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Rapport d’étude préliminaire du Premi Test®
Etude VV
LABORATOIRE D'ETUDES ET DE RECHERCHES SUR LES
MEDICAMENTS VETERINAIRES ET LES DESINFECTANTS
LABORATOIRE COMMUNAUTAIRE DE REFERENCE
B.P.90203 - 35302 FOUGERES Cédex
La Haute-Marche - JAVENE - 35133 FOUGERES (France)
Tél: 33 2 99 94 78 78
Fax: 33 2 99 94 78 99
E-mail: [email protected]
Validation AFNOR des méthodes alternatives
d’analyse – Application à la détection des résidus
d’antibiotiques et autres molécules à effet
antibactérien dans les produits agroalimentaires
Rapport d’étude préliminaire pour la validation
AFNOR du Premi Test®
Code d’étude : VV
Février 2006
Rapport rédigé par V. GAUDIN (AFSSA Fougères)
Avec la collaboration scientifique de Jean-Michel FABRE (Phylum)
Avec la collaboration technique de A. RAULT (AFSSA Fougères)
D:\Documents and Settings\c.marcault\Local Settings\Temporary Internet Files\OLKB\Rapport_Etude_préliminaire090206.doc
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Etude VV
RESUME
L’étude préliminaire de validation AFNOR du Premi®Test était composée de 3 phases, apportant
chacune des informations sur la sensibilité et la spécificité de la méthode alternative, ainsi qu’une
comparaison entre la méthode alternative et la méthode de référence.
Etant donné les particularités du test (basé sur l’analyse du jus de viande) et les difficultés liées à la
matrice muscle, le protocole avait été adapté. Par ailleurs étant donné le manque de sensibilité de la
méthode de référence vis-à-vis de certains antibiotiques il a été nécessaire, chaque fois que cela été
possible, de comparer les deux méthodes (4 boîtes et Premi®Test) aux données fournies par des
méthodes quantitatives permettant de connaître le niveau réel de contamination des échantillons en
antibiotiques.
La phase 1 a permis de déterminer les limites de détection du Premi®Test pour 6 molécules de 5
familles différentes d’antibiotiques à partir de jus de viande de porc supplémentés. Excepté pour la
gentamycine, les limites de détection du PremiTest se situent au niveau des Limites Maximales
de Résidus (LMR).
La phase 2 était basée sur l’analyse par la méthode des 4 Boites et le Premi®Test de muscles de porc
naturellement chargés en antibiotiques (issus d’animaux traités) ainsi que des témoins ‘blancs’ (sans
résidus d’antibiotiques). On a ainsi trouvé un taux de faux-positifs et un taux de faux-négatifs de
0% pour le Premi®Test. Lors de cette phase les taux de faux-négatifs et de faux-positifs sont
meilleurs pour le Premi®Test (0%) que pour la méthode des 4 Boites (57% et 15% respectivement). En
effet la sensibilité de la méthode des 4 Boites est parfois insuffisante pour certains antibiotiques. De
plus, cette phase de l’étude a montré que la méthode 4 Boites et le Premi®Test donnent des
résultats concordants (« les 2 méthodes ne sont pas différentes »).
-
Lors de la phase 3, 1427 échantillons ont été analysés par le Premi®Test dans 6 Laboratoires
Vétérinaires Départementaux (LVD). Ensuite 112 de ces échantillons positifs soit en Premi®Test
(102) soit avec une autre méthode (Bacillus cereus : 10 positifs) ont été envoyés à l’AFSSA. Ces
échantillons ont été analysés à l’AFSSA avec le Premi®Test, la méthode des 4 Boites (référence) et
la méthode STAR (méthode du Laboratoire Communautaire de Référence). Les échantillons détectés
positifs à l’AFSSA par au moins une des méthodes ont été confirmés par une méthode multi-résidus
d’antibiotiques en CL/SM-SM (identification et quantification des molécules). Le Premi®Test s’avère
applicable aux muscles de différentes espèces (porcins, bovins, volaille, ovin, lapin, …). La
comparaison entre le Premi®Test et la méthode des 4 boîtes réalisée sur les seuls échantillons
analysés au niveau de l’AFSSA fait apparaître une différence entre les 2 tests. Toutefois, l’intégration
des résultats négatifs dans les LVD permet de constater que les 2 méthodes ne sont pas différentes.
La capacité de chaque test à détecter les différentes familles d’antibiotiques a été étudiée. Le
PremiTest détecte mieux les antibiotiques de certaines familles (Bétalactamines…) que la méthode
des 4 boîtes et moins bien certaines tétracyclines.
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SOMMAIRE
1.
Objectifs ............................................................................................................................4
2.
Description des méthodes ..............................................................................................5
2.1.
Description de la méthode alternative...................................................................... 5
2.2.
Description de la méthode de référence ................................................................... 7
2.3.
Description des autres méthodes............................................................................... 9
2.3.1.
Méthode STAR .................................................................................................... 9
2.3.2.
Méthode CL/SM-SM............................................................................................ 9
3.
Synthèse bibliographique .............................................................................................10
4.
Protocole des différentes études expérimentales.......................................................15
4.1.
Praticabilité du kit.................................................................................................... 15
4.2.
Protocole des études comparative de la méthode alternative et de la méthode de
référence................................................................................................................................ 16
5.
Résultats des études expérimentales ..........................................................................20
5.1.
Praticabilité du kit.................................................................................................... 20
5.2.
Etudes comparatives de la méthode alternative et de la méthode de référence . 21
5.2.1.
Résultats de la phase 1 : ..................................................................................... 21
a. Limite de détection (échantillons avec des concentrations croissantes de 6
antibiotiques).................................................................................................................. 21
b. Taux de faux positifs (échantillons « blancs »)...................................................... 23
c. Taux de faux négatifs ............................................................................................. 23
5.2.2.
5.2.3.
Total ......................................................................................................................................... 37
Total ......................................................................................................................................... 37
Total ......................................................................................................................................... 37
Total ......................................................................................................................................... 37
Total ......................................................................................................................................... 37
Total ......................................................................................................................................... 37
Total ......................................................................................................................................... 37
Total ......................................................................................................................................... 37
Total ......................................................................................................................................... 37
6.
Conclusions....................................................................................................................40
7.
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES............................................................................41
8.
Annexes ..........................................................................................................................43
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1. Objectifs
Il s’agit d’une demande de validation AFNOR du kit Premi®Test qui est commercialisé par la société
DSM (Pays-Bas) pour la détection des résidus d’antibiotiques dans le muscle.
Le champ de cette validation sera la viande de porc, avec une extension à la viande de bovin et de
volaille. D’après les données de sensibilité du fournisseur, la sensibilité du Premi®Test quelque soit
l’espèce concernée est similaire.
Le laboratoire expert est le Laboratoire d’Etudes et de Recherche sur les Médicaments Vétérinaires et
les Désinfectants (LERMVD) appartenant à l’Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments
(AFSSA).
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2. Description des méthodes
2.1. Description de la méthode alternative
Le Premi®Test permet de détecter les substances antimicrobiennes présentes dans la viande fraîche,
la charcuterie, les reins, le poisson et les œufs. C’est un test à large spectre, qui permet de détecter un
grand nombre d’antibiotiques couramment utilisés pour la viande en moins de 4 heures, sur du jus de
viande (extrait par pressage d’un morceau de viande).
PRINCIPE
Le Premi®Test est basé sur l’inhibition de la croissance du Bacillus stearothermophilus, bactérie très
sensible à de nombreux antibiotiques et aux sulfamides. Des spores standardisées sont inclues dans
de la gélose additionnée de nutriments sélectionnés.
METHODE
Le Premi Test est d’une utilisation simple. Le jus de viande est déposé dans des tubes contenant la
gélose au sein de laquelle se trouvent les spores de Bacillus stearothermophilus. Après 20 minutes de
diffusion puis élimination du jus et préchauffage de l’incubateur pendant 20 minutes, il faut incuber le
tube pendant environ 3 heures à 64°C et vérifier la couleur.
INTERPRETATION DES RESULTATS
La lecture du résultat « oui/non » se limite à une comparaison de couleurs. En l’absence
d’antibiotiques, les spores germent et se développent, entraînant l’acidification du milieu et un
changement de couleur. Si l’échantillon vire nettement du violet au jaune, cela signifie que la quantité
de composés antimicrobiens se situe en deçà des limites de détection du Premi®Test. Inversement, en
présence d’antibiotiques, les spores ne se développent pas, elles sont inhibées par l’antibiotique : une
couleur violette indique un taux d’antibiotiques supérieur ou égal à la limite de détection du test.
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2.2. Description de la méthode de référence
La méthode des 4 boites [6] est la méthode officielle française de détection des résidus d’antibiotiques
dans la viande. La méthode des 4 boites a pour objet, à l'aide de microorganismes sensibles, la mise
en évidence de résidus de substances à activité antibiotique sans en déterminer leur identité. Elle est
applicable aux muscles d'animaux de boucherie et volailles, aux muscles et foies de palmipèdes gras.
PRINCIPE
La détection des résidus de substances à activité antibiotique nécessite l'application d'une technique de
diffusion en gélose qui comporte :
-
La préparation des boîtes de milieu nutritif ;
-
La préparation des souches de microorganismes utilisées pour les tests ;
-
l'ensemencement, par un microorganisme sensible aux substances à activité antibiotique, d'un
milieu nutritif solide coulé en boîte de Pétri.
-
le dépôt, à la surface du milieu ensemencé, d'une rondelle de muscle congelé, suivi d'une
incubation à la température optimale de développement du microorganisme-test.
Les substances à activité antibiotique éventuellement présentes inhibent la croissance du
microorganisme-test : il en résulte la formation d'une zone d'inhibition autour de l'échantillon.
METHODE
Cette méthode requiert l'utilisation des deux espèces suivantes : Bacillus subtilis cultivé à trois pH
différents (6, 7,4 et 8) et Micrococcus luteus cultivé à pH 8.Pour la méthode de diffusion réalisée avec
Bacillus subtilis à pH 7,4, l'addition de triméthoprime permet la détection des sulfamides dans le muscle
grâce à la synergie triméthoprime-sulfamides.
Principales étapes :
-
Sortir les échantillons du congélateur, quelques minutes avant d'opérer, et les déposer sur un
plateau en acier inoxydable.
-
Prélever sur chaque échantillon une "carotte" cylindrique de 8 mm de diamètre et de 2 cm de
long environ, à l'aide d'un emporte-pièce.
-
Tout en poussant le cylindre de muscle hors de l'emporte-pièce, découper à l'aide d'un bistouri
huit rondelles de viande de 2 mm d'épaisseur.
-
Placer deux rondelles en positions diamétralement opposées sur chacune des quatre boîtes
d'essai, en utilisant des pinces.
Il est ainsi possible de déposer dans chacune de ces boîtes jusqu'à six rondelles, correspondant à trois
échantillons à examiner, toutes ces rondelles devant se situer sur un cercle à environ 1 cm de la
périphérie de la boîte.
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Pour chacune des quatre boîtes, sont considérés comme positifs, les échantillons de viande donnant
des zones d'inhibition dont la taille de la zone annulaire est au moins égale à 2 mm.
Il faut recommencer l'essai chaque fois que le résultat semble douteux (pour un même échantillon une
rondelle étant positive et l'autre négative, colonies éparses dans la zone d'inhibition, contaminations,
etc...).
Si le second résultat n'est pas considéré comme positif, le résultat douteux doit être considéré
Conclusion
Sont considérés comme contenant des résidus de substances à activité antibiotique, les échantillons
trouvés positifs par l'une au moins des quatre techniques de diffusion en gélose. De plus chaque boite
présente une sensibilité particulière pour certaines familles d’antibiotiques, ce qui permet de donner les
orientations suivantes :
Boites
Orientation
Bacillus subtilis à
Micrococcus luteus
pH 6
pH 7,4
pH 8
à pH 8
Sulfamides.
Aminosides
Béta-lactamines
ou tétracyclines
Béta-lactamines et
macrolides
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2.3. Description des autres méthodes
2.3.1.
Méthode STAR
METHODE
Le principe de la méthode STAR est le même que celui de la méthode des 4 Boites. Il s’agit d’une
méthode microbiologique de dépistage des résidus d’antibiotiques basée sur l’utilisation de germes
sensibles aux différents résidus d’antibiotiques.
Les microorganismes test suivants sont utilisés:
