EXAMEN PARASITOLOGIQUE DES SELLES

EXAMEN PARASITOLOGIQUE DES SELLES
INDICATIONS ET LIMITES DE L’ANALYSE COPROLOGIQUE
Les indications de la coprologie portent sur la mise en évidence de parasites de l’appareil
digestif et de ses annexes ainsi que de parasites dont les adultes ont une localisation
vasculaire (Schistosomes) ou pulmonaire (Douve du poumon).
Les possibilités de l’analyse des selles sont limitées par la biologie de certains parasites :
- L’analyse coprologique est négative pendant la phase d’invasion des vers
(migration larvaire) qui varie de quinze jours à trois mois selon les vers.
Pendant cette période, l’orientation biologique (Eosinophilie) est un élément à
prendre en considération, et on doit s’orienter vers des méthodes
immunologiques permettant un diagnostic plus précoce.
- L’élimination des formes parasitaires de dissémination est variable dans le
temps, d’où la nécessité de répéter les analyses.
- Cas particulier du dépistage des Oxyures grâce au Scotch test ; les œufs de
Taenia peuvent occasionnellement être mis en évidence par ce prélèvement.
REPETITION DES EXAMENS
Trois analyses effectuées sur des selles recueillies séparément à quelques jours
d’intervalle, peuvent garantir une sécurité satisfaisante au diagnostic . La troisième peut être
pratiquée après réactivation par un purgatif salin (sulfate de magnésium à raison de 5g par
jour, 2 à 3 jours de suite). Cette épreuve présente un intérêt plus particulier dans les
Protozooses et dans la Strongyloïdose.
RENSEIGNEMENTS QUI ORIENTENT LA CONDUITE DE L’EXAMEN
Il faut fournir au biologiste certains éléments d’orientation qui le guideront dans le
choix des techniques à mettre en œuvre. Ces éléments sont :
- Le statut immunitaire du patient.
- L’origine géographique du malade : A- t- il quitté la France continentale? A- t- il
séjourné en zone intertropicale?
- Signes cliniques principaux : diarrhée, prurit, douleurs abdominales, fièvre.
- Eosinophilie sanguine.
RECUEIL DES SELLES
- S’abstenir de prendre des médicaments à base de charbon, de sels de baryum, de
magnésie, d’huiles purgatives, suppositoires, plusieurs jours avant d’envisager l’examen.
- Eviter les aliments qui laissent beaucoup de résidus (crudités notamment peau de
tomates, pommes de terre, petits pois, peau de pêche, poires, figues), ou des graisses ( noix,
olives, cacahuètes, avocats).
Trois jours avant l’examen, éliminer de l’alimentation les féculents, crudités, fruits et
remplacer par pâtes, riz, poisson, laitages.
- Recueillir la totalité de l’émission fécale dans un récipient en plastique transparent
hermétiquement fermé, et séparément des urines. Maintenir à température ambiante (sans
refroidissement) et faire parvenir le plus rapidement possible au laboratoire.
Proscrire une réfrigération qui détruirait les formes végétatives de Protozoaires et les
larves de Strongles, diminuerait la viabilité des œufs pour lesquels on envisage une
coproculture.
- En cas de diarrhée, préférer l’émission des selles au laboratoire pour un examen
dans l’heure qui suit.
- Si l’examen doit être différé, un prélèvement de glaires ou de selles liquides est
mélangé à un fixateur, aussitôt la défécation, afin de préserver les formes végétatives de
Protozoaires. Deux fixateurs sont classiquement utilisés :
MIF : Merthiolate-Iode-Formol : 2,35 ml de solution M.F. seront ajoutés à 0,15ml
de la solution iodée (et non l’inverse), dans les quelques secondes qui précèdent l’addition
de l’échantillon fécal (volume équivalent à la valeur de deux pois). Bien agiter le tube à
hémolyse. Le prélèvement se fera ultérieurement au niveau supérieur de la couche
sédimentée. La chromatine n’est pas colorée, la membrane nucléaire prend une teinte rouge
foncé, le cytoplasme rouge.
