Un clone de cellules souches embryonnaires ou « Embryonic Stem

Un clone de cellules souches embryonnaires
ou « Embryonic Stem Cells » ou « ES cells »
REGENERATION
Cellules souches et Régénération
Les méristèmes situés à l’extrémité des tiges et
racines sont des amas de cellules souches à la base de la
formation des organes aériens: feuilles, tiges, fleur
Le foie est un organe doué d'une fantastique capacité à régénérer.
Ainsi, si on réalise une ablation de 70 % de la masse hépatique chez
le rat, il existe une récupération intégrale en 7 à 10 jours
Régénération chez les métazoaires : hydre, planaire, salamandre
La capacité de régénération des planaires est conférée par les « néoblastes »
Néoblastes =
Population de cellules souches somatiques
distribuées dans tout le mésenchyme du corps
des planaires adultes
-Totipotentes à haut potentiel prolifératif
Rôle:
Renouvellement des cellules différenciées
Formation du Blastème de régénération
Permettent une reproduction asexuée
Les néoblastes sont les seules cellules
mitotiquement actives chez les planaires
Incorporation de BrdU 24h dans un animal intacte.
(2009)
La métamorphose chez les insectes holométaboles
Clusters of stem cells within each organ proliferate to form the adult organs as larval
organs degenerate
PLASTICITE DU DEVELOPPEMENT
Ascidie : œufs en mosaïque
Chordés marins vivant fixés dont les formes larvaires
sont libres. Notocorde + somites
Développement de l’ascidie
La 1ère division partage l’œuf en une moitié droite et une moitié gauche
La 2ème division en une moitié antérieure et une autre postérieure
Présence de déterminants cytoplasmiques décisifs pour la différenciation dès le stade œuf
chez l’ascidie, et qui sont élaborés progressivement pdt l’embryogenèse des mammifères
placentaires.
Développement de type « mosaïque » de l’œuf d’ascidie
Embryologie expérimentale
Expérience de Chabry (1887)
Destruction d’un blastomère au
stade 2 de l’ascidie qui entraîne la
formation anormale d’un demiembryon.
Roux (1888) retrouve le même
phénomène chez l’œuf fécondé de
grenouille.
Oursin : œufs à régulation
Expérience de Driesch (1892) ---> concept de développement régulé – interaction inhibitrice
au cours du dévt naturel comme chez les mammifères (jumeaux).
Plasticité du développement précoce de l’embryon de mammifère
Fusion de morula ou injection d’une seule cellule de la MCI du donneur dans MCI du rec.
Souris de taille normale dont les tissus sont constitués des 2 types de cellules
L’origine du concept de cellules souches
dans les années 50
Après un accident corporel, la quantité normale de sang se reconstitue
normalement. Cela implique que des cellules sanguines restent dans un
état immature dans la moelle des os et la rate. Les histologistes se
sont dit que ce devait être là que les cellules sanguines étaient
régénérées.
Hiroshima
8h15 - 6 août 1945
les « pères de la recherche sur les cellules souches »
Ernest McCulloch et James Till
Toronto, 1961
2 théories s’opposent :
- la théorie polyphylétique
- la théorie monophylétique
Ils apportent la preuve
expérimentale de l'existence d'une
cellule souche hématopoïétique
multipotente chez la souris
ren.
Idée de la dose minimale injectée :
Au lieu de reprendre une forme normale,
la rate forme des nodules indépendants
contenant tous les types cellulaires à
l’exception des lymphocytes
à Multipotence des cellules souches
La CS a donné naissance à d’autres CS
Autorenouvellement
ß
Mono ou polyphylétique ??
Deux souris donneuses de sang, l’une des deux
avait une anomalie chromosomique avec deux
chromosomes joints (mais souris normale)
permettant de reconnaître de quel donneur
provenaient les nodules.
Si une seule cellule donne un nodule, tous les
types cellulaires du nodule doivent avoir le même
caryotype. C’est bien le cas !
