stratégies innovantes d`inactivation des norovirus : optimisation des

Transcription

STRATÉGIES INNOVANTES D’INACTIVATION DES
NOROVIRUS : OPTIMISATION DES PARAMÈTRES
OPÉRATIONNELS ET COMPRÉHENSION DES
MÉCANISMES D’ACTION
Thèse
ALLISON VIMONT
Doctorat en sciences et technologie des aliments
Philosophiae doctor (Ph.D.)
Québec, Canada
© Allison Vimont, 2015
Résumé
La majorité des gastroentérites non-bactériennes sont causées par les norovirus, qui se
transmettent principalement par les surfaces, les aliments et l’eau. La plupart des
désinfectants domestiques sont inefficaces contre ces virus à l’exception de l’acide
hypochloreux qui, cependant, perd une partie de son activité et génère des sous-produits
toxiques en présence de matières organiques. Des méthodes de désinfection
alternatives, efficaces et plus sécuritaires sont aujourd’hui nécessaires pour lutter contre
la propagation des norovirus. Ce projet de recherche a porté sur deux approches
prometteuses, les acides peroxycarboxyliques et les lumières pulsées.
Dans un premier temps, quatre acides peroxycarboxyliques ont été évalués en fonction
de leur concentration et du temps de contact. Les acides monoperoxycarboxyliques, à
savoir les acides peracétique et perpropionique, ont été les plus efficaces en réduisant
la charge virale d’environ 4 log10 après un traitement de 50 mg L-1 pendant 5 minutes.
Ces molécules ont conservé cette activité contre des norovirus déposés sur de l’acier
inoxydable et du PVC, propres ou sales, ainsi qu’immobilisés dans un biofilm artificiel.
Dans le cas de l’acide peracétique, les expérimentations ont démontré que cette
inactivation résultait principalement de dommages causés sur l’ARN viral, probablement
par l’intermédiaire de radicaux libres. À forte concentration, les protéines de la capside
étaient aussi altérées.
Dans un deuxième temps, les norovirus ont été traités par une lumière pulsée (200 à
1000 nm ; 0,69 J cm-2 par impulsion). Trois impulsions (1,6 seconde) ont diminué la
charge virale d’environ 4 log10 dans tous les milieux testés (tampon salin, eaux dures,
minérale et usées) à l’exception des eaux turbides. A la turbidité maximum (1000 NTU),
la réduction était de 2.4 log10. Cette technologie est aussi efficace pour la désinfection
de surfaces propres, même en présence d’un biofilm artificiel (4 log10 après
7 impulsions), mais est affectée par la présence de matières protéiques. Nous avons
démontré que les lumières pulsées inactivaient les norovirus en induisant des dommages
à la fois sur l’ARN viral et l’intégrité des particules.
En conclusion, ces résultats attestent l’efficacité de ces techniques et contribuent à une
meilleure compréhension de leur principe d'action.
iii
Abstract
The majority of non-bacterial gastroenteritis is caused by norovirus, which is transmitted
primarily through surfaces, food and water. Most household disinfectants are ineffective
against these viruses with the exception of the bleach which, however, loses partially its
activity and generates toxic residues in the presence of organic matter. Alternative,
effective and safer methods of disinfection are necessary to hamper the spread of
norovirus. This research project focused on two promising approaches, namely
peroxycarboxylic acids and pulsed light.
On the one hand, four peroxycarboxylic acids were evaluated based on their
concentration and contact time. Monoperoxycarboxylic acids, namely peracetic and
perpropionic acids, were the most effective by reducing the viral load of about 4 log10
after a treatment with 50 mg L-1 for 5 minutes. These molecules maintained their activity
against noroviruses attached on stainless steel and PVC, clean or dirty, and entrapped
in an artificial biofilm. In the case of peracetic acid, we showed that this inactivation was
mainly due to damages on the RNA, probably through free radicals. At high
concentrations, the capsid was also altered.
On the other hand, noroviruses were treated with pulsed light (200-1000 nm; 0.69 J cm-2
per pulse). Three pulses (1.6 seconds) decreased viral load of approximately 4 log10 in
all media tested (buffered saline, hard water, mineral water and sewage treatment
effluent) with the exception of turbid water. At the maximum turbidity (1000 NTU), the
reduction was 2.4 log10. This technology is also effective to disinfect clean surfaces even
in the presence of an artificial biofilm (4 log10 after 7 pulses), but is affected by the
presence of proteinaceous material. We demonstrated that the pulsed light inactivated
norovirus by inducing damage to both the RNA and the integrity of the particles.
In conclusion, these results demonstrate the effectiveness of these approaches and
contribute to a better understanding of their mechanism of action.
v
Table des matières
RESUME ........................................................................................................ III ABSTRACT........................................................................................................ V TABLE DES MATIERES ................................................................................... VII LISTE DES TABLEAUX ................................................................................. XIII LISTE DES FIGURES .................................................................................... XVII LISTE DES ABREVIATIONS ET DES SIGLES ............................................... XXIII REMERCIEMENTS ........................................................................................ XXV AVANT-PROPOS ......................................................................................... XXIX INTRODUCTION ............................................................................................... 1 CHAPITRE 1. REVUE DE LITTERATURE.......................................................... 3 1.1. GASTROENTERITES AIGUËS .......................................................................... 3 1.1.1. Microorganismes pathogènes impliqués ..............................................3 1.1.2. Virus alimentaires ............................................................................3 1.2. CARACTERISTIQUES GENERALES DES NOROVIRUS ................................................. 7 1.2.1. Découverte .....................................................................................7 1.2.2. Taxonomie et classification génétique .................................................7 1.2.3. Structure du virion ........................................................................ 11 1.2.4. Structure et organisation du génome................................................ 13 1.2.5. Caractères culturaux ...................................................................... 13 1.2.6. Modèles pour l’étude des norovirus humains ...................................... 15 1.2.6.1. 1.2.6.2. 1.2.6.3. 1.2.6.4. 1.2.6.5. Norovirus murins ............................................................................... 15 Vesivirus félin et canin ........................................................................ 16 Sapovirus porcins .............................................................................. 16 Tulane virus ...................................................................................... 17 Pseudo-particules virales..................................................................... 17 1.2.7.1. 1.2.7.2. 1.2.7.3. 1.2.7.4. 1.2.7.5. 1.2.7.6. Attachement ..................................................................................... 19 Entrée et transport intracellulaire ......................................................... 21 Décapsidation.................................................................................... 21 Traduction ........................................................................................ 21 Réplication du génome ....................................................................... 22 Assemblage et sortie .......................................................................... 23 1.2.7. Cycle de multiplication ................................................................... 17 1.3. INFECTION CHEZ L’HUMAIN ......................................................................... 23 1.3.1. Épidémiologie ............................................................................... 23 1.3.1.1. 1.3.1.2. 1.3.1.3. Maladie endémique et parfois épidémique.............................................. 23 Saisonnalité ...................................................................................... 25 Épidémiologie moléculaire ................................................................... 25 1.3.7.1. 1.3.7.2. Microscopie électronique ..................................................................... 30 Techniques immunologiques ................................................................ 31 1.3.2. 1.3.3. 1.3.4. 1.3.5. 1.3.6. 1.3.7. Dose infectieuse ............................................................................ 26 Signes cliniques ............................................................................ 27 Pathophysiologie ........................................................................... 28 Immunité ..................................................................................... 29 Excrétion virale ............................................................................. 29 Diagnostic clinique et détection environnementale .............................. 30 vii
1.3.7.3. Techniques moléculaires ..................................................................... 31 1.4. TRANSMISSION ET STABILITE ...................................................................... 33 1.4.1. Transmission de personne à personne .............................................. 33 1.4.2. Transmission par les aliments ......................................................... 37 1.4.2.1. 1.4.2.2. 1.4.2.3. 1.4.3. 1.4.4. 1.4.5. Fruits de mer .................................................................................... 37 Fruits et légumes............................................................................... 38 Manipulateurs d’aliments .................................................................... 38 Transmission par l’eau ................................................................... 39 Transmission par l’environnement ................................................... 41 Transmission par zoonose .............................................................. 43 1.5. STRATEGIES DE PREVENTION ET DE CONTROLE................................................... 44 1.5.1. Traitements .................................................................................. 44 1.5.1.1. 1.5.1.2. 1.5.2. Traitements préventifs ....................................................................... 44 Traitements curatifs ........................................................................... 44 Gestion des infections .................................................................... 44 1.6. DESINFECTION ....................................................................................... 45 1.6.1. Deux grandes approches : chimique et physique................................ 45 1.6.2. Inactivation virale : quelles cibles d’attaque ?.................................... 47 1.7. ACIDES PERACETIQUE ET PEROXYCARBOXYLIQUES ............................................... 49 1.7.1. Présentation ................................................................................. 49 1.7.1.1. 1.7.1.1. 1.7.1.2. 1.7.1.3. 1.7.1.4. 1.7.2. 1.7.3. 1.7.4. 1.7.5. 1.7.6. Formule chimique .............................................................................. 49 Synthèse chimique ............................................................................ 49 Détermination de la concentration en acide peroxycarboxylique ............... 51 Propriétés physiques et chimiques........................................................ 51 Décomposition .................................................................................. 53 Applications et réglementation ........................................................ 53 Avantages et inconvénients ............................................................ 55 Inactivation microbienne ................................................................ 55 Facteurs modulant l’activité ............................................................ 56 Mécanismes d’action ...................................................................... 56 1.8. LUMIERES PULSEES .................................................................................. 57 1.8.1. Présentation ................................................................................. 57 1.8.1.1. 1.8.1.2. 1.8.1.3. 1.8.1.4. 1.8.2. 1.8.3. 1.8.4. 1.8.5. 1.8.6. Nature électromagnétique de la lumière ................................................ 57 Émission, transmission et absorption de la lumière ................................. 59 Photochimie ...................................................................................... 61 Principe des lumières pulsées .............................................................. 61 Applications et réglementation ........................................................ 63 Avantages et inconvénients ............................................................ 63 Inactivation microbienne ................................................................ 65 Facteurs modulant l’activité ............................................................ 65 Mécanismes d’action ...................................................................... 67 CHAPITRE 2. CONTEXTE DU PROJET........................................................... 71 2.1. PROBLEMATIQUE ET HYPOTHESE DE TRAVAIL ..................................................... 71 2.2. OBJECTIFS............................................................................................ 72 CHAPITRE 3. ÉTUDE
DU
POTENTIEL
VIRUCIDE
DES
ACIDES
PEROXYCARBOXYLIQUES ORGANIQUES CONTRE LES NOROVIRUS SUR DES
SURFACES ALIMENTAIRES ............................................................................. 73 3.1. RESUME............................................................................................... 74 3.2. ABSTRACT ............................................................................................ 75 viii
3.3. INTRODUCTION....................................................................................... 76 3.4. MATERIALS AND METHODS .......................................................................... 77 3.4.1. Preparation of MNV-1 lysate ............................................................ 77 3.4.2. Viral quantification by plaque assay.................................................. 77 3.4.3. Preparation of peroxyacid solutions .................................................. 78 3.4.4. Liquid-phase inactivation of MNV-1 by peroxyacid .............................. 78 3.4.4.1. 3.4.4.2. Biocide concentration ......................................................................... 78 Virucidal activity of organic acids and hydrogen peroxide ......................... 79 3.4.5.1. 3.4.5.2. 3.4.5.3. Preparation of viral inoculum ............................................................... 79 Attachment surfaces........................................................................... 79 Experimental procedure ...................................................................... 79 3.4.6.1. 3.4.6.2. Preparation of the alginate film ............................................................ 81 Artificial biofilm experimental procedure ................................................ 81 3.4.5. Inactivation of MNV-1 attached to stainless steel or polyvinyl chloride ... 79 3.4.6. Inactivation of MNV-1 entrapped in alginate ...................................... 81 3.4.7. Statistical analysis ......................................................................... 83 3.5. RESULTS .............................................................................................. 83 3.5.1. Characteristics of peroxyacid solutions.............................................. 83 3.5.2. Aqueous phase activity of the four peroxyacid solutions against MNV-1 . 83 3.5.3. Involvement of organic acids and hydrogen peroxide in activity against
MNV-1 in suspension.................................................................................. 85 3.5.4. Activity of peroxyacid solutions on stainless steel and polyvinyl chloride
immobilized MNV-1 .................................................................................... 85 3.6. DISCUSSION ......................................................................................... 85 3.7. ACKNOWLEDGMENTS ................................................................................ 88 3.8. ETHICAL STANDARDS ................................................................................ 88 3.9. CONFLICT OF INTEREST ............................................................................. 89 CHAPITRE 4. MECANISME D’INACTIVATION DU NOROVIRUS MURIN 1 PAR
L’ACIDE PERACETIQUE .................................................................................. 91 4.1. RESUME ............................................................................................... 92 4.2. ABSTRACT ............................................................................................ 93 4.3. INTRODUCTION....................................................................................... 94 4.4. METHODS ............................................................................................. 96 4.4.1. Virus and cells .............................................................................. 96 4.4.2. Purification of MNV-1 ..................................................................... 96 4.4.3. Virus quantification by plaque assay ................................................. 96 4.4.4. Preparation of aqueous peracetic acid............................................... 97 4.4.5. Inactivation experiments ................................................................ 97 4.4.6. Transmission electron microscopy .................................................... 97 4.4.7. Analysis of viral proteins by SDS-PAGE under reducing conditions ........ 98 4.4.8. RNA extraction .............................................................................. 98 4.4.9. Analysis of viral RNA by electrophoresis ............................................ 98 4.5. RESULTS .............................................................................................. 98 4.5.1. Peracetic acid alters virus particle morphology ................................... 99 4.5.2. Peracetic acid randomly cleaves viral protein in severe conditions ....... 100 4.5.3. Peracetic acid randomly cleaves viral RNA ....................................... 101 4.6. DISCUSSION ....................................................................................... 102 ix
4.7. ACKNOWLEDGMENTS .............................................................................. 104 CHAPITRE 5. EFFICACITE ET MECANISMES D’INACTIVATION DU NOROVIRUS
MURIN PAR LA TECHNOLOGIE DES LUMIERES PULSEES .............................. 105 5.1. RESUME............................................................................................. 106 5.2. ABSTRACT .......................................................................................... 107 5.3. INTRODUCTION .................................................................................... 108 5.4. METHODS........................................................................................... 109 5.4.1. Virus and cells ............................................................................ 109 5.4.2. Virus quantification by plaque assay .............................................. 110 5.4.3. Pulsed light equipment ................................................................. 110 5.4.4. Fluence measurements ................................................................ 110 5.4.5. Liquid-phase inactivation of MNV-1 by pulsed light ........................... 110 5.4.6. Inactivation of MNV-1 attached to solid materials ............................. 111 5.4.7. Inactivation of MNV-1 entrapped in alginate .................................... 111 5.4.8. Experiments on mechanism of action ............................................. 112 5.4.8.1. 5.4.8.2. 5.4.8.3. 5.4.8.4. 5.4.8.5. 5.4.9. Transmission electron microscopy .......................................................112 Analysis of viral proteins by SDS-PAGE ................................................112 RNA extraction .................................................................................112 Analysis of viral RNA by electrophoresis ...............................................113 Analysis of photochemical products by UPLC-MS/MS ..............................113 Statistical analysis ....................................................................... 113 5.5. RESULTS ............................................................................................ 115 5.5.1. Activity of pulsed light against MNV-1 in aqueous suspension ............ 115 5.5.2. Activity of pulsed light against immobilized MNV-1 ........................... 115 5.5.3. Mechanism of action .................................................................... 117 5.6. DISCUSSION ....................................................................................... 121 5.7. ACKNOWLEDGMENTS .............................................................................. 124 CHAPITRE 6. DISCUSSION ET CONCLUSION GENERALE ........................... 125 6.1. ACIDES PEROXYCARBOXYLIQUES ................................................................. 125 6.1.1. Caractérisation des solutions d’acides peroxycarboxyliques ............... 126 6.1.2. Activité anti-norovirus .................................................................. 126 6.1.3. Mécanisme d’action ..................................................................... 128 6.2. LUMIERES PULSEES ................................................................................ 129 6.2.1. Caractérisation des traitements reçus par les échantillons ................. 129 6.2.2. Activité anti-norovirus .................................................................. 130 6.2.3. Mécanisme d’action ..................................................................... 131 6.3. CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES ..................................................... 132 6.3.1. Les acides peroxycarboxyliques ..................................................... 132 6.3.2. Les lumières pulsées.................................................................... 133 6.3.3. Validation de leur activité anti-norovirus ......................................... 135 6.3.4. Le dilemme des norovirus humains : comment s’assurer que les virus
détectés constituent un réel danger ? ......................................................... 135 ANNEXE 1. INACTIVATION DES VIRUS ALIMENTAIRES : RESULTATS
RECENTS
APPLICABLES
AUX
TECHNOLOGIES
DE
TRANSFORMATION
ALIMENTAIRE .............................................................................................. 137 A1.1. RESUME............................................................................................. 138 x
A1.2. ABSTRACT .......................................................................................... 139 A1.3. INTRODUCTION..................................................................................... 140 A1.4. PHYSICAL TREATMENTS............................................................................ 142 A1.4.1. Low-temperature-based methods .................................................. 142 A1.4.2. High-temperature-based methods .................................................. 144 A1.4.2.1. Principle and mode of action .............................................................. 144 A1.4.2.2. Virus inactivation by high-temperature treatments and factors affecting their
effectiveness .................................................................................................... 144 A1.4.3. UV light treatments ..................................................................... 145 A1.4.3.1. A1.4.3.2. A1.4.3.3. Principle and mode of action .............................................................. 145 Virus inactivation by UV light treatments ............................................. 146 Factors affecting the effectiveness of light treatments ........................... 147 A1.4.4.1. A1.4.4.2. Principle and mode of action .............................................................. 147 Virus inactivation by pulsed light treatments ........................................ 148 A1.4.4. Pulsed light treatments ................................................................ 147 A1.4.5. Irradiation treatments .................................................................. 149 A1.4.5.1. Principle and mode of action .............................................................. 149 A1.4.5.2. Virus inactivation by irradiation treatments and factors affecting their
effectiveness .................................................................................................... 150 A1.4.6. High-pressure treatments ............................................................. 151 A1.4.6.1. Principle and mode of action .............................................................. 151 A1.4.6.2. Virus inactivation by high-pressure treatments and factors affecting their
effectiveness .................................................................................................... 152 A1.4.7. Other physical technologies........................................................... 153 A1.4.7.1. A1.4.7.2. A1.4.7.3. A1.4.7.4. Ultrasound ...................................................................................... 153 Pulsed electric field treatment ............................................................ 153 Modified atmosphere packaging ......................................................... 154 Reduced water activity ..................................................................... 154 A1.5. CHEMICAL TREATMENTS ........................................................................... 154 A1.5.1. Washing ..................................................................................... 154 A1.5.2. Hypochlorous acid ....................................................................... 154 A1.5.2.1. A1.5.2.2. Principle and mode of action .............................................................. 155 Virus inactivation by hypochlorous acid and parameters affecting its efficiency
156 A1.5.3. Chlorine dioxide .......................................................................... 156 A1.5.3.1. A1.5.3.2. Principle and mode of action .............................................................. 156 Virus inactivation by chlorine dioxide and parameters affecting its efficiency
157 A1.5.4. Ozone ........................................................................................ 158 A1.5.4.1. A1.5.4.2. Principle and mode of action .............................................................. 158 Virus inactivation by ozone and parameters affecting its efficiency .......... 159 A1.5.5.1. A1.5.5.2. Principle and mode of action .............................................................. 159 Virus inactivation by peracetic acid and parameters affecting its efficiency 160 A1.5.6.1. A1.5.6.2. A1.5.6.3. A1.5.6.4. Iodophores ..................................................................................... 160 Surfactants ..................................................................................... 160 Alcohols.......................................................................................... 161 Acids .............................................................................................. 162 A1.5.5. Peroxyacids ................................................................................ 159 A1.5.6. Other chemical agents ................................................................. 160 A1.6. CONCLUSION ....................................................................................... 162 RÉFÉRENCES ................................................................................................ 163 xi
Liste des tableaux
Tableau 1.1 Liste des cinq principaux agents pathogènes responsables des maladies
d’origine alimentaire au Canada [11] et aux États-Unis [12]. Les chiffres entre
parenthèses correspondent au nombre annuel de cas estimés entre 2000 et 2008. .... 4 Tableau 1.2 Répartition des virus alimentaires les plus fréquemment rencontrés selon
la nature des maladies qu'ils provoquent : gastroentérites, hépatites et autres maladies
comme les infections respiratoires, les encéphalites et les méningites [13]. Les chiffres
entre parenthèses correspondent au nombre annuel de cas estimés au Canada entre
2000 et 2008 [11]. ........................................................................................... 4 Tableau 1.3 Quelques caractéristiques des principaux virus alimentaires sévissant au
Canada. .......................................................................................................... 5 Tableau 1.4 Liste des cinq genres actuellement acceptés dans la famille Caliciviridae
ainsi que l’espèce type représentant chacun des genres et une liste non exhaustive de
leurs hôtes [15]. .............................................................................................. 9 Tableau 1.5 Nomenclature et fonctions des protéines structurales et non structurales
des norovirus. Les noms entre parenthèses sont les autres noms reçus par ces protéines
dans la littérature. Les fonctions portant le symbole * ont été proposées, mais pas
démontrées. ................................................................................................... 12 Tableau 1.6 Caractéristiques des principaux virus utilisés en tant que modèles des
norovirus humains. Ce sont des virus nus dont la capside a un diamètre compris entre
27 et 40 nm et une symétrie icosaédrique et dont le matériel génétique est sous forme
d’ARN simple brin de polarité positive [15]. ......................................................... 14 Tableau 1.7 Facteurs facilitant la propagation et la persistance des norovirus ......... 34 Tableau 1.8 Exemples d'épidémies de gastroentérites dues aux norovirus où la
transmission de personne à personne a été mise en évidence. ............................... 35 Tableau 1.9 Exemples d'épidémies de gastroentérites dues aux norovirus où la
transmission par les aliments a été mise en évidence. .......................................... 36 Tableau 1.10 Exemples d'épidémies de gastroentérites dues aux norovirus où la
transmission par les aliments due à un manipulateur symptomatique ou asymptomatique
a été mise en évidence. .................................................................................... 36 xiii
Tableau 1.11 Exemples d'épidémies de gastroentérites dues aux norovirus où la
transmission par la consommation d’eau contaminée a été mise en évidence. .......... 39 Tableau 1.12 Exemples d'épidémies de gastroentérites dues aux norovirus où la
transmission par l'environnement a été mise en évidence. .................................... 40 Tableau 1.13 Exemples d’avantages et d’inconvénients des acides peroxycarboxyliques
et des lumières pulsées. ................................................................................... 46 Tableau 1.14 Caractéristiques de la liaison entre un atome d’oxygène et un autre atome
[507]. ........................................................................................................... 50 Tableau 1.15 Exemples d’inactivation obtenue avec l’acide peracétique contre des virus
nus en suspension. .......................................................................................... 54 Tableau 1.16 Exemples d’inactivation obtenue avec l’acide peracétique contre des virus
nus immobilisés sur des surfaces inertes. ........................................................... 54 Tableau 1.17 Exemples d’inactivation obtenue avec l’acide peracétique contre des virus
nus immobilisés sur de la laitue. ........................................................................ 54 Tableau 1.18 Énergie de certaines liaisons retrouvées dans les systèmes biologiques
avec la longueur d’onde correspondante [554]. ................................................... 60 Tableau 1.19 Exemples d’inactivation obtenue avec les lumières pulsées contre des
virus nus en suspension. .................................................................................. 64 Tableau 1.20 Exemples d’inactivation obtenue avec les lumières pulsées contre des
virus nus immobilisés sur des surfaces inertes. .................................................... 64 Table 3.1 pH and redox potential (E, mV) of peroxyacid solutions (Cmin = 50 mg L-1;
Cmax = 1000 mg L-1) and hydrogen peroxide (Cmin = 20 mg L-1; Cmax = 1500 mg L-1). 80 Table 3.2 Concentrations (g L-1) of L-cysteine hydrochloride diluted in complete DMEM
and at a final pH of 7 used to neutralize the PAA, PPA, PLA and PCA solutions at the four
peroxyacid concentrations tested (50, 250, 500 and 1000 mg L-1). ......................... 80 Table 3.3 Inactivation of MNV-1 on stainless steel, polyvinyl chloride and in alginate
after 5 minutes of contact with PAA or PPA at a concentration of 50 mg L-1. Viral titers
of controls were (i) 4.18 ± 0.13 log10 pfu per disk under clean conditions and 4.83 ±
0.34 log10 pfu per disk under fouled conditions for stainless steel, (ii) 5.06 ± 0.04 log10
pfu per disk under clean conditions and 4.69 ± 0.32 log10 pfu per disk under fouled
conditions for polyvinyl chloride, and (iii) 5.96 ± 0.22 log10 pfu g-1 in alginate film. Disks
were 1 cm in diameter and alginate film samples were 2.4 cm in diameter. ............. 84 xiv
Table 5.1 Broadband and UV energies measured 80 mm below the xenon lamp using
respectively Nova and ILT1700 radiometers. UV energy is approximately 2 % of the
broadband energy (200 to 1000 nm) and appears in parentheses. Total energies
received at the sample surface from one pulse were calculated by multiplying the fluence
(J cm-2) by the exposed surface area: 2.00 cm² for suspensions, 1.04 cm² for hard
materials, and 4.54 cm² for alginate film. Energies were averaged over 12 pulses
measured at four different locations. ................................................................ 114 Table 5.2 Characteristics of sterile solutions used in this study before pulsed light
treatment: Turbidity (Tu), conductivity (σ), reduction potential (E), dissolved O2 (DO),
absorbance at 254 nm (A254
nm)
and transmittance at 254 nm (T254
nm).
................ 114 Table A.6.1 Overview of physical and chemical treatments used to inactivate foodborne
viruses. ........................................................................................................ 143 xv
Liste des figures
Figure 1.1 Photographie en microscopie électronique d’un agrégat de norovirus humains
provenant de l’épidémie de Norwalk en 1968. Échelle : 100 nm [16]. ...................... 6 Figure 1.2 Relation phylogénétique entre les cinq genres acceptés et quatre des genres
proposés pour classer les calicivirus [35]. Les analyses ont été basées sur la séquence
complète en acides aminés de la protéine non structurale (a) et de la protéine majeure
de la capside VP1 (b). L’échelle représente la distance génétique. ........................... 8 Figure 1.3 Classification des norovirus en sept génogroupes selon la diversité de la
séquence en acides aminés de la protéine de la capside VP1. Les séquences de la protéine
correspondante de 105 souches ont été utilisées pour construire cet arbre. Les auteurs
proposent que la souche GII.15 (cercle en pointillés) s’insère dans un nouveau
génogroupe. Les virus du génotype GII.14 (flèche) sont responsables de la majorité des
infections dues aux norovirus. Les hôtes sont indiqués à côté de chaque génogroupes.
L’échelle correspond au nombre de substitutions d’acides aminés par site. Adapté de
Vinjé [36]........................................................................................................ 8 Figure 1.4 Structure d’une particule « virus-like » reconstituée par cryo-microscopie
électronique à 22 Å et par cristallographie aux rayons X à 3.4 Å : (A) surface ; (B) section
transversale ; (C) protéine de la capside sous forme de monomère ; (D) protéine de la
capside sous forme de dimère. Chaque monomère se compose d’une région N-terminale
faisant face à la l’intérieur de la capside (en vert), d’un domaine S constituant la
structure interne icosaédrique continue de la capside (en jaune) et d’un domaine P
formant la partie externe de la capside. Ce domaine P est divisé en deux sousdomaines : P1 (en rouge) et P2 (en bleu) [62]..................................................... 10 Figure 1.5 Organisation du génome des norovirus humains et murins. (A) L’ARN
génomique des norovirus humains est relié de manière covalente à la protéine VPg
(triangle vert) à son extrémité 5’ et polyadénylé à son extrémité 3’ (AAAA(n)). Il est
divisé en trois ORFs : l’ORF1 codant une polyprotéine qui sera clivée en six protéines par
la protéase virale NS6, l’ORF 2 codant la protéine majeure de la capside (VP1) et l’ORF 3
codant la protéine mineure de la capside (VP2). (B) Les ORFs 2 et 3 sont traduits à partir
des ARN subgénomiques. Le génome des norovirus murins a une organisation similaire
excepté qu’il contient un quatrième ORF sur l’ARN subgénomique codant un facteur de
virulence (VF1). .............................................................................................. 12 xvii
Figure 1.6 Proposition d'une stratégie pour la réplication des norovirus. (1) Les
norovirus s’attachent à leur cellule hôte par l’intermédiaire de structures saccharidiques,
comme le MNV-1 qui reconnaît les résidus d’acide sialique présents sur les glangliosides
GD1a, et (2) sont internalisés probablement par un mécanisme d’endocytose. (3) Le
virion est décapsidé et l’ARN est libéré dans le cytoplasme. (4) L’ARN est traduit par la
machinerie cellulaire de l’hôte suite à une initiation résultant d’une interaction avec la
protéine VPg ou les structures secondaires de l’ARN. (5) L’ORF1 est transcrit en une
polyprotéine qui est co- et post-clivée par la protéase virale NS6. (6) Un complexe de
réplication est formé à partir des membranes du réticulum endoplasmique, de l’appareil
de Golgi et des endosomes recrutées par les protéines virales non structurales NS1/2 et
NS4. (7) L’ARN est répliqué en ARN génomiques et subgénomiques par la polymérase
virale NS7. Les génomes répliqués sont traduits au niveau du complexe de réplication
ou encapsidés dans les particules nouvellement formées qui (8) sortent alors de la cellule
hôte en provoquant sa lyse par apoptose. Adapté de Thorne et coll. [101]. ............. 18 Figure 1.7 Voies de synthèse des antigènes des groupes sanguins et tissulaires du
système ABH et Lewis selon le phénotype sécréteur ou non des individus. Abréviations :
Gal
pour
galactose
;
GlcNAc
pour
N-acétylglucosamine
;
GalNAc
pour
N-acétylgalactosamine ; Fuc pour fucose. Adapté de Ruvoën-Clouet et coll. [158]. ... 20 Figure 1.8 Répartition des épidémies dues aux norovirus qui se sont déclarées aux
États-Unis entre 2009 et 2013 selon les établissements touchés et le mode de
transmission. Le nombre d’épidémies dans les différents établissements est donné pour
les transmissions par les aliments () et de personne à personne () [186]. ........... 24 Figure 1.9 Cycle de transmission des norovirus. Il commence avec des individus infectés
(symptomatiques ou non) qui excrètent du virus dans leurs fèces et, dans le cas des
personnes symptomatiques, dans leurs vomissures. Les virus peuvent alors être
transmis à une personne saine par l’intermédiaire d’un contact de personne à personne,
des aliments prêts-à-manger ou mangés crus, de l’eau de consommation ou de loisir ou
encore par les surfaces environnementales. Notons qu’une contamination peut
emprunter plusieurs de ces vecteurs de transmission comme, par exemple, des légumes
contaminés par l’eau d’irrigation. Les personnes saines susceptibles d’être contaminées
incluent des personnes sensibles aux norovirus (statut sécréteur, 80 % de la population
caucasienne)
et
d’autres
naturellement
résistantes
(statut
non-sécréteur).
Les
personnes au statut sécréteur dont l’immunité acquise n’est plus active sont infectées et
sont à l’origine d’un nouveau cycle. Adapté de Hall et coll. [3]. .............................. 32 xviii
Figure 1.10 Illustration de l’implication relative des modes de transmission direct et
indirect des norovirus, proposée par Lopman et coll. [465]. Ils suggèrent que le plus fort
risque de contamination a lieu suite à un contact direct avec une personne contaminée.
Cependant, ce risque s’atténue assez rapidement. Quelques jours après la déclaration
de la maladie, le risque majeur de contamination provient d’une transmission
environnementale. Ce risque s’atténue avec le temps, mais persiste pendant au moins
deux semaines. ............................................................................................... 42 Figure 1.11 Cibles d’attaque possibles permettant d’inactiver un virus nus, incluant (A)
les structures impliquées dans la reconnaissance de la cellule hôte, (B) les acides
nucléiques ou (C) la capside [7]. ....................................................................... 47 Figure 1.12 Organigramme présentant la place des acides peroxycarboxyliques au sein
des groupes formant les peroxydes organiques. L’acide peracétique est un des
représentants des acides peroxycarboxyliques. .................................................... 48 Figure 1.13 Formule semi-développée de l’acide peracétique................................ 48 Figure 1.14 Illustration du spectre électromagnétique allant des rayons  aux ondes
radio, en passant par les rayons X (RX), les ultraviolets (UV), la lumière du visible
(arc-en-ciel), les infrarouges (IR), les ondes radar (OR) et les ondes radio. Les
fréquences (Hz), les longueurs d’ondes () et l’énergie des photons (E) correspondantes
sont indiquées. Les UV sont sous-divisés en quatre régions, les UV lointains, les UV-C,
les UV-B et les UV-A. Notons que les limites entre les régions de ce spectre sont en
réalité moins nettes [552]. ............................................................................... 58 Figure 1.15 Schématisation d’un équipement générant des lumières pulsées. ......... 60 Figure
1.16
Schématisation
de
deux
systèmes
proposés
par
Dunn
et
coll.
[562] intégrant les lumières pulsées sur des chaînes de production. (A) Appareil traitant
des fluides alimentaires pompables au moment de leur écoulement dans l’enveloppe
entourant la source lumineuse. (B) Appareil de conditionnement aseptique qui remplit
de façon continue un film d'emballage stérilisé par les lumières pulsées. ................. 62 Figure 1.17 Spectres d’absorbance des bases puriques (adénine et guanine) et
pyrimidiques (thymine et cytosine) en solution aqueuse à pH neutre [554]. ............. 66 Figure 1.18 Principaux photoproduits induits par les UV sur les bases azotées. (A)
Exemples de dimères cyclobutaniques à partir d’uracile. Les dimères pyrimidiques se
forment entre deux bases pyrimidiques adjacentes (uracile, thymine ou cytosine). Ce
sont les photoproduits les plus toxiques et mutagènes chez les bactéries. (B) Exemple
xix
de photoproduits 6-4 et d’isomères de valence Dewar à partir d’uracile. Ces
photoproduits se forment aussi entre deux bases pyrimidiques adjacentes et sont les
deuxièmes plus fréquents. (C) Exemple de photoproduit monomérique à partir de
cytosine. (D) Exemple de photoproduit monomérique à partir de thymine. (E) Principaux
photoproduits formés à partir de bases puriques. ................................................. 68 Figure 1.19 Photographies prises en microscopie électronique à transmission d’une
suspension de Listeria monocytogenes non traitée (A), traitée aux UV (B) et traitée aux
lumières pulsées (C) [608]. .............................................................................. 69 Figure 3.1 Inactivation of MNV-1 after 1 (
), 5 (
) and 10 (
) minutes in suspension
containing a) PAA; b) PCA; c) PLA; d) PPA at 50, 250, 500 and 1000 mg L-1 at room
temperature. Results represent mean log10 reduction based on plaque assay. “#” means
that the reduction was complete (> 4.10 log10). Treatments with the same letter did not
differ significantly. The error bars represent standard errors. ................................. 82 Figure 4.1 Transmission electron microscope images of MNV-1 stained with 3 %
aqueous uranyl acetate. Peracetic acid alters viral particle morphology. MNV-1 was
inactivated partially after 5 minutes of exposure to 50 mg L-1 (3.71 ± 0.04 log10 drop in
infectivity) and completely after 10 minutes of exposure to 1000 mg L-1. A: untreated
MNV-1. B and C: MNV-1 treated with 50 mg L-1 for 5 minutes. D to F: MNV-1 treated
with 1000 mg L-1 for 10 minutes. 1: small distorted particle. 2: irregular and distorted
particle. 3: folded particle. 4: empty particle. ...................................................... 99 Figure 4.2 SDS-PAGE analysis of purified MNV-1 untreated, exposed to 50 mg L-1 of
peracetic acid for 5 minutes and to 1000 mg L-1 for 10 minutes. Viral proteins were
visualized on 10 % polyacrylamide using Coomassie blue staining. VP1 = MNV-1 major
capsid protein, VP2 = MNV-1 minor capsid protein. ............................................ 100 Figure 4.3 Peracetic acid degrades viral RNA. Viral RNA was extracted from purified
MNV-1 after experimental treatments. Samples were loaded onto a 6000 RNA Pico Chip
and analyzed on a Bioanalyzer with a UV detector. Results are presented in
electropherogram form. Light gray curve: untreated MNV-1; gray curve: treated with
50 mg L-1 peracetic acid solution for 5 minutes; black curve: treated with 1000 mg L-1
for 10 minutes. Electropherograms shown are averages of triplicate analyses. ....... 101 Figure 5.1 Inactivation of MNV-1 in experimentally contaminated hard waters (A) and
turbid waters (B) after pulsed light treatments at 80 mm from the xenon lamp:
0.69 J cm-2 (
xx
), 2.07 J cm-2 (
), 3.45 J cm-2 (
) and 4.84 J cm-2 (
) provided in 1, 3,
5 and 7 pulses respectively. Water hardness was adjusted with calcium carbonate.
Turbidity was adjusted with bentonite suspended in PBS. Values are mean log10 reduction
per mL of three replicates from at least two independent experiments. The + symbol
indicates that inactivation of the virus was total. The error bars represent standard error.
.................................................................................................................. 116 Figure 5.2 Inactivation of MNV-1 on experimentally contaminated polyethylene (A),
polyvinyl chloride (B) and stainless steel (C) disks (1.04 cm²) under clean (
) and fouled
( ) conditions after treatment with pulsed light at 80 mm from the xenon lamp. Fluence
increased from 0.69 to 8.98 J cm-2 as the number of pulses increased from 1 to 13.
Values are mean log10 reductions of infectious particles per cm² based on three replicates
and at least two independent experiments. The + symbol indicates that inactivation of
the virus was total. The error bars represent standard error. ............................... 118 Figure 5.3 Viral particles disrupted by pulsed light. Infectivity of purified MNV-1 dropped
by 5.15 ± 0.18 log10 after treatment with 2.07 J cm-2 (3 pulses) and was completely
eliminated after treatment with 8.98 J cm-2 (13 pulses). Treated and untreated viral
particles were stained with 3 % aqueous uranyl acetate and visualized by transmission
electron microscopy. A – untreated MNV-1; B and C – MNV-1 treated with 3 pulses; D
and E – MNV-1 treated with 13 pulses; 1 – intact particle; 2 – apparently intact particles;
3 – distorted particle; 4 – debris; 5 – empty particle. ......................................... 119 Figure 5.4 SDS-PAGE analysis of purified MNV-1 untreated, treated with 2.07 J cm-2 (3
pulses) and treated with 8.98 J cm-2 (13 pulses). Viral proteins were analyzed on 10 %
SDS-PAGE followed by Coomassie staining. VP1 = major capsid protein. ............... 119 Figure 5.6 Viral genomic RNA degraded by pulsed light. Viral genomic RNA extracted
from treated or untreated purified MNV-1 was loaded onto a 6000 RNA Pico Chip and
analyzed on a Bioanalyzer with a UV detector. Results are presented in electropherogram
form. Black = untreated MNV-1, gray = 2.07 J cm-2 (3 pulses), light gray = 8.98 J cm-2
(13 pulses). Electropherograms are averages of triplicate analyses. ...................... 120 Figure A.6.1 Overview of mechanisms of inactivation of viruses. ......................... 141 Figure A.6.2 Internationally recognized logo for irradiated foods ......................... 149 xxi
Liste des abréviations et des sigles
ADN
Acide désoxyribonucléique
ARN
Acide ribonucléique
ASTM
American society for testing and materials
EASAC
European academies science advisory council
ELISA
Enzyme-linked immunosorbent assay
FCV
Feline calicivirus
FDA
Food and drug administration
FUT
Fucosyltransférase
GII.4
Génogroupe 2 sous-génogroupe 4
HBGA
Histo blood group antigens
HID50
50 % human infectious dose
ICTV
International committee on taxonomy of viruses
IR
Rayonnement infrarouge
MNV
Murine norovirus
NASBA
Nucleic acid sequence-based amplification
NS
Non-structural protein
ORF
Open reading frame
PAA
Peracetic acid
PCA
Percitric acid
PET
High density polyethylene
PLA
Perlactic acid
PMA
Propidium monoazide
PPA
Perpropionic acid
PVC
Polyvinyl chloride
RT-LAMP
Reverse transcribed loop mediated isothermal amplification
RT-PCR
Reverse transcription polymerase chain reaction
SRSV
Small round-structured virus
UV
Rayonnement ultraviolet
VF1
Virulence factor 1
VLP
Virus-like particles
VP1
Viral protein 1
VP2
Viral protein 2
VPg
Viral protein genome-linked
xxiii
Remerciements
En préambule à cette thèse, je souhaite adresser mes remerciements les plus sincères
aux personnes qui m’ont apporté leur aide et qui ont contribué à l’élaboration de ce
travail. Ce dernier a été réalisé au sein de l’Institut sur la Nutrition et les Aliments
Fonctionnels (INAF) dans l’équipe de virologie alimentaire sous la direction du professeur
Julie Jean et du professeur Ismaïl Fliss.
À ma directrice le Professeur Julie Jean
Professeur titulaire de l’Université Laval
Faculté des sciences de l'agriculture et de l'alimentation
En m’accueillant dans ton équipe de virologie alimentaire pour une maîtrise, tu m’as
ouvert les portes du monde de la recherche. Deux ans plus tard, tu me proposais ce
sujet de thèse que j’ai accepté avec plaisir. Je te remercie d’avoir eu confiance en moi
pour mener à bien ce travail. Je tiens également à te remercier de m’avoir donné
l’occasion d’encadrer un cours à distance durant plusieurs années et ainsi d’entrevoir le
monde de l’enseignement.
À mon codirecteur le Professeur Ismaïl Fliss
Professeur titulaire de l’Université Laval
Tu as accepté d’être mon codirecteur deux fois consécutives, je t’en remercie. Sache
que je t’ai toujours considéré comme un directeur. J’ai grandement apprécié tes conseils
avisés, tes encouragements et ta participation active pour m’aider à finir ce travail dans
des délais raisonnables. Je souhaite aussi te remercier pour toutes ces opportunités
concomitantes à mon doctorat que tu m’as offertes comme les contrats en bactériologie
ou l’encadrement d’un autre cours à distance. Je ne saurais finir ce paragraphe sans te
remercier d’avoir libéré Benoît une session durant, le temps de mes traitements et de
mon rétablissement.
À Monsieur Le Professeur Steve Labrie
Professeur agrégé de l’Université Laval
Je te suis reconnaissante d’avoir accepté d’être le pré-lecteur de ce travail de thèse et
c’est un honneur que de te compter parmi les membres de ce jury.
xxv
À Monsieur Le Professeur Alexander Culley
Professeur adjoint de l’Université Laval
Faculté des sciences et de génie
Je vous remercie de l’intérêt que vous avez bien voulu porter à ce travail en acceptant
d’en être l’examinateur interne. C’est avec plaisir que je vous adresse mes sincères
remerciements.
À Madame Le Chercheur Soizick Le Guyader
Chercheur scientifique à l’institut français de recherche pour l'exploitation de la mer
Laboratoire Santé Environnement et Microbiologie des Mollusques
J’ai été très sensible à l’intérêt que vous avez bien voulu accorder à ce travail en
acceptant de le juger et de vous déplacer jusqu’au Canada. C’est avec plaisir que je vous
adresse mes sincères remerciements.