Solution mère stable de MF :
- Eau distillée
- Teinture de merthiolate n°99 à 0,1% Lilly
- Formol
- Glycérine
Solution iodée de Lugol fraîchement préparée
- Iode
5g
- Iodure de potassium
10 g
- Eau distillée
100 ml
250 ml
200 ml
25 ml
5 ml
APV : Alcool polyvinylique : mélanger dans un tube à hémolyse 1volume de glaires
ou de selles avec 3 volumes d’APV. On peut confectionner un frottis mince qui sera
séché une nuit à 37° C; ce procédé permet l’expédition d’une lame. Le frottis sera
soumis ultérieurement à une coloration élective (Noir chlorazol, Hématoxyline).
(Voir formule APV avec technique de coloration)
CONSEQUENCES D’UN RETARD A EFFECTUER L’EXAMEN
-
-
Destruction des formes trophozoïtes des Protozoaires.
Métamorphose des larves rhabditoïdes de Strongles en larves
strongyloïdes en moins de 24 heures. Au contraire, lors d’un transit
accéléré, les larves de Strongles peuvent encore se trouver dans
l’enveloppe de l’œuf pas tout à fait éclos.
Embryonnement des œufs d’Ancylostoma et de Necator pouvant aller
jusqu’à la libération de larves qu’il faudra différencier avec celles des
Strongles. Pas d’influence sur les autres œufs de vers ni sur les kystes de
Protozoaires.
EXAMEN MACROSCOPIQUE DE LA SELLE
La consistance de la selle est un élément important qui conditionnera la présence ou
l’absence de formes parasitaires.
On doit noter la présence d’éléments non parasitaires : mucus, sang, résidus
alimentaires, lambeaux de desquamation de la muqueuse intestinale.
Il faut observer la présence éventuelle de certains parasites :
- Nématodes : Oxyures et Ascaris adultes.
- Cestodes : anneaux de Taenia (parfois animés de mouvements), scolex recherchés
après thérapeutique.
- Trématodes : ce n’est qu’à la suite d’une thérapeutique que les Douves adultes
peuvent être expulsées.

Les Nématodes seront lavés en eau physiologique, puis fixés au Demke :
Fixateur de Demke :
Formol commercial :
15 ml
Acide acétique crist. :
5 ml
Glycérol :
10 ml
Alcool éthylique à 95° :
24ml
Eau distillée :
46 ml
Le fixateur doit être versé bouillant sur les vers, dans un récipient que l’on ferme ; il
doit agir au moins 2 heures.

Les Cestodes doivent être lavés en eau physiologique puis éclaircis au
Chloral-lactophénol :
Chloral-lactophénol :
Hydrate de chloral cristallisé
50g
Phénol
25g
Acide lactique
25g
L’éclaircissement s’effectue entre lame et lamelle au dessus de la veilleuse du bec
de gaz en renouvelant le réactif au fur et à mesure de son évaporation.

Les Trématodes, d’abord lavés en eau physiologique devront subir ensuite un
relâchement une nuit à 4°C dans de l’eau ordinaire, et seront enfin fixés par
le réactif de Demke.
Remarque : de mauvaises conditions de recueil des selles ou l’ingestion de certains
aliments (fromages) peuvent expliquer la présence exceptionnelle de larves de
Brachycères.
ETALONNAGE DU MICROSCOPE
La mensuration des éléments parasitaires est souvent primordiale pour leur
identification.
Matériel :
- un micromètre – objet qui est une lame de verre portant en son milieu
un trait de 1 mm divisé en 100 parties. La distance séparant deux traits
contigus est donc de 10 m.
- un oculaire micrométrique qui est un oculaire comportant une échelle
graduée.
Réalisation :
- Remplacer l’oculaire normal par l’oculaire micrométrique.
- Disposer sur la platine du microscope le micromètre-objet.
- Etablir la mise au point des 2 échelles et faire coïncider les « O » des
deux échelles.
- On repère une division du micromètre oculaire qui se superpose
exactement à une division du micromètre-objet (ces deux divisions
doivent être recherchées le plus loin possible du « O », de façon à obtenir
une meilleure précision). On peut ainsi en déduire la longueur de chaque
division du micromètre oculaire.
Micromètre objet
Micromètre oculaire
Exemple : 18 divisions du micromètre oculaire couvrent 300 m
1 division couvre donc 16,66 m
-
L’opération doit être effectuée pour les deux objectifs x10 et x 40.
Mesure :
L’élément à mesurer étant au point, il suffit de déterminer le nombre de
divisions du micromètre oculaire qu’il couvre pour obtenir sa taille.
