépliement de la fibronectine, induit par son adsorption, pourrait ainsi être impliqué dans la
fibrillation de la protéine sur l’HA. Par ailleurs, la formation des fibres et des agrégats de
fibronectine à la surface de l’hydroxyapatite suppose un regroupement et donc une diffusion
des protéines sur la surface. L’adsorption de la fibronectine sur l’HA résulterait ainsi
potentiellement de la conjugaison d’un changement de conformation et de la diffusion de la
protéine sur la surface. Le développement et l’étude d’un modèle tenant compte de ces deux
phénomènes pourraient permettre d’indiquer quels mécanismes à l’échelle de la molécule sont
prépondérants dans l’établissement des structures supramoléculaires de fibronectine
observées.
Notre modèle d’adsorption de la fibronectine est élaboré sur la base des modèles
stochastiques d’adsorption séquentielle et de diffusion/agrégation de la littérature (voir Etude
Biblio.III.3) et permet d’évaluer l’impact d’une transition de conformation simple sur la
morphologie d’amas protéiques formés par diffusion/agrégation des protéines adsorbées.
IV.2.Conformations de la fibronectine
IV.2.a. Définitions
La fibronectine, initialement sous forme compacte, peut se déplier suite à son
adsorption sur la surface. Afin d’étudier l’effet général d’une variation importante
d’ellipticité, au cours de la structuration d’une protéine sur une surface, les formes modèles
des conformations de la fibronectine sont simplifiées. Les formes compacte et étendue de la
fibronectine sont ainsi respectivement modélisées par une sphère et un parallélépipède
rectangle, soit, en projection sur la surface, par un disque et un rectangle, ou ‘bâtonnet’ (figure
62).
132
Figure 62. Modèle des formes compactes et étendues de la fibronectine.
Les forme (a) compactes et étendues de la fibronectine peuvent être approchées, de façon très simplifiée, par (b)
une sphère et un parallélépipède rectangle, dont les projections sont représentées par (c) des ensembles de sites
sur un réseau bidimensionnel carré au sein du modèle. Les deux conformations couvrent exactement 29 sites du
réseau.
La forme compacte possède un diamètre correspondant à 7 pas du réseau. Etant donné
l’ordre de grandeur du diamètre d’une molécule de fibronectine, d’environ 20-30nm, un pas
du réseau représente environ 3.5 nm.
IV.2.b. Propriétés
La forme compacte de la fibronectine, sous forme de disque dans le modèle, est
capable de diffuser sur la surface, de s’agréger avec les protéines voisines et/ou de se déplier
pour adopter la forme bâtonnet.
La diffusion est modélisée par une marche aléatoire de Ndiff pas, où un pas correspond
à la longueur de la maille du réseau, chaque direction libre du reseau étant équiprobable.
Le dépliement de la protéine s’effectue selon une direction aléatoirement choisie
parmi les directions libres sur la surface, deux protéines ne pouvant occuper un même site.
Lorsqu’une protéine est isolée sur la surface, son dépliement s’effectue de façon symétrique à
partir de son centre (fig.63.a,b) et il existe au maximum deux directions de dépliement.
Deux protéines sont considérées en contact l’une avec l’autre lorsque deux de leurs
sites sont plus proches voisins sur le réseau (fig.63.c). Dans ce cas, le dépliement de l’une des
deux protéines s’effectue à partir du site de contact (fig.63.d). Comme pour un dépliement de
protéine isolée, la direction est choisie aléatoirement parmi les directions libres. Dans
l’exemple représenté sur la figure 63.c, seules deux directions de dépliement sont possibles,
les deux autres impliquant un chevauchement des deux protéines. De façon générale, lors
133
d’un dépliement au contact d’une protéine, jusqu’à trois directions de dépliement peuvent être
accessibles. L’agrégation de deux protéines en contact, qui dépend de la probabilité PAg,
correspond au maintien permanent de ce contact.
La vitesse de diffusion des amas de protéines sur la surface est d’autant plus faible que
l’amas est grand. Dans notre modèle, la diffusion d’amas de plus d’une protéine est
considérée suffisamment lente pour être négligée. En admettant que le dépliement d’une
protéine permet d’augmenter son interaction avec la surface, on peut également considérer
que la diffusion des formes dépliées est faible et négligeable. Finalement, l’agrégation ou le
dépliement des protéines conduit à leur immobilisation, seuls les monomères compacts
diffusent.
Figure 63. Dépliement de la fibronectine.
Le dépliement d’une forme compacte se fait de façon symétrique à partir du centre de la protéine (représenté en
jaune en a). Dans l’exemple (a), la protéine peut se déplier verticalement, ou horizontalement comme représenté
en (b). Contact entre deux protéines : les sites rouge et jaune des deux protéines sont plus proches voisins, les
deux protéines peuvent s’agréger (c). Lorsqu’une protéine est au contact d’une autre, son dépliement s’effectue à
partir du site de contact (site rouge en c). Dans la situation en c, seules deux directions de dépliement sont libres,
vers la droite, comme représente en d, ou vers le bas.
IV.3.Description du modèle
L’unité de temps est définie par un essai d’adsorption. Entre deux essais d’adsorption
successifs, se déroule la séquence d’évènements (le ‘cycle’ d’adsorption) suivante (fig.64) :
une nouvelle protéine a une probabilité PA de s’adsorber sur un site aléatoirement choisi,
pourvu que celui-ci soit libre, c'est-à-dire que l’adsorption de la protéine ne résulte pas en un
chevauchement avec les protéines voisines. Puis, toutes les protéines peuvent diffuser sur la
surface selon une marche aléatoire de Ndiff pas. Lorsque deux protéines se trouvent en contact,
elles ont une probabilité PAg de s’agréger. Enfin, chaque protéine, agrégée ou non, peut se
déplier avec une probabilité PD avant qu’un nouvel essai d’adsorption ne soit effectué. PD
134
dépend de la présence d’un contact avec une autre protéine.
Figure 64. Modèle d’adsorption de la fibronectine.
A chaque temps, une nouvelle protéine a une probabilité PA de s’adsorber sur un site aléatoirement choisi, puis
toutes les protéines peuvent diffuser sur la surface selon une marche aléatoire de Ndiff pas. Lorsque deux
protéines sont en contact, elles ont une probabilité PAg de s’agréger. Chaque protéine, agrégée ou non, peut se
déplier avec une probabilité PD avant qu’un nouvel essai d’adsorption ne soit effectué. La probabilité de
dépliement PD est dissociée en une probabilité de dépliement PI lorsqu’une protéine est isolée et une probabilité
PC lorsqu’elle est au contact d’une autre protéine.
La dissociation de la probabilité de dépliement PD en probabilité de dépliement d’une
protéine isolée, PI (‘dépliement isolé’), et en probabilité de dépliement d’une protéine au
contact d’une autre, PC (‘dépliement au contact’), permet d’étudier l’impact de différentes
interactions entre protéines sur les structures formées et notamment les trois cas suivants:
-
Lorsque PD=PC=PI, le dépliement ne dépend pas du voisinage de la protéine. Dans ce cas
on parlera de ‘dépliement indépendant’.
-
L’interaction entre protéines peut stabiliser leur conformation et empêcher ainsi le
dépliement. Cette situation correspond à une probabilité de dépliement au contact nulle,
c'est-à-dire PC=0 et PD=PI, qui correspond au ‘dépliement inhibé par contact’.
-
Enfin, l’interaction entre protéines peut favoriser le dépliement. Cette situation est étudiée
dans le cas extrême où la surface seule n’induit pas de changement de conformation, c'està-dire dans le cas où PI=0 et PD=PC. Ce cas correspond au ‘dépliement requérant un
contact’.
La morphologie des structures protéiques formées dans les trois situations de dépliement
est étudiée pour deux probabilités d’agrégation PAg=1 et PAg=10-3.
135
IV.4. Adsorption séquentielle aléatoire
Lorsque la probabilité de changement de conformation, PD, et le nombre de pas de
diffusion, Ndiff, sont nuls en même temps, notre modèle décrit l’adsorption irréversible de
disques, il se réduit alors au modèle d’adsorption séquentielle aléatoire (RSA). Les
configurations du réseau générées pour ces paramètres sont illustrées à différents temps sur la
figure 65.
Figure 65. Exemples de configurations du réseau pour PD=0 et NDiff=0 après l’adsorption de 10, 100, 1000,
7000 et 38000 protéines sur une surface de 1500 sites de côté, le diamètre d’une proteine étant de 7 pas du
réseau.
Afin de s’assurer de la validité de l’implémentation du modèle, il convient de vérifier
que les caractéristiques de ce modèle de RSA sont bien retrouvées pour ces valeurs de
paramètres. L’adsorption est simulée pour trois probabilités d’adsorption, PA=10-4, 3.10-4, et
10-3 et les cinétiques d’adsorption sont représentées sur la figure 66.
Figure 66. Cinétique d’adsorption pour PD=0 et Ndiff=0.
La cinétique d’adsorption est suivie pour PA=10-4 (gris clair), 3.10-4 (gris) et 10-3 (noir). L’écart de la densité de
surface (θt) à la densité de saturation théorique (θ∝=54.7%) est représenté en fonction du temps à la puissance ½. Les courbes sont la moyenne de 10 simulations. Insert : représentation directe de la densité de surface (θt) en
fonction du temps (t en cycles d’adsorption par site du réseau), pour les trois probabilités d’adsorption.
136
Selon la théorie du modèle de RSA, à l’approche de la saturation, la densité de surface
θt, ou fraction de sites couverts par une protéine, varie comme le temps à la puissance –½,
comportement que notre modèle reproduit correctement (fig.66). Selon ce modèle, la densité
de surface maximale, ou ‘jamming limit’, est d’environ 54.7% pour des objets sphériques
(Feder, 1980). La densité de surface moyenne simulée par notre modèle, de 53.5 %, diffère
peu.
IV.5. Changement de conformation et diffusion agrégation
IV.5.a. Amas DLA à dépliement nul
La dimension fractale des amas de diffusion-agrégation dans un modèle d’adsorption
dépend du rapport entre le flux d’adsorption et le coefficient de diffusion des protéines sur la
surface, ainsi que de la densité de surface (Jensen et al, 1995; Jensen et al, 1994; Amar et
Family, 1994). Dans notre modèle, la dimension fractale varie donc en fonction du nombre de
cycles d’adsorption et du rapport Ndiff/PA (fig.67). Un rapport de 106 entre les deux paramètres
permet de générer des amas de dimension fractale moyenne 1.652±0.039, soit l’ordre de
grandeur de la dimension des amas DLA du modèle original sur un réseau carré (Witten et
Sander, 1981).
Figure 67. Effet du rapport entre la diffusion et l’adsorption, Ndiff/PA, sur la dimension fractale des amas à
PD=0.
Les configurations du réseau sont illustrées pour t cycles d’adsorption. La dimension fractale correspondante est
indiquée sur chaque image.
137
Pour ce rapport, la dimension fractale augmente avec le temps d’adsorption, et donc la
densité de surface. La dimension fractale est celle des amas DLA sur un réseau carré, soit
1.65, pour des densités de surface correspondant à environ 2000 protéines adsorbées sur un
réseau de côté L=1500 (fig.67. Ndiff/PA=106 après 1 .125.107 cycles d’adsorption, 2453
protéines sont présentes sur la surface). Au-delà, la dimension fractale augmente avec la
densité de surface (fig.67. NDiff/PA=106 après 2.25.107 cycles d’adsorption). Afin de comparer
les structures résultantes au modèle de la littérature, l’ensemble des simulations est réalisé
pour un nombre de pas de diffusion Ndiff=100, une probabilité d’adsorption PA=10-4, et une
densité de surface de 0.013, correspondant à la présence sur la surface de 1000 protéines.
IV.5.b. Effet du dépliement sur la morphologie des amas formés
1) Amas fractals
Les amas formés possèdent des propriétés d’auto-similarité, comme le montre le
comportement en loi de puissance du nombre de boites carrées nécessaires pour recouvrir un
amas, en fonction de la taille de ces boites, illustré sur la figure 68 pour 4 jeux de paramètres
différents. Ceci nous permet de comparer les morphologies des amas en terme de dimension
fractale, pour toutes les valeurs de probabilité de dépliement étudiées.
A forte probabilité de dépliement, l’exposant de cette loi de puissance diffère en
fonction de l’échelle, comme le montre le changement de pente observé pour une taille de
boîte d’environ 30 pixels (fig.68). Ce changement de pente se produit donc pour une
dimension de boites de l’ordre de la centaine de nanomètres, soit l’ordre de grandeur de la
protéine dépliée. Deux dimensions sont ainsi mises en évidence. La première, proche de 1, à
petite échelle, reflète la dimension de petits amas de bâtonnets, constitués de quelques, voire
d’une seule, protéines. La seconde, proche de la dimension de l’espace, reflète une
distribution uniforme de ces amas sur la surface. Par la suite, seule la plus faible dimension,
caractérisant la morphologie des amas protéiques, sera considérée lorsqu’un tel comportement
sera observé.
138
Figure 68. Illustration de la détermination de la dimension fractale, Df, des amas protéiques, par la
méthode de comptage de boîtes
Df, indiquée à coté de chaque courbe, est déduite de la pente de la droite du log du nombre de boites en fonction
du log de la taille des boites (cf. Matériels et Méthodes). Deux probabilités de dépliement sont illustrées, PD=1
(losanges blancs) et PD=10-7 (losanges noirs) pour une probabilité d’agrégation (a) PAg=1, et (b) PAg=10-3. Pour
PD=1, un changement de pente est observé. La régression linéaire est donc effectuée indépendamment sur chaque
partie de la courbe et les deux dimensions correspondantes sont indiquées. Sur chaque graphique, la courbe du
haut a été décalée verticalement par souci de clarté.
2) Régime limité par la diffusion
La figure 69 illustre la dépendance de l’aspect et de la dimension fractale des amas à la
probabilité de dépliement PD dans le régime limité par la diffusion (PAg=1).
Dépliement requérant un contact
Lorsque le dépliement nécessite un contact entre protéines (fig.69.a), les amas
présentent une morphologie ramifiée proche des amas DLA à faible PD, puis deviennent
rapidement moins compacts lorsque PD augmente. Contrairement aux amas DLA, les amas
formés dans ces conditions présentent également des structures protéiques continues qui
139
créent des espaces fermés à l’intérieur des amas. En corrélation avec leur aspect, la dimension
fractale des amas diminue avec PD pour atteindre une valeur moyenne de 1.431±0.025 à partir
de PD=10-5. Même à faible probabilité de dépliement, la dimension fractale (Df=1.640±0.011
à PD=10-7) est significativement inférieure à celle des amas du modèle universel d’agrégation
limitée par la diffusion. Le dépliement entraîne une extension rapide des extrémités des amas,
du fait de la forme en bâtonnet des protéines dépliées. Ceci permet donc à l’amas d’être atteint
de plus loin par de nouvelles protéines et diminue ainsi, pour un même nombre de protéines
constituant l’amas, la probabilité d’atteindre l’intérieur, par rapport au modèle DLA. Cette
croissance rapide de la taille de l’amas, combinée à la création, par le dépliement, de
structures fermées au sein de l’amas empêchant la diffusion des protéines vers l’intérieur,
semble ainsi à l’origine de la diminution de la compacité des amas et de la dimension fractale
correspondante.
Dépliement inhibé par contact
Dans le cas d’une inhibition de contact du dépliement des protéines (fig.69.c), les
amas présentent la morphologie caractéristique du modèle DLA à faible valeur de la
probabilité de dépliement, PD. L’augmentation de PD entraîne peu de changement si ce n’est
une diminution de la taille des amas formés. La dimension fractale ne change pas non plus
jusqu’à PD=10-4. Au-delà de cette valeur, la dimension décroît rapidement pour atteindre un
plateau autour de 1.22. Pour des probabilités élevées de dépliement, les amas formés
consistent en fait majoritairement en des dimères et monomères de protéines. Le dépliement
s’effectuant très rapidement, les protéines diffusent peu à la surface et, à quelques exceptions
près du fait de l’encombrement stérique, toutes sont dépliées. A partir de PD=10-1, le réseau
tend alors vers une configuration de type RSA de particules en forme de bâtonnet.
140
Figure 69. Dimension fractale Df des amas en fonction de la probabilité de dépliement PD dans le régime
limité par la diffusion (PAg=1).
(a) dépliement requérant un contact : PD=PC ; PI=0; (b) dépliement indépendant du contact : PD=PC =PI et (c)
dépliement inhibé par contact : PD=PI ; PC=0. Les inserts au dessus de chaque courbe illustrent la configuration
du réseau pour chaque jeu de paramètres.
141
Dépliement indépendant
Lorsque le dépliement ne dépend pas du voisinage d’une protéine, c'est-à-dire lorsque
la probabilité de dépliement est la même que la protéine soit en contact avec une autre
protéine ou non, la dimension fractale des amas montre une première diminution avec
l’augmentation de PD, puis, atteint un plateau autour de 1.43 pour PD comprise entre 10-5 et
10-3 (fig.69.b). Cette diminution est très similaire à la diminution observée quand le
dépliement requiert un contact (fig.69.a). Il semble donc que la probabilité de dépliement
isolé, PI, a peu d’influence quand le dépliement est peu probable. Une seconde diminution de
la dimension est observée à partir de PD=10-3, jusqu’à une valeur de Df~1.18. Le réseau est
alors proche d’une configuration de type RSA. La morphologie des amas passe d’une
morphologie proche de celle des amas formés par dépliement requérant un contact, à faible
valeur de PD, à une morphologie proche de celle issue du dépliement inhibé par contact, à
forte valeur de PD. La transition a lieu entre PD= 10-4 et PD=10-2, les trois régimes induisant la
formation d’amas dont la dimension est environ 1.43 pour PD=10-3, mais dont la morphologie
est pourtant très différente (fig.70).
Figure 70. Détails du réseau pour PD=10-3 dans le régime limité par la diffusion.
Chaque image représente un réseau de 750x750 pas (soit environ 3x3µm). Dans les trois cas, la dimension
fractale moyenne d’un amas est d’environ 1.43.
Dans le cas du dépliement indépendant, Df reflète la dimension d’amas de petite taille,
parmi lesquels certains présentent une structure étirée très peu ramifiée. Ceci peut être
compris en terme d’effet stérique. Si deux amas croissent proche l’un de l’autre, la direction
de dépliement d’une protéine s’agrégeant à l’un des deux amas sera biaisée par la présence de
l’amas le plus proche. L’augmentation de la probabilité de dépliement d’une protéine isolée,
PI, diminuant la distance entre les origines des amas, cet effet stérique a d’autant plus de
chances de se produire à forte probabilité de dépliement. Dans le cas du dépliement requérant
un contact, les amas se trouvent initialement suffisamment loin les uns des autres pour ne pas
subir cet effet, mais certains amas proches, qui ne se joignent pas, ne semblent pas
s’interpénétrer. Ceci suggère que le même effet stérique serait exercé au niveau du périmètre
142
de ces amas. De façon générale, on peut penser que cela se produit lorsque la distance entre
deux amas est de l’ordre de grandeur de deux fois la longueur d’une protéine dépliée.
3) Régime limité par la réaction
Dans le régime limité par la réaction (PAg=10-3, fig.71), les amas protéiques présentent
des morphologies différentes de celles observées dans le régime limité par la diffusion mais
un comportement similaire en fonction des différents régimes de dépliement. Le dépliement
requérant un contact produit des amas denses à PD=10-7, dont la compacité décroît
continûment lorsque PD augmente (fig.71.a). Le dépliement inhibé par contact conduit à des
amas denses de type RLA à faible PD, dont la taille diminue jusqu’à PD=10-4, valeur au-delà
de laquelle le réseau tend vers une configuration de type RSA (fig.71.c). Le dépliement
indépendant est proche du dépliement requérant un contact à faible PD et du dépliement inhibé
par contact à forte PD, et présente une morphologie d’amas spécifique entre les deux
comportements (fig.71.b). La dimension fractale montre également un comportement
similaire au régime limité par la diffusion en fonction de PD, c'est-à-dire une petite diminution
à faible PD dans le cas du dépliement requérant un contact, et une diminution plus importante
et plus tardive dans le cas du dépliement inhibé par contact. Lorsque les dépliements isolé et
au contact ont la même probabilité de se produire, la dimension diminue en deux temps,
reflétant les influences respectives de PI puis de PC.
Comme cela pouvait être attendu, la dimension fractale dans le cas d’une probabilité
d’agrégation de 10-3 est de façon générale plus élevée que dans le régime limité par la
diffusion, à l’exception des cas où PC est élevée, lorsque les deux régimes convergent vers un
modèle de type RSA. Par définition, dans le régime limité par la réaction, une protéine peut
poursuivre sa diffusion après un contact avec une autre protéine. Les protéines sous forme
compacte sont alors statistiquement plus souvent isolées les unes des autres que dans le
régime limité par la diffusion, du moins à faible densité de surface. Il n’est alors pas étonnant
que, dans ce régime, la transition vers un comportement similaire au dépliement inhibé par
contact se produise pour des valeurs de probabilité de dépliement plus faibles.
Des protéines subissant des interactions répulsives entre elles tendraient ainsi plus
rapidement vers un revêtement homogène lorsque l’affinité protéine/surface augmente.