À John Wiley & Sons Ltd
Je remercie la maison d’édition John Wiley & Sons Ltd de m’avoir gracieusement permis
d’inclure en annexe de ce mémoire l’intégralité du chapitre de livre intitulé « Inactivation
of Foodborne Viruses: Recent Findings Applicable to Food-Processing Technologies »
publié dans le livre « Practical Food Safety Contemporary Issues and Future Directions »
© 2014 John Wiley & Sons, Ltd.
À Monsieur Le Chercheur Didier Buisson
Directeur de recherche CNRS au Muséum National d’Histoire Naturelle de Paris
Chimie des associations fongiques
Je tiens à te remercier pour tes conseils avisés en tant que chimiste ainsi que pour ta
gentillesse, ta bonne humeur et ta disponibilité.
À Diane Gagnon
Professionnelle de recherche
Merci pour ta disponibilité, tes conseils, tes encouragements, ton humour et ta bonne
humeur à toute heure.
xxvi
À Marine Béguin
Technicienne en travaux d'enseignement et de recherche
Merci aussi pour ta disponibilité, tes conseils, tes encouragements et ton aide dans la
mise en service de la nouvelle machine aux lumières pulsées.
À Céline Paquin, Marie-Michelle Gagnon, Catherine Viel et Isabelle Dufort
Je vous exprime aussi ma gratitude, car vous avez facilité mes travaux de thèse.
À Christophe Le Lay, Hélène Gaudreau, Cyril Roblet, Jérémy Théolier, Geneviève
Petit, Marie-Hélène Lessard, Fatoumata Diarrassouba, Idrissa Samandoulgou
et tous les autres étudiants du local 2402
Merci pour ces moments de partage et les échanges que nous avons pu avoir.
Enfin, à ma famille, mon conjoint et mes proches
Mes derniers remerciements iront à ma famille et mes proches, notamment ma mère,
mon beau-père, mes frères et mes grands-mères ainsi qu’Audrey, nouvellement docteur
en sciences. Une forte pensée à la mémoire de mon grand-père, Yvon Le Corguillé. C’est
en partie grâce à vous que je suis devenue la personne que je suis aujourd’hui,
notamment capable de réaliser ce travail de longue haleine. Vous m’avez profondément
manqué durant ces 5 années. Et un grand merci à toi, Benoît Fernandez, pour ton
soutien, tes encouragements, tes critiques, nos nombreux échanges scientifiques et ta
présence de tous les jours… Sans toi, cette aventure ne se serait probablement pas
réalisée.
xxvii
Avant-Propos
Le présent document traite d’un sujet d’actualité ayant un lien direct avec la santé
publique. Il s’inscrit dans une démarche visant à lutter contre la propagation des
norovirus par le biais de stratégies innovantes de désinfection. Pour relater les résultats
obtenus dans le cadre de ce travail, le présent rapport s’articule en six chapitres dont
trois sont présentés en anglais sous forme d’articles scientifiques.
Le premier chapitre intitulé « Revue de littérature » introduit les connaissances actuelles
et les problématiques reliées aux norovirus, ainsi que les moyens de prévention et de
contrôle actuellement disponibles. Ce dernier point a partiellement fait l’objet d’un
chapitre de livre intitulé « Inactivation of Foodborne Viruses: Recent Findings Applicable
to Food-Processing Technologies » qui a été publié en juin 2014 dans le livre « Practical
Food Safety Contemporary Issues and Future Directions » et qui est présenté en
annexe 1. J’ai écrit ce chapitre sous la direction du Pr. Julie Jean et du Pr. Ismaïl Fliss.
Le deuxième chapitre fait brièvement état du contexte de l’étude et présente l’hypothèse
ainsi que les objectifs de recherche.
Le troisième chapitre intitulé « Study of the virucidal potential of organic peroxyacids
against norovirus on food-contact surfaces » a été réalisé sous la direction du Pr. Julie
Jean et du Pr. Ismaïl Fliss. J’ai réalisé l’ensemble des expériences, le traitement des
résultats ainsi que la plus grande partie de la rédaction. Je suis le premier auteur de cet
article scientifique qui a été publié en mars 2015 dans le journal Food and Environmental
Virology, 7 (1) : 49-57 (IF2013 = 1,975 ; Q2 en sciences environnementales, Q3 en
microbiologie, Q3 en virologie).
Le quatrième chapitre intitulé « Mechanism of inactivation of murine norovirus strain 1
by aqueous peracetic acid » a été réalisé sous la direction du Pr. Julie Jean et du
Pr. Ismaïl Fliss. J’ai réalisé l’ensemble des expériences, le traitement des résultats ainsi
que la plus grande partie de la rédaction. Je suis le premier auteur de cet article
scientifique qui a été soumis en novembre 2014 dans le journal Journal of Applied
Microbiology (IF2013 = 2,386 ; Q2 en biotechnologie et microbiologie appliquée).
Le cinquième chapitre intitulé « Efficacy and mechanisms of murine norovirus inhibition
by pulsed-light technology » a été réalisé sous la direction du Pr. Julie Jean et du
Pr. Ismaïl Fliss. J’ai réalisé l’ensemble des expériences, le traitement des résultats ainsi
que la plus grande partie de la rédaction. Je suis le premier auteur de cet article
xxix
scientifique qui a été publié en avril 2015 dans le journal Applied and Environmental
Microbiology, doi : 10.1128/AEM.03840-14 (IF2013 = 3,952 ; Q1 en microbiologie).
Le sixième chapitre intitulé « Discussion et conclusion générale » est consacré à une
discussion générale ainsi qu’aux perspectives soulevées par ces travaux.
xxx
Introduction
Les maladies d’origine alimentaire et hydrique sont aujourd’hui une préoccupation
majeure pour les secteurs de la santé et alimentaire. Ces infections sont responsables
d’une forte morbidité et s’accompagnent de pertes économiques considérables. Les
norovirus humains à eux seuls sont responsables de 18 % des gastroentérites aiguës à
travers le monde, aussi bien dans les pays développés qu’en voie de développement [1].
Ces récentes estimations corroborent la classification des norovirus en tant qu’agents
biologiques de deuxième plus haute priorité (catégorie B) par le ministère américain de
la santé et des services sociaux. Cette catégorie rassemble d’autres microorganismes
tels que Campylobacter jejuni, Salmonella et Listeria monocytogenes. Pour les norovirus,
ce statut est justifié par leur dissémination relativement facile, la morbidité modérée, le
faible taux de mortalité associés aux épidémies ainsi que par les améliorations à apporter
au niveau de leur détection et de leur surveillance [2].
La transmission des norovirus est principalement véhiculée par les personnes, les
aliments crus ou peu cuits, l’eau et les surfaces [3]. Les biofilms peuvent également être
impliqués dans la dissémination, car les norovirus sont capables d’y pénétrer et d’y
résider [4]. Interrompre la transmission des norovirus en les inactivant directement dans
les aliments, l’eau ou sur les surfaces demeure la stratégie primaire de prévention [5].
Les traitements actuellement disponibles incluent la désinfection chimique avec
notamment le chlore, les ammoniums quaternaires ou les alcools ainsi que des procédés
physiques tels que la chaleur ou la lumière UV. Bien que ces moyens soient généralement
efficaces pour lutter contre les microorganismes, ils le semblent assez peu contre les
norovirus au regard de leur prévalence actuellement élevée et des analyses menées en
laboratoire. Ces virus montrent en effet une résistance assez marquée contre les
désinfectants à base d’alcools et d’ammoniums quaternaires [6, 7]. Le chlore sous forme
d’hypochlorite de sodium est tout de même efficace, mais génère des sous-produits
toxiques en présence de matières organiques [8]. Par ailleurs, certains traitements
efficaces, tels que la chaleur, ne sont pas applicables dans toutes les situations.
Pour répondre à ce problème, ce projet de recherche visait à développer deux méthodes
de désinfection alternatives, efficaces et sécuritaires pour améliorer la lutte contre les
norovirus : les acides peroxycarboxyliques (approche chimique) et les lumières pulsées
(approche physique). À ce jour, l’efficacité anti-norovirus de ces méthodes n’avait pas
été clairement démontrée, car les études publiées ciblaient principalement les bactéries
1
pathogènes ou d’altération. Ainsi, la première partie de ce travail consistait à évaluer
l’efficacité inhibitrice de ces approches contre une souche murine de norovirus (MNV-1)
selon trois protocoles de désinfection : en liquide, sur des surfaces inertes et dans des
biofilms artificiels. Cette dernière condition constitue un des aspects originaux de ce
travail puisque peu d’études se sont intéressées aux virus dans les biofilms et encore
moins à leur inactivation au sein des biofilms. Pour compléter ce premier volet appliqué,
nous proposons un deuxième volet plus fondamental dans lequel les dommages
structuraux engendrés par l’acide peracétique et les lumières pulsées seront examinés
par des méthodes moléculaires, protéomiques et microscopiques, de manière à élucider
le mécanisme impliqué dans l’inactivation virale. L’ensemble de ces résultats permettra
de mieux connaître, comprendre et appliquer ces stratégies innovantes de désinfection.
2
Chapitre 1. Revue de littérature
1.1.
Gastroentérites aiguës
1.1.1. Microorganismes pathogènes impliqués
Les gastroentérites aiguës (diarrhée et vomissements) constituent la seconde infection
la plus fréquente chez l’humain à l’échelle internationale, derrière les infections
respiratoires. Elles sont à l’origine de plus de 1,4 million de décès par an [9]. Les
norovirus sont aujourd’hui reconnus comme une cause majeure de gastroentérites
aiguës, qu’il s’agisse de cas sporadiques ou d’épidémies. Récemment, Ahmed et coll. [1]
ont estimé que les norovirus étaient responsables de 18 % des gastroentérites
aiguës à travers le monde, aussi bien dans les pays en voie de développement que
dans les pays développés. Ce chiffre provient de leur méta-analyse qui regroupe les
résultats d'études indépendantes menées dans 48 pays et publiées entre 2008 et 2014.
D’autres études menées à plus petite échelle ont également mis en évidence
l’importance des norovirus en tant qu’agent pathogène responsable de maladies
d’origine alimentaire. Ces infections sont définies par l’organisation mondiale de la santé
comme étant « une affection, en général de nature infectieuse ou toxique, provoquée
par des agents qui pénètrent dans l’organisme par le biais des aliments ingérés » [10].
Ces agents, qui peuvent être des bactéries, des virus ou des parasites, engendrent
différentes affections telles que des gastroentérites ou des hépatites. Les norovirus ont
été incriminés dans 65 % et 58 % des cas des maladies d’origine alimentaire au
Canada [11] et aux États-Unis [12] respectivement, reléguant ainsi les bactéries
pathogènes au deuxième rang (tableau 1.1). Ces virus ont été responsables d’environ
26 % des hospitalisations (14 663 cas) et 11 % des décès (149 cas) annuels reliés aux
maladies d’origine alimentaire sur le sol des États-Unis [12].
1.1.2. Virus alimentaires
L’impact sanitaire et économique des virus a longtemps été sous-estimé, notamment à
cause du manque d’outils de détection performants. L’avènement des méthodes
moléculaires dans les années 1990 a ainsi révélé la prévalence des virus entériques dont
la prédominance des norovirus (tableau 1.2). Le tableau 1.3 présente quelques
caractéristiques des principaux virus alimentaires sévissant au Canada.
3
Tableau 1.1 Liste des cinq principaux agents pathogènes responsables des maladies d’origine alimentaire au
Canada [11] et aux États-Unis [12]. Les chiffres entre parenthèses correspondent au nombre annuel de cas
estimés entre 2000 et 2008.
CANADA
ÉTATS-UNIS
Rang
Agents pathogènes
Prévalence
Agents pathogènes
Prévalence
1
Norovirus
65 %
(1 047 733)
Norovirus
58 %
(5 461 731)
2
Clostridium perfringens
11 %
(176 963)
Salmonella spp.
non typhoïde
3
Campylobacter spp.
8%
(145 350)
Clostridium perfringens
10 %
(965 958)
4
Salmonella spp.
non typhoïde
5%
(87 510)
Campylobacter spp.
9%
(845 024)
5
Bacillus cereus
2%
(36 269)
Staphylococcus aureus
3%
(241 418)
11 %
(1 027 561)
Tableau 1.2 Répartition des virus alimentaires les plus fréquemment rencontrés selon la nature des maladies
qu'ils provoquent : gastroentérites, hépatites et autres maladies comme les infections respiratoires, les
encéphalites et les méningites [13]. Les chiffres entre parenthèses correspondent au nombre annuel de cas
estimés au Canada entre 2000 et 2008 [11].
FRÉQUENCE
GASTROENTÉRITES
HÉPATITES
AUTRES
Très commune
Norovirus (1 047 773)
-
-
Commune
Sapovirus (9 491)
Rotavirus (4 252)
Adénovirus 40 et 41 (3 739)
Astrovirus (1 912)
Virus de l’hépatite A (271)
-
Occasionnelle
Reovirus
Parvovirus
Virus de l’hépatite E
Entérovirus
4
Tableau 1.3 Quelques caractéristiques des principaux virus alimentaires sévissant au Canada.
Diamètre
de la
capside
(nm)
Génome
Population
cible
Vaccin [14]
Norovirus et
Sapovirus
(Caliciviridae)
[15, 16]
27 - 40
ARN simple brin
non segmenté
7,4 - 8,3 kb
Tous les
groupes d’âge
Non
disponible
Rotavirus
(Reoviridae)
[17, 18]
60 – 80
ARN double brin
11 segments
18,5 kpb
Principalement
les enfants
Disponible
Adénovirus
40 et 41
(Adenoviridae)
[19, 20]
70 - 90
ADN double brin
non segmenté
26,2 - 48,4 kpb
Principalement
les enfants
Non
disponible
Astrovirus
(Astroviridae)
[21, 22]
28 - 30
ARN simple brin
non segmenté
6,4 – 7,7 kb
Tous les
groupes d’âge
Non
disponible
Virus de
l’hépatite A
(Picornaviridae)
[23, 24]
22 - 30
ARN simple brin
non segmenté
7,0 – 8,8 kb
Tous les
groupes d’âge
Disponible
Virus
(Famille)
Image en
microscopie
électronique
(échelle : 100 nm)
5
Figure 1.1 Photographie en microscopie électronique d’un agrégat de norovirus humains provenant de
l’épidémie de Norwalk en 1968. Échelle : 100 nm [16].
6
1.2.
Caractéristiques générales des norovirus
1.2.1. Découverte
Avant la découverte des virus, les gastroentérites non bactériennes étaient connues sous
le nom de vomissements d’hiver (winter vomiting disease, en anglais) en référence à
leur saisonnalité. Elles furent décrites pour la première fois par Zahorsky en 1929 dans
le sud des États-Unis, puis quelques années plus tard au Royaume-Uni [25-27]. À cette
époque, les virus n’étaient pas associés aux épisodes de gastroentérites aiguës [16].
Dans les années 40 et 50, des études réalisées sur des volontaires ont prouvé que les
vomissements d’hiver pouvaient se transmettre par administration de suspensions
fécales filtrées de personnes contaminées. Puisque ces filtrats ne contenaient aucune
bactérie, l’idée d’un agent étiologique viral a peu à peu émergé [28-30].
Le premier norovirus fut découvert en 1968 dans la ville de Norwalk (Ohio, États-Unis)
lors d’une épidémie de gastroentérite ayant sévi dans une école élémentaire. La moitié
des étudiants et professeurs furent touchés. Après 48 heures d’incubation en moyenne,
la maladie s’est traduite par des nausées, des vomissements, des diarrhées et des
crampes abdominales. Les symptômes ont disparu dans les 24 heures [31]. Il fallut
attendre 1972 pour trouver l’agent étiologique en cause. L’observation en microscopie
électronique de matières fécales de volontaires infectés par un filtrat de fèces datant de
l’épidémie de 1968 révéla la présence d’une particule virale de 27 nm de diamètre (figure
1.1). Ce virus fut baptisé « virus de Norwalk » et est devenu le prototype d’un vaste
groupe de petits virus dit Norwalk-like ou à structure ronde (SRSV pour small roundstructured virus, en anglais), connu aujourd’hui en tant que norovirus [32].
Le développement des outils moléculaires a permis le séquençage du génome complet
du virus de Norwalk [33] et a par conséquent constitué une révolution dans le diagnostic
viral qui se basait, jusqu’alors simplement sur les critères épidémiologiques [34]. De
nouveaux virus ont été découverts et leur classification a été adaptée.
1.2.2. Taxonomie et classification génétique
Les norovirus appartiennent à la famille Caliciviridae qui fut créée dans les années 1970
par le comité international sur la taxonomie des virus (ICTV pour International
Committee on Taxonomy of Viruses) pour regrouper tous les virus à ARN simple brin
7
Figure 1.2 Relation phylogénétique entre les cinq genres acceptés et quatre des genres proposés pour classer
les calicivirus [35]. Les analyses ont été basées sur la séquence complète en acides aminés de la protéine non
structurale (a) et de la protéine majeure de la capside VP1 (b). L’échelle représente la distance génétique.
Canins
Bovins
Ovins
Homme
Porc
Homme
Canins
Homme
Félins
Canins
Souris
Figure 1.3 Classification des norovirus en sept génogroupes selon la diversité de la séquence en acides aminés
de la protéine de la capside VP1. Les séquences de la protéine correspondante de 105 souches ont été utilisées
pour construire cet arbre. Les auteurs proposent que la souche GII.15 (cercle en pointillés) s’insère dans un
nouveau génogroupe. Les virus du génotype GII.14 (flèche) sont responsables de la majorité des infections
dues aux norovirus. Les hôtes sont indiqués à côté de chaque génogroupes. L’échelle correspond au nombre
de substitutions d’acides aminés par site. Adapté de Vinjé [36].
8
de polarité positive dont la capside est formée d’une seule et même protéine [37]. Cette
famille tire son nom du latin calix, en référence à la géométrie icosaédrique de la capside
dont la surface forme des dépressions en forme de calice.
En 2012, l’ICTV a réparti les virus de la famille Caliciviridae en cinq genres : Norovirus,
Sapovirus, Vesivirus, Lagovirus et Nebovirus [15]. Les calicivirus pathogènes pour
l’humain appartiennent aux deux premiers genres (tableau 1.4).
Tableau 1.4 Liste des cinq genres actuellement acceptés dans la famille Caliciviridae ainsi que l’espèce type
représentant chacun des genres et une liste non exhaustive de leurs hôtes [15].
Genre
Espèce type
Exemples d’hôtes
Norovirus
Norwalk virus
Humains, bovins, ovins, souris
Sapovirus
Sapporo virus
Humains, porcs
Vesivirus
Vesicular exanthema of swine virus
Mammifères marins, porc, cheval, chien,
primates
Lagovirus
Rabbit hemorrhagic disease virus
Lapin, lièvre
Nebovirus
Newbury-1 virus
Veau
Cinq autres genres ont été suggérés pour classer les calicivirus nouvellement découverts
qui diffèrent des autres genres actuellement établis, à savoir les genres Bavovirus [38,
39], Nacovirus [35, 38, 40], Recovirus avec notamment le Tulane virus [41-45],
Secalivirus [46] et Valovirus [47]. La figure 1.2 présente les relations phylogénétiques
entre les cinq genres acceptés et quatre des genres proposés.
Depuis les années 1990, les virus du genre Norovirus sont classés selon les séquences
de la polymérase et la protéine de leur capside VP1. Ce système a conduit à la division
du genre en cinq grands clades phylogénétiques, ou génogroupes (G), eux-mêmes sousdivisés en génotypes. Les norovirus pathogènes pour l’humain sont regroupés dans les
génogroupes GI, GII et GIV [48, 49]. Le génogroupe GII répertorie aussi des norovirus
infectant les porcs [50-52]. Il en est de même avec le génogroupe IV qui contient des
norovirus félins [53] et canins [54]. Le génogroupe GIII rassemble les norovirus
infectant le bétail bovin [55-57] et ovin [58]. Le génogroupe GV identifie quant à lui les
norovirus murins [59, 60]. Deux génogroupes supplémentaires ont été proposés pour
répertorier des norovirus canins, à savoir GVI [61] et GVII [36]. La figure 1.3 présente
la dernière classification proposée contenant les sept génogroupes. Avec la découverte
de nouveaux norovirus, cette classification au sein du genre Norovirus n’est plus adaptée
et est vouée à évoluer [49].
9
A
B
C
D
Monomère
Dimère
Sous-domaine P2
Sous-domaine P1
Domaine S
Bras (N-terminal)
Figure 1.4 Structure d’une particule « virus-like » reconstituée par cryo-microscopie électronique à 22 Å et
par cristallographie aux rayons X à 3.4 Å : (A) surface ; (B) section transversale ; (C) protéine de la capside
sous forme de monomère ; (D) protéine de la capside sous forme de dimère. Chaque monomère se compose
d’une région N-terminale faisant face à la l’intérieur de la capside (en vert), d’un domaine S constituant la
structure interne icosaédrique continue de la capside (en jaune) et d’un domaine P formant la partie externe
de la capside. Ce domaine P est divisé en deux sous-domaines : P1 (en rouge) et P2 (en bleu) [62].
10
1.2.3. Structure du virion
Les norovirus sont constitués d’une capside protéique d’environ 38 nm de diamètre sans
enveloppe lipidique [63]. La capside présente une symétrie icosaédrique à 3 axes
(T = 3). Elle est composée de 180 sous-unités de la protéine majeure VP1 associées en
dimères [64] et d’un ou deux exemplaires de la protéine mineure VP2 [65]. Ces 90
dimères forment 32 dépressions en forme de calice avec des protrusions en forme
d’arche (figure 1.4 ; A et B).
La protéine VP1 est organisée en deux domaines structuraux majeurs : l’extrémité Nterminale suivie du domaine S (S pour Shell) et la partie saillante C-terminale (P pour
Protruding) (figure 1.4 ; C et D). L’extrémité N-terminale et le domaine S font face
à l’intérieur du virion et forment une couche d’environ 4 nm d’épaisseur. Le bras en
position N-terminale (résidus 1 à 49) permet d’établir les liaisons entre les sous-unités
nécessaires à la formation et au maintien de la capside icosaédrique. Le domaine S
(résidus 50 à 225) présente une structure en feuillets β et est relié au domaine P par
une simple liaison (résidus 219 à 225) faisant office de charnière flexible. Le domaine P
est à l’origine d’une deuxième couche d’environ 4 nm d’épaisseur dotée de protrusions
en forme d’arche à la surface du virion. Il est composé de deux sous-domaines : P1 et
P2. Le sous-domaine P1 (résidus 226 à 278 et 406 à 520) forme les côtés des arches.
Le sous-domaine globulaire P2 (résidus 279 à 405) associé en dimère forme les sommets
des protrusions de la capside [63, 64, 66-68].
Des variations génétiques et structurales sont observées dans les trois régions de VP1 à
différents degrés : très peu pour le domaine S, moyennement pour le sous-domaine P1
et de façon importante pour le sous-domaine P2 [69]. Ce schéma de conservation reflète
les différentes fonctions de ces régions. Le domaine S est en effet à l’origine de la
structure icosaédrique de la capside alors que le sous-domaine P2, hautement variable,
est directement impliqué dans les interactions entre le virus et les cellules hôtes,
conférant ainsi une haute diversité au sein des norovirus. Ces interactions sont facilitées
par la flexibilité de la liaison connectant les domaines S et P [70-72]. Le sous-domaine
P2 est aussi la cible des anticorps produits lors de la réponse immunitaire de l’organisme
hôte [68, 70, 73-75].
11
ORF1
A
NS1/2
NS3
NS4
NS5
NS6
NS7
ORF2
ORF3
VP1
VP2
ORF2
ORF3
VF1 VP1
B
VP2
AAAA(n)
AAAA(n)
ORF4
Figure 1.5 Organisation du génome des norovirus humains et murins. (A) L’ARN génomique des norovirus
humains est relié de manière covalente à la protéine VPg (triangle vert) à son extrémité 5’ et polyadénylé à
son extrémité 3’ (AAAA(n)). Il est divisé en trois ORFs : l’ORF1 codant une polyprotéine qui sera clivée en six
protéines par la protéase virale NS6, l’ORF 2 codant la protéine majeure de la capside (VP1) et l’ORF 3 codant
la protéine mineure de la capside (VP2). (B) Les ORFs 2 et 3 sont traduits à partir des ARN subgénomiques.
Le génome des norovirus murins a une organisation similaire excepté qu’il contient un quatrième ORF sur
l’ARN subgénomique codant un facteur de virulence (VF1).
Tableau 1.5 Nomenclature et fonctions des protéines structurales et non structurales des norovirus. Les noms
entre parenthèses sont les autres noms reçus par ces protéines dans la littérature. Les fonctions portant le
symbole * ont été proposées, mais pas démontrées.
Protéines
Fonctions
Références
NS1/2 (p48, N-term)
Impliquée dans la formation du complexe de réplication*
Contribue à la persistance des infections aux norovirus murins
[76‐80]
NS3 (NTPase, 2C-like)
ARN hélicase*
NTPase
[76, 77, 81]
NS4 (p22, 3A-like)
Impliquée dans la formation du complexe de réplication*
Interagit avec le cytosquelette
[76, 77, 82, 83]
NS5 (VPg)
Protéine liée au génome
Impliquée dans sa réplication et traduction
[76, 77, 84‐88]
NS6 (Pro, 3C-like)
Cystéine-protéase
[89‐91]
NS7 (RdRp, Pol/3Dpol)
ARN polymérase ARN
[33, 76, 77, 92‐
94]
VP1
VP2
VF1
12
Protéine majeure de la capside
Impliquée dans la reconnaissance des cellules-hôtes
Protéine mineure de la capside
Impliquée dans l’encapsidation du génome*
Régule la synthèse de VP1
Facteur de virulence présent chez les norovirus murins
Régule la réponse immunitaire
[62, 76, 95, 96]
[97‐99]
[100]
1.2.4. Structure et organisation du génome
Le génome des norovirus se compose d’une molécule linéaire et compacte d’ARN simple
brin de polarité positive dont la taille varie entre 7,3 et 7,5 kb. L’extrémité 5’ est reliée
de manière covalente à une protéine codée par le virus, nommée VPg pour Viral Protein
genome-linked. L’extrémité 3’ est polyadénylée. Des structures secondaires conservées
au cours de l’évolution sont présentes aux extrémités 5’ et 3’ ainsi qu’à l’intérieur du
génome. Ces structures jouent un rôle important dans la réplication du virus, sa
traduction et sa pathogénicité [68, 101-103].
Le génome des norovirus est organisé en trois cadres de lectures ouverts (ORFs pour
Open Reading Frames) bordés par de courtes régions non traduites en 5’ et 3’ [101],
excepté chez les norovirus murins où un quatrième ORF a récemment été décelé [100]
(figure 1.5). Chez tous les norovirus, l’ORF1 code une polyprotéine d’environ 195 kDa
clivée par la protéase (NS6) codée par le virus en six protéines non structurales (NS)
dont les fonctions biologiques n’ont pas encore toutes été élucidées (tableau 1.5) [76,
77]. Les ORFs 2 et 3 codant la protéine majeure VP1 (environ 60 kDa) et la protéine
mineure VP2 (22 à 29 kDa), respectivement, sont traduits à partir des ARN
subgénomiques. La séquence nucléotidique des ARN subgénomiques est similaire à celle
des ARN génomiques en 3’. Ils sont reliés à VPg à leur extrémité 5’ et polyadénylés à
leur extrémité 3’ [101]. L’ORF 4, codant le facteur de virulence (VF1) présent chez les
souches murines, se situe à l’intérieur de l’ORF 2 et est aussi traduit à partir des ARN
subgénomiques [100].
1.2.5. Caractères culturaux
Jusqu’en 2004, aucun norovirus n’était cultivable en laboratoire. Wobus et coll. [104]
ont constaté que le MNV-1, isolé par Karst et coll. [59] et classé dans le GV, infectait les
cellules de type macrophage in vivo et qu’il se répliquait dans les cellules dendritiques
et les macrophages. Des systèmes de dénombrement du MNV-1 ont pu être développés,
car la culture de cette souche dans les macrophages RAW 264.7 (cellules adhérentes)
induit des modifications morphologiques caractéristiques (effet cytopathogène visible
sous forme de plages de lyse).
Un système in vitro supportant la réplication du norovirus humain GII.4-Sydney vient
d’être publié dans le numéro de novembre 2014 du magazine Science [105]. Cette
souche responsable des dernières pandémies se réplique dans les lymphocytes B
humains BJAB en présence de bactéries entériques exprimant à leur surface des
13
Tableau 1.6 Caractéristiques des principaux virus utilisés en tant que modèles des norovirus humains. Ce
sont des virus nus dont la capside a un diamètre compris entre 27 et 40 nm et une symétrie icosaédrique et
dont le matériel génétique est sous forme d’ARN simple brin de polarité positive [15].
MNV-1
FCV-F9
Sapovirus
porcin
Tulane virus
[16]
[106]
[107]
[108]
[41]
[62]
[71]
[109]
[66]
[110]
Taille du génome
(kb)
7,7
7,3
7,6
7,3
6,7
Structures
impliquées dans
la reconnaissance
de la cellule hôte
HBGAs
Acide sialique
Acide sialique
Acide sialique
HBGAs
Humains
Souris
Félins
Porcs
Primates
Gastroentérite
Systémique
Respiratoire
Gastroentérite
Gastroentérite
Virus
Image en
microscopie
électronique
Norovirus
humains
100 nm
Structure
tridimensionnelle
reconstituée
Hôte
Maladie
14
récepteurs de groupes sanguins et tissulaires (HBGAs pour Histo Blood Group Antigens)
telles qu’Enterobacter cloacae. Jusqu’alors, les souches humaines de norovirus n’étaient
pas cultivables en laboratoire. Plusieurs tentatives infructueuses ont été publiées : des
modèles sensés supporter la réplication des norovirus [111, 112], mais qui n’ont pas pu
être reproduits [113-116] ainsi que des travaux montrant qu’une transfection de cellules
eucaryotes avec de l’ARN isolé de norovirus humains induisait une réplication de l’ARN,
la synthèse de protéines virales et une libération de virions dans le surnageant des
cellules. Cependant, ce système ne supportait pas un réel cycle de réplication virale
puisque les virions générés n’étaient pas infectieux [117].
1.2.6. Modèles pour l’étude des norovirus humains
Puisque les norovirus humains n’étaient pas cultivables, beaucoup d’études portant par
exemple sur leur pathogénicité ou leur stabilité environnementale ont utilisé des modèles
(surrogates). Ces derniers ont été choisis en fonction de leur structure et de leur taille,
qui devaient être idéalement similaires aux norovirus humains, tout en étant facilement
cultivables et en présentant des propriétés similaires au niveau de leur persistance et de
leur croissance [118]. La plupart des modèles sont des calicivirus cultivables, dont les
principales propriétés sont présentées au tableau 1.6 [119].
Bien que ces modèles soient proches des norovirus humains, leurs divergences limitent
l’extrapolation des résultats aux norovirus humains. Dans une récente revue, Richards
[120] suggère que les études menées sur les modèles devraient être remplacées par
des études menées sur des volontaires, de façon à identifier clairement les procédés
d’inactivation efficaces. Ces études cliniques apparaissent toutefois coûteuses et
risquées dans l’opinion publique.
1.2.6.1.
Norovirus murins
Le norovirus murin MNV-1 a été isolé au début des années 2000 dans le tissu cérébral
de souris manipulées génétiquement incapables de synthétiser la protéine Stat1 (capteur
de signal et activateur de transcription 1) impliquée dans l’immunité innée [59]. Ce virus
a entraîné chez ces souris une infection létale associée à divers symptômes incluant
encéphalite, inflammation de la paroi des vaisseaux sanguins cérébraux, méningite,
hépatite et pneumonie.
Le MNV-1 est actuellement considéré comme le meilleur modèle pour étudier les
norovirus humains [121-125]. Il partage des caractéristiques structurale et génomique
15
avec les souches humaines. Il est également transmis oralement, se réplique dans
l’intestin et est excrété dans les matières fécales [126]. Il tolère une large gamme de
pH [125], une propriété essentielle pour résister à l’acidité présente dans l’estomac. En
revanche, le MNV-1 diffère des norovirus humains au niveau des symptômes causés
chez l’hôte et des molécules d’attachement reconnues sur la cellule hôte. Le MNV-1
reconnait les résidus d’acide sialique [127, 128] alors que les norovirus humains
reconnaissent les HBGAs.
1.2.6.2.
Vesivirus félin et canin
Les premiers calicivirus félins (FCV), classés aujourd’hui dans le genre Vesivirus, ont été
isolés dans les années 1950 [129]. Bien que certaines souches soient virulentes, la
plupart d’entre elles provoquent des maladies modérées au niveau de la gueule et des
voies respiratoires supérieures qui disparaissent spontanément [130]. La souche FCV-F9
a été proposée comme souche de référence des FCV [129]. En 1992, un système de
culture a été développé avec des cellules rénales félines de Crandell Reese (CRFK) [131].
Le FCV-F9 a longtemps été utilisé comme modèle et l’est encore depuis la découverte
du MNV-1 mais dans une moindre mesure [132-135]. Cette souche partage des
similarités avec les norovirus au niveau de la séquence et de l’organisation de son
génome. En revanche, ce n’est pas un virus entérique [136], elle reconnaît des résidus
d’acide sialique sur la cellule hôte [137] et ne tolère pas une large gamme de pH [125].
Un autre calicivirus, la souche canine 48, a parfois été utilisé comme modèle pour des
tests d’inactivation [138]. Il a été isolé au Japon dans les années 1990 chez un chiot de
deux mois présentant des diarrhées aqueuses et des vomissements ainsi qu’une
anorexie avant d’en décéder [139]. Cette souche se propage dans les cellules rénales
canines Madin-Darby (MDCK) tout en induisant un effet cytopathogène visible [140].
Toutefois, cette souche résiste peu aux pH acides, bien qu’elle soit entérique [138].
1.2.6.3.
Sapovirus porcins
Les sapovirus entériques porcins ont été isolés pour la première fois dans les années
1980 aux États-Unis et au Royaume-Uni chez des porcs souffrant de diarrhées [141].
Dès 1988, un système de culture a été mis au point avec des cellules rénales de porc
(PPK) [142] puis avec une autre lignée (LLC-PK). À cette époque, ce virus était le seul
calicivirus entérique cultivable [143].
16
Les sapovirus porcins ont quelques fois été utilisés en tant que modèles des norovirus
humains [144]. Il s’agit de virus entériques qui, au même titre que les norovirus
humains, sont détectés dans divers échantillons environnementaux tels que les eaux
usées ou les fruits de mer [145, 146]. De plus, ils résistent à la chaleur (56 °C), aux
traitements chlorés (2,5 mg L-1) et à une large gamme de pH [147]. En revanche, ils
reconnaissent les résidus d’acide sialique sur la cellule hôte et non les HBGAs [148].
1.2.6.4.
Tulane virus
Le Tulane virus a été isolé à la fin des années 2000 dans les matières fécales de
macaques apparemment sains (sans diarrhée) [41]. Ce virus se propage dans les cellules
rénales de singe LLC-MK2 tout en induisant un effet cytopathogène visible.
Le Tulane virus a été utilisé à quelques reprises en tant que modèle des norovirus
humains [149, 150]. Bien qu’il n’appartienne pas au genre Norovirus, mais Recovirus,
sa séquence nucléotidique est très proche de celle des norovirus du GII. De plus, il
reconnaît les mêmes récepteurs sur les cellules hôtes que les norovirus humains [43].
La récente étude comparative de Hirneisen et coll. [123] suggère néanmoins que le
MNV-1 est un meilleur modèle que le Tulane virus car il tolère une plus large gamme de
pH et il ne perd pas son pouvoir infectieux à 4 °C ou en présence de 2 mg L-1 de chlore.
1.2.6.5.
Pseudo-particules virales
Les pseudo-particules virales (VLPs pour Virus-Like Particles) sont un assemblage de
protéines structurales virales sans matériel génétique. Un système d’expression utilisant
des baculovirus recombinants a été développé pour synthétiser des protéines VP1, qui
s’auto-assemblent en VLPs [151]. Selon le gène inséré dans le baculovirus recombinant,
des VLPs mimant différents génogroupes de norovirus peuvent être produites.
Ces VLPs ont déjà été utilisées en tant que modèles [122, 152] pour des tests
d’inactivation. Elles offrent l’avantage de présenter une copie conforme des récepteurs
des norovirus humains à leur surface tout en étant non infectieuses, ce qui peut faciliter
leur utilisation en laboratoire. En revanche, elles ne permettent pas d’étudier la
pathogénicité, la réplication ou la stabilité des norovirus.
1.2.7. Cycle de multiplication
Les norovirus sont transmis oralement. Étant résistants aux faibles pH, ils passent la
barrière gastrique de l’estomac pour atteindre l’intestin où ils infectent l’individu.
17
Milieu extracellulaire
1. Reconnaissance
et attachement
Glanglioside GD1a
Acide sialique
(récepteur du MNV-1)
Bicouche lipidique
Milieu intracellulaire
2. Entrée
3. Décapsidation
4. Traduction
5. Clivage enzymatique
8. Sortie
7. Réplication
Noyau
6. Formation du
complexe de réplication
Figure 1.6 Proposition d'une stratégie pour la réplication des norovirus. (1) Les norovirus s’attachent à leur
cellule hôte par l’intermédiaire de structures saccharidiques, comme le MNV-1 qui reconnaît les résidus d’acide
sialique présents sur les glangliosides GD1a, et (2) sont internalisés probablement par un mécanisme
d’endocytose. (3) Le virion est décapsidé et l’ARN est libéré dans le cytoplasme. (4) L’ARN est traduit par la
machinerie cellulaire de l’hôte suite à une initiation résultant d’une interaction avec la protéine VPg ou les
structures secondaires de l’ARN. (5) L’ORF1 est transcrit en une polyprotéine qui est co- et post-clivée par la
protéase virale NS6. (6) Un complexe de réplication est formé à partir des membranes du réticulum
endoplasmique, de l’appareil de Golgi et des endosomes recrutées par les protéines virales non structurales
NS1/2 et NS4. (7) L’ARN est répliqué en ARN génomiques et subgénomiques par la polymérase virale NS7.
Les génomes répliqués sont traduits au niveau du complexe de réplication ou encapsidés dans les particules
nouvellement formées qui (8) sortent alors de la cellule hôte en provoquant sa lyse par apoptose. Adapté de
Thorne et coll. [101].
18
Puisqu’il n’existait jusqu’à présent aucun système de culture des norovirus humains, les
études portant sur leur réplication se sont basées sur des calicivirus cultivables incluant
le calicivirus félin (FCV) et le MNV-1 [104]. Le cycle de multiplication proposé pour les
norovirus est cytoplasmique et ressemble à celui des autres virus à ARN de polarité
positive (figure 1.6) [68].
1.2.7.1.
Attachement
L’étape initiale de l’infection implique l’attachement du virion à la cellule hôte, le
récepteur permettant ensuite son internalisation. Très souvent, les virus utilisent des
oligosaccharides présents sur les glycoprotéines ou les glycolipides à la surface des
cellules hôtes comme molécules d’attachement [62]. Les norovirus murins reconnaissent
les résidus d’acide sialique présents sur des glycolipides ou des glycoprotéines selon la
souche virale (figure 1.6) [127, 128].
La plupart des norovirus humains reconnaissent les HBGAs. Il s’agit de sucres complexes
regroupant entre autres les antigènes ABH et Lewis présents à la surface des
érythrocytes, de la muqueuse épithéliale des systèmes respiratoire, génito-urinaire et
digestif ainsi que dans les fluides biologiques comme le lait maternel et la salive en tant
qu’oligosaccharides libres [153-155]. La synthèse de ces antigènes est sous la
dépendance de plusieurs gènes codant des glycosyltransférases. Ces enzymes catalysent
des additions spécifiques de monosaccharides sur des chaînes précurseurs (figure 1.7).
Concernant
les
interactions
avec
les
norovirus
humains,
trois
gènes
de
glycosyltransférases sont particulièrement importants : FUT2, FUT3 et ABO. L’enzyme
fucosyltransférase 2 (FUT2) ajoute un fucose en position α-1,2 sur le galactose terminal
des précurseurs et donne naissance à l’antigène H. Les individus présentant une activité
enzymatique FUT2 sont dits sécréteurs et représentent environ 80 % de la population
caucasienne. L’enzyme FUT3 est une α-1,4-fucosyltransférase responsable des
antigènes de Lewis LeA (type 1) et LeX (type 2) chez les individus non sécréteurs ainsi
que des antigènes de Lewis LeB (type 1) et LeY (type 2) chez les individus sécréteurs.
L’antigène H peut subir des modifications par des transférases A ou B (du système ABO)
pour donner les antigènes A et B, respectivement [154, 156].
Tous les norovirus ne reconnaissent pas les mêmes HBGAs [157, 158]. Le virus de
Norwalk (GI.1) est capable de se lier aux antigènes A et H [159], mais pas à l’antigène
B alors que le norovirus VA387 (GII.4) est capable de se lier aux antigènes A et B [160].
Le norovirus GII.9 se fixe quant à lui aux antigènes de Lewis [157]. Ces sites de liaison
19
NON SÉCRÉTEUR
Gal
β1,4 GlcNAc
FUT3
Gal
β1,4 GlcNAc
α1,3
Précurseur type 2
Fuc
x
Le
Gal
β1,3 GlcNAc
FUT3
Gal
β1,3 GlcNAc
α1,4
Précurseur type 1
Fuc
FUT2
a
Le
SÉCRÉTEUR
Gal
β1,3 GlcNAc
α1,2
Fuc
H type 1/2
FUT3
Gal
β1,3 GlcNAc
Enz A
GalNAc α1,3
Gal
Enz B
β1,3 GlcNAc
Gal
α1,3
Gal
β1,3 GlcNAc
α1,2
α1,4
α1,2
α1,2
Fuc
Fuc
Fuc
Fuc
A type 1/2
B type 1/2
b
y
Le (Le )
FUT3
GalNAc α1,3
Gal
FUT3
β1,3 GlcNAc
Gal
α1,3
Gal
β1,3 GlcNAc
α1,2
α1,4
α1,2
α1,4
Fuc
Fuc
Fuc
Fuc
b
y
A Le (A Le )
b
y
B Le (B Le )
Figure 1.7 Voies de synthèse des antigènes des groupes sanguins et tissulaires du système ABH et Lewis
selon le phénotype sécréteur ou non des individus. Abréviations : Gal pour galactose ; GlcNAc pour
N-acétylglucosamine ; GalNAc pour N-acétylgalactosamine ; Fuc pour fucose. Adapté de Ruvoën-Clouet et coll.
[158].
20
sont toujours situés au niveau du sous-domaine P2 de la capside et semblent impliquer
un vaste réseau de liaisons hydrogènes [73, 155, 161, 162].
Bien que ces HBGAs soient des facteurs d’attachement nécessaires aux norovirus
humains, ils ne sont pas suffisants pour permettre une infection de la cellule hôte [105].
D’une manière similaire, le FCV s’attache à sa cellule hôte par l’intermédiaire des résidus
d’acide sialique présents sur les protéines N-glycosylées [137] mais son entrée dans la
cellule hôte nécessite la reconnaissance de la protéine JAM-1 présente dans les jonctions
serrées [162, 163].
1.2.7.2.
Entrée et transport intracellulaire
Lorsque le virion est attaché à sa cellule hôte, il doit initier son internalisation. L’entrée
du norovirus murin MNV-1 dans les cellules de macrophages RAW 264.7 impliquerait un
mécanisme d’endocytose nécessitant la présence de dynamine II et de cholestérol, mais
pas de cavéoline ni de clathrine comme le FCV. Elle est également indépendante du pH
[164-167]. Ce processus n’est pas encore connu pour les norovirus humains.
1.2.7.3.
Décapsidation
Une fois à l’intérieur de la cellule, un système conduisant à la libération de l’ARN dans le
cytoplasme (décapsidation) est activé par différents déclencheurs environnementaux.