TECHNIQUES DE ROUTINE
EXAMEN MICROSCOPIQUE A L’ETAT FRAIS : EXAMEN DIRECT
Ses conditions diffèrent selon la nature et la consistance du prélèvement, par suite de
la présence éventuelle dans les glaires et les selles liquides, de formes végétatives de
Protozoaires dont la fragilité impose des précautions particulières.
1 – Glaires muqueuses ou muco-sanguinolentes
Recherche de formes végétatives d’amibes, d’oeufs de Schistosomes.
L’analyse doit être faite immédiatement après l’émission, ou éventuellement
recueillir les glaires dans un petit récipient fermé hermétiquement et maintenu à la
température du laboratoire.
Utiliser de préférence, une platine chauffante à 37° C.
A l’aide d’un ensemenceur, prélever un fragment de glaire que l’on examinera entre
lame et lamelle. Repérer les formes végétatives grâce à leur mouvement, noter
l’hématophagie.
L’identification des formes végétatives peut être facilitée par une coloration au VF
ou au Lugol.
Coloration au VF : Violet cristal – Fuchsine basique
- Violet Cristal
50 mg
- Fuchsine basique
10 mg
- Ethanol à 95°
20 ml
- Phénol cristallisé fondu
4 ml
Après dissolution, ajouter qsp 100 ml d’eau distillée .
Une petite goutte de colorant est mélangée au prélèvement avec le coin
d’une lamelle ; les structures nucléaires apparaissent foncées, le
cytoplasme rose.
Coloration au Lugol à 1%
- Iode
1g
- Iodure de potassium
2g
- Eau distillée
100 ml
Dissoudre l’iodure de potassium dans le plus petit volume d’eau. Ajouter
lentement les cristaux d’iode jusqu’à dissolution. Ajouter le reste d’eau. Filtrer.
La chromatine ressort par contraste sur le cytoplasme beige clair.
2 – Selles liquides ou en bouse
Recherche de formes végétatives et de kystes de Protozoaires, Coccidies,
Microsporidies, oeufs et larves d’Helminthes.
Mêmes précautions que précédemment concernant les formes végétatives.
C’est le moyen le plus efficace pour diagnostiquer les trophozoïtes de flagellés.
La consistance des selles nécessite de délayer la parcelle de matière fécale, prélevée
à l’aide d’une anse métallique, avec une goutte d’eau physiologique.
3 – Selles moulées
Recherche de kystes de Protozoaires, d’oeufs et larves d’Helminthes.
L’examen direct sera effectué parallèlement à la dilution avec le réactif de
concentration Acéto-Acétique.
Cas particulier d’une suspicion de Bilharziose : effectuer un examen direct d’une
dilution du produit de raclage de la surface des selles.
EXAMEN MICROSCOPIQUE
d’une ou deux techniques de CONCENTRATION STANDARD
La méthode de BAILENGER est une technique simple, rapide et efficace pour la
mise en évidence du plus grand nombre de parasites. Les techniques de flottation
constituent, par leurs indications, un complément de très grande valeur.
1 – Méthodes Diphasiques
Technique de BAILENGER : Réactif Acéto – Acétique pH 5 / Ether
Principe : la mise en présence de 2 phases non miscibles, l’une aqueuse, l’autre
lipophile, permet la réalisation d’un coefficient de partage dont la valeur est conditionnée
pour chaque particule fécale par sa balance hydrophile / lipophile. Les parasites se
concentrent dans le sédiment. On couple l’examen direct à cette technique de concentration
dans le cas d’une selle moulée.
Réactif Acéto-Acétique :
- Acétate de Na
15g
- Acide acétique
3,6 ml
- Eau distillée
1 litre
Ajuster, si nécessaire, à pH 5 avec Acide acétique.
Technique : (illustration pages suivantes)
- Triturer dans un verre à pied, avec un agitateur, une partie de matières fécales ( 2
à 5 g), prélevées en différentes zones, dans 5 à 10 parties (selon la consistance fécale) de
réactif Acéto – Acétique. Effectuer une dilution homogène en ajoutant le réactif d’autant
plus lentement que la selle est dure.
- Effectuer un premier prélèvement (1 goutte entre lame et lamelle) en début de
dilution pour procéder à un examen direct. Maintenir en chambre humide jusqu’à la
lecture. Cette étape est surtout utile pour déceler les oeufs d’Ascaris qui se concentrent
mal.
- Poursuivre la dilution.
- Laisser sédimenter pendant 10 à 30 secondes pour éliminer les gros débris.