àThéorie monophyléthique
une seule cellule souche multipotente donne
naissance à tous les types hématopoïétiques
Expérience: on a réussi à reconstituer le sang
d’une souris avec une seule cellule souche
hématopoïétique
Cellule progénitrice multipotente
qui n’est plus ni totipotente, ni
pluripotente
LES CELLULES SOUCHES
CELLULES SOUCHES
Embryon - fœtus
Formation des organes et des tissus
(200 types cellulaires différents acquisition de fonctions spécialisées et
organisées - organogenèse)
Adulte
Le renouvellement, la régénération, la
réparation des tissus, afin d’assurer la
pérennité des fonctions physiologiques
Embryonnaires
Germinales
Adultes
CELLULES SOUCHES
L’embryogenèse peut se dérouler
normalement in vitro jusqu’au stade
blastocyste chez la souris ou l’homme.
Au-delà, l’embryon a besoin des
conditions fournies par son implantation
dans l’utérus maternel, d’où la nécessité
d’une mère porteuse (PMA).
Qu’est ce qu’une Cellule Souche ?
Cellule indifférenciée, issue de l’embryon, du fœtus ou de
l’adulte qui possède des capacités particulières:
- AUTORENOUVELLEMENT; multiplication à l’identique
pour produire de nouvelles cellules souches.
- POTENTIALITÉ; dans certaines conditions, elles peuvent
engendrer des cellules hautement spécialisées. Ce choix est
influencé par des facteurs intrinsèques ou envir. "niches".
- PROLIFÉRATION prolongée en culture
- CLONOGÉNICITÉ in vitro – Lignées ES, souris KO
- RECONSTITUTION des tissus après lésions. Thérapie
cellulaire, régénération, réparation, méristèmes
- RECHERCHE – fonctionnement des êtres multicellulaires
Division asymétrique
Les trois types de cellules souches des vertébrés
1. Les cellules de l’embryon précoce (zygote, morula) correspondant à
un état transitoire où les cellules sont TOTIPOTENTES
2. Les cellules souches restreintes à un lignage cellulaire déterminé qui
servent à construire l’embryon pendant le développement embryonnaire
- les cellules ES sont PLURIPOTENTES (endo, méso, ectoderme)
- les cellules MULTIPOTENTES sont à la base de la formation d’un tissu,
d’un organe. Ex: les cellules souches hématopoïétiques produisent des
progéniteurs multipotents (lymphocytes, macrophages, plaquettes, etc..)
3. Les cellules souches de l’adulte qui servent au renouvellement des tissus
et qui sont MULTIPOTENTES
Différenciation de la moelle épinière chez les vertébrés
précurseur
neural
zone
ventriculaire
neuroepithelium
zone du
manteau
lumière du tube
neural
tube
neural
plaque du
plancher
notocorde
Cellules souches
Division symétrique
cellule
post-mitotique
Cellules en transit
Cellules différenciées
Division asymétrique
Potentialité de
différentiation des
cellules souches
Greffe de cellules souches hématopoïétiques issues
de cordon ombilical
• Cellules jeunes immatures du cordon, prélèvement facile, rapide, indolore, éthiquement
accepté, réservoir très important, 135 millions de naissances dans le monde chaque année.
• Après l’accouchement, on prélève environ 100 ml de sang de cordon dans la veine
ombilicale.
• Extraction des cellules mononuclées séparées par centrifugation en 30 min. Les cellules
sont cryoconservées.
• 85 maladies pourraient être traitées avec les cellules souches de cordon.
• Une législation obsolète en France. On est actuellement au 16ème rang mondial pour le
stockage des poches. Actuellement, 7000 stockées alors qu’il en faudrait 50000 en France et
on importe des poches de l’étranger pour 15 à 25000 € la poche.
• La conservation familiale privée est faite à l’étranger actuellement, voire les femmes
accouchent à l’étranger.