Cette étape du cycle de reproduction des norovirus est rapide (environ 1 heure après
l’infection) et n’a pas encore été élucidée [68, 167]. Un modèle de décapsidation a été
proposé par Shoemaker et coll. [168] dans lequel des conditions alcalines dissocient la
capside en dimères.
1.2.7.4.
Traduction
Lorsque l’ARN viral est libéré dans le cytoplasme, il se comporte comme un ARN
messager et interagit avec la machinerie cellulaire de l’hôte. Sa traduction est initiée par
la protéine VPg [169] qui fait office de coiffe caractéristique des ARN messagers
eucaryotes et de site d’entrée ribosomale. La structure assez flexible de cette protéine
lui permet de jouer plusieurs rôles [170]. Elle interagit notamment avec le facteur
multiprotéique eIF4F, plus particulièrement eIF4E [169], et le facteur eIF3 qui recrute
le complexe ribosomal 43S [85]. Les structures secondaires présentes aux extrémités 5’
et 3’ des ARN viraux jouent également un rôle dans leur traduction. Elles favorisent des
interactions avec certaines protéines de la cellule hôte qui circularisent les ARN viraux.
21
Sous cette forme, les ARN établissent des liaisons avec certaines protéines capables de
stimuler ou d’inhiber leur traduction et leur réplication (exemples : La et PTB). Ces
protéines sont probablement impliquées dans la régulation du cycle viral en favorisant
soit la traduction soit la réplication des ARN [101].
L’ORF1 est le premier ORF à être traduit. Il en résulte une polyprotéine qui est
rapidement clivée à des sites spécifiques. Les protéines non structurales qui en résultent
sont impliquées dans la réplication du virus, soit directement, soit indirectement par la
formation du complexe de réplication [171]. La traduction des ORFs 2, 3 et 4 (codant
les protéines VP1, VP2 et le facteur de virulence VF1, respectivement) est principalement
effectuée à partir des ARN subgénomiques. Ces ARN sont produits en plus grand nombre
que les ARN génomiques. Il s’agit probablement d’une stratégie visant à réguler la
synthèse des protéines virales et notamment VP1 pour qu’elle soit présente en un
nombre suffisamment élevé permettant la formation de capsides entières (90 dimères)
[126]. Le niveau de traduction de l’ORF3 correspond approximativement à 20 % du
niveau de traduction de l’ORF2. La traduction de l’ORF3 est réalisée par un mécanisme
de terminaison-réinitiation puisque les ARN subgénomiques sont polycistroniques. Après
avoir entièrement traduit l’ORF2, les ribosomes restent parfois liés à l’ARN et
commencent la traduction de l’ORF3 car le codon STOP de l’ORF2 chevauche le codon
d’initiation de l’ORF3. Le facteur de virulence est exprimé par un mécanisme de décalage
du cadre de lecture (leaky scanning) [68, 101].
1.2.7.5.
Réplication du génome
La réplication de l’ARN viral est assurée par un complexe de réplication formé d’une
plateforme membranaire à laquelle se greffe les protéines virales non structurales (dont
la polymérase) et structurales (VP1 et VP2) ainsi que des molécules d’ARN double-brin
synthétisées à partir de l’ARN génomique [101]. La plateforme membranaire consiste en
un réarrangement des membranes du réticulum endoplasmique, de l’appareil de Golgi
et des endosomes de la cellule hôte [172], probablement piloté par les protéines NS1/2
et NS4 [173]. Ce complexe de réplication est localisé dans le cytoplasme et plus
particulièrement dans la région péri-nucléaire à proximité du centrosome (centre
organisateur des microtubules) [172, 174]. Par conséquent, il est probable que les
norovirus utilisent le cytosquelette de leur cellule hôte pour organiser leur réplication.
L’ARN génomique de polarité positive est copié en un brin complémentaire de polarité
négative, qui sert de trame pour la synthèse des ARN génomiques et subgénomiques de
polarité positive [175].
22
1.2.7.6.
Assemblage et sortie
Les dernières étapes concernant l’assemblage de la capside, l’encapsidation de l’ARN
génomique et la sortie des virions sont peu connues. La capacité d’auto-assemblage des
protéines VP1 est peut-être suffisante pour expliquer la formation des capsides. La
présence de VP2 n’est pas nécessaire pour cet auto-assemblage, mais semble requise
pour la stabilité de la capside [176]. Par ailleurs, l’encapsidation de l’ARN génomique (de
nature acide) est probablement stimulée par une interaction avec VP2 (de nature
basique) et favorisée par une interaction avec VP1 au détriment des autres ARN
messagers de la cellule [101].
La sortie des virions fait probablement suite à une lyse des cellules induite par apoptose.
Ce phénomène serait la conséquence de la régulation négative de la survivine, une
protéine de la cellule hôte inhibitrice de l’apoptose, et une activation des caspases, des
protéines engendrant l’apoptose [177]. Concernant le MNV-1, l’expression de l’ORF1
codant la polyprotéine serait suffisante pour induite l’apoptose chez les cellules HEK293
[178].
1.3.
Infection chez l’humain
1.3.1. Épidémiologie
1.3.1.1.
Maladie endémique et parfois épidémique
Les norovirus ont surtout été connus pour les épidémies qu’ils ont provoquées. Plus de
900 rapports publiés ont en effet été recensés entre 1993 et 2011 [179]. Ils sont la
cause majeure des épidémies de gastroentérites à travers le monde, qui se déclarent
dans les établissements de soin, les restaurants, les garderies ou les bateaux de croisière
(figure 1.8) [180]. Selon des études américaine [181] et britannique [182], la
transmission des norovirus est principalement véhiculée par un contact de personne à
personne, mais implique également différents vecteurs dont les surfaces [183, 184].
Toutefois, les infections par les norovirus constituent une maladie endémique et non
seulement épidémique. Il s’agit d’une maladie infectieuse latente où quelques cas se
déclarent sporadiquement et qui se manifeste parfois de façon plus dense, donnant lieu
à des épidémies voire des pandémies [185]. L’aspect endémique des norovirus a été
peu étudié, car ces données sont difficiles à obtenir (consultation peu fréquente des
personnes malades, prélèvements non systématiques pour rechercher la présence des
23
Garderies
Autres et
inconnus
Établissements
pénitentiaires
Bateaux de
croisière et
vacances
Hôpitaux
Écoles et
collectivités
Fêtes et
évènements
Restaurants
Établissements
de soins de
longue durée
Nombre d’épidémies
Contextes épidémiques
Figure 1.8 Répartition des épidémies dues aux norovirus qui se sont déclarées aux États-Unis entre 2009 et
2013 selon les établissements touchés et le mode de transmission. Le nombre d’épidémies dans les différents
établissements est donné pour les transmissions par les aliments () et de personne à personne () [186].
24
norovirus). De plus, des norovirus sont fréquemment détectés dans les matières fécales
de personnes apparemment saines, ce qui complique l’interprétation des données [187].
Une récente revue dresse un état de l’art sur les données disponibles concernant
l’incidence de ces virus [187].
À l’heure actuelle, seuls deux pays, les Pays-Bas et le Royaume-Uni, ont évalué
l’incidence des norovirus dans leur population en cherchant systématiquement la
présence de norovirus dans les échantillons de fèces chez les personnes consultant pour
une gastroentérite. Ces études ont estimé le nombre d’infections à 380 aux Pays-Bas
[188, 189] et 450 [190] ou 470 [191] au Royaume-Uni par 10 000 habitants. D’autres
études, dont les sources étaient plus restreintes, ont obtenu des estimations un peu plus
fortes en faveur des norovirus, allant de 650 à 1 040 cas par 10 000 habitants aux
États-Unis [12] et au Canada [11]. La dernière étude parue aux États-Unis estime que
les norovirus sont annuellement responsables de 570 à 800 décès, de 56 000 à 71 000
hospitalisations, de 400 000 consultations aux services d’urgence, de 1,7 à 1,9 million
consultations externes et de 19 à 21 millions de cas d’infections aux États-Unis [185].
Par ailleurs, les norovirus seraient la cause de 12 % des cas sporadiques de
gastroentérites infantiles, aussi bien dans les pays développés qu’en voie de
développement, d’après une étude systématique menée entre 1990 et 2008 [192].
1.3.1.2.
Saisonnalité
Selon une méta-analyse récente [193], les infections à norovirus surviennent toute
l’année avec une incidence accrue les mois froids. La moitié des cas se déclarent pendant
les mois d’hiver et les ¾ entre octobre et mars dans l'hémisphère nord et entre avril et
septembre dans l'hémisphère sud. L’incidence mensuelle des infections par les norovirus
a été positivement corrélée à la quantité de pluie moyenne. Ces données corroborent de
précédents [194, 195] et récents [196] travaux qui révèlent l’influence de l’humidité
absolue sur l’infectiosité des norovirus. Toutefois, ces observations restent difficiles à
interpréter puisque les études menées en Afrique, en Amérique du Sud et dans les
régions tropicales sont assez peu nombreuses.
1.3.1.3.
Épidémiologie moléculaire
Les souches du GI sont principalement reliées aux épidémies déclarées dans des
établissements scolaires et de restauration [197]. Elles sont aussi plus fortement
impliquées dans les infections d’origine hydrique que les souches des autres
génogroupes [179, 198]. Cette répartition est probablement due à une plus grande
25
stabilité en milieu aqueux des souches du GI [199, 200]. Parmi toutes les souches de
norovirus détectées dans les épisodes de gastroentérites, celles appartenant au GII, et
plus précisément au GII.4, semblent être les plus répandues à travers le monde [201203]. Elles sont principalement reliées aux épidémies déclarées dans des établissements
de soin [197]. Elles sont aussi plus fortement impliquées que les souches des autres
génogroupes dans les infections d’origine alimentaire ou suite à un contact de personne
à personne [179, 198].
Parmi les 32 génotypes identifiés chez les norovirus humains [49], le GII.4 est le seul à
avoir été associé à des pandémies (épidémies mondiales) de gastroentérites [204-206].
Depuis les années 1990, ont été recensées six pandémies successives causées par les
souches US96 [207, 208], Farmington Hills 2002 [209, 210], Hunter 2004 [211], Den
Haag 2006b [205, 212], New Orleans 2009 [213] et récemment Sydney 2012 [214216]. Notons que depuis 2002, la succession des souches s’est accélérée, passant d’un
cycle de sept à huit ans à un cycle de deux à trois ans. Les quatre premières souches
ont émergé à partir d’une souche GII.4 plus ancienne qui a successivement subi des
dérives antigéniques (mutations au niveau du sous-domaine P2 de la capside appelées
antigenic drift en anglais) [153, 217, 218]. En revanche, les deux plus récentes souches
pandémiques ont émergé par l’intermédiaire de deux processus distincts, à savoir des
dérives antigéniques et des recombinaisons entre plusieurs souches GII.4 au niveau de
la jonction entre les ORFs 1 et 2 (antigenic shift) [215]. De plus amples informations sur
ces changements sont disponibles dans une récente revue de littérature [206].
La forte prévalence et la persistance de ce génotype GII.4 résulteraient de la rapide
évolution des protéines de la capside virale, probablement régie par quatre facteurs :
une augmentation du nombre de récepteurs HBGAs reconnus, le nombre restreint de
sites génomiques pouvant être modifiés sans altérer la viabilité du virion, la durée de
l’immunité de la population et la hausse du taux d’erreur de la polymérase des souches
du GII.4 entraînant des mutations dont certaines confèrent de nouvelles propriétés aux
souches telles qu’une augmentation de l’affinité et une reconnaissance de motifs
glycaniques supplémentaires [219].
1.3.2. Dose infectieuse
En 2008, Teunis et coll. [220] ont estimé la quantité de norovirus nécessaire pour
provoquer une gastroentérite aiguë dans 50 % des cas (HID50 pour 50 % Human
Infectious Dose) chez les personnes au statut sécréteur avec les souches 8fIIa et 8fIIb
appartenant au GI.1[221]. Ils ont ainsi établi que la valeur HID50 était de 18 particules
26
si l’inoculum contenait des virus totalement dispersés et de 1015 particules si l’inoculum
contenait des virus en agrégats. Plus récemment et au moyen d’un inoculum – non
dispersé – du virus de Norwalk (GI.1), Atmar et coll. [222] ont estimé que la valeur
HID50 était d’environ 2800 particules chez des adultes au statut sécréteur, peu importe
leur groupe sanguin. Chez des adultes au statut sécréteur et dont le groupe sanguin
était A ou O, la valeur HID50 n’était que de 1320 particules.
1.3.3. Signes cliniques
Les norovirus sont responsables de gastroentérites aigües, généralement bénignes, chez
les enfants et les adultes. La maladie a une courte période d’incubation (de 24 à
48 heures) et se résorbe habituellement seule sans séquelle 12 à 60 heures après
l’apparition des symptômes [223, 224]. La durée de ces symptômes tend à diminuer
avec l’âge [225].
Les manifestations cliniques observables incluent l’apparition soudaine d’une diarrhée
pouvant durer les cinq premiers jours (87 % des cas), des vomissements le premier jour
(74 % des cas), des douleurs abdominales (51 % des cas), des nausées (49 % des cas),
des crampes (44 % des cas), de la fièvre (32 à 45 % des cas) et parfois une présence
de mucus dans les matières fécales (19 % des cas) [226, 227]. Notons que le symptôme
dominant (diarrhée ou vomissements) peut varier d’une personne à l’autre. Les
vomissements semblent moins fréquents chez les enfants de moins d’un an et chez les
personnes hospitalisées [225, 226, 228]. Les infections à norovirus n’ont jamais été
associées à des diarrhées sanguinolentes [229] à l’exception d’un rapport avec des
patients atteints de la maladie de Crohn ou de colites ulcéreuses [230]. En outre, environ
un tiers des personnes infectées seraient asymptomatiques [228, 231], cette tendance
étant plus forte chez les enfants de moins de 5 ans que les adultes [232]. Ces personnes
excrètent néanmoins la même dose virale dans leurs fèces que les malades
symptomatiques [233].
Les personnes présentant des symptômes ne consultent généralement pas un médecin
[225, 226]. Seuls 10 % d’entre elles nécessitent des soins médicaux (hospitalisation et
traitement contre la déshydratation) [188, 190]. Les jeunes enfants, les personnes
âgées et les personnes dont le système immunitaire est défaillant sont plus à risque de
présenter des symptômes plus graves, allant des diarrhées chroniques [234-239] au
décès [229, 240, 241]. Le nombre de décès dus aux norovirus chez les enfants de 5 ans
et moins est estimé à 200 000 cas annuels dans les pays en voie de développement
[192]. Plus rarement, les infections dues aux norovirus ont été associées à des
27
manifestations cliniques graves comme une coagulation intravasculaire disséminée
[242],
des
entérocolites
nécrosantes
[243],
des
convulsions
[244-246],
des
encéphalopathies [247] ou une insuffisance rénale aigüe associée à un syndrome
néphrotique [248].
1.3.4. Pathophysiologie
Les principales connaissances concernant la pathogénicité de ces virus sont issues des
études sur des volontaires ou des modèles porcin, bovin et murin. Elles ont récemment
fait l’objet d’une revue [249]. La maladie causée par les norovirus se caractérise
principalement par des vomissements et des diarrhées aqueuses. Les vomissements ont
lieu sans que la muqueuse gastrique et les fonctions sécrétrices de l’estomac ne soient
altérées [250]. Les diarrhées sont induites au niveau du duodénum à la fois par une
stimulation de la sécrétion d’anions et par un dysfonctionnement de la barrière
épithéliale (réduction de l'étanchéité des protéines de jonction serrée et augmentation
de l'apoptose épithéliale) [251, 252]. De plus, des biopsies de la jonction entre le
duodénum et le jéjunum chez des volontaires ont montré des changements anatomiques
tels que l’épaississement de la paroi intestinale, une anomalie des cellules épithéliales,
une hyperplasie de glandes intestinales (cryptes de Lieberkühn) et une infiltration de
cellules inflammatoires dans la lamina propria, un tissu conjonctif lâche situé sous
l’épithélium de la muqueuse digestive. Ces changements avaient disparus au bout de
deux semaines [253, 254]. Enfin, l’infection symptomatique provoque une diminution de
l’activité enzymatique de l’intestin grêle engendrant une malabsorption des glucides et
des lipides [253].
Il a récemment été démontré que les norovirus pouvaient se répliquer dans les
lymphocytes B [105] en présence de bactéries entériques exprimant à leur surface des
HBGAs. Des études antérieures suggèrent que les norovirus humains puissent également
infecter des entérocytes [249], des cellules dendritiques [255] et des cellules non
épithéliales (cellules de la lamina propria et des glandes de Brunner) [256].
Récemment, plusieurs cas de virémie ont été signalés. La présence de norovirus dans le
plasma sanguin pourrait être la cause de troubles neurologiques [244, 257]. Selon une
étude portant sur des enfants, 15 % des personnes infectées par un norovirus auraient
des particules virales dans le sang [257]. Cette constatation incite à repenser le concept
actuel de l’infection des norovirus humains qui serait, par conséquent, également extraintestinale.
28
1.3.5. Immunité
La réponse immunitaire induite par une infection aux norovirus est globalement assez
peu caractérisée. Plusieurs revues font état des connaissances actuelles [68, 153, 218,
258, 259]. De manière générale, les adultes sont hautement susceptibles aux norovirus,
excepté quelques-uns qui présentent une résistance naturelle à certaines souches. Les
premières études menées sur des adultes volontaires ont en effet révélé qu’après avoir
été contaminés, certains d’entre eux développaient une infection et la maladie alors que
d’autres (avec ou sans immunité acquise précédemment) ne développaient pas
d’infection [260]. Cette résistance naturelle a depuis été expliquée par un facteur
génétique (aucune activité du gène FUT2). De plus, il a été montré que les humains
développent deux types d’immunité acquise : à court terme et à long terme. L’immunité
à court-terme offrirait une protection contre la souche responsable de l’infection durant
une période d’au moins six mois après la première infection. De récents travaux
suggèrent que l’immunité pourrait durer jusqu’à 4,1 à 8,7 années [261]. L’immunité à
long terme est quant à elle controversée. À la suite d’une deuxième infection plusieurs
mois après la première, certains individus génétiquement susceptibles sont à nouveau
sensibles à l’infection alors que d’autres sont encore résistants [153]. Le fait que certains
génotypes, comme les GII.3, soient surtout détectés chez les enfants suggère là aussi
une immunisation à long terme des adultes [219].
1.3.6. Excrétion virale
Des particules virales de norovirus sont détectées dans les matières fécales, les
vomissures ainsi que dans la bouche des individus infectés [262]. Il a récemment été
prouvé que ces particules pouvaient aussi être détectées dans les excrétions nasopharyngées [263].
La charge virale est importante dans les selles des personnes infectées. Elle serait de
l’ordre de 108 à 1010 copies d’ARN par gramme de selles pour les norovirus appartenant
au GII [264-266] ou au GI [267]. Bien que le virus puisse être détecté dans les fèces
pendant une moyenne de quatre semaines suivant l’infection, le pic d’excrétion de
norovirus apparaît 2 à 5 jours après l’infection [267].
La charge virale des vomissures est également conséquente. Elle est estimée à au moins
106 particules virales par millilitre de vomissures, sachant qu’un patient symptomatique
vomit environ 30 mL [268].
29
1.3.7. Diagnostic clinique et détection environnementale
Plusieurs outils sont disponibles pour vérifier la présence de particules virales dans les
fèces, les vomissures, la bouche ainsi que les aliments, l’eau, les surfaces ou tout autre
vecteur suspecté. Puisque tous les norovirus humains ne sont pas encore clairement
cultivables en laboratoire, les méthodes moléculaires et immunologiques ainsi que la
microscopie électronique constituent ce panel d’outils. Plusieurs revues sont disponibles
à ce sujet [36, 269, 270]. Notons que ces méthodes nous renseignent sur la présence
physique des norovirus mais aucunement sur leur pouvoir infectieux. Ce problème fait
l’objet d’études depuis une dizaine d’années. Afin de ne quantifier que les virus
infectieux, divers prétraitements visant à déterminer l’intégrité de la capside ou de l’ARN
ont été étudiés [271].
Lorsqu’une épidémie de gastroentérites est déclarée et que l’agent étiologique en cause
n’est pas encore connu (retard dans l’obtention des résultats des laboratoires), il est
recommandé d’utiliser les critères établis par Kaplan en 1982 [223] pour déterminer si
un norovirus en est responsable [272]. Ces critères sont :
1. les excrétions ne contiennent pas de bactéries pathogènes ;
2. plus de 50 % des cas reportés ont pour symptôme des vomissements ;
3. la durée moyenne ou médiane de la maladie est comprise entre 12 et 60 heures ;
4. la durée moyenne d’incubation de la maladie est comprise entre 24 et 48 heures.
L’efficacité de ces critères a été réévaluée en 2006 [273]. Sur 362 cas confirmés
d’épidémies de gastroentérites, les critères de Kaplan ont montré une sensibilité de
68,2 % avec une spécificité de 98,6 %.
1.3.7.1.
Microscopie électronique
La microscopie électronique fut un outil primordial dans la découverte des norovirus.
Néanmoins, cette technique est peu sensible avec une limite de détection d’environ 106
particules par gramme ou millilitre [268, 274] et nécessite un équipement coûteux [36].
Des variantes ont été développées comme l’immuno-électromicroscopie qui se base sur
la réaction antigène-anticorps visualisée par microscopie électronique en coloration
inverse [32].
30
1.3.7.2.
Techniques immunologiques
Une première génération de tests utilisant des réactifs provenant d’individus infectés par
les norovirus fut développée vers la fin des années 1970 : des dosages radioimmunologiques [275] et immuno-enzymatiques [276] ainsi que le Western Blot [277].
Aujourd’hui, les réactifs utilisés proviennent de VLPs. Les tests d’ELISA (Enzyme-Linked
ImmunoSorbent Assay) sont les plus utilisés [278-282]. Le test RIDA®QUICK (rbiopharm) est le seul test à être approuvé par la FDA pour identifier les norovirus [271].
Ces méthodes présentent l’avantage d’être plus sensibles que la microscopie
électronique, mais ont tout de même une limite de détection proche de 105 particules
par réaction [271, 278]. Elles sont aussi plus rapides et plus simples que les techniques
moléculaires [280], mais moins spécifiques [272, 283]. Les méthodes immunologiques
sont conseillées pour une identification préliminaire en cas d’épidémie et non comme un
véritable outil de diagnostic [282, 284-286], les résultats négatifs devant être validés
par des méthodes moléculaires [287-289]. Enfin, notons que ces méthodes ne
discriminent pas les virus infectieux des capsides entières, mais vides [271].
1.3.7.3.
Techniques moléculaires
Les méthodes moléculaires sont basées sur la détection de l’ARN. Elles sont devenues
accessibles pour la détection des norovirus après le séquençage du génome complet de
plusieurs souches [290, 291]. Avec une limite de détection relativement faible, ce sont
les
plus
adaptées
pour
la
détection
des
norovirus
dans
les
échantillons
environnementaux et alimentaires où la charge virale est souvent faible. Parmi les
méthodes existantes, la RT-PCR conventionnelle, et de plus en plus, la RT-PCR en temps
réel sont majoritairement utilisées. Cette dernière permet une amplification et une
détection plus rapides ainsi qu’un niveau plus faible de post-contaminations en
laboratoire causées par la manipulation des échantillons. Des trousses permettant la
détection de plusieurs pathogènes simultanément sont aujourd’hui disponibles [292].
D’autres méthodes alternatives ont également été développées comme l’amplification
des acides ribonucléiques NASBA (pour Nucleic Acid Sequence-Based Amplification)
[293, 294] ou l'amplification isotherme à médiation par boucles RT-LAMP précédée d’une
transcription inverse (RT-LAMP pour Reverse Transcribed Loop mediated isothermal
AMPlification) [295, 296]. Toutes ces méthodes ne permettent cependant pas de
distinguer les virus infectieux des virus non infectieux ou de l’ARN libre. Des
prétraitements avec des protéases, des nucléases ou des agents intercalant comme le
propidium monoazide (PMA) peuvent alors être utilisés [271].
31
Pathologie intestinale
Symptomatique
(70 %)
Asymptomatique
(30 %)
Excrétion des virus
Fèces
Vomissures
Personne infectée
Encore présente
(40 %)
Protégé
Absente
(60 %)
Susceptible
Immunité acquise précédemment
Vecteurs de transmission
Non-sécréteur
(20 %)
Résistant
Sécréteur
(80 %)
Susceptible
Personne à
personne
Aliments
Eau
Environnement
Population exposée
Figure 1.9 Cycle de transmission des norovirus. Il commence avec des individus infectés (symptomatiques
ou non) qui excrètent du virus dans leurs fèces et, dans le cas des personnes symptomatiques, dans leurs
vomissures. Les virus peuvent alors être transmis à une personne saine par l’intermédiaire d’un contact de
personne à personne, des aliments prêts-à-manger ou mangés crus, de l’eau de consommation ou de loisir ou
encore par les surfaces environnementales. Notons qu’une contamination peut emprunter plusieurs de ces
vecteurs de transmission comme, par exemple, des légumes contaminés par l’eau d’irrigation. Les personnes
saines susceptibles d’être contaminées incluent des personnes sensibles aux norovirus (statut sécréteur, 80 %
de la population caucasienne) et d’autres naturellement résistantes (statut non-sécréteur). Les personnes au
statut sécréteur dont l’immunité acquise n’est plus active sont infectées et sont à l’origine d’un nouveau cycle.
Adapté de Hall et coll. [3].
32
1.4.
Transmission et stabilité
Les fèces et les vomissures, dont les aérosols, d’une personne contaminée constituent
la seule source initiale de norovirus. Les personnes asymptomatiques constituent
également une source de contamination, d’autant plus hasardeuse si ces personnes
manipulent des aliments [297] ou séjournent dans des centres de soins [298]. La
transmission des norovirus peut avoir lieu directement suite à un contact de personne à
personne ou indirectement par l’intermédiaire d’aliments, d’eaux ou d’un environnement
contaminés (figure 1.9). Le tableau 1.7 résume les facteurs reliés aux norovirus qui
expliquent leur dissémination rapide et leur persistance dans la population.
Puisqu’aucun système de culture des norovirus humains n’était disponible, il était
impossible de savoir si les virus détectés dans les aliments, l’eau ou les surfaces étaient
infectieux. Néanmoins, une comparaison entre les souches détectées sur ces vecteurs
et celles détectées dans les excrétions d’individus infectés permettait d’établir une
corrélation, si corrélation il y a. Bien souvent, la source initiale de contamination et le(s)
mode(s) de transmission ne sont pas identifiés [299-303] notamment car plusieurs
modes de transmission successifs sont probablement impliqués [304-307].
1.4.1. Transmission de personne à personne
La contamination peut avoir lieu lors d’un contact direct ou étroit ainsi que lors d’une
exposition aux aérosols engendrés par des vomissements [34, 268, 305, 308-313]. Une
étude a d’ailleurs mis en évidence une relation significative entre la distance séparant
une personne saine de la personne infectée vomissant et le risque de tomber malade
[314]. Ce mode de transmission est souvent mis en cause dans les établissements où
les individus sont confinés comme les bateaux, les avions, les hôtels ou encore les écoles
(tableau 1.8).
Il semblerait que lorsque la source de contamination est inconnue (ni aliment ni eau en
cause), la transmission est souvent dite de personne à personne alors que les
contaminations dues à l’environnement sont aussi fréquentes [315].
33
Tableau 1.7 Facteurs facilitant la propagation et la persistance des norovirus
FACTEUR
DESCRIPTION
RÉFÉRENCES
Charge virale excrétée
considérable
Au moins 106 virus par mL de vomissures et 108 à 1010 copies
d’ARN par g de fèces même chez les individus
asymptomatiques.
[205, 264, 265, 267, 316]
Longue durée des
excrétions
Excrétion jusqu’à un jour avant l’apparition des symptômes et
pendant plusieurs semaines voire plusieurs mois après la
guérison clinique.
[226, 317‐319]
Augmentation du risque de contaminations secondaires et
notamment lorsque ces personnes sont des manipulateurs
d’aliments.
[180]
Dissémination facile et
rapide lors des
vomissements
Dissémination rapide des épidémies à cause de
l’aérosolisation des norovirus lors des vomissements, qui
peuvent à leur tour contaminer l’environnement et induire
des infections secondaires.
[183, 314, 320‐323]
Haute infectiosité
Une infection primaire de norovirus engendrerait plus de 14
infections secondaires en l’absence de mesures d’hygiène.
[324]
Haute stabilité
environnementale
D’après les observations faites pendant les épidémies, les
norovirus peuvent rester infectieux pendant deux semaines
sur des surfaces environnementales et plus de deux mois
dans l’eau. Des conditions sèches et fraiches semblent
favorables à leur persistance.
[200, 322, 325]
Forte résistance aux
désinfectants
chimiques
Les études menées sur le MNV-1 ou d’autres modèles
suggèrent que les norovirus sont hautement résistants aux
désinfectants chimiques classiquement utilisés.
[7, 138, 326]
Large panel de
personnes
susceptibles
Les norovirus peuvent infecter des personnes de tout âge,
des nourrissons aux personnes âgées.
[68]
Ils présentent une forte diversité antigénique induite par des
mutations et des recombinaisons engendrées par l’ARN
polymérase ARN-dépendante virale qui ne possède pas
d’activité de relecture et est encline aux changements de
matrices pendant la réplication.
[327‐330]
Immunité à long
terme incertaine
L’immunité à long terme protégeant un individu contre toutes
les souches de norovirus n’existe pas.
[68]
34
Tableau 1.8 Exemples d'épidémies de gastroentérites dues aux norovirus où la transmission de personne à
personne a été mise en évidence.
SOURCE
RÉFÉRENCES
Maisons de retraite et hôpitaux
[34, 311, 331‐336]
Résidences universitaires
[337]
Camps de réfugiés
[338]
Pèlerinage
[313]
Camps d’été
[339]
Bateaux
[305, 312, 340, 341]
Garderies
[342, 343]
Hôtel
[344]
Exposition à des vomissures
[268, 308, 314, 345, 346]
35
Tableau 1.9 Exemples d'épidémies de gastroentérites dues aux norovirus où la transmission par les aliments
a été mise en évidence.
SOURCE
RÉFÉRENCES
Huîtres
[347‐358]
Crustacés
[359]
Moules
[360]
Salades
[361‐364]
Légumes
[365]
Melons
[366]
Framboises
[367‐372]
Tableau 1.10 Exemples d'épidémies de gastroentérites dues aux norovirus où la transmission par les aliments
due à un manipulateur symptomatique ou asymptomatique a été mise en évidence.
Manipulateur symptomatique
Manipulateur asymptomatique
SOURCE
RÉFÉRENCES
SOURCE
RÉFÉRENCES
Gâteaux de mariage
[373, 374]
Roulés au jambon
[375]
Pâtisseries
[376]
Tomates et hamburgers
[377]
Petits pains
[378]
Sandwichs
[379]
Charcuterie
[380]
Salades
[381, 382]
Sandwichs et salades
[383]
Salades
[384]
36
1.4.2. Transmission par les aliments
Ce mode de transmission implique fréquemment les aliments consommés crus ou peu
cuits, incluant les fruits de mer ainsi que les fruits et légumes (tableau 1.9). La
contamination des aliments peut avoir lieu pendant la phase de production à cause de
l’eau d’irrigation par exemple, ou pendant la phase de préparation par l'intermédiaire du
manipulateur (tableau 1.10). Ce mode de transmission peut rapidement engendrer de
larges épidémies [13] constituant un réel problème dont l’ampleur est accrue dans le
cadre du commerce international entre pays qui n’ont pas les mêmes règles d’hygiène.
1.4.2.1.
Fruits de mer
Parmi les aliments impliqués dans les épidémies de norovirus, les fruits de mer et
notamment les huîtres sont les plus souvent mis en cause [315]. Leur contamination fait
souvent suite à une contamination des eaux côtières d’élevage, elles-mêmes
contaminées par des eaux usées non traitées provenant par exemple des bateaux de
pêche [385] (sujet révisé par Campos et coll. [386]). Des analyses de routine menées
dans différents pays ont mis en évidence la présence de norovirus humains dans les
zones côtières [387] et dans les fruits de mer [388-391]. Les quantités étaient certes
faibles, mais susceptibles de conduire à des infections après ingestion, puisque la dose
infectieuse est faible et que les fruits de mer sont souvent consommés crus. Les
norovirus sont capables de persister longtemps à l’intérieur des bivalves (au moins
quatre semaines dans les moules après leur contamination [392]) en plus de ne pas être
efficacement éliminés par les systèmes d’épuration des bivalves [121, 393, 394]. La
qualité de l’eau des exploitations conchylicoles est donc primordiale.
Ces mollusques bivalves se nourrissent en filtrant de grandes quantités d'eau à travers
leurs branchies [395] et sont capables de concentrer sélectivement différents types de
pathogènes, dont des norovirus humains, jusqu’à 1000 fois en 24 heures [392, 396,
397]. Les norovirus humains se fixent dans les tissus des coquillages grâce à des résidus
glucidiques similaires aux ligands humains [398]. Les norovirus du GII.4 se fixent
quasiment dans tous les tissus, ceux du GII.3 s’accumulent préférentiellement au niveau
du manteau et des branchies et ceux du GI au niveau de leur tube digestif [399]. Il en
résulte que les coquillages sont souvent porteurs de différentes souches de norovirus
simultanément. Ce phénomène explique pourquoi les épidémies reliées aux coquillages
mettent en cause plusieurs génotypes, contrairement aux épidémies liées à un contact
de personne à personne qui n’impliquent généralement qu’un génotype [395].
37
1.4.2.2.
Fruits et légumes
Les fruits et légumes frais sont aussi une source de contamination fréquente par les
norovirus (tableau 1.9) car ils sont consommés crus ou peu cuits, parfois sans être pelés
et peuvent être sujets à de nombreuses manipulations lors de leur préparation. Ils
peuvent être contaminés en surface ou en interne par l’eau d’irrigation ou de lavage
[400-402], lors de leur préparation [403, 404] ou par un manipulateur (tableau 1.10)
suite à des transferts entre leurs mains, les surfaces et les aliments.
Certains végétaux comme la laitue semblent posséder des récepteurs similaires aux
HBGAs à la surface de leurs feuilles (au niveau des stomates ou des nervures
secondaires) favorisant l’attachement des norovirus [405]. Notons que la présence de
boues favorise la contamination des laitues [406]. L’intérieur des fruits et légumes peut
aussi être contaminé suite à une internalisation, par les racines, des norovirus présents
dans l’eau d’irrigation [400, 407]. Dans ce dernier cas, il est alors d’autant plus difficile
de les éliminer avant leur consommation à l’état frais.
Des analyses de routine ont mis en évidence la présence de norovirus humains sur une
variété de fruits et légumes [389]. Les norovirus semblent capables d’y persister durant
une période excédant la durée de vie des produits [294, 408].
1.4.2.3.
L’expression
«
Manipulateurs d’aliments
manipulateurs
d’aliments
»
regroupe
les
récoltants
(pêcheurs,
maraîchers), les cuisiniers et les traiteurs [409]. Une bonne hygiène (surtout des mains)
est capitale pour éviter une transmission des norovirus [309, 410]. Si leurs mains sont
contaminées par des norovirus, ils peuvent les transmettre par contact à des aliments
ou à toute autre surface animée ou inanimée (poignées de porte ou robinets par
exemple) ou encore à de l’eau. Des études suggèrent que les norovirus persistent
pendant au moins deux heures sur des mains [411], laissant le temps à un individu de
transférer ces virus jusqu’à sept surfaces propres de manière successive [412]. Notons
que dans ce cas, la transmission du virus devient alors environnementale. L’implication
des manipulateurs d’aliments pourrait être réduite s’ils étaient mieux informés au sujet
des norovirus et de leurs voies de transmission [413].
Par ailleurs, une infection par les norovirus peut se manifester par une apparition
soudaine de vomissements par jets et donc d’aérosols. Lorsque la maladie se déclare de
cette façon chez un manipulateur d’aliment au travail, la situation est particulièrement
problématique car des norovirus sont disséminés dans toute la pièce et donc difficilement
38
éliminés en totalité (tableau 1.10). Une telle épidémie a par exemple eu lieu après qu’un
assistant-cuisinier ait vomi dans l’évier de la cuisine [414]. Il a aussi été démontré que
30 % des personnes infectées étaient asymptomatiques. Étant donné qu’elles excrètent
tout de même des virus, le risque de transmission est assez élevé si ces personnes sont
des manipulateurs d’aliments [13, 415, 416].
1.4.3. Transmission par l’eau
Les norovirus présents dans les matières fécales et les vomissures des personnes
malades finissent par être rejetés dans les eaux usées. Ils se retrouvent ensuite dans
les effluents car les systèmes d’épuration des eaux usées (à base de boues activées ou
de filtres) sont assez peu efficaces pour leur élimination [417-419]. Ainsi, les norovirus
se retrouvent dans les eaux superficielles, comme les rivières ou les lacs, mais aussi
dans les eaux souterraines après infiltration et dans l’eau de consommation [420]. Des
analyses de routine ont révélé la présence des norovirus dans des eaux urbaines [421],
des bassins versants, des estuaires et des rivières [422, 423]. Les norovirus,
principalement du GI, seraient capables d’y persister pendant au moins deux mois [200,
424]. La contamination des eaux s’accentue à mesure que la source se rapproche d’un
système d’épuration [425]. Par conséquent, les norovirus peuvent être transmis à une
personne saine par l’intermédiaire d’eaux de consommation ou de loisir (tableau 1.11)
souillées [426] ce qui peut rapidement engendrer de larges épidémies [13].
Tableau 1.11 Exemples d'épidémies de gastroentérites dues aux norovirus où la transmission par la
consommation d’eau contaminée a été mise en évidence.
Eau de consommation
Eaux de loisir
SOURCE
RÉFÉRENCES
SOURCE
RÉFÉRENCES
Puits personnels
[427‐431]
Fontaine
[432]
Réservoirs d’hôtels ou de
stations de vacances
[433‐437]
Lac
[438]
Eau de la ville
[421, 439‐443]
Piscine
[444, 445]
Glaçons
[446]
Parc aquatique
[447]
Rivière
[448]
39
Tableau 1.12 Exemples d'épidémies de gastroentérites dues aux norovirus où la transmission par
l'environnement a été mise en évidence.
SOURCE DE L’ÉPIDÉMIE
RÉFÉRENCES
Matériel informatique (école)
[449]
Casiers, commodes, rideaux, instruments médicaux, claviers, toilettes, chaises
(hôpitaux et centres de réhabilitation)
[450‐452]
Surfaces horizontales, tapis, sièges de toilette, restaurant (hôtels)
[183, 453]
Passerelle (salle de concert)
[454]
Surfaces (péniches)
[184]
Toilettes, robinets pour servir les jus de fruits (avion)
[455‐457]
Toilettes (bateaux)
[458]
40
Par ailleurs, plusieurs études suggèrent qu’une attention particulière doit être portée aux
biofilms, notamment présents dans les eaux usées et les systèmes de distribution d’eau.
Ces structures complexes composées de microorganismes et de leurs exopolymères sont
capables de coloniser pratiquement n’importe quel type de surface [459]. Elles offrent
une protection à ces microorganismes contre les stress environnementaux et notamment
les désinfectants. Il a déjà été rapporté que des bactériophages comme le MS2 ou le
φX174 ainsi que le poliovirus étaient capables de s’attacher et de pénétrer dans des
biofilms bactériens [420, 460, 461]. Récemment, des norovirus humains ont été
détectés dans des biofilms présents dans des eaux usées [4]. Bien que les norovirus ne
puissent pas s’y multiplier, ces biofilms peuvent contribuer au prolongement de la durée
des contaminations en libérant progressivement les norovirus internalisés lors de
l’érosion naturelle du biofilm, en sus de la protection offerte contre les traitements
d’assainissement.
1.4.4. Transmission par l’environnement
La contamination d’une personne peut également avoir lieu sans aucun contact avec une
personne
infectée,
seulement
par
l’intermédiaire
d’un
environnement
souillé
(tableau 1.12). Le terme « environnement » regroupe toutes les surfaces inanimées
telles que la lunette des toilettes, les poignées de porte, les comptoirs de cuisine ou les
claviers d’ordinateur. Ces différents objets, fréquemment touchés, peuvent être
contaminés suite à une exposition directe avec des excrétions d’un individu contaminé
[462], à un contact avec une surface animée comme les mains des cuisiniers [412, 463,
464] ou encore par des particules de poussières, lipidiques ou aqueuses, chargées en
norovirus [465]. Les virus ne sont pas forcément exposés uniquement à la surface du
matériau, ils peuvent aussi pénétrer dans ses aspérités, surtout s’il est poreux [462].
Ainsi, les norovirus ont déjà été détectés sur des interrupteurs muraux, des télévisions,
des téléphones cellulaires ou publics, des robinets, des lunettes des toilettes, des fours
à micro-ondes, des claviers d’ordinateur ou des chaises [320, 321]. De même, ils ont
faiblement, mais fréquemment, été détectés sur plusieurs surfaces de restaurants [299].
Ces contaminations sont détectées pendant les épisodes épidémiques, mais également
en dehors. Les norovirus et les autres virus entériques sont en effet connus pour leur
grande persistance sur les surfaces tout en gardant leur pouvoir infectieux [409].
Récemment, Kim et coll. [466] ont prouvé qu’après 28 jours sur du bois, du verre, de
l'acier inoxydable, de la céramique ou du plastique, la concentration du MNV-1 était
réduit de 2,3 log10 maximum. Ces résultats sont en accord avec de précédents travaux
41
Transmission directe
Infections
Vomissements soudains
Transmission environnementale
Temps
J1
Jours suivants
Semaines suivantes
Figure 1.10 Illustration de l’implication relative des modes de transmission direct et indirect des norovirus,
proposée par Lopman et coll. [465]. Ils suggèrent que le plus fort risque de contamination a lieu suite à un
contact direct avec une personne contaminée. Cependant, ce risque s’atténue assez rapidement. Quelques
jours après la déclaration de la maladie, le risque majeur de contamination provient d’une transmission
environnementale. Ce risque s’atténue avec le temps, mais persiste pendant au moins deux semaines.
42
[467, 468]. De même, le FCV, qui a longtemps utilisé comme modèle animal des
norovirus, persiste plus de 3 jours sur les boutons de téléphone, pendant 1 à 2 jours sur
les souris d’ordinateur et de 8 à 12 heures sur les claviers d’ordinateurs [469]. La
présence de résidus alimentaires augmente grandement la survie des norovirus sur les
surfaces. Des coupons en acier inoxydable, propres et avec des résidus de porc, ont été
infectés avec le norovirus murin MNV-1. En 30 jours, le pouvoir infectieux n’était plus
mesurable sur les coupons propres (6,2 log de réduction) alors que les coupons avec
des résidus de porc n’ont montré que 1,4 log de réduction [470]. Les objets difficilement
nettoyables comme les tapis sont aussi problématiques [183, 322].
La présence d’un environnement contaminé et incorrectement désinfecté semble jouer
un rôle déterminant dans l’étendue spatiale [320, 321] et temporelle des infections [183,
451, 471, 472]. Ce dernier point est bien illustré dans la revue de Lopman et coll. [465]
dont la figure 1.10 a été adaptée. Au regard de cette persistance et comme l’ont souligné
plusieurs établissements, il est nécessaire d’adopter des mesures d’hygiène rigoureuses
afin de contenir les contaminations [320, 321, 473, 474] et d’autant plus si les
programmes de désinfection ne sont pas véritablement efficaces [475, 476].
