Chapitre 2.5.2.

CHAPITRE 2.5.2.
DOURINE
(Trypanosoma equiperdum)
RÉSUMÉ
La dourine est une maladie contagieuse chronique ou aiguë des solipèdes reproducteurs qui est
transmise directement d’un animal à un autre par le coït. L’agent causal est Trypanosoma
equiperdum (Doflein, 1901).
La dourine est la seule trypanosomose qui ne soit pas transmise par un vecteur invertébré.
Trypanosoma equiperdum diffère des autres trypanosomes en ce qu’il est d’abord un parasite des
tissus qui envahit rarement le sang. Il n’y a pas de réservoir naturel connu du parasite autre que les
équidés infectés. Il est présent dans les sécrétions génitales du mâle et de la femelle. La période
d’incubation, la gravité et la durée d’évolution de la maladie varient considérablement ; elle est
souvent fatale, mais des cas de guérison spontanée peuvent se produire. Des infections
subcliniques existent et les ânes et les mulets, plus résistants que les chevaux, peuvent demeurer
des porteurs inapparents. L’infection n’est pas toujours transmise à chaque saillie par un animal
infecté. Le rat peut être infecté expérimentalement et utilisé pour entretenir indéfiniment les
souches du parasite. Pour le stockage, le mieux est de conserver les souches de Trypanosoma
equiperdum en azote liquide.
Les signes cliniques sont marqués par des exacerbations et des rechutes périodiques, se terminant
par la mort ou, éventuellement, par la guérison. Tous les symptômes suivants peuvent être
observés : fièvre, oedèmes locaux des organes génitaux et des glandes mammaires, éruptions
cutanées, incoordination, paralysie faciale, lésions oculaires, anémie et cachexie. Des plaques
cutanées oedémateuses, de 5 à 8 cm de diamètre et épaisses de 1 cm sont pathognomoniques.
Identification de l’agent pathogène : le diagnostic définitif dépend de la constatation des signes
cliniques et de l’identification du parasite. Comme cela est rarement possible, le diagnostic repose
d’habitude sur les signes cliniques et sur la preuve sérologique apportée par la réaction de fixation
du complément (FC).
Épreuves sérologiques : les anticorps sont présents chez les animaux infectés qu’ils présentent
ou non des signes cliniques. Le test de FC est utilisé pour confirmer l’infection des cas cliniques ou
des porteurs latents. Les animaux non infectés, notamment les ânes, donnent souvent des
résultats peu clairs. L’épreuve d’immunofluorescence indirecte (IFI) peut être utilisée pour confirmer
l’infection ou résoudre des difficultés posées par des résultats non concluants de la FC. Des
épreuves immuno-enzymatiques (ELISA) sont également utilisées.
Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique : il
n’existe pas de vaccin. La seule méthode de lutte efficace repose sur l’abattage des animaux
infectés. Une bonne hygiène de la monte est essentielle en raison d’une possibilité de transmission
de l’infection par tout objet contaminé.
A. INTRODUCTION
La dourine est une maladie contagieuse chronique ou aiguë des solipèdes reproducteurs qui est transmise
directement d’un animal à l’autre pendant la saillie. L’agent causal est Trypanosoma equipedum (Doflein, 1901).
La dourine est également connue sous d’autres noms : mal du coït, el dourin, morbo coitale maligno,
Beschälseuche, slapsiekte, sluchnaya bolyezn, et covering disease (1, 7).
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Chapitre 2.5.2. — Dourine
Bien que la maladie ait été connue depuis des temps anciens, sa nature ne fut établie qu’en 1896 lorsque Rouget
découvrit des trypanosomes chez des chevaux algériens infectés. La dourine est la seule trypanosomose qui ne
soit pas transmise par un vecteur invertébré. Trypanosoma equiperdum diffère des autres trypanosomes en ce
qu’il est d’abord un parasite des tissus, rarement détecté dans le sang. On ne connaît pas d’autre réservoir
naturel du parasite que les équidés infectés.
L’infection est transmise pendant la saillie, le plus souvent de l’étalon à la jument, mais aussi de la jument à
l’étalon, du fait de la présence du parasite dans le liquide séminal et les exsudats muqueux du pénis et du
fourreau du mâle infecté, ainsi que dans le mucus vaginal de la femelle infectée. Initialement, les parasites sont
trouvés à l’état libre sur la surface de la muqueuse ou entre les cellules épithéliales d’un animal nouvellement
infecté. L’invasion des tissus s’étend et des macules oedémateuses apparaissent dans le tractus génital. Les
parasites peuvent alors passer dans le sang qui les transporte dans d’autres parties du corps. Dans les cas
typiques, cette invasion métastatique donne naissance à des plaques cutanées caractéristiques.