143
Figure 71. Dimension fractale des amas en fonction de la probabilité de dépliement PD dans le régime
limité par la réaction (PAg=10-3).
(a) dépliement requérant un contact : PD=PC ; PI=0; (b) dépliement indépendant du contact : PD=PC =PI et (c)
dépliement inhibé par contact : PD=PI ; PC=0. Les inserts au dessus de chaque courbe illustrent la configuration
du réseau pour chaque jeu de paramètres.
144
4) Fraction de protéines dépliées
La dimension fractale des amas formés dépend de la façon dont les protéines
s’associent entre elles, cette association dépendant elle-même de la forme d’une protéine. La
diminution observée de la dimension fractale des amas avec l’augmentation de la probabilité
de dépliement pourrait ainsi être directement corrélée avec la proportion de protéines dépliées
sur la surface. Afin d’examiner cette possibilité, la proportion moyenne de protéines dépliées
par amas est donc observée pour les trois situations de dépliement dans les deux régimes
d’agrégation (fig.72).
Figure 72. Fraction de protéines dépliées par amas en fonction de la probabilité de dépliement PD.
Régime limité par la réaction (lignes continues) et par la diffusion (lignes discontinues) dans le cas du
dépliement requérant un contact (ronds noirs), du dépliement inhibé par contact (losanges noirs) et du
dépliement indépendant (ronds blancs). Toutes les courbes sont quasiment confondues, excepté dans le cas du
dépliement inhibé par contact.
Les changements observés en terme de dimension fractale des amas ne semblent pas
uniquement dépendre de la proportion de protéines dépliées. Pour les deux régimes
d’agrégation, dans le cas du dépliement requérant un contact, la fraction moyenne de
protéines dépliées par amas double de PD=10-7 à PD=10-5 pour atteindre son maximum audelà. Dans le cas du dépliement inhibé par contact, elle demeure en deçà de 0.04 jusqu’à une
probabilité de dépliement de 10-4 et 10-5 dans le régime limité par la réaction et la diffusion
respectivement, à partir de laquelle elle augmente constamment (fig.72). Ces comportements
reflètent l’évolution de la dimension fractale pour les deux régimes (fig 69.a,c et 71.a,c), plus
la proportion de protéines dépliées est importante, plus la dimension fractale est faible.
145
L’écart entre les régimes limités par la diffusion ou la réaction est également retrouvé.
Cependant, la corrélation n’est pas évidente en ce qui concerne le dépliement indépendant.
Dans ce cas, contrairement à ce qui est observé pour la dimension fractale, la proportion de
protéines dépliées ne présente pas un comportement intermédiaire entre les deux autres types
de dépliements, mais semble plutôt adopter une évolution similaire au dépliement requérant
un contact. Une même proportion de protéines dépliées entraîne une dimension fractale plus
faible, lorsque le dépliement des protéines isolées est permis. Ceci indique que la
morphologie des amas formés dépend, non seulement de la fraction de protéines dépliées,
mais également du fait que le dépliement survient avant ou après l’agrégation, c'est-à-dire du
fait qu’il s’agit d’un dépliement isolé ou au contact.
5) Conclusion
Dans notre modèle, la diffusion des protéines dépliées est considérée nulle, donc, plus
la probabilité de dépliement est importante, plus la longueur de diffusion d’une protéine est
courte. Comme la diffusion des amas est également nulle, le dépliement n’affecte que la
diffusion des protéines isolées. Outre le fait qu’il arrête la diffusion de la protéine qui se
déplie, le dépliement d’une protéine isolée entraîne également un nouvel obstacle pour les
autres protéines diffusives et augmente donc le nombre de rencontres et d’agrégations. A
faible probabilité de dépliement, la plupart des protéines peuvent diffuser jusqu’à atteindre un
petit nombre d’amas et le dépliement au contact est favorisé. Plus la probabilité de dépliement
augmente, plus le nombre d’amas augmente et les protéines ne forment plus que de petits
amas, jusqu’au moment où le système converge vers le modèle RSA. Entre les deux, le
dépliement des protéines isolées est suffisamment important pour augmenter le nombre
d’amas et ainsi favoriser le dépliement au contact, mais suffisamment faible pour permettre la
diffusion et l’agrégation. Cette phase constitue un régime intermédiaire entre les modèles de
DLA/RLA et le modèle RSA, pour lequel la dimension fractale des amas apparaît stable sur
deux ou trois ordres de grandeur de probabilité de dépliement dans le cas du dépliement
indépendant (fig.69.b et 71.b). De façon générale, le comportement du modèle dépend de la
balance entre la diffusion et le dépliement, et on peut finalement supposer que la transition
entre les deux régimes, c'est-à-dire la phase intermédiaire, apparaîtra à des probabilités de
dépliement d’autant plus faibles que la diffusion des protéines sur la surface est lente.
146
IV.6. Discussion
Le dépliement d’une sphère vers une forme bâtonnet affecte significativement la
morphologie des amas formés par diffusion-agrégation et diminue en particulier la dimension
fractale de ces amas par rapport au modèle universel de DLA. D’autres modifications de ce
modèle peuvent permette de générer des amas de dimension plus faible. C’est le cas pour des
objets adsorbés sphériques, lorsque des interactions attractives s’exercent entre les particules
adsorbées (Puertas et al, 2004) ou que la diffusion des amas est prise en compte (Meakin,
1983).
L’agrégation de particules diffusives en forme de bâtonnets a fait l’objet d’études en
deux (Parkinson et al, 1995; Parkinson et al, 1994) et en trois dimensions (Mohraz et al,
2004). Ces études ont montré que la forme étendue induisait une augmentation de la
dimension fractale des amas formés par comparaison à des objets sphériques. Dans le modèle
en deux dimensions, développé pour modéliser la fibrillation du collagène, l’orientation des
bâtonnets est en fait la même et est fixée durant le processus d’agrégation (Parkinson et al,
1994). L’augmentation de la dimension résulte alors simplement de l’empilement obligatoire
des bâtonnets en parallèle. Cependant, dans le modèle tridimensionnel, l’orientation des
bâtonnets, également fixée, est initialement aléatoirement choisie. L’augmentation de la
dimension des amas dans ce cas est alors discutée comme résultant de la possibilité
d’agrégation des bâtonnets à des distances inférieures à leur plus grand rayon de giration,
c'est-à-dire lorsque les grands axes de deux bâtonnets sont situés dans des plans parallèles
(Mohraz et al, 2004). La divergence de ces résultats avec nos observations pourrait en fait
résulter d’un comportement d’objets anisotropes différent selon la dimension euclidienne.
Dans notre modèle, la diminution de la dimension fractale, par rapport au modèle DLA,
provient de la forme même de la protéine dépliée, associée au fait que le dépliement entraîne
des boucles fermées à l’intérieur d’un amas, que de nouvelles protéines ne peuvent atteindre.
Si des structures similaires sont formées en 3D, de nouveaux bâtonnets peuvent en revanche
atteindre la partie interne de la boucle. Que ce soit en recouvrant la boucle ( l’axe du bâtonnet
étant approximativement dans le plan de la boucle) ou en passant à travers, cette agrégation va
en partie combler le vide et augmenter la dimension. Ce type d’évènements, non permis dans
notre modèle, sauf si une protéine s’adsorbe directement au milieu d’une boucle, ce qui est
peu probable, pourrait en partie expliquer pourquoi la dimension fractale d’amas de bâtonnets
augmente en 3D et diminue en 2D.
147
V.Pertinence du modèle dans l’adsorption de la
Fibronectine sur l’HA
Le modèle d’adsorption développé prédit des organisations des protéines sur la surface
très différentes selon le type et l’intensité des interactions entre les protéines, et entre les
protéines et la surface. Afin d’examiner la pertinence de telles interactions dans l’organisation
de la fibronectine sur l’HA, la morphologie des structures observées est comparée à celles des
structures simulées.
V.1.Dimension fractale des amas de fibronectine
Du fait du temps de calcul nécessaire, les surfaces simulées ne représentent qu’environ
1/100
ème
d’un champ de microscopie de fluorescence. Cependant, comme les amas simulés,
les amas de fibronectine présentent des propriétés d’auto-similarité, c'est-à-dire une
invariance par changement d’échelle, qui permet la comparaison de leur morphologie à celle
des amas simulés, via l’estimation de leur dimension fractale. La dimension fractale des amas
de fibronectine formés sur l’hydroxyapatite est estimée par la méthode de comptage des
boites (fig.73).
Figure 73. Calcul de la dimension fractale des amas de fibronectine.
La méthode de comptage des boites est appliquée à un amas de fibronectine formé après 15 minutes (ronds) et 2
heures (losanges noirs) d’adsorption à 0.1 g/L. Dans le premier cas, la dimension à petite échelle correspond à la
dimension de la fibre, de 1.365 (ronds blancs). Le changement de pente à plus grande échelle correspond à la
dimension du réseau de 0.819 (ronds gris) et traduit la faible densité de surface.
148
Comme dans le cas des amas simulés, pour des amas de petite taille ou peu nombreux,
un changement de dimension est observé à grande échelle (fig.73, Df=0.819). La dimension
fractale correspondante reflète alors la distribution des amas sur la surface. Dans l’exemple de
la figure 73, les amas de fibronectine recouvrent une faible proportion de la surface, et cette
dimension est faible.
L’estimation de la dimension fractale des structures de fibronectine formées sur
l’hydroxyapatite met en évidence trois populations, les amas denses de fibres connectées, les
fibres isolées ou connectées en amas peu denses, et les agrégats.
V.2.Agrégats et structures fibrillaires denses
Les agrégats de fibronectine présentent un aspect et une dimension proches de ceux du
modèle RLA (fig.74).
Figure.74. Amas de fibronectine observés et simulés de dimension fractale ~1.8.
La dimension fractale est indiquée au-dessus de chaque image et les conditions d’adsorption, ou les paramètres
de simulation, en dessous. T50: tampon Tris 50mM, pH 7.4.
Dans le cas des amas observés comme dans le cas des amas simulés, la taille des
agrégats formés est variable. Il semble que les agrégats de fibronectine formés sur l’HA
puissent être formés par un processus n’impliquant pas de dépliement, c'est-à-dire un modèle
classique de RLA de sphères.
Les amas de fibres connectées de fibronectine, quant à eux, ont une dimension fractale
moyenne d’environ 1.60 (fig.75).
149
Figure 75. Amas de fibronectine de dimension fractale moyenne 1.60.
La dimension de l’amas est indiquée au-dessus de chaque image. Les conditions d’adsorption de la fibronectine
sont indiquées en dessous.
Les modèles originaux d’agrégation limitée par la diffusion (DLA) et par la réaction
(RLA) conduisent à des amas d’aspect différent et de dimension moyenne significativement
supérieure à ces amas fibrillaires de fibronectine (fig.76).
Figure 76. Amas simulés par les modèles de DLA et RLA.
L’addition du dépliement dans le modèle de diffusion-agrégation permet de générer
des amas protéiques de dimension analogue à celle observée des amas de fibronectine. Dans
les cas étudiés du modèle, ces amas sont obtenus dans le régime limité par la diffusion ou par
la réaction, pour des probabilités de dépliement inférieures à 10-6, lorsque le dépliement au
contact est permis. Les amas correspondants, résultant du dépliement indépendant, sont
illustrés sur la figure 77.
Figure 77. Amas protéiques simulés de dimension fractale ~1.6 dans le cas du dépliement indépendant.
Les deux exemples d’amas résultent d’une probabilité de dépliement de 10-6 dans le régime limité par la
diffusion (à gauche) et 10-7 dans le régime limité par la réaction (à droite).
150
Outre une dimension plus faible, le dépliement au contact permet également de
générer des amas présentant des boucles fermées, notamment dans le cas du régime limité par
la réaction (fig.77, droite). Cette caractéristique est généralement observée sur les amas de
fibronectine (fig.75) et n’apparaît pas dans les amas du modèle DLA (fig.76).
Notre modèle permet de reproduire certaines caractéristiques observées des amas
fibrillaires de fibronectine formés à la surface de l’hydroxyapatite. Ces caractéristiques
semblent plutôt correspondre à un régime limité par la réaction, c'est-à-dire à des interactions
plutot répulsives entre protéines, défavorisant l’agrégation. La comparaison des structures
observées de fibronectine avec les structures prédites par notre modèle indique également que
la structuration de la fibronectine impliquerait un dépliement des protéines, en particulier un
dépliement non inhibé par le contact entre deux protéines.
La génération de structures compactes correspondant aux agrégats, d’une part, et la
génération d’amas fibrillaires denses, d’autre part, correspondent à des probabilités de
dépliement différentes. Ainsi, notre modèle suggère que le comportement de la fibronectine
selon certaines conditions d’adsorption (par exemple la présence de Tween ou une force
ionique intermédiaire qui favorisent l’agrégation aux dépens de la fibrillation), pourrait être
lié à un dépliement plus ou moins favorisé de la protéine à la surface.
V.3.Coexistence des agrégats et des fibres
La croissance des amas simulés s’effectue de manière relativement homogène, la
distribution de la taille des amas dans une condition donnée étant étroite. Or,
expérimentalement, si les agrégats précèdent les fibres, aux temps longs les deux états
coexistent souvent sur la surface du matériau. Cette constatation nous conduit à envisager
qu’un évènement critique puisse déclencher la fibrillation localement :
Dans notre modèle, la probabilité de dépliement au contact est la même que la protéine
voisine soit déjà dépliée ou non. Une hypothèse serait que la probabilité de dépliement soit en
fait dépendante de l’état conformationnel de la protéine voisine et soit en particulier plus forte
à proximité d’une protéine déjà dépliée. Ceci revient à dissocier PC, la probabilité de
dépliement au contact, en PC/B, probabilité de dépliement au contact d’une protéine dépliée en
bâtonnet, et PC/D, probabilité de dépliement au contact d’une protéine sous forme de disque.
Les premières simulations basées sur ce modèle sont effectuées dans le cas où seule une
protéine dépliée peut induire le dépliement d’une protéine voisine, c'est-à-dire pour PC/B=1 et
151
PC/D=0 . Pour des probabilités de dépliement supérieures à 10-3, aucune différence
significative n’est observée par rapport au modèle de dépliement indépendant. En revanche,
lorsque la probabilité de dépliement d’une protéine isolée diminue, deux types d’amas
protéiques coexistent sur la surface dans le régime limité par la diffusion (fig.78, PAg=1).
Dans ce cas, on observe en effet de petits amas de type DLA simultanément à des amas dans
lesquels les protéines sont dépliées. PC/D étant nulle, tant qu’une protéine ne s’est pas dépliée
selon PI, les protéines s’agrègent et forment des amas de type DLA. Le dépliement d’une
protéine isolée va entraîner le dépliement des protéines à son contact et former le second type
d’amas. Si PI est trop forte, en l’occurrence supérieure à 10-4, seuls des amas du second type
sont formés.
Dans le régime limité par la réaction, la diminution de PI, entraîne une augmentation
de la taille des amas et une diminution de leur nombre mais l’aspect de ces amas reste
homogène (fig.78). Dans ce régime, nous avons vu précédemment que le dépliement isolé est
favorisé. L’apparition d’amas de deux types différents requiert alors certainement une
probabilité de dépliement isolé PI beaucoup plus faible que dans le régime limité par la
diffusion.
Figure 78. Dissociation de la probabilité de dépliement au contact PC, selon la conformation de la protéine
voisine.
Simulations réalisées pour des probabilités de dépliement isolé PI croissantes de 10-6 à 10-3 dans les régimes
limités par la diffusion (PAg=1, ligne du haut) et par la réaction (PAg=10-3, ligne du bas).
152
Ces résultats sont préliminaires mais l’incorporation d’une dépendance à l’état
conformationnel de la protéine voisine du dépliement au contact parait effectivement
permettre l’émergence de deux types de structures simultanément sur la surface.
V.4.Fibres isolées et direction de dépliement privilégiée
En terme de dimension fractale, une deuxième population d’amas de fibres de
fibronectine, présentant une dimension moyenne d’environ 1.39, est observée. Cette
population d’amas de faible dimension regroupe des amas de fibres connectées mais
également les fibres isolées de fibronectine (fig.79).
Figure 79. Amas de fibronectine de dimension fractale 1.35-1.45.
Les amas simulés de dimension fractale correspondante sont des amas de petite taille
dont l’aspect diffère de celui des amas de fibronectine (fig.80).
Figure 80. Amas protéiques simulés de dimension fractale ~1.4 dans le régime limité par la diffusion.
Pour ces faibles dimensions, quelques amas présentent une structure étirée dans le cas
du dépliement indépendant (fig.80, droite) mais ces structures résultent d’un encombrement
stérique dû à la proximité des amas voisins, comme discuté précédemment. La présence de
longues fibres de fibronectine indique une direction d’élongation privilégiée qu’un simple
dépliement de direction aléatoirement choisie ne suffit pas à expliquer. La fibronectine
153
possède de nombreux sites d’auto-association le long de sa séquence et plusieurs
combinaisons entre ces sites ont été mises en évidence expérimentalement (voir Etude Biblio
II). Il pourrait alors être judicieux de considérer dans le modèle que la direction de dépliement
entraînant la plus grande surface de contact entre deux protéines pourrait être plus favorable
que les autres directions possibles (fig.81).
Figure 81. Choix de la direction de dépliement en fonction de la surface de contact avec la voisine.
Lorsqu’une protéine se trouve au contact d’une autre, plusieurs directions de dépliement sont possibles, trois
dans l’exemple représenté. Le dépliement P1 entraîne ici un plus grand contact entre les deux protéines que les
deux autres directions. Jusqu’à présent, dans un tel cas, le modèle considérait les probabilités P1, P2 et P3 égales.
Un développement du modèle consisterait à leur attribuer des valeurs différentes, et notamment à favoriser le
dépliement selon P1.
Une telle modification du modèle pourrait ainsi favoriser le processus d’élongation
aux dépens de la ramification, sans toutefois l’exclure. L’effet de cette modification sur la
morphologie des amas protéiques formés, et notamment la conservation d’amas de dimension
environ 1.6 à plus forte densité de surface, reste cependant à étudier et constitue une
perspective de développement de notre modèle.
V.5.Conclusion
La comparaison des amas simulés avec ceux observés dans nos expériences requerrait
une analyse systématique de la distribution de la dimension fractale des amas de fibronectine,
en fonction des conditions d’adsorption. Nos premières analyses permettent cependant de
mettre en évidence des caractéristiques communes des amas de fibronectine, dont certaines
sont capturées par notre modèle. Le modèle initialement développé considère un dépliement
simple, dépendant uniquement des contacts entre protéines et des interactions de volume
exclu. La différence entre certaines caractéristiques observées par l’expérience et les résultats
des simulations indique que ce modèle minimal doit être enrichi. Le développement d’un
modèle d’adsorption de la fibronectine doit vraisemblablement considérer la hiérarchisation
des interactions entre protéines, en fonction de leur conformation et de la surface de contact
154
entre elles.
Par ailleurs, l’émergence de fibres à forte force ionique, lorsque la conformation de la
fibronectine est vraisemblablement étendue en solution, ajoutée au fait que ces fibres auraient
une structure différente des fibres formées à faible force ionique, suggère la présence de plus
de deux états conformationnels différents, à la surface de l’HA, soit en terme de forme, soit en
terme de propriétés. Ainsi, la formation de fibres à forte force ionique pourrait par exemple
faire intervenir une forme étendue de la fibronectine capable de diffuser à la surface.
155
VI.Structuration de la fibronectine adsorbée: dépendance
au matériau
Pour une même protéine et dans des conditions d’adsorption données, le dépliement
est directement dépendant des interactions qui peuvent s’établir avec la surface. Les
différentes probabilités de dépliement du modèle pourraient ainsi refléter l’adsorption de la
fibronectine sur différentes surfaces.
Les matériaux de comblement prothétique du tissu osseux se répartissent dans trois
grandes catégories, les métaux, les polymères et les céramiques (voir Etude Biblio I.2b). Afin
d’étudier la généralisation possible des mécanismes de structuration de la fibronectine sur une
surface, l’étude expérimentale est ainsi étendue à d’autres matériaux que l’hydroxyapatite, un
métal, l’acier inoxydable, et un polymère, le polycarbonate. Cette étude est également
appliquée à du verre, matériau couramment employé en biologie cellulaire.
Les observations par immunofluorescence de la fibronectine adsorbée sur ces
différents matériaux sont présentées sur la figure 82.
Figure 82. Marquage immunofluorescent de la fibronectine adsorbée sur le verre, l’acier et le
polycarbonate.
La fibronectine, diluée à 0.1 g/L dans le tampon T50 (Tris 50mM, pH7.4), est adsorbée 2h à 37°C. Chaque
colone présente deux illustrations du revêtement de fibronectine observés sur chacun des matériaux.
Dans les conditions d’adsorption testées (0.1g/L, 2h, T50), seule l’adsorption sur le
verre semble pouvoir induire la fibrillation et l’agrégation de la fibronectine. L’adsorption sur
l’acier conduit essentiellement à la formation d’agrégats, tandis que sur le polycarbonate, la
fibronectine forme un revêtement le plus souvent homogène, les petites taches disséminées
apparaissant sur les photos (fig.82) étant également observées sur le témoin.