1.4.5. Transmission par zoonose
Le conseil consultatif des académies des sciences européennes (EASAC pour European
Academies Science Advisory Council) a défini la zoonose comme étant toute infection
naturellement transmissible, directement ou indirectement, entre les animaux vertébrés
et l'humain avec certains agents causant la maladie à la fois chez l'animal, l'homme et
des commensaux de l'animal [477]. La question d’une transmission par zoonose pour
les norovirus est soulevée par le simple fait que les génogroupes II et IV rassemblent
des souches infectant les humains et d’autres animaux.
Pour le moment, aucune transmission zoonotique n’a été rapportée. Toutefois, des
indices laissent penser que ce mode de transmission peut exister. Par exemple, les
norovirus humains peuvent infecter des veaux [478] ou des porcelets gnotobiotiques
[479] et des réponses sérologiques à des souches humaines ont été détectées chez les
porcs [480]. En outre, des antigènes contre des souches canines du GIV [481] ont été
identifiés chez des vétérinaires. Des études supplémentaires sont nécessaires afin de
trancher sur l’éventualité d’une transmission zoonotique des norovirus et de déterminer
si les animaux peuvent constituer un réservoir, duquel pourraient émerger de nouvelles
souches.
43
1.5.
Stratégies de prévention et de contrôle
Bien que les infections par les norovirus soient généralement bénignes, il s’agit d’une
maladie endémique générant de lourdes pertes économiques estimées à plusieurs
centaines de millions de dollars américains par an [187, 482-484]. Pour limiter le nombre
d’infections et ainsi l’ampleur des épidémies de gastroentérites, deux grandes stratégies
sont généralement employées : vacciner la population et gérer les cas déclarés pour
prévenir les infections secondaires ou les épidémies.
1.5.1. Traitements
1.5.1.1.
Traitements préventifs
Aucun vaccin contre les norovirus n’est encore commercialisé car leur mise au point a
été retardée par plusieurs facteurs dont le manque d’un système de culture des norovirus
humains et leur grande variation antigénique. Toutefois, plusieurs candidats prometteurs
sont en cours de développement [485]. La compagnie pharmaceutique Takeda a déjà
lancé plusieurs essais cliniques avec des vaccins monovalents dirigés contre les norovirus
du GI.1 [486-488] et bivalents contre les norovirus des GI.1 et GII.4 [489]. Récemment,
Bernstein et coll. [490] ont publié les résultats d’un essai clinique où un vaccin bivalent
à base de VLPs dirigé contre les norovirus des GI.1 et GII.4 a permis de réduire les
vomissements et les diarrhées dus aux norovirus.
1.5.1.2.
Traitements curatifs
Peu de traitements curatifs contre les norovirus sont aujourd’hui disponibles (révisé par
Rocha-Pereira et coll. [491]). La plupart des molécules disponibles ont pour cible la
protéase (NS6) et l’ARN polymérase-ARN dépendante (NS7). Citons par exemple la
ribavirine, un analogue de la guanosine, qui bloque l’activité de la polymérase [492].
1.5.2. Gestion des infections
Plusieurs guides nationaux destinés à la gestion des infections et des épidémies en
établissement de soin sont parus en Australie, en Irlande, au Royaume-Uni et aux
États-Unis [272, 493-496]. Ils s’accordent tous pour préconiser un renforcement des
mesures de nettoyage et de désinfection en plus d’une hygiène stricte des mains,
l’isolement des patients, la restriction des visites, l'exclusion du personnel de travail
infecté et la fermeture des services touchés.
44
1.6.
Désinfection
Ce point a fait partie d’un chapitre de livre présenté à l’annexe 1.
1.6.1. Deux grandes approches : chimique et physique
Afin d’interrompre la transmission des norovirus, plusieurs molécules chimiques et
procédés physiques peuvent être utilisés directement sur les aliments, dans l’eau ou des
boissons ou encore sur les surfaces.
L’acide hypochloreux, les alcools et les ammoniums quaternaires sont trois types de
molécules
largement
retrouvés
dans
les
formulations
commercialisées.
L’acide
hypochloreux, présent dans l’eau de Javel, est le plus utilisé. Il est notamment ajouté
dans les systèmes de distribution d’eaux et recommandé pour la désinfection des
surfaces en cas d’infections à norovirus par le CDC américain [493]. Cependant,
plusieurs études ont conclu que cette molécule était insuffisamment efficace (réduction
virale inférieure à 3 log10) pour la décontamination de surfaces [497, 498] et d’aliments
frais [408, 499-501]. De plus, elle forme en présence de résidus organiques des sousproduits toxiques [502], comme les trihalométhanes considérés comme potentiels
cancérogènes [8]. Par ailleurs, notre équipe a récemment démontré que les alcools et
les ammoniums quaternaires étaient peu, voire pas efficaces contre les norovirus [6].
Des substances alternatives plus sécuritaires sont par conséquent recherchées telles que
le dioxyde de chlore, l’ozone et l’acide peracétique [7]. Concernant les procédés
physiques, les traitements à la chaleur ont été les premiers utilisés et sont les plus
connus. Ils sont efficaces mais ne sont pas applicables à tous les produits, comme les
fruits et légumes consommés frais. Par conséquent, de nouveaux procédés dits de
pasteurisation à froid ont été développés. Les hautes pressions, l’irradiation, la lumière
UV ou les lumières pulsées entrent dans cette catégorie. Sans induire d’augmentation
de la température, ces procédés ont un pouvoir inhibiteur contre des bactéries, des
levures, des moisissures ainsi que des virus [7]. Notre équipe a récemment obtenu des
résultats encourageants sur l’inactivation des norovirus par les lumières pulsées [503].
Pour ce doctorat, nous avons examiné de plus près deux technologies écologiquement
responsables, une chimique avec les acides peroxycarboxyliques, dont l’acide
peracétique, et une physique avec les lumières pulsées. Ces deux méthodes couvrent
des champs d’application différents au regard de leurs avantages et inconvénients
propres (tableau 1.13).
45
Tableau 1.13 Exemples d’avantages et d’inconvénients des acides peroxycarboxyliques et des lumières
pulsées.
CARACTÈRE
ACIDES PEROXYCARBOXYLIQUES
LUMIÈRES PULSÉES
Stockage
Nécessite des mesures particulières
(substances explosives)
Aucun stockage nécessaire
Nécessite un appareillage
Non
Oui
Utilisation automatisée
Possible
Possible
Présence de résidus
Oui, sauf si un rinçage est appliqué
Non
Applicable aux aliments solides
Oui, sauf pour les fruits de mer,
seulement en surface
Oui, seulement en surface
Applicable aux boissons
Parfois
Oui, si la turbidité est faible
Applicable aux objets emballés
Non, sauf si l’emballage est
perméable aux gaz
Oui, si l’emballage n’absorbe
pas les UV
Applicable aux eaux de rinçage
Oui
Oui, si la turbidité est faible
46
1.6.2. Inactivation virale : quelles cibles d’attaque ?
Plusieurs phénomènes distincts qui interfèrent avec le cycle de réplication peuvent
entraîner une inactivation virale (figure 1.11). Ainsi, les virus nus peuvent être inhibés
suite à une altération de leurs antigènes viraux, de leur capside et/ou de leurs acides
nucléiques [504, 505].
cellule hôte
A. Altération des
structures impliquées
dans la
reconnaissance de la
cellule hôte
B. Altération des
acides nucléiques
(cassures, dimères,
dégradation partielle
ou totale)
virus entérique
C. Altération de la
capside
Figure 1.11 Cibles d’attaque possibles permettant d’inactiver un virus nus, incluant (A) les structures
impliquées dans la reconnaissance de la cellule hôte, (B) les acides nucléiques ou (C) la capside [7].
47
Hydroperoxydes
Peroxydes dialkyles
Hydroperoxydes et peroxydes dialkyles
avec un α-oxygen substitué
Peroxydes organiques
ROOH ou ROOR'
Ozonides et ozonation
Acides
peroxycarboxyliques
R[C(O)OOH]n
Peroxyacides
Acides
organoperoxysulfoniques
Peroxydes acyles
RSO2-OOH
Peroxyesters acyles
Figure 1.12 Organigramme présentant la place des acides peroxycarboxyliques au sein des groupes formant
les peroxydes organiques. L’acide peracétique est un des représentants des acides peroxycarboxyliques.
Figure 1.13 Formule semi-développée de l’acide peracétique.
48
1.7.
Acides peracétique et peroxycarboxyliques
1.7.1. Présentation
1.7.1.1.
Formule chimique
L’acide peracétique est un acide peroxycarboxylique (figure 1.12). Il est d’ailleurs aussi
connu sous le nom d’acide peroxyacétique, d’hydroperoxyde d'acétyle ou d’acide
éthaneperoxoïque.
Les
acides
peroxycarboxyliques
forment
avec
les
acides
organoperoxysulfoniques la classe des peroxyacides, une des sept classes des peroxydes
organiques [506].
Les peroxydes organiques sont des composés dérivés du peroxyde d’hydrogène,
H-O-O-H, dans lesquels au moins un des atomes d’hydrogène a été remplacé par un
groupement carboné (R ou R’). Ils comprennent donc une liaison peroxyde (O-O) et ont
une
formule
générale
de
type
R-O-O-H
ou
R-O-O-R’
[506].
Les
acides
peroxycarboxyliques ont pour formule générale R[C(O)OOH]n [506]. La formule
semi-développée de la molécule d’acide peracétique (C2H4O3) est indiquée à la figure
1.13.
1.7.1.1.
Plusieurs
Synthèse chimique
méthodes
ont
été
développées
pour
la
synthèse
des
acides
peroxycarboxyliques [506]. La plus utilisée est une réaction réversible entre du peroxyde
d’hydrogène et un acide carboxylique, catalysée par de l’acide sulfurique. Le peracide
est formé suite à une attaque nucléophile du peroxyde d’hydrogène sur l’acide
carboxylique non dissocié. L’acide peroxycarboxylique se présente alors en solution
aqueuse
en
mélange
avec
l’acide
carboxylique
et
le
peroxyde
d’hydrogène
(équation 1.1). Les solutions concentrées peuvent contenir jusqu’à 40 % d’acide
peroxycarboxylique et sont additionnées de stabilisants tels que les acides dipicolinique
ou phytique [506].
Équation 1.1 Réaction chimique en milieu acide (acide sulfurique) menant à la synthèse d’acide
peroxycarboxylique. Il s’agit d’un équilibre quaternaire entre l’acide carboxylique, du peroxyde d’hydrogène,
l’acide peroxycarboxylique correspondant et de l’eau.
49
(Équation 1.2)
(Équation 1.3)
(Équation 1.4)
Tableau 1.14 Caractéristiques de la liaison entre un atome d’oxygène et un autre atome [507].
Force de la liaison (kJ mol-1)
Caractère de la liaison ionique (%)
50
O-H
O-C
O-NO et O-NO2
O-P
480
380
155
160-200
18
15
7
0
1.7.1.2.
Plusieurs
Détermination de la concentration en acide peroxycarboxylique
méthodes
permettent
de
déterminer
la
concentration
en
acide
peroxycarboxylique d’une solution : mesure de la conductivité, chromatographie ou
titration colorimétrique. La mesure de la conductivité est une technique rapide et facile,
mais peu sélective puisque tous les ions présents dans la solution participent à la
conductivité. La chromatographie est également rapide mais requiert une calibration
avec des standards dont la concentration doit être déterminée par titration
colorimétrique [508]. Cette dernière méthode se déroule en deux étapes. Premièrement,
la quantité de peroxyde d’hydrogène est dosée avec du sulfate de cérium (IV) (Ce(SO4)2)
en milieu acide (H2SO4) (équation 1.2). Le point d’équivalence est visualisé par le
changement de couleur de l’indicateur coloré (ferroïne). Deuxièmement, de l’iodure de
potassium (KI) est ajouté au mélange. Il réagit avec l’acide peroxycarboxylique pour
former l’acide correspondant, du diiode (I2), de l’eau et du sulfate de potassium (K2SO4)
(équation
1.3).
La
quantité
de
diode
(proportionnelle
à
celle
de
l’acide
peroxycarboxylique) est dosée par du thiosulfate de sodium (Na2S2O3) (équation 1.4).
Ce deuxième point d’équivalence est visualisé par le changement de couleur de
l’indicateur coloré (amidon) [509].
1.7.1.3.
Propriétés physiques et chimiques
Les acides peroxycarboxyliques sont généralement plus solubles dans l’eau et de plus
faibles acides que les acides carboxyliques parents [506]. Par exemple, le pKa de l’acide
peracétique est de 8,2 alors que celui de l’acide acétique est de 4,7. En solution aqueuse,
les acides peroxycarboxyliques se présentent sous la forme de liquides incolores, d’odeur
piquante et désagréable. Cette odeur caractéristique tend à s’atténuer plus la masse
moléculaire
du
peracide
augmente.
Les
acides
peroxycarboxyliques
ne
sont
généralement pas sensibles aux chocs physiques, mais peuvent exploser après
chauffage [506]. Par exemple, une solution d’acide peracétique peut exploser
violemment si elle est chauffée à 110 °C [510]. Les propriétés chimiques de ces
molécules résultent majoritairement du fait que la liaison peroxyde (O-O) est
relativement faible (tableau 1.14) [511]. En effet, chacun des atomes d’oxygène de la
liaison peroxyde a deux paires d’électrons célibataires qui se repoussent et qui
interagissent avec les liaisons adjacentes de la molécule de peroxyde. Cette liaison O-O
confère à la molécule entière un pouvoir oxydant et la propriété de se scinder de manière
homolytique. Par conséquent, les acides peroxycarboxyliques sont une source de
radicaux libres qui ne nécessite pas d’initiateur [507].
51
(Équation 1.5)
(Équation 1.6)
(Équation 1.7)
(Équation 1.8)
(Équation 1.9)
(Équation 1.10)
(Équation 1.11)
(Équation 1.12)
(Équation 1.13)
(Équation 1.14)
(Équation 1.15)
(Équation 1.16) (Équation 1.17) (Équation 1.18)
(Équation 1.19)
52
1.7.1.4.
Décomposition
En solution aqueuse, les acides peroxycarboxyliques peuvent se décomposer de
différentes manières : (1) par décomposition spontanée en libérant un alcool et du
dioxyde de carbone (équation 1.5) ou leur acide parent et du dioxygène (équation 1.6),
(2) par décomposition catalysée par un métal (équation 1.7), (3) par hydrolyse en
libérant leur acide parent et du peroxyde d’hydrogène (équation 1.8) et (4) par rupture
homolytique de la liaison peroxyde en libérant un radical peroxyle et un radical hydroxyle
(équation 1.9). Ces décompositions sont accélérées en présence d’acides forts, de
particules métalliques, par la chaleur ou la lumière [506, 512-514].
Les radicaux libres ainsi formés (équation 1.9) sont des espèces intermédiaires très
réactives dont la demi-vie est de courte durée (inférieure à 10-3 seconde). Ils vont donc
interagir avec les composants les plus proches, et notamment l’acide carboxylique ou
peroxycarboxylique, mais aussi les acides aminés des capsides virales par exemple, pour
former de nouveaux radicaux (équations 1.10 à 1.17) [506, 514]. Cette propagation
prend fin lorsque deux radicaux interagissent pour former une liaison covalente entre
eux, par une recombinaison (équation 1.18) ou une dismutation (équation 1.19) [506].
1.7.2. Applications et réglementation
L’acide peracétique est utilisé dans différents domaines tels que la désinfection du
matériel médical [515], pour le traitement des eaux usées [516], dans l’industrie du
papier [512], pour l’époxydation des triglycérides [517] et en alimentaire. La FDA
américaine a approuvé l’utilisation de l’acide peracétique (numéro CAS : 79-21-0) pour
la désinfection de certains produits alimentaires, notamment la volaille ainsi que des
fruits et légumes. La concentration d’acide peracétique ne doit pas excéder 200 mg L-1
sur la viande et 80 mg L-1 dans l'eau de lavage des fruits et légumes. La FDA a également
réglementé la concentration en peroxyde d'hydrogène qui ne doit pas excéder 75, 220
et 59 mg L-1 dans la viande, les produits à base de volaille et dans l'eau de lavage des
légumes, respectivement [518, 519]. Par ailleurs, la FDA a approuvé l’utilisation de
l’acide peracétique sur le matériel et les ustensiles de transformation alimentaire ainsi
que sur d'autres articles en contact avec les aliments si les concentrations en acide
peracétique, en peroxyde d’hydrogène et en acide acétique sont comprises entre 100 et
200 mg L-1, 550 et 1 100 mg L-1 et 150 et 300 mg L-1 respectivement [520].
53
Tableau 1.15 Exemples d’inactivation obtenue avec l’acide peracétique contre des virus nus en suspension.
CONCENTRATION
(mg L-1)
pH
DURÉE
(min)
RÉDUCTION
NOTE
RÉFÉRENCE
1 000
-
15
> 3,0 log10
-
[521]
MS2
15
7
10
1,3 log10
-
[522]
MS2
10 000
1,5
20
4,0 log10
-
[523]
750
-
15
4,0 log10
-
[524]
2 000
-
1
> 4,3 log10
Mélange dans de
l’éthanol à 80 %
[525]
VIRUS
Caliciviridae
FCV
Leviviridae
Picornaviridae
Hépatite A
Poliovirus type 1
Tableau 1.16 Exemples d’inactivation obtenue avec l’acide peracétique contre des virus nus immobilisés sur
des surfaces inertes.
CONCENTRATION
(mg L-1)
pH
DURÉE
(min)
RÉDUCTION
RÉFÉRENCE
Acier inoxydable
propre
1 000
7
5
4,0 log10
[526]
Hépatite A
Acier inoxydable
souillé
1 000
-
5
0,6 log10
[527]
Poliovirus type 1
Acier inoxydable
propre
2 000
2,7
10
> 4,8 log10
[497]
VIRUS
SURFACE
Caliciviridae
MNV-1
Picornaviridae
Tableau 1.17 Exemples d’inactivation obtenue avec l’acide peracétique contre des virus nus immobilisés sur
de la laitue.
CONCENTRATION
(mg L-1)
pH
DURÉE
(min)
RÉDUCTION
RÉFÉRENCE
FCV
100
4
2
3,.2 log10
[499]
MNV-1
100
4
2
2,4 log10
[499]
MNV-1
250
-
5
1,4 log10
[500]
250
4
2
0,7 log10
[499]
VIRUS
Caliciviridae
Picornaviridae
Hépatite A
54
1.7.3. Avantages et inconvénients
L’atout majeur des acides peroxycarboxyliques réside dans la nature non toxique de
leurs produits de décomposition. Ils présentent aussi l’avantage d’être hautement
solubles dans l’eau. Il a par ailleurs été démontré que l’acide peracétique était
rapidement efficace [528], sans altérer les qualités organoleptiques et nutritionnelles
des aliments [529]. En revanche, l’entreposage des acides peroxycarboxyliques est
délicat eu égard à leur instabilité. Dépassé une certaine concentration, ils sont également
corrosifs sur certains matériaux comme l’acier, le fer, le cuivre et le laiton même peints
ou plaqués avec du nickel et du chrome, ainsi que sur certains polymères comme le
polyuréthane, le ciment et certains matériaux de construction. Toutefois, l’acier
inoxydable, la porcelaine, le téflon, la faïence, le polyéthylène et le polypropylène n’y
sont pas sensibles [528]. De plus, l’utilisation massive de l’acide peracétique – et plus
encore les autres acides peroxycarboxyliques – reste restreinte à cause de son coût
élevé, en raison d’une production limitée [530].
1.7.4. Inactivation microbienne
L’acide peracétique est l’acide peroxycarboxylique qui a été le plus étudié pour ses
propriétés antimicrobiennes. Il est considéré comme un désinfectant puissant, par le
biais des radicaux libres qu’il génère, tout en étant sécuritaire, car il se décompose en
produits non toxiques et biodégradables. Son activité est reconnue contre les
mycobactéries, les bactéries, les spores bactériennes, les levures, les moisissures et les
algues [531]. D’autres acides peroxycarboxyliques, tels que les acides perpropionique,
percitrique ou perlactique ont fait l’objet de quelques études, et notamment des brevets
pour le contrôle des populations microbiennes des aliments avec une application sous
forme gazeuse [532] ou pour le contrôle des populations microbiennes du tractus digestif
d’animaux avant leur abattage [533].
Les résultats actuellement disponibles indiquent que l’acide peracétique a une activité
contre différents virus nus en suspension, qui excède parfois 4 log10 (tableau 1.15).
Toutefois, les concentrations testées sont pour la plupart supérieures à celles autorisées
par la FDA. Par ailleurs, notons que le peroxyde d’hydrogène présent dans le mélange
participe probablement à l’inactivation observée, mais dans une faible mesure puisqu’il
exhibe une activité antivirale qu’à de fortes concentrations (au moins 10 000 mg L-1)
[497, 522, 534-538].
55
L’activité antivirale des autres acides peroxycarboxyliques n’a pas été examinée, à
l’exception d’une étude avec de l’acide percitrique [539]. Une réduction de 4.0 log10 du
poliovirus avait été observée après un traitement de 1000 mg L-1 pendant 5 min.
L’acide peracétique est également efficace contre plusieurs virus nus déposés sur de
l’acier inoxydable (tableau 1.16). Les concentrations utilisées sont encore une fois
supérieures à celles autorisées par la FDA.
Enfin, quelques études ont évalué le pouvoir inhibiteur de l’acide peracétique contre des
virus nus immobilisés sur de la laitue (tableau 1.17). Il est apparu relativement efficace
pour des concentrations inférieures à celles autorisées par la FDA. Cependant, les
réductions sont globalement inférieures à 3.0 log10, suggérant que l’acide peracétique
pourrait être utilisé pour prévenir les contaminations croisées et non comme un
désinfectant. Une forte résistance du virus de l’hépatite A a été observée [499].
1.7.5. Facteurs modulant l’activité
Peu d’études se sont penchées sur les facteurs impactant l’activité antivirale des acides
peroxycarboxyliques, tels que le pH ou la température. Certains résultats suggèrent que
cette molécule est peu influencée par la présence de matières organiques [500, 521,
525].
1.7.6. Mécanismes d’action
Le
mécanisme
d’action
impliqué
dans
l’activité
antimicrobienne
des
acides
peroxycarboxylique a principalement été étudié dans le cas des bactéries et de l’acide
peracétique.
Notons
qu’il
semble
légitime
de
penser
que
tous
les
acides
peroxycarboxyliques agissent de la même manière contre un microorganisme donné.
Comme nous l’avons vu précédemment, l’acide peracétique est présent dans un mélange
contenant de l’acide acétique et du peroxyde d’hydrogène. Ces trois molécules ont une
activité antibactérienne non spécifique, dont les cibles sont aléatoires. L’acide acétique
sous forme non dissociée (pH < 4,7) diffuse passivement à travers la membrane et
pénètre dans la cellule. Le pH intracellulaire étant proche de la neutralité, l’acide se
dissocie et libère un anion et un proton. L’accumulation d’anions et de protons participe
à l’inactivation en induisant une inhibition de certaines fonctions cellulaires [540, 541].
Il en est de même avec le peroxyde d'hydrogène qui génère des radicaux libres
hydroxyles responsables de dommages au niveau des lipides membranaires, de l'ADN et
d'autres composants cellulaires essentiels [540, 542, 543]. La molécule d’acide
56
peracétique est également destructrice au regard de son effet oxydant sur les protéines,
en particulier sur les groupes thiol des résidus de cystéine. Ces derniers ont des rôles
structural et fonctionnel importants. Les enzymes possédant un résidu de cystéine dans
leur site actif, les protéines structurales de la paroi et les ribosomes peuvent ainsi être
endommagés [544, 545].
Puisque les norovirus ne possèdent pas de lipides et ont un contenu interne très
sommaire, les sites potentiellement dommageables se résument aux protéines virales
(majoritairement VP1, mais aussi VP2 et VPg) et à l’ARN. Le mécanisme d’action impliqué
dans l’activité antivirale des acides peroxycarboxyliques a été peu étudié. Dans les
années 1990, Maillard et coll. ont décrit les différents dommages causés par un
traitement sévère à base d’acide peracétique sur le bactériophage F116. Ils ont alors
observé une altération structurale de la tête et de la queue [546], une altération des
protéines virales [547] et de l’ADN [548]. Dans les années 2000, des dommages
similaires ont été observés sur une souche respiratoire d’adénovirus après un traitement
sévère [525, 549, 550].
Bien que ces études nous renseignent sur les effets de l’acide peracétique au niveau des
particules virales, elles ne démontrent pas les effets premiers responsables de
l’inactivation. Récemment, une étude suggère qu’un traitement modéré responsable
d’une inactivation partielle (100 mg L-1) ne détruirait pas totalement la capside virale,
de sorte qu’elle conserverait une fonction protectrice de l’ARN [499].
1.8.
Lumières pulsées
1.8.1. Présentation
1.8.1.1.
Nature électromagnétique de la lumière
La lumière est une onde électromagnétique, composée d’un champ électrique et d’un
champ magnétique, qui transporte de l’énergie d’un point A à un point B. Cette énergie
est portée par une particule sans masse, nommée photon, qui possède une fréquence
et une longueur d’onde propre. Le comportement des radiations électromagnétiques
dépend de leur fréquence, inversement proportionnelle à leur longueur d’onde, comme
exprimé par la relation de Planck (équation 1.20) [551].
57
u = h =
௛௖
ఒ
Équation 1.20 Relation de Planck avec u l’énergie (J) d’un photon, h la constante de Planck (6.62.10-34 J s),
 la fréquence (s-1), c la vitesse de la lumière dans le vide (2.99.108 m s-1) et λ la longueur d’onde (m) [551].
3.10
10
10
26
-18
12
3.10
10
10
24
-16
10
3.10
10
10
22
-14
8
3.10
10
10
20
-12
6
3.10
10
10
10
3.10
-10
10
4
Rayons 
UV
lointains
18
10
RX
UV-C UV-B UV-A
200
280
315
400
16
-8
3.10
10
2
10
14
-6
0
UV
3.10
10
10
-4
-2
12
3.10
10
10
IR
-2
-4
10
3.10
10
10
8
0
-6
3.10
10
10
Micro-ondes
2
-8
OR
6
3.10
10
10
4
4
 (Hz)
 (m)
-10
E (eV)
Ondes
radio
IR
proches
Visible
780
1500 nm
Figure 1.14 Illustration du spectre électromagnétique allant des rayons  aux ondes radio, en passant par les
rayons X (RX), les ultraviolets (UV), la lumière du visible (arc-en-ciel), les infrarouges (IR), les ondes radar
(OR) et les ondes radio. Les fréquences (Hz), les longueurs d’ondes () et l’énergie des photons (E)
correspondantes sont indiquées. Les UV sont sous-divisés en quatre régions, les UV lointains, les UV-C, les
UV-B et les UV-A. Notons que les limites entre les régions de ce spectre sont en réalité moins nettes [552].
58
Les ondes électromagnétiques couvrent une très large gamme de fréquences, depuis les
ondes radio (fréquence proche de 100 Hz) jusqu’aux rayons  (fréquence proche de
1023 Hz). L’ensemble de ces ondes constitue le spectre électromagnétique (figure 1.14).
Le terme « lumière » fait communément référence à la lumière visible par les yeux des
humains. Plus généralement, le terme « lumière » correspond aux longueurs d’ondes
photochimiques (de 100 à 1000 nm), soit la lumière du visible et ses régions adjacentes
(les ultraviolets ou UV et les infrarouges proches) [551].
1.8.1.2.
Émission, transmission et absorption de la lumière
L’émission d’une lumière dépend de nombreux facteurs tels que l’énergie apportée ou
les dimensions de la lampe. La luminosité (brightness) de la lampe est décrite par
l’émittance et est exprimée en W m-2. Elle correspond donc à la puissance de
rayonnement (W) émis par la lampe rapportée par unité de surface (m2) [551].
La quantité de lumière atteignant une cible a reçu plusieurs dénominations dans la
littérature, souvent inexactes, telles que « intensité », « irradiance », « débit de fluence »
et « dose d’UV ». Lorsque la quantité de lumière reçue est quantifiée par unité de surface,
il faut parler d’irradiance (W m-2). Lorsque la quantité de lumière reçue est quantifiée
par unité de volume, il faut parler de débit de fluence (W m-2). La fluence correspond au
débit de fluence (ou à l’irradiance) multiplié par le temps d’exposition (W s m-2 = J m-2).
Par ailleurs, le terme « dose » ne devrait pas être utilisé puisqu’il réfère à une quantité
totalement absorbée, comme la quantité d’UV nécessaire pour induire un coup de soleil
sur la peau, par exemple. Or, la lumière atteignant un microorganisme est généralement
peu absorbée [553]. La fluence reçue par un échantillon doit absolument être
correctement quantifiée puisqu’elle caractérise le traitement appliqué et permet ainsi la
comparaison avec d’autres expériences, même si des équipements différents sont
utilisés.
La lumière est transmise à une vitesse de 2,99.108 m s-1 dans le vide et ralentit
lorsqu’elle entre dans un milieu fini tel que l’air. Le rapport entre la vitesse de la lumière
dans le vide et dans un milieu correspond à l’indice de réfraction. Lorsque la lumière
passe d’un milieu à l’autre, une partie de la lumière peut être réfléchie ou réfractée. Si
le milieu contient des éléments diffusants, alors une partie de la lumière est diffusée. De
plus, si le milieu contient des éléments absorbants, alors la lumière est atténuée
conformément à la loi de Beer-Lambert [551]. Dans ce dernier cas, notons que si
certaines radiations sont absorbées par le milieu, elles ne seront plus disponibles pour
l’inactivation des microorganismes [554].
59
Tableau 1.18 Énergie de certaines liaisons retrouvées dans les systèmes biologiques avec la longueur d’onde
correspondante [554].
Liaison
Énergie (kJ mol-1)
Longueur d’onde correspondante (nm)
O–H
460
260
C–H
410
290
N–H
390
310
C–O
370
320
C=C
830
140
Cൌ
ഥ N
850
140
C=O
750
160
C=N
600
200
PANNEAU DE CONTRÔLE
Inducteur
Décharge électrique
Condensateur
Alimentation
Déclencheur
CHAMBRE DE TRAITEMENT
Lampe au
xénon
Radiations électromagnétiques
Échantillon
Figure 1.15 Schématisation d’un équipement générant des lumières pulsées.
60
1.8.1.3.
Photochimie
Une molécule ne peut absorber un photon qu’à condition que l’énergie du photon soit
équivalente à l’énergie de l’une de ses liaisons [555]. Les photons dont la longueur
d’onde est comprise entre 100 et 1000 nm peuvent être absorbés par des structures
biologiques. Par exemple, les photons de la région UV ont une énergie similaire à
certaines liaisons fréquemment retrouvées dans les systèmes biologiques (tableau
1.18). Lorsque des photons de ces longueurs d’onde sont absorbés par une molécule,
cette dernière passe de son état initial stable à un état excité instable de plus forte
énergie. Pour retrouver son état initial, elle peut libérer cet excès d’énergie sous la forme
d’un photon (fluorescence ou phosphorescence), de chaleur ou d’une transformation
chimique (photochimie) [551].
La photochimie regroupe donc les transformations chimiques induites par l’absorption
de photons dont la longueur d’onde est comprise entre 100 et 1000 nm. La
photosynthèse est un exemple de photochimie, résultant de l’absorption de certains
photons du visible par les chlorophylles présentes dans les algues ou les plantes vertes
[551]. Les photons dont la longueur d’onde est supérieure à 1000 nm ont en revanche
trop peu d’énergie pour induire des réactions chimiques ; ils apportent de la chaleur. À
l’inverse, les photons dont la longueur d’onde est inférieure à 100 nm (radiations
ionisantes) ont trop d’énergie pour induire une réaction chimique ; ils causent des
ruptures au sein des molécules en les ionisant [551].
1.8.1.4.
Principe des lumières pulsées
Les lumières pulsées ont reçu divers noms dans la littérature scientifique tels que lumière
blanche à large spectre pulsée [556], lumière UV pulsée [557], lumière pulsée à large
spectre et de haute intensité [558] ou lumière blanche pulsée [559]. Cette technologie
consiste à exposer un élément à de brèves et intenses radiations. En pratique, un courant
accumulé dans un condensateur durant une fraction de seconde est transmis à une
lampe, contenant un gaz inerte, sous forme de décharge de haute intensité. Les
électrons entrent en collision avec des molécules de gaz, qui sont alors excitées. En se
désexcitant, ces molécules de gaz émettent une lumière brève, quelques centaines de
microsecondes, et intense, quelques joules par centimètre carré (figure 1.15) [560,
561]. La nature du gaz et de l’enveloppe de la lampe ainsi que le système de
refroidissement de la lampe modulent le spectre émis. Par exemple, une lampe remplie
de xénon dont l’enveloppe est faite de quartz et qui est refroidie par de l’eau émettra un
61
A
B
entrée du produit
chambre de traitement
scellage du film
pour former
l’emballage
lampe
lampe
sortie
entrée
pompe
système de
remplissage
et de scellage
des produits finis
film d'emballage
Figure 1.16 Schématisation de deux systèmes proposés par Dunn et coll. [562] intégrant les lumières pulsées
sur des chaînes de production. (A) Appareil traitant des fluides alimentaires pompables au moment de leur
écoulement dans l’enveloppe entourant la source lumineuse. (B) Appareil de conditionnement aseptique qui
remplit de façon continue un film d'emballage stérilisé par les lumières pulsées.
62
spectre allant des UV-C (200 nm) aux proches IR (1100 nm) [555, 560]. Par ailleurs, à
fluence égale (W s cm-2), la puissance (W) générée par les impulsions (peak power) est
plus grande que celle générée par des radiations continues. Pour cette raison, les
lumières pulsées ont une capacité pénétrante plus importante que les UV continus [562].
De plus amples informations sont disponibles dans la revue de Moraru et coll. [560].
1.8.2. Applications et réglementation
Les lumières pulsées ont diverses applications incluant l’agglomération par frittage
d’encres et de matériaux à base de métaux sur des substrats, la polymérisation de divers
matériaux utilisés dans les dispositifs médicaux ou les disques optiques ou encore la
désinfection [563]. Sous ce dernier volet, les lumières pulsées ont fait l’objet d’un brevet
dès 1984 [564]. Depuis, leur efficacité a été confirmée pour la décontamination en
surface de divers aliments solides, emballés ou non, tels que la laitue, du chou [565,
566], des saucisses [567-569], des œufs [570-572] et du miel [573]. Les lumières
pulsées peuvent aussi être utilisées pour la décontamination de liquides alimentaires tels
que l’eau [556] ou des jus de fruits [574-576], des surfaces alimentaires [577] et
médicales [578]. La figure 1.16 présente deux systèmes proposés par Dunn et coll. [562]
qui intègrent les lumières pulsées pour la stérilisation de liquides alimentaires et le
conditionnement aseptique de liquides alimentaires. La FDA américaine a approuvé
l’utilisation des lumières pulsées pour la décontamination d’aliments et de surfaces
alimentaires à condition que le traitement ait recours à une lampe au xénon émettant
des radiations, allant de 200 et 1000 nm, sous forme d’impulsions durant 2 ms au
maximum. L’énergie totale reçue par les échantillons ne doit pas excéder 12 J cm-2 [579].
1.8.3. Avantages et inconvénients
Cette technologie est respectueuse de l’environnement, car elle ne nécessite pas d’ajout
de produit chimique et utilise des lampes au xénon, un gaz inerte, contrairement aux
lampes UV qui contiennent du mercure. De plus, les lumières pulsées ont peu, voire pas
d’effets négatifs sur les propriétés organoleptiques et les qualités nutritionnelles des
aliments tels que des fraises [580], du jus de pomme [581], divers légumes [582] ou
encore des œufs [571]. Cette technologie permet même de réduire le brunissement
enzymatique des fruits et légumes coupés [562] ou le potentiel allergène de quelques
aliments tels que le soja [583]. Par ailleurs, elle n’implique pas de radiations ionisantes
qui sont assez peu acceptées dans l’opinion publique [582]. Enfin, les fabricants
affirment que les coûts d’opération sont faibles [584].
63
Tableau 1.19 Exemples d’inactivation obtenue avec les lumières pulsées contre des virus nus en suspension.
FLUENCE TOT.
(mJ cm-²)
FLUENCE UV
(mJ cm-2)
INACTIVATION
RÉFÉRENCE
91
-
> 5,5 log10
[503]
Virus de l’hépatite A
91
-
4,8 log10
[503]
Virus de l’hépatite A
250
-
3,8 log10
[558]
Poliovirus type 1
500
125
6,2 log10
[556]
Poliovirus type 1
250
-
3,7 log10
[558]
Poliovirus type 1
-
28
> 6,0 log10
[585]
500
125
> 4,3 log10
[556]
500
125
> 4,9 log10
[556]
-
115
3,0 log10
[585]
-
3
2,7 log10
[586]
VIRUS
Caliciviridae
MNV-1
Picornaviridae
Leviviridae
MS2
Reoviridae
Rotavirus
Adenoviridae
Adénovirus D
Podoviridae
T7
Tableau 1.20 Exemples d’inactivation obtenue avec les lumières pulsées contre des virus nus immobilisés sur
des surfaces inertes.
SURFACE
FLUENCE TOT.
(mJ cm-²)
FLUENCE UV
(mJ cm-2)
INACTIVATION
REFERENCE
MNV-1
PVC propre
60
-
> 3.6 log10
[503]
MNV-1
PVC souillé
60
-
2.3 log10
[503]
60
-
> 7.0 log10
[503]
60
-
3.6 log10
[503]
PVC propre
91
-
> 4.5 log10
[503]
PVC souillé
91
-
> 4.5 log10
[503]
91
-
> 4.5 log10
[503]
91
-
> 4.5 log10
[503]
VIRUS
Caliciviridae
Acier inoxydable
propre
Acier inoxydable
souillé
MNV-1
MNV-1
Picornaviridae
Virus de
l’hépatite
Virus de
l’hépatite
Virus de
l’hépatite
Virus de
l’hépatite
64
A
A
A
A
Acier inoxydable
propre
Acier inoxydable
souillé
La principale limitation des lumières pulsées réside dans leur faible pouvoir pénétrant,
imposant des restrictions quant à la nature des objets traités. Par exemple, si elles
doivent être appliquées sur un produit emballé, l’emballage devra être transparent aux
UV [555]. De plus, elles peuvent induire un échauffement du produit si le traitement
dure longtemps. Par exemple, la farine de maïs atteint 120 °C après un traitement de
100 secondes à 8 cm d’une lampe alimentée par un courant de 3800 V [587].
1.8.4. Inactivation microbienne
Les lumières pulsées sont considérées comme une technologie efficace pour l’inactivation
de bactéries, levures et moisissures [561, 582]. Par exemple, des réductions chez
Pseudomonas aeruginosa [588], Saccharomyces cerevisiae [589] et Aspergillus niger
[578] de 6.8, 6.0 et 4.8 log10 ont été observées après des traitements de 3.0, 0.7 et
1.0 J cm-2, respectivement.
Toutefois, l’activité antivirale des lumières pulsées a très peu été étudiée. Les résultats
actuellement disponibles sont assez difficiles à comparer en raison des disparités au
niveau des équipements, des modes opératoires et des données rapportées. Par
exemple, Huffman et coll. [556] ont utilisé un système PureBright® dynamique alors
que les autres [503, 558, 585] ont utilisé des systèmes statiques. Certains ont mesuré
la quantité d’UV seulement alors que d’autres ont mesuré la fluence totale. En dépit de
ces variations, les premiers résultats suggèrent que les lumières pulsées sont une
technologie efficace contre les virus nus, réduisant la charge virale de plusieurs log10 en
une courte durée et donc sans dépasser les limites autorisées par la FDA (tableau 1.19).
Jean et coll. [503] ont observé une inhibition du MNV-1 supérieure à 5,5 log10 après 2
secondes de traitement. En outre, notre équipe a démontré l’efficacité des lumières
pulsées pour l’inactivation du MNV-1 et du virus de l’hépatite A immobilisés sur du PVC
(chlorure de polyvinyle) et de l’acier inoxydable. Des réductions supérieures à 3 log10
ont été observées (tableau 1.20). Dans l’optique de simuler des surfaces sales, les
expériences ont été dupliquées en présence de protéines. Des réductions moindres ont
été obtenues, comprises entre 2,3 et 4,5 log10. Notons qu’aucune étude d’inactivation
virale n’a jusqu’à présent été menée sur des aliments.
1.8.5. Facteurs modulant l’activité
Tous les paramètres qui influencent la quantité de radiations atteignant les
microorganismes moduleront nécessairement l’efficacité des lumières pulsées. Ces
paramètres peuvent être reliés au système de traitement ou au produit traité.
65
Absorbance relative à 254 nm
1.6
1.4
1.2
16
ADN
Adénine
Guanine
Thymine
Cytosine
14
12
10
1.0
8
0.8
0.6
0.4
6
4
0
200 210 220 230 240 250 260 280 280 290 300
Longueur d’onde (nm)
-1
0.0
cm )
2
-1
0.2
Coefficient d’absorption molaire (mol L
1.8
Figure 1.17 Spectres d’absorbance des bases puriques (adénine et guanine) et pyrimidiques (thymine et
cytosine) en solution aqueuse à pH neutre [554].
66
En effet, l’efficacité du traitement dépend de l’énergie reçue par l’échantillon [558, 578,
590], elle-même dépendante du temps de traitement [578, 589, 591, 592] et
inversement proportionnelle à la distance entre l’échantillon et la lampe [503, 582, 587,
593, 594]. La position de l’échantillon par rapport à la lampe doit également être
considérée si le système utilisé n’assure pas une homogénéité de la fluence en tout point
de la chambre de traitement [582, 594]. En outre, l’épaisseur et la composition des
éléments traités aux lumières pulsées entre en jeu. Ils doivent être un maximum
transparents aux longueurs émises et par conséquent contenir peu de particules
absorbant les UV, tels que les ions ferriques et ferreux, hypochlorite, permanganate,
sulfite ou l’ozone [595]. Dans le cas d’aliments emballés, l’emballage doit répondre à
ces critères [584]. Par ailleurs, les caractéristiques de la surface du produit sont
également importantes. Elle doit être peu réfléchissante [584] et présenter peu
d’aspérités qui pourraient offrir une protection aux microorganismes par un effet
d’ombrage [566, 593, 596].
Enfin, l’efficacité de ce traitement dépend également de la sensibilité du microorganisme
ciblé. Par exemple, les microorganismes dont les acides nucléiques se présentent sous
la forme d’un double brin semblent plus résistants [558] car lorsqu’un des brins est
endommagé, l’autre s’il est encore intact, peut servir de matrice pour la réparation ou
la réplication [597].
1.8.6. Mécanismes d’action
Si l’activité antivirale des lumières pulsées a quelque peu été examinée, le mécanisme
d’action mis en jeu n’a lui jamais été étudié.
Néanmoins, il est légitime de penser que les UV contenus dans les lumières pulsées
auront au moins le même effet que ceux émis par des lampes UV basse ou moyenne
pression. Cet effet est dit photochimique et résulte de l’absorption d’UV par les acides
nucléiques (figure 1.17) [598, 599].
L’absorption de photons UV par des nucléotides se traduit par la formation de
photoproduits (figure 1.18) et/ou de cassures des brins. La plupart des photoproduits
impliquant des bases pyrimidiques sont des dimères cyclobutaniques (CPD pour
Cyclobutane Pyrimidine Dimer). Ces derniers peuvent être créés par les UV-C [600], les
UV-B [601] ou les UV-A [602]. Dans une moindre mesure, des photoproduits 6-4 et leurs
isomères de valence Dewar peuvent être formés. Des photoproduits monomériques
peuvent également être formés à partir de cytosine ou de thymine. Plus rarement, les
67
A B C D E Figure 1.18 Principaux photoproduits induits par les UV sur les bases azotées. (A) Exemples de dimères
cyclobutaniques à partir d’uracile. Les dimères pyrimidiques se forment entre deux bases pyrimidiques
adjacentes (uracile, thymine ou cytosine). Ce sont les photoproduits les plus toxiques et mutagènes chez les
bactéries. (B) Exemple de photoproduits 6-4 et d’isomères de valence Dewar à partir d’uracile. Ces
photoproduits se forment aussi entre deux bases pyrimidiques adjacentes et sont les deuxièmes plus
fréquents. (C) Exemple de photoproduit monomérique à partir de cytosine. (D) Exemple de photoproduit
monomérique à partir de thymine. (E) Principaux photoproduits formés à partir de bases puriques.