La période d’incubation, la gravité et la durée de la maladie varient considérablement. En Afrique du Sud, la
maladie est typiquement chronique ; habituellement bénigne, elle peut persister pendant plusieurs années
(5). Dans d’autres contrées, comme en Afrique du Nord et en Amérique du Sud, la maladie tend à être plus aiguë,
ne durant souvent que de 1 à 2 mois ou, exceptionnellement, 1 semaine. Bien que la dourine soit une maladie
mortelle, avec une mortalité moyenne de 50 % (spécialement chez l’étalon), la guérison peut survenir. Des
infections subcliniques sont reconnues. Les ânes et les mulets sont plus résistants que les chevaux.
Comme les trypanosomes ne sont pas présents en permanence dans le tractus génital au cours de la maladie, la
transmission de l’infection ne se produit pas nécessairement à chaque saillie par un animal infecté. La
transmission de l’infection de la jument au poulain peut se faire par des muqueuses, comme la conjonctive. On a
montré que le lait de la jument infectée était infectieux. Des animaux autres que les équidés peuvent être infectés
expérimentalement. Des souches adaptées au rat peuvent être entretenues indéfiniment ; le sang de rat infecté
peut être conservé au froid de façon satisfaisante. Les antigènes pour les épreuves sérologiques sont
couramment produits à partir de rats de laboratoire infectés.
La maladie est marquée par des stades d’exacerbation, d’accalmie ou de rechutes, qui varient en durée et qui
peuvent apparaître une ou plusieurs fois avant la mort ou la guérison. Les signes les plus fréquemment observés
sont l’hyperthermie, une tuméfaction et un œdème local des organes génitaux et des glandes mammaires, des
éruptions cutanées oedémateuses, le fléchissement des articulations, une incoordination motrice, une paralysie
faciale, des lésions oculaires, de l’anémie et un amaigrissent prononcé. Un signe pathognomonique est la plaque
oedémateuse consistant en une lésion cutanée surélevée, atteignant 5 à 8 cm de diamètre et 1 cm d’épaisseur.
Ces plaques apparaissent habituellement sur les côtes, quoiqu’elles puissent apparaître aussi ailleurs sur le
corps et elles persistent d’ordinaire entre 3 et 7 jours. Elles ne sont pas un signe constant.
Généralement, l’oedème disparaît et réapparaît à intervalles irréguliers. Au cours de chaque période de
rémission, on peut observer une augmentation permanente de tissu épaissi et induré de la muqueuse vaginale.
Celle-ci peut présenter des macules semi-transparentes développées et épaissies. Des plis de la membrane
enflée peuvent faire saillie à travers la vulve. Il n’est pas inhabituel de trouver de l’œdème des glandes
mammaires et des tissus adjacents. Une dépigmentation de l’aire génitale, du périnée et de la mamelle peut se
produire. Chez l’étalon, le premier signe clinique est une enflure variable englobant le gland et le prépuce.
L’œdème s’étend vers l’arrière, au scrotum, aux nœuds lymphatiques inguinaux et au périnée avec une extension
vers l’avant le long de la partie inférieure de l’abdomen. Chez les étalons de races lourdes, l’œdème peut
s’étendre à l’ensemble de la paroi de l’abdomen.
L’hyperthermie est intermittente, les signes nerveux comprennent l’incoordination motrice ; surtout des membres
postérieurs, des lèvres, des naseaux, des oreilles et de la gorge. La paralysie faciale est généralement
unilatérale. Dans les cas mortels, la maladie est généralement lente et progressive, avec augmentation de
l’anémie et de la cachexie, bien que l’appétit soit conservé presque tout le temps.
À l’autopsie, on trouve des exsudats gélatineux sous la peau. Chez l’étalon, le scrotum, le fourreau et la tunique
testiculaire sont épaissis et infiltrés. Dans quelques cas, les testicules sont enrobés dans une masse dure de
tissu scléreux et peuvent être méconnaissables. Chez la jument, la vulve, la muqueuse vaginale, l’utérus, la
vessie et les glandes mammaires peuvent être épaissis avec infiltration gélatineuse. Les nœuds lymphatiques,
particulièrement dans la cavité abdominale, sont hypertrophiés, ramollis et, dans quelques cas, hémorragiques.
La moelle épinière des animaux atteints de paraplégie est souvent molle, pulpeuse et décolorée, particulièrement
dans les régions lombaire et sacrée.
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Chapitre 2.5.2. — Dourine
B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC
1.
Identification de l’agent pathogène
Un diagnostic définitif dépend de la reconnaissance des signes cliniques et de la mise en évidence du parasite.
