revue générale Apport de la cytogénétique moléculaire au

abc
revue générale
Ann Biol Clin 2004, 62 : 629-37
Apport de la cytogénétique moléculaire
au diagnostic des anomalies chromosomiques
N. Bouayed Abdelmoula
Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 78.47.27.170 le 07/02/2017.
Laboratoire d’histologie-embryologie,
Faculté de médecine de Sfax
[email protected]
Résumé. La cytogénétique moléculaire est une nouvelle méthode d’analyse du
génome qui utilise à la fois les outils de la biologie moléculaire et de la
cytogénétique. La principale technique utilisée est l’hybridation in situ en
fluorescence qui consiste à hybrider des sondes froides d’ADN sur des lames
de préparations chromosomiques. Le développement progressif, au cours des
vingt dernières années, de différentes approches techniques de cytogénétique
moléculaire aussi bien ciblées que globales, a permis d’élargir considérablement le champ d’application de la cytogénétique aussi bien dans l’analyse des
processus tumoraux que dans le diagnostic chromosomique constitutionnel
pré- et postnatal. Dans cette mise au point, nous présentons les principales
applications de la cytogénétique moléculaire et son apport au diagnostic des
anomalies chromosomiques constitutionnelles et acquises.
Mots clés : Fish, chromosome, cytogénétique
Article reçu le 15 novembre 2003,
accepté le 26 juin 2004
Summary. Molecular cytogenetic approaches based on fluorescence in situ
hybridization (FISH) with chromosome-specific probes have been increased in
recent years. They become a powerful tool for chromosomal diagnosis in
prenatal, constitutional and cancers genetic disorders. In fact, various procedures are now available to rapid identification of numerical and structural chromosome aberrations that escape to conventional chromosome banding analysis. Here, contribution of molecular cytogenetic approaches for diagnosis of
disease related chromosomal changes are presented and discussed.
Key words: Fish, chromosome, cytogenetics
Depuis l’introduction des techniques de bandes chromosomiques en 1969 par Caspersson et Zech [1], l’analyse
cytogénétique est devenue un outil de diagnostic clinique
performant des maladies génétiques chromosomiques
constitutionnelles pré- et postnatales et un outil pour l’évaluation de certains désordres génétiques associés à la pathologie cancéreuse.
cessibles aux interprétations cytogénétiques basées sur les
techniques de bandes. La détermination de ces anomalies
de petites tailles est actuellement identifiée par les techniques de cytogénétique moléculaire, en particulier l’hybridation in situ en fluorescence (Fish) dotée d’une plus
grande sensibilité.
L’analyse cytogénétique classique basée sur l’interprétation de la succession des bandes de l’ensemble du génome
permet le diagnostic de la plupart des anomalies chromosomiques. Cependant les aberrations chromosomiques
complexes, les remaniements intéressant des fragments
chromosomiques de taille inférieure à quelques mégabases (Mb) tels que les microdélétions et les remaniements
cryptiques ou encore les anomalies impliquant des régions
du génome ayant un marquage peu spécifique restent inac-
L’hybridation in situ
en fluorescence (Fish)
Tirés à part : N. Bouayed Abdelmoula
Ann Biol Clin, vol. 62, n° 6, novembre-décembre 2004
Le principe de la Fish
L’hybridation in situ en fluorescence est une technique
qui met à profit l’une des propriétés des acides nucléiques : l’association spécifique d’une molécule d’ADN simple brin marquée (sonde) avec sa séquence complémentaire (cible) ; l’acide nucléique cible étant dans sa situation
originelle au sein d’un chromosome en métaphase ou dans
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la chromatine du noyau en interphase. La Fish permet
ainsi de détecter sur une préparation cytogénétique un
hybride entre une séquence ayant préalablement incorporé
un marqueur et sa séquence chromosomique complémentaire [2].
La première étape de l’hybridation in situ en fluorescence
consiste en une dénaturation thermique de l’ADN cible et
de la sonde si cette dernière est sous forme d’ADN double
brin. La deuxième étape consiste en l’hybridation de la
sonde sur l’ADN cible à 37 °C pendant une durée variable
selon le type de sonde utilisé (quelques heures à plusieurs
jours). La troisième étape correspond à la révélation de
l’hybridation qui peut être directe ou indirecte grâce à des
protéines spécifiques (molécules « signal ») couplées à des
fluorochromes et à la contre-coloration du support chromosomique. Les lames hybridées sont lues avec un photomicroscope à épifluorescence équipé de filtres spécifiques
aux différents fluorochromes utilisés et éventuellement
d’un analyseur d’images (figure 1). La sonde hybridée
avec la cible est révélée sous forme d’un signal fluorescent
et l’analyse des signaux permet de déterminer la présence,
la localisation et le nombre de copies d’une séquence cible
et par conséquent de détecter les remaniements chromosomiques de nombre ou de structure [2].