Boite Bs8 : Bacillus subtilis cultivé à pH 8
Boite Kv8 : Kocuria varians ex. Micrococcus luteus cultivé à pH 8
Boite Bc6 : Bacillus cereus cultivé à pH 6
BoiteEc8 : Escherichia coli cultivé à pH 8
Boite Bst : Bacillus stearothermophilus cultivé à pH 7.4
INTERPRETATION
Un échantillon de muscle, de foie gras, de crevette ou de poisson est considéré comme positif quand il
donne une zone d’inhibition supérieure à 2 mm, sur au moins une des boîtes Bs 8, Kv 8, Bc 6 et Ec 8 et
/ ou supérieure à 4 mm pour la boite Bst. Deux rondelles provenant du même échantillon doivent
donner le même résultat (positif ou négatif).
Boite
Bs 8
Kv 8
Bc 6
Ec 8
Bst
Famille
Aminoglucosides
Macrolides et
Tétracyclines
Quinolones
Sulfamides et
béta-lactamines
2.3.2.
béta-lactamines
Méthode CL/SM-SM
La méthode de confirmation physico-chimique utilisée dans cette étude est basée sur la
chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (CL/SM-SM). Cette méthode
multi-résidus a été développée au sein de l’AFSSA Fougères. Elle permet, avec 2 modes d’extraction
différents seulement, de dépister les rés. De plus après le dépistage elle permet de quantifier la
molécule détectée en première instance. L’utilisation de la spectrométrie de masse en fait une
technique de confirmation, c’est-à-dire qu’elle permet d’IDENTIFIER la (ou les) molécule(s) et de la
(les) QUANTIFIER.
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3. Synthèse bibliographique
Depuis 1998, de nombreux articles ont été publiés en France ou à l’étranger sur les performances du
Premi®Test, souvent comparées à des méthodes de référence.
Popelka (2005) [16], a comparé le Premi®Test avec la méthode des 4 Boites traditionnelle (Bacillus
subtilis et Kocuria rhizophila) et le test BsDA (Bacillus stearothermophilus disc assay). Les limites de
détection ont été déterminées pour 5 antibiotiques de la famille des beta-lactamines, en utilisant des jus
de viande de volaille supplémentés, mais aussi en traitant des volailles avec de l’amoxicilline. Les
échantillons positifs étaient confirmés par chromatographie liquide haute performance (CLHP).
Le tableau suivant présente les limites de détection obtenues :
Pénicilline
Amoxicilline
Ampicilline
Oxacilline
Cloxacilline
G
LMR (µg/kg)
50
50
50
300
300
LOD Bacillus
5
10
25
30
30
LOD Kocuria rhizophila (µg/kg)
10
25
30
50
50
LOD Premi®Test (µg/kg)
4
5
5
40
50
stearothermophilus (µg/kg)
Quel que soit le test, les limites de détection sont inférieures aux LMRs respectives. Le Premi®Test
présente les limites de détection les plus basses pour les beta-lactamines.
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L’étude de Arts (2000) [2] a porté dans un premier temps sur des jus de muscle de porc,
supplémentés avec différents antibiotiques. Les résultats sont présentés dans le tableau suivant :
Lors de cette étude, des expériences ont aussi été réalisées sur des jus de viande de porc, de poulet et
de bovin, supplémentés avec une plus grande variété d’antibiotiques. En conclusion peu ou pas de
différences ont été observées au niveau des limites de détection des antibiotiques entre les différentes
espèces.
Enfin cette étude a montré que le Premi®Test peut détecter la plupart des antibiotiques comme les
beta-lactamines, macrolides, tetracyclines, sulfamides et les aminosides à la LMR ou en dessous en 3
heures. Aucun résultat faux-positif n’a été obtenu lors de cette étude avec le Premi®Test.
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L’étude de Reybroeck (2000) [18] a été réalisée sur des jus de viande supplémentés de différentes
espèces (bœuf, porc, poulet) afin de déterminer les limites de détection d’antibiotiques issus de
différentes familles. Le tableau suivant présente les résultats de l’étude de sensibilité :
Les limites de détection du Premi®Test sont inférieures aux LMRs pour les beta-lactamines, 2
macrolides et les sulfamides, un peu supérieures aux LMRs pour les tétracyclines et la lincomycine, et
enfin la sensibilité est insuffisante pour les aminoglycosides et la spiramycine.
Cette étude montre qu’il y peu de différence de sensibilité pour la plupart des antibiotiques testés,
quelle que soit l’espèce d’origine du muscle testé.
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Dans une autre étude de Reybroeck (2000) [17], les performances du Premi®Test ont été testées sur
du muscle de poulet naturellement contaminé. Les concentrations musculaires après traitement ont été
déterminées par un test appelé Charm II (radio-immunoessai semi-quantitatif). Le tableau suivant
présente un résumé des résultats de l’étude :
Pour quelques composés, les concentrations obtenues étaient inférieures aux limites de détection du
Premi®Test et donc non détectées. Par contre les beta-lactamines et les sulfamides sont détectés au
niveau de la LMR, mais pas la spiramycine.
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Plusieurs publications de Fabre (2003, 2004) [7-9] ont présenté le Premi®Test et ses performances
comparées pour différentes espèces animales.
Une des publications [7] condense les résultats de plusieurs études, en France et à l’étranger, réalisées
ces dernières années (dont une en collaboration avec l’AFSSA Fougères).
Ces études ont été réalisées sur le muscle de porc et de volaille.
Les limites de détection du Premi®Test ont été déterminées comme proches des LMRs pour les
tétracyclines, les sulfamides et inférieures aux LMRs pour les beta-lactamines.
Conclusion de l’étude bibliographique :
Le Premi®Test peut détecter la plupart des antibiotiques au niveau des LMRs (macrolides,
tetracyclines, sulfamides) ou même en dessous (beta-lactamines). Pour quelques antibiotiques comme
des aminosides, la spiramycine (macrolide), les limites de détection sont plus élevées que les LMRs.
C’est le cas pour tous les tests de dépistage des résidus d’antibiotiques puisqu’il n’existe pas de test à
l’heure actuelle capable de détecter tous les résidus d’antibiotiques au niveau des LMRs.
Plusieurs études ont montré que l’origine du muscle (espèce animale d’origine) a peu ou pas
d’influence sur la sensibilité du test.
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Etude VV
4. Protocole des différentes études expérimentales
Le présent chapitre détaille les protocoles qui ont été mis en œuvre dans le cadre de l’étude réalisée
par l’AFSSA. L’étude préliminaire a démarré fin Septembre 2005 et s’est terminée fin Janvier 2006.
4.1. Praticabilité du kit
Il est à noter que le Laboratoire expert ayant déjà utilisé le test pour des essais préliminaires et celui-ci
ayant été diffusé dans plusieurs laboratoires (LVD), le rapport d’étude bénéficie d’une expérience
importante concernant la praticabilité. Les données résultant de cette étude de praticabilité sont
intégrées dans les résultats de l’étude pour les critères 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 13.
Critères de praticabilité du kit :
Critères à contrôler
Communication
sur le critère
Méthode de contrôle du critère
1
Emballage
Emballage ou
notice
Vérification par le laboratoire expert
2
Volume des réactifs
Emballage ou
notice
3
Conditions de stockage (+
date de péremption)
Emballage ou
notice
Emballage ou
notice
ère
4 Mode d’utilisation après la 1
utilisation
5
Equipement ou locaux
spécifiques
Notice
6
Réactifs prêts à l’emploi ou
réactifs à préparer (protocole)
Emballage ou
notice
7
Temps de formation d’un
technicien inexpérimenté
Rapport
Mesurée par le laboratoire expert (moins d’un jour,
entre 1 jour et 1 semaine ou plus d’1 semaine)
(possibilité de se servir des durées mises en œuvre
par les laboratoires collaborateurs)
8
Temps réel de
manipulation/Flexibilité de la
technique en fonction du
nombre d’échantillons à
analyser,...
Rapport
Temps de manipulation comparé à la méthode de
référence (inférieur, égal ou supérieur)
9
Délai avant les résultats
Rapport et
attestation
10
Type de qualification d’un
technicien
Rapport
Précisé par le laboratoire expert par rapport au niveau
requis pour la méthode de référence (même niveau ou
niveau différent) (le laboratoire expert peut se servir
des données des laboratoires collaborateurs)
Attestation
Notice
Rapport
Durée et fréquence
Etapes communes avec la
méthode de référence
12 Si oui, traçabilité des résultats
Maintenance par le
13
laboratoire
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Etude VV
4.2. Protocole des études comparative de la méthode alternative et
de la méthode de référence
L’étude de sensibilité et de spécificité a été réalisée en trois temps :
-
Phase 1 : des jus de viande de porc contenant des concentrations connues de différents
antibiotiques et des jus de viande de porcs blancs (20) sont été analysés avec le Premi®Test
seulement. Cette première partie a permis de connaître la sensibilité du test, pour différents
antibiotiques, à des concentrations proches des LMR ;
-
Phase 2 : des échantillons naturellement chargés en antibiotiques provenant d’animaux
traités avec des antibiotiques connus à des doses connues ont été analysés avec 3 méthodes :
Premi®Test et méthode de référence (4 boîtes) ainsi que CL-SM-SM pour disposer d’une
quantification. Cette phase a été limitée à 3 antibiotiques différents (mélange OTC/Sulfa,
Tylosine et amoxicilline) du fait des difficultés d’obtention de tels échantillons ;
-
Phase 3 : des échantillons naturellement chargés en antibiotiques provenant de
prélèvements dans le cadre du contrôle officiel ont été analysés avec les 3 méthodes décrites cidessus. Cette étape permet de disposer de comparaison entre Premi®Test et méthode des 4
boîtes pour un nombre étendu d’antibiotiques et des matrices d’origines différentes (ex. espèces
différentes).
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•
Etude VV
PHASE 1 : Jus de viande :
6 antibiotiques dont 2 beta-lactamines (1 pénicilline et 1 céphalosporine) ont été testés en
supplémentant des jus de viande de porc.
Une étude de sensibilité et de spécificité du Premi Test® (sans comparaison avec la méthode des 4
boites) a été réalisée en utilisant des jus de viande de porc supplémentés.
Chaque antibiotique choisi a été testé à 3 concentrations différentes :
BETA-
SULFAMIDES
Antibiotique
Sulfadimérazine
Oxytétracycline
Tylosine
Amoxicilline
Ceftiofur
Gentamycine
100
100
100
50
200
50
50/100/200
50/100/200
50/100/200
25/50/100
100/200/400
50/100/200
LMR (muscle)
(µg/kg)
Concentrations
(µg/kg)
TETRACYCLINES MACROLIDES
BETA-
Famille
LACTAMINES LACTAMINES
AMINOSIDES
Le choix des concentrations a été basé sur les Limites Maximales de Résidus (LMR) des divers
antibiotiques dans la matrice d’intérêt et sur la sensibilité de la méthode de référence et celle annoncée
par le fournisseur de kits.
5 aliquots par antibiotique et par concentration (chaque concentration en 5 exemplaires) ont été
préparés dans des tubes avant d’être codifiés par le responsable technique selon le tableau
préalablement établi (annexe 2) afin de réaliser les analyses en aveugle. Ils seront conservés au
congélateur à environ –20°C.
Lors de cette 1ère phase, chaque échantillon (5 échantillons/antibiotique/concentration) sera
analysé 1 fois seulement par la méthode alternative, soit 5*6*3 = 90 analyses à réaliser en Premi
Test® seul.
20 échantillons de matrice blanche (viande de porc dépourvue de résidus d’antibiotiques ou
autres substances à activité antibactérienne) ont été codifiés afin de réaliser les analyses en double
et en aveugle 1 fois par la méthode alternative et 1 fois par la méthode de référence.
soit 20*2 = 40 analyses à réaliser en 4 Boîtes et 40 en Premi Test®.
NB : Ces échantillons ont été mélangés avec ceux de la phase 1 pour les analyses en Premi ®Test. Ils
sont inclus dans les échantillons codifiés de 1 à 130 (annexe 1).
NB : Etant donné que la méthode des 4 Boites est la méthode officielle française, l’absence de
substances antibactériennes dans ces échantillons dits « blancs » a été vérifiée par le résultat
négatif de la méthode des 4 boites sur ces échantillons.
Au total une série de 130 échantillons (codes 1 à 130) a été préparée : 90 jus de viande
supplémentés et 20 jus de viande en double, exempts de résidus d’antibiotiques (témoins
négatifs) (cf. annexe 2) pour l’étude de spécificité (cf. 4.2.2.).
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•
Etude VV
PHASE 2 : Echantillons naturellement chargés (préparés à l’AFSSA) :
Une étude comparative a été menée en utilisant des échantillons naturellement chargés. L’étude de
matériaux naturellement chargés est venue confirmer les résultats de la 1ère phase.
L’étude a été réalisée sur des porcs :
- 1 lot de porcs blancs (non traités) ;
- 3 lots de porcs traités (sous contrôle de la l’AFSSA) ;
Chaque lot a reçu un antibiotique ou une association d’antibiotiques classiquement utilisés en
élevage.
Les animaux ont été abattus de manière à obtenir dans le muscle des valeurs proches de celles
attendues.
Plusieurs prélèvements ont été réalisés sur chaque porc.
Un échantillon a été examiné systématiquement en CL/SM-SM.
Les antibiotiques et leurs concentrations respectives sont les suivants :
Famille
Antibiotique
TETRACYCLINES /
SULFAMIDES
Oxytétracycline (OTC) /
Sulfadiméthoxine (SDMX)
LMR (muscle
100 / 100
porc) (µg/kg)
Concentrations
MACROLIDES
BETALACTAMINE
Tylosine
Amoxicilline
100
50
750,9
269,5
SDMX
OTC
(µg/kg)
151,1
764,9
Ecart-type (µg/kg)
13,2
44,8
76,1
18,0
8,7
5,9
10,1
6,7
réelles mesurées
Coefficient de
variation (%)
Après l’abattage et une fois les niveaux de contamination connus, 5 morceaux de muscle d’environ 20g
chacun (5 échantillons/antibiotique/concentration) ont été prélevés sur chaque lot de porc (blanc et
traités) avant d’être codifiés selon le tableau préalablement établi (annexe 4) afin de réaliser les
analyses en aveugle. Ils ont été conservés au congélateur à environ –20°C.
Ces échantillons de muscle naturellement chargés ont été analysés en parallèle et en aveugle avec la
méthode de référence (méthode des 4 Boites) et la méthode alternative (Premi® Test).
18/53
•
Etude VV
PHASE 3 : Echantillons naturellement chargés (Action pilote DGAl) :
La phase 3 a été réalisée en utilisant les échantillons provenant d’une étude pilote mise en place par la
Direction Générale de l’Alimentation (DGAl) concernant une nouvelle méthode de recherche des
résidus d’antibiotiques dans les viandes (NOTE DE SERVICE DGAL/SDSPA/SDRRCC/N2005), donc
sur des échantillons naturellement chargés provenant du terrain.
Dans cette étude pilote, 6 laboratoires vétérinaires départementaux (LVD) ont analysés plus de 1400
échantillons en utilisant à la place de la méthode des 4 boîtes le Premi®Test, et en parallèle une boîte
utilisant le germe Bacillus cereus spécifique de la détection des tétracyclines.
Planning des prélèvements :