68
UV provoquent des altérations sur les bases puriques telles que des dimères d’adénine,
des photoproduits Porschke ou encore des photoadduits T-A [603]. Ces photoproduits
induisent une déformation (en forme de coude) de l’hélice formée par les acides
nucléiques [604]. Lorsqu’ils sont présents en grand nombre, ils provoquent une forte
mutagénèse puisqu’ils interfèrent avec l’appariement normal des bases. Il en résulte de
fréquentes mutations, mais aussi des déplacements de cadre de lecture, des sites
abasiques et des ruptures de brins [605]. Les microorganismes sont alors incapables de
se répliquer et donc inactivés [606].
De plus, des travaux menés dans les années 2000 sur des bactéries et des levures ont
permis d’esquisser un premier mécanisme d’action double. Avec une fluence
suffisamment élevée (au moins 0,5 J cm-2), Wekhof [607] a proposé un effet dit
photothermique, en sus de l’effet photochimique sur les acides nucléiques déjà évoqué,
pour expliquer les « explosions » des microorganismes observées en microscopie
électronique
par
plusieurs
auteurs
(figure
1.19)
[578,
608,
609].
Cet
effet
photothermique serait provoqué par une surchauffe des microorganismes, résultant d’un
refroidissement insuffisant comparé à la hausse de température due à l’absorption des
UV. Une différence de température est donc créée entre les microorganismes et le milieu
environnant à cause d’une différence d’absorption des radiations. Les microorganismes
deviennent un centre local de vaporisation et explosent. Ces observations sont en accord
avec des travaux plus récents [610, 611]. Notons que seule la région UV est incriminée
dans l’effet photothermique, car lorsque des filtres bloquant ces photons sont utilisés,
les microorganismes ne subissent pas ces dommages physiques [608, 612].
A
B
C
Figure 1.19 Photographies prises en microscopie électronique à transmission d’une suspension de Listeria
monocytogenes non traitée (A), traitée aux UV (B) et traitée aux lumières pulsées (C) [608].
Récemment, Kramer et coll. [613] a proposé un autre modèle dans lequel l’inactivation
microbienne ne serait en réalité due qu’aux dommages sur les acides nucléiques, les
dommages physiques n’étant observés que si la fluence est plus importante.
69
Chapitre 2. Contexte du projet
2.1.
Problématique et hypothèse de travail
Tel que décrit dans la revue de la littérature (chapitre 1), les norovirus sont l'une des
causes majeures de gastroentérites au niveau mondial. Ils constituent donc un véritable
problème de santé publique. Les stratégies de prévention et de contrôle actuellement en
place ne suffisent pas pour contenir la propagation de ces virus. Une des raisons réside
dans l’activité inhibitrice insuffisante du chlore sur les surfaces et les aliments [408, 497501] dont l’utilisation est recommandée en cas d’épidémie, notamment par le CDC
américain [493]. De plus, les eaux de consommation traitées par chloration contiennent
au final du chlore résiduel ainsi que des sous-produits toxiques générés au contact de
matières organiques [8, 502]. Les alcools et les ammoniums quaternaires présents dans
une large gamme de désinfectants domestiques sont par ailleurs peu voire pas efficaces
contre les norovirus [6]. Parallèlement, les traitements à la chaleur qui sont efficaces
contre les norovirus ne sont pas applicables à tous les produits, notamment ceux
consommés crus [7]. Des moyens de désinfection efficaces et sécuritaires sont requis
pour interrompre la transmission des norovirus et ainsi limiter leur prévalence.
Les acides peroxycarboxyliques et les lumières pulsées apparaissent comme deux
approches prometteuses pour l’inactivation des norovirus d’après les premiers résultats
disponibles dans la littérature. En plus de leurs propriétés antibactériennes et
antifongiques, ces deux approches ne requièrent pas – et n’engendrent pas – de produits
toxiques. En effet, les acides peroxycarboxyliques se décomposent en acides organiques,
peroxyde d’hydrogène, dioxygène, dioxyde de carbone et eau [516]. Les lumières
pulsées ne nécessitent pas l’ajout de substance chimique et sont générées par des
lampes contenant du xénon, un gaz inerte, contrairement aux lampes UV qui contiennent
du mercure [560]. Néanmoins, peu d’études visant à inhiber les norovirus se sont
penchées sur les acides peroxycarboxyliques, autres que l’acide peracétique, ou les
lumières pulsées. Par conséquent, l’influence des conditions physico-chimiques
expérimentales, telles que la présence de résidus organiques, sur l’activité antivirale
ainsi que les mécanismes d’action impliqués dans cette activité sont peu ou pas connus.
Ainsi, l’hypothèse de cette thèse est qu'une connaissance approfondie des
mécanismes d’action et des paramètres régissant l’activité antivirale des solutions
71
d’acides peroxycarboxyliques et des lumières pulsées permettrait de développer des
approches efficaces et écologiquement responsables pour l’inactivation des norovirus.
2.2.
Objectifs
Cette thèse a pour objectif général d’évaluer et de comprendre l’activité anti-norovirus
des acides peroxycarboxyliques et des lumières pulsées. Le présent travail a été
construit autour des quatre objectifs spécifiques suivants :
1.
évaluer l’activité antivirale de quatre acides peroxycarboxyliques contre le MNV-1
en suspension, immobilisés sur différentes surfaces inertes propres et sales ainsi
que dans un biofilm artificiel ;
2.
élucider les mécanismes impliqués dans l’inhibition du MNV-1 par l’acide
peracétique ;
3.
évaluer l’activité antivirale des lumières pulsées contre le MNV-1 en suspension
dans des échantillons hydriques, immobilisés sur différentes surfaces inertes
propres et sales ainsi que dans un biofilm artificiel ;
4.
élucider les mécanismes impliqués dans l’inhibition du MNV-1 par les lumières
pulsées.
72
Chapitre 3. Étude du potentiel virucide des
acides peroxycarboxyliques organiques contre
les norovirus sur des surfaces alimentaires
Study of the virucidal potential of organic peroxyacids against norovirus on food-contact
surface
Allison Vimont, Ismaïl Fliss, Julie Jean
STELA Dairy Research Centre, Nutrition and Functional Foods Institute, Université Laval,
G1V 0A6, Québec, QC, Canada
Publié en mars 2015 dans le journal Food and Environmental Virology, 7 (1) : 49-57.
IF2013 = 1,975
Q2 en sciences environnementales
Q2 en microbiologie
Q3 en virologie
73
3.1.
Résumé
Cette étude visait à évaluer l’efficacité de quatre acides peroxycarboxyliques différents,
à savoir les acides peracétique (PAA), perpropionique (PPA), perlactique (PLA) et
percitrique (PCA), pour l’inactivation de virus en suspension ou attachés sur de l’acier
inoxydable ou du chlorure de polyvinyle. Un modèle de norovirus humains a été utilisé,
le norovirus murin 1. Une suspension virale (107 unités formatrices de plages par
millilitre) a été traitée avec des solutions les acides peroxycarboxyliques (mélange à
l’équilibre
composé
d’acide
organique,
de
peroxyde
d’hydrogène,
d’acide
peroxycarboxylique et d’eau) dont les concentrations variaient entre 50 et 1000 mg L-1
avec des temps de contact compris entre 1 et 10 minutes. Le taux d’inactivation a été
mesuré par la technique des plages de lyse. Le PAA et le PPA se sont révélés les plus
efficaces, où un traitement de 5 minutes avec 50 mg L-1 a permis de réduire la population
virale d’au moins 3 log10, que le virus soit en suspension, attaché sur de l’acier
inoxydable ou du chlorure de polyvinyle en conditions propres et sales. Aucune activité
n’a été détectée pour les acides organiques et le peroxyde d’hydrogène. Une inactivation
d’au moins 3 log10 a également été observée sur les virus immobilisés dans le biofilm
artificiel (gel d’alginate). Ces petites molécules au fort pouvoir oxydant pourraient être
utilisées pour inactiver les norovirus de façon sécuritaire dans l’eau ou sur les surfaces
dures.
74
3.2.
Abstract
This study was conducted to evaluate the efficacy of four different peroxyacids, namely
peracetic (PAA), perpropionic (PPA), perlactic (PLA) and percitric (PCA) for inactivating
viruses in suspension or attached to stainless steel or polyvinyl chloride surfaces. The
test virus was a proxy for human norovirus, namely murine norovirus 1. Plaque-forming
units in suspension (107 per mL) were treated with 50 to 1000 mg L-1 peroxyacid
(equilibrium mixture of organic acid, hydrogen peroxide, peroxyacid and water) for 1 to
10 min. Inactivation was measured by plaque assay. PAA and PPA were the most
effective, with a 5 min treatment at 50 mg L-1 being sufficient to reduce viral titer by at
least 3.0 log10, whether the virus was in suspension or attached to stainless steel or
polyvinyl chloride disks under clean or fouled conditions. Combinations of organic acid
and hydrogen peroxide were found ineffective. Similar inactivation was observed in the
case of virus in artificial biofilm (alginate gel). These short super-oxidizers could be used
for safe inactivation of human noroviruses in water or on hard surfaces.
75
3.3.
Introduction
Human norovirus is a major foodborne and waterborne pathogen, responsible for at least
50 % of all gastroenteritis outbreaks worldwide [229, 614, 615]. Noroviruses are nonenveloped small viruses containing a single-stranded positive-sense RNA genome. The
genus Norovirus belongs to the family Caliciviridae [616]. Norovirus outbreaks occur
often in crowded locations such as hospitals, nursing homes, cruise ships and schools
[175]. Although norovirus infection is usually self-limiting and not medically serious, it
represents a public health concern because it spreads rapidly, involves people of all ages
and causes significant economic loss [482]. Low minimal infective dose, stability in the
environment, high load in feces and vomit, prolonged duration of shedding even after
symptoms are resolved, and poor long-term immunity all contribute to the high incidence
of infection by this virus [138, 180, 220, 267].
Norovirus infections are transmitted primarily in a fecal-oral mode and to a lesser extent
via vomit, and spread via contaminated food or water, direct person-to-person contact,
aerosols, food handlers and environmental surfaces [180]. Foods with a high risk of
norovirus contamination include fresh produce, shellfish and other products that undergo
minimal or no processing [361, 370, 617]. Despite current means of disinfection used
to hinder spread via food, water and fomites [618], the prevalence of norovirus infection
remains high. This points to problems with the disinfectants used and the way they are
used, as well as outbreak management and prevention. Moreover, the presence of
bacterial biofilm can make disinfection even more difficult to achieve, and therefore
should be considered when developing new antiviral preparations. Entrapment of
infectious norovirus in natural wastewater biofilms has been proven [4]. Biofilms not
only protect virions against environmental stress, but also may maintain continuous
release of virus into the environment as film is sloughed.
The well-established effectiveness of most sanitizers or disinfectants against bacteria
and fungi does not always extend to naked viruses. While more resistant than enveloped
viruses to many chemical agents, naked viruses are generally sensitive to oxidizers such
as chlorine [6, 138]. A major drawback of chlorine is its reaction with natural organic
matter to produce toxic by-products including trihalomethanes (e.g. chloroform), which
are considered to be potential carcinogens [8]. Chemicals such as peracetic acid (PAA)
[516], which do not release toxic compounds into the environment, are thus increasingly
used. PAA in solution establishes a quaternary equilibrium composed of organic acid,
hydrogen peroxide, peroxyacid and water:
76
RCOOH + H2O2 ↔ RCOOOH + H2O
PAA is the most studied of the peroxyacids. Its strong germicidal properties have been
demonstrated repeatedly over the decades [619, 620]. The US FDA has approved its
use at concentrations up to 200 mg L-1 for sanitizing food products such as fruits and
vegetables as well as food-contact surfaces, and up to 80 mg L-1 in wash water used in
food processing [518-520]. The inhibitory activity of PAA on enteric viruses has
previously been evaluated [497, 499, 500, 521-523, 525-527, 537]. It has also been
reported that high concentrations of PAA damage nucleic acid and proteins of F116
bacteriophage and respiratory adenovirus [547-549]. Except for percitric acid [539], no
other peroxyacid solution has been studied. The preparation, characterization and
evaluation of the antiviral activity of new peroxyacid compounds could therefore be of
interest to the food industry. Soluble organic acids differ in terms of the structure of the
functional group, which could add a biological effect to the chemical activity of the
corresponding peroxyacids as sanitizers or disinfectants.
The purpose of the work presented in this paper was to prepare, characterize and
perform a preliminary screening of four peroxyacid solutions as virucidal agents by
observing their effectiveness at inactivating murine norovirus strain 1 (MNV-1) in
suspension or attached to stainless steel or polyvinyl chloride surfaces. The influence of
bacterial biofilm on the virucidal effect of peroxyacid solutions was also evaluated. To
achieve this work, MNV-1, which is the most employed surrogate for the study of human
norovirus [123-125] was used.
3.4.
Materials and methods
3.4.1. Preparation of MNV-1 lysate
MNV-1 was propagated in RAW 264.7 cells as described previously [122]. The virus and
the cell line were obtained from Health Canada, Bureau of Microbial Hazards (Tunney’s
Pasture, Ontario, Canada K1A 0K9). Once purged of cellular debris by centrifuging, virus
lysate was divided into aliquots and stored at -80 °C. The viral titer was estimated at
1.2x107 pfu mL-1, based on plaque assay.
3.4.2. Viral quantification by plaque assay
The MNV-1 infectious titer in stock aliquots and treated samples was determined by
plaque assay and expressed in pfu mL-1 as described previously [621] with some
77
modifications. Briefly, RAW 264.7 cells seeded at a density of 8x105 per well (in 12-well
culture plates, Corning Life Sciences) were incubated for 24 h at 37 °C in a humidified
5 % CO2 atmosphere without shaking, then infected with 300 µL of MNV-1 suspension
diluted in 10-fold series, followed by 90 minutes of incubation then overlaid with 3 mL
of complete DMEM containing 1 % agarose and incubated for 60 hours. The cell layers
were then fixed in 3.7 % formaldehyde and stained with 0.1 % (wt/vol) crystal violet.
Results were expressed as log reduction, calculated by subtracting log10 viral titer before
treatment (control) from log10 viral titer after treatment [622]. The criterion used for
activity described as virucidal in this study was a three-log reduction (99.9 %
inactivation).
3.4.3. Preparation of peroxyacid solutions
Peroxyacid solutions were prepared from solutions of food-grade acetic (Sigma-Aldrich,
reference 27225, Ontario, Canada), propionic (Laboratoire MAT, reference PF-0221,
Québec, Canada), lactic (Laboratoire MAT, reference LU-0200, Québec, Canada) and
citric acids (Laboratoire MAT, reference CU-0153, Québec, Canada), using optimal
conditions of synthesis determined previously for PAA [623]. Briefly, the reaction was
carried out at 30 °C for 48 hours by mixing 1.5 volumes of acid solution and 1 volume
of 30 % hydrogen peroxide with 1 % (by weight) sulfuric acid as catalyst. Equilibrium
solutions were stored at -20 °C. Peroxides were titrated using a colorimetric reaction
described previously [509]. Each colorimetric assay was performed twice. Dilutions in
sterile hard water (deionized water plus 400 mg L-1 CaCO3) were prepared immediately
after titration, stored on ice and used within 1 hour (without pH adjustment) in viral
inactivation experiments.
3.4.4. Liquid-phase inactivation of MNV-1 by peroxyacid
3.4.4.1.
Biocide concentration
Peroxyacids were tested at 50, 250, 500 and 1000 mg L-1. The pH and redox potential
of the solutions are shown in Table 3.1. Experiments were conducted according to ASTM
standard test method E 1052-96 [624]. Briefly, 50 µL of MNV-1 lysate was added to
450 µL of each biocide solution at 22 °C ± 2 °C. Sterile hard water was used as a
negative control. Reactions were neutralized by ten-fold dilution in complete DMEM (at
pH 7) containing L-cysteine hydrochloride (for cell culture, Sigma-Aldrich, reference
C7477, Ontario, Canada) after 1, 5 or 10 minutes and residual infectious virus was
78
quantified immediately. The concentrations used for each condition (Table 3.2) were
determined by the sulforhodamine B recovery assay [625]. Each test was carried out in
three replicates with a minimum of two independent experiments.
3.4.4.2.
Virucidal activity of organic acids and hydrogen peroxide
The virucidal activity of organic acids (20, 50 and 100 g L-1) and hydrogen peroxide (20
and 1500 mg L-1) were tested separately in order to assess their involvement in viral
inactivation. Inactivation experiments were also conducted according to ASTM standard
test method E 1052-96 [624] as described previously.
3.4.5. Inactivation of MNV-1 attached to stainless steel or polyvinyl chloride
3.4.5.1.
Preparation of viral inoculum
Virus inactivation experiments were conducted under clean and fouled conditions
according to ASTM standard test method E 2197-02 [626]:
a) Clean conditions corresponded to undiluted MNV-1 lysate;
b) Fouled conditions corresponded to mixing MNV-1 lysate with sterile 0.4 % porcine
mucin type II (Sigma, reference M2378, Missouri, USA), sterile 5 % tryptone (Oxoid,
reference LP0042, Hants, United Kingdom) and sterile 5 % bovine serum albumin
fraction V (Laboratoire MAT, reference ALB001, Québec, Canada) in proportions of
68 %, 20 %, 7 % and 5 % respectively. Porcine mucin, tryptone and bovine serum
albumin were diluted in phosphate buffer (pH 7.2).
3.4.5.2.
Attachment surfaces
Disks (1 cm in diameter) cut from stainless steel (Den-Mar Acier Inoxydable Inc.,
Quebec, Canada) and polyvinyl chloride (type 1, grade 1, Plastique Polyfab, Quebec,
Canada) were cleaned with 0.1 % sodium dodecyl sulfate solution and rinsed with
distilled water several times to eliminate residual detergent while avoiding contact with
fingers. The disks were then sterilized by autoclaving for 15 minutes at 121 °C.
3.4.5.3.
Experimental procedure
Inactivation of MNV-1 on surfaces by PAA and PPA at a concentration of 50 mg L-1 was
tested according to ASTM standard test method E 1053-97 [627] with some
modifications. Briefly, 20 µL of suspension containing 5x105 pfu mL-1 were placed on
79
Table 3.1 pH and redox potential (E, mV) of peroxyacid solutions (Cmin = 50 mg L-1; Cmax = 1000 mg L-1) and
hydrogen peroxide (Cmin = 20 mg L-1; Cmax = 1500 mg L-1).
pH
E (mV)
Solution
Cmin
Cmax
Cmin
Cmax
PAA
3.8
2.8
510
665
PPA
3.9
2.8
590
670
PLA
3.0
1.9
570
620
PCA
3.5
2.4
545
605
Hydrogen peroxide
6.1
5.3
375
393
Table 3.2 Concentrations (g L-1) of L-cysteine hydrochloride diluted in complete DMEM and at a final pH of 7
used to neutralize the PAA, PPA, PLA and PCA solutions at the four peroxyacid concentrations tested (50, 250,
500 and 1000 mg L-1).
Peroxyacid concentration (mg L-1)
80
Solution
50
250
500
1000
PAA
0.5
1.0
5.0
5.0
PPA
1.0
1.0
5.0
5.0
PLA
1.0
5.0
5.0
10.0
PCA
0.5
1.0
1.0
1.0
each disk and allowed to dry for 60 ± 5 minutes at 22 °C ± 2 °C in a laminar flow hood.
The disk was then placed in a vial and 180 µL of test solution were placed on the dried
spot. The same volume of sterile hard water was used as a control. After 5 min of contact,
the solution was neutralized with EBSS solution supplemented with 1 g L-1 of L-cysteine
hydrochloride (pH 7.5) and the disk was mixed using a vortex device for one minute to
elute the residual virus for infectivity assay. Each test was carried out in three replicates
with a minimum of two independent experiments.
3.4.6. Inactivation of MNV-1 entrapped in alginate
3.4.6.1.
Preparation of the alginate film
Biofilm formation and dissolution protocols were based on previous work [628]. MNV-1
lysate was mixed with a sterile low-viscosity aqueous solution of alginate (Sigma,
reference A2158, Oakville, Canada) such that the final alginate concentration was 2 %
(by weight) and the MNV-1 titer was 107 pfu g-1. The mixture (600 µL) was placed in a
well of a 6-well tissue culture plate (Greiner Bio-One, reference 657640, USA). The insert
was then placed, taking care not to trap bubbles on the liquid surface. Each insert was
filled with 2 mL of sterile 50 mmol L-1 calcium chloride solution (Sigma, reference C5080,
Oakville, Canada) and left in a laminar flow hood at 22 °C ± 2 °C for 2 hours. After
polymerization, the biofilm was washed by immersion for 1 hour in sterile 5 mmol L-1
calcium chloride solution then cut with a sterile scalpel to obtain circles 2.4 cm in
diameter (0.97 mm in thickness), which were weighed.
3.4.6.2.
Artificial biofilm experimental procedure
Inactivation of MNV-1 in alginate film by PAA and PPA at a concentration of 50 mg L-1
was tested at 22 °C ± 2 °C. The quantity of biocide solution added was nine times the
mass of the film. Control tests were performed using sterile hard water. After 5 min of
contact, the solution was neutralized by ten-fold dilution in the stop solution (L-cysteine
hydrochloride). The alginate film was removed and immersed in 500 µL of sterile
100 mmol L-1 sodium citrate solution (AnalaR grade, reference B10242, BDH Inc.,
Toronto, Canada) at pH 7 and mixed every 5 minutes using a vortex device for a total
of 15 minutes. The remaining biocide + stop solution and the dissolved biofilm were
diluted for separate determinations of residual viral infectivity. Each test was carried out
with three replicates per condition including control, with a minimum of two independent
experiments.
81
b)
5
4
c
a# a#
ab
c
bc
a# a#
a# a# a#
MNV-1 reduction
(log10 PFU mL-1)
MNV-1 reduction
(log10 PFU mL-1)
a)
3
2
d
1
50
3
a
2
1
d
1000
d)
a a#
ab a
4
#
a a
b
3
c
c
2
e
de
d
50
250
500
Concentration (mg L-1)
0
MNV-1 reduction
(log10 PFU mL-1)
MNV-1 reduction
(log10 PFU mL-1)
250
500
5
1
4
bc
bc
b
d cd
d cd
50
250
500
d
bc
d
0
0
c)
5
5
abc ab
4
a# a#
c
bc
a# a#
1000
#
#
ab a a
3
2
d
1
0
1000
50
250
500
1000
Figure 3.1 Inactivation of MNV-1 after 1 (
), 5 (
) and 10 (
) minutes in suspension containing a) PAA; b) PCA; c) PLA; d) PPA at 50, 250, 500 and 1000
mg L-1 at room temperature. Results represent mean log10 reduction based on plaque assay. “#” means that the reduction was complete (> 4.10 log10). Treatments
with the same letter did not differ significantly. The error bars represent standard errors.
82
3.4.7. Statistical analysis
Analysis of variance (ANOVA) was used to test for differences in mean reductions among
treatments and treatment means were analyzed using a completely randomized design
at P value ≤ 0.05 in JMP® 9.0.2, a business unit of SAS (2010). If statistically significant
differences were found using the ANOVA, the Fisher protected LSD test was used to
analyze differences between the treatment means.
3.5.
Results
3.5.1. Characteristics of peroxyacid solutions
Based on the concentrations measured by the colorimetric assay, the solutions contained
more peroxyacid than hydrogen peroxide, except for PLA. Hydrogen peroxide
concentrations in solutions of PAA, PPA, PLA and PCA (1000 mg L-1) were respectively
387, 456, 1479 and 267 mg L-1 (data not shown). The pH of the peroxyacid solutions
ranged from 1.9 to 3.9, while the pH of hydrogen peroxide solutions ranged from 5.3 to
6.1 (Table 3.1). In addition, the redox potential of any peroxyacid solution was higher
than that of hydrogen peroxide. The lowest redox potential among the peroxyacid
solutions was observed for 50 mg L-1 PAA (510 mV), while the highest was observed for
1000 mg L-1 PPA (670 mV). Hydrogen peroxide showed a maximal redox potential of
393 mV at 1500 mg L-1.
3.5.2. Aqueous phase activity of the four peroxyacid solutions against MNV-1
The inactivation of MNV-1 in aqueous suspension following 1, 5 and 10 minutes of
contact with PAA, PPA, PLA and PCA at 50, 250, 500 and 1000 mg L-1 was evaluated by
plaque assay. As expected, inactivation increased significantly with increasing
concentration and contact time. One minute of contact with PAA or PPA at a
concentration of 250 mg L-1 was sufficient to reduce MNV-1 titer by 3–4 log10. PLA and
PCA at a concentration of 1000 mg L-1 produced smaller reductions of respectively 2.7
and 0.1 log10. Five or 10 minutes of contact with 50 mg L-1 PAA or PPA or 250 mg L-1
were sufficient to reduce MNV-1 titer by at least 99.9 %. Furthermore, five minutes of
contact with 250 mg L-1 PAA or PPA or 10 minutes of contact with 500 mg L-1 PLA reduced
MNV-1 titer by at least 4.1 log10 (complete inactivation). PCA solution at a concentration
of 1000 mg L-1 produced a reduction of 1.97 log10 after 10 min of treatment (Figure 3.1).
83
Table 3.3 Inactivation of MNV-1 on stainless steel, polyvinyl chloride and in alginate after 5 minutes of contact
with PAA or PPA at a concentration of 50 mg L-1. Viral titers of controls were (i) 4.18 ± 0.13 log10 pfu per disk
under clean conditions and 4.83 ± 0.34 log10 pfu per disk under fouled conditions for stainless steel, (ii) 5.06
± 0.04 log10 pfu per disk under clean conditions and 4.69 ± 0.32 log10 pfu per disk under fouled conditions for
polyvinyl chloride, and (iii) 5.96 ± 0.22 log10 pfu g-1 in alginate film. Disks were 1 cm in diameter and alginate
film samples were 2.4 cm in diameter.
Reduction in MNV-1 titer (log10)
Stainless steel
Biocide
PAA solution
PPA solution
84
Clean
conditions
≥ 3.92 ±
0.10
≥ 3.92 ±
0.10
Fouled
conditions
≥ 4.21 ±
0.02
≥ 4.21 ±
0.02
Polyvinyl chloride
Clean
conditions
≥ 4.00 ±
0.08
≥ 4.00 ±
0.08
Fouled
conditions
≥ 4.04 ±
0.05
≥ 4.07 ±
0.04
Alginate
≥ 4.03 ±
0.27
≥ 3.95 ±
0.27
3.5.3. Involvement of organic acids and hydrogen peroxide in activity against
MNV-1 in suspension
Contact with acetic, propionic, lactic and citric acids at concentrations of 20, 50 and
100 g L-1 (higher than those of the peroxyacid solutions) for up to 10 minutes did not
reduce the MNV-1 infectious titer by more than 0.5 log10 pfu mL-1 (data not shown).
Hydrogen peroxide at a concentration of 1500 mg L-1 did no better, with a reduction
smaller than 0.5 log10 pfu mL-1 after 10 minutes of contact (data not shown).
3.5.4. Activity of peroxyacid solutions on stainless steel and polyvinyl chloride
immobilized MNV-1
Recoveries of infectious MNV-1 particles from stainless steel and polyvinyl chloride
surfaces (1.04 cm²) were respectively 94.0 ± 1.8 % and 97.5 ± 3.0 % under clean
conditions, and respectively of 99.9 ± 0.1 % and 98.3 ± 0.4 % under fouled conditions.
The disks thus retained at least 5 log10 pfu cm-2. Total inactivation of MNV-1 on stainless
steel or polyvinyl chloride under clean or fouled conditions was observed after 5 minutes
of contact with PAA or PPA solutions at a concentration of 50 mg L-1. This corresponds
to a reduction of around 104 pfu per disk (Table 3.3). Meanwhile, the recovery of MNV1 from the alginate films made for this study (4.52 cm², 0.34 ± 0.01 g) was 95.2 ±
2.9 %. These films thus retained at least 106 pfu cm-2. The entrapped MNV-1 was
inactivated completely after five minutes of contact with PAA or PPA at a concentration
of 50 mg L-1 (Table 3.3).
3.6.
Discussion
The very frequent involvement of norovirus in foodborne illnesses is well documented in
different parts of the world such as the USA [614] and Europe [615]. Norovirus infections
spread rapidly, particularly in closed community situations such as nursing homes,
hospitals, hostels, schools and even cruise ships, and where food and water sources are
shared. Noroviruses are indeed transmitted through the fecal-oral route, by consumption
of contaminated food or water, by direct person-to-person contact, by airborne
transmission (aerosols), by fomites and by food handlers [629]. This highlights the need
for better hygienic practices and more effective disinfectants. The aim of this study was
to evaluate the destructiveness of peroxyacids to noroviruses, represented by MNV-1.
The use of these solutions is little known despite their interesting properties.
85
In the first step, we measured the inactivation of MNV-1 in suspension by PAA, PPA, PLA
and PCA using the cell culture technique. All of these compounds except for PCA were
virucidal at a concentration of 250 mg L-1 and 5 minutes of contact. PAA and PPA at
50 mg L-1 (the FDA allows up to 80 mg L-1) are the most interesting for direct application
on foods since the hydrogen peroxide concentration in these solutions (50 mg L-1) is also
below the concentration allowed [518, 519] in wash water for vegetables (59 mg L-1),
meat (75 mg L-1) and poultry (220 mg L-1). PLA solution could nevertheless be used at
a concentration of 250 mg L-1 for surface disinfection followed by rinsing. There are a
few studies of the inactivation of enteric viruses in suspension by commercial PAA [521523, 525, 539] and by PCA [539]. Our observation is consistent with previous reports
for feline calicivirus and MS2 [521-523], which were inactivated easily by PAA in solution.
The activity of PAA solution against poliovirus is uncertain. Some studies suggest that
this virus is more resistant than MNV-1 to PAA, where contact with 2000 mg L-1 for 1
minute produced reductions of 2 log10 [525] or 0.9 log10 [539], contrary to others where
a 4 log10 inactivation was observed after a contact with 750 mg L-1 for 15 min [524] and
with 20 mg L-1 for 30 min [630]. This virus is reportedly more sensitive to PCA solution
than to PAA solution [539]. These different sensitivities of MNV-1 and poliovirus were
not observed in the case of hypochlorous acid, another oxidizing compound [631].
The peroxyacids tested in this study represent a range of structural complexity: PAA <
PPA < PLA < PCA, PAA being the simplest structure and PCA the most complex.
Inactivation of MNV-1 follows the same order, being greater with PAA and the least with
PCA at a given concentration and contact time. Structural complexity thus seems to
reduce the ability of peroxyacids to inactivate MNV-1. This may be explained by the fact
that the alkyl groups of the carbon-centered radical act as stabilizers by increasing the
number of electrons releasable [632].
In the second step of this study, we evaluated the impact of organic acids and hydrogen
peroxide individually on MNV-1 infectivity, since they are both present in peroxyacid
solutions. No significant inactivation was observed even after 10 minutes of contact with
these compounds in solution. These results are not surprising for two reasons: first of
all, the ability to survive exposure to gastric acidity would be a useful evolutionary
development for a foodborne virus [633] and second, previous studies have already
demonstrated that hydrogen peroxide is an effective virucide only at concentrations
higher than 10 g L-1 and therefore is less potent than PAA [497, 536, 538]. It is worth
noting that despite their weak activity, both the acid and hydrogen peroxide are likely
essential for the activity of the peroxyacid. Since the peroxyacid solution is in
86
equilibrium, hydrogen peroxide and residual organic acid can react to form the
peroxyacid as it is consumed [634-636]. The greater effectiveness of a peroxyacid
solution can also be attributed to the generation of organic peroxyl radicals, which have
much longer half-lives than hydroxyl radicals [637] and should be able to diffuse over
longer distances to reaction sites [638].
We next investigated the virucidal activity of PAA and PPA (the best of the four
peroxyacids evaluated in this study) at a concentration of 50 mg L-1 against MNV-1
attached to inert hard surfaces under clean and fouled conditions. Stainless steel and
polyvinyl chloride are widely used in the food industry. In the literature, various mixtures
such as 40 % fetal bovine serum, 25 % fecal suspension [521] or 0.3 % bovine serum
albumin plus 0.3 % washed sheep erythrocytes [526] have been used to simulate
organic fouling of such surfaces. We used the mixture recommended in ASTM E standard
method 2197-02, which is much less subject to variability than are animal sera. Our
results showed that both solutions were virucidal on clean or fouled surfaces. Magulski
et coll. [526] also observed at least 3 log10 reductions of MNV-1 on stainless steel after
5 minutes of contact with PAA at a concentration of 1000 mg L-1. Baert et coll. [500]
also found that the presence of organic matter did not affect the antiviral activity of PAA.
This result opens a wide range of possible applications. It is worth noting that PPA has
the advantage of being more stable than PAA, which can be explosive under certain
conditions [635].
Finally, we investigated the potential protective role of biofilm, since viruses are able to
lodge within these structures [4]. To our knowledge, the effect of biocides on viruses
inside an artificial biofilm has not been published. We used 2 % alginate (an anionic
polysaccharide) matrix to simulate bacterial biofilm [639-641]. Unlike Coquet et coll.
[640], we simply used the alginate matrix without bacterial growth and thereby avoided
interference with MNV-1 quantification by the cell culture method. By preparing a thinner
biofilm (1 mm or less) than those generally used (3 mm) [639, 640] we examined biofilm
conditions closer to those found in the food industry, where thicknesses are usually less
than 50 µm [642]. Our use of 90 % matrix and 10 % MNV-1 lysate reproduced conditions
described previously (85 % matrix, 15 % microorganisms) for imitating natural biofilms
[642]. We thus demonstrated that PAA and PPA diffused unhindered into the alginate
matrix and inactivated the virus lodged within the film.
Other biocides tested for the control of norovirus include hypochlorous acid, chlorine
dioxide, ozone, ethanol, and quaternary ammonium. In general, inactivation of
noroviruses by oxidizing compounds is not uncertain, unlike ethanol [643, 644] and
87
quaternary ammonium [645, 646]. Hypochlorous acid is the most commonly used, due
to its convenience, low cost and high efficacy against bacteria, although it reacts with
natural organic matter to produce a variety of toxic disinfection by-products including
trihalomethanes, which are suspected potential carcinogens [8, 502]. Like chlorine
dioxide, hypochlorous acid is effective at lower concentrations than peroxyacid at
reducing viral population in suspension by at least 3 log10. Treatments with as little as a
few mg L-1 for a few seconds are virucidal [631, 647]. In contrast, their effectiveness
decreases substantially when the viruses are attached to hard surfaces [498, 527],
conditions under which their effectiveness is comparable to that of PAA or PPA solution.
Their effectiveness also decreases much more under fouled conditions [648]. Virucidal
concentrations are therefore above those permitted by the U.S. FDA [649, 650], unlike
for peroxyacid solutions, which are effective even on fouled hard surfaces at
concentrations lower than the maximum allowed [518].
In conclusion, PAA and PPA solutions offer undeniable advantages compared to more
common biocides when the target is norovirus but also other microorganisms present on
food-contact surfaces. They are more effective in the presence of organic matter, have
less environmental impact and appear overall to be safer to use. They are synthesized
from food-grade organic acids and do not generate any toxic by-products. Like PAA, the
three other peroxyacids appear to be bactericidal and fungicidal and to destroy spores
[531]. These nonspecific oxidizers would leave few possibilities for the development of
resistance in microorganisms. Our results obtained for the other two peroxyacids, PLA
and PCA, suggest that structural complexity might hinder the effectiveness of peroxyacid
solutions at inactivating MNV-1. These results suggest that an appropriate application of
PAA or PPA solutions could lead to better control of the spread of human norovirus
infections via contaminated liquids or surfaces, even when biofilm is involved.
3.7.
Acknowledgments
This work was supported by a grant from the Natural Sciences and Engineering Research
Council of Canada. We thank Kirsten Mattison from Health Canada for providing the virus
and RAW 264.7 cell line.
3.8.
Ethical standards
The manuscript does not contain clinical studies or patient data.
88
3.9.
Conflict of interest
The authors declare that they have no conflict of interest.
89
Chapitre 4. Mécanisme d’inactivation du
norovirus murin 1 par l’acide peracétique
Mechanism of inactivation of murine norovirus strain 1 by aqueous peracetic acid
Soumis en novembre 2014 dans le journal Journal of Applied Microbiology
IF2013 = 2,386
Q2 en biotechnologie et microbiologie appliquée
91
4.1.
Résumé
But : L’objectif de cette étude était d’élucider le mécanisme impliqué dans l’inactivation
du norovirus murin (MNV-1) par l’acide peracétique.
Méthodes et résultats : Des méthodes de culture cellulaire, de microscopie électronique
à transmission, d’électrophorèses sur gels de polyacrylamide (SDS-PAGE) et d’agarose
ont été utilisées pour évaluer le pouvoir infectieux, la morphologie ainsi que l’intégrité
des protéines et de l’ARN du MNV-1 exposé à l’acide peracétique pendant 5 minutes à
une concentration de 50 mg L-1 ou pendant 10 minutes à une concentration de
1000 mg L-1. Le traitement le moins intense a conduit à un mélange de virus infectieux
et non infectieux présentant un ARN fragmenté, mais peu ou pas de modification au
niveau des protéines et de la morphologie des virions. Le traitement le plus intense a
causé une inactivation totale, des dommages plus importants sur l’ARN ainsi qu’une
fragmentation des protéines virales et diverses altérations de la morphologie des virions.
Conclusion : Ces résultats suggèrent que l’inactivation du MNV-1 par l’acide peracétique
est principalement due à des dommages sur l’ARN, probablement par l’intermédiaire de
radicaux libres. Des concentrations plus élevées conduisent à des dommages
supplémentaires au niveau des protéines.
Importance et impact de l'étude : Les informations concernant le mécanisme d’action
fournies par cette étude seront utiles pour le développement d'une méthode de détection
moléculaire visant à discriminer les virus infectieux des non infectieux.
92
4.2.
Abstract
Aims: The aim of this study was to shed light on the mechanisms involved in the
inactivation of murine norovirus (MNV-1) by peracetic acid solution.
Methods and results: Cell culture, transmission electron microscopy, SDS-PAGE assay
and RNA electrophoresis were used to evaluate the infectivity, morphology, protein
integrity and genome integrity of MNV-1 exposed to peracetic acid at a concentration of
50 mg L-1 for 5 minutes or 1000 mg L-1 for 10 minutes. The less intense treatment
produced a mixture of infectious and non-infectious virus particles with fragmentation of
viral RNA, but little or no modification of viral morphology or proteins. The more intense
treatment caused complete inactivation and more damage to RNA, fragmentation of viral
protein and various alterations of particle morphology.
Conclusion: These results suggest that MNV-1 inactivation by peracetic acid solution is
due primarily to damage to RNA at low concentrations and to this plus additional damage
to proteins at high concentrations, probably initiated by free radicals.
Significance and impact of study: The mechanistic information provided by this study
will be helpful for the development of a molecular detection method aiming to
discriminate infectious from non-infectious virus.
93
4.3.
Introduction
Human noroviruses are a major cause of gastroenteritis worldwide [229, 614, 615]. They
are non-enveloped, single-stranded positive-sense RNA viruses belonging to the genus
Norovirus of the family Caliciviridae [15]. Norovirus infection is transmitted primarily
through the faecal-oral route and spread either by direct contact with fecal matter or via
indirect contact through contaminated minimally processed or not processed foods, or
via water or environmental surfaces. Outbreaks often occur in crowded locations, such
as hospitals, nursing homes, cruise ships, schools and so on. Their high environmental
stability, low minimal infectious dose (less than 3000 viral particles), high titre in faeces
and vomit (up to 100 million infectious particles per gram), the prolonged duration of
viral shedding even after symptoms are resolved, poor long-term acquired immunity,
and resistance to traditional sanitizers all contribute to their high prevalence and rapid
dissemination [5, 222]. Although norovirus illness is generally mild and self-limiting, it
generates significant economic losses for the food industry and is a burden for the
health-care system. A recent review by Barclay et coll. [5] emphasizes that as long as
an effective vaccine or curative treatment remains unavailable, control of the spread of
norovirus should be based on strict application of hygiene programmes, including
disinfection.
Chlorine has long been used as a microbicide and continues to be used despite
disadvantages
associate
with
the
formation
of
toxic
by-products
such
as
trihalomethanes, a potentially carcinogenic compound [6-8, 138]. Other antimicrobial
agents such as peracetic acid, which do not release toxic compounds into the
environment, are accordingly attracting growing attention. Peracetic acid is the product
of a reversible reaction and exists in aqueous solution in quaternary equilibrium between
acetic acid, hydrogen peroxide, peracetic acid and water (equation 4.1). It decomposes
spontaneously into acetic acid, hydrogen peroxide and water [516]. The US FDA has
approved its use at concentrations up to 200 mg L-1 for sanitizing certain food products,
especially fruits, vegetables, and food-contact surfaces, and up to 80 mg L-1 in washing
water [518-520].
CH3COOH + H2O2 ↔ CH3COOOH + H2O
(Equation 4.1)
Peracetic acid has been shown to be safe and effective against a broad range of
microorganisms [619, 620] including enteric viruses such as murine norovirus 1
(MNV-1), feline calicivirus, hepatitis A virus and poliovirus type 1 [497, 499, 500, 52194
523, 525-527, 537]. It has been proposed for decontaminating noroviruses on surfaces
[526], on foods [499] and for preventing contamination during vegetable-washing
processes [500]. In a previous work, our team showed that other peroxyacids, in
particular perpropionic acid (chemically more stable than peracetic acid), were also
effective against MNV-1 in suspension or on hard surfaces under clean and fouled
conditions as well as entrapped in artificial biofilm [651].
To date, the mechanisms involved in this antiviral activity are poorly documented. Effects
of high concentrations of peracetic acid on viral nucleic acid and proteins have been
described previously. It has been reported that contact with 1 g L-1 of peracetic acid for
10 minutes altered the appearance of the genome package inside the F116
bacteriophage capsid, produced altered or folded capsids and damaged the tail [547].
The authors also noted that the DNA was damaged after treatment with 10 g L-1 of
peracetic acid for 10 minutes, but did not determine whether this occurred inside the
capsid or after release into the medium from a fractured protein coat [548]. Another
group working on respiratory adenovirus observed that treatment with 2 g L-1 of
peracetic acid completely destroyed the structure of viral particles after 15 minutes [525]
and completely denatured protein [549] and DNA [550] after 60 minutes. None of these
studies analyzed genome integrity or established a clear correlation between the effects
of peracetic acid on the infectivity of the complete viral particle.
It is not known if peracetic acid inflicts the same types of damage at low and high
concentrations. Indeed, short-term effects responsible for viral inactivation are not
defined in these previous studies. It remains to be determined whether peracetic acid
inactivates naked viruses by (1) penetrating into the capsid and altering the genome
and/or (2) damaging the capsid (and whether or not viral nucleic acid is thus released
and in what condition) [652]. Moreover, the viruses used in these studies differ from
noroviruses in certain respects, in particular particle size and structure, including the
nature and size of the genome. Indeed, norovirus (35-40 nm [15]) is at least 50 times
smaller than phage F116 (145 nm [546]) and 10 times smaller than adenoviruses (70–
90 nm [19]). It contains a single-stranded RNA of 7 kb [15] whereas the genomes of
phage F116 [548] and adenoviruses [19] are double-stranded DNA of at least 20,000
base pairs. These differences could underlie different intrinsic weaknesses, which could
lead to divergent mechanisms of action and/or efficiency of disinfectants.