Les approches techniques
Les approches techniques en cytogénétique moléculaire
sont multiples. Le choix du type de l’analyse dépend de
l’application pratique et des objectifs diagnostiques. Ainsi,
deux catégories d’approches peuvent être distinguées : les
approches ciblées et les approches globales (tableau I).
Les techniques ciblées
Ces techniques, rendues possibles par la disponibilité de
sondes spécifiques, nécessitent d’avoir une idée préalable
sur les chromosomes impliqués pour détecter les remaniements chromosomiques. On peut distinguer d’une part
l’approche Fish locus spécifique permettant d’obtenir un
signal fluorescent correspondant à une région limitée et
particulière de l’ADN : un gène, une séquence unique ou
répétée centromérique ou télomérique et ce, en utilisant
une sonde de séquence complémentaire à la cible. D’autre
Sonde
ADN
Marquage
de la sonde
Cible
Lame et
préparation
chromosomique
Sonde en
solution
(biotine, digoxigènine,
fluorochrome...)
ADN cible
Prétraitement de la lame :
Rnase, digestion partielle
des protéines plasmatiques :
pepsine, protéinase K
Préparation de la sonde :
ADN compétiteur,
tampon d'hybridation
Dénaturation
AT T CC
thermique
T A A GG
Dénaturation de la cible
Hybridation spécifique
Conditions de T° (37-42°)
Durée (6 à 24 h)
Lavages
Fluorochrome
Anticorps dirigé
contre le marqueur
La sonde moléculaire se fixe
Élimination des sondes non
spécifiquement fixées
Détection par immunofluorescence
Directe ou indirecte
Pas de sonde fixée = délétion
Analyse au microscope en
épifluorescence
Filtres adaptés aux
différents fluorochromes
Figure 1. Principe de la Fish. Les différentes étapes sur préparation chromosomique. Exemple d’une sonde spécifique de la région
proximale du chromosome 15 (15q11.2) spécifique du syndrome d’Angeman et du syndrome de Willi-Prader. Le résultat indique la
perte du locus testé sur l’un des chromosomes 15 qui s’écrit del(15)(q11).
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Cytogénétique moléculaire et anomalies chromosomiques
Tableau I. Les approches techniques de la Fish et les sondes
correspondantes.
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Fish ciblée
Peinture chromosomique
Les types des sondes
Sonde de peinture d’un chromosome entier
Sonde de peinture d’un bras chromosomique
Fish spot (chaque
Sondes spécifiques de loci ou de gènes
hybridation donne un
Sondes spécifiques des gènes de fusion en
signal fluorescent distinct) oncohématologie
Sondes spécifiques des séquences
centromériques α-satellites
Sonde alphoïde tous centromères
Sondes spécifiques des régions
subtélomériques
Sonde tous télomères
Sondes spécifiques des séquences β-satellites
(Yqh par exemple)
Fish globale
Les types des sondes
CGH
ADN génomique testé + ADN génomique
témoin
M-Fish/Sky
24 sondes de peinture chromosomiques
spécifiques des 22 autosomes et les
chromosomes X et Y
part, il y a la peinture chromosomique permettant de mettre en évidence un chromosome particulier en entier (ou
seulement un bras chromosomique) par hybridation sur
toute sa longueur [3].
Les techniques globales
Ces techniques d’hybridation in situ permettent au
contraire d’analyser le génome entier en une seule étape et
de mettre en évidence les remaniements les plus ambigus
et les plus complexes. Cependant elles ne permettent pas
de reconnaître avec précision les régions chromosomiques
impliquées.
Il peut s’agir de la Fish en 24 couleurs sous ses deux
aspects qui diffèrent au niveau de la méthode d’acquisition
des images permettant la classification des chromosomes
métaphasiques : la M-Fish (multiplex-FISH) et le caryotype spectral ou le Sky (spectral karyotyping) [4, 5]. Ces
deux techniques permettent l’identification et l’analyse simultanées de tous les chromosomes en attribuant à chaque
paire d’autosomes, à l’X et à l’Y une couleur propre et
distincte.