Les DDSV ont ainsi prélevé le nombre d’échantillons prévu par les notes de service dans le courant des
mois de septembre, octobre, novembre et décembre 2005. Ces échantillons ont été envoyés
régulièrement aux laboratoires. Ces laboratoires ont reçu une formation sur le Premi®Test et sur la
boîte Bacillus cereus en Septembre 2005.
Planning des envois à l’AFSSA :
Tous les échantillons positifs avec le Premi®Test et/ou la boîte Bacillus cereus ont été transmis par les
LVD à l’AFSSA.
Les échantillons étaient envoyés tous les 15 jours un planning pré-déterminé afin de réduire au
minimum les délais entre toutes les analyses, ainsi que les temps de transport. Les échantillons à
confirmer étaient impérativement envoyés sous le régime du froid en messagerie rapide (moins de 24
heures) de manière à arriver non décongelés.
Pour chaque série d’analyses dans les LVD et à chaque envoi d’échantillons positifs par un LVD à
l’AFSSA, le LVD nous faisait parvenir un fichier Excel synthétisant toutes les caractéristiques des
échantillons analysés (dont l’espèce), ainsi que les résultats obtenus au LVD en Premi®Test
(annexe 7).
Tous les échantillons réceptionnés à l’AFSSA ont été codifiés (codification habituelle du laboratoire (en
2005, T05/XXXX) afin de réaliser les analyses en aveugle avec la méthode des 4 boîtes, le
Premi®Test, la boite Bacillus cereus et la méthode STAR.
Les échantillons positifs ou douteux avec l’une au moins de ces méthodes ont été analysés en CL/SMSM (screening systématique).
L’AFSSA a pu ainsi comparer sur des échantillons «naturellement » positifs en antibiotiques
(identification et quantification en CL/SM-SM) les résultats obtenus avec la méthode des 4 boîtes et le
Premi®Test.
19/53
Etude VV
5. Résultats des études expérimentales
5.1. Praticabilité du kit
Critères de praticabilité du kit : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13.
Critères à contrôler
Communication
sur le critère
Méthode de contrôle du critère
1
Emballage
Emballage ou
notice
1 boite polystyrène + 1 notice d’utilisation en plusieurs
langues.
2
Volume des réactifs
Emballage ou
notice
25 ampoules, 1 seringue doseuse de 1 ml (volume
mesuré fixe = 100 µl), des embouts de seringues
jetables
3
Conditions de stockage (+
date de péremption)
Emballage ou
notice
Notice : A stocker au frais (<8°C). NE PAS
CONGELER
Date de péremption et numéro de lots indiqués sur
l’emballage.
Emballage ou
notice
Notice : A stocker au frais (<8°C). NE PAS
CONGELER
ère
4 Mode d’utilisation après la 1
utilisation
5
Equipement ou locaux
spécifiques
Notice
Incubateur DSM ou bain-marie (64°C)
6
Réactifs prêts à l’emploi ou
réactifs à préparer (protocole)
Emballage ou
notice
Aucun réactif à préparer. Tout est prêt à l’emploi.
7
Temps de formation d’un
technicien inexpérimenté
Rapport
Entre 1 jour et 2 jours (formation de 6 LVD)
Fonction du nombre d’échantillons :
Temps de décongélation des échantillons (à 37°C),
Dépôt des échantillons dans les ampoules,
Lavages à l’eau
Temps réel de
manipulation/Flexibilité de la
technique en fonction du
nombre d’échantillons à
analyser,...
Rapport
9
Délai avant les résultats
Rapport et
attestation
10
Type de qualification d’un
technicien
Etapes communes avec la
8
11
12 Si oui, traçabilité des résultats
13
Maintenance par le
laboratoire
Rapport
Indépendant du nombre d’échantillons :
Temps de pressage,
Pré-incubation 20 minutes
Incubation à 64°C entre 2H40 et 3H00 en moyenne
Environ 5 heures entre le début de préparation des
échantillons et la lecture des résultats pour 15 à 20
échantillons.
Qualification requise inférieure à la méthode de
référence (car réactifs prêt à l’emploi).
Attestation
Aucune
Notice
Saisie des résultats sous Excel (n°lot, validité, témoins
négatifs et/ou positifs, résultats…)
Rapport
Contrôle de l’incubateur ou bain-marie (t°)
20/53
Etude VV
5.2. Etudes comparatives de la méthode alternative et de la
A l’AFSSA, tout échantillon douteux ou positif en Premi®Test est considéré comme positif et a donc été
confirmé par CL/SM-SM. Par contre les échantillons notés douteux en méthode des 4 Boites (ou
méthode STAR) sont considérés comme négatifs. Ces derniers n’ont été confirmés en CL/SM-SM que
si le Premi®Test était positif ou douteux.
5.2.1.
Résultats de la phase 1 :
a. Limite de détection (échantillons avec des concentrations
croissantes de 6 antibiotiques)
La photographie suivante montre le mode de lecture d’un témoin négatif, d’un témoin positif et de 2
échantillons de la phase 1.
Les tableaux de l’ensemble des résultats bruts du Premi®Test pour la phase 1 sont présentés
en annexe 3.
21/53
Etude VV
Le tableau suivant permet d’avoir une vision globale de la sensibilité du Premi®Test :
BETA-
BETA-
Famille
SULFAMIDE
TETRACYCLINE
MACROLIDE
Antibiotique
Sulfadimérazi
Oxytétracycline
Tylosine
Amoxicilline
Gentamycine
Ceftiofur
LMR (muscle) (µg/kg)
100
100
100
50
50
1000
50/100/200
50/100/200
50/100/200
25/50/100
50/100/200
100/200/400
0/5
3/5
4/5
5/5
1/5
4/5
5/5
5/5
2/5
(LMR)
(LMR)
(LMR)
(LMR)
(2 x LMR)
5/5
5/5
5/5
5/5
(2 x LMR)
(2 x LMR)
(2 x LMR)
(2 x LMR)
Taux de détection à 50% la LMR
0%
60%
80%
Taux de détection à la LMR
20%
80%
Taux de détection à 2 fois la LMR
100%
100%
Concentrations testées (µg/kg)
(LMR en rouge / 2xLMR en bleu)
LACTAMINE
AMINOSIDE
Nombre d’échantillons positifs
Premi®Test
0/5
Premi®Test
concentration 2 (médiane)
Premi®Test
concentration 3 (la plus haute)
Global
2/5
14 / 30
1/5
18 / 30
3/5
5/5
28 / 30
100%
(0%)
-
48%
100%
100%
0%
(100%)
67%
100%
100%
40%
(100%)
90%
(LMR)
concentration 1 (la plus basse)
LACTAMINE
La limite de détection correspond à la concentration la plus basse qui donne un résultat positif ou
douteux pour chacun des 5 réplicats des essais. La phase 1 a ainsi permis de déterminer la
limite de détection du Premi®Test pour chacun des antibiotiques testés.
BETA-
BETA-
Famille
SULFAMIDE
TETRACYCLINE
MACROLIDE
Antibiotique
Sulfadimérazine
Oxytétracycline
Tylosine
Amoxicilline
Gentamycine
Ceftiofur
LMR (muscle) (µg/kg)
100
100
100
50
50
1000
Limite de détection
2xLMR
2xLMR
LMR
0.5xLMR
> 2xLMR
0.5xLMR
LACTAMINE
AMINOSIDE
LACTAMINE
22/53
Etude VV
b. Taux de faux positifs (échantillons « blancs »)
Au cours de la phase 1, 20 jus « blancs » (sans résidus d’antibiotiques) ont été testés en 2
exemplaires, soit 40 analyses. L’absence de résidus d’antibiotiques dans ces jus de viande a été vérifié
par la méthode de référence (4 Boites) et une autre méthode microbiologique (méthode STAR).
Sur ces 20 jus :
Un seul jus est positif 2 fois et 4 autres jus sont positifs (en réalité classes “douteux”) sur une
des deux répétitions et négatifs sur l’autre.
15 jus sont négatifs les deux fois.
Au bilan : il y a 6 analyses positives sur 40, soit 15% des cas et un échantillon positif 2 fois, soit
5% des échantillons.
Le taux de faux positifs correspond au nombre de résultats positifs obtenus pour des échantillons
blancs (exempts de substances antibiotique) divisé par le nombre total d’échantillons positifs (ce même
nombre plus le nombre d’échantillons contaminés donnant un résultat positif) et multiplié par 100. On
notera que, dans le cas présent le taux de faux positifs (tel qu’il est calculé dans cette étude) doit être
interprété avec prudence car il dépend en réalité du nombre relatif d’échantillons blancs et contaminés
que l’on décide de tester. Soit un taux de 6/(6+20) = 23% de faux positifs au niveau de 1 fois la LMR.
De même le taux de faux positifs au niveau de 2 fois la LMR est de : 6/(6+27) = 18%.
c. Taux de faux négatifs
Le taux de faux négatifs correspond au nombre de résultats négatifs obtenus pour des échantillons
contaminés (artificiellement dans ce cas) divisé par le nombre total d’échantillons négatifs (ce même
nombre plus le nombre d’échantillons blancs donnant un résultat négatif) et multiplié par 100.
On notera ici aussi que, dans le cas présent le taux de faux négatifs (tel qu’il est calculé dans cette
étude) doit être interprété avec prudence car il dépend en réalité du nombre relatif d’échantillons blanc
et contaminés que l’on décide de tester.
Sur les résultats de la phase 1, le taux de faux-négatifs a été calculé à une concentration de 1 fois la LMR
et est égal à : 10/(10+34) = 22 %. De même, le taux de faux-négatifs a été calculé à une concentration
de 2 fois la LMR et est égal à : 3/(3+34) = 8 %.
CONCLUSION DE LA PHASE 1 :
L’étude de jus de viande de porc supplémentés a permis de montrer que pour 6 molécules appartenant
à 5 familles d’antibiotiques différentes, la limite de détection du Premi® Test se situe au niveau de la
Limite Maximale de Résidu (LMR) correspondante. Pour un seul antibiotique (gentamycine), la limite de
détection est supérieure à la LMR (40% de positifs à 2xLMR).
Avec 20 échantillons « blancs » testés et 6 molécules antibiotiques (5 échantillons par antibiotique), le
taux de faux-négatifs à 2 fois la LMR est de 8% et le taux de faux-positifs de 18%.
Le résultat est satisfaisant puisque pour une méthode de dépistage le taux qui doit être minimal est le
taux de faux négatifs, étant donné que les échantillons déclarés positifs (dont les faux positifs) doivent
être confirmés par une méthode physico-chimique pour identification et quantification.
23/53
5.2.2.
Etude VV
Les résultats bruts issus des analyses avec les 2 méthodes sont présentés en annexes 5 et 6.
Le tableau suivant permet de résumer les résultats obtenus :
Tableau détaillé des résultats
Antibiotique
LMR (muscle porc) (µg/kg)
Concentrations trouvée
LC-MS-MS (en µg/kg)
Oxytétracycline /
Global échantillons
Amoxicilline
Tylosine
100 / 100
50
100
760 / 150
270
750
5/5
5/5
5/5
15 / 15
0/5
5/5
5/5
5/5
15 / 15
3/5
5/5
4/5
1/5
10 / 15
2/5
Sulfadiméthoxine
naturellement chargés
Blanc 1
Nombre positifs
Premi®Test
Nombre positifs
Star
Nombre positifs
4 Boites
Ensuite l’exploitation de ces données a été réalisée suivant le référentiel de validation AFNOR en
prenant la méthode des 4 Boites comme la méthode de référence.
Pour chaque niveau Li (i = 1 à 3) et chaque combinaison matrice /analyte ces résultats sont présentés
sous forme d’un tableau récapitulatif comme suit :
24/53
Etude VV
Présentation des résultats bruts des 2 méthodes.
BLANC
Résultats
Négatif (-)
Méthode
Positif (+)
Total
4B
3
2
5
Premi
Total
5
8
0
2
5
10
4B
Premi
Total
Négatif (-)
0
0
0
Résultats
Positif (+)
5
5
10
Total
5
5
10
4B
Premi
Total
Négatif (-)
0
0
0
Résultats
Positif (+)
5
5
10
Total
5
5
10
Négatif (-)
4
0
4
Résultats
Positif (+)
1
5
6
Total
5
5
10
SULFA/TETRA
Méthode
AMOXI
Méthode
TYLOSINE
Méthode
4B
Premi
Total
a. Calculs et interprétation en comparant directement la méthode des 4
boîtes et le Premitest
Couples de résultats des méthodes de référence et alternative
Réponse
Méthode
alternative
positive (A+)
négative (A-)
Total
Méthode référence (4 Boites)
positive (R+) négative (R-)
Total
11
2
4
3
13
7
15
5
20
L’exploitation des couples de résultats a permis de déterminer les paramètres suivants :
Exactitude
relative AC (%)
70,0
Spécificité
relative SP (%)
42,9
Sensibilité
relative SE (%)
84,6
Exactitude relative: AC = (PA + NA)/N*100%
Spécificité relative: SP = (NA/N-)*100%
Sensibilité relative: SE = (PA/N+)*100%
25/53
Etude VV
Où :
N = NA + PA + PD + ND : nombre total d’échantillons
N- est le nombre total d’échantillons négatifs obtenus avec la méthode de référence (NA + PD)
N+ est le nombre total d’échantillons positifs échantillons obtenus avec la méthode de
référence (PA + ND)
b. Calcul des intervalles de confiance (IC) (par rapport au nombre
d'échantillons analysés) :
Les intervalles de confiance sont calculés pour chaque pourcentage p de AC, de SE et de SP et
associés au nombre d’échantillons soumis à l’essai.
Ici 10%<p<90% :
IC 95% AC
IC 95% SE
IC 95% SP
IC 95% = p +/- 2*racine[p(1-p)/n]
avec n = N, N+, N- respectivement pour p(%) = AC, SE, SP
2*racine[p(1-p)/n]
p + 2*racine[p(1-p)/n]
p - 2*racine[p(1-p)/n]
0,20
0,90
0,50
0,20
1,05
0,65
0,37
0,80
0,05
c. Examen des résultats discordants:
On utilise le test de Mc Nemar afin d’étudier les résultats discordants et de déterminer si les méthodes
sont différentes ou non.
Nombre de résultats discordants: Y = PD + ND
Y = PD + ND
6
Donc 6<Y<22
m la + petite des valeurs PD et ND = 2
Loi binomiale
Pour n=6, M = Mmax(m) = 0 avec alpha = 0,05
Donc m>M
Donc les 2 méthodes (Premi®Test et 4 Boites) ne sont pas différentes
d. Résumé des résultats:
Les calculs sont récapitulés dans le tableau suivant :
Résumé des résultats.
PA
11
NA
3
ND
2
N
20
AC (%)
0,7
IC (%)
0,20
N+
13
SE (%)
0,846
IC (%)
0,20
N7
SP (%)
0,429
IC (%)
0,37
PD
4
26/53
Etude VV
Il faut noter que si on prend la méthode CL/SM-SM comme méthode de référence, on a lors les
résultats suivants :
Exactitude
relative AC (%)
100
Spécificité
relative SP (%)
100
Sensibilité
relative SE (%)
100
En effet, l’exactitude relative de 70% seulement entre le Premi®Test et la méthode des 4 Boites vient
des résultats faux-négatifs et faux-positifs de la méthode des 4 Boites, et non d’un problème de
sensibilité et/ou de spécificité du Premi®Test. Dans cette phase 2, les taux de faux-négatifs et de fauxpositifs du Premi®Test sont tous deux égaux à 0% (tous les échantillons « blancs » sont négatifs). Par
contre le taux de faux-positifs de la méthode des 4 Boites est de 15% et le taux de faux négatifs de
57%. Si on compare avec les résultats de la méthode STAR, le taux de faux-positifs est de 17 % et le
taux de faux négatifs de 0%.
CONCLUSION DE LA PHASE 2 :
-
Cette phase de l’étude a montré que la méthode 4 Boites et le Premi®Test donnent des résultats
concordants (« les 2 méthodes ne sont pas différentes »). Toutefois on observe que lors de cette
phase les taux de faux-négatifs et de faux-positifs (par rapport à la présence ou à l’absence
réelle de résidus d’antibiotiques dans les échantillons, mesurés via la CL/SM-SM) sont
meilleurs pour le Premi®Test que pour la méthode des 4 Boites. En effet la sensibilité de la
méthode des 4 Boites est parfois insuffisante pour certains antibiotiques.
-
Le fait d’avoir traité les animaux à l’AFSSA ainsi que l’analyse des matrices naturellement
chargées et des matrices »blanches » par CL/SM-SM permet d’être certain du contenu de ces
échantillons.
-
Enfin il faut noter que concentrations des échantillons naturellement chargés sont très supérieures
aux LMRs respectives des 4 antibiotiques (de 1.5 à 7.6 fois la LMR). Ceci est dû à des difficultés en
pratique à produire des échantillons naturellement chargés à une concentration précise.
27/53
5.2.3.
Etude VV
Cette étude a été menée en utilisant des échantillons naturellement chargés provenant «du terrain».
Elle vient compléter les 2 premières phases. 1427 échantillons ont été analysés (objectif initial =
1000) dans 6 laboratoires vétérinaires départementaux (LVD) en utilisant 2 méthodes : le