La fibrillation de la fibronectine sur le verre est en moyenne moins fréquente et aussi
variable que celle sur l’HA dans les mêmes conditions (fig.83). Des agrégats de fibronectine
sont observés sur les trois surfaces, et particulièrement sur l’acier sur lequel leur formation est
156
systématique. Le polycarbonate, en revanche, n’induirait que rarement l’agrégation et jamais
la fibrillation de la fibronectine.
Figure 83. Fréquence d’apparition (H) d’un revêtement homogène, (A) d’agrégats et (F.tot) de fibres de
fibronectine sur différents matériaux.
Les conditions d’adsorption sont identiques à celles de la figure 82.
La structuration de la fibronectine dépend du matériau sur lequel elle est adsorbée. Les
différences observées ne semblent pas résulter de différences d’adsorption. En effet, la
quantité de fibronectine adsorbée sur ces matériaux est de l’ordre de la quantité adsorbée sur
l’HA et ne diffère pas significativement d’un matériau à l’autre (fig.84).
Figure 84. Adsorption de la fibronectine sur l’HA, l’acier, le polycarbonate et le verre.
La fibronectine est dosée par ELISA. Les conditions d’adsorption sont identiques à celles de la figure 82.
En revanche, l’exposition du site central de liaison de la fibronectine aux cellules (FnCBS) sur l’acier, le polycarbonate et le verre, est significativement supérieure à son
exposition sur l’hydroxyapatite (fig.85).
157
Figure 85. Exposition du site de liaison aux cellules de la fibronectine (Fn-CBS) adsorbée sur l’HA, l’acier,
le polycarbonate et le verre.
L’exposition du Fn-CBS est dosée par ELISA. Les conditions d’adsorption sont identiques à celles de la figure
82. Différence significative par rapport à l’exposition sur l’HA: **p<0.01; ***p<0.001.
L’ensemble de ces résultats suggère une organisation de la fibronectine dépendant
étroitement du matériau sur lequel elle est adsorbée. Ainsi, aucune corrélation n’est mise en
évidence entre la morphologie de la fibronectine et l’exposition du domaine CBS ou la
quantité de fibronectine adsorbée. Chaque matériau semble au contraire adopter un profil
d’adsorption et de structuration de la fibronectine particulier. Outre une différence de
composition de surface, ces matériaux présentent également d’importantes différences de
rugosité, comme le montre la figure 86.
Figure 86. Images de microscopie à force atomique de la surface de l’hydroxyapatite, de l’acier, du verre
et du polycarbonate.
Les images sont réalisées en mode tapping, à l’aide d’une pointe en nitrure de silicium. La rugosité est reflétée
par l’écart type de la distribution des hauteurs, indiqué sur chaque image.
158
Ainsi le polycarbonate et l’hydroxyapatite présentent une rugosité importante (>300
nm), par comparaison à l’acier et au verre (<25nm). Cette rugosité fait notamment varier la
surface totale disponible. Considérer le rapport entre l’exposition du CBS et la quantité totale
de fibronectine adsorbée peut permettre de s’affranchir de la différence. Ce rapport moyen est
d’environ 0.98 et 0.70 sur l’acier et le polycarbonate sur lesquels le revêtement de
fibronectine est homogène ou constitué d’agrégats. Il est d’environ 0.60 sur le verre, et 0.25
sur l’HA, sur lesquels la fibronectine fibrille. L’éventuelle corrélation négative entre
l’exposition du domaine CBS et la fibrillation de la fibronectine n’apparaît statistiquement pas
significative. D’ailleurs, le verre et le polycarbonate, proches du point de vue de l’exposition
relative du CBS, conduisent à des revêtements très différents de fibronectine.
La fibrillation et l’agrégation de la fibronectine dépendent de la concentration, du
temps d’adsorption, ou encore de la force ionique en solution. Conclure à l’incapacité d’un
matériau à induire la fibrillation semble donc prématuré après n’avoir testé qu’une condition
d’adsorption, les différences observées pouvant par exemple résulter de délais dans la
séquence temporelle de la structuration de la fibronectine. Il serait intéressant de pouvoir
poursuivre l’étude de la structuration de la fibronectine sur différents matériaux en fonction
des conditions d’adsorption pour, d’une part, comprendre les mécanismes de fibrillation de la
fibronectine sur une surface, mais aussi, d’autre part, parce que ces différentes surfaces sont,
comme l’hydroxyapatite, utilisées dans des biomatériaux, sondes ou implants, et que
l’interaction avec les protéines de la MEC, la fibronectine en particulier, peut participer à leur
intégration dans ou leur tolérance par l’organisme.
159
VII.Adhérence cellulaire
La structuration de la fibronectine sur une surface peut affecter le comportement
cellulaire. Afin d’étudier cette relation, des expériences d’adhérence cellulaire sur
l’hydroxyapatite, et les autres matériaux utilisés, ont été réalisées.
L’adhérence d’une lignée cellulaire d’ostéosarcome humain, MG63, est testée sur l’HA en
fonction du temps et de la concentration d’adsorption de la fibronectine (fig.87).
Figure 87. Adhérence des cellules MG63 sur l’HA, en fonction du temps et de la concentration
d’adsorption de la fibronectine.
L’adhérence est évaluée par le dosage au MTT après 2 heures d’ensemencement des cellules sur l’HA. Les
résultats, exprimés en % de l’adhérence sur l’HA nue, sont la moyenne de 3 expériences.
Après 2 heures d’ensemencement des cellules sur l’HA, aucune différence
significative d’adhérence n’est observée, quels que soient le temps et la concentration
d’adsorption de la fibronectine. En outre, l’adhérence montre une grande variabilité pour une
condition d’adsorption donnée. De la même façon, l’exposition du domaine central de liaison
aux cellules montre une variabilité comparable et aucune différence significative d’exposition
de ce domaine n’est observée entre ces conditions d’adsorption (fig.88).
Figure 88. Exposition du domaine de liaison aux cellules de la fibronectine (Fn-CBS) en fonction du temps
et de la concentration d’adsorption de la fibronectine sur l’HA.
L’exposition du Fn-CBS est évaluée par dosage ELISA. Les résultats, exprimés en densité optique (DO) à
405nm, sont la moyenne de 4 expériences.
160
L’exposition de ce domaine de reconnaissance cellulaire montrait en revanche une
augmentation significative avec l’augmentation de la force ionique (cf. fig.57). L’adhérence
cellulaire des MG63, testée à différentes forces ioniques d’adsorption de la fibronectine sur
l’HA, montre pourtant une diminution de l’adhérence avec l’augmentation de la force ionique,
la présence de Tween ne modifiant pas sensiblement l’adhérence (fig.89).
Figure 89. Adhérence cellulaire sur l’HA après adsorption de la fibronectine à différentes forces ioniques,
en présence ou en absence de Tween
Le Tween est ajouté à la fibronectine dans un rapport molaire de 100 (Tween/Fn 100). L’adhérence est évaluée
par dosage au MTT, après 2 heures d’ensemencement des cellules sur l’HA. Les résultats, exprimés en % de
l’adhérence sur l’HA nue, sont la moyenne de 4 expériences. Insert : adhérence sur l’hydroxyapatite préincubée
dans chacun des tampons, sans fibronectine.
Les résultats de la figure 89 sont présentés en pourcentage de l’adhérence sur le même
témoin sans fibronectine, c'est-à-dire l’hydroxyapatite préincubée dans un tampon T50. Or,
sans fibronectine, la préincubation dans des tampons contenant du sel et surtout du Tween
semble diminuer fortement l’adhérence cellulaire (fig.89, insert). Ces résultats suggèrent
d’une part, que l’effet de la fibronectine sur l’adhérence est en fait important lorsqu’elle est
adsorbée à une force ionique intermédiaire (T50N20) par rapport à l’adhérence dans ce
tampon sans fibronectine. D’autre part, ils suggèrent une possible adsorption du Tween à la
surface de l’HA, qui diminuerait l’adhérence cellulaire.
Par ailleurs, la structuration de la fibronectine en présence de Tween, pourrait alors
résulter de cette adsorption du surfactant, modifiant la surface, plutôt que d’une interaction
avec le Tween en solution.
Enfin, l’adhérence des MG63, évaluée sur l’acier, le polycarbonate et le verre, indique
un effet majeur de la surface sous-jacente, la présence de la fibronectine modifiant peu
l’adhérence sur les différents matériaux (fig.90).
161
Figure 90. Adhérence des MG63 sur différents matériaux nus ou après adsorption de la fibronectine 2h,
0.1 g/L.
L’adhérence est évaluée par dosage au MTT, après 2 heures d’ensemencement des cellules sur les matériaux.
Les résultats, exprimés en % de l’adhérence sur l’HA nue, sont la moyenne de 3 expériences. Différence
significative par rapport à l’adhérence sur l’hydroxyapatite: ## p<0.01; # p<0.05. Différence significative par
rapport à l’adhérence sans fibronectine *p<0.05.
Dans l’ensemble, nos résultats ne mettent pas en évidence d’effet significatif de la
présence de la fibronectine sur l’adhérence cellulaire, sur les différents matériaux ou en
fonction des conditions d’adsorption. Les cellules sont capables de réorganiser la fibronectine
sur laquelle elles sont ensemencées et des différences pourraient être observées pour des
temps plus courts d’adhérence. Par ailleurs, si la quantité de cellules est la même, la
fibronectine peut modifier la morphologie cellulaire. Les premiers essais, à confirmer, de
marquage des cellules adhérentes sur l’hydroxyapatite, suggèrent en effet un impact important
de la présence de fibronectine sur la morphologie cellulaire. Ces expériences ont été réalisées
sur une seule lignée cellulaire. Il conviendrait également de les étendre à d’autres types
cellulaires, notamment des cultures primaires de cellules osseuses.
Enfin, la fibronectine régule de nombreux comportements cellulaires. Si sa
structuration influence peu l’adhérence, elle peut en revanche influencer d’autres
comportements cellulaires, et notamment la migration, la différenciation ou la prolifération.
Son influence sur ces étapes plus tardives de la colonisation d’un matériau pourrait constituer
une perspective à développer.
162
Conclusions et Perspectives
163
Conclusion et Perspectives
L’objectif de notre étude est la compréhension des mécanismes qui sous-tendent
l’organisation d’une protéine sur une surface et en particulier d’une protéine de la matrice
extracellulaire, la fibronectine, sur un substitut osseux, une céramique d’hydroxyapatite. Cette
étude s’inscrit dans le contexte du développement de biomatériaux bioactifs nécessitant un
contrôle de l’interaction protéine/surface, non seulement en terme de quantité de protéine
adsorbée mais également, et surtout, en terme de morphologie du revêtement protéique, dont
les propriétés biologiques dépendent.
Nos travaux mettent en évidence que la simple adsorption de la fibronectine sur l’HA
peut induire l’agrégation et/ou la fibrillation de la protéine. L’occurrence de ces états
d’organisation dépend fortement des conditions d’adsorption et notamment du temps et de la
concentration. Par ailleurs, nos résultats montrent une dépendance non monotone à la force
ionique en solution de l’organisation de la fibronectine sur l’HA. La fibrillation de la protéine
est en effet favorisée à faible et forte force ionique mais inhibée à force ionique intermédiaire.
Ces observations, associées aux nombreuses études sur la fibronectine et sur
l’adsorption des protéines en général, nous ont amenés à faire l’hypothèse que des
changements de conformation de la protéine était notamment impliqués dans la formation des
différentes structures observées. Sur la base de modèles d’adsorption de la littérature, nous
avons ainsi développé un modèle stochastique de diffusion-agrégation permettant d’étudier
l’impact, sur la morphologie du revêtement protéique, d’un changement de conformation, et
des interactions entre protéines sur ce changement.
Un changement de conformation peut entraîner des modifications structurales variées et
sa modélisation par une transition ‘sphèrebâtonnet’ peut paraître simpliste. Si, pour être
plus réaliste, notre modèle devrait certainement être amélioré de ce point de vue, il semble
cependant qu’il rende compte de certaines caractéristiques morphologiques des amas de
fibronectine formés à la surface de l’hydroxyapatite. La comparaison entre les simulations et
les observations expérimentales permet de supposer que les interactions entre protéines
pourraient être impliquées dans le dépliement nécessaire à la fibrillation. Il semble par ailleurs
que ce dépliement ne résulterait pas d’un dépliement induit par simple contact mais plutôt
d’un phénomène coopératif, le dépliement d’une protéine entraînant ensuite le dépliement de
ses voisines. En effet, les premiers résultats considérant cette coopérativité permettent de
reproduire la croissance de deux types de structure simultanément sur la surface, observée
expérimentalement.
Un tel mécanisme pourrait expliquer non seulement que différents états d’organisation
puissent coexister mais également, les deux étant liés, la variabilité du phénomène observé.
164
En effet, de nombreuses expériences ont été nécessaires pour mettre en évidence des
comportements généraux d’évolution de la structuration de la fibronectine, en fonction du
temps ou de la concentration par exemple. Les observations de l’exposition du domaine
central de la fibronectine, du marquage des fibres à la thioflavine T ou de l’inhibition de la
fibrillation par le fragment N-terminal montrent également une grande variation entre les
échantillons, ne permettant pas de tirer de conclusions sur les effets observés. L’observation
de la fibronectine adsorbée en microscopie à force atomique (Bergkvist et al, 2003) ou, plus
récemment, par la technique du FRET2 appliquée à l’étude de molécules isolées, mettent ainsi
en évidence une variabilité importante dans le temps et dans l’espace de la conformation de la
fibronectine adsorbée (Antia et al, 2005).
Si nos résultats permettent d’émettre des hypothèses, de nombreux points restent à
élucider quant aux mécanismes impliqués dans la fibrillation de la fibronectine induite par son
adsorption. Le – ou les – changement(s) de conformation supposé(s) par nos hypothèses doit
être vérifié(s). Les différences d’organisation de la fibronectine peuvent procéder d’une
simple extension de la fibronectine ou d’une dénaturation, c'est-à-dire d’une modification des
structures secondaires de la protéine. Une étude de la variation des structures secondaires de
la fibronectine adsorbée, au cours du temps et en fonction des conditions d’adsorption, en
spectroscopie infrarouge pourrait permettre de répondre à cette question. Cependant, d’une
part cette technique ne permettrait pas d’identifier l’évolution de la fibrillation dans le temps
si celle-ci ne fait pas intervenir de changements de structures secondaires, et d’autre part, cette
approche, procurant des données moyennes sur une population, pourrait ne pas permettre
d’observer des changements ne concernant qu’une partie de cette population. Cette étude
pourrait s’accompagner d’un suivi de la fibrillation en microscopie à force atomique (AFM)
par exemple. L’utilisation d’une méthode de visualisation de résolution moléculaire
permettrait en effet, d’une part d’observer d’éventuels changements importants de structure
tertiaire, mais également de directement suivre l’évolution du revêtement protéique au cours
du temps et notamment de déterminer si deux populations d’agrégats, l’une menant à des
fibres, l’autre non, sont effectivement formées sur la surface.
Les structures de fibronectine observées seraient apparemment plutôt décrites par un
régime limité par l’agrégation, ce qui semble cohérent avec le fait que la fibronectine est un
objet chargé. L’augmentation de la force ionique, diminuant ces répulsions, favorise
2
La technique du FRET permet de relier une mesure de fluorescence à la distance entre deux flurochromes
greffés au sein d’une même molecule (voir Etude Biblio II.3b). Cette technique permet donc de visualiser des
changements de conformations au sein de cette molécule.
165
l’agrégation. En théorie, cet écrantage des répulsions conduirait alors plutôt à une agrégation
de type limitée par la diffusion. La résolution optique, encore limitée par l’amplification par
des anticorps, ne permet sans doute pas de discriminer entre la formation d’amas de type DLA
ou RLA, lorsqu’ils sont de petite taille, les deux apparaissant vraisemblablement compacts en
immunomarquage. L’utilisation de méthodes microscopiques de plus haute résolution pourrait
aider à la distinction entre les deux mécanismes. Cependant, un problème rencontré lors
d’essais d’observation de la fibronectine sur l’HA par l’AFM est la planéité de la surface. En
effet, si les céramiques d’HA sont relativement planes à l’échelle d’une molécule, le suivi du
processus d’agrégation nécessite l’observation à une échelle plus importante et la rugosité de
la surface ne permet pas toujours de distinguer la protéine adsorbée, même en utilisant les
données de déphasage et non pas d’amplitude en mode tapping3. Une façon de suivre la
fibrillation de la fibronectine dans le temps pourrait être la microscopie de fluorescence mais
en utilisant cette fois une fibronectine marquée par un fluorochrome qui permettrait un suivi
cinétique de l’adsorption. Cette étude nécessiterait cependant de s’assurer préalablement que
le marquage de la protéine ne modifie pas ses propriétés d’assemblage. Nos résultats
suggèrent également une différence de structure possible entre des fibres formées à forte et
faible force ionique. L’observation à plus petite échelle pourraient également peut être
permettre de faire le distinguo entre les deux.
Enfin, le marquage à la thioflavine T suggère une organisation partielle de type
amyloïde. L’étude par diffraction X et spectroscopie infra-rouge pourraient permettre là aussi
d’apporter des nouvelles informations, sur la présence de structures périodiques et de feuillets
β intermoléculaires respectivement.
Un problème reste la validation de l’hypothèse suggérée par le modèle, que le
dépliement serait induit par la rencontre avec une protéine dépliée. Si une possible corrélation
statistique entre le dépliement et l’agrégation pourrait être tirée de méthodes séparées, l’idéal
serait de trouver un moyen d’investigation expérimentale permettant de révéler simultanément
l’agrégation et l’extension. Une idée, qui nécessiterait toutefois la mise en œuvre de moyens
techniques importants, serait d’utiliser des techniques de fluorescence de type FRET,
couplées à l’observation de l’agrégation par AFM par exemple.
Enfin, les images de fluorescence de la fibronectine adsorbée suggère une profondeur
des amas et donc une croissance en trois dimensions. Cet aspect devrait être confirmé par
3
En AFM, le mode tapping, ou mode oscillant, permet d’obtenir une image topographique d’une surface par
enregistrement des variations de l’amplitude d’oscillation de la pointe qui balaye la surface, mais également des
informations sur la composition d’une surface, par enregistrement du déphasage du à l’amortissement de ces
mêmes oscillations.
166
l’observation en microscopie confocale par exemple. Un aspect négligé dans notre étude est
également le fait que la fibronectine est constituée de deux chaînes. Une piste intéressante
serait d’étudier dans quelle mesure la forme dimérique de la fibronectine a un impact sur ses
propriétés d’assemblage.
Notre modèle d’adsorption permet d’étudier l’effet des interactions entre protéines,
facilitant, ou au contraire inhibant, leur changement de conformation. Le changement de
conformation est une caractéristique générale des protéines aux interfaces et ce type de
modèle pourrait être éventuellement applicable à d’autres protéines que la fibronectine.
En général l’interaction entre protéines est plutôt considérée comme stabilisatrice de la
conformation native d’une protéine, du fait de l’encombrement moléculaire (Meadows et al,
2003; Kondo et Fukuda, 1998; Kondo et al, 1996). Cependant, l’effet inverse a été mis en
évidence dans différents cas. L’assemblage de structures protéiques amyloïdes fait ainsi
intervenir des changements de conformation concomitants de l’agrégation (Scheibel et al,
2004; Modler et al, 2003), et peut être induite par l’adsorption (Hoyer et al, 2004; Zhu et al,
2002). De plus, l’induction de la formation de ce type de structures en présence de fibres déjà
formées (Xing et al, 2002; Krebs et al, 2000), suggère une propagation du dépliement, qui
pourrait correspondre au mécanisme de dépliement induit par contact imaginé dans notre
modèle. Ces mécanismes d’agrégation pourraient en fait décrire le comportement de
nombreuses protéines. Une hypothèse est en effet que la plupart des protéines aurait en fait un
potentiel ‘amyloïdogénique’ (Fu et al, 2004; Dobson, 1999).
Outre ces structures particulières, le dépliement du lysozyme adsorbé dépendrait par
exemple uniquement de la densité de protéines adsorbées, indépendamment du temps, de la
concentration d’adsorption ou de l’hydrophobie de la surface, suggérant une prédominance
des interactions entre protéines dans l’induction du dépliement (Sethuraman et al, 2004).
Une perspective intéressante de ce travail serait donc d’étendre en parallèle l’étude
expérimentale et le développement du modèle à d’autres protéines et d’autres surfaces afin de
tester la généralisation possible des mécanismes envisagés.
L’induction d’un dépliement par l’adsorption, puis l’amplification du phénomène par
interactions entre protéines voisines présente, d’une certaine manière, des similitudes avec la
fibrillation de la fibronectine au sein de la matrice. Comme le souligne une revue récente, si ni
la structure des fibres de fibronectine, ni les mécanismes qui conduisent à leur formation au
sein des matrices ne sont clairement élucidés, il semble en revanche que la clef de voûte du
167
processus soit le changement de conformation de la molécule (Mao et Schwarzbauer, 2005).
La plupart des études sur le sujet convergent vers l’hypothèse que ce changement de
conformation résulterait de l’interaction entre la fibronectine et les intégrines, via le couplage
de ces dernières au cytosquelette. Cependant, si l’assemblage d’une matrice de fibronectine
requiert la présence du domaine central de liaison aux cellules, ce n’est pas le cas de
l’incorporation de fibronectine exogène au sein d’une matrice (voir Etude Bibliographique II).