Il peut s’agir aussi de l’hybridation génomique comparative (CGH) qui consiste en l’hybridation simultanée et
compétitive, sur des métaphases lymphocytaires normales,
de l’ADN test et d’un ADN témoin normal, marqué chacun par un fluorochrome différent. La CGH permet ainsi
de détecter et de localiser sur les chromosomes métaphasiques normaux les différences relatives du nombre de copies de séquences d’ADN entre les deux génomes, test et
témoin en calculant le rapport d’intensité de fluorescence
le long de chaque chromosome. Cette approche permet
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l’analyse globale des anomalies déséquilibrées survenant
dans l’ensemble du génome sans la nécessité d’avoir des
mitoses. Cependant, elle ne permet en aucun cas de déceler les remaniements chromosomiques équilibrés [4].
Applications
de la cytogénétique moléculaire
Depuis la découverte du nombre exact des chromosomes
humains, la cytogénétique humaine s’est développée dans
deux principales directions :
1) l’étude des anomalies chromosomiques constitutionnelles : soit après la naissance au cours de l’exploration des
syndromes dysmorphiques, des retards mentaux, des syndromes d’instabilité chromosomique, des anomalies du
développement sexuel ou des infertilités ; soit en prénatal
pour le dépistage d’aberrations chromosomiques devant
une anomalie échographique du fœtus ou un risque accru
d’anomalie chromosomique (âge maternel avancé >
38 ans, antécédent d’anomalie chromosomique dans la famille, marqueurs sériques positifs...) ;
2) l’analyse des anomalies chromosomiques acquises présentes : soit au cours des hémopathies malignes ; soit au
cours des tumeurs solides.
Considérée comme une méthode complémentaire au caryotype standard, la cytogénétique moléculaire, avec toutes ses approches, a des indications multiples et variées
selon le domaine d’application.
Dans le cas particulier des anomalies chromosomiques,
notamment de structure, identifiées par la cytogénétique
classique mais pas entièrement caractérisées telles que les
chromosomes marqueurs surnuméraires et les translocations complexes, l’apport de la cytogénétique moléculaire
est commun aux deux domaines constitutionnel et acquis.
Les applications communes
aux anomalies de structure chromosomique
L’analyse fine des anomalies chromosomiques par les
techniques de cytogénétique moléculaire est très importante puisqu’elle permet aux cytogénéticiens de faire un
diagnostic chromosomique précis et d’apporter par conséquent pour le généticien clinique un support solide lui
permettant une évaluation correcte du risque pour le patient et éventuellement pour sa famille lors du conseil
génétique.
La détermination
d’un remaniement de structure complexe
La peinture chromosomique sur chromosomes métaphasiques est la technique de choix au cours de l’étude de
certaines translocations cryptiques qui se présentent
comme de simples délétions et au cours des remaniements
de structure complexes impliquant trois chromosomes ou
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plus, et ce d’autant plus que les fragments chromosomiques impliqués sont de petite taille [6]. Cependant, les
limites de détection d’un remaniement intrachromosomique par la peinture sont de l’ordre de quelques Mb. D’où
l’intérêt, dans ces cas, des sondes subtélomériques
chromosome-spécifiques et de certaines sondes de séquences uniques locus-spécifiques (figure 2 D et E).
Pour ce qui est des insertions et des excès de matériel
survenant de novo qui constituent un problème diagnostique majeur pour les cytogénéticiens, les techniques de
cytogénétique moléculaire ciblée apportent certes une aide
au diagnostic mais le plus souvent au prix d’un retard dans
les délais de réponse. En effet, le choix des sondes utilisées, spécifiques de tel ou tel chromosome ou de certains
loci se fait en tenant compte de la morphologie des bandes
en cytogénétique conventionnelle sur le chromosome d’intérêt. Cette approche est délicate, demande de l’expérience et peut nécessiter un grand nombre de tentatives.
Dans ces cas, l’hybridation génomique comparative et
l’hybridation in situ en fluorescence en 24 couleurs en tant
que techniques globales sont très utiles pour déterminer
l’origine chromosomique de ces petits fragments supplémentaires. Cependant, pour préciser la région chromosomique à laquelle ils appartiennent, le recours à l’hybridation in situ en fluorescence ciblée, notamment avec des
sondes de séquences uniques, est souvent nécessaire. La
CGH permet de plus, ce qui n’est pas possible avec la
peinture chromosomique, d’identifier le matériel chromosomique manquant en cas de délétion [4, 7, 8].