Premi®Test et une boîte avec Bacillus cereus.
Les principaux résultats au niveau de ces laboratoires sont présentés ci-dessous. Le tableau suivant
présente l’ensemble des analyses réalisées par les 6 LVD en Premi® Test et Bacillus cereus.
Résultats des analyses dans les laboratoires départementaux
Premi®Test dans les LVD
Negatifs
Douteux
Positifs
1325
36
66
Corrélation résultats LVD/AFSSA :
Premi AFSSA
Négatif
douteux
Positif
Total
douteux
13
7
16
36
Premi LVD
Négatif
positif
4
17
2
6
4
43
10
66
Total
34
15
63
112
Les tableaux ci-dessus montrent que, parmi les analyses réalisées dans les LVD, 112 échantillons sur
1427 ont été trouvés positifs (ou douteux) avec au moins une des méthodes (Premi® Test ou
Bacillus cereus)(soit 7,8%). Parmi eux, 102 échantillons ont été trouvés positifs ou douteux en
Premi®Test (soit 7,1%). Dix échantillons négatifs Premi®Test au niveau des LVD ont quand même été
analysés à l’AFSSA car ils étaient positifs en Bacillus cereus. Parmi ces 10 échantillons, 6 ont été
trouvés positifs ou douteux Premi®Test à l’AFSSA. Ensuite, la présence d’une tétracycline a été
confirmée par CL/SM-SM dans 9 de ces échantillons.
Sur les 1427 échantillons analysés en Premi®Test dans les LVD, 102 ont été trouvés positifs ou
douteux par cette méthode. Parmi ces 102 échantillons, 72 ont été retrouvés positifs ou douteux en
Premi®Test à l’AFSSA, soit une corrélation de 70%. La différence de 30 % peut être due soit à des
faux résultats positifs des LVD, soit à une dégradation des molécules entre les analyses au LVD et à
l’AFSSA, bien que les meilleures conditions de transport et de stockage aient été relativement bien
respectés et que les délais entre les analyses aient été réduits.
NB : Le taux de faux-positifs LVD a été observé principalement au début de l’étude (lors des premiers
envois). Ensuite avec l’habitude de lecture, pratiquement tous les positifs Premi®Test LVD
étaient confirmés positifs en Premi®Test à l’AFSSA.
28/53
Etude VV
1. Corrélation méthode alternative/méthode de référence (4 Boites) à l’AFSSA
a. Calculs et interprétation en ne prenant pas en compte les négatifs LVD
La comparaison directe des deux méthodes présente un biais évident qui tient au fait que tous
les échantillons négatifs en Premi®Test lors d’une première analyse dans les LVD ne sont pas
pris en compte. C’est pourquoi une deuxième étude qui intègre ces échantillons est présentée
plus loin.
Méthode référence
positive (R+) négative (R-)
7
71
positive (A+)
négative (A-)
3
31
Total
10
102
Réponse
Méthode
alternative
Total
78
34
112
Exactitude relative AC (%)
Spécificité relative SP (%)
Sensibilité relative SE (%)
33,9
30,4
70,0
Exactitude relative: AC = (PA + NA)/N*100%
Spécificité relative: SP = (NA/N-)*100%
Sensibilité relative: SE = (PA/N+)*100%
Où :
N = NA + PA + PD + ND : nombre total d’échantillons
N- est le nombre total d’échantillons négatifs obtenus avec la méthode de référence (NA + PD)
N+ est le nombre total d’échantillons positifs échantillons obtenus avec la méthode de
référence (PA + ND)
Calcul des intervalles de confiance (IC) (par rapport au nombre d'échantillons analysés) :
Les intervalles de confiance sont calculés pour chaque pourcentage p de AC, de SE et de SP et
associés au nombre d’échantillons soumis à l’essai.
10%<p<90% :
IC 95% AC
IC 95% SE
IC 95% SP
IC 95% = p +/- 2*racine[p(1-p)/n]
0,09
0,43
0,25
0,29
0,99
0,41
0,09
0,40
0,21
Examen des résultats discordants :
Examen des résultats discordants
Test de Mac Nemar (ANNEXE B)
Y = PD + ND
74 Donc Y>22
d=valeur absolue (PD-ND)
d²/Y
68
62,5
> 3,841
29/53
Etude VV
Donc les 2 méthodes sont différentes.
Résumé des résultats :
Les calculs sont résumés dans le tableau suivant :
Résumé des résultats.
PA
7
NA
31
ND
3
N
112
AC (%)
0,34
IC (%)
0,09
N+
10
SE (%)
0,70
IC (%)
0,29
N102
SP (%)
0,30
IC (%)
0,09
PD
71
30/53
Etude VV
b. Calculs et interprétation en prenant en compte les 1315 négatifs LVD
Sur les 1427 échantillons analysés en Premi®Test dans les LVD, 1325 ont été trouvés négatifs par
cette méthode. Parmi eux, 10 échantillons étaient positifs avec la boite Bacillus cereus. Ces 10
échantillons ont donc été envoyés à l’AFSSA pour confirmation. Donc 1315 échantillons négatifs
Premi®Test dans les LVD n’ont pas été envoyés à l’AFSSA pour analyse. De ce fait quand on
s’intéresse uniquement aux échantillons arrivés à l’AFSSA, on introduit un biais dans l’analyse
statistique des résultats puisqu’on élimine 1315 échantillons qui auraient de façon quasi-certaine été
négatifs aussi en méthode des 4 Boites.
En effet si on regarde les résultats de notre étude 2005 à l’AFSSA, tous les échantillons négatifs
Premi®Test et négatifs Bacillus cereus à l’AFSSA étaient aussi tous négatifs en méthode des 4 Boites,
soit 28 échantillons. Seuls les échantillons négatifs Premi®Test et positifs Bacillus cereus dans les LVD
(10 échantillons) ont été positifs en méthode des 4 Boites (3 échantillons sur 10).
Combinaison Premi®Test/Bacillus cereus comparée à la méthode des 4 Boites.
Douteux
Premi
Valeur en
AFSSA Bacillus cereus Total
Bacillus
cereus pH
6
0
3
4,5
1-Neg
11
11
4bte
1
1
2
AFSSA 2-Dou
3-Pos
1
1
2
Total
13
1
1 15
Négatifs
Positifs
Valeur en Bacillus
cereus
Total
Total Total
Valeur en Bacillus cereus
0
20
8
28
2,25 3 3,25 4,25 6
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
7
1
1
21
10
3
34
0 1,25 2,25 3 4
44 1
12
1
2
1 1 1
58 1
2 1 1
Etant donné ces résultats, on peut émettre l’hypothèse que tous les échantillons négatifs dans les
LVD aussi bien en Premi®Test que sur Bacillus cereus auraient aussi été négatifs en 4 Boites.
Si on prend en compte ces 1315 échantillons négatifs Premi®Test et présumés négatifs en 4 Boites en
les intégrant dans l’étude comparative, on obtient le tableau suivant :
31/53
45
13
5
63
77
25
10
112
Etude VV
Méthode référence
Réponse positive (R+) négative (R-)
Total
7
71
78
positive (A+)
Méthode
négative (A-)
3
1346
1349
alternative
Total
10
1417
1427
Exactitude relative AC (%)
94,8
Spécificité relative SP (%)
95,0
Sensibilité relative SE (%)
70,0
Intervalles de confiance (IC)
IC 95% = p +/- 2*racine[p(1-p)/n]
10%<p<90% :
IC 95% SE
0,29
0,99
0,41
p>90% :
Low Confidence Limit LCL
LCL
0,85
IC 95% AC
LCL
0,93
IC 95% SP
Examen des résultats discordants
Test de Mac Nemar (ANNEXE B)
Y = PD + ND
74
Donc Y>22
d=valeur absolue (PD-ND)
68
d²/Y
62,5
> 3,841
Donc les 2 méthodes sont différentes
Résumé des résultats
PA
7
NA
1346
ND
3
N
1427
AC (%)
0,95
LCL
0,85
N+
10
SE (%)
0,70
IC (%)
0,29
N1417
SP (%)
0,95
LCL
0,93
PD
71
32/53
Etude VV
En conclusion la concordance (exactitude relative) entre les résultats du Premi®Test et de la méthode
des 4 Boites est très satisfaisante si on inclue tous les échantillons du panel.
Si les 2 méthodes sont déclarées différentes après un test statistique, c’est en raison d’un taux élevé de
déviation positive (Premi®Test +/4 Boites -) qui est du au manque de sensibilité de la méthode de
référence vis à vis d’un certain nombre d’antibiotiques.
33/53
Etude VV
2. Comparaison méthode alternative (PremiTest) /méthode de référence (4 Boites) à
l’AFSSA pour les échantillons retrouvés positifs avec la méthode CL/SM-SM à l’AFSSA
Les résultats présentés dans les tableaux des pages suivantes concernent les échantillons pour
lesquels une molécule a été identifiée en CL/SM-SM lors de l’étude 2005 à la date de présentation
des résultats (20 cas), parmi ceux-ci :
o Pour le Premi®Test : 11 étaient positifs, 5 douteux et 4 négatifs.
o Pour la méthode des 4 boîtes : 8 étaient positifs, 4 douteux et 8 négatifs.
Si on cumule cette étude avec les résultats d’une étude précédente (réalisée en 2003-2004) (57 cas),
on obtient les résultats suivants :
o Pour le Premi®Test : 39 positifs, 7 douteux et 11 négatifs.
o Pour la méthode des 4 boîtes : 37 positifs, 8 douteux et 12 négatifs.
Au bilan on constate que, sur l’ensemble des échantillons pour lesquels une molécule a pu être
identifiée, grâce à la méthode CL/SM-SM, le pourcentage d’échantillons positifs en Premi®Test est
comparable à celui des positifs en méthode des 4 boîtes. Toutefois, les molécules retrouvées ne sont
pas exactement les mêmes : meilleure détection des Bétalactames ou des Sulfamides pour le
Premi®Test, meilleure détection de certaines tétracyclines pour la méthode des 4 boîtes.
34/53
Etude VV
Résultats provenant des échantillons analysés en 2005
Molécule
Seuil
N
<LMR
Beta-lactames
<LMR
4
>LMR
1
Total
5
<LMR
Sulfamides
D
P
Total
N
1
6
7
7
3
3
1
1
1
3
1
9
10
8
1
1
10
3
4
11
3
3
5
11
1
1
6
12
>LMR
Total
Tetracyclines
4BT
Premi®Test
D
4
Total
7
1
3
P
12
3
3
1
1
1
1
1
1
1
1
>LMR
Total
<LMR
Quinolones
>LMR
Total
<LMR
Beta + Sulfa
Tetra + Sulfa
Tetra + Beta
>LMR
1
1
1
1
Total
1
1
1
1
<LMR
1
1
1
1
Total
1
1
1
1
<LMR
1
1
1
1
1
1
1
1
>LMR
>LMR
Total
<LMR
Macrolides
1
1
1
1
1
1
1
>LMR
Total
Global
1
<LMR
4
6
12
22
12
3
8
23
>LMR
1
0
4
5
1
2
1
4
Total
5
6
16
27
13
5
9
27
35/53
Etude VV
Résultats provenant des échantillons analysés en 2003 et 2004
Molécule
Seuil
N
Beta-lactames
Tetracyclines
Sulfamides
4BT
Premi®Test
D
P
Total
<LMR
2
2
>LMR
5
5
Total
7
7
N
D
P
Total
1
1
2
5
5
6
7
1
<LMR
1
1
0
2
2
2
>LMR
4
1
6
11
11
11
Total
5
2
6
13
13
13
<LMR
1
1
>LMR
2
2
Total
3
3
1
1
1
1
2
1
2
3
<LMR
Quinolones
Beta + Sulfa
>LMR
1
2
3
3
3
Total
1
2
3
3
3
<LMR
2
2
1
2
>LMR
1
1
1
Total
3
3
1
1
1
1
1
<LMR
Tetra + Sulfa
3
1
>LMR
3
3
3
3
Total
3
3
3
3
1
2
1
1
2
3
3
1
2
3
4
5
2
3
5
<LMR
Tetra + Beta
>LMR
Total
<LMR
Macrolides
Global
1
>LMR
Total
1
<LMR
2
1
6
9
1
3
5
9
>LMR
5
1
22
28
3
1
24
28
Total
7
2
28
37
4
4
29
37
36/53
Etude VV
Cumul des échantillons analysés de 2003 à 2005 (compilation des 2 études)
Molécule
Seuil
N
<LMR
Beta-lactames
P
Total
N
D
P
Total
1
8
9
7
1
1
9
8
8
1
1
6
8
1
16
17
8
2
7
17
3
3
8
14
11
11
19
25
<LMR
5
4
4
13
>LMR
5
1
6
12
10
5
10
25
3
3
1
1
2
1
1
2
2
2
1
1
2
3
4
2
2
4
1
2
3
3
3
1
2
3
3
3
<LMR
2
2
1
2
>LMR
2
2
1
1
4
4
1
2
<LMR
1
>LMR
Total
<LMR
Sulfamides
D
>LMR
Total
Tetracyclines
4BT
Premi®Test
>LMR
1
Total
<LMR
Quinolones
>LMR
Total
Beta + Sulfa
Total
Tetra + Sulfa
Total
<LMR
Tetra + Beta
<LMR
1
1
>LMR
1
4
1
1
1
3
3
3
3
4
4
4
4
1
1
1
1
1
1
1
1
1
3
1
2
3
3
3
1
2
3
4
6
1
1
4
6
2
<LMR
6
7
18
31
13
6
13
32
>LMR
6
1
26
33
4
3
25
32
12
8
44
64
17
9
38
64
Total
Global
2
>LMR
Total
Macrolides
1
Total
37/53
Etude VV
3. Résultats des données en fonction de l’espèce
Cette phase 3 de l’étude a permis de travailler sur de très nombreuses espèces et ainsi de renforcer les
résultats des phases 1 et 2 qui étaient basées uniquement sur du muscle de porc.
Les échantillons positifs avec au moins une des méthodes microbiologiques (Premi®Test, 4 Boîtes ou
méthode européenne STAR) ont été analysés en CL/SM-SM. Les résultats détaillés des confirmations par
CL/SM-SM par espèce sont présentés en annexes 8 à 10.
Le tableau suivant résume les résultats obtenus au niveau des LVD, puis à l’AFSSA avec le
Premi®Test, la méthode des 4 Boites, la méthode STAR et la méthode de confirmation par CL/SM-SM.
Répartition par espèce
Espèce
Bovin
Porc
Volaille
Autres
Inconnu
379
671
205
26
146
63
26
1
5
7
65
31
4
5
7
45
19
2
5
7
3
5
2
0
0
Nb échantillons positifs STAR
13
13
4
0
2
Nb échantillons testés
38
18
4
1
0
14
8
3
0
0
Nombre échantillons analysés
au LVD
LVD
Nombre positifs et douteux
LVD Premi®Test
Nombre échantillons analysés
à l’AFSSA
Nb échantillons positifs et
AFSSA
douteux Premi®Test
Nb Echantillons positifs 4
Boîtes
AFSSA
CL/SMSM
Nb échantillons positifs
(molécule identifiée)
On observe le manque de sensibilité de la méthode des 4 Boites vis à vis d’un certain nombre d’antibiotiques,
puisque le nombre de positifs 4 Boites est bien inférieur au nombre de positifs CL/SM-SM (molécule
identifiée). Par contre la meilleure sensibilité du Premi®Test permet de détecter plus de vrais-positifs qu’avec
la méthode des 4 Boites.
Toutefois, pour une partie des échantillons positifs en Premi®Test analysés ensuite en CL/SM-SM,
aucun résidu d’antibiotique n’a été retrouvé. On ne peut toutefois être certains qu’il s’agisse de « fauxpositifs » pour 2 raisons principales :
-
soit un problème d’instabilité des molécules contenues initialement dans l’échantillon (stockage
ou transport, délai avant l’analyse en CL/SM-SM trop long, molécules très instables….),
38/53
-
Etude VV
soit la présence dans l’échantillon d’antibiotiques qui ne sont pas contenus dans le spectre de
détection de la méthode CL/SM-SM ou pour lesquels la sensibilité est insuffisante.
Le Premi®Test a été utilisé, au niveau des LVD comme au niveau de l’AFSSA, sur des jus provenant de
toutes les espèces. Les conditions de mise en œuvre ne diffèrent pas entre les espèces. Les études
bibliographiques (voir précédemment) ne font pas état de différence importante concernant les seuils de
détection.
Ces données vont permettre d’étendre la validation du Premi®Test du muscle de porc aux muscles de
bovin et de volaille.
CONCLUSIONS DE LA PHASE 3 :
-
Lors de cette phase 3, les taux de faux-positifs de la méthode des 4 Boites et du Premi®Test sont
respectivement de 1% et de 30%. Par contre les taux de faux-négatifs de la méthode des 4 Boites et
du Premi®Test sont respectivement égaux à 16 et 4%. Si on compare avec les résultats de la
méthode STAR, le taux de faux-positifs est de 10 % et le taux de faux négatifs de 6%.
-
Cette phase de l’étude a donc montré que la méthode des 4 Boites et le Premi®Test donnent des
résultats différents (« les 2 méthodes sont différentes »). Toutefois, comme dans la phase 2, on
observe que les taux de faux-négatifs sont meilleurs pour le Premi®Test que pour la méthode des 4
Boites, sachant que c’est le paramètre à minimiser pour une méthode de dépistage. En effet, la
sensibilité de la méthode des 4 Boites est parfois insuffisante pour certains antibiotiques, ce qui
explique aussi qu’elle donne moins de résultats faux-positifs que le Premi®Test.
-
Il faut noter que, contrairement à la phase 2, ici nous ne sommes pas certains du contenu des
échantillons. Ce sont les résultats de CL/SM-SM qui sont considérés comme la réalité du contenu des
échantillons. Toutefois, pour les raisons évoquées précédemment (instabilité, problèmes liés à la
CL/SM-SM), on ne peut garantir que les résultats de CL/SM-SM représentent la réalité.
-
Le Premi®Test est applicable aux muscles de différentes espèces (porcins, bovins, volaille, ovin,
lapin, …), à la condition de tester chaque fois un jus témoin négatif de chaque espèce à analyser.
39/53
Etude VV
6. Conclusions
-
Les 3 phases de cette étude de validation AFNOR du Premi®Test ont permis de réunir une grande
somme de données et de résultats sur les performances du Premi®Test dans un 1er temps, mais aussi
sur les performances comparées du Premi®Test et de la méthode des 4 Boites.
-