- Décanter dans un tube à centrifuger (environ moitié du tube), et ajouter
sensiblement le même volume d’Ether (ou légèrement moins) en laissant une collerette
d’environ 1 cm.
- Emulsionner parfaitement en oblitérant l’orifice du tube avec le pouce et en
agitant vivement. Dégazer.
- Centrifuger 3 mn à 2500 trs/min. 4 couches se superposent.
Phase éthérée
Débris
Phase aqueuse
Culot d’enrichissement : PARASITES
- Eliminer d’un geste sec les 2 phases liquides et l’anneau de débris après avoir
décollé ce dernier des parois du tube avec les mors d’une pince. Remettre rapidement le
tube en position horizontale, passer un tampon de coton sur les parois internes du tube pour
se débarrasser de toute trace de débris.
- Prélever 1 goutte de culot avec une pipette Pasteur après avoir remis en
suspension les parasites en agitant le tube. Examiner entre lame et lamelle.
La mise en évidence des structures nucléaires des kystes d’amibes peut être facilitée par une
coloration au VF ou au Lugol.
Indications :
Œufs d’helminthes
Kystes de Protozoaires
Cryptosporidies
2 - Méthodes par Flottation

Technique de JANECKSO modifiée :Réactif Iodomercurique (densité 1,440)
Réactif Iodomercurique :
- Iodure de potassium
53 g
- Iodure mercurique (Biiodure de mercure)
10 g
- Eau distillée
100 ml
Faire dissoudre l’iodure de potassium dans le plus faible volume d’eau ; ajouter le
biiodure de mercure peu à peu tout en agitant ; compléter à 100 ml.
L’inconvénient est l’action caustique, allergique et polluante du réactif mercuriel.

Technique de FAUST : Solution aqueuse de Sulfate de Zinc (densité 1,180)
Solution aqueuse de Sulfate de Zinc : solution saturée à 33 % environ.

Technique au NaCl (densité 1,2 – pH 2)
Réactif : solution saturée de chlorure de sodium à pH 2
- Acide chlohrydrique N
47,7 ml
- Eau distillée
952,3 ml
- Glycocolle
7,0 g
- Chlorure de sodium
à saturation
Principe : effectuer une dilution fécale avec un liquide plus dense que les éléments
parasitaires qui surnagent et se concentrent dans le film superficiel. Une prédilution en eau
distillée est préconisée pour le JANECKSO et le FAUST. Pour la technique au NaCl, cette
étape est inutile.
Technique : (illustration pages suivantes)
- Triturer dans un verre à pied, avec un agitateur, 5g de selles prélevées en
différentes zones. Diluer progressivement avec de l’eau distillée selon la consistance
de la selle (au 1/10 en moyenne).
- Tamiser sur un tamis métallique, et remplir un tube à centrifuger.
- Centrifuger 2 à 3 mn à 3000 trs/min. Eliminer la phase aqueuse.
- La technique de FAUST impose des centrifugations multiples (3 à 4jusqu’à
ce que le liquide surnageant soit clair.
- Diluer très soigneusement le culot avec le Réactif Iodomercurique ou la
Solution de Sulfate de Zinc ajouté progressivement au début, puis en quantité
suffisante pour remplir le tube jusqu’à ½ cm du bord.
- Centrifuger 2 min à 2000 trs/min.
- Prélever, aussitôt après centrifugation, avec une anse métallique plusieurs
gouttes du film superficiel et les déposer sur une lame.
Méthodes par flottation (suite)
Indications : oeufs d’Ankylostomes (d : 1,055), Ascaris fertiles (d : 1,110), Taenia,
Schistosomes et Douves sont souvent altérés.
Contre-indications : selles riches en lipides
Oeufs d’Ascaris infertiles (d : 1,200)
Larves d’Helminthes
Kystes de Protozoaires
EXAMEN D’UNE PREPARATION MICROSCOPIQUE
Recherche et identification d’oeufs d’Helminthes et de kystes de Protozoaires
Une goutte de la préparation à examiner est portée sur une lame porte-objet et
recouverte d’une lamelle 20 x 20 ou 18 x 18. Elle doit être suffisamment mince et
uniformément claire pour être facilement et entièrement lisible.
On effectue un examen systématique de la préparation selon le schéma suivant :
-
1 - On parcourt la lamelle à l’objectif x 10, ce qui permet de repérer les éléments
parasitaires; chaque élément intéressant est placé au centre du champ puis observé et
mesuré à l’objectif x 40.