• Pourtant ! La première greffe de sang de cordon fut réalisée avec succès en 1988 à
l’Hôpital St Louis chez un enfant atteint d’anémie de Fanconi.
Au cours du développement embryonnaire, les cellules sont produites en excès
La mort cellulaire permet de réguler la taille des organismes et de sculpter
leur forme
Homéostasie cellulaire :
L’état d’un tissu représente un équilibre entre la mort et le remplacement
de ses cellules assuré par les cellules souches qu’il contient.
La mort cellulaire est aussi importante que la production de nouvelles
cellules. L’homéostasie cellulaire est un rempart contre le développement de
tumeurs
Composé de plusieurs dizaines de milliards de cellules, on estime que
l’organisme humain en perd chaque année, par le processus normal de suicide
cellulaire, une quantité qui correspond au poids de son corps
Comme Phénix, l’oiseau mythique, nous renaissons chaque jour de nos cendres !
Les trois types de cellules souches des vertébrés
1. Les cellules de l’embryon précoce (morula, blastocyte) correspondant à
un état transitoire où les cellules sont TOTIPOTENTES
2. Les cellules souches restreintes à un lignage cellulaire déterminé qui
servent à construire l’embryon pendant le développement embryonnaire
- les cellules ES sont PLURIPOTENTES (endo, méso, ectoderme)
- les cellules MULTIPOTENTES sont à la base de la formation d’un tissu,
d’un organe. Ex: les cellules souches hématopoïétiques produisent des
progéniteurs multipotents (lymphocytes, macrophages, plaquettes, etc..)
3. Les cellules souches de l’adulte qui servent au renouvellement des tissus
et qui sont MULTIPOTENTES
La fécondation
Stade 2 cellules
Embryons de 9 jours
Blastocyste
Naissance des souriceaux vers le 19ème jour
1981: on sait cultiver les cellules ES
GB :
Nature. 1981 Jul 9;292(5819):154-6.
Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.
Evans MJ, Kaufman MH.
EU :
Proc Natl Acad Sci U S A. 1981 Dec;78(12):7634-8.
Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in
medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.
Martin GR.
Conditions de culture permettant de maintenir les cellules ES de la MCI dans un état de
prolifération infinie. Les cellules ES sont cultivées sur une couche de cellules
nourricières fibroblastiques. Elles peuvent être retransplantées indéfiniment et
fournissent des lignées permanentes euploïdes à 40 chromosomes alors que des cellules
tumorales sont aneuploïdes.
Blastocyste
Origine des cellules ES
Culture des cellules ES de souris
or LIF (Leuk. Inh. Factor)
Evans et al. 1981 Nature
Martin et al. 1981 PNAS
Un clone de cellules ES
Rappels : génome, nb gènes, types séq.,
Caryotype normal
Trisomique 21
pour obtenir une souris transgénique
C’est un gain de fonction
Souris transgénique à droite surproduisant l’hormone de croissance
et donc plus grande que la souris sauvage
Un modèle murin de maladie d’Alzheimer
Production de souris chimères
Qu’est ce qu’une Cellule Souche ?
Cellule indifférenciée, issue de l’embryon, du fœtus ou de
l’adulte qui possède des capacités particulières:
- AUTORENOUVELLEMENT; multiplication à l’identique
pour produire de nouvelles cellules souches.
- POTENTIALITÉ; dans certaines conditions, elles peuvent
engendrer des cellules hautement spécialisées. Ce choix est
influencé par des facteurs intrinsèques ou envir. "niches".
- PROLIFÉRATION prolongée en culture
- CLONOGÉNICITÉ in vitro – Lignées ES, souris KO
- RECONSTITUTION des tissus après lésions. Thérapie
cellulaire, régénération, réparation, méristèmes
- RECHERCHE – fonctionnement des êtres multicellulaires
Blastocyste
Une nouvelle façon de produire
des souris chimères
à partir de cellules ES
le 8 octobre 2007 :
1
Le prix Nobel de médecine 2007
a été attribué aux Américains Mario Capecchi1
et Oliver Smithies2, ainsi qu'au Britannique
Martin Evans3, pour leurs travaux sur
les cellules souches.