En conclusion , le Premi®Test est applicable aux muscles de différentes espèces (porcin, bovin,
ovin, …) en utilisant comme témoin négatif un muscle »blanc » de l’espèce analysée.
-
La méthode des 4 Boites (prise comme méthode de référence) et le Premi®Test ont des
performances comparables en terme de sensibilité et de spécificité lorsqu’on prend des échantillons
non biaisés. Il y a par contre une différence si l’on ne prend en compte que des échantillons déjà
sélectionnés par screening avec le Premi®Test.
-
Le taux de faux-négatifs du Premi®Test a toujours été inférieur à celui de la méthode des 4 Boites.
C’est ce taux qui doit être minimal pour une méthode de dépistage des résidus d’antibiotiques.
-
A l’inverse le taux de faux-positifs du Premi®Test s’est révélé, dans la phase 3, plus élevé que
celui de la méthode des 4 Boites. Ceci ne remet pas en cause les performances de la méthode mais
incite d’une part à améliorer la méthode de confirmation (CL/SM-SM) afin de retrouver une plus large
palette d’antibiotiques, d’autre part un éventuel surcoût lié à la nécessité de confirmer les positifs par
CL/SM-SM.
40/53
Etude VV
7. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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TNO-report V49933 (1); October 2002.
[2] C. ARTS, E. GEIJP, J. STARK, R. WITKAMP Premi®Test: a broad spectrum screening test for
detection of antimicrobial compounds in meat, organs and urine. Symposium book Euroresidue IV (mei
2000, Veldhoven): 186 - 192. (2000).
[3] C.J.M. ARTS, R.F. WITKAMP. The Premi®Test for screening for residues of antimicrobial
compounds in meat, organs and urine. TNO report V99.1031.
[4] S. BEVERLEY, M. SHARMAN, J. TARBIN, J. STARK, E. GEIJP Improvements to the screening of
antimicrobial drug residues in food by the use of the Premi®Test. Veterinary Science (Supplement A),
V70: 138. (2001).
[5] S. BEVERLEY, M. SHARMAN Improvement to the screening of antimicrobial drug residues in food
by the use of Premi®Test. Research in Veterinary Science: Vol. 70; April 2001.
[6] BOGAERTS, R; WOLF, F. (1980) A standardized method for the detection of residues of
antibacterial substances in fresh meat, Die Fleischwirtschaft, 60, 672-674
[7] JM. FABRE, C. MIRCOVICH, E. GEIJP Antibiotic residues in pork and poultry meat in France: the
current situation and an evaluation of a new screening test. (On request) Bulletins des GTV,
January/February 2004.
[8] JM. FABRE. Des Méthodes de recherche d'antibiotiques dans la viande se développent en France.
La Semaine Vétérinaire, July 2003.
[9] JM. FABRE. Recherche des résidus d'antibiotiques dans la viande: De nouvelles méthodes pour de
nouveaux besoins. La Semaine Vétérinaire, July 2003
[10] E. GEIJP, F. DE BRUIJN, F. DE GOEIJEN, J. STARK Determination of residues in spiked samples
and incured tissue using the Premi®Test. III International Fundisa Seminar on Food Safety in Madrid,
Spain October 2003..
[11] E. GEIJP, P. LANGEVELD, J. STARK Premi®Test, a standard diffusion test for the detection of
antibacterial substances in meat. Abstract book "Third International Symposium of Hormone and
Veterinary Drug Residue Analysis, Brugge". (1998).
[12] E. GEIJP, F. DE BRUIJN, J. STARK Premi®Test, broad spectrum screening test for the detection
of antibacterial compounds in meat. Symposium Lebensmittel-mittel zum leben, 8 - 10 April in Münster,
Germany. (2002).
41/53
Etude VV
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[14] H. OFFEREINS, I. ENGELEN Premi®Test for screening for antimicrobial substances in fish fillets.
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[15] P. POPELKA, J. NAGY, PA. POPELKA, S. MARCINCAK, P. JEVINOVA, K. HUSSEIN.
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administration of Amuril plv.sol. The University of Veterinary Medicine, Kosice, The Slovak
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[16] P. POPELKA, J. NAGY, R. GERMUSKA, S. MARCINCAK, P. JEVINOVA, A. DE RIJK. Comparison
of various assays used for detection of beta-lactam antibiotics in poultry meat. Food Additives and
Contaminants, June 2005.
[17] W. REYBROEK. Performance of the Premi®Test using naturally contaminated meat. Poster
presented at EuroResidue IV, Veldhoven, the Netherlands, 8-10 May 2000.
[18] W. REYBROEK Detection of residues of antibiotics in foodstuffs with microbiological tests using
bacillus. Poster presented at Bacillus 2000, Brugge, Belgium, 30-31 August, 2000..
[19] V. ROBERTSON. Meat Market Review January 2003.Commissioned by Hill and Knowlton. Written
and compiled.
[20] J. STARK Antibiotic residues in food products. Antibiotic today, Supplement of Chimica Oggi
Chemistry Today: 33 - 36. (2000).
[21] S. STEAD, M. SHARMAN, J.A. TARBIN, E. GIBSON, S. RICHMOND, J. STARK, E. GEIJP.
Meeting maximum residue limits: an improved screening technique for the rapid detection of
antimicrobial residues in animal food products. Food Additives and Contaminants, March 2004, 21 (3),
216-221.
[22] S. L. STEAD, M. SHARMAN Improvements to the Screening of Antimicrobial Drug Residues in
Food by the use of the Premi®Test. Poster at Residues Analysis Conference in Antwerp June 2002.
[23] H. CANTWELL & M. O’KEEFFE. Evaluation of the Premi®Test and comparison with the One Plate
Test for the detection of antimicrobials in kidney. Food Additives and Contaminants, February 2006, 23
(2), 120-125
42/53
Etude VV
8. Annexes
43/53
Etude VV
ANNEXE 1. PHASE 1 et spécificité : Codification aléatoire des 90 échantillons de la phase 1 + les 2*20 échantillons de l'étude de spécificité
Répétitions
1
2
3
4
5
50
49
9
73
41
13
Sulfadimérazine
100
92
104
22
55
43
Répétitions
1
2
3
4
5
25
18
38
8
122
10
Amoxicilline
50
107
112
27
82
39
100
124
127
64
129
121
25
46
47
40
84
77
Gentamycine
50
117
65
5
101
123
100
3
42
74
25
12
100
115
36
81
118
17
Ceftiofur
200
90
35
30
111
91
400
69
76
67
102
2
Répétitions
1
2
Blanc 1
114
11
Blanc 2
19
57
Blanc 3
26
37
Blanc 4
60
105
Blanc 5
125
54
Blanc 6
97
66
Blanc 7
108
86
Blanc 8
96
6
Blanc 9
100
20
Blanc 10
89
56
Répétitions
1
2
Blanc 11
15
88
Blanc 12
103
33
Blanc 13
4
28
Blanc 14
48
63
Blanc 15
16
71
Blanc 16
113
93
Blanc 17
58
87
Blanc 18
7
14
Blanc 19
99
78
Blanc 20
110
62
200
119
106
34
61
72
50
59
94
31
85
53
Oxytétracycline
100
120
51
23
109
44
200
130
70
21
80
1
50
79
50
24
128
52
Tylosine
100
98
95
32
45
75
200
126
68
29
116
83
D:\Documents and Settings\c.marcault\Local Settings\Temporary Internet Files\OLKB\Rapport_Etude_préliminaire-090206.doc
44/53
Etude VV
ANNEXE 2. Origine des 20 porcs blancs utilisés pour l'étude de spécificité (PHASE 1)
Blanc 1
Blanc 2
Blanc 3
Blanc 4
Blanc 5
N° lot
Lot 53
Lot 62V
Lot 86
Lot 39
Lot 62V
Origine lot
Champion
Champion
Champion
Champion
Champion
Date réception
Pressage le
05/04/2005 23/09/2005 12/12/2005 04/03/2004 23/09/2005
03/10/2005 26/09/2005 06/01/2006 03/10/2005 26/09/2005
Blanc 6
Blanc 7
Blanc 8
Blanc 9
Blanc 10
N° lot
Lot 62V
Lot 69
Lot 86
Lot 62V
Lot 39
Origine lot
Champion
Carrefour
Champion
Champion
Champion
Date réception
23/09/2005 04/10/2005 12/12/2005 23/09/2005 04/03/2004
26/09/2005 10/10/2005
06/01/2006 26/09/2005 03/10/2005
Blanc 11
Blanc 12
Blanc 13
Blanc 14
Blanc 15
N° lot
Lot 86
Lot 69
Lot 69
Lot 69
Lot 86
Origine lot
Champion
Carrefour
Carrefour
Carrefour
Champion
Pressage le
Date réception
12/12/2005 04/10/2005 04/10/2005 04/10/2005 12/12/2005
06/01/2006 10/10/2005 10/10/2005 10/10/2005
06/01/2006
Blanc 16
Blanc 17
Blanc 18
Blanc 19
Blanc 20
N° lot
Lot 342
Lot 62V
Lot 86
Lot 39
Lot 69
Origine lot
Champion
Champion
Champion
Champion
Carrefour
Pressage le
Date réception
05/07/2005 23/09/2005 12/12/2005 04/03/2004 04/10/2005
Pressage le
03/10/2005 26/09/2005 06/01/2006 03/10/2005 10/10/2005
Date analyse : 29 et 30/09/05
Bc 6
0
Lot 53
0
Lot 342
0
Lot 39
0
Lot 62V
Date analyse : 06 et 07/10/05
Bc 6
0
Lot 69
184
Bs 8
0
0
0
0
Série :
Kv 8
0
0
0
0,25
Série :
Kv 8
0
185
Bs 8
0
Date analyse : 06/01/2006
Lot muscle 86
Lot :
Premi Test : négatif
Validité :
Ec 8
0
0
0
0
Bst
0
2,75
0
0
Ec 8
0
Bst
0
05I26/16
March2006
45/53
Etude VV
ANNEXE 3. PHASE 1 et spécificité : Résultats du Premi® Test
Répétitions
1
2
3
4
5
50
DDD-
Sulfadimérazine
100
DDD+
D-
200
+
+
D+
+
D+
50
D+
DD+
D+
Oxytétracycline
100
+
+
D+
D+
-
200
+
+
+
+
+
50
D+
D+
+
+
Tylosine
100
++
++
++
+
++
200
++
++
++
++
++
Répétitions
1
2
3
4
5
25
++
+
++
++
++
Amoxicilline
50
++
++
++
++
+
100
++
++
++
++
++
50
DDDD-
Gentamycine
100
D+
+
D-
200
D+
DD+
DD+
100
DDD+
D+
Ceftiofur
200
DDD+
-
400
+
++
+
D+
D+
Répétitions
1
2
Blanc 1
-
Blanc 2
DD+
Blanc 3
DD-
Blanc 4
D-
Blanc 5
DD+
Blanc 6
DD-
Blanc 7
-
Blanc 8
-
Blanc 9
D-
Blanc 10
DD-
Répétitions
1
2
Blanc 11
DD+
Blanc 12
-
Blanc 13
-
Blanc 14
-
Blanc 15
D-
Blanc 16
D+
+
Blanc 17
DD+
Blanc 18
D-
Blanc 19
-
Blanc 20
-
46/53
Etude VV
ANNEXE 4 PHASE 2 : Codification aléatoire des échantillons de la phase 2
Répétitions
1
2
3
4
5
Blanc
147
140
133
148
146
Matériau
SULFA/TETRA
TYLO
135
138
141
132
136
150
145
143
131
149
AMOXI
142
134
144
137
139
47/53
Etude VV
ANNEXE 5. PHASE 2 : Résultats du Premi Test
Jour 1
Jour 2
Date analyse
24/01/2006
26/01/2006
Codes échantillons
131 à 144
145 à 155
Lot Premi Test
05K02/16
05K02/16
Validité Premi Test
April2006
April2006
Durée incubation
2H40
2H50
Résultat Témoin -
-
-
Résultat Témoin +
++
++
PREMI
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
+
++
++
Molécule
SULFA/TETRA
TYLO
Blanc 1
AMOXI
SULFA/TETRA
SULFA/TETRA
AMOXI
TYLO
AMOXI
Blanc 1
SULFA/TETRA
AMOXI
TYLO
AMOXI
SULFA/TETRA
Blanc 1
Blanc 1
Blanc 1
TYLO
TYLO
RESULTATS PREMI TEST
Codes
131
132
133
134
135
136
137
138
139
140
141
142
143
144
145
146
147
148
149
150
48/53
Etude VV
ANNEXE 6. PHASE 2 : Résultats de la méthode de référence (4 Boites)
Date analyse :
23 au 24/01/06
B. subtilis B. subtilis pH
Code
pH 6
7,4.
131
132
133
134
135
136
137
138
139
140
141
142
143
144
145
146
147
148
149
150
4,5/5
0/0
0/0
5/5
4,5/5
2/2
6/6
0/0
5,5/5
0/0
4,5/5
6/6
0/0
5/5,5
5/5
0/0
0/0
0/0
0/0
0/0
2/2,5
0/0
0/0
3,5/3,5
3/3
1,5/1,5
4,5/5
0/0
4/4,5
0/0
4/4
4/4
0/0
3,5/4
3/3
0/0
0/0
0/0
0/0
0/0
Série :
623b
B. subtilis M. luteus pH 8. Absence/présence
pH 8
3/3
0/0
0/0
4,5/5
3/3,5
1/1
6/6
0/0
5/5
0/0
4/4
5/5
0/0
4/4
4/4
0/0
0/0
0/0
0/0
0/0
2/2
1/1
1/1
12/12
2,5/2,5
0/0
11/11
1/1
11,5/12
2/2
1,5/1,5
11/11
1/1,5
11/11
3/3
2/2
1/1
1/1
1,5/1
2/2,5
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Code
Molécule
131
132
133
134
135
136
137
138
139
140
141
142
143
144
145
146
147
148
149
150
SULFA/TETRA
TYLO
Blanc 1
AMOXI
SULFA/TETRA
SULFA/TETRA
AMOXI
TYLO
AMOXI
Blanc 1
SULFA/TETRA
AMOXI
TYLO
AMOXI
SULFA/TETRA
Blanc 1
Blanc 1
Blanc 1
TYLO
TYLO
49/53
Etude VV
ANNEXE 7. PHASE 3 : Saisie des résultats du Premi Test par AR au fur et à mesure des analyses
Laboratoire
(code département)
(*) : PS = Plan de Surveillance DGAL / S = Saisie abattoir / Autre préciser
(**) : Positif / Douteux / Négatif
(***) : zone d'inhibition en mm : 1,5 / 2 / 3,5... / si pas d'inhibition mettre 0
48
N° prélèvement
Département (code)
Origine du prélèvement
156
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
Résultat
Espèce :
Date de
Date de
Code
Age de
Durée de
réalisation du (ov, bv,
réalisation conservation
échantillon
l'animal si
Origine
Pièce
prélèvement cp, pc,
de
si connue laboratoire
connu
anatomique si de l'analyse
dinde,
si connue
l'échantillon
(format :
(si nécessaire
(préciser
(*)
connue
poulet,
(format :
jj/mm//aa) avant analyse
pour le labo)
unité)
jj/mm//aa) canard…)
PS
050905 In 54
13/07/2005
bv
5 ans
12/09/2005
N° Lot de
PremiTest
utilisé
Résultat
Premitest
(**)
61
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Envoi AFSSA
Résultats
n°
de la boîte
identification
Bacillus Date d'envoi échantillon
cereus (en
envoyé à
mm)
l'AFSSA
14/09/2005
50/53
48-09-342
Etude VV
ANNEXE 8. PHASE 3 : Résultats du Premi®Test à l’AFSSA en fonction de l’espèce animale.
Espèce simplifiée
Premi
AFSSA
douteux
Somme
douteux
Négatif
Somme
Négatif
Positif
Somme
Positif
Total
M1
Absence
Chlortétracycline
Doxycycline
Oxytetracycline
Sulfadiméthoxine
suspiscion ancien traitement
erytromicine
Autres
1
Porc Volaille Total
1
1
7
1
1
1
1
1
1
1
1
7
4
Absence
Chlortétracycline
Doxycycline
Oxytétracycline
Pas confirmé
Absence
Amoxicilline
Chlortétracycline
Doxycycline
Oxytetracycline
Oxytétracycline
Pénicilline G
Tétracycline
Traces de pénicilline G
Bovin
5
1
4
1
1
2
1
5
1
9
15
1
1
1
1
1
1
1
1
1
22
38
2
9
1
1
2
1
1
12
18
1
4
12
4
1
2
1
5
13
25
2
1
1
1
2
2
1
1
36
61
51/53
Etude VV
ANNEXE 9. PHASE 3 : Résultats de la méthode des 4 Boites à l’AFSSA en fonction de l’espèce
animale.
4bte AFSSA
1-Neg
Somme 1Neg
2-Dou
Somme 2Dou
3-Pos
Somme 3-Pos
Total
Espèce
simplifiée
M1
Autres Bovin Porc Volaille Total
Absence
1
20
6
1
28
Amoxicilline
1
1
2
Oxytetracycline
2
2
Oxytétracycline
1
1
Pas confirmé
5
5
Pénicilline G
1
1
Sulfadiméthoxine
1
1
1
1
1
Absence
Doxycycline
Pénicilline G
Absence
Chlortétracycline
Doxycycline
Oxytétracycline
suspiscion ancien
traitement erytromicine
Tétracycline
30
4
1
1
9
3
1
1
6
4
1
3
1
1
1
1
1
2
38
5
18
1
41
7
3
1
1
1
11
1
3
1
2
2
4
1
1
9
61
52/53
Etude VV
ANNEXE 10. PHASE 3 : Résultats de la méthode STAR à l’AFSSA en fonction de l’espèce
animale.
STAR
1-Neg
Somme 1Neg
2-Dou
Somme 2Dou
3-Pos4
Somme 3Pos4
3-PosBst
Somme 3PosBst
Total
M1
Absence
Oxytetracycline
Oxytétracycline
Pénicilline G
Autres
1
1
Absence
Pas confirmé
Pénicilline G
Sulfadiméthoxine
Espèce simplifiée
Bovin Porc Volaille Total
10
1
12
2
2
1
1
1
1
13
9
5
1
2
4
16
13
5
1
1
1
15
1
Absence
Chlortétracycline
Doxycycline
Oxytétracycline
suspiscion ancien
traitement erytromicine
Tétracycline
1
5
3
1
1
2
1
1
1
Absence
Amoxicilline
1
20
1
3
4
2
1
1
4
4
1
1
5
5
1
3
1
12
10
2
1
6
38
6
18
1
4
13
61
53/53
Rapport de l’étude collaborative Premi Test
Etude WI
LABORATOIRE D'ETUDES ET DE RECHERCHES SUR LES
MEDICAMENTS VETERINAIRES ET LES DESINFECTANTS
LABORATOIRE COMMUNAUTAIRE DE REFERENCE
B.P.90203 - 35302 FOUGERES Cédex
La Haute-Marche - JAVENE - 35133 FOUGERES (France)
Tél: 33 2 99 94 78 78
Fax: 33 2 99 94 78 99
E-mail: [email protected]
Validation AFNOR des méthodes alternatives
d’analyse – Application à la détection des résidus
d’antibiotiques et autres molécules à effet
antibactérien dans les produits agroalimentaires
Rapport d’étude collaborative pour la validation
AFNOR du Premi®Test
Code d’étude : WI
Mai 2006
Rapport rédigé par V. Gaudin (AFSSA Fougères)
Avec la collaboration technique de C. Hédou, A. de Courville et A. Rault (AFSSA Fougères)
1
Etude WI
RESUME
Il s’agit d’une demande de validation AFNOR du kit Premi®Test, qui permet de détecter un grand
nombre d’antibiotiques couramment utilisés pour le muscle en moins de 4 heures, sur du jus de
viande. Le champ de cette validation est la viande de porc, avec une extension à la viande de bovin et