In the present study, a multifaceted approach combining cell culture, transmission
electron microscopy, miniaturized electrophoresis and SDS-PAGE assay has been used
to elucidate the short-term effects responsible for the inactivation of norovirus by
95
aqueous peracetic acid. For this purpose, effects were examined after treatments of two
different intensities.
4.4.
Methods
4.4.1. Virus and cells
Murine norovirus strain 1 and RAW 264.7 cells were obtained courtesy of Kirsten
Mattison (Health Canada, Bureau of Microbial Hazards, Tunney’s Pasture, Ottawa,
Ontario, Canada K1A 0K9). Cells were cultured in complete DMEM (all reagents for cell
culture were provided by Wisent Biocenter, Canada) at 37 °C under a humidified 5 %
CO2 atmosphere. Complete DMEM consisted of DMEM with 1 g L-1 glucose, L-glutamine
and phenol red, supplemented with 10 % foetal bovine serum (premium quality) plus
100 IU mL-1 penicillin, 100 mg L-1 streptomycin, 2 mmol L-1 L-glutamine and 1.5 g L-1
sodium bicarbonate. MNV-1 was propagated in RAW 264.7 cells as described previously
[122].
4.4.2. Purification of MNV-1
The purification of MNV-1 was performed as described previously [122]. Briefly, virus
lysate
free
of
cell
debris
was
digested
enzymatically
and
concentrated
by
ultracentrifugation (170,000 x g for 3 hours at 4 °C). The pellet was re-suspended in
PBS and further purified by ultracentrifugation (160,000 x g for 3 hours at 4 °C) through
a sucrose gradient (7.5–45 %). Fractions containing MNV-1 were identified by SDS-PAGE
and pooled. MNV-1 was finally concentrated by centrifugation (170,000 x g for 3 hours
at 4 °C). The MNV-1-containing pellets were re-suspended in PBS, divided into aliquots
and stored at -80 °C. Viral protein was measured using the DCTM protein assay kit (BioRad).
4.4.3. Virus quantification by plaque assay
Titers of MNV-1 in stock aliquots and treated mixtures were determined by plaque assay
and were expressed in pfu mL-1 as described previously [621] with some modifications.
Briefly, RAW 264.7 cells seeded at a density of 8x105 per well (in 12-well culture plates,
Corning Life Sciences, reference 3336) were incubated for 24 h at 37 °C in a humidified
5 % CO2 atmosphere without shaking, then infected with 300 µL of MNV-1 suspension
diluted in 10-fold series, followed by 90 minutes of incubation then overlaid with 3 mL
96
of complete DMEM containing 1 % agarose (Invitrogen, reference 15510-027, California,
USA) and incubated for 60 hours. The cell layers were then fixed in 3.7 % formaldehyde
(BDH, reference 0500) and stained with 0.1 % (wt/vol) crystal violet (Sigma, reference
C3886, Oakville, Canada). The log reduction was calculated by subtracting the log10 of
viral titer before exposure to biocide (control) from the log10 of viral titer after exposure
to biocide [622].
4.4.4. Preparation of aqueous peracetic acid
Peracetic acid solution was prepared from food grade acetic acid (Sigma-Aldrich,
reference 27225, Ontario, Canada) under optimal conditions determined previously
[623]. The equilibrium solution was stored at -20 °C. Residual hydrogen peroxide and
peracetic acid were titrated using colorimetric assays with ceric sulfate IV and sodium
thiosulfate solutions respectively as described previously [509]. The colorimetric assay
was performed twice as soon as the solution was equilibrated at room temperature.
Dilutions of peracetic acid solution were prepared with sterile distilled water immediately
after titration and before the inactivation experiments, stored on ice and used within
1 hour without pH adjustment.
4.4.5. Inactivation experiments
Two peracetic acid treatments were used, namely 50 mg L-1 for 5 minutes and
1000 mg L-1 for 10 minutes. Purified MNV-1 suspension (200 µL at 5 109 pfu mL-1) was
added to 200 µL of peracetic acid solution (2X concentration) at 22 °C ± 2 °C. Positive
controls received 200 µL of sterile distilled water instead of peracetic acid solution.
Distilled water was used as a negative control. At the end of the defined contact time,
samples were separated immediately into four tubes intended for visualization by
transmission electron microscopy, analysis of proteins by SDS-PAGE under reducing
conditions, RNA extraction and plaque assay. Viral RNA integrity was analyzed by
electrophoresis. Inactivation experiments and subsequent analyses were done in
triplicate with a minimum of two independent experiments.
4.4.6. Transmission electron microscopy
Purified MNV-1 treated with peracetic acid or not was diluted ten-fold in purified water.
A 5 µL drop of this diluted MNV-1 suspension was applied to separate glow-discharge
carbon-coated EM grids and stained with 5 µL of 3 % aqueous uranyl acetate for 1 min.
The stained grids were then dried and examined using a JEM-1230 transmission electron
97
microscope (JEOL) at 80 kV. Images were captured using a Gatan UltraScan 1000XP
camera.
4.4.7. Analysis of viral proteins by SDS-PAGE under reducing conditions
Ten microliters of purified MNV-1 treated with peracetic acid or not were mixed with
10 µL of Laemmli buffer (Bio-Rad) containing 0.05 % β-mercaptoethanol. Samples were
left on ice for 5 minutes, heated at 90 °C for 5 minutes, left on ice for 5 minutes and
then loaded into 10 % polyacrylamide gel. Electrophoresis was performed at a constant
voltage of 150 V. Viral proteins were visualized using Coomassie blue staining. A
Precision Plus protein standard (Bio-Rad) was used as a molecular weight marker.
4.4.8. RNA extraction
Purified MNV-1 in 20 µL of suspension treated with peracetic acid or not was immediately
diluted ten-fold in purified water supplemented with L-cysteine hydrochloride at a
concentration equivalent to that of peracetic acid. Viral RNA was extracted using a
QIAamp MinElute Virus Spin kit (Qiagen, reference 57704) according to the
manufacturer’s instructions, except that the carrier RNA was not added to the lysis
buffer. RNA was eluted in 80 µL RNase-DNase-free water.
4.4.9. Analysis of viral RNA by electrophoresis
MNV-1 RNA in 10 µL of water was denatured for 2 min at 70 °C prior to analysis. One µL
of this sample (around 2 ng µL-1 in the case of untreated MNV-1) was analyzed on a
6000 RNA Pico Chip (Agilent, reference 5067-1513) with a Bioanalyzer (Agilent)
according to the manufacturer’s instructions. All analyses were done under RNase-free
conditions. All samples were mixed with a 25 nucleotides marker as an internal control.
4.5.
Results
In order to gain insight into the viral inactivation mechanism, we applied two specific
peracetic acid treatments to purified MNV-1 (5.109 pfu mL-1 and 0.6 µg µL-1 protein):
50 mg L-1 for 5 minutes and 1000 mg L-1 for 10 minutes. At 50 mg L-1 for 5 minutes, a
mixture of infectious and non-infectious virus particles was obtained (4.94 ± 0.04 log10
virus survivors). However, at 1000 mg L-1 for 10 minutes, viruses were totally inactivated
(data not shown).
98
4.5.1. Peracetic acid alters virus particle morphology
As shown by electron microscopy in Figure 4.1A, untreated MNV-1 particles were round
particles approximately 35–40 nm in diameter. Following treatment with 50 mg L-1 of
peracetic acid for 5 minutes (Figures 4.1B and 4.1C), distorted and irregular particles
were apparent, some of which were about 15–30 nm in diameter, among larger numbers
of particles that appeared to be intact. After contact with 1000 mg L-1 of peracetic acid
for 10 minutes (Figures 4.1D to 4.1F), distorted particles were much more numerous
and folded or empty particles also appeared. The latter still had a round shape. It should
be noted that particles that appeared intact were still visible. This result shows that
peracetic acid altered the shape of capsids without disrupting them.
A
B
C
2
1
D
E
3
F
4
2
Figure 4.1 Transmission electron microscope images of MNV-1 stained with 3 % aqueous uranyl acetate.
Peracetic acid alters viral particle morphology. MNV-1 was inactivated partially after 5 minutes of exposure to
50 mg L-1 (3.71 ± 0.04 log10 drop in infectivity) and completely after 10 minutes of exposure to 1000 mg L-1.
A: untreated MNV-1. B and C: MNV-1 treated with 50 mg L-1 for 5 minutes. D to F: MNV-1 treated with
1000 mg L-1 for 10 minutes. 1: small distorted particle. 2: irregular and distorted particle. 3: folded particle.
4: empty particle.
99
4.5.2. Peracetic acid randomly cleaves viral protein in severe conditions
The RNA genome of norovirus is protected by a capsid composed of 180 copies of a
major protein, VP1, and a few copies of a minor protein, VP2 [126]. In order to
investigate whether or not peracetic acid degraded the viral proteins, equal amounts of
viral proteins were analyzed on SDS-PAGE under denaturing conditions. As expected,
the major capsid protein VP1 (molecular mass of approximately 56 kDa) was clearly
visualized
(Figure 4.2). The band corresponding to VP2 (molecular mass of
approximately 22 kDa) was much lighter. The abundance of VP1 was analyzed with
Quantity One® software using images obtained with ChemiDoc™ XRS (Bio-Rad). The
amount of VP1 protein from untreated MNV-1 and MNV-1 treated with 50 mg L-1 of
peracetic acid for 5 minutes was equal. However, following contact with 1000 mg L-1 of
peracetic acid for 10 minutes, VP1 intensity decreased by 17 ± 4 % compared to the
untreated control. Since the assay was performed under denaturing conditions, these
results suggest that this concentration of peracetic acid causes random breakage in the
VP1 primary structure, unlike at low concentration, leading to reduction of VP1 mass and
1000 mg L
-1
50 mg L
Untreated
kDa
Ladder
-1
hence of VP1 length.
250
150
100
75
VP1
50
37
25
VP2
20
Figure 4.2 SDS-PAGE analysis of purified MNV-1 untreated, exposed to 50 mg L-1 of peracetic acid for 5
minutes and to 1000 mg L-1 for 10 minutes. Viral proteins were visualized on 10 % polyacrylamide using
Coomassie blue staining. VP1 = MNV-1 major capsid protein, VP2 = MNV-1 minor capsid protein.
100
4.5.3. Peracetic acid randomly cleaves viral RNA
The RNA of untreated MNV-1 produced a well-resolved peak (light gray curve in
Figure 4.3). In the case of RNA treated with peracetic acid, this peak was much less
intense, indicating a decrease in the amount of RNA present in the sample, due likely to
degradation. Additional bands of molecular weight appearing between 1000 and
4500 nucleotides were very likely due to degradation products. The moderate treatment
(50 mg L-1 of peracetic acid for 5 minutes) seemed to produce fewer detectable
fragments. The fragments produced by the more severe treatment were likely smaller
than 200 nucleotides, which is too small to be retained during RNA purification and
appear on the electropherogram.
MNV-1 RNA
marker
Figure 4.3 Peracetic acid degrades viral RNA. Viral RNA was extracted from purified MNV-1 after experimental
treatments. Samples were loaded onto a 6000 RNA Pico Chip and analyzed on a Bioanalyzer with a UV detector.
Results are presented in electropherogram form. Light gray curve: untreated MNV-1; gray curve: treated with
50 mg L-1 peracetic acid solution for 5 minutes; black curve: treated with 1000 mg L-1 for 10 minutes.
Electropherograms shown are averages of triplicate analyses.
101
4.6.
Discussion
Noroviruses are the leading cause of nonbacterial gastroenteritis worldwide [229, 614,
615]. They represent a genuine public health problem, causing widespread and rapidly
propagating illness among people of all ages and hence significant economic loss [482].
Norovirus dissemination usually involves transmission through person-to-person
contact, water, food and environmental fomites [180]. As is the case for many viruses,
solutions containing chlorine, quaternary ammonium compounds and alcohols have been
used in attempts to limit the spread of norovirus, but none of these has proven very
effective. Peracetic acid solution has been proposed recently as a more effective and
safer agent for surface decontamination [526], disinfection of food [499] or preventing
cross-contamination of fruits and vegetables during rinsing [500].
Aqueous peracetic acid is an equilibrium mixture of acetic acid, hydrogen peroxide,
peracetic acid and water. The activity of this mixture is due most likely to the lowstrength peroxide bond (O-O), which allows homolysis and oxidizing action by means of
free radicals formed, including hydroxyl HO•, acyloxyl RCO2• and acylperoxyl RCO3• [506,
507, 653].
Although the efficacy of peracetic acid against some viruses has been demonstrated, the
mechanisms involved have not been studied in detail. The main objective of this study
was to provide new insight into short-term effects leading to the inactivation of norovirus
by aqueous peracetic acid. A treatment of intermediate intensity produced a mixture of
infectious and non-infectious viral particles with damaged (i.e. cleaved) RNA (Figure
4.3), based on observations made using the Bioanalyzer. This type of damage is due
likely to free radicals generated by the peracetic acid solution. Known to target the
electron-rich purine and pyrimidine hetero-cycles [654] and the sugar-phosphate
backbone [655], free radicals are thus able to initiate reactions that lead to RNA strand
breakage. The electrophilic peracetic acid molecule [653] could damage the RNA by itself
[654], but it is probably too large to diffuse into an unaltered viral particle [656]. In
addition, free radicals can induce mutations resulting in aberrant gene expression [655]
and therefore in inactivation of the virus. The electrophoresis method used in our study
does not allow the detection of mutations. Although RNA strand breakage alone might
be sufficient cause to explain inactivation, the identification of such mutations would
provide complementary information on the mechanism of action of peracetic acid.
102
Based on our EM images and SDS-PAGE results (Figures 4.1 and 4.2), free radicals
appear to reach the viral genome without causing major disruption of the capsid. Free
radicals formed outside the capsid are presumably transferred into the viral particle and
on to the RNA through the capsid proteins. Peroxyl radicals can initiate elimination
reactions that result in damage to single amino acids and the release of additional
radicals that can propagate damage [632]. Although it has never been reported that
radicals are capable of transfer from proteins to RNA, it has been reported that they are
capable of transfer through proteins [632] and from DNA to proteins [657]. It has also
been shown that VP1 may undergo oxidative damage such as carbonylation of amino
acid side chains, resulting in a loss of antigenicity [653, 658] without disruption of the
capsid. Further studies are needed in order to verify whether or not capsid protein VP1
remains antigenic after the less intense treatment in this study, and whether or not such
loss of antigenicity means loss of infectivity.
When a more intense treatment was applied, additional damage to RNA as well as
alterations to particle structure and random degradation of VP1 were observed. The
increased damage to RNA is consistent with previous reports of alterations to DNA inside
phage F116 [548] and adenoviruses [550] induced by exposure to peracetic acid at a
concentration of more than 2000 mg L-1. No specific damage such as nucleoside
oxidation or strand breakage was described, since indirect methods (enzymatic digestion
and PCR targeting a limited region) were used in these studies. Alterations to particle
structure and viral proteins after intense treatments have also been reported [525, 546,
547, 549]. The effect of peracetic acid is more pronounced on capsid proteins, which
could explain the more extensive inactivation. Oxidation can indeed lead to polypeptide
chain cleavage, which would explain why the capsid of some virions was fractured even
though they kept the overall round appearance (Figure 4.1F). This type of damage is
due likely to hydroxyl radicals, which are believed to attack primarily the protein
backbone by abstraction of the hydrogen atom from the α-carbon position. In the
presence of oxygen, α-carbon atoms may react with protein peroxyl radicals, resulting
in protein fragmentation [632, 659]. To a lesser extent, oxidation of proteins can also
lead to formation of cross-linked protein aggregates [659]. Such damage to capsid
proteins can hinder viral attachment to the host cell or the viral replication cycle or cause
release of the viral genome into the surrounding medium, where it will be attacked by
free radicals.
Considered as a whole, these results suggest that the mechanism of MNV-1 inactivation
by peracetic acid solution involves first of all damage to the genome at low
103
concentrations and then damage to VP1 at higher concentrations. It has been suggested
in previous reports that the use of RT-PCR for rapid evaluation of the efficacy of viral
destruction by peracetic acid solution is unreliable [499, 521], even with proteinase K
and RNase pre-treatment to eliminate virions rendered non-infectious [521]. As a
nonspecific oxidizer, peracetic acid causes random fragmentation, which may still allow
molecular detection of the viral genome. This is unlike chlorine, which quickly destroys
the 5’ non-translated regions of RNA [660] and gives RT-PCR-based results that are
strongly correlated with cell culture test results for infectivity [499]. Based on our
results, further studies are needed in order to develop a quantitative method capable of
distinguishing infectious norovirus from norovirus inactivated by peracetic acid and
hence guiding the proper application of this solution in industry and in institutions. This
method should probably combine molecular and immunological components.
4.7.
Acknowledgments
This work was supported by a grant from the Natural Sciences and Engineering Research
Council of Canada. We thank Richard Janvier for his help with electron microscopy.
104
Chapitre 5. Efficacité et mécanismes
d’inactivation du norovirus murin par la
technologie des lumières pulsées
Efficacy and mechanisms of murine norovirus inhibition by pulsed-light technology
Publié en mai 2015 dans le journal Applied and Environmental Microbiology
doi : 10.1128/AEM.03840-14
IF2013 = 3,952
Q1 en microbiologie
105
5.1.
Résumé
Les lumières pulsées sont une technologie de pasteurisation athermique reconnue par la
FDA pour inactiver les microorganismes sur les surfaces alimentaires avec une fluence
cumulée n’excédant pas 12 J cm-2. Dans cette étude, nous avons évalué son efficacité
pour l’inactivation du norovirus murin 1 (MNV-1) en tant que modèle des norovirus
humains, en suspension dans un tampon PBS, des eaux dures, minérale, turbides et
dans des eaux usées, ainsi que sur des surfaces alimentaires en polyéthylène haute
densité, chlorure de polyvinyle et acier inoxydable, en présence ou non d’un biofilm
artificiel. L’appareil générant les lumières pulsées émettait une lumière à large spectre
continu (200-1000 nm) avec une fluence à 8 cm sous la lampe de 0,67 J cm-2 par
impulsion, dont 2 % provenant des UV. Le pouvoir infectieux du MNV-1 a été réduit d’au
moins 3 log10 en moins de 3 secondes (cinq impulsions, 3,45 J cm-2) dans les suspensions
peu turbides et sur les surfaces propres même en présence d'alginate ainsi qu’en
6 secondes (11 impulsions, 7,60 J cm-2) sur les surfaces sales, à l'exception de l'acier
inoxydable (2,6 log10). La présence de protéines et de bentonite a diminué l’efficacité du
traitement. L'analyse de la morphologie, des protéines virales et de l'intégrité de l'ARN
des virus traités nous a permis d'élucider les mécanismes impliqués dans l'activité
antivirale des lumières pulsées. Elle semble perturber la structure des particules tout en
dégradant les protéines et l'ARN. Ces résultats suggèrent que cette technologie pourrait
constituer un moyen alternatif et efficace pour l’inactivation des norovirus dans les eaux
usées, les boissons peu turbides, l'eau potable ou sur des surfaces alimentaires, avec ou
sans biofilm.
106
5.2.
Abstract
Pulsed light is a non-thermal processing technology recognized by the FDA for killing
microorganisms on food surfaces, with cumulative fluences up to 12 J cm-2. In this study,
we investigated its efficacy for inactivating murine norovirus 1 (MNV-1) as human
norovirus surrogate in PBS buffer, hard water, mineral water, turbid water and sewage
treatment effluent and on food-contact surfaces including high-density polyethylene,
polyvinyl chloride and stainless steel, free or in an alginate matrix. The pulsed light
device emitted a broadband spectrum (200–1000 nm) at a fluence of 0.67 J cm-2 per
pulse with 2 % UV at 8 cm beneath the lamp. Reductions in viral infectivity exceeded
3 log10 in less than 3 seconds (5 pulses, 3.45 J cm-2) in clear suspensions and on clean
surfaces even in the presence of alginate, and in 6 seconds (11 pulses, 7.60 J cm-2) on
fouled surfaces except for stainless steel (2.6 log10). The presence of protein or bentonite
interfered with viral inactivation. Analysis of the morphology, the viral proteins and the
RNA integrity of the treated MNV-1 allowed us to elucidate the mechanisms involved in
the antiviral activity of pulsed light. Pulsed light appeared to disrupt MNV-1 structure
and degrade viral protein and RNA. The results suggest that pulsed light technology
could provide effective alternative means of inactivating noroviruses in wastewaters, in
clear beverages, in drinking water or food-handling surfaces in the presence or absence
of biofilms.
107
5.3.
Introduction
Human noroviruses are responsible for a fifth of all cases of acute gastroenteritis
worldwide [1]. They spread directly via person-to-person contact (fecal-oral and
vomitus-oral) or indirectly through food, water and the environment [5]. Natural biofilms
in sewage treatment effluent could be responsible for many persistent waterborne
outbreaks, since they have been found to harbor noroviruses [4, 661]. Infection spreads
quickly and widely, affecting individuals of all ages, especially where many people gather
or live in close proximity, such as in long-term-care residences, retirement homes, cruise
ships and the like. Infectious doses as low as 2800 particles, the high viral loads in feces
and vomit (up to 109 genomic copies per gram), persistence in the environment,
prolonged duration of viral shedding even after symptoms are resolved and inadequate
long-term immunity all contribute to the high incidence of norovirus illness [662].
Although the illness is usually mild and self-limiting, the large number of cases per year
represents a considerable loss in productivity and constitutes a substantial burden on
society [5, 175].
Among the physical disinfection processes, pulsed light treatment appears well suited
for the disinfection of food-contact surfaces in industrial and health care settings and for
decontaminating water and beverages. It has been proposed as a means of non-thermal
pasteurization for food preservation and for decontaminating air and packaging materials
[663]. It has proven effective for inactivating bacteria, fungi and yeasts in water and
foods and in diagnostic laboratories. Besides its advantages of speed and costeffectiveness, it does not require the addition of any chemical product [561]. This
technology is based on very short high-intensity pulses of white light from UV-C to near
IR. The spectrum is thus much broader than the monochromatic light (continuous-wave
germicidal UV at 254 nm) emitted by low-pressure mercury lamps or the polychromatic
light (200-300 nm) emitted by medium-pressure mercury lamps [553]. Most of the
photons in this broad range have enough energy to induce chemical reactions but too
little to cause molecular bond breakage as occurs in the presence of ionizing radiation
[551]. According to the FDA, pulsed light may be safely used for the decontamination of
food and food-contact surfaces by using a xenon lamp emitting wavelengths between
200 and 1000 nm, pulse durations not exceeding 2 milliseconds, and cumulative
intensity not exceeding 12 J cm-2 [579].
While the pulsed light approach appears promising based on published results, studies
of its use for inactivating viruses are scarce. Early results are nevertheless encouraging.
108
The treatment intensity received by sample is characterized by the fluence, which is
calculated by multiplying the total radiant power incident per unit area by the exposure
time. Using a PureBright device, Huffman et coll. [556] obtained greater than 4 log10
reductions in the infectivity of poliovirus and rotavirus in tap water at a turbidity of 0 to
10 NTU flowing at about 15 L min-1 using treatment intensities of 500 mJ cm-2. Roberts
et coll. [558] reported similar reductions for nine enveloped and non-enveloped viruses
including poliovirus and hepatitis A virus using an intensity of 1 J cm-2 in PBS buffer, but
required 2 J cm-2 to reach 3 log10 when the buffer contained protein at a concentration
of 2 mg mL-1. Focusing on the UV portion of the pulsed light fluence, Lamont et coll.
[585] calculated that poliovirus in PBS buffer was completely inactivated (6 log10) after
exposure to 28 mJ cm-2 UV, whereas adenovirus required 115 mJ cm-2 UV for a reduction
of 3 log10. In previous work by our group [503], a 5 log10 reduction of hepatitis A virus
and MNV-1 in PBS buffer was obtained after exposure to respectively 59 and 91 mJ cm-2
calculated UV fluence. The effectiveness of the pulsed light treatment was also decreased
in the presence of dissolved protein. Results on stainless steel and polyvinyl chloride
(PVC) disks were similar. This is the only previous study that has focused on the
resistance of noroviruses to pulsed light on different surfaces under various conditions
of fouling. Meanwhile, the mechanisms involved in the antiviral activity of pulsed light
remain unknown.
The aim of the present work is to evaluate the efficacy of pulsed light for inactivation of
norovirus in sewage treatment effluent and drinking water as a function of hardness and
turbidity. It also aims to evaluate its efficacy for decontaminating different surfaces,
under clean and fouled conditions, as well as in the presence of biofilm. Finally, we
sought to elucidate the mechanism involved in this antiviral activity. To achieve this,
murine norovirus was used as a surrogate for human norovirus [123] which could not
be cultured before the recent publication of Jones et coll. [105].
5.4.
Methods
5.4.1. Virus and cells
Murine norovirus strain 1 and RAW 264.7 cells were obtained courtesy of Kirsten
Mattison (Health Canada, Bureau of Microbial Hazards, Tunney’s Pasture, Ottawa,
Ontario, Canada K1A 0K9). RAW 264.7 cell culture and MNV-1 propagation,
concentration and purification were performed as described previously [122]. Viral
protein was measured using the DCTM protein assay kit (Bio-Rad).
109
5.4.2. Virus quantification by plaque assay
The titer of MNV-1 in stock aliquots and treated suspensions was determined by plaque
assay and was expressed in pfu mL-1 as described previously [651].
5.4.3. Pulsed light equipment
Pulsed light treatments were carried out in a bench-top SINTERON 500 system
connected to a LC-915 process chamber (154 mm x 154 mm x 165 mm) fitted with a
LH-910 spiral lamp (type C, 107 mm diameter, Xenon Corp., MA, USA). The system was
operated at 830 J per pulse (3800 V discharge from a 115 µF capacitor). The xenon lamp
spectrum spans the 200–1000 nm range. Samples in a 24-well cell culture plate centered
on the process chamber shelf placed 80 mm beneath the lamp were exposed to one
520 µs pulse every 0.555 second for varied lengths of time.
5.4.4. Fluence measurements
The broadband energy (J) and UV fluence (J cm-²) were measured three times at four
different locations 80 mm beneath the lamp. A period of at least 10 min was provided
between sample treatments to prevent possible overheating of the detectors. The
broadband energy was measured using a Nova display (Ophir Optronics Inc.,
Wilmington, MA) with a stainless steel perforated plate (with a single 0.97 cm² round
hole) placed over the pyroelectric head (PE50, calibrated prior to the study) and setting
the pulse width and wavelength respectively at 1.0 ms and 254 nm. The total broadband
fluence (in J cm-2) of a treatment was calculated as follows:
Total fluence = energy (joules) measured after one pulse X number of pulses / 0.97 cm²
The UV fluence was measured using an ILT1700 display (International Light Technologies
Inc., Peabody, MA) connected to a SED040 photodiode covered with a W diffuser, a
QNDS2 neutral density filter (to reduce intensity by 100) and an ACT5 filter that was
calibrated prior to the study.
5.4.5. Liquid-phase inactivation of MNV-1 by pulsed light
Viral suspensions containing approximately 105 pfu mL-1 were prepared by diluting
purified MNV-1 in hard water prepared according to the The Association of Official
Analytical Chemists [664], in water made turbid with bentonite (Fisher, reference B235),
in PBS buffer, in bottled mineral water (Dasani brand) or in water collected at a municipal
110
sewage treatment plant (Saint Nicolas, Quebec, Canada) just after the grit removal step
(effluent 1) and just after activated sludge treatment (effluent 2). The sewage treatment
samples were sterilized by exposure to 37 kGy of -irradiation in a Gammacell-220
Co
60
cell (Atomic Energy of Canada). The other suspension media were sterilized by
autoclaving for 15 minutes at 121 °C. Measurements of turbidity (model 2100AN, Hach
Company, Loveland, CO, USA), conductivity (YSI 3100 conductivity meter), reduction
potential (electrode VWR, reference 14002-856), dissolved oxygen (electrode VWR,
reference 14002-800) and absorption and transmittance from 200 to 1000 nm (HP 8453
spectrometer, Hewlett Packard) were carried out at 24.0 ± 1 °C. One milliliter of each
viral suspension was then placed in a 24-well plate (sample surface area of 2 cm2 and
0.5 cm depth) for treatment. Untreated viral suspensions were included as positive
controls. The viral titer was then determined as described above. Sample temperature
was monitored using a type K thermocouple (Sper Scientifics).
5.4.6. Inactivation of MNV-1 attached to solid materials
One-centimeter disks of polyethylene (PET), PVC type 1 grade 1 (Plastique Polyfab,
Quebec, Canada) and stainless steel (Den-Mar Acier Inoxydable Inc., Quebec, Canada)
were cleaned with 0.1 % sodium dodecyl sulfate solution, rinsed with distilled water
several times and then sterilized by autoclaving for 15 minutes at 121 °C. The viral load
(105 pfu cm-2) was used under clean and fouled conditions according to the standard
test method ASTM E 2197-02 [626]. Inactivation experiments were conducted according
to standard test method ASTM E 1053-97 [627] with some modifications. Briefly, 30 µL
of virus suspension was placed on each disk and allowed to dry for 60 ± 5 min at 22 ±
2 °C in a laminar flow hood, the disks were placed in a 24-well plate and treated. Controls
received no pulse light treatment. Virions were recovered from the test materials in
Earle’s balanced salt solution and assayed immediately. Recoverability R (%) of
infectious viral particles from the material surface was calculated as R = (100 X T60 / Ti)
where Ti = initial viral titer and T60 = viral titer after drying for 60 minutes at room
temperature.
5.4.7. Inactivation of MNV-1 entrapped in alginate
Purified MNV-1 was suspended at 105 pfu g-1 in a sterile solution of 2 % (wt) low-viscosity
sodium alginate (Sigma, reference A2158, Oakville, Canada). Alginate film 0.97 mm
thick was formed as described previously [651], weighed and then treated. Control tests
111
received no pulsed light treatment. Virions were recovered as described previously [651]
and assayed immediately.
5.4.8. Experiments on mechanism of action
Aliquots (400 µL) of purified MNV-1 suspended at a titer of approximately
5 X 109 pfu mL-1 (0.6 mg protein mL-1) were exposed to 2.07 J cm-2 (3 pulses) or
8.98 J cm-2 (13 pulses). Unexposed viral suspension and distilled water were included
as positive and negative controls. Treated aliquots were immediately separated into four
tubes for visualization by transmission electron microscopy (TEM), protein analysis by
SDS-PAGE under reducing conditions, RNA extraction, and plaque assay. Extracted RNA
was used for integrity analysis by electrophoresis and photoproduct detection by
UPLC-MS/MS after enzymatic digestion.
5.4.8.1.
Transmission electron microscopy
Five µL of pulsed-light-treated MNV-1 suspension diluted ten-fold in water were placed
on a glow-discharge carbon-coated EM grid and stained with 5 µL of 3 % aqueous uranyl
acetate for 1 min. The stained grid was then dried and examined using a JEM-1230
transmission electron microscope (JEOL) at 80 kV. Images were captured using a Gatan
UltraScan 1000XP camera.
5.4.8.2.
Analysis of viral proteins by SDS-PAGE
Ten µL of pulsed-light-treated MNV-1 were mixed with 10 µL of Laemmli buffer (Bio-Rad)
containing 5 % β-mercaptoethanol. The mixture was kept on ice for 5 minutes, held at
90 °C for 5 minutes and then left again on ice for 5 minutes. The sample was loaded
into 10 % polyacrylamide gel and electrophoresed under reducing conditions at a
constant voltage of 100 V along with a precision plus protein standard (Bio-Rad) as a
molecular weight marker. Viral proteins were visualized by Coomassie blue staining.
5.4.8.3.
RNA extraction
Viral RNA was extracted from a 200 µL aliquot of MNV-1 (pulsed-light-treated or not)
diluted ten-fold in water using a QIAamp MinElute Virus Spin kit according to the
manufacturer’s instructions (Qiagen, reference 57704) except that carrier RNA was not
added to the lysis buffer. RNA was eluted in 80 µL RNase-DNase-free water.
112
5.4.8.4.
Analysis of viral RNA by electrophoresis
MNV-1 RNA in 10 µL of extract was denatured for 2 min at 70 °C prior to analysis. A
1 µL aliquot was analyzed on a 6000 RNA Pico Chip (Agilent, reference 5067-1513) using
a Bioanalyzer (Agilent) according to the manufacturer’s instructions. RNA from untreated
MNV-1 was also electrophoresed on 0.8 % agarose under denaturing conditions as
described previously [665].
5.4.8.5.
Analysis of photochemical products by UPLC-MS/MS
MNV-1 RNA in a 50 µL aliquot was digested enzymatically described previously [666].
The sample was injected into a Waters Acquity H-class UPLC system fitted with an ACE
excel C18 (J) column (100 x 2.1 mm internal diameter, 2 µm particle size) and UV
detection (260 nm, UV trace from 210 to 800 nm). The mobile phase was a gradient of
5 mmol L-1 ammonium formate and methanol (Fisher) at a flow rate of 200 µL min-1.
The proportion of methanol reached 80 % after 10 min. The Waters TQD was operated
in the positive mode. Analyses were performed in the multiple-reaction-monitoring
mode.
Several
transitions
were
monitored
simultaneously:
268.25

136.25
(adenosine), 284.15  152.00 (guanosine), 245.02  113.00 (uridine), 244.40 
112.00 (cytidine) as well as a scan between 200 and 600 m/z in order to detect any
other molecules as dimers. The dwell time was set at 0.005 s for each signal.
5.4.9. Statistical analysis
All measurements were performed in triplicate and obtained from at least two
independent experiments. The log reduction was expressed as mean log10 titer ±
standard deviation and calculated by subtracting titer before exposure to pulsed light
(control) from the titer after exposure [622]. A reduction of 3 log10, which corresponds
to 99.9 % inactivation, was used as the criterion for declaring the treatment as virucidal.
One-way multiple comparisons were performed using JMP® 10 statistical analysis
software, a product of SAS (2013). P values < 0.05 were considered statistically
significant.
113
Table 5.1 Broadband and UV energies measured 80 mm below the xenon lamp using respectively Nova and
ILT1700 radiometers. UV energy is approximately 2 % of the broadband energy (200 to 1000 nm) and appears
in parentheses. Total energies received at the sample surface from one pulse were calculated by multiplying
the fluence (J cm-2) by the exposed surface area: 2.00 cm² for suspensions, 1.04 cm² for hard materials, and
4.54 cm² for alginate film. Energies were averaged over 12 pulses measured at four different locations.
Number
of pulses
Fluence
(J cm-2)
1
Energy (J) at the sample surface
Suspension
Hard material
Alginate
0.69 (0.02)
1.38 (0.03)
0.72 (0.02)
3.13 (0.07)
3
2.07 (0.05)
4.15 (0.09)
2.15 (0.05)
9.38 (0.21)
5
3.45 (0.08)
6.91 (0.16)
3.59 (0.08)
15.63 (0.35)
7
4.84 (0.11)
9.67 (0.22)
5.02 (0.11)
21.89 (0.49)
9
6.22 (0.14)
-
6.46 (0.15)
-
11
7.60 (0.17)
-
7.89 (0.18)
-
13
8.98 (0.20)
-
9.33 (0.21)
-
Table 5.2 Characteristics of sterile solutions used in this study before pulsed light treatment: Turbidity (Tu),
conductivity (σ), reduction potential (E), dissolved O2 (DO), absorbance at 254 nm (A254 nm) and transmittance
at 254 nm (T254 nm).
Tu
(NTU)
σ
(µS cm-1)
E
(mV)
DO
(mg L-1)
A254 nm
(cm-1)
T254 nm
(%)
50 mg L-1
0
166
338
3.7
0.0
100.0
-1
100 mg L
0
215
330
3.8
0.0
100.0
150 mg L-1
0
286
325
3.6
0.0
100.0
200 mg L-1
0
362
320
4.3
0.0
100.0
400 mg L
0
686
337
2.8
0.0
100.0
0
14300
291
4.4
0.0
100.0
55
15540
285
4.3
1.6
2.7
100 NTU
111
15840
286
3.6
2.4
0.4
200 NTU
215
16000
284
4.3
2.8
0.1
500 NTU
541
16680
280
3.3
3.6
0.0
1000 NTU
977
16560
279
3.8
3.9
0.0
Mineral water
0
52
392
4.1
0.0
100.0
Effluent 1
57
577
305
3.9
1.2
6.7
Effluent 2
4
593
323
3.6
0.0
84.6
Solution
Hard water
-1
Turbid water
0 NTU
50 NTU
114
5.5.
Results
Under the conditions of the present study, the four locations of the illuminated surface
were exposed to an average broadband fluence of 0.69 J cm-2 per pulse. About 2 % of
this energy was associated with UV (Table 5.1).
5.5.1. Activity of pulsed light against MNV-1 in aqueous suspension
Evaluation before and after exposure to pulsed light revealed that even the most severe
treatment in this study (8.98 J cm-2) generally did not result in any significant change in
liquid sample physicochemical characteristics (Table 5.2) and raised the temperature by
not more than 2.2 ± 0.3°C. The pH of all suspensions remained between 6.6 and 7.5.
The absorbance spectra of the five hard water samples (50–400 mg L-1 CaCO3
equivalent) were similar and near zero over the 200–1000 nm range, with the exception
of a small peak associated with a decrease in transmittance at 974 nm due to water
[667] (data not shown). The transmittance of these hard waters was 100 % at the
germicidal wavelength of 254 nm. Viral inactivation increased with the number of pulses.
There was no statistically significant difference in inactivation among the five hard waters
(P > 0.05). Essentially total inactivation (greater than 4.0 log10) was observed with three
pulses or 2.07 J cm-2 (Figure 5.1A). Absorbance increased in the UV region and spread
over the visible region as turbidity increased from 0 to 1000 NTU (data not shown).
Transmittance at 254 nm dropped rapidly as turbidity increased (Table 5.2). As shown
in Figure 5.1B, the treatment became significantly less effective as turbidity increased
(P < 0.05). A 3 log10 reduction was achieved with a treatment of 3.45 J cm-2 (five pulses)
at turbidity up to 200 NTU. Inactivation at this intensity was total only in PBS (0 NTU).
Finally, the absorbance and transmittance spectra of mineral water and effluent 1 were
very similar to those respectively of hard waters and 50 NTU water (data not shown).
Transmittance by effluent 2 was 84.6 % at 254 nm (Table 5.2). There was no statistically
significant difference between the three samples in term of viral inactivation (P > 0.05).
As was the case for hard waters, inactivation was total at 2.07 J cm-2 (data not shown).
5.5.2. Activity of pulsed light against immobilized MNV-1
A critical step in the study of norovirus inactivation on hard surfaces is recovery of
attached virus. Using the protocol described in the methods section, recoveries of
infectious MNV-1 particles from PET, PVC and stainless steel surfaces (1.04 cm²) were
115
(A)
MNV-1 reduction (log10)
5
+++
+++
50
100
+++
+++
++
4
3
2
1
0
150
200
400
Hardness (mg L-1)
(B)
5
++
4
3
2
1
0
0
50
100
200
500
1000
Turbidity (NTU)
Figure 5.1 Inactivation of MNV-1 in experimentally contaminated hard waters (A) and turbid waters (B) after
pulsed light treatments at 80 mm from the xenon lamp: 0.69 J cm-2 ( ), 2.07 J cm-2 ( ), 3.45 J cm-2 ( )
and 4.84 J cm-2 ( ) provided in 1, 3, 5 and 7 pulses respectively. Water hardness was adjusted with calcium
carbonate. Turbidity was adjusted with bentonite suspended in PBS. Values are mean log10 reduction per mL
of three replicates from at least two independent experiments. The + symbol indicates that inactivation of the
virus was total. The error bars represent standard error.
116
similar and ranged from 95 % to 98 % (data not shown). The reduction in infectivity
again increased with the number of pulses (P < 0.001, Figure 5.2). Under clean
conditions, there was no significant difference between inactivation of MNV-1 on the
different materials (P > 0.05). However, the presence of protein residue (204 µg per
disk) significantly decreased the effectiveness of the treatment (P < 0.01) regardless of
the material. A reduction of at least 3 log10 occurred on clean disks when the applied
fluence was 3.45 J cm-2. Twice as much energy (7.60 J cm-2) was required to achieve
the same reduction on fouled plastic disks (Figures 5.2A and 5.2B), while the greatest
reduction obtained on fouled stainless steel was 2.6 log10 with 8.98 J cm-2 (Figure 5.2C).
Using the protocol described in the methods section, the recovery of MNV-1 from alginate
films was 96.4 ± 0.6 %. These films (4.52 cm², 0.39 ± 0.01 g) retained 5.8 log10 pfu g-1.
The infectivity of entrapped MNV-1 was reduced by 3.58 ± 0.1 log10 after application of
0.69 J cm-2 and eliminated after exposure to 2.07 J cm-2 (data not shown).
5.5.3. Mechanism of action
To gain insight into the mechanism involved in viral inactivation by pulsed light, we
compared treatments at 2.07 (3 pulses) and 8.98 J cm-2 (13 pulses). The moderate
treatment left a mixture of infectious and non-infectious viral particles (3.88 ±
0.03 log10 pfu mL-1) while the intensive treatment produced total inactivation. As shown
in Figure 5.3A, untreated MNV-1 particles were round and 35–40 nm in diameter. After
the moderate treatment, the appearance was significantly different from the control,
featuring a mixture of debris, apparently intact particles, distorted particles and some
empty particles (Figures 5.3B and 5.3C). After the intensive treatment, a larger amount
of debris was observed plus a few distorted particles and apparently intact particles
(Figures 5.3D and 5.3E). SDS-PAGE analysis of the capsid of untreated MNV-1 confirmed
the presence of major protein and minor proteins, respectively VP1 and VP2 [126]. At a
molecular mass of approximately 56 kDa, VP1 was clearly visible (Figure 5.4). The
abundance of VP1 (analyzed using Quantity One® software on images obtained with
Bio-Rad ChemiDoc™ XRS) decreased by 53.5 ± 3.6 % relative to the untreated control
after the moderate treatment. The intensive treatment did not increase this value
significantly. These results suggest that pulsed light caused random breakage in the VP1
primary structure, leading to a reduction of VP1 and then a reduction of VP1 length (the
assay was performed under denaturing conditions). Finally, RNA size (around 7000
bases) and integrity were analyzed respectively on 0.8 % agarose gel under denaturing
conditions and with a Bioanalyzer. All samples were mixed with a 25-nucleotide marker
117
(A)
5
4
3
2
1
0
0,69
2,07
3,45
4,84
6,22
7,60
8,98
Fluence (J cm-2)
(B)
5
+
+
+
+
4,84
6,22
7,60
8,98
7,60
8,98
4
3
2
1
0
0,69
2,07
3,45
Fluence (J
cm-2)
(C)
5
4
3
2
1
0
0,69
2,07
3,45
4,84
6,22
Fluence (J cm-2)
Figure 5.2 Inactivation of MNV-1 on experimentally contaminated polyethylene (A), polyvinyl chloride (B) and
stainless steel (C) disks (1.04 cm²) under clean ( ) and fouled ( ) conditions after treatment with pulsed
light at 80 mm from the xenon lamp. Fluence increased from 0.69 to 8.98 J cm-2 as the number of pulses
increased from 1 to 13. Values are mean log10 reductions of infectious particles per cm² based on three
replicates and at least two independent experiments. The + symbol indicates that inactivation of the virus was
total. The error bars represent standard error.