3
2
Cellules souches embryonnaires de souris.
• Capacité de se multiplier indéfiniment en donnant de nouvelles cellules souches
• Possibilité de se différencier en cellules matures (nerveuses, sang, foie, peau, etc..)
• Les cellules souches sont présentes au stade embryonnaire, et dans l'org. adulte
• Espoir de thérapies cellulaires (Parkinson, Alzheimer, Huntington, etc.),
1ère étape :
La construction d’un vecteur ADN qui
provoquera l’inactivation d’un gène particulier
dans les cellules ES
2ème étape :
L’électroporation du vecteur dans les cellules ES
dans lesquelles s’opère la recombinaison
homologue entre le vecteur et le locus ciblé
Les cellules ES poussent en présence de G418
3ème étape :
Criblage des cellules ES recombinantes
dans lesquelles a eu lieu la recombinaison
homologue par :
1.
addition de G418 dans le milieu
2. criblage par PCR
3. Southern blot
4. Caryotype
Principe de la PCR
Recherche des cellules ES recombinantes par PCR et
électrophorèse des fragments d'ADN sur gel d’agarose
Southern blot
On vérifie que la recombinaison homologue s’est
opérée normalement (sondes internes et externes),
puis on hybride le blot avec une sonde Néo – pourquoi ??
4ème étape :
Injection de qq cellules ES modifiées issues
d’un seul clone ES dans la cavité d’un
blastocyste de souris sauvage
Comment choisir la lignée de cellules ES et la souris receveuse ??
Injection de cellules souches modifiées
dans la cavité d'un blastocyste de souris.
5ème étape
Réimplantation de plusieurs blastocystes dans une femelle
pseudogestante
Obtention d’une souris chimère
Comment la repérer dans la cage ??
et…. INCH'ALLAH !!
La thérapie cellulaire à partir des
cellules souches embryonnaires
peut entraîner :
- Le rejet immunologique
- Le développement de tumeurs
à Clonage thérapeutique
à iPS ou induced pluripoent cells
Perspectives de médecine régénérative
Cellules souches embryonnaires humaines
Un espoir de médecine régénérative
Cellules souches et cœur
Cellules souches embryonnaires : ES
Les cellules ES sont source de cellules progénitrices cardiaque isl1+
Moretti et al., Cell 2006
Cellules ES Knock in Isl1-lacZ
Différenciation de la moelle épinière chez les vertébrés
zone
ventriculaire
précurseur
neural
zone du
manteau
lumière du tube
neural
tube
neural
plaque du
plancher
notocorde
Division symétrique
cellule
post-mitotique
Division asymétrique
Contrôle de la différenciation des cellules souches neurales (3)
Les facteurs extrinsèques
Faire des cellules ES hum. à partir d’un ovocyte énucléé ayant reçu un noyau 2n somat.
Ces cellules ES permettraient de réparer des tissus déficients chez l’homme
Obtention de clones de grenouilles à partir de noyaux mâles de l’épith. de l’intestin
Inefficace chez les mammifères : seulement de 1 à 3% de naissances par rapport
au nombre d’ovocytes énuclées
Cette petite souris brune est née du clonage de noyaux cellulaires
provenant du cerveau d'un mâle mort en 1992, c’est-à-dire 16 ans plus tôt !
Proc. National Academy of Sciences, PNAS (2008)
d’où Jurassic Park..
Le seul chien cloné à partir d’un noyau d’une cellule somatique de sa mère
Clonage de bovins
17 vaches clonées à partir d’un seul donneur d’une biopsie de peau de 1 cm2 prélevée à l’âge
adulte. Les cellules sont cultivées pdt 2 semaines. 96 embryons ont été transplantés au stade
blastocyste dont 17 ont survécu et se sont développés normalement.