Ceci permet : - l’identification des oeufs d’Helminthes.
- de noter la forme et la taille des kystes de Protozoaires.
La lecture de toute la préparation se poursuit ainsi à l’objectif x 10.
2 - L’identification des kystes de Protozoaires s’effectue ensuite à l’objectif x
100 à immersion. Pour cela on repère d’abord à l’objectif x 10 un des kystes précédemment
observé, puis après l’avoir parfaitement centré et avoir déposé une goutte d’huile à
immersion sur la lamelle, on l’identifie au grossissement x 1000 ( le passage à l’objectif x
40 n’est alors plus possible).
3 - En cas de difficulté quant à l’observation des structures nucléaires des kystes
de Protozoaires, il est possible de faciliter l’identification par coloration. Nous conseillons
la technique Violet cristal-Fuchsine basique : déposer une goutte du culot d’enrichissement
Acéto – Acétique sur une lame ainsi qu’une petite goutte de réactif VF et mélanger avec le
coin d’une lamelle; recouvrir de la lamelle et examiner à l’objectif à immersion.
Le Lugol à 2% peut également être utilisé.
TECHNIQUES SPECIALES
NUMERATION DES ŒUFS
Cette technique permet d’apprécier l’intensité d’une infestation (Ankylostomes), de
juger de l’efficacité d’une thérapeutique.
1 – Frottis épais de KATO et MIURA
Principe : C’est une technique de décoloration des selles qui permet de distinguer
les œufs de parasites dans une préparation des selles rendue translucide.
Réactif et matériel : Solution de glycérine-vert malachite
- Glycérine
100 ml
- Eau distillée
100 ml
- Solution de vert malachite à 3 %
1 ml
Bandes de cellophane adhésive de 20 x 30 mm immergées dans la solution
de glycérine pendant 24 heures.
Technique: Sur une lame porte-objet, déposer 50 mg de selles, recouvrir par une des
bandes de cellophane imprégnée, presser à l’aide d’un bouchon de caoutchouc pour répartir
régulièrement la selle; laisser éclaircir une heure à température ambiante. Examiner
rapidement car un sur-éclaircissement risquerait de faire passer inaperçu certains œufs
(Ankylostomes, Schistosomes).
Les résultats sont rendus en nombre d’œufs par gramme de selles.
2 – Méthode de GORDON et WHITLOCK
Principe : Diluer les selles avec une solution dense que l’on met à flotter dans une
cellule à numération de Mac Master.
Réactifs et matériel :
- Solution de sulfate de zinc à 33 % (réactif de Faust )
- Solution d’iodomercurate de potassium (réactif de Janeckso et Urbanyi)
La cellule de Mac Master est constituée de 2 lames de verre distantes de 1,5 mm; sur la
lame supérieure est délimitée une surface de 1 cm ² correspondant à un volume de 0,15 ml
et divisée en six bandes.
Technique: Dans un verre à pied et à l’aide d’un agitateur, délayer 2 g de selles avec
30 ml de réactif. Eliminer les débris volumineux par passage sur un tamis métallique. Après
agitation, introduire la dilution dans la cellule : attendre 5 mn pour permettre aux œufs de
monter et de s’appliquer contre la lame supérieure graduée, au niveau de laquelle on
effectue la mise au point avec l’objectif x 10.
Pour exprimer les résultats en nombre d’éléments par gramme de selles, multiplier par 100
le nombre d’œufs trouvés (volume 0,15 ; dilution au 1/15).
Méthode de BAERMANN et LEE
Méthode biologique de concentration des larves de Strongles
Quand la mettre en œuvre ?
Même si elle n’a pas été prescrite par le clinicien, cette technique doit être mise en
route lorsque les renseignements cliniques, épidémiologiques ou biologiques (examen de
selle négatif ou cristaux de Charcot-Leyden, séjour en zone d’endémie, hyperéosinophilie
sanguine, prurit) font suspecter une anguillulose.
Principe : On met à profit l’hygrotropisme et le thermotropisme des larves.
Matériel :
Selle
Tamis
ssssss + gaze
Entonnoir
Eau
Raccord caoutchouc
Pince
Pipette
Technique :
- Disposer une gaze sur le fond d’un tamis métallique placé dans un entonnoir.