Ces observations suggèrent que l’interaction avec les cellules pourrait induire un changement
de conformation initial et qu’ensuite le mécanisme pourrait être en partie coopératif. Si la
fibrillation de la fibronectine au sein de la matrice fait intervenir de nombreux partenaires et
moyens de régulations, on peut cependant se poser la question de l’analogie possible entre les
mécanismes suggérés par nos expériences d’adsorption et la fibrillation de la fibronectine au
sein de la matrice. Ainsi, un modèle de fibrillation de la fibronectine à la surface des cellules,
développé selon des processus stochastiques de diffusion agrégation, a-t-il été très récemment
proposé (Pompe et al, 2005).
La structuration de la fibronectine au sein de la matrice extracellulaire influence le
comportement cellulaire. Sa structuration ne semble cependant pas significativement
influencer l’adhérence sur l’hydroxyapatite. L’adhérence sur l’hydroxyapatite seule est en fait
déjà élevée, par rapport au polystyrène de culture par exemple, et la présence de la
fibronectine peut n’avoir qu’une faible influence, soit parce que la surface est saturée en
cellules, soit parce que la fibronectine ne recouvre pas entièrement la surface et que
l’adhérence moyenne reflète finalement essentiellement la surface sous-jacente. Ainsi,
l’adhérence sur différents matériaux dépend-elle plus du matériau lui-même que de la quantité
de fibronectine ou de sa structuration. Toutes conditions confondues, l’adhérence ne semble
étonnamment pas plus corrélée à l’exposition du domaine de reconnaissance des cellules. Au
vu de la variabilité de la structuration de la fibronectine, mesurer l’adhérence moyenne ne
semble finalement pas le moyen le plus judicieux d’observer l’influence de cette structuration
sur l’hydroxyapatite. Cette étude pourrait être poursuivie par des marquages en parallèle de la
fibronectine adsorbée et des cellules adhérentes. Ceci permettrait en effet d’étudier
directement une éventuelle corrélation entre le comportement cellulaire, d’adhérence, de
morphologie ou de migration par exemple, et la fibronectine sous-jacente. Les premiers essais
réalisés au laboratoire montrent que la présence de la fibronectine favorise nettement
l’étalement des cellules, et cette étude est à poursuivre. Dans le cadre de l’élaboration de
biomatériaux osseux, une préoccupation est bien sûr le contrôle du comportement cellulaire
168
sur le matériau à plus long terme, notamment en terme de prolifération et de différenciation de
cellules osseuses sur lesquelles la fibronectine joue un rôle prépondérant in vivo, et qu’il
conviendrait d’étudier, en utilisant probablement d’autres types cellulaires que la lignée
d’ostéosarcome utilisée ici, par exemple des cellules de moelle osseuse.
L’ensemble de nos résultats souligne la variabilité et la complexité d’un phénomène
dont l’étude nécessite clairement l’emploi de plusieurs méthodes en parallèle, mesures
d’ensemble et mesures locales, simulations et expérimentations. Nous avons mis certains
outils d’étude du système au point, mais la compréhension des mécanismes sous-jacents
requiert le développement de ces outils et la poursuite des travaux par d’autres méthodes. Nos
résultats suggèrent néanmoins que la fibrillation de la fibronectine sur une surface pourrait
être décrite par des mécanismes de diffusion agrégation.
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195
Annexes
196
Annexess
Annexe 1 : Article I
Soumis à Journal of Colloid Interface Science
197
Annexes
Adsorption-induced Fibronectin Aggregation and Fibrillogenesis
Delphine Pellenc§, Hugues Berry§+, Olivier Gallet§1
§ ERRMECe, Université de Cergy-Pontoise, 2 avenue Adolphe Chauvin BP 222, 95302 Pontoise CEDEX, France
+ Team Alchemy, INRIA Futurs, 4 rue Jacques Monod, 91893 Orsay CEDEX, France
Keywords: Fibronectin, aggregation, fibrillogenesis, protein adsorption, hydroxyapatite, biomaterials
Abstract Fibronectin (Fn), a high molecular weight glycoprotein, is a central element of extracellular matrix
architecture that is involved in several fundamental cell processes. In the context of bone biology, little is
known about the influence of the mineral surface on fibronectin supramolecular assembly. We investigate
fibronectin morphological properties induced by its adsorption onto a model mineral matrix of
hydroxyapatite (HA). Fibronectin adsorption onto HA spontaneously induces its aggregation and fibrillation.
In some cases, fibronectin fibrils are even found connected into a dense network that is close to the matrix
synthesized by cultured cells. Fibronectin adsorption-induced self-assembly is a time-dependant process that
is sensitive to bulk concentration. The N-terminal domain of the protein, known to be implicated in its selfassociation, does not significantly inhibit the protein self-assembly while increasing ionic strength in the bulk
alters both aggregation and fibrillation. The addition of a non-ionic surfactant during adsorption tends to
promote aggregation with respect to fibrillation. Ultimately, fibronectin fibrils appear to be partially
structured like amyloid fibrils as shown by thioflavine T staining. Taken together, our results suggest that
there might be more than one single organization route involved in fibronectin self-assembly onto
hydroxyapatite. The underlying mechanisms are discussed with respect to Fn conformation, Fn/surface and
Fn/Fn interactions and a model of fibronectin fibrillogenesis onto hydroxyapatite is proposed.
Introduction1
Fibronectin (Fn2) is a high molecular
weight glycoprotein that is a major
component of the extracellular matrix (ECM)
of all connective tissues. This multifunctional
protein is known to play a role on several
fundamental cell functions, adhesion, growth,
differentiation or migration [1]. In bone,
Fibronectin is involved in the early stages of
osteogenesis [2;3;4] and has been suggested
to be able to nucleate mineralization [5;6].
Fibronectin has not only a prominent
functional role in connective tissues but is
also capable of interacting with a number of
matrix components, including type I collagen
[7], glycosaminoglycans [8], osteopontin [9]
and itself [10;11;1], what makes it a central
support of matrix architecture.
1
Address correspondence to Olivier Gallet,
ERRMECe, [email protected]; tel: +33(0)1
34 25 66 99
2
Abbreviations used: (ECM) extracellular matrix;
(EDTA) Ethylenediamine Tetraacetic Acid; (Fn)
Fibronectin; (F70) Fibronectin 70kDa N-terminal
fragment; (HA) hydroxyapatite; (THT) thioflavine T;
(IIIn) nth type III Fn domain; (In) nth type I Fn domain
198
Fibronectin is found under compact
form in the plasma [12] and at the cell surface
[13]. Both are incorporated in the ECM,
where they are found under extended forms,
which self-associate into a dense fibrilar
network [14]. In vivo, the compact-toextended transition is partly triggered by cellapplied mechanical forces through cell
membrane receptors, the integrins [15;16].
Fibronectin is composed of two nearly
identical subunits, each of which is a
combination of type I, II and III domains (see
Fn structure on fig.1). Its compact form is
stabilized by inter-subunit ionic interactions
between III2-3 and III12-14 or I1-5 domains [17]
and Fn extension may be triggered by ionic
strength increase [18;19;20;21] or upon
adsorption onto hydrophilic surfaces [22;23].
This transition would allow the exposure of
Fn self-association domains required for fibril
growth but the mechanisms underlying fibril
and subsequent network self-assemblies are
still under investigation [24;25;10].
Together with the understanding of
fundamental processes, Fn self-assembly
mechanisms may have relevance in
optimizing a biomaterial performance.
Annexess
physicochemical environment of the protein
in order to elucidate the interactions involved
in fibronectin adsorption and self-association
on HA.
Fig.1. Fibronectin schematic structure. The combination of
type I, II and III domains is represented for one strand of the
dimere. Location of cell-binding site, 70 kDa N-terminal
fragment and main Fn self-association sites are indicated.
Calcium phosphate matrices are largely
studied as hard tissue implants [26] due to
their capacity to establish chemical bonds
with the surrounding tissue. Hydroxyapatite
(HA) is the major inorganic component of
mammalian bones and synthetic HA has been
shown to have a high biocompatibility,
concerning both cell adhesion [27;28] and
plasma protein adsorption [29]. It exhibits
large osteoconductive properties in vivo
[30;31] and may be used as a model matrix to
investigate fundamental mechanisms of bone
mineralization [32].
Biomineralization is a physiological
process involving crystal formation in living
organisms. In addition to regulate cellular
functions, bone matrix proteins, the synthesis
of which is synchronized in time and location
with the mineralization process [33;34], are
now known to play a direct role on the
mineral nucleation and growth [35;36;37;38].
This activity is tightly linked to their
structural organization onto the mineral
matrix that would provide the confined space
and physico-chemical local environment
needed for the ordered morphology of the
crystals.
Investigating not only the adsorption
properties of ECM molecules but also their
assembling properties at the supramolecular
scale on mineral matrices might therefore
help the understanding of some mineralization
fundamentals. While fibronectin adhesive
properties have been extensively used to
improve the biocompatibility of hard tissue
implants [39;40;41], little is known about the
influence of the mineral surface on the protein
assembly. Our purpose here is the
investigation of fibronectin supramolecular
assembly induced by its adsorption onto a
model mineral matrix of hydroxyapatite. We
characterize the aggregative structures and the
sequence of the assembly and try to decipher
responses of this assembly to variations of the
Materials and Methods
Hydroxyapatite ceramic disks
Hydroxyapatite powder, synthesized by wet
precipitation route, was kindly provided by Pr
Eric Champion (SPCTS UMR CNRS 6638,
Université
de
Limoges,
France).
Hydroxyapatite disks, 13 mm diameter and 3
mm thick, were fabricated by pressing the
powder under 80 MPa for 15s. After
compression, disks were sintered for 2 hours
at 1200°C. Phase composition was checked
with X-ray diffraction. Prior to adsorption
experiments, the ceramics disks were
immersed for 24 hours at 37°C in the
adsorption buffer to allow surface chemical
and thermal equilibration.
Fibronectin Purification
Fibronectin was purified from human
cryoprecipitated plasma (kind gift from
Laboratoire du Fractionnement et des
Biotechnologies, Les Ulis, France) according
to Poulouin and al. [42]. This purification
process has been shown to provide a protein
solution exhibiting a purity of about 98%
w/w. Fibronectin was stored at 8°C in 50 mM
Tris buffer pH 7.4, containing 1mM EDTA.
Prior to each series of adsorption experiments,
fibronectin was filtered through a 0.2µm sieve
to remove large protein aggregates that might
have grown in solution.
For cell adhesion experiments,
filtration was processed under sterile
atmosphere. All the adsorption experiments
were carried out at 37°C and, unless
otherwise stated, for 2 hours with fibronectin
diluted 0.1 g/L in 50 mM Tris buffer pH 7.4.
Adsorption experiments
To assess the influence of ionic strength on
fibronectin surface assembly, different NaCl
50mM Tris buffers were made, the
composition of which is summarized in table
1. Ionic strengths are calculated for a
fibronectin concentration of 0.1g/L at pH 7.4.
The influence of a non-ionic surfactant on
fibronectin assembly was assayed using poly199
Annexes
oxyethylensorbitan monolaurate (Tween 20®,
Sigma-Aldrich, USA). Tween 20 was
extemporaneously added to fibronectin
solutions to a final Fn/Tween20 molar ratio
ranging from 0.1 to 100. The highest Tween
concentration remains below the surfactant's
critical micellar concentration, which is 60
mg/L.
Table 1. Table I. Adsorption buffer composition. Each buffer
contains 50mM Tris, various amount of NaCl and is buffered at
pH 7.4.
N-terminal 70kD fibronectin fragment
Adsorption experiments involving the Nterminal domain of the fibronectin were
performed using the purified 70-kDa
fibronectin N-terminal domain (F70) (SigmaAldrich,
USA). The fragment was
homogeneously added to fibronectin solutions
at the beginning of the adsorption experiment.
Fibronectin concentration was kept at 0.1 g/L
and the Fn/F70 molar ratio ranged from 0.1 to
1.0.
ELISA assay
The amount of fibronectin adsorbed onto HA
samples was quantified using direct ELISA.
Ceramic samples were saturated for 1 hour at
37°C in 3 % non-fat milk Tris buffer. They
were incubated for 1 hour at 37°C with rabbit
anti-human plasma fibronectin polyclonal
antibody (Sigma F-3648) diluted 1:5000 in
saturation buffer and washed three times with
the saturation buffer. Samples were then
incubated for 1 hour at 37°C with goat antirabbit IgG phosphatase alkaline-conjugated
antibody (Sigma A3687) diluted 1:15000 in
saturation buffer, and washed three times in
Tris buffer. They were finally incubated for 1
hour at 37°C with PNPP diluted 0.3% w/v in
diethanolamine. PNPP hydrolysis product was
detected spectrophotometrically at 405nm.
Fn cell-binding site (cbs) exposure
Fibronectin cell-binding site exposure was
estimated by direct ELISA using the same
procedure as described above except that the
primary antibody was a mouse monoclonal
anti-Fn cbs antibody (Chemicon MAB1933)
diluted 1:1000, and the secondary one a sheep
anti-mouse IgG phosphatase alkaline200
conjugated antibody (Sigma A5324) diluted
1:15000.
Desorption – Next to the adsorption
experiments, ceramics were rinsed with Tris
buffer to remove loosely bound fibronectin.
They were then immersed for 24 hours at
37°C in 50mM Tris buffer. The protein
amount released in the supernatant was
determined by colorimetric protein assay
(Biorad protein assay).
Immunofluorescent staining
In situ detection of the fibronectin coating
onto HA ceramics was performed by
immunofluroescent staining. Following Fn
adsorption, ceramic samples were saturated
for 1 hour at 37°C in 3 % non-fat milk Tris
buffer, prior to immunodetection assay. They
were then incubated for 1 hour at 37°C with
rabbit
anti-human
plasma
fibronectin
polyclonal antibody (Sigma F-3648) diluted
1:1000 in the saturation buffer, washed three
times, and incubated for 45 minutes at room
37°C with goat anti-rabbit IgG TRITCconjugated antibody (Sigma T-6778) diluted
1:500 in the saturation buffer, and finally
washed 3 times in Tris buffer. Fluorescence
images were obtained with bandpass filter
centred at 570 nm. All controls for nonspecific labelling yielded only background
fluorescence.
Thioflavine T staining
Fibronectin fibril structure was investigated
using thioflavine T (Sigma Chemical; St
Louis, MO, USA), a non-specific stain for
amyloid fibrils with a beta-sheet structure
[43]. Thioflavine T (THT) was diluted in Tris
buffer at a concentration of 1 mM and then
filtered three times through a 0.2µm sieve.
Prior to the adsorption experiments THT was
mixed with Fibronectin to a final Fn:THT
molar ratio of 55:1. After supernatant removal
and sample gentle wash, fibronectin
immunofluorescent staining was performed as
described above. Samples were then observed
with a fluorescence microscope. Fluorescence
images were obtained with bandpass filters
centred at 480 nm and 570 nm to isolate
spectrally the THT and TRITC probes
respectively.
Annexess
Fig.2. Fibronectin morphological states on hydroxyapatite.
Fibronectin was observed by immunofluorescent staining
following adsorption of the protein diluted 1g/L in T50 buffer. In
this condition, fibronectin exhibits four distinct morphologies:
homogeneous coating (a), aggregates (b), isolated (c, d) or
connected (e, f) fibrils. In some cases, fibronectin fibrils are
connected into large clusters covering the surface (g, h).
Asterisks on (e) and (f) show examples of nodes between
connected fibrils. The arrows on (e) and (g) indicate thicker
structures were lateral interactions between individual fibrils
are thought to occur. Note that both isolated and connected
fibrils often coexist with aggregates (d, f, h). Scale bar 100 µm.
Morphological state frequency
From 5 to 20 fields were randomly chosen on
each sample, depending on the sample
variability. The occurrence frequency of one
fibronectin morphological state is expressed
as the number of fields presenting this state
over the total number of fields observed. The
results are then presented as the mean ± sd. of
this frequency over the total number of
samples in a given condition. Connected
fibrils prevailed over isolated ones in
counting these state frequencies so that the
total fibril proportion does not contain any
duplication.
Cell adhesion experiments
Cell adhesion assays were performed using
MG 63 cells. These cells are derived from
osteosarcomic human cells and able to
differentiate into osteoblastic cells under
specific conditions. All cell culture products
were purchased from Eurobio. Cells were
grown in HAM F12 medium complemented
with 10% foetal calf serum, 1%
penicillin/streptomycin and 1% glutamine.
When cells reached 80% confluence, they
were released from the substrate by treating
with 2ml of 0.5g/L trypsin in 0.2g/L EDTA,
diluted in 25ml complete medium and
centrifuged for 5 minutes at 1200g. The pellet
was resuspended either in complete medium
or in serum-free medium for cell adhesion
assays. Cells were then seeded on ceramics,
which had been previously coated with
fibronectin. After 2 hours incubation, samples
were gently washed with TBS to remove
unattached cells. 500 µL MTT, diluted 0.5
mg/mL in HAM F 12 medium, were then
added to each well and incubated for 3 hours.
Reduced MTT was released with addition of
1ml of isopropanol/HCl 0.1N and the number
of cells was estimated spectrophotometrically
at 570nm. Cell adhesion was expressed as a
percentage of the adhesion measured on
uncoated HA.
Statistics – All statistical differences between
mean values were decided by comparing
deviations with a Fischer test and then
comparing the means using the appropriate
Student t-test. Minimal p-value is indicated in
each case.
Results
Four morphological states
Fibronectin
adsorption
onto
HA
spontaneously induces its aggregation and
fibrillogenesis
as
shown
by
immunofluorescent staining (fig.2). The
different states that are observed are classified
into four categories according to their
morphological
features:
Homogeneous
Coating, Aggregates, Isolated Fibrils and
Connected Fibrils. Homogeneous Coating
refers to a state where the fluorescent staining
of adsorbed fibronectin presents a uniform
intensity, i.e. when none of the other
structures is observed (fig.2a). This does not
mean that the fibronectin coating does not
exhibit any particular organization at all, but
201
Annexes
that, if present, its characteristic scale lies
below optical resolution so that we may not
differentiate it from a truly uniform
distribution. Aggregates are small compact
structures, exhibiting irregular shapes. Their
larger dimension typically ranges from a few
to a few tens of micrometers (fig.2.b) but
bigger aggregates, about 50µm long, could be
observed in few cases. Upon adsorption onto
HA, fibronectin also forms elongated fibrilar
structures, exhibiting a linear or tortuous
shape (fig.2.c, d). Their length ranges from
tens to thousands of micrometers on average
and may occasionally reach the millimetre
(fig.2.d, e). Fibronectin fibrils may be found
isolated or connected one to another. Some
fibrils exhibit a marked direction change that
could let suppose that two fibrils are linked,
but we consider fibrils to be connected only
when no less than three branches emerge from
what is thus referred to as a node, i.e. only
when there was no uncertainty about a
connexion (see asterisks on fig.2.e, f).
Fibronectin may also display thicker
elongated structures that suppose lateral
interactions between individual fibrils (see
arrows on fig.2.e, g). Ultimately, fibronectin
connected fibrils may turn into a dense
network of highly ramified structures (fig.2.g,
h).
Time sequence of the assembly
Fibronectin assembly onto hydroxyapatite is a
time-dependent process, the sequence of
which is presented on figure 3. At low bulk
concentration (fig.3.a), fibronectin aggregates
appear on the surface within the first five
minutes of adsorption and persist over hours,
their proportion being unchanged with time.
Conversely, almost no fibrils are present at
the beginning of adsorption. Their total
proportion significantly increases after 30
minutes but remains about three times lower
than the aggregate one. This proportion
represents mostly isolated fibrils as the
proportion of connected ones stays below 0.1
at all times. Despite changes in morphology,
and especially fibril emergence, at this
concentration, fibronectin amount on HA
does not significantly change with time, as
shown by direct Fn ELISA assay on ceramic
samples (fig.4.a).
202
Fig.3. Time-sequence of fibronectin assembly on HA with
respect to bulk concentration. The occurrence frequency of
each of the four morphological states (see illustrations on fig.1)
is followed between 5 minutes and 15 hours at fibronectin bulk
concentration (a) 0.01 g/L; (b) 0.1 g/L; (c) 1g/L. Frequencies
are calculated from immunofluorescent images as described in
Materials and Methods part. (H) homogeneous coating, (A)
aggregates , (F.isol.) isolated fibrils, (F.connect.), connected
fibrils and (F.tot.) total fibrils. Results are means over 9
samples. s.d bars have been omitted for clarity. For each
concentration and type of structure we tested the significance
of the time evolution against the time 5minutes t: p<0.05; tt:
p<0.01. Statistical significance of the bulk concentration
increase is tested against the concentration 0.01g/L: We
indicated + p<0.05; ++ p<0.01; +++ p<0.001 when the
frequency was found higher than that at 0.01 g/L, or - p<0.05; - p<0.01 when it was found lower.