Takahashi et al. Cell 2007
L’idée est de ne plus utiliser les cellules embryonnaires qui posent des problèmes éthiques
mais de partir de cellules somatiques prélevées chez une personne adulte
Procédures pour tester la pluripotence des cellules souches
Les souris chimères faites à partir des
iPS produisent des gamètes issues des
iPS.
Ces souris chimères ont été croisées
avec des souris normales et des petits
avaient la couleur des souris dont
provenaient les fibroblastes originels.
On a donc pu obtenir des gamètes et
une descendance à partir de cellules
de la peau d’un adulte !!
Integration of Transplanted ES Cell-Derived Motor Neurons into the
Spinal Cord In Vivo
(A) Implantation of HBG3 ES cell-derived MN-enriched EBs into
stage 15–17 chick spinal cord.
(B) Bright-field/fluorescence image showing eGFP+ MNs in thoracic
and lumbar spinal cord, assayed at stage 27 (ventral view).
(C and D) Location of FACS-sorted ES-cell derived eGFP+ MNs in
thoracic spinal cord, assayed at stage 27. eGFP+ MNs are
clustered in the ventral spinal cord (D).
(E–J) Transverse sections through stage 27 chick spinal cord at rostral
cervical levels after transplantation of MN-enriched EBs. MNs
are concentrated in the ventral spinal cord and are segregated
from transplanted interneurons, labeled by a mouse-specific Lim2
antibody (E). Many ES cell-derived MNs coexpress eGFP and
Lhx3 (F). ES cell-derived MNs (G) and axons (arrow, H) are
labeled by rodent-specific anti-NCAM antibody, but do not
express the chick MN marker protein SC1 (I and J). eGFP−,
NCAM+ axons cross the floor plate but do not project out of the
spinal cord (arrows, G and H).
(K–N) Transverse sections of thoracic spinal cord at stage 27, after
grafting EBs grown with RA (2 μM) and anti-Hh antibody (5E1,
30 μg/ml). No mouse-derived MNs were detected either by eGFP
(K) or by a mouse-specific anti-HB9 antibody (L). In contrast,
many mouse-derived NCAM+ (M) and Lim2+ (N) interneurons
are present.(O–Q) Transverse sections through stage 27 spinal
cord at thoracic (O and P) and lumbar (Q) levels after grafting
MN-enriched EBs. eGFP+ MNs are concentrated in the ventral
spinal cord. Ectopic eGFP+ MNs are located within the lumen of
the spinal cord. eGFP+ axons exit the spinal cord primarily via the
ventral root and project along nerve branches that supply axial
(O–Q), body wall (O and P), and dorsal and ventral limb (Q)
muscles. The pathway of axons is detected by neurofilament (NF)
expression. eGFP+ axons are not detected in motor nerves that
project to sympathetic neuronal targets.
Cellules souches pluripotentes induites iPS
Re-programmation de cellules adultes différenciées
iPS Souris
Takahashi et Yamanaka Cell 2006
iPS Homme
Takahashi et al Cell 2007
Adult cells
(Skin fibroblast)
Healthy or
diseased
individual
OCT4
SOX2
KLF4
Myc
Genetic
repair
Self-renewal
iPS cells
Transplantation
Differentiation
Science 2008
Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can
be differentiated into motor neurons.
Dimos JT, Rodolfa KT, Niakan KK, Weisenthal LM, Mitsumoto H, Chung W,
Croft GF, Saphier G, Leibel R, Goland R, Wichterle H, Henderson CE, Eggan
K.
Harvard Stem Cell Institute, Stowers Medical Institute, Department of Stem Cell
and Regenerative Biology, Harvard University, Cambridge, MA 02138, USA.
We have generated iPS cells from an 82-year-old woman diagnosed with a familial form of
amyotrophic lateral sclerosis (ALS). These patient-specific iPS cells possess properties of
embryonic stem cells and were successfully directed to differentiate into motor neurons, the
cell type destroyed in ALS.