La tubulure de l’entonnoir porte un tube de caoutchouc susceptible d’être fermé par une
pince et ajusté, par son extrémité libre, à une pipette Pasteur.
- La pince étant ouverte, verser de l’eau tiède jusqu’à la partie inférieure
du tamis. Les larves se collectent dans la pipette en deux à trois heures.
- Par manipulation de la pince, on soutire 5 à 10 ml de liquide que l’on centrifuge
lentement mais longtemps pour conserver aux larves leur mobilité. Le culot est examiné
entre lame et lamelle.
Variante : Méthode de BAERMANN et BRUG
Le tamis garni de gaze et contenant la selle est déposé sur un verre à pied contenant
de l’eau tiède, de telle sorte que le niveau de l’eau atteigne celui des selles. Au bout de 2
heures, le liquide est prélevé doucement par aspiration à l’aide d’une pipette Pasteur reliée à
une trompe à vide. La décantation est interrompue lorsqu’il ne reste que quelques millilitres
d’eau dans lesquels l’examen à la loupe binoculaire permet l’observation des larves.
CULTURE DES VERS
Quand la mettre en œuvre ?
Dans le cadre d’une suspicion d’Ankylostomose ou de Strongyloïdose, si les
techniques de concentration n’ont pas donné de résultats, une mise en culture à partir d’une
quantité plus importante de selles peut apporter un résultat positif.
Principe :
Ces vers sont capables de subir une évolution dans le milieu extérieur
Pour les Ankylostomes, l’évolution sous forme de larve permet de
différencier les genres Ancylostoma et Necator.
Pour les Strongles, la culture permet de multiplier le nombre d’éléments
parasitaires pour en favoriser l’identification.
Technique :
Les selles analysées doivent être maintenues à température du laboratoire
entre le moment de la défécation et celui de la mise en culture : une température de 37° C
ainsi que le froid altère la viabilité des larves. Dans tous les cas les selles doivent être
manipulées dans les plus brefs délais.
Nous préconisons la technique en boîte de Pétri sur bande de papier filtre;
son avantage est de pouvoir effectuer un prélèvement quotidien pour surveiller l’évolution.
- Appliquer ensemble deux ou trois lames et les entourer, sur plusieurs
épaisseurs, d’une bande de papier filtre plus étroite que la longueur des lames.
- Etaler la selle en film mince sur un côté en laissant une petite marge.
- Humidifier avec de l’eau distillée de façon à former une petite rigole
autour de la lame.
- Porter à 25 - 28° C. Humidifier avec de l’eau distillée tiède tous les
jours si nécessaire.
- Prélèvement : il s’effectue sous la loupe à la pipette Pasteur après avoir
ajouté quelques gouttes d’eau distillée avant la lecture car les larves ont tendance à se
dissimuler sous les lames. Chaque goutte prélevée sera déposée sur une lame et additionnée
d’une goutte de Formol à 5 % pour tuer les larves.
Selles
Eau
Lames + Papier
CULTURE D’AMIBES
Quand la mettre en œuvre ?
En pratique on ne la met en œuvre que lorsque les examens microscopiques ont été
négatifs et lorsque cliniquement l’amibiase est le diagnostic le plus vraisemblable.
Elle peut rendre service lorsque l’identification imprécise est gênée par un nombre
réduit de trophozoïtes. La culture en accroît le nombre.
Mise en culture sur milieu diphasique :
Support de sérum de cheval coagulé sur lequel on étale le prélèvement fécal avec
un agitateur; ajouter une ampoule de sérum de Ringer pour Protozoaires. Bien visser les
tubes. Multiplication en 24 à 48 heures à 37°C. Prélever au niveau de l’amidon de riz sans
remettre en suspension.
Etalement
de selles
Sérum de
cheval
Sérum de
Ringer
Prélèvement
COLORATIONS ELECTIVES DES FORMES VEGETATIVES DE
PROTOZOAIRES
Quand les mettre en œuvre ?
Soit lors de la recherche extemporanée sur selles non moulées ou glaires
muco-sanguinolentes.
Soit après cultures d’amibes.
1 – Le MIF qui associe fixation et coloration en tube à hémolyse est la coloration la
plus simple et la plus rapide. Elle donne d’excellents résultats pour les amibes, mais le MIF
est un moins bon colorant des flagellés.