La détermination
d’un petit chromosome surnuméraire
Les chromosomes marqueurs sont des petits fragments
chromosomiques observés occasionnellement dans les cellules en culture, fréquemment en mosaïque, et sont habituellement surnuméraires. Il s’agit d’une anomalie de nombre mais aussi un réarrangement de structure, dont
l’origine chromosomique est difficile à identifier par les
techniques de cytogénétique conventionnelles. Le retentissement clinique des marqueurs chromosomiques est variable selon leur composition génétique. Ils peuvent être responsables de malformations congénitales ou d’un retard
mental mais ils sont parfois présents chez des individus
normaux et ségrègent sur plusieurs générations. La découverte d’un marqueur chromosomique surnuméraire par les
techniques de cytogénétique classique pose toujours un
problème pour les cytogénéticiens quel que soit le contexte
clinique de découverte, mais surtout lors d’un diagnostic
prénatal car il est dans tous les cas nécessaire de bien
identifier le marqueur et de préciser ses critères pronostiques pour bien mener le conseil génétique.
La peinture chromosomique et l’hybridation in situ en
fluorescence utilisant des sondes de séquences uniques
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permettent d’identifier l’origine chromosomique de la plupart des marqueurs, mais cette approche ciblée est assez
longue nécessitant un certain nombre d’hybridations et est
confrontée à deux contraintes surtout en matière de diagnostic prénatal : le temps des techniques et la quantité du
matériel cellulaire nécessaire. Les approches globales appliquées en première intention permettent de confirmer
l’origine chromosomique du marqueur d’emblée en une
seule étape technique. Mais étant donné qu’elles ne permettent pas de reconnaître avec précision les régions chromosomiques impliquées, des hybridations ciblées ultérieures avec d’autres types de sondes, surtout de séquences
uniques, seront nécessaires pour une meilleure caractérisation du marqueur.
De nombreux marqueurs dérivent du chromosome 15 (bras
courts) et leur pronostic dépend de la présence ou non de
séquences euchromatiques [9-11]. D’autres marqueurs dérivent du chromosome 18 et sont de mauvais pronostic
(trisomie 18 partielle). Les marqueurs dérivés du chromosome Y retrouvés chez des femmes présentant un syndrome de Turner avec une formule chromosomique en
mosaïque constituée d’une population cellulaire ayant
perdu un des deux chromosomes X et une autre population comportant un marqueur dérivé du chromosome Y,
sont aussi de mauvais pronostic. Ces femmes ont en fait
un risque élevé de développer un gonadoblastome justifiant l’ablation des gonades [12]. L’hybridation avec des
sondes alphoïdes chromosome-spécifiques est utile dans
ce cas particulier pour l’évaluation du taux de mosaïcisme
car de plus, le pronostic de fertilité dépend de la présence
et de la proportion d’une population cellulaire normale
46,XX [13].
Exceptionnellement, les chromosomes marqueurs sont dépourvus des séquences centromériques habituelles, ce qui
représente une nouvelle entité de marqueurs, dits acentriques ou analphoïdes. Cette entité a été identifiée grâce aux
techniques d’hybridation in situ en fluorescence qui ont
permis, en plus, de dévoiler leur mécanisme de formation
(duplication-inversion des extrémités chromosomiques)
[14] (figure 2 F et G).
Les applications spécifiques
à la cytogénétique constitutionnelle
La détermination rapide des aneuploïdies
Les aneuploïdies des chromosomes 13, 18, 21 , X et Y,
essentiellement des trisomies pour les autosomes, correspondent à 60 % des anomalies chromosomiques détectées
après amniocentèse [15]. La détection de ces aneuploïdies
en diagnostic prénatal est assurée habituellement par l’analyse cytogénétique conventionnelle. Elle peut se faire actuellement par les techniques de cytogénétique moléculaire en particulier par Fish sur noyaux interphasiques.