Celle-ci est rarement possible parce que : a) bien que les signes cliniques et les lésions macroscopiques d’une
forme typique de la maladie soient pathognomoniques, elles ne peuvent pas toujours être identifiées avec
certitude, spécialement aux stades précoces ou lors de cas latents : elles peuvent être confondues avec d’autres
affections comme l’exanthème coïtal (de plus, dans certains pays [p.ex. en Amérique du Sud], les infections à
T. evansi donnent lieu à des signes cliniques semblables) ; b) les trypanosomes ne sont que rarement présents et
sont extrêmement difficiles à trouver, même dans les zones oedématiées, et c) les trypanosomes ne sont
présents dans le sang que par éclipses et en petit nombre, ce qui complique leur détection. Pour des raisons
inconnues, aucune souche de T. equiperdum n’a été isolée dans un quelconque pays du monde depuis 1982 et
la plupart des souches actuellement disponibles dans les laboratoires nationaux de diagnostic sont apparentées à
T. evansi (3).
En pratique, le diagnostic repose sur les caractéristiques cliniques confirmées par la sérologie. Récemment,
d’autres approches ont été étudiées et publiées (3).
Chez les animaux infectés, les trypanosomes ne sont présents, en petit nombre, que dans la lymphe et les
liquides d’œdème des organes génitaux externes, dans le mucus vaginal et dans le liquide contenu dans les
plaques. Ils sont d’ordinaire indétectables dans le sang, mais on peut les trouver dans le mucus urétral ou vaginal
récolté par des irrigations ou des raclages préputiaux ou vaginaux 4 à 5 jours après la contamination. Plus tard,
les parasites peuvent être trouvés dans les liquides d’oedèmes ou de plaques, notamment peu de temps après
leur éruption. La peau de la zone recouvrant la plaque doit être lavée, rasée et séchée, et le liquide qu’elle
contient aspiré avec une seringue. Les vaisseaux sanguins doivent être évités. Ce prélèvement à l’état frais
obtenu par aspiration est examiné au microscope pour observer la motilité des trypanosomes. Ceux-ci ne sont
présents que pendant quelques jours, de telle sorte que les lésions doivent être examinées à plusieurs reprises.
Le parasite est rarement trouvé en gouttes épaisses, mais il est parfois détectable par centrifugation du sang et
examen à nouveau du plasma centrifugé.
Comme la dourine est la seule trypanosomose à affecter les chevaux en climat tempéré, l’observation de
trypanosomes dans des gouttes épaisses suffit pour un diagnostic positif. Dans les pays où existent également le
Nagana et le Surra, il est difficile de distinguer microscopiquement T. equiperdum (par sa morphologie et sa
motilité) des autres membres du sous-genre Trypanozoon (T. evansi, T. brucei). En particulier, T. equiperdum et
T. evansi ne peuvent être différenciés sur la base de critères morphologiques. Tous deux sont monomorphes, ont
des trypomastigotes allongés avec un flagelle libre, bien que des formes pléomorphes, protéonucléées et trapues
soient parfois reconnues.
Les souches typiques du parasite ont des longueurs allant de 15,6 à 31,3 µm.
2.
Épreuves sérologiques
Les anticorps humoraux sont présents chez les animaux infectés, qu’ils manifestent ou non des signes cliniques.
La réaction de fixation du complément (FC) (11) est utilisée pour confirmer le diagnostic clinique et pour détecter
les infections latentes. Les équidés non infectés, en particulier les ânes et les mulets, donnent souvent des
réactions peu interprétables ou non spécifiques en raison des effets anti-complémentaires de leurs sérums. Dans
le cas de sérums anti-complémentaires, l’épreuve d’immunofluorescence indirecte (IFI) est préférable à la FC. Il
n’y a pas de protocole adopté au plan international. Dans certains pays, des réactions croisées sont possibles
dues à la présence d’autres trypanosomes, par exemple, T. cruzi et T. evansi. Les épreuves immunoenzymatiques (ELISA) sont également utilisées. Trypanosoma equiperdum est étroitement apparenté à d’autres
trypanosomes du Vieux Monde, y compris T. brucei et T. evansi. Les membres de ce genre Trypanosoma
partagent tous des éléments conservés de leur cytosquelette commun qui provoquent une forte réponse
sérologique croisée. Tous les antigènes et les antisérums (monoclonaux et polyclonaux) actuellement disponibles
pour utilisation dans les tests de diagnostic sérologique contiennent ces éléments qu’ils ont conservés ou les
anticorps dirigés contre eux. C’est pourquoi aucune des techniques sérologiques décrites ci-dessous n’est
spécifique de la dourine. Le diagnostic de la dourine doit reposer sur l’anamnèse, la clinique et le résultat des
examens anatomo-pathologiques aussi bien que sur la sérologie. Des améliorations significatives dans le
sérodiagnostic de la dourine exigeront la mise au point de sous-unités antigéniques plus spécifiques des
trypanosomes et des anticorps correspondants.