2 – Le Noir Chlorazol (méthode de Kohn) assure, sur frottis humide de la selle, la
fixation et la coloration en 4 heures à température ambiante.
Réactifs : Alginate de Na
- Alginate de Na basse viscosité
2g
- NaCl
0,6g
- Eau distillée
100 ml
Noir Chlorazol 0,5g à dissoudre dans
- Alcool éthylique à 90°
17 ml
- Alcool méthylique
16 ml
- Acide acétique
2 ml
- Phénol cristallisé fondu
2 ml
- Acide Phosphotungstique à 1%
1,2 ml
- Eau distillée
qsp
100 ml
Laisser mûrir à la lumière plusieurs semaines.
Technique :
- Sur une lame, mélanger 1goutte de prélèvement fécal + 1goutte Alginate de Na
(améliore l’adhérence). Etaler.
- Dans une boîte de Pétri contenant du Noir Chlorazol et munie d’un chevalet,
retourner la lame (le colorant doit affleurer la lame retournée). Incuber 4 heures
à température ambiante.
-
Rincer délicatement à l’eau du robinet.
Déshydrater 1 minute par alcool (70°, 80°, 90°, 95°).
puis alcool absolu et xylène ( 1 min).
Montage à l’Eukitt ou au Depex.
3 – La coloration à l’Hématoxyline ferrique ( méthode de Goldman) s’effectue sur
frottis sec, ou sur frottis humide.
Fixation
Frottis sec:1 gtte prélèvement fécal + 3 gttes solution APV (réactif 4); étaler;1 nuit à 37° C.
Frottis humide :1gtte prélèvement fécal +1 gtte Alginate de Na ; étaler ; retourner
immédiatement la lame dans une boite de Pétri contenant le Schaudinn acétique (réactif
2) préchauffé à 56° C, il doit affleurer la lame retournée. Mettre à 56°C pendant 10min.
Réactif 1 : Sublimé : solution aqueuse de HgCl2 à saturation (dissoudre à chaud
10% du sel puis refroidir)
Réactif 2 : Fixateur de Schaudinn acétique
2 volumes de Sublimé
1 volume Ethanol à 95°
Au moment de l’emploi, ajouter 5% d’acide acétique cristallisable.
Réactif 3 : Schaudinn acétique - Glycérol
98,5 ml Schaudinn acétique
1,5 ml Glycérol
Réactif 4 : Solution d’APV :
100 ml de Schaudinn acétique-Glycérol
5g d’APV (90-50 basse viscosité liquide).
Porter à 75° C au Bain Marie sous agitation.
Après fixation (frottis sec ou humide), passer successivement dans les bains suivants :
Alcool iodé à 70° 5 min
Alcool 50° 2 fois 5 min
Rincer 15 min sous un filet d’eau du robinet.
Coloration à l’Hématoxyline ferrique
Réactif de Goldman :
Solution 1 : Hématoxyline 1% dans Ethanol à 95°
Solution 2 : Sulfate d’ammonium ferrique 20g
Acide acétique
5 ml
Acide sulfurique
0,6 ml
Eau distillée
500 ml
Mélanger au moment et à volumes égaux les solutions 1 et 2; filtrer.
Diluer ce mélange dans un volume égal d’Acide phosphotungstique à 0,5 %.
Technique :
- Immerger dans le réactif de Goldman 10 min les frottis secs
5 min les frottis humides fixés
- Passer les lames dans 2 borrels avec Acide phosphotungstique 2% :
Borrel 1 : 2 à 3 immersions
Borrel 2 : 15 min pour frottis sec
10 min pour frottis humide
- Rincer 15 min sous un filet d’eau du robinet .
- Déshydrater 1 minute par alcool (70°,80°,90°, 95°).
puis alcool absolu et xylène ( 1 min).
- Montage à l’Eukitt ou Depex.
COLORATION DES CRYPTOSPORIDIES
Techniques de coloration temporaire des Cryptosporidies
(n’ayant qu’une valeur d’orientation)
1 – Lugol à 2 %
Mélanger 1 goutte de selle liquide + 1 grosse goutte de Lugol 2 %
Lecture dans les 5 min à l’objectif X 40 : Cryptosporidies réfringentes
Levures jaune – brun
2 – Vert Malachite 5 %
Mélanger 1 goutte de selle liquide + 1 petite goutte de Vert malachite
Lecture dans les 5 min à l’objectif X 40 : Cryptosporidies réfringentes
Levures vertes
Technique de coloration permanente d’Henriksen et Pohlenz
La recherche de Cryptosporidies doit s’effectuer devant toute diarrhée persistante
chez un immunodéprimé.