Bulk concentration effect on the assembly
Fibronectin concentration in the bulk has
significant impact on the protein surface
assembly. Increasing Fn bulk concentration
from 0.01 to 0.1 g/L results in a two-fold
increase in isolated fibrils (fig.3.b). A second
increase in concentration displaces the effect
towards connected fibrils (fig.3.c). In this
latter case, the increase is observed at short
times but results in the same total fibril
proportion than at 0.1 g/L after 15 hours
adsorption, suggesting an acceleration of the
process rather than further fibril creation.
Fibronectin concentration in the bulk has an
opposite effect on aggregates, its increase
significantly decreasing their proportion.
Annexess
Fig.5. Fibronectin desorption from HA with respect to Fn bulk
concentration and adsorption duration. Following Fn
adsorption at 0.01, 0.1 or 1g/L from 5 minutes to 15 hours, HA
samples were immersed for 24 hours in T50 buffer. Fn
desorption was then deduced from protein amount detected in
the supernatants. Results are mean over 3 samples.
Significant difference with desorption at 5 minutes: *p<0.05.
Fig.4. Time evolution of fibronectin total adsorption and cell
binding site (cbs) exposure on HA with respect to bulk
concentration. Fibronectin was let adsorb onto hydroxyapatite
for 2 hours in T50 buffer. We quantified (a) Fn adsorption by
direct ELISA using a polyclonal anti-Fn antibody and (b) Fn
cell binding site (Fn-CBS) exposure using a monoclonal anti
Fn-CBS antibody. This was done for three different Fn bulk
concentrations 0.01g/L, 0.1 g/L and 1 g/L from 5 minutes to 15
hours. Results are means over 4 samples. For each
concentration we tested the significance of the time evolution
against the time 5minutes t: p<0.05. Statistical significance of
the bulk concentration increase is tested against the
concentration 0.01g/L: - p<0.05; - - p<0.01.
Surprisingly, when probing fibronectin
quantity, the higher the concentration and the
longer the adsorption time, the lower the
amount of the protein on HA ceramics
(fig.3a). Fibronectin is detected using direct
ELISA, the procedure of which implies
several hours of incubation in Tris buffers.
Fibronectin low detected amounts could thus
either be due to lower adsorption as well as to
a higher desorption during the assay. To settle
the question we assayed fibronectin
desorption from HA samples with respect to
the adsorption time and bulk concentration.
This revealed a four-fold higher desorption
for 1g/L-15h adsorption, compared with the
other time and concentration conditions
(fig.5). Between these, no significant
differences are observed between desorbed
quantities, while there are differences in the
amount detected on the surfaces of HA
samples (fig.4.a). If desorption is involved, it
might therefore not be the only reason for low
fibronectin detection, and differences during
the adsorption step might be implicated as
Fig.6. MG63 cell adhesion on Fn-coated HA with respect to Fn
bulk concentration during adsorption. MG63 cells adhered for
2 hours on HA samples previously coated with 0.01, 0.1 or
1g/L Fn during 5 minutes to 15 hours. Cell adhesion was
evaluated using MTT assay and expressed in percentage of
adhesion on uncoated HA. Significant difference with 5minutes
condition: t p<0.05; with 0.01 g/L condition: – p<0.05
well. One should note here, that, despite
desorption, since immunofluorescence and
ELISA are very similar methods, as far as
incubation times and buffer composition are
concerned, the amount detected by the latter
remains relevant when discussing the former.
In order to examine a possible correlation
between
fibronectin
supramolecular
organization
and
conformation,
we
investigated the accessibility of the
fibronectin cell-binding site (cbs) with respect
to the adsorption time and concentration but
could not find any significant difference
amongst adsorption conditions (fig.4.b). Due
to a high variability of the staining, no
significant change is observed either when
relating the cbs exposure to the total
fibronectin amount, as shown by the ratio
between both detection levels in each
condition (not shown).
203
Annexes
MG63 cell adhesion
Fibronectin layer morphology might directly
influence its function and we assessed this
relationship by evaluating MG63 cell
adhesion with respect to Fn adsorption
conditions. MG63 cell adhesion is only poorly
affected by Fn concentration or adsorption
time (fig.6). Except a higher adhesion after 5
minutes adsorption of 0.01 g/L Fn, compared
to other conditions, no other significant
evolution is observed. Consistent with the
variability in Fn cell-binding site exposure
(fig.4.b), we found a high variability of cell
adhesion with respect to Fn bulk
concentration and adsorption duration, so that
we could not show any significant correlation
with fibronectin amount or morphological
state, and these preliminary results would
require further investigations.
Ionic strength
As electrostatic interactions may influence
both fibronectin tertiary structure and binding
to the HA surface, we investigated the effect
of varying the ionic strength in the bulk on
fibronectin assembly on HA. Figure 7
illustrates
fibronectin
morphological
structures observed for three different ionic
strengths. At the lowest value (T50, I=0.048),
fibronectin exhibits both fibrils and
aggregates, as described previously. At higher
value (T50N20, I=0.068), fibronectin exhibits
only aggregates disseminated all over the
surface and with quite regular shape and size.
At high ionic strength (T50N500, I=0.548),
both morphological states are found again.
Note that, in this condition, fibrils are similar
in aspect to those observed at low ionic
strength.
The
frequency
of
each
morphological state over a whole range of
ionic strength values is presented on figure 8.
This shows biphasic behaviours of aggregate
and fibril proportion with respect to
increasing ionic strength, i.e. an initial
increase in aggregate and decrease in fibril
proportion, the latter completely disappearing
between I=0.063 and I=0.198, followed by a
reversal of the effect, i.e. a decrease in
aggregate and increase in fibril proportion.
The ionic strength increase is correlated with
an increase in fibronectin adsorption (that
might also be due to a decrease in desorption
204
Fig.7. Ionic strength influence on fibronectin assembly on HA
Fibronectin, diluted 0.1 g/L in T50Nx (Tris 50mM, NaCl x mM,
pH 7.4) buffers, adsorbed on HA samples for 2 hours at 37°C.
Each row presents 3 illustrations of the structures observed in
each ionic strength condition. Scale bar: 100 µm.
Fig.8. Fibronectin morphological state occurrence on HA with
respect to the ionic strength in the bulk. Fibronectin, diluted 0.1
g/L in T50Nx (Tris 50mM, NaCl x mM, pH 7.4) buffers,
adsorbed on HA samples for 2 hours at 37°C. Fn state
abbreviations are the same as in figure 3. Results are means
over 7 samples. s.d. have been omitted for clarity. Difference
with respect to T50 condition * p<0.05 ** p<0.01; *** p<0.001.
Fig.9. Ionic strength effect on fibronectin adsorption and cbs
exposure on HA Fibronectin, diluted 0.1g/L in T50Nx (Tris
50mM, NaCl x mM, pH 7.4) buffers, adsorbed on HA samples
for 2 hours at 37°C. Fn total adsorption and cbs exposure are
quantified using direct ELISA. Results are means over 4
samples. Significant difference with respect to T50 condition:
*p<0.05; **p<0.005.
Annexess
during detection assay, as seen before), which
reaches a plateau value beyond I=0.068
(fig.9.a), where there is a rapid increase in cbs
exposure (fig.9.b).
Fig.10. Ionic strength and non-ionic surfactant influences on
fibronectin assembly on HA. Fibronectin, diluted 0.1 g/L in in
T50Nx (Tris 50mM, NaCl x mM, pH 7.4) buffers, containing
Tween 20 to a final Tween/Fn molar ratio 1 or 100, adsorbed
on HA samples for 2 hours at 37°C.
Non-ionic surfactant
Further investigation of the interactions at
work in fibronectin assembly on HA was
carried out by examining the effect of adding
Tween 20, a non-ionic surfactant, in three
different ionic strength adsorption buffers.
Without salt, for an equimolar Tween/Fn
ratio, fibronectin fibril morphology is similar
to that observed without Tween; while a
hundred times higher Tween/Fn molar ratio
results in the complete disappearance of
fibronectin fibrils on HA and only very small
aggregates are observed (fig.10). Both
morphological states evolve in a slightly
different way with respect to Tween content,
as aggregate proportion suddenly increases at
low tween content, while total fibril
proportion seems to be more gradually
lowered with increasing Tween (fig.11.a). At
intermediate ionic strength value, Tween has
not effect either on aggregate aspect (fig.10)
or on their proportion (fig.11.c). At high ionic
strength, the presence of a non-ionic
surfactant does not change fibril proportion
but increases aggregate one in a sudden
fashion, in a way similar to the effect
observed at low ionic strength. In general,
increasing Tween content leads to an in
increase in fibronectin adsorption (fig.12) and
the lower the ionic strength the stronger the
effect. All the ionic strengths generate the
same fibronectin amount at the highest Tween
content so that Tween and ionic strength
appear to have the same promoting effect on
fibronectin adsorption.
Fig.11. Effect of a non-ionic surfactant on fibronectin
morphological state occurrence on HAwith respect to the ionic
strength in the bulk Tween 20 was added to each adsorption
buffer (a)T50N0, (b)T50N20 or (c)T50N500 to a final
Tween/Fn molar ratio ranging from 0 to 100. Fn state
abbreviations are the same as in figure 3. Results are means
over 3 samples. s.d. have been omitted for clarity. Significant
difference with respect to the same ionic strength condition
without Tween: higher frequency +p<0.05; ++p<0.01;
+++p<0.001; lower frequency - p<0.05 ; - -p<0.01 ; - - p<0.001.
Fig.12. Effect of a non-ionic surfactant on fibronectin
adsorption onto hydroxyapatite with respect to the ionic
strength in the bulk Fn total adsorption is quantified using
direct ELISA. Results are means over 3 samples. Significant
difference with no Tween condition * p<0.05,**p<0.01 and with
T50 condition, at the same Tween content §§p<0.01
§§§p<0.001.
205
Annexes
Fn N-terminal domain
Fibronectin self-association is known to rely
on interactions between specific domains of
the protein among which the N-terminal
domain is the most prominent [44;45]. We
examined the inhibitive potential of a
fibronectin 70kD N-terminal fragment (F70)
on fibronectin self-assembly onto HA.
Whatever its amount, the presence of F70
does not affect the aggregate proportion but
significantly reduces the isolated fibril
proportion (fig.13). It does not have much
effect on connected ones and the decrease in
total fibril proportion appear to be not
significant.
Fig.13. 70 kDa N-terminal Fn fragment (F70) inhibition assay
of fibronectin assembly. F70 was added to 0.1g/L Fn to a final
Fn:F70 molar ratio ranging from 10 to 1. Significant difference
with the frequency without F70 ** p>0.001; * p>0.01.
Amyloid-like structures
Amyloid fibrils are protein aggregative
structures
involved
in
many
neurodegenerative
diseases
[46].
As
fibronectin is supposed to have an
amyloidogenic potential [47] and as amyloid
fibrils may be surface-induced [48], we
wondered whether our adsorption-induced
fibronectin structures exhibited amyloid-like
properties and probed them using thioflavine
T (THT), a non-specific fluorescent dye of
amyloid structures [49;50]. We observed THT
staining, with respect to adsorption time and
bulk concentration. The results are
exemplified for Fn 1g/L on figure 14. In this
condition, except at short time (fig.14.a), most
fibronectin aggregates are THT-stained
(fig.14.b, c, and e). THT incorporation into
fibronectin fibrils appears to be more variable
as there may be stained or unstained fibrils in
the same adsorption condition (fig.14.d, e). At
lower bulk concentration, the staining is
206
overall less significant and as much variable
(not shown) and we are not able to decipher
Fig.14. Amyloid-like structure in fibronectin aggregates and
fibrils on HA 1 g/L fibronectin adsorbed with thioflavine T in
T50 buffer. right panel: THT staining; left panel:
mmunofluorescent staining. In this condition, at short time,
aggregates do not incorporate THT (a) while there are often
stained at longer times (b,c,e). In general, fibrils exhibit a quite
strong THT staining (b,d) while some connected ones are not
stained at all (e)
any correlation of the staining with the
adsorption time, or fibronectin morphological
state. Fibronectin amyloid-like structures
seem to form on HA, but this does not appear
to be the main mechanism for fibrils
assembly.
Discussion
At low bulk concentration, fibronectin
aggregates appear within minutes on
hydroxyapatite surface, while fibril proportion
increases rather slowly with time. This delay
between both structures emergence raises the
question whether aggregates only precede or
also nucleate fibril formation, i.e. whether
both morphological states belong to the same
organization path. If fibrils were directly
formed from aggregates, the persistence of the
Annexess
latter with time, at low bulk concentration,
would imply a simultaneous increase in
fibronectin amount. This is not supported by
our results (fig. 4.a). Alternatively, fibrils
could be formed from the reorganization of
molecules adsorbed within minutes but that
are not aggregated, while aggregates would
remain amorphous structures. In contradiction
with this view, at high bulk concentration, the
faster fibril formation is concomitant to a
decrease in aggregate proportion with time.
This decrease seems however unlikely to
occur out of desorption, since there is no
reason this would not be the case at low bulk
concentration. Hence, our data suggest that
the actual scenario of fibronectin fibrillation
might be more complex. The concentrationinduced increase in fibril proportion is mainly
due to the appearance of connected fibrils.
Except in few cases, where the network
covers large surface areas, fibrils are
connected into small clusters laying separate
one from another. This indicates that
connexion is more likely to occur through a
branching process, i.e. fibrils are grown from
the same origin (node), rather than through
joining of independently grown fibrils, which
would require a high fibril surface coverage
for meeting to occur. The decrease in
aggregate proportion might actually be
directly correlated to the appearance of nodes,
the former being the origin of the latter.
Consistent with this view, we may observe
that aggregates are often –but not exclusively
– positioned at the intersection of fibronectin
fibrils (see fig.1.f, g) when both are present.
Thus, one possibility could be that a different
type of aggregates forms at higher bulk
concentration and is able to nucleate fibrils
(see fig 15.a).
Our discontinuous time observation does
not allow ascertaining that fibril-nucleating
aggregates would be favoured at higher
concentration, but several data in the literature
point out that such mechanisms might be at
work in fibronectin assembly onto
hydroxyapatite. Our results indicate that
aggregates that form at low and high bulk
concentration might be different in nature,
and this is likely to be related to surface
coverage. It is known that most proteins
undergo structural
adsorption [51;52].
rearrangement
upon
Fig.15. Hypothetic model of fibronectin assembly on HA with
respect to (a) bulk concentration and (b) ionic strength (see
discussion).
Out of steric hindrance, the extent of these
surface-induced denaturations is reduced as
the bulk concentration, and hence the surface
coverage, increase [53;54;55]. Incidentally, at
high bulk concentration, the lower
protein/surface contact area results in a higher
degree of desorption [56], in agreement with
our observed desorption during the detection
assay. Simple excluded volume effects might
therefore explain how different fibronectin
conformations would arise onto HA with
respect to adsorption bulk concentration.
Though the underlying molecular mechanism
would require further investigation, we may
speculate that the 'fibril-competent' form at
higher bulk concentration might be linked to a
higher flexibility of the molecules weakly
bound to the substrate. At low surface
coverage, fibronectin exhibits a higher
stiffness, when compared to high surface
coverage, as shown by force microscopy
studies [57]. This flexibility at high bulk
concentration might allow the reorganization
of fibronectin aggregates that is required for
fibril growth to occur.
At low ionic strength value, fibronectin is
under a compact soluble form that is
stabilized by inter-subunit electrostatic
interactions [17]. Moreover, at pH 7.4,
fibronectin, which is an acidic protein with
pHi=5.5, has an overall negative charge. In
these conditions, repulsive interactions
207
Annexes
between Fn molecules are therefore
predominant
and,
despite
structural
rearrangement that may follow, the initial
adsorbing form is rather compact.
Increasing the ionic strength will first
decrease the repulsion between adsorbed
molecules and incoming ones from the bulk,
as well as repulsion between adsorbed
molecules
themselves.
This
might
respectively explain the observed increases in
surface
aggregation
and
fibronectin
adsorption (see fig.15.b). This concomitantly
leads to the complete disappearance of
fibronectin fibrils. As fibronectin aggregation
is a very fast process, we conjecture that the
aggregates, which are favoured in this case,
are amorphous ones, since one might expect
they would have lead to fibril growth after 2
hours adsorption if they were nucleating ones.
We may not exclude the hypothesis though,
that these associated forms may need longer
time for fibrils to grow, a step that would then
only be delayed.
A higher ionic strength does not further
enhance fibronectin adsorption but increases
again the fibril proportion. Increasing ionic
strength triggers Fn transition from compact
to extended form [20;58;19;21] with minimal
changes in intra-subunit tertiary structure
[21]. The Fn domains that would be involved
in the compact conformation of the protein
[17;59] are also predictably involved in Fn-Fn
intermolecular association [45;44]. Above
50mM NaCl, Fibronectin fibrillogenesis onto
HA would therefore be favoured by extension
of the molecules in the bulk, so that it would
adsorb under a conformation where selfassociation domains might already be exposed
(see fig.15.b). Consistent with this view,
Pernodet et al. observed the induction of
fibronectin fibrillogenesis upon adsorption
onto charged surfaces. They discuss their
observation in terms of bonding between the
surface and Fn charged domains implicated in
the compact form, thereby allowing Fn arms
extension and adsorption under a fibrilcompetent form [24]. Fn cell-binding site is
situated in the central region of the protein
(see fig.1). Its exposure increase at high ionic
strengths tends to confirm the salt-induced Fn
arms extension, but also implies the fibrils
formed on HA at low and high ionic strengths
208
have different structures. Consistent with this
idea, the addition of a non-ionic surfactant
alters fibronectin fibrils only when they are
formed at low ionic strength.
If repulsive interactions are certainly
involved in Fn/Fn interactions, interactions
between Fn and HA are less clear. The
addition of Tween 20 has the exact opposite
effect to what could be expected if
hydrophobic interactions between Fn and HA
were at work – i.e. no effect or a decrease in
adsorption out of competitive adsorption
[60;61]. In addition to favouring Fn
adsorption, the presence of a surfactant also
promotes its aggregation. Though the exact
mechanisms are not fully understood, some
authors tend to think that non-ionic
surfactants might promote protein unfolding
through the penetration of their hydrophobic
tail into the apolar region of the protein,
thereby exposing hydrophobic patches and
promoting either surface/protein [62] or
protein/protein hydrophobic interactions [63].
A recent study even suggests that the nonionic surfactant-induced inhibition of protein
aggregation might be linked to the
stabilization of small soluble aggregates,
preventing further growth, rather than to a
complete inhibition of protein association
[64]. Hydrophobic regions have been
identified inside [65;66] and between [67;68]
Fn domains. These regions might underlie Fn
interactions with the hydrophobic tail of the
surfactant. The observed increase in
fibronectin adsorption might be linked either
to a direct promotion of protein/surface
interactions, or, to surfactant-induced
aggregation in the bulk and direct deposition
of the aggregates and, if present, Fn/Tween
interactions remain to be elucidated.
Taken together our results indicate that there
might be various both aggregated and fibrilar
fibronectin structures formed onto HA (see
recapitulation on figure 15), a feature shared
by several proteins [69;70;71]. Varying the
adsorption conditions impairs not only Fn
conformation and Fn/Fn interactions in the
bulk, but also Fn/Fn interactions on the
surface, Fn/HA binding and ultimately HAinduced Fn conformational change. All these
features balance each other and while the
present paper suggests some mechanisms that
Annexess
may be involved, finding out the exact
fibronectin surface assembly pathways
requires further study.
The high variability in cbs exposure, THT
staining and cell response to fibronectin
fibrils and aggregates with respect to time and
concentration suggests moreover that
different Fn association mechanisms could
take place simultaneously. Ultimately,
fibronectin organization is known to influence
cell behaviour and elucidating the functional
differences between Fn aggregated states, has
to be further investigated, as this could yield
insights for the creation of new bone
biomaterials.
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210
Annexess
Annexe 2 : Article II
En révision pour Physical Review E
211
Annexes
Adsorption-induced conformational changes in protein diffusion-aggregation surface
assemblies
Delphine Pellenc*, Olivier Gallet*, Hugues Berry*+1
*ERRMECe, Université de Cergy-Pontoise, 2 avenue Adolphe Chauvin, 95302 Pontoise CEDEX, France
+
Team Alchemy, INRIA Futurs, 4, rue Jacques Monod, 91893 Orsay Cedex, France
PACS number(s): 87.68.+z, 82.40.Np, 87.14.Ee, 87.15.-Aa, 05.10.Ln, 82.20.Wt
Abstract
2D rigid colloid aggregation models may be applied to protein layers when no large conformational
change is involved. Yet, following adsorption, several proteins undergo a conformational transition that may
be involved in aggregative structures. Our focus here is how a conformational change might influence
surface clustering in a diffusion-aggregation model. We propose a model including diffusion, aggregation
and unfolding of proteins that are randomly adsorbed onto a surface. Our model allows simulating the case
where protein-protein interaction favours unfolding and the case where this interaction prevents it. We study
the effect of a simple disk-to-rod unidirectional unfolding and investigate the morphology of the resulting
clusters in the diffusion- and reaction-limited regimes. A rich variety of structures is produced, with fractal
dimension differing from universal diffusive aggregation models. Increasing unfolding probability shifts the
system from neighbour-induced to neighbour-prevented unfolding regime. The intermediate structures that
arise from our model could be helpful in understanding the assembly of different observed protein structures.