de volaille. L’objet de ce document est de présenter les résultats de l’étude collaborative.
MATERIAUX:
Après la présentation au Bureau Technique du projet d’étude collaborative, un des matériaux porc a
été remplacé par de la volaille (poulet) et un 4e antibiotique (Tylosine) a été ajouté. Le choix des
concentrations a été fait à partir des Limites Maximales de Résidus et des résultats de la phase 1 de
l‘étude préliminaire.
Porc
Bœuf
Porc
Poulet
Antibiotique
Oxytetracycline
Sulfadimerazine
Ceftiofur
Tylosine
LMR
100
100
200
100
‘Blanc’
‘Blanc’
‘Blanc’
‘Blanc’
Concentrations
20
20
40
10
choisies (µg/kg)
200
200
400
100
400
400
800
200
Chaque matériau a été préparé, codifié et envoyé en double aveugle, soit 32 échantillons à
analyser par laboratoire. En plus des échantillons, l’AFSSA a préparé et fourni à tous les laboratoires
collaborateurs 3 témoins négatifs (porc, bœuf, poulet) et un témoin positif bœuf (contenant de la
pénicilline G à 10 µg/kg). Les laboratoires participants devaient réaliser les analyses en double
aveugle (2 séries distinctes d’analyses).
RESULTATS :
Les résultats du laboratoire expert sont très satisfaisants :
•
14 échantillons blancs sur 16 sont bien négatifs ;
•
En dessous du seuil de détection supposé 14 échantillons sur 16 sont négatifs ;
•
Au seuil de détection supposé tous les échantillons sont positifs ;
•
En dessus du seuil de détection supposé tous les échantillons sont positifs.
Les résultats des laboratoires participants ont été analysés afin de déterminer différents paramètres
de validation. Un laboratoire a été éliminé de l’analyse en raison d’un délai de transport trop long et
d’une décongélation des échantillons. La spécificité (95,3 %) et la sensibilité au niveau L3 (72,5 %)
sont très satisfaisantes. Les résultats des laboratoires participants en terme de répétabilité et de
reproductibilité sont très satisfaisants, avec respectivement un pourcentage moyen de 94,8% pour un
même échantillon et de 92,7 % pour 2 échantillons identiques (paire) en répétabilité et un pourcentage
moyen de 89,1 en reproductibilité.
2
Etude WI
SOMMAIRE
1.
Objectifs ______________________________________________________________ 4
2.
Présentation de la méthode alternative ______________________________________ 4
3.
Planning de l’étude _____________________________________________________ 5
4.
Préparation et envoi des matériaux _________________________________________ 5
5.
6.
4.1.
Préparation des matériaux ___________________________________________ 5
4.2
Stabilité___________________________________________________________ 6
4.3.
Codification des échantillons _________________________________________ 6
4.4.
Laboratoires collaborateurs __________________________________________ 6
Résultats ______________________________________________________________ 7
5.1.
Résultats du laboratoire expert _______________________________________ 7
5.2.
Résultats des laboratoires participants _________________________________ 9
Analyse des résultats ____________________________________________________ 9
6.1.
Pourcentage de résultats positifs ______________________________________ 9
6.2.
Répétabilité des résultats ___________________________________________ 12
6.3.
Reproductibilité___________________________________________________ 15
7.
Conclusions __________________________________________________________ 15
8.
Annexes______________________________________________________________ 17
3
Etude WI
1. Objectifs
Il s’agit d’une demande de validation AFNOR du kit Premi®Test qui est commercialisé pour la
détection des résidus d’antibiotiques dans le muscle. Le champ de cette validation est la viande de
porc, avec une extension à la viande de bovin et de volaille.
L’étude préliminaire est maintenant terminée et l’analyse des résultats a été présentée et acceptée.
L’objet de ce document est donc de présenter les résultats de l’étude collaborative.
L’objectif de l’étude collaborative est de déterminer la variabilité des résultats obtenus avec la
méthode alternative dans différents laboratoires utilisant des échantillons identiques.
2. Présentation de la méthode alternative
Le Premi®Test permet de détecter les substances antimicrobiennes présentes dans la viande fraîche,
la charcuterie, les reins, le poisson et les œufs. C’est un test à large spectre, qui permet de détecter
un grand nombre d’antibiotiques couramment utilisés pour la viande en moins de 4 heures, sur du jus
de viande (extrait par pressage d’un morceau de viande).
PRINCIPE
Le Premi®Test est basé sur l’inhibition de la croissance du Bacillus stearothermophilus, bactérie très
sensible à de nombreux antibiotiques et aux sulfamides. Des spores standardisées sont inclues dans
de la gélose additionnée de nutriments sélectionnés.
METHODE
Le Premi Test est d’une utilisation simple. Le jus de viande est déposé dans des tubes contenant la
gélose au sein de laquelle se trouvent les spores de Bacillus stearothermophilus. Après 20 minutes de
diffusion puis élimination du jus et préchauffage de l’incubateur pendant 20 minutes, il faut incuber le
tube pendant environ 3 heures à 64°C et vérifier la couleur.
La lecture du résultat « oui/non » se limite à une comparaison de couleurs. En l’absence
d’antibiotiques, les spores germent et se développent, entraînant l’acidification du milieu et un
changement de couleur. Si l’échantillon vire nettement du violet au jaune, cela signifie que la quantité
de composés antimicrobiens se situe en deçà des limites de détection du Premi®Test. Inversement,
en présence d’antibiotiques, les spores ne se développent pas, elles sont inhibées par l’antibiotique :
une couleur violette indique un taux d’antibiotiques supérieur ou égal à la limite de détection du test.
4
Etude WI
3. Planning de l’étude
La partie préparation des matériaux a été réalisée entre le 24 et le 27 Mars 2006, et l’étude de
stabilité entre Mars et Avril 2006.
Le colis concernant les échantillons a été envoyé aux laboratoires collaborateurs le 28 mars 2006. La
réception pour les laboratoires français a eu lieu le 29 mars 2006 et le 30 mars 2006 pour 2 des
laboratoires européens (TNO et CSL). Le dernier laboratoire (CCL) a reçu les échantillons seulement
la semaine suivante et dans un mauvais état. Ils ont quand même réalisé les analyses mais leurs
résultats ont été exclus de l’analyse.
L’analyse des échantillons a été réalisé entre le 30 mars 2006 et le 6 avril 2006.
L’analyse des résultats par le laboratoire expert a eu lieu en Avril 2006.
4. Préparation et envoi des matériaux
4.1.
Préparation des matériaux
Après la présentation au Bureau Technique du projet d’étude collaborative, un des matériaux porc a
été remplacé par de la volaille (poulet) et un 4e antibiotique (Tylosine) a été ajouté.
Le choix des concentrations a été fait à partir des Limites Maximales de Résidus et des résultats de la
phase 1 de l ‘étude préliminaire.
Tableau 1. Pour les 4 antibiotiques choisis, le tableau suivant représente le choix des concentrations :
Porc
Bœuf
Porc
Poulet
Antibiotique
Oxytetracycline
Sulfadimerazine
Ceftiofur
Tylosine
LMR
100
100
200
100
‘Blanc’
‘Blanc’
‘Blanc’
‘Blanc’
Concentrations
20
20
40
10
choisies (µg/kg)
200
200
400
100
400
400
800
200
Des morceaux de muscle ont été pressés afin d’en extraire le jus. En premier lieu, la préparation des
échantillons s’est faite dans les meilleures conditions afin d’éviter la pollution des échantillons ‘blancs’.
Ensuite des fractions de ce jus ont être supplémentées avec les différents antibiotiques aux
différentes concentrations.
Chaque matériau a été préparé, codifié et envoyé en double aveugle, soit 32 échantillons à
analyser par laboratoire.
En plus des échantillons, l’AFSSA a préparé et fourni à tous les laboratoires collaborateurs 3 témoins
négatifs (porc, bœuf, poulet) et un témoin positif bœuf (contenant de la pénicilline G à 10 µg/kg).
5
Etude WI
Le transport et le stockage (à l’AFSSA et dans les laboratoires participants) a été réalisé dans les
meilleures conditions (échantillons congelés, transport dans la carboglace en 24 à 48 heures,
stockage à –20°C minimum avant et après l’envoi).
4.2
Stabilité
Une étude de stabilité des matériaux a été réalisée préalablement à l’envoi des échantillons ainsi que
pendant la période avant l’envoi et la fin des analyses par les laboratoires collaborateurs afin de
garantir la stabilité des matériaux. Cette étude a été réalisée à l’AFSSA par le biais d’analyses avec le
Premi®Test.
Ces 2 études ont montré que les matériaux étaient stables sur la période dévolue à l’analyse.
4.3.
Codification des échantillons
Afin de garantir des analyses en aveugle, les 32 échantillons ont été codifiés par l’AFSSA par des
numéros de 1 à 32. Chaque laboratoire était identifié par un code (de A à P). De plus les participants
n’ont pas été informés du contenu (antibiotiques choisis et concentrations) des échantillons.
Le tableau de codification est présenté en annexe 1.
4.4.
Laboratoires collaborateurs
11 laboratoires ont été choisis et sollicités pour participer à cette étude. Le laboratoire expert et le
laboratoire du fabricant ne sont pas comptés parmi ces laboratoires.
Parmi les 11 laboratoires, les 6 Laboratoires Vétérinaires Départementaux (LVD) ayant déjà participé
à la phase 3 de l’étude préliminaire, ainsi que des laboratoires privés français et des laboratoires
européens pourraient participer à l’étude (cf. annexe 2).
Les 11 laboratoires ont reçu avec le colis un courrier d’instructions (annexes 3 et 4), un accusé de
réception (annexes 5 et 6), un formulaire de résultats (annexes 7 et 8). De plus, chaque laboratoire a
reçu un tableau (annexe 9) indiquant en fonction du code d’échantillon (1 à 32) l’espèce d’origine de la
viande, afin de comparer les résultats de chaque échantillon avec le témoin négatif de l’espèce
correspondante.
Toutes les analyses devaient être effectuées en double (2 séries d’analyse distinctes) et en aveugle,
avec le Premi®Test uniquement, dans chacun des laboratoires collaborateurs. Les participants
avaient un délai d’une semaine maximum après réception des échantillons.
Ils devaient impérativement analyser en plus des échantillons inconnus un témoin négatif (‘blanc’) par
espèce et un échantillon positif (supplémenté avec de la pénicilline G à 10 µg/kg).
6
Etude WI
5. Résultats
5.1.
Résultats du laboratoire expert
Tableau 2. Résultats du laboratoire expert
Espèce/AB
Concentration
(ng/ml)
1ère série
d’analyses
2è série
d’analyses
28
3
22
6
7
25
Porc OTC
Porc OTC
Porc OTC
Porc OTC
Porc OTC
Porc OTC
T- bovin
T- porcin
T- poulet
T+ porcin
0
20
200
400
0
20
NEGATIF
NEGATIF
NEGATIF
POSITIF
NEGATIF
NEGATIF
POSITIF
POSITIF
NEGATIF
NEGATIF
NEGATIF
NEGATIF
NEGATIF
POSITIF
NEGATIF
NEGATIF
POSITIF
POSITIF
NEGATIF
NEGATIF
4
23
2
9
21
1
14
31
17
5
12
13
20
18
19
30
16
15
10
11
29
26
27
32
8
24
Porc OTC
Porc OTC
Porc ceft
Porc ceft
Porc ceft
Porc ceft
Porc ceft
Porc ceft
Porc ceft
Porc ceft
Bœuf sulfa
Bœuf sulfa
Bœuf sulfa
Bœuf sulfa
Bœuf sulfa
Bœuf sulfa
Bœuf sulfa
Bœuf sulfa
Poulet Tylo
Poulet Tylo
Poulet Tylo
Poulet Tylo
Poulet Tylo
Poulet Tylo
Poulet Tylo
Poulet Tylo
200
400
0
40
400
800
0
40
400
800
0
20
200
400
0
20
200
400
0
10
100
200
0
10
100
200
POSITIF
POSITIF
NEGATIF
NEGATIF
POSITIF
POSITIF
NEGATIF
NEGATIF
POSITIF
POSITIF
NEGATIF
DOUTEUX ↓
POSITIF
POSITIF
NEGATIF
NEGATIF
POSITIF
POSITIF
POSITIF
DOUTEUX
POSITIF
POSITIF
NEGATIF
NEGATIF
POSITIF
POSITIF
DOUTEUX ↑
POSITIF
NEGATIF
NEGATIF
POSITIF
POSITIF
NEGATIF
NEGATIF
DOUTEUX
POSITIF
NEGATIF
NEGATIF
POSITIF
POSITIF
NEGATIF
NEGATIF
NEGATIF
POSITIF
POSITIF
NEGATIF
POSITIF
POSITIF
NEGATIF
DOUTEUX ↓
POSITIF
POSITIF
Code aveugle
Le laboratoire expert a obtenu un seul résultat faux positif pour les 2 séries d’analyses pour
l’échantillon de poulet blanc (code 10), alors que le même échantillon (code 27) a été trouvé négatif
pour les 2 séries. La concentration L1 a été choisie pour donner des résultats négatifs mais le fait que
le laboratoire expert ait parfois trouvé un résultat positif n ‘entraîne pas de faux positifs. Le laboratoire
7
Etude WI
expert n’ a obtenu aucun résultat faux négatif sachant que la concentration L3 était celle prévue pour
donner des résultats positifs, alors que la concentration L2 devait être à la limite de sensibilité du test.
Il faut noter que l’analyse ultérieure des résultats a été réalisée en prenant comme principe que les
résultats douteux sont des résultats positifs, ce qui est appliqué lors des analyses de routine.
Le tableau ci-dessous présente les résultats du laboratoire expert de manière synthétique (Nombre de
résultats positifs ou douteux sur 4 échantillons testés par antibiotique et par concentration) :
OTC
CEFT
SULF
TYLO
Porc
Porc
Boeuf
Poulet
L0
0
0
0
2
L1
0
0
0
2
L2
4
4
4
4
L3
4
4
4
4
Les résultats du laboratoire expert sont très satisfaisants :
a. 14 échantillons blancs sur 16 sont bien négatifs
b. En dessous du seuil de détection supposé 14 échantillons sur 16 sont négatifs
c.
Au seuil de détection supposé tous les échantillons sont positifs ;
d. En dessus du seuil de détection supposé tous les échantillons sont positifs.
8
5.2.
Etude WI
Résultats des laboratoires participants
Avant l’étude, des conditions d’élimination des résultats d’un laboratoire avaient été fixées par
l’AFSSA :
-
le témoin négatif est détecté positif,
-
le témoin positif est détecté négatif,
-
mauvais état des échantillons à l’arrivée,
-
problème de stockage (ex. température trop élevée > -15°C)
Deux laboratoires ont finalement été éliminés de l’analyse des résultats :
-
Laboratoire L : livraison du colis retardée, échantillons décongelés et témoin négatif poulet
détecté positif pour les 2 séries d’analyses,
-
Laboratoire H : témoin négatif poulet détecté positif pour la 1ère série d’analyses.
Un tableau général présentant les résultats individuels de chaque laboratoire collaborateur (données
brutes) est situé en annexe 10.
6. Analyse des résultats
6.1.
Pourcentage de résultats positifs
Tableau 3. Pourcentages de résultats positifs pour chaque matériau et pour la totalité des laboratoires
Nombre de positifs par niveau de concentration pour les analyses en double
Lab
Porc OTC
Porc OTC
Porc OTC
Porc OTC
Porc ceft
Porc ceft
Porc ceft
L0
L1
L2
L3
L0
L1
L2
Porc ceft
L3
0
20
200
400
0
40
400
800
A
0
0
0
1
0
0
1
4
B
0
0
0
4
0
0
0
4
C
0
0
0
4
2
0
0
4
D
0
0
0
4
0
0
0
4
4
E
0
0
0
0
0
0
0
F
0
0
4
4
4
2
3
4
G
0
0
0
4
0
0
0
4
M
0
0
0
0
0
0
0
4
N
0
0
0
4
0
0
0
4
FP0 (a)
FP1 b)
VP2 c)
VP3 d)
FP0 (a)
FP1 b)
VP2 c)
VP3 d)
0
0
4
25
6
2
4
36
0%
0%
11%
69%
17%
6%
11%
100%
Total
9
Etude WI
Nombre de positifs par niveau de concentration pour les analyses en double
Bœuf sulfa
Bœuf sulfa Bœuf sulfa Bœuf sulfa
Poulet Tylo Poulet Tylo Poulet Tylo Poulet Tylo
L0
L1
L2
L3
L0
L1
L2
L3
Lab
0
20
200