Ce protozoaire a pu également être incriminé comme cause d’épidémies régressant
en quelques jours dans les crèches et écoles maternelles chez des enfants
immunocompétents.
Réactif : Fuchsine phéniquée : 10ml solution A + 90ml solution B
Solution A : Fuchsine de Ziehl
- Fuchsine basique
15 g
- Ethanol à 95°
100 ml
Solution B : Eau phéniquée
- Cristaux de Phénol
- Eau distillée
5g
100 ml
Technique :
- Faire sécher sur une lame 1 goutte de selle liquide ou de culot de concentration.
- Fixer au Méthanol
5 min
- Sécher
- Colorer par la Fuchsine phéniquée
1 heure
- Rincer à l’eau du robinet
- Différencier par H2SO4 2%
10 à 20 secondes
- Rincer à l’eau du robinet
- Contre-colorer par une solution de Vert Malachite à 5 % :
Sur un cristallisoir, laisser un peu d’eau du robinet sur la lame et ajouter
quelques gouttes de Vert Malachite ; homogénéiser.
- Rincer à l’eau du robinet. Sécher.
Lecture à l’objectif X 100 à immersion : la contre-coloration permettra de
différencier les levures qui se colorent en vert alors que les Cryptosporidies (3 à 5 m)
prennent une teinte qui varie du rose pâle au rouge vermillon, faisant apparaître quatre
sporozoïtes en forme de croissant autour d’une zone claire plutôt centrale.
COLORATION DES MICROSPORIDIES
par la technique de Weber modifiée
Les microsporidies sont trouvées chez 10 à 15 % des patients VIH positifs et atteints
de diarrhée; dans 80 % des cas Enterocytozoon bieneusi est en cause.
Réactif de Weber : Mélanger les colorants et l’acide :
- Chromotrope 2R
6g
- Vert rapide
0,15 g
- Acide phosphotungstique
3 ml
Attendre 30 mn et ajouter 100 ml d’eau distillée.
Technique :
- Réaliser un frottis très mince sur 1 cm² avec 10 l de selle liquide.
- Sécher.
- Fixer au Méthanol.
5 min
- Sécher.
- Colorer au Weber.
90 min
- Décolorer dans un bain comprenant :
10 secondes
Alcool à 90° 995,5 ml
Acide acétique 4,5 ml
- Rincer rapidement dans de l’Alcool à 90°.
- Déshydrater successivement 1 min : Alcool à 95°, Alcool absolu, Xylène.
- Montage au Depex.
Lecture à l’objectif X 100 à immersion : la coloration des Microsporidies (2 m)
semble souvent renforcée à l’équateur avec un aspect asymétrique de la spore dû à la
vacuole polaire.
SCOTCH TEST
Méthode de Graham ou des lames adhésives
Les œufs d’Oxyures sont rarement retrouvés lors de l’examen parasitologique des
selles sauf en cas d’hyperinfestation. Ils se situent sur la marge anale où ils sont libérés par
le ver femelle en général le soir (prurit vespéral). Un interrogatoire médical soigneux
permet souvent de faire le diagnostic d’oxyurose mais en cas de doute cette recherche est
demandée.
Prélèvement : le matin, avant la défécation et la toilette, appliquer le côté adhésif de
la lame sur les bords de la marge anale. Rabattre la bandelette protectrice à sa place initiale
c’est-à-dire sur l’enduit adhésif qui a permis le prélèvement.
Examen microscopique : les œufs sont repérés par leur réfringence à l’objectif
X 10 et confirmés à l’objectif X 40.
Cette technique permet aussi de retrouver parfois des embryophores de Taenia sp.
TECHNIQUE D’IDENTIFICATION DES ŒUFS DE SCHISTOSOMES
sur produit de raclage rectal ou biopsie rectale
effectués sous rectoscopie
-
Coloration à la Fuchsine phéniquée :
La coque des œufs se colore en rouge.
Décoloration à l’Alcool chlorhydrique :
Seuls les œufs de Schistosoma haematobium se décolorent.
La coque des autres espèces portent une substance alcoolo-acido résistante.
Contre coloration au Bleu de Méthyle :
La coque des œufs de Schistosoma haematobium se teinte en bleu « outremer ».