Cette technique a l’avantage d’être rapide mais nécessite
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Cytogénétique moléculaire et anomalies chromosomiques
toujours une confirmation secondaire des résultats par la
cytogénétique conventionnelle. En effet, elle utilise comme
cible les noyaux interphasiques des cellules placentaires
ou fœtales obtenues par choriocentèse ou amniocentèse et
des sondes cosmidiques de séquences alphoïdes ou de
préférence de séquences uniques spécifiques (en raison
des homologies des séquences alphoïdes) des chromosomes 13, 18, 21, X et Y. L’analyse s’effectue sur 50 noyaux
et n’est considérée comme anormale pour une sonde donnée que si plus de 80 % des cellules examinées possèdent
un nombre anormal de signaux d’hybridation [15, 16]
(figure 2A). Ainsi un diagnostic prénatal des plus fréquentes aneuploïdies peut être fait en 48 heures en analysant
directement un grand nombre de cellules sans étape de
culture préalable. Cette rapidité d’obtention du résultat
constitue l’attrait principal de la technique et se compare
favorablement au délai de réponse habituel (10 à 15 jours
voire plus) de l’analyse cytogénétique classique. De plus
l’absence de culture cellulaire fait de cette technique une
approche assez simple [3].
Le diagnostic de sexe
L’hybridation in situ en fluorescence permet la détermination anténatale du sexe en utilisant les sondes qui identifient les régions centromériques des chromosomes X et Y
(figure 2B). Cette démarche est très utile pour le diagnostic prénatal des pathologies liées au chromosome X pour
lesquelles aucune étude moléculaire n’est possible [3]. La
recherche du gène SRY dans le sérum maternel constitue
actuellement une autre alternative pour le diagnostic prénatal du sexe [17].
Le diagnostic des microremaniements syndromiques
L’hybridation in situ en fluorescence permet aussi le diagnostic des microremaniements syndromiques qui peuvent être soit des duplications soit des microdélétions.
Décrites dans les années 1980 grâce à l’utilisation des
techniques cytogénétiques de haute résolution, certains microremaniements ont pu être rattachés à des syndromes
décrits cliniquement de longue date. D’autres ont permis
de décrire de nouveaux syndromes (cytogénétique syndromique) [18, 19]. La précision de la localisation chromosomique et le développement des techniques de biologie
moléculaire ont permis de cloner certains de ces loci et
l’hybridation in situ en fluorescence est utilisée actuellement pour confirmer le diagnostic d’au moins 18 syndromes grâce aux sondes correspondantes, c’est-à-dire locusspécifiques. La démarche diagnostique dans ce domaine
est particulière dans la mesure où c’est le clinicien qui
évoque le syndrome cliniquement et demande sa confirmation par le cytogénéticien (recherche du microremaniement par la sonde spécifique). Cependant, la détection de
ces microremaniements par la Fish dépend de leur fréquence pour chaque syndrome puisque certains de ces
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syndromes impliquent des gènes soumis à empreinte parentale et par conséquent peuvent être secondaires à une
disomie uniparentale dont le diagnostic ne peut être fait
que par des tests de biologie moléculaire. Par exemple
pour le syndrome de Willi-Prader, 70 % des cas sont dus à
une microdélétion au niveau du bras long du chromosome
15 (l5q12) (figure 2C) alors que 30 % sont liés à une
disomie uniparentale ou autre perturbation telle qu’une
anomalie de la méthylation [20-22]. Le syndrome de DiGeorge est un autre exemple où 90 % des cas sont liés à
une microdélétion du bras long du chromosome 22 (22ql1)
alors que 10 % des cas seraient liés à d’autres remaniements chromosomiques ou encore à des mutations géniques [23, 24].
Les applications spécifiques
aux anomalies acquises
En cytogénétique oncohématologique
Les études de cytogénétique classique au cours des hémopathies malignes ont permis de montrer que certains remaniements chromosomiques récurrents sont caractéristiques
et parfois même spécifiques. Ces remaniements ont pu
être directement ou indirectement reliés à des altérations
de gènes, oncogènes ou suppresseurs de tumeurs. La caractérisation moléculaire de certains réarrangements a permis
d’envisager l’utilisation de l’hybridation in situ en fluorescence dans ces hémopathies malignes aussi bien pour le
diagnostic que pour l’établissement du pronostic, le suivi
de l’évolution des clones anormaux et l’évaluation de certaines thérapeutiques telles que la greffe de moelle osseuse [25].