400
0
10
100
200
A
0
0
0
1
0
0
3
4
B
0
0
0
4
0
0
4
4
C
0
0
0
0
0
0
4
4
D
0
0
2
4
0
0
4
4
E
2
2
2
2
0
0
1
4
F
0
0
2
2
0
0
4
4
G
0
0
0
2
0
0
3
4
M
1
1
0
0
0
0
3
4
N
1
0
0
4
0
0
4
4
FP0 (a)
FP1 b)
VP2 c)
VP3 d)
FP0 (a)
FP1 b)
VP2 c)
VP3 d)
4
3
6
19
0
0
30
36
11%
8%
17%
53%
0%
0%
83%
100%
Total
Globalement les résultats sont homogènes entre laboratoires. Le tableau ci-dessus montre des
résultats très proches pour tous les laboratoires participants (excepté le laboratoire expert) :
•
Pour les échantillons négatifs (16 par laboratoires correspondants à 3 espèces différentes) :
o
Dans 4 laboratoires, 100% des échantillons sont négatifs ;
o
Dans 5 laboratoires, 1 ou 2 échantillons (sur 16) sont positifs ou douteux, parfois dans
une seule série d’analyses (laboratoires M et N) ;
o
•
Pour les échantillons contenant des antibiotiques à une concentration considérée comme en
dessous du seuil de détection :
•
o
Dans 6 laboratoires 100% des échantillons sont négatifs ;
o
Dans 3 laboratoires 1 ou 2 échantillons (sur 16) sont positifs ou douteux ;
Pour les échantillons contenant des antibiotiques à une concentration considérée à la limite
de détection :
o
La tylosine est généralement détectée (83 % de positifs à L2) alors que les autres
antibiotiques sont peu détectés ;
•
Pour les échantillons contenant des antibiotiques à une concentration considérée comme au
dessus du seuil de détection :
o
Le taux moyen d’échantillons positifs à la concentration L3 est de 81 % ;
o
Le taux de détection à la concentration L3 pour les 4 antibiotiques est de 100% pour 3
laboratoires (B, D, N) ;
o
Ce taux est de 100% pour la totalité des laboratoires concernant la tylosine et le
ceftiofur.
10
Etude WI
Tableau 4. Pourcentage de spécificité (SP) et de sensibilité (SE) :
Total
SP (%)
SE (%)
Au niveau L2
SE (%)
Au niveau L3
95,3
27,5
72,5
Où :
• le % de spécificité SP pour les niveaux L0 et L1 :
SP = (1-(FP/N-))*100 %
Où:
N-: nombre total de tous les essais L0 et L1
FP : nombre de faux positifs
•
le % de sensibilité SE pour chaque niveau de contamination positif L2 et L3 à l’aide de
l’équation suivante :
SP = (VP/N+))*100 %
Où:
N+: nombre total des essais L2 ou L3 respectivement
VP : nombre de vrais positifs
Conclusion : La spécificité et la sensibilité au niveau L3 sont très satisfaisantes.
11
6.2.
Etude WI
Répétabilité des résultats
Les tableaux suivants présentent l’ensemble des résultats des laboratoires participants par matrice
(combiné espèce animale/antibiotique) en terme de répétabilité.
Tableaux 5. Résultats de l’étude de répétabilité
Tableau 5a. Porc OTC
(Nombre d’analyses identiques pour un
Lab
même échantillon / N)*100
(Nombre d’analyses identiques pour 2
échantillons identiques (paire) / N)*100
A
5/6
5/6
B
6/6
6/6
C
6/6
6/6
D
6/6
6/6
E
6/6
6/6
F
6/6
6/6
G
6/6
6/6
H
6/6
4/6
M
6/6
6/6
N
6/6
6/6
Tableau 5b. Porc ceftiofur
Lab
A
5/6
5/6
B
6/6
6/6
C
6/6
6/6
D
6/6
6/6
E
6/6
6/6
F
5/6
3/6
G
6/6
6/6
H
6/6
6/6
M
6/6
6/6
N
6/6
6/6
Lab
A
5/6
5/6
B
6/6
6/6
C
6/6
6/6
Tableau 5c. Bœuf sulfa
D
4/6
6/6
E
0/6
6/6
F
6/6
2/6
G
6/6
4/6
H
5/6
5/6
M
6/6
5/6
N
6/6
6/6
12
Etude WI
Tableau 5d. Poulet Tylo
Lab
A
5/6
5/6
B
6/6
6/6
C
6/6
6/6
D
6/6
6/6
E
5/6
5/6
F
6/6
6/6
G
5/6
5/6
H
6/6
6/6
M
5/6
5/6
N
6/6
6/6
Lab
Tableau 5e. Porcs blancs
A
4/4
4/4
B
4/4
4/4
C
4/4
2/4
D
4/4
4/4
E
4/4
4/4
F
4/4
4/4
G
4/4
4/4
H
3/4
3/4
M
4/4
4/4
N
4/4
4/4
Lab
Tableau 5f. Bœufs blancs
A
2/2
2/2
B
2/2
2/2
C
2/2
2/2
D
2/2
2/2
E
0/2
2/2
F
2/2
2/2
G
2/2
2/2
H
2/2
2/2
M
1/2
1/2
N
1/2
1/2
13
Etude WI
Tableau 5g. Poulets blancs
Lab
A
2/2
2/2
B
2/2
2/2
C
2/2
2/2
D
2/2
2/2
E
2/2
2/2
F
2/2
2/2
G
2/2
2/2
H
1/2
1/2
M
1/2
1/2
N
1/2
1/2
Le tableau suivant présente l’analyse globale des résultats de tous les participants en terme de
répétabilité.
Tableau 6. Analyse globale
Lab
A
B
C
D
E
F
G
M
N
Total
87,5
100,0
100,0
93,8
71,9
96,9
96,9
90,6
96,9
87,5
100,0
93,8
100,0
96,9
78,1
90,6
90,6
96,9
94,8
92,7
Les résultats des laboratoires participants en terme de répétabilité sont très satisfaisants avec un
pourcentage moyen de 94,8% pour un même échantillon et de 92,7 % pour 2 échantillons identiques
(paire).
14
6.3.
Etude WI
Reproductibilité
Le tableau suivant présente l’analyse des résultats de tous les laboratoires participants en terme de
reproductibilité, par matériau (combinaison espèce animale/antibiotique) et de façon globale.
Tableau 7. Résultats de l’étude de reproductibilité
N° de série Antibiotique
(n° de la
(ou témoin
Niveau de
Niveau de Reproductibilité
paire)
négatif)
contamination contamination
(%)
1
Porc OTC
L0
0
100,0
2
Porc OTC
L1
20
100,0
3
Porc OTC
L2
200
88,9
4
Porc OTC
L3
400
69,4
5
Porc ceft
L0
0
83,3
6
Porc ceft
L1
40
94,4
7
Porc ceft
L2
400
88,9
8
Porc ceft
L3
800
100,0
9
Bœuf sulfa
L0
0
91,7
10
Bœuf sulfa
L1
20
91,7
11
Bœuf sulfa
L2
200
83,3
12
Bœuf sulfa
L3
400
52,8
13
Poulet Tylo
L0
0
100,0
14
Poulet Tylo
L1
10
100,0
15
Poulet Tylo
L2
100
83,3
16
Poulet Tylo
L3
200
100,0
Total
89,1
Les résultats des laboratoires participants en terme de reproductibilité sont très satisfaisants avec un
pourcentage moyen de 89,1%.
La reproductibilité la moins bonne a été observée pour la combinaison bœuf/sulfamethazine. Il faut
noter qu’une concentration L3 un peu plus forte et donc plus éloignée du seuil de détection aurait sans
doute donné de meilleurs résultats en terme de reproductibilité.
7. Conclusions
Ce rapport complète l’étude préliminaire réalisée pour la validation AFNOR du Premi®Test. D’une
façon générale on retrouve les mêmes types de résultats que lors de l’étude préliminaire en terme de
niveau de détection. Les résultats de l’étude collaborative sont très satisfaisants. Les résultats bruts
de 9 laboratoires ont finalement été analysés, en plus de ceux du laboratoire expert.
La spécificité a été estimée à 95.3 %, de plus la sensibilité du test au niveau L3 a été calculée à
72,5%. Ces résultats sont similaires à ceux obtenus lors de précédentes validations de kits de
détection des résidus d’antibiotiques dans le lait.
15
Etude WI
Les résultats en terme de répétabilité et de reproductibilité sont très satisfaisants, avec des
pourcentages moyens de 94,8% et 92,7 % pour la répétabilité et de 89,1 pour la reproductibilité.
16
Etude WI
8. Annexes
17
Etude WI
Annexe 1. Codification aléatoire des matériaux pour les laboratoires participants.
Lab
Mat 1
Mat 2
Mat 3
Mat 4
Mat 5
Mat 6
Mat 7
Mat 8
Mat 9
Mat 10 Mat 11 Mat 12 Mat 13 Mat 14 Mat 15 Mat 16 Mat 17 Mat 18 Mat 19 Mat 20
Porc
OTC
Porc
OTC
Porc
OTC
Porc
OTC
Porc
OTC
Porc
OTC
Porc
OTC
Porc
OTC
Porc
ceft
Porc
ceft
Porc
ceft
Porc
ceft
Porc
ceft
Porc
ceft
Porc
ceft
Porc
ceft
Bœuf
sulfa
Bœuf
sulfa
Bœuf
sulfa
Bœuf
sulfa
400
0
20
200
400
0
20
200
400
0
40
400
800
0
40
400
800
0
20
200
A
1
13
31
20
11
2
8
15
7
14
10
22
24
21
19
5
18
32
27
16
B
26
22
10
31
2
13
23
18
25
8
24
12
5
1
32
15
16
4
14
20
C
30
29
15
8
5
13
6
16
12
24
3
25
10
31
21
1
7
4
32
2
D
14
8
7
22
13
3
4
29
30
19
26
27
15
20
1
21
6
28
12
9
E
26
27
15
20
1
21
24
17
25
5
14
8
7
22
13
3
9
2
10
11
F
2
9
21
1
14
16
23
28
25
4
18
19
30
26
27
32
8
24
3
22
G
31
4
18
19
6
7
2
9
21
1
14
16
23
28
25
29
30
27
32
20
H
24
3
22
6
23
9
21
26
27
32
2
8
13
20
15
10
11
30
1
14
11
L
7
31
17
5
12
13
9
21
1
27
32
14
16
23
30
2
20
15
10
M
16
23
26
27
32
8
24
3
22
6
11
7
31
17
2
9
21
1
14
4
N
14
16
23
28
20
15
10
11
29
27
32
8
24
3
22
19
2
9
21
1
P
28
3
22
6
7
25
4
23
2
9
21
1
14
31
17
5
12
13
20
18
Lab
Mat 21 Mat 22 Mat 23 Mat 24 Mat 25 Mat 26 Mat 27 Mat 28 Mat 29 Mat 30 Mat 31 Mat 32
Bœuf
sulfa
Bœuf
sulfa
Bœuf
sulfa
Bœuf
sulfa
Poulet Poulet Poulet Poulet Poulet Poulet Poulet Poulet
Tylo
Tylo
Tylo
Tylo
Tylo
Tylo
Tylo
Tylo
0
20
200
400
0
10
10
200
0
10
10
A
23
25
12
9
29
6
30
4
28
17
26
200
3
B
29
17
9
27
21
3
30
19
11
6
7
28
C
28
20
18
19
22
11
27
9
14
23
17
26
D
2
10
11
32
16
23
24
17
25
5
31
18
E
32
16
23
4
29
30
19
6
28
12
18
31
F
6
7
31
17
5
12
13
20
15
10
11
29
G
15
10
11
8
24
3
22
17
5
12
13
26
H
16
28
25
4
18
19
29
7
31
17
5
12
L
29
28
25
4
26
18
19
8
24
3
22
6
M
18
28
25
19
30
5
12
13
29
20
15
10
N
5
12
13
25
4
18
17
30
26
6
7
31
P
19
30
16
15
10
11
29
26
27
32
8
24
18
Rapport de l’étude collaborative du Premi Test
Etude WI
Annexe 2. Liste des laboratoires collaborateurs
LDV 29 (accord par M. Vergier)
Anne Moisan (responsable technique SSMAE)
22 Avenue de la Plage des gueux Creach Gwenn
29334 Quimper Cedex
tel. : +33 298102888
[email protected]
LDA 56 (principe d’accord par Yves Corfmat: a envoyer le protocole)
Catherine Malejacq (hygiene alimentaire chef de service : Yves Corfmat)
3 Rue Denis Papin
BP 20080
56792 Saint-Ave Cedex
tel. : +33 297461415
LDA 22 (principe d’accord par Valérie Charnay: a envoyer le protocole)
Anne-Sophie Moigno
Service Microbiologie Alimentaire
Rue de Seibot
22940 Pleufragan
tel. : +33 296013722
LDA 50 (accord par Michel Petron)
Lionel Lemarchand
Resp. hygiene alimentair
Route de Bayeux
50008 Saint Lô Cedex
tel. : +33 233756300
mail : [email protected]
LVD 49 (accord par Mm. Catherine Delnatte)
Sybille Bourdeau
Microbiologie Alimentaire
18 Boulevard Larvoisier
49009 Angers Cedex 01
tel. : +33 241226800
mail: [email protected]
LDA 35
Florence le Brizoual ou Chantal Monfort
24 Rue Antoine Joly
35031 Rennes Cedex
tel. : +33 299142700
ANILAB
Patrice RETHO
ZA de Penhouet
56220 CADEN
Tél : 02-97-67-85-55
Fax : 02-97-67-86-66
Alcontrol
Olivier Leprand Responsable du Laboratoire de Chimie
ALcontrol Cervac
Laboratoire de Chimie
ZAC des monts Gaultier
33 Rue Lavoisier
35230 Noyal Chatillon sur Seiche
19
Etude WI
TEL 02 23 50 06 35
MOBILE:06 14 84 15 04
Mail: [email protected]
TNO
Robert Schilt
Postbus 360
3700 AJ Zeist
les Pays Bas
CCL
Rob Margry
Postbus 200
5460 BC Veghel
Pays Bas
Mail : [email protected]
CSL
Central Science Laboratory
Dr. Sara Stead
Sand Hutton
York Y041 1LZ
England
Mail: [email protected]
20
Etude WI
Annexe 3. Courrier d’instructions en français
Sybille Bourdeau
LABORATOIRE D'ETUDES ET DE RECHERCHES SUR
Microbiologie Alimentaire
LES MEDICAMENTS VETERINAIRES ET LES DESINFECTANTS
18 Boulevard Larvoisier
49009 Angers Cedex 01
Fougères, le 28 Mars 2006
Sujet: Etude collaborative test 2006 sur le Premi®Test
Code de l’étude collaborative : WI
Votre code de laboratoire : A
Cher Docteur Bourdeau,
Merci d’avoir accepté de participer à cette étude collaborative 2006 sur le Premi®Test.
Cette étude comporte 32 échantillons de jus de viande, plus 3 témoins négatifs (de différentes
espèces : porc, poulet et bœuf) et un témoin positif porc (pénicilline G à 10 µg/kg). Les échantillons
devront être stockés à – 20°C dès réception du colis dans votre laboratoire.
Merci de remplir l’accusé de réception situé dans l’enveloppe collée sur le côté du colis et de nous le
renvoyer par fax.
Instructions pour l’analyse :
® Décongeler lentement les 32 échantillons, plus les 4 témoins et bien mélanger.
® Analyser les échantillons avec le Premi®Test en suivant les instructions du kit (100 µl de jus par
ampoule, pré-incubation de 20 minutes, lavage, incubation à 64 °C pendant environ 3 heures (voir
dans la boite pour le temps exact)).
® Les échantillons de chaque espèce devront être comparés au témoin négatif correspondant afin
d’optimiser le temps d’incubation et d’obtenir une sensibilité optimale. C’est pourquoi vous
trouverez ci-joint un tableau vous indiquant pour les échantillons 1 à 32 l’espèce d’origine de
l’échantillon (porc, bœuf ou volaille).
® Réaliser les analyses des échantillons codés et des témoins en double, lors de 2 différentes
séries, mais le même jour (si possible le Jeudi 30 Mars 2006). Chaque tube contient une quantité
suffisante de jus de viande (environ 400 µl) pour réaliser les analyses en double.
Résultats:
® Reporter les 2 séries de résultats pour les témoins et pour chaque échantillon sur le formulaire de
résultats et dans le fichier formulaire_résultats_Premi.doc que vous avez reçu par e-mail.
Pour tout supplément d’informations, n’hésitez pas à me contacter
Cordialement,
Valérie GAUDIN
Documents joints :
e-mail: [email protected]
Accusé de réception
Formulaire de résultats
21
Etude WI
Tableau de correspondance numéro d’échantillon/espèce animale
22
Etude WI
Annexe 4. Courrier d’instructions en anglais
Dr. Sara Stead
LABORATOIRE D'ETUDES ET DE RECHERCHES SUR
Central Science Laboratory
LES MEDICAMENTS VETERINAIRES ET LES DESINFECTANTS
Sand Hutton
York Y041 1LZ
England
Fougères, the 28th of March 2006
Subject: Collaborative test 2006 with Premi®Test
Code of the collaborative study : WI
Your laboratory code: D
Dear Doctor Stead,
Thank you for agreeing to participate to the collaborative test 2006 with Premi®Test.
This study includes 32 coded frozen meat juice samples, plus 3 negative controls (from porcine,
bovine and chicken origin) and 1 positive control (penicillin G at 10 µg/kg). The samples have to be
stored at –20°C as soon as they arrive in your laboratory.
Please return by fax the completed acknowledgement of receipt located in front of the parcel in the
envelope.
Instructions for analysis:
® Defrost the 32 milk samples plus the 4 controls, and shake well.
® Analyse the samples with Premi®Test following the manufacturer protocol (100 µl of juice on the
ampoule)
® The samples from each animal specie have to be compared with the negative control from the
same specie to optimise the incubation time and to obtain the optimal sensitivity test. Therefore you
will enclosed a table which correlate each sample from number 1 to 32 to the corresponding animal
specie (pork, beef and chicken).
® Perform the analysis of the coded samplesth and the controls in duplicate, in 2 different series, but
the same day (if possible on Thursday 30 of March 2006)
Results:
® Report
the 2 results for the controls and for each sample in the results form and in the file
ResultformPremi.doc that you received by e-mail.
I would be delighted to supply any further information you may require.
Yours sincerely,
Valérie GAUDIN
e-mail: [email protected]
Enclosures: Acknowledgement of receipt
Results form
Table of correspondence sample number/animal specie
23
Etude WI
Annexe 5. Accusé de réception en français
ACCUSE DE RECEPTION
________________________________________________________
ETUDE COLLABORATIVE PREMI®TEST
MARS 2006
Fax à : 02.99.94.78.80 – Valérie GAUDIN
CODE DU LABORATOIRE: ----------------------------------------------------------------INSTITUT: ------------------------------------------------------------------------------PERSONNE A CONTACTER: --------------------------------------------------------------NOMBRE D’ECHANTILLONS DE JUS DE VIANDE : ---------------------------------------DATE DE RECEPTION DES ECHANTILLONS : --------------------------------------------HEURE DE RECEPTION : ------------------------------------------------------------------
Aspect des echantillons :
CONGELES