I. INTRODUCTION3
Proteins may be found circulating, in
physiological fluids, incorporated in a gel, the
extra-cellular matrix (ECM), or interacting
with solid surfaces. This is the case in bone
and teeth were ECM proteins are closely
associated with the mineral matrix. This
interaction plays a direct role in the
mineralization process [1-4] and has been
focused on in several studies [5-11]. The
surface-protein interaction is also one of the
first events following an implant graft and
raises much interest in biomedical
engineering [12-17].
Protein layer functions depend on both
the single molecule conformational state and
the self-assembled structure properties. The
conformation of a protein depends on its
location and surrounding, and adsorption at
interfaces may strongly affect it. A protein
may
indeed
undergo
surface-induced
conformational changes, often referred to as
'surface denaturations' [18-19]. In several
3
Corresponding author: Hugues Berry e-mail:
[email protected], tel.: (33)1 72 92 59 22
212
cases, these transitions lead to conformations
that have functions differing from the soluble
forms. They may for instance result in a loss
of activity for enzymes [20-21], or in the
modulation of the adhesion-promoting effect
of ECM proteins [22-23]. The properties of a
protein layer depend not only on the molecule
conformation but also on the spatial
distribution of the proteins on the surface [24]
that may prevail over substrate topology [25].
Maheshwari et al. have for instance shown
that, at a given surface density of adhesionpromoting
peptides,
cell
adhesion,
cytoskeleton organization and migration
speed tend to be favoured by a clustered
distribution of the peptides, with respect to
their dispersion over the surface [26]. Given
the tight correlation between protein layers
morphology and their functions, the accurate
understanding and prediction of their
morphological features appears to be needed
in various areas of biology. In that
perspective, simulation studies may be a
useful tool and several approaches have been
developed over the past decade.
Annexess
FIG.1. Depiction of the model: At each time step, proteins adsorb at
random position. They are then allowed to diffuse on the surface
unless they unfold or aggregate. Neighbour-required unfolding PI=0;
Neighbour-prevented unfolding PN=0; Neighbour-independent
unfolding PI=PN.
Surface assembly of sphere-shaped
particles are well described by diffusion
aggregation models derived from Witten and
Sanger's model [27] and adapted to random
sequential adsorption processes [28]. Briefly,
in this kind of models, once adsorbed,
particles diffuse randomly onto the surface
and two particles may aggregate when
meeting one another. Those models are able
to describe protein surface assemblies in
different bulk conditions provided the
adsorption does not induce a large
conformational change [29]. It is known
though that a number of protein aggregative
structures, such as fibrils, the assembly of
which may be surface-induced [30], imply
partial unfolding [31-34]. Van Tassel et al.
developed a sequential adsorption model that
includes a symmetrical post-adsorption
conformational change of the molecule [35].
This model fits fibronectin adsorption data in
terms of kinetic behaviour or surface coverage
but does not include surface diffusion.
However, their more recent data suggest a
post-adsorption clustering that might involve
surface diffusion [36-37].
Considering
the
experimental
knowledge of protein adsorption, a model of
protein layer formation should take both
surface diffusion and unfolding of the
adsorbed protein into account. Our focus here
is how conformational changes might
influence the protein surface clustering
process in a diffusion-aggregation model and
thus the morphology of the resulting surface
assemblies. We propose a model including
diffusion, aggregation and unfolding of
molecules that are randomly adsorbed onto a
surface. We study the effect of a simple
unidirectional unfolding from a disk to a rodshaped particle. Unfolding is first considered
not to depend on the vicinity of the protein.
We also studied the effects of protein-protein
interactions on the unfolding events. We
investigate the role of unfolding on the
morphology of the resulting clusters in both
the diffusion-limited (DL) and reactionlimited (RL) regimes.
II. MODEL AND SIMULATION
PROCEDURES
Bulk proteins are modelled as disk-shaped
particles of radius α that adsorb onto a square
lattice of size L x L at random positions.
Figure 1 shows a general scheme of the
model. At each time step, a position for the
centre of a particle is chosen at random and,
provided adsorption results in no overlap with
previously adsorbed proteins, the protein
adsorbs with a probability Pa per lattice site
per unit time. All the adsorbed proteins are
then allowed to diffuse according to an Ndiffsteps random walk of their particle centre. We
consider the diffusion of a cluster to be slow
enough to be negligible and let only
monomers diffuse so that the aggregation of a
protein results in its immobilization. If a
protein diffuses beyond the lattice limits, it is
removed. We include unfolding attempts of
the adsorbed protein between adsorption
events. If allowed to, the protein will then
spread into a rod-like particle. The unfolding
maximizes the contact between the protein
and the surface what increases the binding
energy. The unfolded specie is therefore often
considered irreversibly adsorbed [38-39].
Consistent with this view, we considered the
unfolded protein diffusion to be negligible. If
two proteins come in contact, i.e. when at
least two sites of theirs become nearest
neighbours, they have a probability Pag to
irreversibly aggregate.
To study the effect of protein
interactions on the conformational change, the
unfolding of an isolated molecule and that of
213
Annexes
a protein that is part of a cluster are
considered separately. Unfolding of an
isolated protein occurs symmetrically from
the centre of the molecule while unfolding of
a clustered protein starts from the contact site
with the neighbour. Both undergo excluded
surface effect and the direction of unfolding is
chosen at random among available ones.
These two events are referred to as isolated
and neighbour-induced unfolding with
respective probabilities PI and PN per protein
per unit time. The case PI=0 stands for
neighbour-required and PN=0 for neighbourprevented unfolding. Hence, PN=PI represents
a neighbour-independent unfolding.
Each simulation is performed on a square
lattice of linear dimension L=1500. The
folded proteins are modelled as disk-shaped
particles of radius α=3 and the unfolded one
as rods of length β=29 and thickness 1. Note
that β is taken to keep constant the number of
sites occupied by a single protein whether it is
unfolded or not. The fractal dimension of
deposition-diffusion-aggregation models is
known to depend on the relative values of the
deposition flux and the diffusion coefficient,
as well on the surface coverage [28; 40-41].
We found the ratio Pa/Ndiff=10-6 to allow the
generation of isolated clusters in the
diffusion-limited regime that are similar in
aspect and fractal dimension to the diffusionlimited aggregation (DLA) and reactionlimited aggregation (RLA) clusters when no
unfolding takes place. To investigate the
effect of the unfolding with respect to these
well known DLA and RLA structures, all the
simulations are therefore performed with
Pa=10-4 and Ndiff=100. The simulations are
completed for a final surface coverage θ much
below the percolation threshold, θ~0.013, that
is for 1000 proteins being present on the
lattice at the same time. We specifically study
the cases Pag=1 and Pag=10-3. For reading
convenience, we refer to these cases as DL
and RL regimes even when the unfolding
shifts the systems to other behaviour. The
fractal dimensions of the resulting clusters are
estimated using a box counting method [42].
214
FIG.2. Illustration of the cluster fractal dimension calculation using a
box counting method. The fractal dimension Df is deduced from the
slope of the log-log plot of the number of boxes versus the box
dimension. Two unfolding probabilities are shown here, P=1 (open
symbols) and P=10-7 (filled symbols), in the case of neighbourindependent unfolding, i.e. PN=PI. (a) diffusion-limited regime:
Pag=1; (b) reaction limited regime: Pag=10-3. For P=1 a two-scale
behaviour is observed, so that each part of the curve is fitted
independently and the two corresponding dimensions are indicated.
In both panels, the curves have been shifted for clarity
III. RESULTS AND DISCUSSION
We investigated the effect of the
unfolding of the monomer on the morphology
of surface protein clusters. We studied
separately the effect of the neighbourhood and
of the surface on the unfolding. This could be
done by dissociating the unfolding probability
in a surface-induced unfolding probability, PI,
when the protein is isolated, and a neighbourinduced probability, PN, when it is in contact
with another one. The case PI=0 represents
neighbour-required
unfolding,
PN=0
neighbour-prevented unfolding, and PN=PI
neighbour-independent unfolding. All the
simulations are performed for the same final
surface coverage and the folded and unfolded
monomers cover the same surface fraction.
Annexess
FIG.3. Cluster fractal dimension Df versus the unfolding probability P in the diffusion-limited regime where Pag=1. (a)
Neighbour-required unfolding: P=PN and PI=0; (b) Neighbour-independent unfolding: P=PN=PS and (c) Neighbourprevented unfolding: P=PI and PN=0. The inserts on top of each plot show examples of lattice configurations for each
parameter set
215
Annexes
This allows us to study the only effect of the
conformation change on the cluster
morphology.
The clusters exhibit auto similarity properties
as shown by the power-law behaviour of the
number of square boxes needed to cover a
cluster vs. the box linear dimension plotted on
fig.2. This allows us to compare their
morphology in terms of fractal dimension,
over the whole range of unfolding
probabilities studied here. At high unfolding
probability, in both neighbour-independent
and neighbour-prevented unfolding, a twoscale behaviour is observed, the first part of
the curve reflecting the fractal dimension of
small-sized cluster and the second, at larger
length scales, reflecting a uniform distribution
of these small clusters (fig.2). In the
following, only the short-length scale fractal
dimension, reflecting the cluster morphology,
will be considered, when such behaviour is
observed.
Figure 3 shows the dependence of the
cluster aspect and fractal dimension on the
unfolding probability P in the diffusionlimited regime (i.e. Pag=1). In this regime,
setting both unfolding probabilities to zero
generates clusters with fractal dimension of
1.652±0.039 (not shown), i.e. classical DLA
on two-dimensional square lattice [27]. When
neighbour-required unfolding (fig.3a) is
included, the clusters exhibit a ramified
morphology that is close to DLA clusters at
low P, but rapidly displays less compact
structures, containing void spaces. Consistent
with their aspect, the cluster fractal dimension
decreases with increasing P to reach the
average value 1.431±0.025 at P=10-5, and no
further change in the dimension is observed at
higher probability. Even at low unfolding
probability (1.640±0.011 at PN=10-7), the
fractal dimension is significantly lower than
the dimension found for the universal
diffusive aggregation model. Unfolding
causes a large cluster tip expansion, due to the
rod shape of unfolded proteins, and this
allows the cluster to be reached from farther
by incoming proteins. This causes a faster
growth, which, combined with the formation
of closed structures that prevents incoming
216
proteins from diffusing inside the clusters,
may explain the conformational changeinduced
compactness
decrease
and
corresponding low dimension. Cluster fractal
dimensions lower than DLA cluster
dimension may also appear with spherical
objects when cluster diffusion [43] or
attractive interactions [44] are taken into
account.
The aggregative behaviour of diffusing rodshaped particles have been studied in two [4546] and three dimensions [47]. These studies
showed that the higher the length of a particle,
the higher the cluster fractal dimension. In the
two dimensional model, the orientation of the
rod shape particle are all the same and remain
fixed during the diffusion-aggregation
process. Therefore, the increase of the fractal
dimension simply results form the obligatory
parallel packing of the rods. In the three
dimensional case though, the rods are initially
randomly oriented and then diffuse in a
direction depending on their aspect ratio. In
this case, the increase of the fractal dimension
is thought to arise from the possible
aggregation of rods at distances lower than
their larger gyration radius [47]. The apparent
discrepancy of these results with ours might
originate from the aggregative behaviour of
anisotropic objects that may vary with the
Euclidean dimension. Our lower fractal
dimension results from the monomer shape
together with the fact that the unfolding
produces closed structures, or loops,
preventing incoming proteins from diffusing
inside the clusters. If a similar loop is formed
in three dimensions, incoming rods may still
diffuse and reach the inner part of this kind of
void. Either by ‘capping the void’ (the axis of
the incoming rod being in the plane of the
void) or crossing through it, this aggregation
will increase the cluster fractal dimension.
Such events which are not allowed in our
model may in part explain why the fractal
dimension decreases in 2D rod clusters and
increases in 3D.
In the case of neighbour-prevented unfolding,
the clusters exhibit the typical morphology of
DLA clusters at low P and little change, but a
size decrease, is observed with increasing P.
Annexess
FIG.4. Cluster fractal dimension Df versus the unfolding probability P in the reaction-limited regime where Pag=10-3. (a)
Neighbour-required unfolding: P=PN and PI=0; (b) Neighbour-independent unfolding: P=PN=PI and (c) Neighbourprevented unfolding: P=PI and PN=0. The inserts on top of each plot show examples of lattice configurations for each
parameter set.
217
Annexes
The fractal dimension shows no change
either until P=10-4 (fig. 3c). Above this
value, it rapidly decreases to reach a
plateau value of about 1.22. At high P
values, the clusters actually mostly consist
in monomers and dimers and when P is 1,
the network tends toward random
sequential adsorption (RSA) of rod-like
particles since almost no diffusion takes
places and – except for steric
considerations – all the proteins are
unfolded.
When the unfolding does not depend on
the monomer surrounding, i.e. for
neighbour-independent unfolding, the
fractal dimension shows a first decrease
with increasing unfolding probability P and
reaches a plateau value of ~1.43 between
10-5 and 10-3 (fig.3b). This decrease is very
similar to that observed for neighbourrequired unfolding (i.e. PI=0, fig.3a). The
cluster morphologies are very similar as
well. It seems therefore that PI does not
play a significant role when little unfolding
occurs. A second decrease is observed
above 10-3 until a final value of ~1.18,
where the lattice configuration is close to
random sequential adsorption. Cluster
morphology crosses over from neighbourrequired unfolding, at low P value, to
neighbour-prevented unfolding at high P
value. The transition occurs for unfolding
probabilities between 10-4 and 10-2, where
the fractal dimensions is ~1.43 in the three
cases (neighbour-required, -prevented and
-independent unfolding). The clusters
present
however
quite
different
morphologies. For neighbour-independent
unfolding, with P=10-3 and 10-2, the
dimension reflects the dimension of small
size clusters among which a few present an
elongated, low-ramified structure. This
may be understood in terms of steric
effects. If two clusters grow close one from
another, the direction of unfolding for a
protein joining one of the cluster will be
biased by the closest cluster. The
neighbour-prevented unfolding probability
decreases the distance between two
clusters origins and this steric hindrance
218
has a high probability to occur. In
neighbour-required unfolding, the clusters
are far enough one from another not to feel
their neighbour (fig.3a) but close clusters,
that do not bridge, do not interpenetrate
much. This might thus suggest that the
same steric effect is experienced on the
cluster perimeter. Incidentally, one may
think this simply occurs when the distance
between two clusters becomes of the order
of 2 fold the length of the unfolded protein.
In the Reaction-limited regime (i.e.
Pag=1; fig.4), clusters morphologies that
are very different from those observed in
the diffusion-limited regime (fig.3) are
generated.
The
neighbour-required
unfolding produces dense clusters at P=107
, with continuous compactness decrease
with increasing P, while the neighbourprevented unfolding leads to dense clusters
close to RLA ones at low P, with size
decrease until P=10-4, beyond which the
lattice resembles RSA configurations. The
neighbour-independent unfolding clusters
resemble neighbour-required unfolding
ones at low P and neighbour-prevented
unfolding ones a high P, with a specific
intermediate morphology at P=10-5 and 104
. The fractal dimension exhibits the same
qualitative behaviour with respect to
unfolding probability than in the DL
regime, i.e. an early slight decrease with PN
(fig.4a), and a later sharp decrease with PI
(fig.4c). When both unfoldings are equally
applied, the fractal dimension undergoes a
two-step decrease with P, reflecting
separate PN and PI influences (fig.4b). As
expected, the cluster dimension is overall
higher than in DL regime, except at high
surface-induced unfolding value, where
both regimes converge towards random
sequential adsorption. Apart from cluster
compacity, the RL regime also differs from
the DL one regarding the crossover
between neighbour- and surface-induced
unfoldings, which occurs faster and at
lower unfolding probability. By definition,
in the RL regime, the monomers are not
entirely sticky so that the proteins may
jump back after a contact. Folded proteins
Annexess
are therefore statistically more often found
isolated than interacting with another
protein, at least at low surface coverage.
No wonder then, if, in this regime, the
crossover to isolated unfolding is found at
lower unfolding probability value. In terms
of protein adsorption, slowly aggregative
proteins, which experience repulsive
interactions, would tend rapidly towards
random adsorption with increasing protein
surface
affinity.
FIG 5. Unfolded protein fraction per cluster versus unfolding
probability P in the reaction- (continuous lines) and diffusion(dotted lines) limited regimes for neighbour-prevented, required, and –independent unfoldings. The symbols are the
same as in figures 3 and 4. All curves exhibit the same shape
except in the neighbour-prevented regime (P=PI; PN=0; filled
diamonds) where the unfolded fraction increases more slowly
with P in both regimes.
The changes in fractal dimension
observed when increasing the unfolding
probability appear to be only partly
correlated to the average proportion of
unfolded protein per cluster as shown on
fig.5. For both RL and DL regimes, in the
neighbour-required unfolding case, the
unfolded protein fraction slightly increases
from 10-7 to 10-5 above which it reaches its
maximum value. For neighbour-prevented
unfolding, it remains below 0.04 until 10-4
and 10-5 in RL and DL respectively, and
then
constantly
increases.
These
behaviours reflect the changes observed in
cluster fractal dimension for both regimes
(fig.3 & 4 a, c), the higher the unfolded
fraction the lower the dimension. In the
neighbour-prevented case, the unfolded
fraction changes reflects the observed
differences between the RL and DL regime
as well. Yet, the correlation is not obvious
for neighbour-independent unfolding. In
this case, contrary to what is observed for
the fractal dimension, the unfolded fraction
does not exhibit an intermediate behaviour
between neighbour-prevented and required unfoldings but rather follows
neighbour-required unfolding behaviour.
The fact that the same unfolded fraction
leads to a lower cluster fractal dimension
when isolated unfolding is allowed
suggests that the morphology of the
resulting clusters depends not only on the
unfolded fraction but also on whether these
unfolding events occurs before or after the
aggregation, i.e. whether they are isolated
or clustered unfoldings.
In our model, we considered
the diffusion of unfolded proteins to be
negligible, hence, the higher the unfolding
probability the shorter the diffusion length.
Since cluster diffusion is negligible as
well, unfolding only alters diffusion for
isolated proteins. More than ending their
diffusion, it also creates a new obstacle on
the lattice for other diffusing proteins and
subsequently increases the rate of
aggregative encounters. At low unfolding
probability, most of the proteins may
diffuse and aggregate to a small number of
clusters and unfolding of clustered proteins
is favoured. The higher the unfolding
probability, the higher the number of
clusters, so that proteins mostly form
dimers and the system finally tends to a
random sequential adsorption of rod
particles, where almost no diffusion takes
place. Between the two behaviours, the
unfolding of isolated monomers is high
enough to increase the cluster number and
thus favour neighbour-induced unfolding,
and low enough to allow diffusion and
subsequent aggregation. It may therefore
be supposed that the transition zone would
be found at lower values the lower the
diffusion coefficient of folded monomers.
IV. RELEVANCE TO PROTEIN
AGGREGATION
We developed a depositiondiffusion-aggregation model that accounts
for the adsorption-induced conformational
219
Annexes
change, which is a generic feature of
proteins at interfaces. Though widely
described in experimental studies, this
unfolding event has however seldom been
considered in theoretical ones [35,38]. We
aim at investigating conformational
changes related to biomacromolecules
surface self-assembly. On this purpose, we
studied the effect of a very simple disk-torod transition of proteins adsorbing and
diffusing
on
a
lattice.
FIG.6. Immunofluorescent staining of a fibronectin layer
spontaneously formed upon adsorption onto (a),(b)
hydroxyapatite or (c) cell culture glass. The cluster fractal
dimension, estimated from a box counting method, is indicated
at the bottom left of each picture
Proteins undergo various
structural changes upon adsorption and
using a two-state all-or-nothing unfolding
process might seem a little simplistic.
While, to be more realistic, our model
could certainly benefit from some
enhancement regarding this point, this
simple transition may approximate some
proteins behaviours when studying the
general effects of an unfolding event.
Indeed, in several cases, mostly for high
molecular weight proteins, the threedimensional structure of adsorbed proteins
may be described as two overall states,
compact or extended. This is for instance
the case for fibronectin [22,63-65].
Fibronectin is a high molecular weight
protein of the extracellular matrix of
connective tissues in which it is found
under a fibrilar form. The underlying
assembly mechanisms are still under
investigation but it has been shown that
fibronectin fibrillogenesis may be surfaceinduced [63, 66-67]. Figure 6 presents a
staining of human fibronectin adsorbed
onto a bone substitute material,
hydroxyapatite (HA). Adsorption onto HA
spontaneously
induces
fibronectin
fibrillogenesis
and
produces
large
connected fibrilar structures the fractal
220
dimension of which ranges over 1.5-1.6
(fig 6.a,b). Moreover, unlike classical DLA
clusters, fibronectin clusters do not present
an open ramified tree-like structure but
rather contain closed-loop structures inside
the aggregates. All these features are
captured by our model, in the DL regime
for low unfolding probability (fig3.a,b
P=10-6) or in the RL regime at higher
unfolding probability (fig4.a, P>10-5; 4.b,
P=10-5), both when clustered unfolding is
allowed.