Ainsi pour les remaniements chromosomiques acquis récurrents de type translocations dont les points de cassure
clonés ont été utilisés pour produire des sondes spécifiques, l’hybridation permet la détection des cellules porteuses de la translocation sur métaphases et/ou noyaux
interphasiques sous la forme d’une fusion des deux gènes
se traduisant par la juxtaposition de deux spots de couleur
différente telle que la fusion bcr-abl pour la translocation
t(9;22)(q34;ql1) de la leucémie myéloïde chronique
(figure 2H). Les sondes peuvent aussi correspondre à un
seul gène ou à la région localisée entre deux points de
cassures tels que le gène MLL en 11q23 et la sonde de
l’inversion du chromosome 16 caractéristique des leucémies aiguës myéloïdes [26-28].
La peinture chromosomique contribue aussi à confirmer et
à caractériser les remaniements non récurrents découverts
en cytogénétique classique, de dévoiler certaines translocations cryptiques ou semicryptiques et d’identifier certains chromosomes marqueurs qui échappent à l’analyse
cytogénétique. C’est le cas par exemple des délétions du
bras long des chromosomes 5 et 7 au cours des myélodysplasies pour lesquelles l’hybridation in situ en fluores633
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C
D
E
F
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Cytogénétique moléculaire et anomalies chromosomiques
G
H
I
J
Figure 2. Fish sur métaphases et noyaux avec différentes sondes chromosomiques. A : Fish tricolore des trois sondes centromériques
des chromosomes X, Y et 18 sur des noyaux interphasiques de cellules amniotiques ne montrant pas d’anomalies de nombre (un spot
vert (X), un spot rouge (Y) et deux spots bleus (18)) ; B : Fish d’une sonde de séquences alphoïdes centromériques spécifique du
chromosome X sur métaphase montrant une trisomie X ; C : Fish d’une sonde du locus D15S10 localisé en 15q11-q13 et d’une sonde
témoin du locus PML (télomérique) montrant une microdélétion de la région 15q11-q13 sur une métaphase d’un patient atteint du
syndrome de Prader-Willi ; D : peinture bicolore des chromosomes 2 et 6 sur métaphase montrant une trisomie 6 partielle résultant
d’une translocation déséquilibrée ; E : Fish bicolore de la sonde centromérique du chromosome X et de la sonde de séquence unique
spécifique du gène SRY (en rouge) sur métaphase d’un homme XX ayant une translocation cryptique du gène SRY sur l’un des
2 chromosomes X ; F : Fish d’une sonde de type YAC, spécifique de la région terminale du bras long du chromosome 3 (3q28) sur
métaphase montrant, à côté de l’hybridation normale au niveau des bras longs des deux chromosomes 3, le marquage des deux
extrémités d’un petit marqueur acentrique formé par inversion duplication 3q ; G : Fish d’une sonde subtélomérique spécifique de
l’extrémité terminale du bras long du chromosome 13 (13q34-qter) sur métaphase montrant, à côté de l’hybridation normale au niveau
des bras longs des deux chromosomes 13, le marquage des deux extrémités d’un petit marqueur acentrique formé par inversion
duplication 13q ; H : Fish bicolore : détection de la translocation t(9;22)(q34;q11) sur noyaux interphasiques d’un patient atteint d’une
leucémie myéloïde chronique. Cohybridation de la sonde du locus M-bcr localisé en 22q11( rhodamine) et de la sonde du locus abl
localisé en 9q34 (FITC) ; I : Fish d’une sonde de séquences alphoïdes spécifiques du chromosome 8 sur noyaux interphasiques
médullaires montrant une trisomie 8 secondaire chez une patiente atteinte d’une leucémie myéloïde chronique ; J : peinture du
chromosome 22 sur métaphase d’un sarcome d’Ewing montrant la translocation d’un fragment du chromosome 22 sur le chromosome
11 d’une translocation à 3 chromosomes t(4;11;22) (q25;q24;ql1.2) identifiée par Fish.
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revue générale
cence a montré qu’elles ne sont pas toujours pures et qu’il
s’agit dans un bon nombre de cas de translocations déséquilibrées de matériel 5 et 7 [29].
Les anomalies secondaires de nombre comme les trisomies peuvent être confirmées par la peinture chromosomique et suivies au cours de l’évolution par des sondes alphoïdes (figure 2I).