DECONGELES

REMARQUES
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------COURRIER D’INSTRUCTIONS JOINT
OUI

NON

TABLEAU PAR ESPECE JOINT
OUI

NON

FORMULAIRE DE RESULTATS JOINT
OUI

NON

Signature
24
Etude WI
Annexe 6. Accusé de réception en anglais
ACKNOWLEDGEMENT OF RECEIPT
________________________________________________
RING TRIAL PREMI®TEST
MARCH 2006
Fax to: (int) 33.2.99.94.78.80 – Valérie GAUDIN
LABORATORY CODE: ---------------------------------------------------------------------INSTITUTE: -----------------------------------------------------------------------------SCIENTIST TO CONTACT: --------------------------------------------------------------NUMBER OF MEAT JUICE SAMPLES: ----------------------------------------------------DATE OF RECEIPT OF THE SAMPLES: ---------------------------------------------------TIME OF RECEIPT: -----------------------------------------------------------------------
Aspect of meat juice samples:
FROZEN

UNFROZEN

REMARKS
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ENCLOSED INSTRUCTIONS LETTER
YES

NO

ENCLOSED TABLE PER ANIMAL SPECIE
YES

NO

ENCLOSED RESULTS FORM
YES

NO

Signature
25
Etude WI
Annexe 7. Formulaire de résultats en français
FORMULAIRE DE RESULTATS
ETUDE COLLABORATIVE PREMI TEST (2006)
Code du laboratoire :
Institut: --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Numéro de lot du Premi®Test:
-------------------------------------------------------------------------
Date de péremption du Premi®Test : ---------------------------------------------------------------Date d‘analyse (si possible le 30/03/06):
----------------------------------------------
Signature
CODE
ECHANTILLONS
INTERPRETATION VISUELLE
Exprimé en POSITIF, DOUTEUX ou NEGATIF
1ère série d’analyses
2è série d’analyses
T- bovin
T- porcin
T- poulet
T+ porcin
1
2
3
4
5
6
7
8
9
26
Etude WI
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
REMARQUES
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Résultats à retourner avant le 4 Avril 2006
À : V. GAUDIN
Fax: 02.99.94.78.80
De préférence par e-mail:[email protected]
27
Etude WI
Annexe 8. Formulaire de résultats en anglais
RESULTS FORM
RING TRIAL PREMI TEST (2006)
Laboratory code:
Institute: --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Batch number of Premi®Test:
-------------------------------------------------------------------------
Validity date of Premi®Test : ------------------------------------------------------------------------Date of analysis (by preference on 30/03/06): ----------------------------------------------
Signature
SAMPLE CODE
VISUAL INTERPRETATION
Expressed as POSITIVE, DOUBTFUL or NEGATIVE
1st round of analyses
2nd round of analyses
T- bovine
T- porcine
T- chicken
T+ procine
1
2
3
4
5
6
7
28
Etude WI
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
REMARKS
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Please return before 04/04/2006
to: V. GAUDIN
Fax: 33.2.99.94.78.80
Preferably by e-mail: [email protected]
29
Etude WI
Annexe 9. Exemple de tableau envoyé aux laboratoires collaborateurs pour identifier l’origine
(espèce) des échantillons.
Echantillons
A
A
Porc
Porc
Porc
Porc
Porc
Porc
Porc
Porc
Porc
Porc
Porc
1
13
31
20
11
2
8
15
7
14
10
22
Porc
Porc
Porc
Porc
Bœuf
Bœuf
Bœuf
Bœuf
Bœuf
Bœuf
Bœuf
Bœuf
21
19
5
18
32
27
16
23
25
12
9
24
Poulet
A
29
Porc
Poulet Poulet Poulet Poulet Poulet Poulet Poulet
6
30
4
28
17
26
3
30
Etude WI
Annexe 10. Tableau général présentant les résultats individuels de chaque laboratoire collaborateur (données brutes).
BILAN par matériau
Porc OTC
0
20
Mat 1
1ere
Lab analyse
Mat 5
2e
analyse
200
Mat 2
Mat 6
400
Mat 3
Mat 7
Mat 4
Mat 8
1ere
2e
1ere
2e
1ere
2e
1ere
2e
1ere
2e
1ere
2e
1ere
2e
analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse
A
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
D
B
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
C
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
D
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
E
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
F
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
G
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
D
D
D
D
H
-
-
-
-
-
-
D
D
+
D
+
+
+
+
+
+
M
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
N
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
Porc ceft
0
40
Mat 9
1ere
Lab analyse
Mat 13
2e
analyse
400
Mat 10
Mat 14
800
Mat 11
Mat 15
Mat 12
Mat 16
1ere
2e
1ere
2e
1ere
2e
1ere
2e
1ere
2e
1ere
2e
1ere
2e
analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse
A
-
-
-
-
-
-
-
-
-
D
-
-
+
D
+
+
B
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
C
-
-
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
D
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
E
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
D
D
+
+
F
D
D
D
D
-
-
D
D
-
D
+
+
+
+
+
+
G
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
H
-
D
-
-
-
-
-
-
+
D
D
D
+
+
+
+
31
Etude WI
M
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
N
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
Bœuf sulfa
0
20
Mat 17
Mat 21
200
Mat 18
Mat 22
400
Mat 19
Mat 23
Mat 20
Mat 24
1ere
2e
1ere
2e
1ere
2e
1ere
2e
1ere
2e
1ere
2e
1ere
2e
1ere
2e
Lab analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse
A
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
D
-
-
-
B
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
C
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
D
-
-
-
-
-
-
-
-
-
D
E
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
D
+
+
+
+
-
+
-
+
-
F
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
-
-
D
D
G
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
H
-
-
-
-
-
D
D
D
+
+
+
D
-
-
D
D
D
D
+
D
M
-
D
-
-
-
-
-
D
-
-
-
-
-
-
-
-
N
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
D
+
D
+
Poulet Tylo
0
10
Mat 25
Mat 29
100
Mat 26
Mat 30
200
Mat 27
Mat 31
Mat 28
Mat 32
1ere
2e
1ere
2e
1ere
2e
1ere
2e
1ere
2e
1ere
2e
1ere
2e
1ere
2e
Lab analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse analyse
A
-
-
-
-
-
-
-
-
+
D
-
D
D
+
D
+
B
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
C
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
D
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
E
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
D
+
+
+
+
F
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
G
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
-
D
+
+
+
+
32
Etude WI
D
D
-
D
D
+
+
D
+
M
-
-
-
-
-
-
-
-
N
-
-
-
-
-
-
-
-
H
+
+
+
+
D
-
D
D
+
D
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
33