118
A
1
B
C
4
D
E
5
4
3
2
2
3
2
-2
8,98 J cm
-2
2.07 J cm
Untreated
Negative control
kDa
Marker
Figure 5.3 Viral particles disrupted by pulsed light. Infectivity of purified MNV-1 dropped by 5.15 ± 0.18 log10
after treatment with 2.07 J cm-2 (3 pulses) and was completely eliminated after treatment with 8.98 J cm-2
(13 pulses). Treated and untreated viral particles were stained with 3 % aqueous uranyl acetate and visualized
by transmission electron microscopy. A – untreated MNV-1; B and C – MNV-1 treated with 3 pulses; D and E
– MNV-1 treated with 13 pulses; 1 – intact particle; 2 – apparently intact particles; 3 – distorted particle; 4 –
debris; 5 – empty particle.
250
150
100
75
VP1
50
37
25
Figure 5.4 SDS-PAGE analysis of purified MNV-1 untreated, treated with 2.07 J cm-2 (3 pulses) and treated
with 8.98 J cm-2 (13 pulses). Viral proteins were analyzed on 10 % SDS-PAGE followed by Coomassie staining.
VP1 = major capsid protein.
119
MNV-1 RNA
Arbitrary fluorescence units (FU)
110
90
70
50
marker
30
10
-10
17
27
25
37
47
200
1000
57
67
4000
Time (s)
Length (nt)
Figure 5.5 Viral genomic RNA degraded by pulsed light. Viral genomic RNA extracted from treated or untreated
purified MNV-1 was loaded onto a 6000 RNA Pico Chip and analyzed on a Bioanalyzer with a UV detector.
Results are presented in electropherogram form. Black = untreated MNV-1, gray = 2.07 J cm-2 (3 pulses),
light gray = 8.98 J cm-2 (13 pulses). Electropherograms are averages of triplicate analyses.
120
as an internal control, as shown in Figure 5.5. RNA from untreated MNV-1 produced a
well-resolved peak (light gray curve). RNA from treated MNV-1 also produced this peak
but at lower intensity, meaning that the quantity of intact RNA decreased due to the
treatment. This observation is corroborated by the decrease in the total quantity of
extracted RNA detected after the moderate (2.0 ± 0.2 ng µL-1) and intensive treatments
(1.6 ± 0.0 ng µL-1). Pulsed light thus appeared to cause breaking of RNA into fragments
smaller than 200 nucleotides, which are not retained during purification and therefore
did not appear on the electropherogram. Moreover, UPLC profiles were similar for the
three samples enzymatically digested. No photoproducts were detected on the
chromatogram or in the mass spectrum. However, it is possible that photoproducts too
small to be detected were produced.
5.6.
Discussion
Pulsed light technology has been found effective for eliminating bacteria and fungi on
eggshells [572], on fruits [668], in fruit juices [574, 669], on packaged chicken [569]
and on food packaging materials [670]. The FDA has recommended total fluence up to
12 J cm-2 for decontamination of food and food-contact surfaces [579]. However, studies
on virus inactivation by pulsed light remain rare and difficult to compare because of
differences in the equipment used and the type of data reported. In the present study,
inactivation of a surrogate of human norovirus by pulsed light was evaluated in aqueous
suspension, on food-contact surfaces and in artificial biofilm. The mechanism of viral
inhibition was also investigated.
Several parameters may influence the efficacy of pulsed light, including the composition
and turbidity of the sample, the pulse energy, the number of pulses and treatment time.
According to our results, pulsed light treatment was effective at inactivating MNV-1 in
clear liquids up to 0.5 cm in depth. Viral titer in PBS was reduced by 2.0 ± 0.2 and 3.3
± 0.5 log10 after treatments with broadband fluences of 0.69 and 2.07 J cm-2 respectively
of which 16 and 47 mJ cm-2 were UV fluences. These values are consistent with previous
results obtained for hepatitis A virus and poliovirus type 1 with pulsed light [558, 585]
and for MNV-1 with continuous UV light [671, 672]. As observed in the case of bacteria
and fungi [673], inactivation of MNV-1 appeared equivalent whether the light was
continuous or pulsed but was faster with pulsed light (232 s [671] vs 1.5 s).
In this study, we also investigated the influence of medium composition on the efficacy
of pulsed light. Our results showed that water hardness up to 400 mg L-1 equivalent
121
CaCO3 (686 µS cm-1), mineral water or conductivities up to 14.3 mS cm-1 did not
interfere with viral inactivation with pulsed light, suggesting a high potential of the
technology for treating municipal drinking water, which has been a vehicle for the spread
of norovirus infection [441, 442]. In contrast, turbidity did have a negative impact on
treatment efficacy. While infectivity was reduced by at least 3.9 ± 0.5 log10 using a
broadband fluence of 4.84 J cm-2 (109 mJ cm-2 UV fluence) at up to 200 NTU, reductions
were only 2.06 ± 0.3 log10 at 1000 NTU. Fruits and vegetables as well as their juices are
often involved in norovirus outbreaks [366, 371, 457, 674]. Since the turbidity of
clarified fruit juices is under 200 NTU [675], at least these products could be treated
without major modification of the pulsed light treatment system. Pulsed light appears
not to alter food composition [580, 581] or nutritional properties [584, 663]. Finally, our
results suggest that pulsed light would be effective for decontaminating effluent from
primary sewage treatment. Because of the speed with which it acts, this technology
offers several advantages over continuous UV treatments. It could be used to deal with
contamination issues, including contamination of shellfish by municipal sewage released
into marine product growing areas [676] and contamination of vegetables by irrigation
[144, 407].
Food contact surfaces are frequently involved in the contamination of foods during
processing. Food spoilage and pathogenic microorganisms including viruses may adhere
to these surfaces and persist for a long period of time. Recent studies have clearly
demonstrated the persistence of norovirus on inert surfaces. In this study, we have
shown that inactivation of MNV-1 on clean surfaces increased with fluence, reaching
reductions of 3.8–4.3 log10 when a broadband fluence of 4.84 J cm-2 (UV fluence of
109 mJ cm-2) was applied. These results are consistent with a previous report for
hepatitis A virus [503]. The presence of protein reduced the efficacy of pulsed light by
up to 100 times. Under fouled conditions used in the present study, each disk (1 cm²)
was loaded with 204 µg of protein, which was 240 times higher than the amount
(0.9 µg cm-2) used previously and found to decrease viral destruction by 10 and 1000
times respectively on PVC and stainless steel [503]. It therefore appears that protein in
quantities as small as 1 µg cm-2 can reduce the effectiveness of pulsed light but
increasing protein amount did not result in any further inhibition. Since biofilm in drinking
water reservoirs and distribution systems has been shown to harbor norovirus [4], we
assessed the efficacy of pulsed light at inactivating MNV-1 entrapped in alginate. One
mm thick alginate film did not seem to protect against pulsed light since MNV1 was
inactivated at the same level as the virus alone. This result is consistent with the finding
122
of Bialka [677] who reported that penetration of the UV portion to depths up to 1 cm
occurs in opaque solid materials such as whey protein gels. In addition, several authors
have noted that the alginate slime of mucoid strains of Pseudomonas aeruginosa does
not provide any protection against the lethal action of pulsed light [678, 679]. The
viability of Ps. aeruginosa in biofilms was reduced by 5.8 ± 0.2 log10 using up to
21.6 μJ cm-2 UV fluence [679]. It is obvious that our preliminary result obtained with
artificial biofilm should be validated with natural bacterial biofilm.
Attempts to elucidate the mechanism by which pulsed light kills bacteria and yeasts have
been published [551, 589, 608, 609, 680, 681]. In the present study, multiple assays
were performed to provide insight into the mechanism of virus inactivation by pulsed
light. To our knowledge, this is the first time that effects of pulsed light on viral structure
have been investigated. Modifications both at the level of nucleic acids and capsid were
observed. Our analyses indicated single-strand breakage of MNV-1 RNA as well as
damages to the virion structure (distorted and empty particles) and breakage of viral
proteins. These physical alterations rendered with no doubt the virions unable to
recognize their binding site and entering into the host cells or to replicate. UV
wavelengths included in pulsed light are known to induce strand breakage and/or
photoproducts such as cyclobutane pyrimidine dimers [551, 680, 681]. Although no
photoproducts were detected by UPLC-MS/MS analysis, their formation in small amounts
cannot be excluded. However, this was not likely a major factor in the inactivation of
MNV-1. While UV fluence received by samples is capable of altering viral nucleic acids
[598, 599], it is probably not capable of altering the viral capsid directly [682-684]. This
rupture of viral capsid could be explained by the model proposed by Wekhof et coll.
[578] who observed the same phenomenon on bacterial and fungal cells. He supposed
that it arose from instantaneous overheating, caused by absorbing UV light, which is
transformed into heat and transferred to the water contained in the microbial cell. This
idea is consistent with previous work on phages T4 and T7 in which long-pass 295 et
400 nm filters reduced pulsed light efficiency [586]. The focus has been on UV, since the
other wavelengths emitted are few or not absorbed by nucleic acids, proteins and water
[551].
In conclusion, this study shows that pulsed light under the specific conditions allowed by
the FDA is effective at inactivating MNV-1. Since the process is rapid, environmentally
friendly and active against a broad range of microorganisms including bacteria [588],
yeasts [587] and enteric viruses [7], its application to the disinfection of drinking water,
clear beverages, food-contact surfaces and even biofilm and sewage treatment effluent
123
should be possible provided that agents that interfere with light transmission,
particularly proteins, are taken in account. We have also provided insight into the
mechanism by which pulsed light inactivates viruses. Our results suggest that this
technology has a dual impact on viral particles, damaging both the genetic material and
the structure and thereby leaving little chance of recovery. The development of this
alternative is timely because the incidence of norovirus illness remains unacceptably
high and its prevention constitutes a superior approach compared to the cost and
consequences of treating infection.
5.7.
Acknowledgments
This work was supported by grants from Ministère de l’Agriculture, des Pêcheries et de
l’Alimentation du Québec (MAPAQ) and Agriculture and Agri-Food Canada ( 810154)
and from Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC)
( 262956). We thank Kirsten Mattison for providing the virus and RAW 264.7 cell line,
XenonCorp for complementary information about lamp spectrum and irradiance
measurements, Ali Demirci Ph.D. for the generous loan of the Nova meter and for
technical advice, and Richard Janvier for help with electron microscopy.
124
Chapitre 6. Discussion et conclusion générale
Depuis l’essor des méthodes moléculaires, les norovirus sont reconnus comme une cause
majeure de gastroentérites aiguës touchant aussi bien les enfants que les adultes. Des
cas sporadiques ou épidémiques se déclarent dans le monde entier tout au long de
l’année, avec une prépondérance hivernale marquée. Ces virus hautement contagieux
et stables dans l’environnement sont principalement transmis par les contacts directs
entre personne, les aliments crus ou peu cuits, les eaux de consommation ou de loisir
et les surfaces. En dépit de leur caractère bénin, les infections à norovirus engendrent
de lourdes pertes économiques pour l’industrie alimentaire et le domaine de la santé. La
récente revue de Barclay et coll. [5] explique clairement que le contrôle des infections à
norovirus, à l’heure actuelle, passe obligatoirement par l’application stricte des
programmes d’hygiène incluant la désinfection, puisqu’aucun vaccin ou traitement
curatif efficace n’est disponible.
Dans ce contexte, cette étude visait à développer deux alternatives innovantes aux
méthodes de désinfection traditionnelles, une chimique et une physique. Ces dernières
se devaient de présenter un potentiel virucide tout en étant sécuritaires. Au regard de
la littérature, les acides peroxycarboxyliques et les lumières pulsées ont été choisis. Pour
ce faire, trois protocoles de désinfection ont été mis en place de façon à évaluer leur
pouvoir virucide (inhibition de l’infectiosité) contre des virus en suspension, sur des
surfaces sèches et immobilisés dans un biofilm artificiel. Par ailleurs, le mécanisme
d’action responsable de l’inactivation virale a été examiné au moyen d’approches
moléculaires, protéomiques et microscopiques.
6.1.
Acides peroxycarboxyliques
L’activité antivirale de l’acide peracétique a fait l’objet d’une dizaine de publications
scientifiques depuis les années 1990 [497, 499, 500, 521-523, 525-527, 537]. En
surcroit de l’acide percitrique [539], aucun autre acide peroxycarboxylique n’a été
étudié. Sachant que leur réactivité chimique varie en fonction de leur structure, l’activité
antivirale de différents acides peroxycarboxyliques a été évaluée dans le but d’étendre
les connaissances à leur sujet et d’identifier une molécule potentiellement plus efficace
que l’acide peracétique.
125
6.1.1. Caractérisation des solutions d’acides peroxycarboxyliques
Le troisième chapitre de cette thèse porte sur le pouvoir virucide de quatre acides
peroxycarboxyliques, à savoir les acides peracétique, perpropionique, perlactique et
percitrique. Ces solutions ont été synthétisées dans les locaux de l’Université Laval dans
les conditions optimales déterminées pour l’acide peracétique par Zhao et coll. [623].
Les concentrations en acides peroxycarboxyliques et en peroxyde d’hydrogène ont été
mesurées par des dosages colorimétriques adaptés aux acides peroxycarboxyliques
aliphatiques [509]. Bien que ces dosages aient déjà été utilisés pour les acides
perlactique et percitrique qui ne sont pas aliphatiques [685], une caractérisation des
solutions par spectroscopie infrarouge aurait pu être réalisée [507].
6.1.2. Activité anti-norovirus
Dans un premier temps, chacune des quatre solutions a été testée à quatre
concentrations (50, 250, 500 et 1000 mg L-1) pendant trois temps de contact (1, 5 et
10 minutes) contre le MNV-1 en suspension. Des activités variables ont été
observées. Les acides peracétique et perpropionique se sont révélés les plus efficaces
en réduisant la charge virale d’environ 4 log10 après 5 minutes de temps de contact à
une concentration de 50 mg L-1. Il est possible que ces disparités résultent du niveau de
stabilité des radicaux libres formés par ces solutions. Les acides perlactique et
percitrique, dont la structure chimique est plus complexe, conduiraient à des radicaux
libres plus stables que les acides peracétique et perpropionique [632]. Des expériences
complémentaires ont prouvé que l’inactivation obtenue n’était due ni aux acides ni au
peroxyde d’hydrogène, mais bien aux solutions d’acides peroxycarboxyliques totales.
Ces premiers résultats sont encourageants puisque les concentrations utilisées en acide
peroxycarboxylique et en peroxyde d’hydrogène ne dépassent pas les limites maximales
autorisées par la FDA pour l’acide peracétique [518, 519].
Dans un second temps, le pouvoir virucide des acides peracétique et perpropionique a
été évalué contre le MNV-1 déposé sur des disques d’acier inoxydable et de PVC,
deux matériaux fréquemment retrouvés en industrie alimentaire. Les expériences ont
été menées en conditions propres et sales, de façon à apprécier l’impact des matières
organiques sur l’efficacité des traitements. Puisqu’il n’existe pas de consensus quant à
la composition d’une condition sale, nous avons suivi les recommandations de la norme
ASTM 2197-02. Ces solutions à une concentration de 50 mg L-1 ont permis d’inactiver le
MNV-1 d’environ 4 log10 après 5 minutes de temps de contact, sans aucune différence
126
significative entre les deux conditions. Ainsi, les matières organiques testées ne
modulent pas l’efficacité des acides peracétique et perpropionique. Cette observation est
en accord avec de précédents travaux [500, 526].
Dans un troisième temps, le pouvoir virucide des acides peracétique et perpropionique
a été évalué contre le MNV-1 immobilisé dans un biofilm artificiel créé en
laboratoire. Les biofilms naturels, comme ceux qui se forment dans les stations
d’épuration à partir des eaux usées, sont connus pour héberger des virus entériques et
notamment des norovirus humains des GI et GII [4]. Ces structures contribuent
probablement à leur dispersion, mais aussi à leur persistance en leur offrant une
protection contre les stress environnementaux tels que les agents de désinfection. Pour
caractériser cette potentielle protection contre les acides peracétique et perpropionique,
nous avons développé un protocole permettant de produire un biofilm artificiel mince
(1 mm d’épaisseur) pour se rapprocher des conditions réelles (épaisseur d’environ
50 µm) [642]. Ce biofilm artificiel est composé d’alginates puisque ces polymères sont
majoritairement retrouvés dans les biofilms naturels de Pseudomonas aeruginosa, une
bactérie fréquemment impliquée dans la formation des biofilms présents dans les
entreprises alimentaires. Contrairement à Coquet et coll. [640], nous avons utilisé ce
gel stérile car la présence de bactéries aurait pu compromettre le dénombrement des
virus par la méthode des plages de lyse. Finalement, nous avons observé une réduction
d’environ 4 log10 après un temps de contact de 5 minutes avec une concentration de
50 mg L-1, démontrant ainsi que le gel d’alginate n’empêche aucunement les solutions
d’acides peroxycarboxyliques d’atteindre les virus immobilisés.
En conclusion, les acides peracétique et perpropionique sont deux molécules oxydantes
efficaces et sécuritaires pour l’inactivation des norovirus en suspension et sur des
surfaces, même en présence de résidus organiques ou d’un biofilm artificiel. Cette étude
a confirmé des données déjà publiées pour l’acide peracétique et mis en évidence l’acide
perpropionique.
Ce
dernier
possède
un
groupement
méthyle
supplémentaire
comparativement à l’acide peracétique qui lui confère une stabilité plus importante et un
caractère moins explosif [635]. Dans ce contexte, il serait intéressant d’évaluer le
pouvoir virucide d’autres acides monoperoxycarboxyliques avec une chaine carbonée
plus longue comprenant entre quatre et sept carbones (pour garder une solubilité
maximale dans l’eau). Ainsi, les acides perbutyrique, pervalérique, percaproïque et
perénanthique pourraient faire l’objet d’une étude complémentaire.
127
6.1.3. Mécanisme d’action
Le quatrième chapitre de cette thèse porte sur le mécanisme d’action impliqué dans
l’inactivation du MNV-1 par l’acide peracétique. À ce jour, seules deux équipes ont décrit
les dommages causés par de fortes concentrations en acide peracétique sur le
bactériophage F116 [547, 548] et des adénovirus respiratoires [525, 549, 550]. Les
traitements appliqués étant sévères, les auteurs n’ont pas pu identifier les dommages
responsables de l’inactivation. De plus, les virus utilisés se distinguent des norovirus au
niveau de la taille de leur capside, du type et de la taille de leur génome. Par conséquent,
notre étude avait pour objectif de déterminer si les dommages observés sur ces virus
après un traitement sévère étaient identiques à ceux induits par un traitement modéré
et ainsi, imputables à l’inactivation des norovirus.
Ici, plusieurs techniques ont été combinées de façon à évaluer l’inactivation du pouvoir
infectieux, les intégrités de l’ARN et de la capside ainsi que la morphologie des particules
virales. Premièrement, l’infectiosité résiduelle des virus a été quantifiée par la technique
des plages de lyse. Deuxièmement, l’intégrité de l’ARN a été évaluée qualitativement
par
comparaison
des
spectres
obtenus
au
moyen
du
Bioanalyzer
(appareil
d’électrophorèse mesurant la fluorescence émise par un marqueur intercalé dans les
brins d’ARN suite à une excitation par un laser). Nous avons choisi cet appareil et non
un gel d’agarose standard suivi d’une révélation des acides nucléiques aux UV en raison
de sa sensibilité (limite de détection de 50 pg µL-1). Troisièmement, l’intégrité de la
protéine VP1 a été évaluée par comparaison des profils de migration obtenus sur SDSPAGE en conditions réductrices. Bien que la charge virale présente dans les échantillons
permettait une visualisation de VP1 avec cette technique, une analyse avec le
Bioanalyzer nous aurait donné plus d’information quant à la dégradation des protéines
(visualisation probable d’une trainée de protéines invisible sur SDS-PAGE). Finalement,
la morphologie des particules virales a été observée par microscopie électronique à
transmission en coloration inverse.
Afin d’établir une chronologie dans les dommages induits sur le virion, nous avons choisi
d’appliquer deux traitements : un traitement modéré où l’inactivation n’était pas totale
(50 mg L-1 pendant 5 minutes) et un traitement sévère où l’inactivation était totale
(1000 mg L-1 pendant 10 minutes). Les différentes analyses ont révélé que le traitement
modéré entrainait une fragmentation aléatoire importante de l’ARN viral sans induire de
changements majeurs sur la morphologie des particules ni sur les protéines VP1. Outre
une fragmentation de l’ARN plus importante, le traitement sévère a induit des
128
changements structuraux au niveau des particules virales ainsi qu’une fragmentation
aléatoire des protéines VP1. Ces résultats suggèrent donc que l’acide peracétique
inactive les norovirus en attaquant leurs acides nucléiques, probablement par
l’intermédiaire de radicaux libres. A une forte concentration, des dommages sont causés
sur les protéines de la capside entraînant par conséquent des dommages au niveau de
la structure des particules.
Pour confirmer ou infirmer que l’inactivation est seulement due à une altération de l’ARN
et pas à une modification des antigènes présents à la surface de la capside, il aurait pu
être intéressant d’appliquer une méthode supplémentaire, nommée cell-binding assay,
de façon à quantifier le nombre de virus encore capable de se lier aux cellules hôtes.
Cette méthode consiste à mettre la suspension virale en contact avec les cellules hôtes
pendant une heure à 4 °C, le temps que les virus s’y adsorbent. Une extraction d’ARN
est ensuite réalisée sur ce mélange suivie d’une quantification des ARN viraux par RTPCR en temps réel. Gilling et coll. [686] l’ont récemment utilisée pour élucider le
mécanisme d’action associé à l’inactivation du MNV-1 par l'huile essentielle d'origan.
6.2.
Lumières pulsées
Les études menées sur l’activité antimicrobienne des lumières pulsées sont assez peu
nombreuses, en particulier sur l’activité antivirale. À ce jour, cinq publications dont les
expérimentations ont été menées en phase liquide ont été recensées [503, 556, 558,
585, 586]. Seuls Jean et coll. [503] ont étudié la résistance des norovirus déposés sur
de l’acier inoxydable et du PVC. Le cinquième chapitre de cette thèse examine le pouvoir
virucide des lumières pulsées selon les conditions physico-chimiques des suspensions de
MNV-1 ainsi que le mécanisme d’action qui y est associé. Pour ce faire, nous avons
adopté la même démarche scientifique que pour les acides peroxycarboxyliques.
6.2.1. Caractérisation des traitements reçus par les échantillons
Les quelques études publiées sont difficilement comparables à cause de disparités au
niveau des équipements utilisés et des données rapportées. Par exemple, certains
quantifient l’inactivation virale en fonction de la fluence totale sans mentionner la part
d’UV du spectre reçu [558] alors que d’autres la quantifient uniquement en fonction du
nombre d’impulsions [585]. En conséquence, nous avons choisi de mesurer la fluence
totale ainsi que la quantité d’UV reçues par les échantillons. Notre appareil (SINTERON
500 de chez XenonCorp) émet un spectre continu allant de 200 à 1000 nm, avec une
129
fluence reçue par impulsion à 8 cm de la lampe qui s’élève à 0,67 J cm-2 dont 2 %
proviennent de la région UV.
6.2.2. Activité anti-norovirus
Dans un premier temps, les lumières pulsées ont été testées à quatre fluences (0,69,
2,07, 3,45 et 4,84 J cm-2) contre le MNV-1 en suspension dans différentes matrices
incluant des eaux de dureté croissante (50, 100, 150, 200 et 400 mg L-1 équivalent
CaCO3), des eaux de turbidité croissante (0, 50, 100, 200, 500 et 1000 NTU), de l’eau
minérale et des eaux usées prélevées à deux étapes de leur épuration (après dessablage
et après les boues actives). Une réduction d’au moins 3 log10 a pu être atteinte en moins
de 3 secondes (3,45 J cm-2 délivrés en 5 impulsions) dans toutes les conditions, excepté
les eaux dont la turbidité excédait 200 NTU. À la turbidité maximale (1000 NTU), le
traitement maximal (4,84 J cm-2 délivrés en 7 impulsions) a permis de réduire le MNV-1
de 2 log10. Ces premiers résultats sont encourageants puisque la fluence totale reçue
par l’échantillon ne dépasse pas la limite maximale autorisée par la FDA qui est de
12 J cm-2 [579].
Dans un second temps, les lumières pulsées ont été évaluées contre le MNV-1 déposé
sur des disques d’acier inoxydable, de PVC et de PET, des matériaux fréquemment
retrouvés en industrie alimentaire ou dans les systèmes de distribution d’eau. Ces
expériences ont été menées en conditions propres et sales. Les lumières pulsées se sont
révélées capables d’inhiber le MNV-1 d’environ 4 log10 sur les surfaces propres dès
4,84 J cm-2. En revanche, la présence de matières organiques réduit significativement
l’efficacité des traitements par un facteur 10 voire 100. La réduction minimale a été
observée sur l’acier inoxydable sale où le traitement maximal (8,98 J cm-2 délivrés par
13 impulsions) a inhibé le MNV-1 par 2,6 log10.
Dans un troisième temps, le pouvoir virucide des lumières pulsées a été évalué contre
le MNV-1 immobilisé dans un biofilm artificiel. Une inactivation totale a été
observée dès trois impulsions (2,07 J cm-2). Le gel d’alginate n’a par conséquent
nullement nui à l’efficacité des lumières pulsées. Cette observation est en accord avec
de précédents travaux [678, 679].
En conclusion, les lumières pulsées sont rapidement efficaces pour l’inactivation des
norovirus dans les liquides peu turbides et sur les surfaces propres (sans matière
protéique) même en présence d’un biofilm d’alginates. Les lumières pulsées pourraient
ainsi être appliquées sur des jus de fruits clarifiés, qui sont parfois incriminés dans les
130
épidémies de norovirus [366, 371, 457, 674], ou sur les eaux usées en sortie de station
d’épuration, qui conduisent parfois à la contamination des fruits de mer [676]. Notons
que les données obtenues dans cette étude ne sont probablement pas extrapolables aux
virus à ARN ou ADN double brin [558] parce que, si le brin codant n’est pas endommagé,
il pourrait permettre la réparation du brin non codant servant de matrice lors de la
réplication et de la transcription de l’ADN une fois le virus internalisé dans une cellule
hôte [687].
6.2.3. Mécanisme d’action
À notre connaissance, il s’agit de la première étude décrivant les effets induits par les
lumières pulsées sur la structure des virus. Le mécanisme d’action impliqué dans
l’activité antivirale des lumières pulsées a été examiné au moyen de plusieurs
techniques, dont certaines ont été présentées pour le cas de l’acide peracétique. Ainsi,
l’infectiosité du MNV-1, l’intégrité de l’ARN et des protéines VP1 ainsi que la morphologie
des particules virales ont été évaluées par la technique des plages de lyse, Bioanalyzer,
SDS-PAGE en conditions réductrices et microscopie électronique à transmission en
coloration inverse, respectivement. Aucune PCR n’a été utilisée car les UV contenus dans
le spectre émis sont connus pour induire des photoproduits empêchant la réplication
[589, 608]. En revanche, la présence de ces photoproduits a été recherchée par UPLC
en phase inverse couplée à un spectromètre de masse.
Afin d’établir une chronologie dans les dommages induits sur le virion, nous avons
appliqué deux traitements : un traitement modéré où l’inactivation n’était pas totale
(2,07 J cm-2 délivrés en 3 impulsions) et un traitement sévère où l’inactivation était
totale (8,98 J cm-2 délivrés en 13 impulsions). Les différentes analyses ont révélé que le
traitement modéré entrainait des changements structuraux des particules virales,
allant de la déformation à une déstructuration, corrélés à une dégradation de
VP1 ainsi qu’une fragmentation aléatoire de l’ARN. Les mêmes dommages ont été
induits par le traitement sévère, avec une importance accrue. De ce fait, nous pouvons
qualifier le mode d’action des lumières pulsées de double, car elles agissent à la fois au
niveau des acides nucléiques et des protéines.
Les dommages causés sur les acides nucléiques (cassures et/ou photoproduits) résultent
de l’absorption de certains photons appartenant aux UV, dépendamment de leur énergie,
par les structures aromatiques des bases puriques et pyrimidiques [551, 680, 681]. Bien
que nous n’ayons pas détecté de photoproduits, nous ne pouvons pas exclure leur
présence. Néanmoins, la fragmentation de l’ARN est suffisante pour expliquer
131
l’inactivation observée. Par ailleurs, les dommages structuraux observés sur le MNV-1
ont également été observés chez des bactéries [608] et des levures [589]. En revanche,
il est peu probable qu’ils résultent de l’effet direct des UV sur les protéines. Des études
précédentes ont en effet montré que la quantité d’UV nécessaire pour altérer des
protéines était largement supérieure à celle fournie par notre système (47 mJ cm-2 avec
le traitement modéré) et à celle nécessaire pour altérer des acides nucléiques [684].
Wekhof et coll. [578] a proposé un modèle dans lequel il explique l’explosion des
bactéries par une surchauffe ponctuelle du milieu intracellulaire. Ce modèle semble
transposable aux virus dont le contenu interne aqueux [656] pourrait être vaporisé suite
à la conversion en chaleur de l’énergie apportée par les UV absorbés.
Plusieurs études suggèrent que seuls les UV contenus dans le spectre des lumières
pulsées seraient impliqués dans l’activité microbienne [578, 609] puisque les autres
longueurs d’ondes émises semblent peu ou pas absorbées par les acides nucléiques, les
protéines ou l’eau [551]. Au contraire, d’autres études suggèrent que les UV ne sont pas
la seule région impliquée puisque des inactivations virale [586] et bactérienne [555] ont
été observée en présence de filtres bloquant les UV. Dans ce dernier cas [555],
l’inactivation a pu être partiellement induite par une augmentation de la température
car le traitement était très sévère (175 J cm-2). L’implication des UV et des autres régions
du spectre pourrait être tranchée en reproduisant ces expériences en présence de filtres.
Le verre pyrex et le plastique Makrolon bloquent par exemple les longueurs d’onde
inférieures à 305 et 400 nm, respectivement [578]. Pour pouvoir comparer les résultats
avec et sans filtres, il faudra veiller à ce que la fluence reçue par les échantillons soit
similaire dans les deux situations. Il sera alors nécessaire de jouer sur la distance entre
la lampe et l’échantillon et non sur le voltage envoyé à la lampe car le spectre émis
serait différent [555]. Par ailleurs, il serait intéressant d’évaluer la contribution des
impulsions dans l’inactivation des virus comme suggéré par Krishnamurthy et coll. [609]
pour l’inactivation bactérienne.
6.3.
Conclusion générale et perspectives
6.3.1. Les acides peroxycarboxyliques
Outre leur activité antivirale, les solutions d’acides peroxycarboxyliques exhibent aussi
des
activités antibactérienne et antifongique
peracétique à une concentration de 250 mg L
-1
[531].
Par
exemple,
l’acide
inhibe totalement Bacillus subtilis en
10 minutes et Candida albicans en 3 minutes [688]. D’autres acides peroxycarboxyliques
132
ont fait l’objet d’un brevet visant à désinfecter le tube digestif des animaux avant leur
abattage de façon à limiter les contaminations durant la découpe des carcasses. Une
inhibition de Salmonella enteritidis d’environ 1 et 3 log10 a notamment été observée pour
les acides perlactique et percitrique à une concentration de 60 mg L-1, respectivement
[685]. De plus, les bactéries, levures et moisissures ne semblent pas développer de
résistance contre ces solutions, probablement en raison du caractère aléatoire des
attaques oxydantes, comme le suggère l’absence de littérature à ce sujet. Par ailleurs,
la présence de matières organiques ne requiert pas une augmentation des
concentrations en acides peroxycarboxyliques, assurant ainsi une efficacité équivalente
dans des conditions variables. Enfin, ces molécules ont la particularité de se décomposer
en sous-produits non toxiques incluant l’acide parent, du peroxyde d’hydrogène, du
dioxygène, du dioxyde de carbone et de l’eau.
En dépit de leur coût de fabrication et des précautions à prendre pour leur entreposage,
les acides peroxycarboxyliques présentent des avantages non négligeables qui
justifieraient une utilisation plus importante pour l’assainissement des fruits et légumes
contaminés à leur surface, de l’eau utilisée pour leur rinçage, de surfaces en industries
alimentaires ou en milieu médical. Dans le cadre d’une utilisation directe sur des
fruits et légumes (fruits rouges et laitue par exemple), il serait intéressant d’évaluer
l’impact des acides peroxycarboxyliques sur les qualités organoleptique, nutritionnelle
et microbiologique (microbiotes naturels bactérien, fongique et viral) et sur la durée de
vie des produits traités.
Par ailleurs, il serait intéressant de développer une solution combinant un agent
nettoyant et un acide peroxycarboxylique pour avoir un nettoyage et un
assainissement en une seule étape. Ce produit apporterait un gain de temps pour les
industriels au niveau de l’entretien quotidien de leurs équipements tels que les tapis des
convoyeurs ou les conduites pour acheminer les liquides alimentaires. Ce mélange serait
approprié pour un nettoyage « en place » et permettrait l’assainissement efficace des
surfaces difficilement accessibles par l’homme susceptibles d’abriter des biofilms. Il
faudra veiller à ce que l’agent nettoyant incorporé soit compatible, voire synergique,
avec les acides peroxycarboxyliques.
6.3.2. Les lumières pulsées
Les lumières pulsées possèdent un pouvoir virucide, bactéricide et fongicide sans
recourir à l’ajout de substance chimique et sans induire d’augmentation de la
chaleur [584]. Une culture de Listeria innocua a par exemple été inhibée d’environ
133
7 log10 après un traitement de 0,4 J cm-2 [668]. Maftei et coll. [669] ont par ailleurs
observé une réduction d’environ 3 log10 de Penicillium expansum dans du jus de pomme
clarifié après un traitement de 16 J cm-2. Bien qu’une résistance soit peu probable,
les traitements doivent cependant être suffisamment intenses pour éviter une
réparation des bactéries, levures ou moisissures [582]. De plus, les lampes générant
les lumières pulsées sont remplies d’un gaz inerte contrairement aux lampes générant
des UV continus qui contiennent du mercure.
Bien que les lumières pulsées aient un pouvoir pénétrant relativement faible, elles
constituent une approche prometteuse pour l’assainissement de différents produits en
surface et/ou en profondeur selon leur composition, de façon à prévenir non seulement
les infections virales, mais aussi celles causées par les bactéries pathogènes. Elles
pourraient être rapidement implantées dans les industries de transformation alimentaire,
avec une installation fixe au-dessus des tapis convoyeurs de façon à traiter chaque
produit alimentaire emballé ou non en surface ainsi que les équipements autour des
produits (tapis convoyeur notamment). En réduisant la charge microbienne initiale des
produits alimentaires, aussi bien pathogène que d’altération, les lumières pulsées
permettraient d’augmenter leur durée de vie. Par ailleurs, un traitement par les lumières
pulsées de l’eau de consommation avant la distribution dans les réseaux urbains ou
avant embouteillage ainsi que des bouteilles en plastique peut être envisagé si le
plastique utilisé est transparent aux UV. Il faudrait évaluer si les lumières pulsées
peuvent remplacer les technologies déjà en place (chloration ou ozonation par exemple)
ou si elles devraient être utilisées en complément pour avoir un effet antimicrobien
maintenu jusqu’à la consommation de l’eau. De plus, les lumières pulsées pourraient
facilement être utilisées en remplacement des traitements tertiaires aux UV dans les
stations d’épuration. Étant largement plus rapides, elles permettraient un plus grand
débit de traitement. Les impulsions de lumières retarderont peut-être la formation d’un
biofilm à la surface des lampes qui réduirait l’efficacité des traitements. Cette technologie
pourrait également être mise à profit dans la conchyliculture au niveau de
l’assainissement des eaux qui sont utilisées dans les bassins de dépuration des
mollusques avant leur commercialisation.
Enfin, il pourrait également être envisagé d’associer les lumières pulsées aux acides
peroxycarboxyliques pour l’assainissement de l’eau issue du rinçage des fruits et
légumes, des petits équipements tels que des couteaux utilisés dans la découpe des
carcasses ou du matériel médical en acier inoxydable. Cette combinaison synergique
permettrait de diminuer le temps des traitements et/ou de réduire la concentration en
134
acide peroxycarboxylique et/ou d’avoir un traitement plus efficace, car les lumières
pulsées augmenteraient le taux de génération de radicaux libres.
6.3.3. Validation de leur activité anti-norovirus
Des expériences complémentaires sont nécessaires afin d’estimer la robustesse de ces
deux approches. Ainsi, l’efficacité des acides peroxycarboxyliques pourrait être testée
sur des aliments, des tapis artificiellement contaminés par le système de vomissements
« Larry » [689], des lunettes de toilettes ou des claviers d’ordinateurs. De même,
l’efficacité des lumières pulsées pourrait être évaluée sur des fruits et légumes ou dans
des stations d’épuration. Des essais à l’échelle pilote et industrielle demeurent
nécessaires pour valider les résultats obtenus à l’échelle du laboratoire. En attendant
une méthode de titration du pouvoir infectieux des norovirus humains, ces résultats
obtenus avec des modèles devraient être validés par des expériences menées avec des
souches humaines sur des volontaires, comme le suggère Richards [120]. Si ces essais
s’avèrent
concluants,
ces
approches
pourraient
être
proposées
aux
autorités
réglementaires en tant qu’outils de contrôle et de prévention des épidémies virales
d’origine alimentaire.
6.3.4. Le dilemme des norovirus humains : comment s’assurer que les virus
détectés constituent un réel danger ?
La récente revue critique de Knight et coll. [271] met en évidence le fait que les
méthodes moléculaires ou immunologiques, utilisées seules, ne permettent pas de
distinguer les norovirus humains infectieux des non infectieux. Ainsi, la détection de ces
virus n’est pas systématiquement synonyme d’infection potentielle. Dans ce contexte,
quelle stratégie pourrait être adoptée par les industriels pour vérifier la sécurité sanitaire
d’un produit ayant subi un traitement d’assainissement lors de leurs contrôles de
routine ?
Les expériences menées au cours de cette thèse nous permettent de proposer une
stratégie dans le cas particulier où les acides peroxycarboxyliques ou les lumières
pulsées seraient utilisés. Puisqu’un modèle de réplication des norovirus humains du GII.4
vient d’être découvert et sachant que les dommages induits sur l’ARN et la capside sont
aléatoires, nous suggérons une cell-binding RT-PCR adaptée à partir de la méthode
développée par Gilling et coll. [686] dont l’extraction d’ARN serait précédée d’un
traitement avec un agent intercalant (PMA) pour ne pas quantifier l’ARN libre ou présent
dans une capside endommagée tel que proposé par Parshionikar et coll. [690].
135
Dans l’hypothèse où les autres norovirus humains ne pourraient se multiplier dans ce
système in vitro, une binding-based RT-PCR précédée d’un traitement avec un agent
intercalant pourrait être envisagée. La binding-based RT-PCR a pour but de quantifier
l’ARN des virus dont les antigènes sont intacts. Ces derniers sont sélectionnés avant
l’extraction d’ARN au moyen de billes magnétiques recouvertes de ligands. Dancho et
coll. [691] ont développé une telle méthode en utilisant la mucine gastrique de porc
comme ligand. Cette substance a en effet la propriété de se lier à de multiples souches
de norovirus, car elle contient les récepteurs des groupes sanguins A, H1 et LeB [692,
693]. Li et coll. [694] l’ont appliquée avec des ligands supplémentaires, dont le
ganglioside GD1a pour détecter le MNV-1. Il s’est avéré que la quantité de virus
infectieux était surestimée en comparaison avec la méthode des plages de lyse [694].
Cette surestimation aurait peut-être été évitée si un prétraitement visant à empêcher la
quantification des ARN libres ou présents dans une capside endommagée avait été
utilisé. Toutefois, cette méthode constitue un premier pas prometteur pour la
discrimination des virus infectieux et non infectieux par des méthodes moléculaires.
136
Annexe 1.
Inactivation des virus alimentaires :
résultats récents applicables aux technologies de
transformation alimentaire
Inactivation of Foodborne Viruses: Recent Findings Applicable to Food-Processing
Technologies
Chapitre 23 du livre intitulé « Practical Food Safety: Contemporary Issues and Future
Directions » (ISBN: 978-1-118-47460-0)
Practical Food Safety: Contemporary Issues and Future Directions, First Edition.
Edited by Rajeev Bhat and Vicente M. Gómez-López.
© 2014 John Wiley & Sons, Ltd. Published 2014 by John Wiley & Sons, Ltd.
137
A1.1. Résumé
Les virus alimentaires tels que les norovirus sont devenus une préoccupation majeure
en matière de sécurité alimentaire puisqu’ils sont responsables de plus de la moitié de
toutes les maladies d’origine alimentaire. La prévalence élevée de ces virus dans le
secteur alimentaire peut être liée à plusieurs facteurs tels que leur forte persistance dans
l'environnement ainsi que leur faible dose infectieuse. Même si un traitement réduit une
charge virale initiale de 5 log10 par 1000 fois, les virions résiduels encore infectieux
(0,01%) peuvent être suffisants pour induire une maladie. Les aliments peu transformés,
tels que les bivalves ou les produits consommés frais, sont souvent impliqués dans la
transmission des virus alimentaires chez les humains. Ce chapitre présente les récentes
conclusions relatives à l'inactivation de ces virus induite par des approches physiques et
chimiques. En plus des méthodes traditionnelles utilisant la chaleur ou des composés
chimiques tels que le chlore ou les acides organiques, des technologies innovantes telles
que les hautes pressions, les lumières pulsées, l'irradiation ainsi que l'ozone ou les acides
peroxycarboxyliques sont présentées.
138
A1.2. Abstract
Foodborne viruses such as noroviruses have become a huge food safety concern, being
responsible for more than half of all foodborne illnesses. The high prevalence of
foodborne viruses in the food sector may be related to several factors such as their high
persistence in the environment and in foods, as well as their low infectious dose. Even if
a treatment reduces an initial viral load of 5 log10 by 1000-fold, residual unaffected
virions (0.01 %) may be sufficient to cause illness. Minimally processed foods such as
bivalve molluscs and fresh produce are frequently involved in the transmission of
foodborne viruses to humans. This chapter provides an update on the recent findings
relating to the inactivation of foodborne viruses using physical and chemical approaches.
In addition to traditional methods using heat or chemical compounds such as chlorine
and organic acids, innovative technologies such as high-pressure, pulsed light and
irradiation as well as ozone or peroxyacid treatments are presented.
139
A1.3. Introduction
Food safety is a great concern in both the food and health sectors. The World Health
Organization (WHO) defines a foodborne illness as a disease caused by infectious agents
transmitted to humans through ingestion of contaminated foods [10]. The number of
incidences is increasing year by year. In the United States for example, among the 216
million cases of infectious illnesses reported each year, 9.4 million are caused by
foodborne agents [614]. These are primarily viruses (59%), followed by bacteria (39%)
and parasites (2%). Among the viruses, noroviruses cause over 5 million cases of
gastroenteritis per year (more than 99% of viral foodborne illness). Sapoviruses,
rotaviruses, astroviruses and, to a lesser extent, hepatitis A virus (HAV) are other
significant causes of gastro-enteric illness [12]. Adenoviruses, hepatitis E virus,
aichivirus and enteroviruses such as poliovirus are sometimes implicated. In general,
enteric viruses are non-enveloped RNA viruses that invade the human body via the
intestine, are excreted in human feces and are transmitted by the faecal oral route.
Foodborne viruses have been the subject of a review by Greening [695].
Although it has long been known that viruses may be transmitted by foods, the first
evidence of this was reported in 1915 when raw milk was associated with the
transmission of poliomyelitis to humans. The incidence of foodborne viral illness was
underestimated
until
the
1990s
when
molecular
tools
were
developed.