The conformation change of a
protein strongly depends on the surface it
is adsorbed on [22, 48-50] and our model
allows the investigation of several
protein/substrate couples. For instance,
fibronectin adsorption onto glass leads to
the formation of small compact aggregates
(fig.6.c), rather than to the fibrilar clusters
observed on hydroxyapatite. These
structures are similar to RLA aggregates
and our model indicates that the difference
with the adsorption structures observed on
HA might reflect a difference in the protein
unfolding on the two surfaces.
In addition to the surface/protein
interaction, it is inferred from many
experiments that protein interactions
themselves play a major role in the
conformational change, by either favouring
or preventing it. The latter may be
intuitively understood in terms of surface
crowding [51-53]. This crowding may
however have the opposite effect as
exemplified by a number of data in the
literature. For instance, adsorption-induced
denaturation of lysozyme increases with
increasing surface coverage, whatever the
kind of surface [53]. Moreover, in the
assembly of some specific protein
structures, such as amyloid fibrils,
conformational
changes
occur
concomitantly with aggregation [55-56].
The ability of a native protein to form such
structures when seeded by preformed
fibrils [57-58] suggests again that unfolded
conformations may be stabilized by
interactions with their neighbours. These
aggregation mechanisms could actually be
Annexess
appropriate to many other proteins, since
the hypothesis that most proteins would
have an amyloidogenic potential has
emerged [59-60]. The neighbour-required
unfolding might ultimately be relevant to
oligomerization mechanism such as
domain swapping [61-62]. Taken together
these results strongly suggest that
neighbour-required
unfolding
might
govern several protein aggregation
processes.
Unfolding has significant
impact on diffusive aggregation cluster
morphology. Contrary to general diffusive
aggregation models, rather leading to open
branched structures, it allows the formation
of looped structures, a feature shared by
some protein fibrilar assemblies [19,6667]. Despite and because of its simplicity,
our model is relevant to general protein
adsorption features as well as specific
protein-protein interactions that may be
inferred from experimental observations.
We aim at improving the algorithm that is
currently quite CPU time-consuming to
investigate
some
singular
protein
aggregative behaviour. We study here the
case were aggregation induces unfolding;
the events might occur the other way round
and conformational changes may surely
alter the sticking and unfolding-inductive
properties
of
a
protein.
Further
investigation of the model will include
different sticking properties depending on
homotypic or heterotypic contacts between
folded and unfolded monomers. We
believe this might describe some
experimental features such as the
simultaneous growth of amorphous
aggregates and fibrilar structures that is
observed for some proteins at interfaces.
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Colloid Interface Sci
223
Annexes
224
Annexes
Annexe 3 : Code informatique
225
Annexes
Fichier source principal
////////Adsorption : Diffusion Agrégation Changement de conformation///////
///////////// Init Janvier 2004 / MàJ Juillet 2005/////////////////////////
///////////////////////////////////////////////////////////////////////////
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#include <stdio.h>
#include <time.h>
#include "math.h"
#include <fstream>
using namespace std;
typedef vector<Site> vect_site;
typedef vector<double> vect_double;
typedef vector<Protein> vect_protein;
//variables globales
//taille=L+1
Position reseau[1501][1501];
vector<Protein> vect_prot_agregees;
vector<Protein> vect_prot_diffusives;
vector<Protein> vect_prot_alpha;
vector<Protein> vect_prot_beta;
///////////////////////////////////////////////////////////////////////////
///////////////////////////////////////////////////////////////////////////
int main()
{
int nb_prot=0;
int num_ads=0;
int nb_beta=0;
vect_double vect_densite_diffusives;
vector<vect_double> vect_densite_diff_run;
vect_double vect_densite_agregees;
vector<vect_double> vect_densite_agreg_run;
vect_double vect_densite_alpha;
vector<vect_double> vect_densite_alpha_run;
vect_double vect_densite_beta;
vector<vect_double> vect_densite_beta_run;
vector<int> vect_tempsterm_run;
//////paramètres ajustables//////////////////
int alpha=3;
double proba_ads=0.0001;
double proba_etal=0;
double proba_etal1=0.01; //depli spontané
226
Annexes
double proba_depli_induit_alpha=0; //depli induit par compacte
double proba_depli_induit_beta=1; //depli induit par depliee
double proba_agreg=0.001;
int Lo=500;
int temps;
int Nrun=1;
int Ndiff=100;
int Nmax=1000;
int nombre_de_prot;
int L=alpha*Lo;
ofstream file1("-4_-2_0_1_-3_N100_N1000_densite.txt");
file1<<"L="<<L<<"; proba ads="<<proba_ads<<"; nb runs="<<Nrun<<"; proba
depli spont="<<proba_etal1<<"; proba depli induit par
alpha="<<proba_depli_induit_alpha<<"; proba depli induit par
beta="<<proba_depli_induit_beta<<"Ndiff="<<Ndiff<<"\n";
file1<<"temps"<<"\t"<<"d diff"<<"\t"<<"d agreg"<<"\t"<<"d alpha"<<"d
beta"<<"\n";
ofstream file2("-4_-2_0_1_-3_N100_N1000_position.txt");
file2<<"L="<<L<<"; proba ads="<<proba_ads<<endl;
file2<<"Ndiff="<<Ndiff<<"\n";
//file2<<"temps="<<temps<<"\n";
//ofstream file3("_1_1_1_rayongir.txt");
//file3<<"taille amas"<<"\t"<<"rayon giration"<<endl;
//ofstream file4("C:/reseau_final.txt");
srand((unsigned)time(NULL));
/////déclarations fonctions//////////////
vector<Site> calcul_positions(int,int,int);
Protein diffusion(Protein,int,int,int);
bool agregation(Protein);
int identite_voisine(Protein);
//int identite_voisine_beta(Protein);
vector<int> directions_depliement(Protein,int);
vector<Site> depliement(Protein,int,vector<int>,int);
Site site_contact(Protein);
vector<int> directions_depli_induit(Protein, Site,int);
vector<Site> depli_induit(Protein,Site,int,vector<int>,int);
int nb_alpha;
nb_alpha=calcul_positions(4,4,alpha).size();
int minimum(vector<int>);
int irun;
for (irun=0;irun<Nrun;irun++)
{
int temps=0; //initialiser compteur temps normalise
///// tableau positions à zero//////////
int xtab;
int ytab;
Position init(false,0,false);
for (xtab=0;xtab<=L;xtab++)
{
for (ytab=0;ytab<=L;ytab++)
227
Annexes
{
reseau[xtab][ytab]=init;
}
}
////////////////////////////ADSORPTION/////////////////////////////////////
double test_ads;
int itemps=0;
//for (itemps=0;itemps<((temps*L*L));itemps++)
while (nb_prot<Nmax)
{
itemps++;
if ((itemps%(L*L))==0)
temps++;
test_ads=((double)rand()/(double)(RAND_MAX+1));
if (test_ads<proba_ads) //si adsorption
{
int aleatx;
//choix aléatoire site sur réseau
int aleaty;
aleatx=(nb_alpha)+(int)((L-2*(nb_alpha))*((double)rand()/(double)(RAND_MAX+1)));
aleaty=(nb_alpha)+(int)((L-2*(nb_alpha))*((double)rand()/(double)(RAND_MAX+1)));
Site site_ads(aleatx,aleaty);
/***************test site choisi libre**************************/
bool site_libre=true;
if(nb_prot==0)
{ ;}
else{
int x; int y;
for (x=aleatx-alpha;x<=aleatx+alpha;x++)
{
for (y=aleaty-alpha;y<=aleaty+alpha;y++)
{
Site site(x,y);
if
((site,site_ads).distance(site,site_ads)<=alpha)
{
if
(reseau[x][y].retourne_occupation()==true)
{
site_libre=false;
break;
}
}
}
}
} //fin boucle si pas 1ere => test site_libre
if(site_libre==true)
//construction nouvelle proteine adsorbée
{
nb_prot++;
num_ads++;
vector<Site> positions_prot(nb_alpha);
positions_prot=calcul_positions(aleatx,aleaty,alpha);
228
Annexes
Protein
prot(site_ads.retourne_x(),site_ads.retourne_y(),alpha,false,num_ads,
positions_prot);
//mise a jour reseau
int i;
int size=positions_prot.size();
for (i=0;i<size;i++)
{
int a=positions_prot[i].retourne_x();
int b=positions_prot[i].retourne_y();
Position position(true, num_ads, false);
reseau[a][b]=position;
}
//verif si agrégation avant diffusion
if (agregation(prot)==true)
{
double
test_agreg=((double)rand()/(RAND_MAX+1));
if (test_agreg<proba_agreg)
{
Protein
prot2(site_ads.retourne_x(),site_ads.retourne_y(),alpha,true,num_ads,positi
ons_prot);
vect_prot_agregees.push_back(prot2);
int
id_voisine=identite_voisine(prot2);
int i;
for
(i=0;i<vect_prot_alpha.size();i++)
{
int
xpv=vect_prot_alpha[i].retourne_xc();
int
ypv=vect_prot_alpha[i].retourne_yc();
double
Rpv=vect_prot_alpha[i].retourne_rayon();
vector<Site>
positions_voisine=vect_prot_alpha[i].retourne_positions();
if
((vect_prot_alpha[i].retourne_identite()==id_voisine)&&(vect_prot_alpha[i].
retourne_statut_agreg()==false))
{
Protein
prot_voisine(xpv,ypv,Rpv,true,id_voisine,positions_voisine);
vect_prot_alpha[i]=prot_voisine;
vect_prot_agregees.push_back(prot_voisine);
int m;
// prot depliee elim de vecteur diffusives
for
(m=0;m<vect_prot_diffusives.size();m++)
{
if
((vect_prot_diffusives[m].retourne_xc()==xpv)&&(vect_prot_diffusives[m].ret
ourne_yc()==ypv))
vect_prot_diffusives.erase(vect_prot_diffusives.begin()+m);
229
Annexes
} // aussi
eliminer la voisine des diffusives...
}
}
vect_prot_alpha.push_back(prot2);
}
else
{
vect_prot_diffusives.push_back(prot);
vect_prot_alpha.push_back(prot);
}
}
else
{
vect_prot_diffusives.push_back(prot);
vect_prot_alpha.push_back(prot);
}
}
}
//fin test ads
//////////////////////////////DIFFUSION////////////////////////////////////
int idiff;
for(idiff=0;idiff<Ndiff;idiff++) //nb pas de MA
{
int ialpha;
int Nalpha=vect_prot_diffusives.size();
for (ialpha=0;ialpha<Nalpha;ialpha++) // test diffusion pour chaque
protéine alpha.
{
Protein prot_diff;
prot_diff=diffusion(vect_prot_diffusives[ialpha], nb_alpha,alpha, L);
int xprot_diff=prot_diff.retourne_xc();
int yprot_diff=prot_diff.retourne_yc();
//mettre a jour positions du reseau
int id_alpha=vect_prot_diffusives[ialpha].retourne_identite();
//liberer positions précédentes
int i;
for (i=0;i<nb_alpha;i++)
{
int x;
x=vect_prot_diffusives[ialpha].retourne_positions()[i].retourne_x();
int y;
y=vect_prot_diffusives[ialpha].retourne_positions()[i].retourne_y();
reseau[x][y]=init;
}
// eliminer proteine si sortie du reseau
int index;
int m;
for (m=0;m<vect_prot_alpha.size();m++)
{
int x=vect_prot_diffusives[ialpha].retourne_xc();
230
Annexes
int y=vect_prot_diffusives[ialpha].retourne_yc();
if
((vect_prot_alpha[m].retourne_xc()==x)&&(vect_prot_alpha[m].retourne_yc()==
y))
index=m;
}
if ((xprot_diff>(L((nb_alpha))))||(xprot_diff<((nb_alpha)))||(yprot_diff<((nb_alpha)))||(ypro
t_diff>(L-(nb_alpha))))
{
vect_prot_alpha.erase(vect_prot_alpha.begin()+index);
vect_prot_diffusives.erase(vect_prot_diffusives.begin()+ialpha);
//elim prot
nb_prot--;
ialpha--; //decalage index
Nalpha--; //mise a jour taille vecteur pour boucle diff
}
else
{
//ou occuper nouvelles positions
for (i=0;i<nb_alpha;i++)
{
int x=prot_diff.retourne_positions()[i].retourne_x();
int y=prot_diff.retourne_positions()[i].retourne_y();
Position pos2 (true,id_alpha, false);
reseau[x][y]=pos2;
}
//verif si agrégation apres diffusion
if (agregation(prot_diff)==true)
{
double
test_agreg=((double)rand()/(RAND_MAX+1));
if (test_agreg<proba_agreg)
{
//bool agreg=true;
Protein
prot2(xprot_diff,yprot_diff,alpha,true,id_alpha,prot_diff.retourne_position
s());
vect_prot_agregees.push_back(prot2);
int
id_voisine=identite_voisine(prot2);
int i;
//bool ichange_index=false;
/* :::::eliminer prot et sa voisine de diff et MàJ ds alpha :::::::::::::*/
for
(i=0;i<vect_prot_alpha.size();i++)
{
int
xpv=vect_prot_alpha[i].retourne_xc();
int
ypv=vect_prot_alpha[i].retourne_yc();
double
Rpv=vect_prot_alpha[i].retourne_rayon();
231
Annexes
vector<Site>
if
((vect_prot_alpha[i].retourne_identite()==id_voisine)&&(vect_prot_alpha[i].
retourne_statut_agreg()==false))
{
Protein
prot_voisine(xpv,ypv,Rpv,true,id_voisine,positions_voisine);
vect_prot_alpha[i]=prot_voisine;
vect_prot_agregees.push_back(prot_voisine);
int m;
for
(m=0;m<vect_prot_diffusives.size();m++)
{
if
((vect_prot_diffusives[m].retourne_xc()==xpv)&&(vect_prot_diffusives[m].ret
ourne_yc()==ypv))
{
Nalpha--;
if
(m<ialpha)
{
ialpha--;
}
}
}
}
}
/**************MàJ prot diff dans alpha et elim de diff*******************/
vect_prot_alpha[index]=prot2;
vect_prot_diffusives.erase(vect_prot_diffusives.begin()+(ialpha-1));
vect_prot_diffusives.erase(vect_prot_diffusives.begin()+ialpha);
ialpha--;
Nalpha--;
}
else
{
vect_prot_diffusives[ialpha]=prot_diff;
vect_prot_alpha[index]=prot_diff;
}
}
else
{
vect_prot_diffusives[ialpha]=prot_diff;
vect_prot_alpha[index]=prot_diff;
}
}
} //fin diffusion sur ialpha
} //fin temps de diffusion idiff
////////////////////////////DEPLIEMENT/////////////////////////////////////
int ialpha;
232
Annexes
int Nalpha=vect_prot_alpha.size();
for (ialpha=0;ialpha<Nalpha;ialpha++) // test etalement pour chaque
protéine alpha.
{
int xalpha=vect_prot_alpha[ialpha].retourne_xc();
int yalpha=vect_prot_alpha[ialpha].retourne_yc();
int id_alpha=vect_prot_alpha[ialpha].retourne_identite();
Site centre_alpha(xalpha,yalpha);
double test_etal=((double)rand()/(double)(RAND_MAX+1));
vector<Site>
positions_alpha=vect_prot_alpha[ialpha].retourne_positions();
//////////////////////////DEPLIEMENT INDUIT////////////////////////////////
if (agregation(vect_prot_alpha[ialpha])==true)
{
proba_etal=proba_depli_induit_alpha;
int xq; int yq;
for (xq=xalpha-alpha-1;xq<=xalpha+alpha+1;xq++)
{
for (yq=yalpha-alpha;yq<=yalpha+alpha+1;yq++)
{
Site siteq(xq,yq);
if
(((centre_alpha,siteq).distance(centre_alpha,siteq)>alpha)&&((centre_alpha,
siteq).distance(centre_alpha,siteq)<=(alpha+1)))
{
if
((reseau[xq][yq].retourne_occupation()==true)&&(reseau[xq][yq].retourne_dep
liement()==true))
{
proba_etal=proba_depli_induit_beta;
break;
}
}
}
}
if (test_etal<proba_etal)
{
Site site_agreg;
site_agreg=site_contact(vect_prot_alpha[ialpha]);
vector<int> v_directions;
v_directions=directions_depli_induit(vect_prot_alpha[ialpha],site_agr
eg, nb_alpha);
if (v_directions.size()!=0)
{
//liberer positions reseau de alpha
int k;
for (k=0; k<nb_alpha;k++)
{
int xk; int yk;
xk=vect_prot_alpha[ialpha].retourne_positions()[k].retourne_x();
yk=vect_prot_alpha[ialpha].retourne_positions()[k].retourne_y();
Position r(false, 0, false);
reseau[xk][yk]=r;
}
233
Annexes
//deplier alpha
nb_beta++;
vector<Site> positions_prot;
positions_prot=depli_induit(vect_prot_alpha[ialpha],
site_agreg, nb_alpha,v_directions, id_alpha);
Protein p(xalpha,yalpha,(positions_prot.size()1)/2,true,id_alpha,positions_prot);
vect_prot_beta.push_back(p); //prot etalée dans vecteur
beta
vect_prot_agregees.push_back(p);
int m;
// prot agrégée elim de
vecteur diffusives
for (m=0;m<vect_prot_diffusives.size();m++)
{
if
((vect_prot_diffusives[m].retourne_xc()==xalpha)&&(vect_prot_diffusives[m].
retourne_yc()==yalpha))
}
vect_prot_alpha.erase(vect_prot_alpha.begin()+ialpha);
//prot depliee elim de vecteur alpha
ialpha--;
Nalpha--;
} //fin depliement si place
} // fin depliement si proba ok
//
} // fin depliement si non agregee
} // fin depliement induit par contact
/////////////////////////DEPLIEMENT SPONTANE///////////////////////////////
else
{
proba_etal=proba_etal1;
if (test_etal<proba_etal)
{
v_directions=directions_depliement(vect_prot_alpha[ialpha],nb_alpha);
if (v_directions.size()!=0)
{
//liberer positions reseau de alpha
int k;
for (k=0; k<nb_alpha;k++)
{
int xk; int yk;
xk=vect_prot_alpha[ialpha].retourne_positions()[k].retourne_x();
yk=vect_prot_alpha[ialpha].retourne_positions()[k].retourne_y();
Position r(false, 0, false);
reseau[xk][yk]=r;
}
//deplier alpha
nb_beta++;
vector<Site> positions_prot;
234
Annexes
positions_prot=depliement(vect_prot_alpha[ialpha],
nb_alpha,v_directions, id_alpha);
Protein p(xalpha,yalpha,(positions_prot.size()1)/2,false,id_alpha,positions_prot);
int m;
// prot depliee elim de vecteur diffusives
for (m=0;m<vect_prot_diffusives.size();m++)
{
if
((vect_prot_diffusives[m].retourne_xc()==xalpha)&&(vect_prot_diffusives[m].