Pourtant, il existe des différences dans la différenciation des cellules
iPS comparée à celle des cellules ES (analyse de l’article Hu et al.,
2010)
Fig. 1. iPS cells can be established from patient fibroblasts after biopsy.
(A) Primary dermal fibroblasts (hFib, human fibroblasts) derived from an 82-year-old female
ALS patient, A29. (B) iPS cells produced from patient A29. (C) iPS cells produced from a
second patient, A30, sister to patient A29. (D) Direct sequencing of a PCR product from A29
iPS cells, confirming the presence of one copy of the dominant L144F SOD1 allele. (E and
F) SSEA-4 and NANOG protein expression in A29 iPS cells.
J T Dimos et al. Science 2008;321:1218-1221
Fig. 3. Patient-specific iPS cells are pluripotent stem cells.
(A) EBs formed from A29b iPS
cells, 5 days after seeding.
(B to F) These EBs contained
cells representative of each of
the three embryonic germ
layers: endoderm [(B), αfetoprotein (AFP)], mesoderm
[(C), desmin; (D), α–smooth
muscle actin (α-SMA)], and
ectoderm [(E), β-tubulin IIIb
(TuJ1); (F), GFAP].
J T Dimos et al. Science 2008;321:1218-1221
Fig. 4. iPS cells generated from ALS patients can be differentiated into motor neurons.
A29b iPS cell EBs were patterned with RA and SHH, then plated on laminin, either whole (A and B) or after
dissociation (C to H), and allowed to mature for 7 to 15 days. (A) Neuron-like outgrowths. (B) Extensive TuJ1positive neuronal processes grow out from plated whole iPS EBs, which contain a high proportion of HB9-stained
nuclei. (C) Neuronal identity of HB9-expressing cells is confirmed by high-magnification image of HB9 and TuJ1
coexpression in dissociated patient-specific motor neuron cultures. (D) GFAP-expressing glial cells can be found
in addition to TuJ1-expressing neurons in differentiated patient-specific iPS cell cultures. [(E) to (H)] The motor
neuron identity of HB9- and TuJ1-positive cells is confirmed by the coexpression of HB9 and ISL. HB9 (E) and
ISL (F) localization is nuclear (G) and highly coincident (H).
Les trois types de cellules souches des vertébrés
1. Les cellules de l’embryon précoce (morula, blastocyte) correspondant à
un état transitoire où les cellules sont TOTIPOTENTES
2. Les cellules souches restreintes à un lignage cellulaire déterminé qui
servent à construire l’embryon pendant le développement embryonnaire
- les cellules ES sont PLURIPOTENTES (endo, méso, ectoderme)
- les cellules MULTIPOTENTES sont à la base de la formation d’un tissu,
d’un organe. Ex: les cellules souches hématopoïétiques produisent des
progéniteurs multipotents (lymphocytes, macrophages, plaquettes, etc..)
3. Les cellules souches de l’adulte qui servent au renouvellement des tissus
et qui sont MULTIPOTENTES
Potentials of germ line–derived stem cells
Human iPSCs and hESCs follow the same temporal course of neural differentiation.
epith
Neural tube Ros
day 0
day 8-10
day 15
Variation of iPSC neural differentiation.
WHY ?
Thérapie cellulaire en 2010
- Transplantation de cellules souches hématopoïétiques (MO, sang de cordon)
- Transplantation autologue de peau chez les brulés et de tissus osseux et cartilagineux
- Transplantation de MO ou de cellules satellites du muscle strié dans les infarctus du myoc.
- Transplantation de cellules mésencéphaliques embryonnaires dans la maladie de Parkinson
- Essais de transplantation de cellules pancréatiques pour traiter le diabète
FUTUR
-Transformation de cellules somatiques en cellules ES-like
- Transformation directe de certaines cellules adultes du malade en
cellules différenciées du type désiré