Viral
contamination of foods can occur pre-harvest or at any stage in the harvesting,
processing, distribution and preparation of foods. The increasing consumption of raw
foods and the globalization of international trade have contributed to the increase in the
number of outbreaks of viral foodborne illness [696]. Shellfish, berries, herbs and salads
are the foods at the greatest risk of contamination by viruses at the pre-harvest stage.
Foods requiring more preparation and subsequently consumed raw, cold or slightly
cooked are at increased risk of contamination by food handlers. These include notably
bread and bakery goods, sandwiches or cold desserts [697]. Current food hygiene
guidelines, which are optimized for the prevention of bacterial growth, may be
insufficient against viruses [13].
Controlling foodborne viruses in the food sector represents a daunting challenge
compared to bacteria and fungi for several reasons. Their presence in foods is not
detectable without sophisticated means, since they are inert particles that do not
replicate in the absence of specific living host cells. In addition, the ingestion of only a
few virions may be sufficient to cause illness unlike bacteria, which in most cases do not
140
cause illness unless thousands of live cells are ingested. Finally, viruses withstand a wide
variety of commonly used food processing and preservation treatments and storage
conditions, unlike vegetative bacterial and fungal cells. They are also able to withstand
the extreme acidic conditions and enzymatic attacks of the host gastrointestinal tract
[696]. Viruses can persist for long periods on surfaces and in foods until they meet their
host cells and cause infection [695]. The three principal mechanisms of inactivation of
viruses are depicted in Figure A.1.
A. Damage to structures that dock on host cell receptors
host cell with host cell receptors
B. Damage to nucleic acids (breaks, dimers, partial or total degradation)
enteric virus
C. Damage to the capsid
Figure A.6.1 Overview of mechanisms of inactivation of viruses.
141
Several techniques have been developed in order to reduce microbial growth and
metabolism in foods. Nicholas Appert in 1809 invented canning as a food preservation
technique, a half-century before the existence and significance of microbial life in foods
were explained by Louis Pasteur [698]. Although thermal processing is suitable for
reducing the numbers of viable microbial cells in many food matrices, it is not applicable
to fresh produce which is eaten raw for enjoyment of texture and flavour. Heating may
alter beyond recognition the tissue structure and flavour of fruits and vegetables beyond
recognition, as well as decreasing the vitamin content. Various non-thermal processing
techniques collectively known as cold pasteurization [699] have been developed in
addition to the use of chemical additives. These must ideally be active against a wide
range of pathogenic organisms, easy to use, economical, and must not result in the
production of toxic or dangerous byproducts [700]. A treatment that reduces the
infectious viral particle titre by 3 or 4 log10 cycles is generally regarded as satisfactory
[701].
In this chapter, an overview of the antiviral effects of traditional and more recent
methods used in the food sector is presented. These treatment methods, summarized in
Table A.6.1, are divided into two major groups, namely physical and chemical.
A1.4. Physical treatments
A1.4.1.
Low-temperature-based methods
Low and high temperatures are the most widely used methods of preservation in the
food industry. These methods are based on the exchange of heat, defined as the form
of energy that can be transferred from one medium to another across a temperature
gradient.
Low temperatures refer to freezing (below -10 °C) and refrigeration (between -1.5 and
+8 °C), which increase the shelf life of the product for a limited period by slowing
enzymatic reaction rates and microbial growth. However, viral persistence might be
slightly altered at low temperature, especially below 10 °C [468, 702] as well as at room
temperature [408], regardless of the matrix (food, water, inert surface). For instance,
HAV, norovirus and rotavirus remain infectious on various frozen fruits (at -20 °C) for
up to 90 days, with reductions of less than 1 log10 [703]. These observations corroborate
data from documented outbreaks involving frozen fruits contaminated by HAV or
norovirus [368].
142
Table A.6.1 Overview of physical and chemical treatments used to inactivate foodborne viruses.
APPLICATIONS
TREATMENT
CHEMICAL TREATMENTS
PHYSICAL TREATMENTS
High temperature
UV light
Solid
foods
Liquid
foods




Food
contact
surfaces

ADVANTAGES
DISADVANTAGES
Commonly used
Not applicable to all
food products
Easy to use
Oxidation, flavour
changes
Uses mercury (toxic
vapour)
Easy to use
No toxic compounds
generated
No food quality changes
Applicable to frozen
foods
Applicable to packaged
foods
Applicable at room
temperature
Minimal change in food
quality
Thermal effects (food
surface)
Pulsed light

Irradiation

High pressure


Hypochlorous acid



Very effective in certain
situations
Toxic by-products
Chlorine dioxide



No toxic by-products
Explosive gas
Ozone


Toxic gas
Peracetic acid


Reactive with certain
materials


Negative consumer
opinion
Huge capital cost
143
A1.4.2.
High-temperature-based methods
A1.4.2.1. Principle and mode of action
High-temperature treatments, especially pasteurization and sterilization, have long been
a major processing technology in the food industry because of their significant
destructive effect on microbial life. Heat can be transferred in three ways: by convection,
conduction, or radiation. Recent advances have focused primarily on conduction (also
called ohmic heating) and on radiation (microwaves and radiofrequency waves) as heat
transfer mechanisms, while convection is regarded as conventional [698].
Heat processing is safe, chemical-free and produces tenderness and cooked flavours
while conferring long food shelf life by eliminating most, if not practically all, spoilage
organisms. However, many foods involved in outbreaks of viral illness are fresh produce
intended for consumption without heat treatment, in order to provide the enjoyment of
crunchy texture and fresh (uncooked) flavour as well as the benefit of full nutritional
value [704]. In order to preserve the market value of these products, novel non-thermal
technologies such as UV and pulsed light, irradiation and high-pressure processing are
being studied as alternative means of inactivating viruses in foods.
Temperatures higher than 65 °C inflict damage on surface molecules such as receptors
by causing irreversible modification of protein secondary, tertiary and quaternary
structures [705, 706]. Viruses subjected to such conditions lose their infectious
capability, while their nucleic acids remain detectable by molecular methods. This implies
that high temperatures do not destroy nucleic acids and that, although the viral capsid
is damaged by heat, it continues to protect the nucleic acid against the surrounding
physical conditions [598, 707]. In practice, no correlation between viral infectivity and
detection of RNA can be established. Molecular methods are therefore suitable for
establishing whether or not a heat-treated food is or has been contaminated by a virus,
but do not indicate whether or not it is safe to consume [708].
A1.4.2.2. Virus inactivation by high-temperature treatments and factors
affecting their effectiveness
Inactivation of viruses is generally much more extensive at higher processing
temperatures. Many studies have focused on the effects of light cooking on the
inactivation of enteric viruses in shellfish, since these foods are often involved in
outbreaks of viral illness [315]. These studies show that an internal temperature of 70 °C
144
is insufficient to produce significant inactivation [709-711]. It is generally assumed that
a few minutes at a temperature close to 100 °C are necessary in order to achieve more
than a 3 log10 reduction of viral titre in foods [707, 712-714] or on inert surfaces [497].
Somatic and F-specific bacteriophages have been proposed as model viruses for hightemperature treatment “worst-case scenarios”, while HAV seems to be less resistant at
temperatures above 50 °C [702].
In complex food matrices, prolonged treatments at high temperatures are needed in
order to achieve significant inactivation of viruses [702]. Heat treatments can even cause
the formation of viral aggregates depending on the type of food, the ionic composition
of the medium, the pH and the isoelectric point of the virus [715]. Protein, fat and sugar
protect virions against heat [713, 716]. For instance, whereas complete inactivation of
HAV (i.e. 5 log10 reduction) in shellfish meat required steaming to an internal
temperature of 85 - 90 °C for 1.5 min [717], 30 seconds at 75 °C were sufficient to
achieve a 6 log10 reduction of this virus suspended in buffer [718]. It has also been
observed that inactivation is faster at lower pH [712, 719].
A1.4.3.
UV light treatments
Light is a form of electromagnetic radiation, and as such transports energy from one
location to another. This energy is carried by mass-less units called photons, each with
a specific frequency and wavelength and associated electric and magnetic field
components [551]. The word light can refer to visible light or more generally to radiation
at any wavelength from 100 to 1000 nm, which includes visible light and its adjacent
spectral regions, namely ultraviolet (UV) light and near infrared (IR) radiation. In this
chapter, light refers to this broader range of wavelengths, also called photochemical.
The quantity of light reaching the target is expressed as irradiance in watts per square
meter (W m-²) or as fluence (W s m-2 = J m-2), which is irradiance multiplied by the
exposure time [553]. Proper calculation of the fluence is the most important factor in
evaluating a light treatment since it allows direct comparisons of different treatments,
regardless of the experimental setup. It is nevertheless sometimes improperly reported.
UV-C (wavelengths from 200 to 280 nm) treatment of preserved foods was discovered
in the 1930s. UV light is emitted by a mercury lamp in a continuous mode, contrary to
pulsed light [720]. The emitted spectrum can be monochromatic (253.7 nm) or
145
polychromatic (from 250 to 600 nm) depending on the vapour pressure of the mercury
[606, 721]. UV light is now used in a wide variety of industrial fields and in particular for
the treatment of solid foods, liquid foods and potable water [554, 722, 723], applications
now approved by the US Food and Drug Administration (FDA) [724].
UV light is a minimal process with many benefits including low cost, easy handling and
use, and lack of irritating or toxic byproducts [119]. Furthermore, unlike chlorine, UV
light does not cause any changes in the colour, flavour, odour or pH of water [600].
However, UV light is strongly absorbed by most of materials and cannot penetrate
beyond the surface layer of solid objects [595]. For this reason, inactivation of viruses
by UV light is subject to physical constraints and limited primarily to highly transparent
materials and non-reflective surfaces [584]. In addition, UV light may cause quality
defects such as oxidation of fats, resulting in off-flavours such as rancidity, fishiness,
“cardboard” flavour and oxidized flavour. Retinoids, a class of chemical compounds
related to vitamin A, are also very susceptible to oxidation because of their alkyl chains
with highly conjugated double bonds [725].
Data available for bacterial and eukaryotic cells, combined with those obtained for the
inactivation of viruses, have contributed to a consensus regarding the mode of action of
UV light. Nucleic acids are the principal site of the damage inflicted by UV, which induces
photoproduct formation, mostly cyclobutane dimmers of adjacent pyrimidine bases
[600]. At low levels, these photoproducts are responsible for mutations since they
interfere with normal base pairing, while beyond a certain level the organism is too
damaged to remain viable. Viruses exposed to UV light are unable to replicate and are
thus inactivated [606]. To a lesser extent, UV light affects capsid proteins, leading to
distortion of the capsid [726], exposing the genome to environmental ribonucleases (or
at least causing a loss of the ability to dock on and enter the host cell).
A1.4.3.2. Virus inactivation by UV light treatments
Most of the reported studies have been conducted with suspensions of virus in water or
buffer. These studies suggest that adenoviruses are the most resistant to UV light, while
viruses of the family Microviridae seem to be the least resistant [727-729]. There are
very few investigations of the inactivation of viruses on foods by UV light. [730]
evaluated the effect of UV light (120 mJ cm-2) on feline calicivirus, aichivirus and HAV
on the surface of lettuce, greens onions and strawberries. Reductions greater than 3 log10
were observed on lettuce and green onions but not on strawberries, regardless of the
virus tested.
146
A1.4.3.3. Factors affecting the effectiveness of light treatments
Many factors may affect the efficacy of efficacy of light treatments including UV and
pulsed-light (see following section). These are divided in two groups: those affecting the
light path and those associated with viral characteristics. The most important physical
factor is the fluence reaching the viruses in the sample. Anything that interferes with the
fluence will decrease inactivation. Fluence may be affected by treatment parameters
such as the amount of energy delivered [558], treatment duration or number of pulses
[578], or the distance from the light source to the target [503]. Parameters associated
with the sample, such as the presence of UV absorbers [595], the pH of the food [726],
and the presence of asperities or a significant microbial load on the product surface
providing protection against light [561, 594] may also affect the efficacy of pulsed-light
treatment.
The hybridization state of the nucleic acid also appears to affect the susceptibility of
viruses to photo-inactivation. Single-stranded nucleic acids are apparently more
photosensitive than double-stranded nucleic acids [558, 731]. The superior resistance
of double-stranded nucleic acids is likely due to damaged portions of a strand being
repaired using the intact opposite strand as a template [597]. Nucleic acid hybridization
state in conjunction with virus size and type appears to have an impact on the
effectiveness of inactivation by UV light treatment [732]. For example, poliovirus type 1
(7440 bases in a particle 20–30 nm in diameter) is less sensitive than the MS2 phage
(3569 bases in a particle of similar size) to the same treatment [599]. It has also been
shown that freezing/thawing before treatment increases the efficiency of the inactivation
of adenovirus type 6 by UV light [733].
A1.4.4.
Pulsed light treatments
Pulsed light technology has emerged in recent years as a new alternative to thermal
treatment for inactivating pathogens and spoilage microorganisms on foods. Its study
began during the late 1970s in Japan and a commercial process was patented in 1984
[564]. Known by several names in the scientific literature (pulsed-light, pulsed broad
spectrum white light, pulsed ultraviolet light, high-intensity broad spectrum pulsed light,
pulsed white light), this technology is based on exposing the food to pulses of light
emitted by a xenon lamp. The spectrum is polychromatic (from 200 to 1000 nm) and
147
the pulses are 20000 times more intense than the sunlight reaching the Earth's surface
[561].
The FDA has approved pulsed light treatment for the decontamination of food or foodcontact surfaces using a xenon lamp emitting wavelengths between 200 and 1000 nm,
pulse durations not exceeding 2 ms, and cumulative intensity not exceeding 12 J cm-2
[579].
As is the case for UV light, one advantage of pulsed light is that it does not produce toxic
compounds [582]. Although only a few studies have been carried out on foods, pulsed
light does not seem to alter food sensory attributes and nutritional properties [562, 581,
582, 584]. Unlike UV light, pulsed light treatment should produce minimal photooxidation because of the short pulse duration [591], and represents less of a threat to
the environment than mercury lamps, since xenon is an inert gas [582]. Due to its high
intensity and short duration, pulsed light provides effective microbial inactivation at
relatively low energy input, penetrating opaque or thick materials better than continuous
UV light and causing significantly lower product damage. In addition, it is claimed by the
manufacturers of the equipment that pulsed light has a relatively low operating cost
[584]. Its main drawback is that sample heating may occur, depending on the treatment
[593]. Shadowing can also occur, allowing microbes hidden in the food or those deep
inside colonies to escape exposure to the light [564]. For large-scale applications, the
possibility of the emergence of resistant microbes should be investigated.
The specific mechanisms by which pulsed light causes viral inactivation are not
understood. However, information is available on bacteria and fungi. The mechanisms
involved photochemical and photothermal effects. Indeed, pulsed light inactivates
microorganisms partly because the emitted spectrum includes UV light, of which the
specific effects are described in previous section [560]. Pulsed light also inactivate
microorganisms by increasing the temperature of the treated item, and thus the
microorganisms, sufficiently to vaporize a portion of the water from the microorganism.
This water then escapes in a steam flow, inducing membrane disruption and causing
their death. This overheating has been observed in fungal spores and vegetative cells of
bacteria [561, 578, 734]. We postulate that those mechanisms are also involved in virus
inactivation by pulsed light.
A1.4.4.2. Virus inactivation by pulsed light treatments
148
Studies of viral inactivation by pulsed light remain rare and difficult to compare because
of differences in the equipment used and the type of data reported [503, 556, 585].
There is one study of the efficiency of viral inactivation by pulsed light on inert surfaces,
but no study published to date of the inactivation of viruses on foods. On stainless steel
or polyvinyl chloride coated with foetal bovine serum to simulate organic matter, titres
of HAV and norovirus 1 were reduced by more than 3 log10 cycles [503].
Factors affecting the effectiveness of pulsed light treatments are discussed in previous
section.
A1.4.5.
Irradiation treatments
Food irradiation was conceived in the last years of the nineteenth century, with the
discoveries of X-rays by von Roentgen in 1895 and radioactivity by Becquerel in 1896.
Also called gamma irradiation, cold pasteurization or irradiation pasteurization [735],
food irradiation as a means of destroying bacteria has been studied since 1904 [736].
In 1983, the Codex Alimentarius Commission stated that foods receiving irradiations up
to 10 kGy were safe to eat and therefore toxicological testing was no longer necessary.
Since then, several countries have approved irradiation for food applications. The US
FDA issued a regulation (21 CFR 179.26) that specifies limitations on the fluence
permitted for specific applications as well as the type and sources of irradiation used.
This regulation allows gamma rays from cobalt-60 or cesium-137, x-rays from x-ray
generators and accelerated electron beams from electron beam accelerators. Specific
labelling and an international recognized logo (Figure A.6.2) must also appear on the
package. The statement “treated with radiation” or “treated by irradiation” must be
displayed [737].
Figure A.6.2 Internationally recognized logo for irradiated foods
Irradiation treatments can be grouped into the following three processes based on the
reduction of antimicrobial activity obtained: radurization (also called radiation
pasteurization, 0.75–2.5 kGy), radicidation (2.5–10 KGy) and radappertization
(equivalent to a 12-D heat treatment, 30–40 KGy). Radappertization is not
recommended for use in foods since it alters their properties significantly [698, 738].
149
X-rays, gamma rays and electron beams are ionizing radiations, meaning they have
sufficient energy to knock off electrons from molecules and thereby disrupt both covalent
and non-covalent bonds. In the case of viruses, ionizing radiations cause breaks in both
RNA and DNA and damage the viral capsid, leading to corruption of the viral genetic
code and distortion of viral geometry [122]. These chemical events may also be a
consequence of reactive diffusible free radicals such as hydroxyl radical, hydrogen
peroxide or hydrogen, formed by the radiolysis of water [739].
A1.4.5.2. Virus inactivation by irradiation treatments and factors affecting
their effectiveness
Few studies have focused on the effects of irradiation on viruses. In general, a treatment
of at least 3 kGy is needed to achieve a 1 log10 reduction of viral titre in foods [134, 740743]. Murine norovirus and coxsackievirus B-2 seem to be more resistant, since 7 kGy
are needed to obtain a 1 log10 reduction [122, 744, 745]. Doses up to 4.0 kGy and
5.5 kGy are currently approved by the US FDA to control foodborne pathogens in lettuce
and molluscs respectively [737]. The use of gamma irradiation is therefore quite
impractical at authorized doses as means of inactivating all viruses in fresh products. In
addition, no study has been published to date on viral inactivation by irradiation of
surfaces.
Since food products can be irradiated in the package, the possibility of post-processing
contamination is eliminated. Irradiation is also effective on frozen foods, which increases
the threshold dose usable before off-flavour develops. The properties of irradiated foods
are similar to those treated with conventional pasteurization technologies. Poultry meat,
eggs, red meats, sea products, as well as spices and other frying ingredients are good
candidates for decontamination by irradiation. Dissipation of radiation-induced offflavours or off-odours may occur during storage, and optimizing packaging conditions
and controlling packaging permeability can control changes to sensory properties to a
certain extent. Decontamination of foods by ionizing radiation is therefore considered as
a safe, efficient, environmentally clean and energy efficient process [746-748].
Ionization nevertheless requires the establishment of very strict safety rules and is very
expensive to implement. Although its safety and effectiveness have been demonstrated,
irradiation still has bad press among consumers since it involves nuclear energy. It
remains true that irradiation of foods can have a negative impact on proteins, lipids,
carbohydrates and vitamins, depending on the dose used. Indeed, irradiation of proteins
(containing phenylalanine, tyrosine and methionine) and unsaturated lipids leads to the
150
development of off-flavours, in addition to decreasing nutritional value. Excluding
oxygen and applying antioxidants decreases lipid oxidation. Irradiation can also depolymerize high-molecular-weight carbohydrates into smaller units, resulting in
softening of fruits and vegetables. The effect of irradiation on vitamins depends on the
fluence used. Thiamine is considered one of the most labile to irradiation [739, 747].
The inactivation of foodborne microorganims by ionizing radiation depends on the
irradiation fluence, the type of virus, the temperature and the food composition [738].
The degree of inactivation obtained is generally proportional to fluence, although an
inverse relationship exists between the fluence required and viral genome size [122].
Low temperatures tend to protect viruses against irradiation [743]. Finally, the
effectiveness of gamma irradiation has been found greatly affected by the presence of
proteins, which apparently capture free OH radicals before they can damage viral nucleic
acid and capsids [749].
A1.4.6.
High-pressure treatments
The first studies of the effects of high pressure on foods are those of Hite, who reported
before the beginning of the twentieth century that milk “kept sweet for longer” after a
pressure treatment of 600 MPa for 1 hour at room temperature [750]. The first pressuretreated foods became available commercially in Japan in the early 1990s [751]. Today,
high-pressure processing is also known as high hydrostatic pressure or ultra-high
pressure processing. This treatment consists of subjecting liquid or solid foods, with or
without packaging, to pressures between 50 and 1000 MPa (0.5 - 10 kbar or 7 –
145 kpsi), to inactivate microbial cells. The temperature variation is minimal (3 °C per
100 MPa, depending on the food composition) and all parts of the product are subjected
to the same pressure at exactly the same time, unlike heat processing in which
temperature gradients are created. High-pressure systems and their effects have been
reviewed [699]. Although this technology allows significant extension of food shelf life,
it does not sterilize and foods must therefore be refrigerated in order to maintain their
sensory characteristics and microbiological stability [699, 751, 752].
The use of high pressure for food has not been subject to regulation by the US FDA. In
Europe, high-pressure treated foodstuffs may be considered "novel foods" in accordance
with EC regulation 258/97. Several products have been evaluated and approved for
commercialization on a national scale, such as high-pressure pasteurized orange juice
151
(France), cooked ham (Spain), oysters (Great Britain) and fruits (Germany) [753]. High
pressure could be used to inactivate bacteriophages in milk used for cheese making
[754].
The principal advantage of high pressure is that foods can be processed at room
temperature. This ensures minimal change in the nutritional quality and organoleptic
properties of the processed food. Both packaged and unpackaged foods may be treated.
In addition, high pressure has been proven to reduce the total energy requirement by
at least 20 % compared to conventional sterilization by heat [698]. Nevertheless, some
adverse effects associated with high-pressure treatment have been reported. Colour
changes may occur in some foods. For example, fresh meat may present a cooked
appearance, due to changes in myoglobin structure [699]. A major drawback of high
pressure is the high cost of the equipment. High pressure is still considered an expensive
specialized technology, since a commercial vessel may cost GBP 500000 to 1 million,
depending on the size [751].
In terms of mechanism of action, high pressure appears to inactivate viruses by
disrupting the capsid structure. At pressures of 200 MPa and higher, ionic and
hydrophobic bonds responsible for maintaining the tertiary and quaternary structure of
capsid proteins may be disrupted without affecting hydrogen bonds or covalent bonds
[755]. Disruption of viral capsid structure likely impairs capsid functions such as
attachment, receptor binding and entry of the virus into the host cell. High pressure does
not seem to damage the genetic material, of which the integrity depends on covalent
and hydrogen bonds [756-758]. One consequence of this is that quantitative detection
of the viral genome by PCR does not measure the inactivation effect of high pressure
[759].
A1.4.6.2. Virus inactivation by high-pressure treatments and factors affecting
their effectiveness
The resistance to high pressure, or baro-resistance, of viruses is highly variable. In
general, a treatment of 500 MPa for 1 min should be sufficient to obtain at least a 3 log10
reduction of active virus in or on foods [471, 760-762]. Nevertheless, bacteriophages
ФX174, MS2, T4 and c2 resist pressures up to 500 MPa [763, 764].
The effectiveness of high pressure for inactivating noroviruses has been investigated
using in vivo assays. In a study by Gogal et coll. [765], a treatment of 400 MPa for 5 min
rendered this virus incapable of infecting mice. Similarly, oysters spiked with 104
152
infectious units of Norwalk virus (GI.1) and subsequently subjected treated at 600 MPa
for 5 min at 6 °C did not cause illness in human volunteers, while treatment at 400 MPa
was apparently not destructive to this virus [766]. In study by Lou et al. (2012), viruslike particles of human norovirus GII.4 easily resisted pressures of up to 600 MPa. The
capsid of the GII.4 strain might be more resistant to high pressure than is that of the
GI.1 strain [767], just as coxsackievirus B-5 is more resistant than coxsackievirus A-9.
The destructiveness of high pressure to viruses in foods depends on several parameters
including pressure, temperature and composition of the food matrix. Inactivation is
generally proportional to pressure, and pressure has a greater impact than treatment
time [768]. Fat, protein, carbohydrate, salinity and acidity have all been shown to
provide protection against the destructive effects of high pressure [133, 203, 769, 770].
Finally, resistance to high pressure varies within related taxonomic groups or even
strains [633].
A1.4.7.
Other physical technologies
A1.4.7.1. Ultrasound
Ultrasound is a cyclic sound pressure wave with a frequency above the human audibility
range (20 kHz or more). It is also called sonication or ultra-sonication. It is widely used
to disrupt particles including living cells. Despite the low number of reported studies, it
appears safe to say that this treatment is insufficient to inactivate significant numbers
of viruses [499, 771, 772].
A1.4.7.2. Pulsed electric field treatment
Treatment by pulsed electric fields involves the application of high-voltage electric fields
in very short pulses to food products held between a set of electrodes. This technology
is best applied to liquid and semi-liquid foods such as juices, milk, yogurt, soup or liquid
eggs, all of which contain ions that are electric charge carriers and hence conduct
electrical current. This processing can vary in terms of electric field strength, pulse
waveform, temperature, pressure and time of exposure. Although the antibacterial
effects of pulsed electric field treatment are well documented, little information is
available on its antiviral effects. The few studies carried out on enteric viruses show that
pulsed electric fields of strengths up to 29 kV.cm-1 do not produce the minimal 3 log10
cycle reduction of infectious particles required to warrant further attention [773-775].
More in-depth studies are still needed to evaluate the potential of this promising
153
technology as a new method of cold processing for the inactivation of enteric virus in
foods.
A1.4.7.3. Modified atmosphere packaging
Modified atmosphere packaging can inhibit spoilage caused by bacteria and fungi,
thereby extending food shelf life. However, it cannot inactivate enteric viruses [776].
A1.4.7.4. Reduced water activity
Reducing the water activity of a food slows down the growth rate of bacteria and other
microorganisms. However, water activity does not appear to have much effect on viruses
except for poliovirus, which seems to be less resistant than other enteric viruses [633,
777]. Studies conducted on foods corroborate this observation [778, 779].
A1.5. Chemical treatments
In general, the factors to consider when choosing a chemical disinfectant include the
organic load in the process water, the type of organic material present, exposure time,
concentration, temperature, water pH and chemistry, type of microbial organisms
present and product (e.g. vegetable) topography [119]. This section presents the
conventional hypochlorous acid treatment as well as alternative chemicals such as
chlorine dioxide, ozone and peracetic acid.
A1.5.1.
Washing
Simply washing vegetables reduces virus numbers typically by about 1 log10 regardless
of the washing method used [499, 780]. Despite the limited reduction, washing is a basic
common-sense step to apply unconditionally in order to reduce the numbers of virions
in food preparations and in viral transmission routes. The effectiveness of this step can
be enhanced by adding trisodium phosphate to the water [781].
A1.5.2.
Hypochlorous acid
Halogens are molecules of non-metal elements (group 17 of the periodic table) including
most notably chlorine (Cl). The halogens are strong oxidizers, meaning they tend to gain
electrons and form anions such as Cl-, which makes them suitable as sanitizing and
disinfecting
agents
[782].
Chlorine
compounds
are
commercially
available
as
hypochlorites (mainly sodium and calcium salts of hypochlorous acid HClO, i.e. NaClO
154
and Ca(ClO)2), chlorine gas Cl2, chlorine dioxide ClO2 and chloramines. Chloramines are
slow-release forms derived from ammonia by substitution of one, two or three hydrogen
atoms with chlorine atoms.
According to the US FDA regulation, the use of sodium or calcium hypochlorite is allowed
up to 200 mg L-1 (equivalent to 200 ppm of available chlorine) for food-contact surface
decontamination [520] and for food decontamination [519]. It is applied to fresh produce
generally at a temperature of 12–21 °C, pH 5–7, for 2–10 s as a spray or for 30 s to
5 min as flume water [119].
Hypochlorous acid is the active form of chlorine in water. Its standard potential of
oxidation is +1.49 V [783]. When dissolved in water, sodium hypochlorite (equation 1),
calcium hypochlorite (equation 2) and chlorine gas (equation 3) all generate
hypochlorous acid. Sodium and calcium hypochlorites are chlorine in alkaline form.
Sodium hypochlorite is usually sold as a liquid whereas calcium hypochlorite is usually
sold as a powder, granules or tablets [784].
(1)
NaOCl + H2O → HOCl + Na+ + OH-
(2)
Ca(OCl)2 + 2H2O → 2HOCl + Ca2+ + 2OH-
(3)
Cl2 + H2O → HOCl + HCl
Once HOCl and OH- are formed, an additional reaction occurs (equation 4) generating a
hypochlorite ion (OCl-). The equilibrium of this chemical reaction is pH dependent and
both compounds coexist in equal proportions at pH 7.4 [785, 786].
(4)
HOCl + OH- ↔ OCl- +H2O
Although hypochlorous acid is effective in many situations, it has several disadvantages.
It may react with natural organic matter to produce a variety of toxic byproducts
including trihalomethanes such as chloroform, considered as potential carcinogens [8].
Other classes of byproducts also may be produced such as haloacetic acids,
haloacetonitriles or cyanogen halides [502]. Peptides in water are of greater concern
than free amino acids because chlorinated peptides are more stable than chlorinated
derivatives of amino acids [787].
In terms of mechanism of action, chlorine seems to act differently depending on the
virus type (RNA or DNA). On RNA viruses, chlorine seems to act on the genetic material,
even at concentrations below 1 mg L-1 [788], causing the loss of the 5′ non-translated
155
region [660]. This may explain why few authors have ever detected inactivated
poliovirus with intact nucleic acid by PCR [789]. While the sequence chosen for
amplification was intact, some regions were probably lost. Chlorine may also act by
altering the capsid proteins at doses above 1 mg L-1 [660]. In the case of DNA viruses,
inactivation is due to damage to capsid proteins, especially those that direct replication
cycle processes after attachment to the host cell [790], possibly causing the release of
the viral genome into the surrounding medium. It is not known whether these differences
are due to different binding mechanisms of the viruses, different capsid protein
compositions, or reactions associated with the higher chlorine exposures required to
inactivate single-stranded RNA viruses [790].
A1.5.2.2. Virus inactivation by hypochlorous acid and parameters affecting
its efficiency
Published studies show clearly that 200 mg L-1, the highest chlorine concentration
allowed, is not effective (reduces viral infectious titre by less than 3 log10) in removing
viral contaminants from fresh produce [408, 499-501]. Similar results have been
obtained for surface decontamination [497, 498]. Baert and colleagues emphasize that
chlorine treatment of fresh produce is more useful for preventing cross-contamination
during the washing process than for reducing the number of infectious units present on
fresh produce [500]. Since porcine parvovirus is one of the most resistant viruses to
chlorine treatment, it could be used as an indicator of chlorine treatment efficacy.
The destructive effect of halogens on viruses is affected mostly by pH, temperature and
the presence of organic matter. Since the effect depends on hypochlorous acid
concentration, efficacy is greater at acidic pH. Higher temperature improves efficacy
[791-794], while the presence of organic matter in the viral sample tends to decrease
efficacy [648]. When conditions are not optimal, it is possible to compensate for low
efficacy by increasing the concentration of the active agent.
A1.5.3.
Chlorine dioxide
Chlorine dioxide is the most widely accepted English name for the molecule ClO2. The
terms chlorine oxide, anthium dioxide, chlorine (IV) oxide, chlorine peroxide,
chloroperoxyl and chloryl radical are also used [795]. The compound may be used at
residual concentrations not exceeding 3 mg L-1 as an antimicrobial agent in water for
156
poultry processing or to wash fruits and vegetables that are not raw agricultural
commodities. The treatment of fruits and vegetables with chlorine dioxide must be
followed by a potable water rinse or by blanching, cooking, or canning [649].
Several methods of generating chlorine dioxide are permitted by the FDA [649], in
particular passing chlorine gas through an aqueous solution of sodium chlorite using a
mechanical generator (equation 5):
(5)
2 NaClO2 + Cl2 → 2ClO2+2 NaCl
Chlorine dioxide at room temperature is an explosive yellowish-green gas, existing
primarily as a free radical. One of its most important physical properties is its high
solubility in water, up to 20 g L-1 or approximately 10 times more soluble than chlorine
[787, 796].
Chlorine dioxide disinfects by oxidation (standard potential of +1.28 V) but it does not
chlorinate [783, 796]. Its main advantage over other chlorine-based disinfectants is that
it reacts primarily with tertiary amines, phenols and aromatic amines and limits the
formation of harmful trihalomethanes and haloacetic acids when reacting with natural
organic matter. However, since it is explosive under pressure, it has to be produced onsite [787].
Chlorine dioxide supposedly reacts with the 5’ un-translated region of the RNA genome
[797], thus impairing the ability of the molecule to act as a template for RNA synthesis
[798]. At concentrations above 1 mg L-1, it may affect capsid proteins without promoting
virolysis [799, 800].
A1.5.3.2. Virus inactivation by chlorine dioxide and parameters affecting its
efficiency
Based on studies in buffer, a concentration of 3 mg L-1 of chlorine dioxide is sufficient to
inactivate adenovirus, feline calicivirus, HAV and coxsackievirus B-5 [801, 802].
However, no study has been conducted on foods to date. Studies of effectiveness on
surfaces suggest that chlorine dioxide should be used at concentrations reaching
500 mg L-1 for 5 minutes to ensure sufficient destruction of viruses [527]. Additional
studies are needed to validate these results.
Effectiveness may be affected by different factors including pH, temperature and
suspended organic matter. Inactivation is enhanced with increasing alkalinity and with
157
increasing temperature. Suspended matter and pathogen aggregation reduce its
disinfection efficiency [796, 801].
A1.5.4.
Ozone
Interest in ozone (O3) has expanded in recent years in response to consumer demand
for “greener” food additives, regulatory approval hurdles, and increasing acceptance of
ozone as an environmentally friendly technology [803]. The use of ozone in the food
industry has been reviewed [804, 805]. Ozone (CAS RN 10028-15-6) may be used safely
as an antimicrobial agent in the treatment, storage and processing of foods, including
meat and poultry, in the gaseous or aqueous phase [806]. It has been suggested
recently that ozone be used for other applications in the food sector such as disinfection
of food surfaces and sanitation of food plant equipment [804].
Ozone is produced commercially by passing electrical discharges or ionizing radiation
through air or oxygen. Pure ozone is an unstable pale blue gas with a characteristic
pungent odour. Although it has an oxidation reduction potential of +2.07 V, which is
much higher than those of chlorine, hypochlorous acid or hydrogen peroxide, the
reactivity of ozone is due mainly to the great oxidizing power of its free radicals, namely
hydroperoxyl (.HO2), hydroxyl (.OH) and superoxide (.O2-), which are formed
spontaneously by the decomposition of ozone in water at alkaline pH [805, 807].
High reactivity and the absence of harmful residues (excess ozone self-decomposes
rapidly to oxygen) make ozone a very attractive agent for ensuring the quality and
microbiological safety of foods [808]. Ozone is produced on-site, eliminating the cost of
storage and transportation [805]. Unfortunately, ozone is a toxic gas that can cause
severe illness and even death if inhaled in large quantities [804]. Moreover, ozone reacts
with lipids and proteins [805, 809]. It is so reactive that it would probably be more
effective for viral inactivation on pre-cut/pre-shredded produces because the surface
area is increased and therefore, the area for ozone to interact on produce is therefore
increased [810].
As an antiviral disinfectant, the primary mechanism of action of ozone appears to be
structural damage to the viral capsid, which subsequently loses its virus-host-cell
specificity and therefore its infectivity. Nucleic acids seem to be a secondary site of attack
[811-814].
158
A1.5.4.2. Virus inactivation by ozone and parameters affecting its efficiency
The few studies on viral inactivation show that treatment for 1 min is insufficient to
achieve a 3 log10 reduction or better by washing with water containing ozone at a
concentration of 6.25 mg L-1 [810]. The decomposition of ozone in the aqueous phase
of foods is so rapid that its antiviral action may be presumed to take place mainly at the
surface [807]. The potential of gaseous ozone as an antiviral disinfectant has been
evaluated. It appears highly effective for the inactivation of airborne viruses [815, 816].
In general, the antiviral activity of ozone may be affected by three factors, namely
temperature, pH and ozone-consuming compounds. Effectiveness seems to decrease as
temperature increases [817, 818], although no difference was observed between 5 and
20 °C in at least one study [819]. Viruses seem more resistant to inactivation by ozone
at low pH than at neutral pH [818], although Lim and colleagues noted that MNV-1 was
more rapidly inactivated at pH 5.6 than at pH 7. Finally, the composition of the food
matrix can interfere with inactivation by providing an abundance of reducing compounds
with which ozone reacts preferentially [810].
A1.5.5.
Peroxyacids
Peroxyacetic acid or peracetic acid is the most common peroxyacid sold for sanitization.
The US FDA has approved its use at concentrations up to 200 mg L-1 for sanitizing certain
food products (especially fruits and vegetables) and food-contact surfaces, and up to
80 mg L-1 in washing water [518-520].
Peracetic acid is produced from the reaction of acetic acid (CH3CO2H) with hydrogen
peroxide (H2O2) in the presence of sulphuric acid (H2SO4), which acts as a catalyst. This
reaction is not complete and reaches equilibrium. Peracetic acid is thus available as a
mixture containing acetic acid (CH3CO2H), hydrogen peroxide (H2O2), peracetic acid
(CH3CO3H) and water (H2O) (equation 7) [529]. It is a clear, colourless liquid with a
strong pungent acetic acid odour.
(7)
CH3CO2H + H2O2 ↔ CH3CO3H + H2O
In this chapter, peracetic acid solution refers to the mixture of the four components
described above. The main advantage of peracetic acid and the other peroxyacids is that
they do not release toxic compounds into the environment. Moreover, the efficacy of
159
peracetic acid appears indifferent to the presence of organic matter [516]. However,
there is a lack of data on the inactivation of viruses on foods and food-contact surfaces.
Very few studies have been published on the mechanism of action of peracetic acid on
viruses. Its disinfectant activity is based on the release of active oxygen [529], which
mainly alters capsid structure [525, 546, 547], leading to damage to the genome [548].
A1.5.5.2. Virus inactivation by peracetic acid and parameters affecting its
efficiency
Few studies have been conducted on the efficacy of peracetic acid against viruses. It is
presumed that the activity of this mixture is due mainly to peracetic acid, since hydrogen
peroxide must be present at concentrations of at least 10 000 mg L-1 in order to
inactivate viruses [497, 522, 534-538].
Reductions of infectious titres of HAV, feline calicivirus and murine norovirus reached 1
- 3 log10 cycles on lettuce (the only food tested) treated with peracetic acid at
concentrations of 100 - 250 mg L-1 for a few minutes [499, 500]. This compound would
therefore be more useful for preventing cross-contamination during the washing process
rather than reducing the number of infectious particles present on foods. Moreover,
studies conducted on surfaces used concentrations about 10 times higher than those
permitted by the FDA [497, 526, 527, 537]. At these concentrations, peracetic acid is
effective against most viruses except for HAV, which could be used as a reference for
disinfection by peracetic acid. The presence of organic material has little impact on the
antiviral activity [500, 521, 525]. More studies are needed to specify the nature of the
activity of peracetic acid under different conditions.
A1.5.6.
Other chemical agents
A1.5.6.1. Iodophores
Iodophores are solutions composed of iodine and non-ionic surfactants or carriers. The
US FDA approves their use for sanitizing food-handling equipment [520]. In addition,
even though they are not approved for direct contact with foods, they might have some
usefulness for treatment of produce items that are peeled before consumption [820].
Today, iodophores are applied mainly as topical antiseptics for medical and veterinary
purposes. Their use has been reviewed [462].
A1.5.6.2. Surfactants
160
Surfactants are usually organic compounds that are amphiphilic, meaning they contain
a hydrophobic portion (called the tail) and a hydrophilic portion (called the head). These
molecules can be classified according to the polar head group: non-ionic surfactants such
as Nonidet P-40, Triton X-100 or polysorbates (Tween 20) have no charged groups,
anionic surfactants such as sodium dodecyl sulphate (SDS) have a negatively charged
group, and cationic surfactants such as quaternary ammonium compounds have a
positively charged group.
Non-ionic and anionic surfactants have recently been reported as enhancers of antiviral
sanitization in fresh produce. The combination of these molecules with a commonly used
sanitizer enhanced the efficiency of the removal of viruses from fresh produce by
approximately 100-fold. The surfactants used were SDS, Nonidet P-40, Triton X-100 and
Tween 20 [821]. Since SDS is an FDA-approved food additive and polysorbates are
considered “generally recognized as safe” (GRAS) by the FDA, the implementation of
this novel sanitization strategy would be a feasible approach to reduce viral load in fresh
produce.
Quaternary ammonium compounds are a large group of cationic surfactants in which the
hydrogen atoms in the ammonium group are replaced by alkyl and/or aryl groups.
Typically, at least one of the alkyl groups is a long hydrophobic carbon chain, which
increases its surface-active properties. One of the most widely used quaternary
ammonium
compounds
is
benzalkonium
chloride
(alkyldimethylbenzylammonium
chloride). The most widespread use of these compounds is as disinfectants of hard
surfaces [462]. Their effect on enteric viruses is uncertain.
Many researchers report no destructive effect [497, 645, 822-825], while others have
observed 2 - 3 log10 reductions of infectious titre after treatment at concentrations of
0.5 mg mL-1 [826].
A1.5.6.3. Alcohols
Alcohol-based sanitizers are generally effective for reducing the numbers of enteric
viruses by at least 3 log10 cycles on human hands [643, 827-829]. However, the use of
such sanitizers does not replace hand washing with soap and water, although it might
complement it. Hospitals have already associated the use of alcohol-based hand sanitizer
alone without hand washing with an increase in the number of outbreaks of
gastroenteritis [830]. The true efficacy of alcohol as an antiviral disinfectant on surfaces
remains uncertain [526, 644].
161
A1.5.6.4. Acids
Although acids are well known as antimicrobial substances, they do not efficiently
inactivate enteric viruses. Tolerance to acid is an adaptive feature of foodborne viruses,
since they must withstand acidic pH during passage through the stomach. Nevertheless,
the combination of an organic acid (levulinic acid) and SDS reduces infectious viral titre
by more than 3 log10 on stainless steel surfaces after 5 minutes of exposure. In addition,
the presence of organic matter did not significantly affect sanitizer efficacy [831]. This
subject has been reviewed by Baert et coll. [633].
A1.6. Conclusion
Heat processing is an effective means of inactivating viruses in foods. It is not applicable
to all products however; and in view of the increasing popularity of minimally processed
foods, other agents must be examined. Chlorine-based disinfectants are widely used
despite their tendency to release toxic byproducts, since their antiviral activity on foods
and food-contact surfaces is indisputable. In view of the increasing numbers of outbreaks
of gastroenteritis associated with changing food consumption habits, it is obvious that
novel processes such as cold pasteurization are needed in order to target viruses while
maintaining the nutritional and organoleptic value of foods. The new processes also must
be less threatening to the environment. High-risk foods are becoming an ongoing
challenge to food processors, which have yet to come up with an acceptable way of
completely inactivating enteric viruses in foods or on food-contact surfaces. Further
research on the effects of viral inactivation techniques and agents in various food
matrices is urgent. Finally, it should not be forgotten that food-processing technology
must never be used as a substitute for good agricultural practices, good manufacturing
practices and proper sanitation.
162
Références
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Matzopoulos R, Mayosi BM, McAnulty JH, McDermott MM, McGrath J, Memish ZA, Mensah GA,
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