retourne_yc()==yalpha))
}
vect_prot_alpha.erase(vect_prot_alpha.begin()+ialpha);
//prot depliee elim de vecteur alpha
Nalpha--;
ialpha--;
if (agregation(p)==true)
{
double test_agreg=((double)rand()/(RAND_MAX+1));
if (test_agreg<proba_agreg_beta)
{
Protein p2(xalpha,yalpha,(positions_prot.size()1)/2,true, id_alpha,positions_prot);
vect_prot_agregees.push_back(p2);
vect_prot_beta.push_back(p2);
int id_voisine=identite_voisine(p2);
int i;
for (i=0;i<vect_prot_alpha.size();i++)
{
if
((vect_prot_alpha[i].retourne_statut_agreg()==false)&&(vect_prot_alpha[i].r
etourne_identite()==id_voisine))
{
int
x_voisine=vect_prot_alpha[i].retourne_xc();
int
y_voisine=vect_prot_alpha[i].retourne_yc();
double
R_voisine=vect_prot_alpha[i].retourne_rayon();
vector<Site>
Protein
p_voisine(x_voisine,y_voisine,R_voisine,true,id_voisine,positions_voisine);
vect_prot_alpha[i]=p_voisine;
int j;
for
(j=0;j<vect_prot_diffusives.size();j++)
{
if
(vect_prot_diffusives[j].retourne_identite()==id_voisine)
{
vect_prot_diffusives.erase(vect_prot_diffusives.begin()+j);
}
}
}
}
}
else
235
Annexes
{
vect_prot_beta.push_back(p); //prot etalée dans
vecteur beta
}
}//fin test agreg si contact
else
{
vect_prot_beta.push_back(p); //prot etalée dans
vecteur beta
}
}
}
}
}
//fin depliement si place
// fin depliement si proba ok
// fin depliement spontané
//fin boucle depliement for Nalpha
///////////////////ecriture positions///////////////////////
if ((itemps==(temps*L*L)-1)&&(irun==0))
{
int x; int y;
for (x=0;x<=L;x++)
{
for (y=0;y<=L;y++)
{
if (reseau[x][y].retourne_occupation()==true)
{ file2<<x<<"\t"<<y<<"\n"; }
}
}
}
//////////////////////ecriture densités/////////////////////////////////
if (itemps%(L*L)==0)
{
vect_densite_diffusives.push_back((double)(vect_prot_diffusives.size())*nb_
alpha/(pow((double)(L-(nb_alpha-1)),2)));
vect_densite_agregees.push_back((double)(vect_prot_agregees.size())*nb_alph
a/(pow((double)(L-((nb_alpha-1))),2)));
vect_densite_alpha.push_back((double)(vect_prot_alpha.size())*nb_alpha/(pow
((double)(L-(nb_alpha-1)),2)));
vect_densite_beta.push_back((double)(vect_prot_beta.size())*nb_alpha/(pow((
double)(L-((nb_alpha-1))),2)));
}
} //fin boucle tant que nb_prot<max(sur itemps)
///////////////////////////////////////////////////////////////////////////
vect_densite_diffusives.push_back((double)(vect_prot_diffusives.size())*nb_
alpha/(pow((double)(L-(nb_alpha-1)),2)));
vect_densite_agregees.push_back((double)(vect_prot_agregees.size())*nb_alph
a/(pow((double)(L-((nb_alpha-1))),2)));
vect_densite_alpha.push_back((double)(vect_prot_alpha.size())*nb_alpha/(pow
((double)(L-(nb_alpha-1)),2)));
vect_densite_beta.push_back((double)(vect_prot_beta.size())*nb_alpha/(pow((
double)(L-((nb_alpha-1))),2)));
//mettre vecteur contenant les densités de chaque itemps dans vecteur avant
nouveau run
236
Annexes
vect_densite_diff_run.push_back(vect_densite_diffusives);
vect_densite_agreg_run.push_back(vect_densite_agregees);
vect_densite_alpha_run.push_back(vect_densite_alpha);
vect_densite_beta_run.push_back(vect_densite_beta);
vect_tempsterm_run.push_back(itemps);
} //fin boucle echantillonnage irun
///////////////////////////////////////////////////////////////////////////
//moyenner les densités de chaq run/tot runs à chq itemps
int imoy;
for (imoy=0;imoy<temps+1;imoy++)
{
int iech;
double densite_moy_diff=0;
double densite_moy_agreg=0;
double densite_moy_alpha=0;
double densite_moy_beta=0;
for (iech=0;iech<Nrun;iech++)
{
densite_moy_alpha=densite_moy_alpha+vect_densite_alpha_run[iech][imoy
];
densite_moy_diff=densite_moy_diff+vect_densite_diff_run[iech][imoy];
densite_moy_agreg=densite_moy_agreg+vect_densite_agreg_run[iech][imoy
];
densite_moy_beta=densite_moy_beta+vect_densite_beta_run[iech][imoy];
}
densite_moy_diff=densite_moy_diff/Nrun;
densite_moy_agreg=densite_moy_agreg/Nrun;
densite_moy_alpha=densite_moy_alpha/Nrun;
densite_moy_beta=densite_moy_beta/Nrun;
if (imoy<temps)
{file1<<imoy+1<<"\t"<<densite_moy_diff<<"\t"<<densite_moy_agreg<<"\t"
<<densite_moy_alpha<<"\t"<<densite_moy_beta<<"\n";}
else
{file1<<vect_tempsterm_run[iech]/(L*L)<<"\t"<<densite_moy_diff<<"\t"<
<densite_moy_agreg<<"\t"<<densite_moy_alpha<<"\t"<<densite_moy_beta<<"\n";}
} //fin calcul/ecriture densités moyennes
return 0;
} //fin main
///////////////////////////////////////////////////////////////////////////
///////////////////////////////////////////////////////////////////////////
///////////
////////////////
///////////
FONCTIONS
////////////////
///////////
////////////////
///////////////////////////////////////////////////////////////////////////
////////////////////////
FONCTIONS
/////////////////////
/////////////////////// v_positions de protein/////////////////////////////
vector<Site> calcul_positions(int x,int y, int taille)
{
vector<Site> v_positions;
v_positions.erase(v_positions.begin(),v_positions.end());//vider
v_positions;
Site site(x,y);
237
Annexes
int i;
int j;
for (i=x-taille;i<=x+taille;i++)
{
for (j=y-taille;j<=y+taille;j++)
{
Site pos(i,j);
if ((site,pos).distance(site,pos)<=taille)
v_positions.push_back(pos);
}
}
return v_positions;
}
///////////////////////////DIFFUSION///////////////////////////////////////
///////////////////////////////////////////////////////////////////////////
Protein diffusion(Protein p, int nb_alpha, int alpha, int L)
{
v_directions.erase(v_directions.begin(),v_directions.end());//vider
v_directions;
int d1=0; int d2=1; int d3=2; int d4=3;
vector<bool> dir;
int k;
for (k=0;k<4;k++)
{ dir.push_back(true);}
int xc=p.retourne_xc();
int yc=p.retourne_yc();
int id=reseau[xc][yc].retourne_protein_id();
vector<vect_site> v_pos_diff;
v_pos_diff.push_back(calcul_positions(xc+1,yc,alpha));
v_pos_diff.push_back(calcul_positions(xc,yc+1,alpha));
v_pos_diff.push_back(calcul_positions(xc-1,yc,alpha));
v_pos_diff.push_back(calcul_positions(xc,yc-1,alpha));
int
int
for
{
for
d;
x;
(d=0;d<4;d++)
(x=0;x<nb_alpha;x++)
{
int xx=v_pos_diff[d][x].retourne_x();
int yx=v_pos_diff[d][x].retourne_y();
if
((reseau[xx][yx].retourne_occupation()==true)&&(reseau[xx][yx].retourne_pro
tein_id()!=id))
{
dir[d]=false;
//
break;
}
}
}
if (dir[0]==true) {v_directions.push_back(d1);}
238
Annexes
int t=v_directions.size();
if (t==0)
{
return p;
}
int n=(int)(t*(-(double)rand()/(double)(RAND_MAX+1)));
int x2; int y2;
if (v_directions[n]==0) {x2=xc+1; y2=yc;}
if (v_directions[n]==1) {x2=xc; y2=yc+1;}
if (v_directions[n]==2) {x2=xc-1; y2=yc;}
if (v_directions[n]==3) {x2=xc; y2=yc-1;}
int j;
for (j=0;j<nb_alpha;j++)
{
v_positions.push_back(v_pos_diff[v_directions[n]][j]);
}
bool A=p.retourne_statut_agreg();
Protein prot(x2,y2,alpha,A,p.retourne_identite(),v_positions);
return prot;
}
/////////////////////////agregation////////////////////////////////////////
bool agregation(Protein p)
{
bool aggregation=false;
int i;
int j;
int id_p=reseau[xc][yc].retourne_protein_id();
for (i=0;i<p.retourne_positions().size();i++)
{
vector<Site> premiers_voisins_p;
premiers_voisins_p=p.retourne_positions()[i].premiers_voisins();
// sur ts les 1ers voisins des sites de la prot
for(j=0;j<4;j++)
{
int x=premiers_voisins_p[j].retourne_x();
int y=premiers_voisins_p[j].retourne_y();
int id=reseau[x][y].retourne_protein_id();
if ((id!=0)&&(id!=id_p))
//pour les positions occupées par une prot differente
{
aggregation=true; //prot agrégée
break;
}
}
}
//
}
return aggregation;
}
//////////////////identite voisine d'une proteine//////////////////////////
239
Annexes
int identite_voisine(Protein p)
{
int identite_voisine;
int identite=p.retourne_identite();
int i;
{
int j;
for (j=0; j<4; j++)
{
if
((reseau[x][y].retourne_protein_id()!=0)&&(reseau[x][y].retourne_protein_id
()!=identite))
{
identite_voisine=reseau[x][y].retourne_protein_id();
break;
}
}
}
return identite_voisine;
}
/////////////////////DEPLIEMENT////////////////////////////////////////////
///////////////////////////////////////////////////////////////////////////
//////////////////////////directions_depliement////////////////////////////
vector<int> directions_depliement(Protein p, int nb_alpha)
{
int d1=0;
int d2=1;
bool dir1=true; bool dir2=true;
int xc=p.retourne_xc(); int yc=p.retourne_yc();
int x;
int y;
for (x=xc-(nb_alpha-1)/2;x<=xc+(nb_alpha-1)/2; x++)
{
if
((reseau[x][yc].retourne_occupation()==true)&&(reseau[x][yc].retourne_prote
in_id()!=id))
{
dir1=false;
break;
}
}
for (y=yc-(nb_alpha-1)/2;y<=yc+(nb_alpha-1)/2;y++)
{
if
((reseau[xc][y].retourne_occupation()==true)&&(reseau[xc][y].retourne_prote
in_id()!=id))
240
Annexes
{
dir2=false;
break;
}
}
if (dir1==true) v_directions.push_back(d1);
if (dir2==true) v_directions.push_back(d2);
return v_directions;
}
//////////////////depliement unidirectionnel///////////////////////////////
vector<Site> depliement(Protein p, int nb_alpha, vector<int> v_dir, int
identite)
{
int
int
int
int
d1=0;
d2=1;
xc=p.retourne_xc(); int yc=p.retourne_yc();
x;
int y;
//int i;
int j;
int n=(int) (v_dir.size()*((double)rand()/(double)(RAND_MAX+1)));
if (v_dir[n]==d1)
for (x=xc-(nb_alpha-1)/2;x<=xc+(nb_alpha-1)/2; x++)
{
Site site(x,yc);
v_positions.push_back(site);
Position p(true, identite, true);
reseau[x][yc]=p;
}
if (v_dir[n]==d2)
{
for (y=yc-(nb_alpha-1)/2;y<=yc+(nb_alpha-1)/2; y++)
{
Site site(xc,y);
reseau[xc][y]=p;
}
}
return v_positions;
}
///////////////////////////////////////////////////////////////////////////
/////////////////////////DEPLIEMENT INDUIT/////////////////////////////////
///////////////////////////////////////////////////////////////////////////
///////////////////site en contact avec une autre protéine/////////////////
Site site_contact(Protein p)
{
int id_p=reseau[xc][yc].retourne_protein_id();
241
Annexes
Site site_contact;
Site site(xc,yc);
int x2=0;
int y2=0;
Site site_contact2(x2,y2);
int i;
int j;
{
for(j=0;j<4;j++)
{
int id=reseau[x][y].retourne_protein_id();
if ((id!=0)&&(id!=id_p))
//pour les
positions occupées par une prot differente
{
int xp=p.retourne_positions()[i].retourne_x();
int yp=p.retourne_positions()[i].retourne_y();
Site site_prot(xp,yp);
site_contact2=site_prot;
break;
}
}
}
return site_contact2;
}
////////// directions libres depliement induit/////////////////////////////
vector<int> directions_depli_induit(Protein p, Site site_contact,int
nb_alpha)
{
int d1=0;
int d2=1;
int d3=2;
int d4=3;
bool dir1=true; bool dir2=true; bool dir3=true; bool dir4=true;
int xcontact=site_contact.retourne_x(); int
ycontact=site_contact.retourne_y();
int xc=p.retourne_xc(); int yc=p.retourne_yc();
int x;
int y;
for (x=xcontact;x<xcontact+nb_alpha; x++)
{
if
((reseau[x][ycontact].retourne_occupation()==true)&&(reseau[x][ycontact].re
tourne_protein_id()!=id))
{
dir1=false;
break;
}
}
242
Annexes
for (x=xcontact-nb_alpha+1;x<=xcontact; x++)
{
if
((reseau[x][ycontact].retourne_occupation()==true)&&(reseau[x][ycontact].re
{
dir2=false;
break;
}
}
for (y=ycontact;y<ycontact+nb_alpha;y++)
{
if
((reseau[xcontact][y].retourne_occupation()==true)&&(reseau[xcontact][y].re
{
dir3=false;
break;
}
}
for (y=ycontact-nb_alpha+1;y<=ycontact;y++)
{
if
((reseau[xcontact][y].retourne_occupation()==true)&&(reseau[xcontact][y].re
{
dir4=false;
break;
}
}
if
if
if
if
(dir1==true)
(dir2==true)
(dir3==true)
(dir4==true)
v_directions.push_back(d1);
return v_directions;
}
/////////depliement induit/////////////////////////////////////////////////
vector<Site> depli_induit(Protein p,Site site_contact,int
nb_alpha,vector<int> v_dir, int identite)
{
int
int
int
int
d1=0;
d2=1;
d3=2;
d4=3;
int xcontact=site_contact.retourne_x(); int
ycontact=site_contact.retourne_y();
int x;
int y;
int n=(int) (v_dir.size()*((double)rand()/(double)(RAND_MAX+1)));
if (v_dir[n]==d1)
{
for (x=xcontact;x<xcontact+nb_alpha; x++)
243
Annexes
{
Site site(x,ycontact);
reseau[x][ycontact]=p;
}
}
if (v_dir[n]==d2)
{
for (x=xcontact-nb_alpha+1;x<=xcontact; x++)
{
Site site(x,ycontact);
reseau[x][ycontact]=p;
}
}
if (v_dir[n]==d3)
{
for (y=ycontact;y<ycontact+nb_alpha; y++)
{
Site site(xcontact,y);
reseau[xcontact][y]=p;
}
}
if (v_dir[n]==d4)
{
for (y=ycontact-nb_alpha+1;y<=ycontact; y++)
{
Site site(xcontact,y);
reseau[xcontact][y]=p;
}
}
return v_positions;
}
244
Annexes
Classes (headers et fichiers sources)
Site.h
#ifndef Site_h
#define Site_h
#include<vector>
class Site
{
private:
int x, y;
public:
/** méthodes d'accès aux var de Site ******** */
int retourne_x() const
int retourne_y() const
{return x;}
{return y;}
/** struct. attributs de Site********* */
Site(int a, int b) {x = a; y = b;} //constructeur de site
~Site() {} // destructeur de site
Site() {} //constructeur par défaut
/** déclarations des méthodes de Site ********* */
Site operator= ( const Site ); //surcharge opérateur =
double distance( const Site, const Site ); //distance cartésienne entre deux sites
vector<Site> premiers_voisins(); // premiers voisins d'un site
bool comparer_site(const Site, const Site); //comparaison 2 sites
};
#endif
Site.cpp
#include<iostream>
#include "Site.h"
#include "math.h"
#include <vector>
/********* definition constructeur de copie de site**********************/
/*Site::Site(const Site &source)
{
x=source.x;
y=source.y;
}*/
/******** calcul distance entre deux points repere cartésien 2D **********/
double Site::distance(const Site s1, const Site s2)
{
double dist;
dist = sqrt(pow((s1.x-s2.x),2)+pow((s1.y-s2.y),2));
return dist;
}
245
Annexes
/************surcharge opérateur = pour Site **************************/
Site Site::operator=(const Site s)
{
if (this==&s) //signif du &?
return *this; //qd va-t-on se servir de ca ?
x=s.x;
y=s.y;
return s;
}
/************comparaison 2 sites************************************/
bool Site::comparer_site(const Site s1,const Site s2)
{
bool meme_site=false;
if ((s1.x==s2.x)&&(s1.y==s2.y))
meme_site=true;
return meme_site;
}
/***********premiers voisins site en 2D********************************/
vector<Site> Site::premiers_voisins()
{
vector<Site> voisins;
Site voisin1(x-1,y);
voisins.push_back(voisin1);
Site voisin2(x,y-1);
Site voisin3(x+1,y);
Site voisin4(x,y+1);
return voisins;
}
Position.h
#ifndef Position_h
#define Position_h
#include<vector>
class Position
{
private:
bool occupation;
int protein_id;
bool depliement;
public:
/** méthodes d'accès aux var de Position ******** */
bool retourne_occupation() const
246
{return occupation;}
Annexes
int retourne_protein_id() const {return protein_id;}
bool retourne_depliement() const {return depliement;}
/** struct. attributs de Position ********* */
Position(bool a, int b, bool c) {occupation = a; protein_id = b;
depliement=c;} //définit constructeur
~Position() {} // définit destructeur
Position() {occupation=false; protein_id=0; depliement=false;}
//constructeur par défaut
};
#endif
Centroid.h
Centroid.cpp
Protein.h
#ifndef Protein_h
#define Protein_h
#include<vector>
#include "Site.h"
class Protein
{
private:
int xc;
int yc;
double Rayon;
bool agreg;
int identite;
public:
Protein(int a, int b,double R,bool ag, int id,vector<Site> v) {
xc=a; yc=b; Rayon=R; agreg=ag; identite=id; v_positions=v;}
//constructeur protein
~Protein() {} //destructeur
Protein() {} //constructeur par défaut
/***********methodes d'accès*********/
int retourne_xc() const { return xc; }
int retourne_yc() const { return yc; }
double retourne_rayon() const { return Rayon; }
bool retourne_statut_agreg() const { return agreg;}
int retourne_identite() const { return identite;}
vector<Site> retourne_positions() const { return v_positions;}
/***********fonctions de protein*******/
Centroid calcul_centroid();
bool comparer_protein(const Protein, const Protein);
};
#endif
247
Annexes
Protein.cpp
#include "Protein.h"
#include <vector>
#include <iostream>
#include "math.h"
#include <algorithm>
#include <functional>
/*********calcul centroide d'une protéine*************/
Centroid Protein::calcul_centroid()
{
int i;
int size = v_positions.size();
int *y=new int[size];
int *x=new int[size];
int
int
int
int
for (i=0;i<size;i++)
{
x[i]=v_positions[i].retourne_x();
y[i]=v_positions[i].retourne_y();
}
xmin =*min_element(x,x+size);
xmax =*max_element(x,x+size);
ymin =*min_element(y,y+size);
ymax =*max_element(y,y+size);
Centroid
C(((double)xmax+(double)xmin)/2,((double)ymax+(double)ymin)/2);
delete[] y;
delete[] x;
return C;
}
/******************comparaison 2 proteines*******************************/
bool Protein::comparer_protein(const Protein P1, const Protein P2)
{
bool meme_protein=false;
if
((P1.retourne_xc()==P2.retourne_xc())&&(P1.retourne_yc()==P2.retourne_yc())
)
meme_protein=true;
return meme_protein;
}
248
Résumé
L'association étroite des protéines de la matrice extracellulaire (MEC) à la matrice
minérale au sein du tissu osseux participe directement au contrôle de la morphologie et de la
croissance du minéral au cours de l'ostéogenèse. Cette interaction fait l'objet de nombreuses
études, visant tant à élucider les mécanismes fondamentaux de la minéralisation qu'à élaborer
des matériaux bioactifs de substitution du tissu osseux. L'interaction protéine/surface est
également l'un des premiers événements suivant l'implantation d'un matériau dans l'organisme
et fait l'objet de nombreuses études en ingénierie biomédicale. Fondamentales ou appliquées,
ces recherches nécessitent la compréhension et la prédiction des propriétés des revêtements
protéiques en deux dimensions. C'est dans ce contexte que nous nous intéressons à la
structuration de la fibronectine, protéine majeure de la MEC osseuse, sur une matrice
minérale synthétique d'hydroxyapatite (HA). Cette étude est menée d'une part à l'aide de
l'observation par immunofluorescence de fibronectine humaine adsorbée sur des céramiques
denses d'HA, et d'autre part au travers du développement d'un modèle d'adsorption, étudié par
simulations numériques.
Nos observations de la fibronectine adsorbée sur l'HA mettent en évidence l'apparition
d'états de structuration variés de la protéine, classés en quatre types morphologiques :
revêtement homogène, agrégats, fibres isolées et connectées. Dans certains cas l'adsorption
sur l'HA conduit à l'établissement d'un réseau fibrillaire dense proche du réseau de
fibronectine matriciel synthétisé par des cellules en culture. La fréquence d'apparition de ces
différents états dépend des conditions d'adsorption de la protéine et notamment du temps, de
la concentration, de la force ionique, ou de la présence d'un surfactant en solution. La
corrélation entre la structuration de la fibronectine et la conformation de la molécule est par
ailleurs étudiée grâce à des sondes moléculaires spécifiques. Ces études permettent d'avancer
un scénario plausible quant aux interactions impliquées dans la formation des différents types
morphologiques.
L'impact des propriétés de la molécule, et notamment de sa conformation, sur la
morphologie des amas supramoléculaires formés est étudié par simulation d'un modèle
stochastique décrivant l'adsorption séquentielle de protéines, leur diffusion aléatoire sur la
surface, leur changement de conformation et leur agrégation. Notre modèle permet en
particulier d'étudier l'effet des interactions entre protéines voisines dans l'induction ou
l'inhibition du dépliement. Les configurations simulées, générées par des méthodes de type
Monte Carlo, montrent notamment que le dépliement influe significativement sur la
morphologie des amas, évaluée en terme de dimension fractale.
Si certaines hypothèses doivent être confirmées, l'ensemble de nos résultats concourt à
clarifier les mécanismes de fibrillation et d'agrégation de la fibronectine sur une surface. Le
lien entre les propriétés morphologiques des structures agrégatives observées et leurs
fonctions, en terme de colonisation du support par les cellules par exemple, reste à étudier et
constitue l'une des perspectives de ce travail. Le développement de notre modèle, associé à
l'extension de l'étude expérimentale à d'autres types de surface et/ou protéines, pourra
contribuer à élucider les principes généraux gouvernant l'assemblage de protéines en deux
dimensions.
___________________________________________________________________________
Mots Clefs : Adsorption, Auto-assemblage, Biomatériaux hybrides, Fibronectine,
Hydroxyapatite, Modèle stochastique.
Laboratoire ERMMECe, Université de Cergy-Pontoise
2 avenue Adolphe Chauvin, BP 222, 95302 Cergy-Pontoise CEDEX.

ECOLE DOCTORALE SCIENCE ET INGENIERIE De l`Université de

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