Certaines hémopathies notamment lymphoïdes mais aussi
myéloïdes s’accompagnent d’anomalies de nombre à type
d’hypo- ou d’hyperploïdie et d’anomalies de structure assez complexes au cours des évolutions clonales. Dans ces
situations les méthodes de Fish ciblée ne sont pas toujours
efficaces et les techniques de CGH et d’hybridation in situ
en fluorescence en 24 couleurs prennent tout leur intérêt
pour déchiffrer les anomalies les plus subtiles et les plus
complexes [5, 30, 31].
Après allogreffe de moelle osseuse avec un donneur et un
receveur de sexe différent, l’hybridation in situ en fluorescence avec une sonde du chromosome Y ou deux sondes
des chromosomes X et Y (Fish bicolore) permet de montrer la présence de cellules hôtes résiduelles et de chiffrer
le chimérisme [32].
La recherche de la maladie résiduelle habituellement faite
par PCR, peut être assurée par Fish sur des cellules en
interphase avec des sondes de séquences uniques spécifiques du remaniement moléculaire primaire (un gène de
fusion par exemple) ou des sondes de séquences alphoïdes
lorsqu’il s’agit d’anomalies de nombre [32].
En cytogénétique des tumeurs solides
Les tumeurs solides présentent en général de très nombreux remaniements chromosomiques sous forme de déséquilibres récurrents correspondant à des gains, des pertes,
des délétions et des amplifications [25].
L’apport de la cytogénétique classique et moléculaire à
visée diagnostique est très limité dans ce domaine sauf
pour certaines tumeurs qui sont caractérisées par des réarrangements spécifiques, tels que les tumeurs neuroépithéliales (PNET) et le sarcome d’Ewing caractérisés par une
translocation récurrente t(11;22) (q24;ql1.2) et ses variantes [33] (figure 2J).
Cependant il a été suggéré que le taux d’altérations chromosomiques qui augmente avec la progression tumorale
aurait une valeur pronostique. Lorsqu’il existe une corrélation bien établie entre une amplification génique et un
pronostic défavorable telle que l’amplification de N-myc
dans les neuroblastomes l’hybridation génomique comparative ainsi que sa variante utilisant les micropuces à ADN
(CGH-microarray) restent les meilleures méthodes quantitatives permettant la recherche des séquences amplifiées
ou délétées. Cette technique permet par ailleurs d’avoir
une vision globale des anomalies déséquilibrées sans la
636
nécessité d’avoir des mitoses, ce qui constitue un avantage
certain [34, 35].
La multi-Fish permet aussi de mieux caractériser les remaniements de structure souvent complexes et de déterminer
l’origine de certains segments chromosomiques formés
par l’amplification de gènes (50-100 copies), anomalies
fréquemment observées dans les tumeurs solides. Ces amplifications peuvent prendre la forme soit de chromosomes
minuscules appelés doubles-minutes soit de segments de
coloration homogène, faits de duplications en tandem
d’une séquence génique, attachés à un ou plusieurs chromosomes et dits hsr (homogeneously staining region) [25].
Très récemment, la Fish sur noyaux interphasiques appliquée sur les frottis cytologiques urinaires et les lavements
bronchiques permet en utilisant un assortiment de sondes
centromériques ou de séquences uniques spécifiques des
chromosomes les plus concernés par les amplifications de
dresser le pronostic pré- et postopératoires des tumeurs
solides des tractus urinaire et respiratoire [36, 37].
Conclusion
L’introduction des techniques de cytogénétique moléculaire a permis d’élargir considérablement le champ d’application de la cytogénétique en diagnostic clinique. Outre
les applications déjà envisagées, on assiste actuellement à
une utilisation plus spécifique de ces techniques dans les
nouvelles approches diagnostiques, à savoir le diagnostic
préimplantatoire et l’étude des cellules fœtales dans le
sang maternel [38, 39].
Les techniques globales sont incontestablement prometteuses dans le domaine particulier de la cytogénétique
oncohématologique et des tumeurs solides. Elles ouvrent
la voie à la recherche de nouveaux gènes impliqués dans
la cancérogenèse et ce, en mettant en évidence des réarrangements récurrents et spécifiques avec caractérisation
moléculaire ultérieure des gènes impliqués.
Cependant, l’application de la cytogénétique moléculaire
et sa mise en place routinière dans les laboratoires de
cytogénétique reste confronté au problème majeur de son
coût assez onéreux.
Remerciements. Nous tenons à remercier Madame le docteur
Marie-France Portnoï (hôpital Saint-Antoine de Paris) de nous
avoir aimablement fourni les illustrations.
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