a)
Test de Fixation du Complément (Épreuve prescrite pour les échanges internationaux)
Des techniques standards ou des microplaques peuvent être utilisées (6). Le sérum de cobaye (disponible
commercialement) est utilisé comme source de complément. Les autres réactifs sont des globules rouges
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Chapitre 2.5.2. — Dourine
de mouton (GRMs) lavés en tampon véronal et le sérum hémolytique de lapin (c’est-à-dire sérum de lapin
anti-GRM) (commercial).
•
Production de l’antigène
i)
Un rat est inoculé avec une souche stock de T. equiperdum conservé par congélation. Le rat doit être
indemne de T. lewisi, ce qui peut être obtenu par injection de néoarsphénamine, ou mieux encore en
utilisant un rat provenant d’un élevage d’animaux de laboratoire indemne de germes pathogènes
(SPF). Les rats adultes reçoivent par voie intra-péritonéale 0,5 à 1 ml d’un stabilat congelé et
rapidement décongelé. À l’acmée de la parasitémie, le sang est recueilli sous anti-coagulant, ce qui
servira comme culture stock pour l’inoculation d’autres rats.
ii)
20 gros rats sont inoculés par voie intra-péritonéale avec 0,3 ml de la culture stock. Tous les rats
doivent avoir ensemble une forte infection. D’ordinaire, les rats meurent dans les 3 à 5 jours ; avant
leur mort, le sang est prélevé à la queue pour examen microscopique en goutte épaisse. Quand la
parasitémie est maximale, les rats sont saignés et leur sang est recueilli en soluté physiologique
citraté. Si la parasitémie n’est pas synchrone, les rats peuvent être saignés et leur sang conservé en
soluté physiologique de dextrose/citrate acide à 4°C jusqu’à ce que tous soient saignés.
iii)
Le sang est filtré sur gaze de mousseline et centrifugé à 800 g pendant 4 min. La plupart des GRMs se
déposent alors que les trypanosomes demeurent en suspension.
iv)
Le liquide surnageant est transféré dans un tube propre, la couche supérieure des GRMs est
mélangée aux trypanosomes dans un second tube et la couche qui reste dans un troisième. Du soluté
physiologique citraté est ajouté aux tubes 2 et 3 pour empêcher l’agglomération des cellules. Tous les
tubes sont mélangés et centrifugés à 1 500 g pendant 5 min.
v)
Le liquide surnageant est éliminé et la couche blanche supérieure des trypanosomes est transférée de
ces tubes dans un tube propre. La couche du dessous, de couleur rose, est transférée dans un second
tube et la couche inférieure dans un troisième tube.
vi)
Du soluté physiologique est ajouté et mélangé et les tubes sont encore centrifugés à 1 500 g pendant
5 min pour séparer les trypanosomes. Cette étape de lavage est répétée jusqu’à ce que tous les
trypanosomes soient collectés pour former une masse blanche pure. 10 rats doivent fournir 3 à 5 g
d’antigène. Ce procédé de purification peut aussi être réalisé en utilisant une colonne de DEAE
(diéthylaminoéthyl) cellulose en solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS) contenant du
glucose, à pH 8 (10).
vii)
Ce concentré de trypanosomes est dilué dans 2 volumes de tampon véronal et 5 % de
polyvinylpyrrolidone comme cryoprotecteur. Avant utilisation dans les tests de FC, l’antigène doit être
dispersé en une fine suspension avec un homogénéiseur broyeur à billes de verre, à main ou à
moteur, refroidi dans la glace (13). Cet antigène peut être divisé en fractions aliquotes, congelé et
lyophilisé.
L’antigène est standardisé par titrage contre une dilution à 1 % d’un antisérum de faible titre.
Sérums : les sérums positifs et négatifs doivent être inactivés à 58°C pendant 30 min avant d’être utilisés
dans les tests. Les sérums de mulets et d’ânes sont normalement inactivés à 62°C pendant 30 min. Les
dilutions de sérums qui sont positives dans les épreuves de dépistage sont titrées contre 2 unités
d’antigène. Les sérums testés sont triés à une dilution de 1/5. Les sérums montrant plus de 50 % de FC à
cette dilution sont d’ordinaire considérés comme positifs.
Sérums anti-complémentaires : si le témoin anti-complémentaire ne présente qu’une trace d’activité
anti-complémentaire, celle-ci peut être ignorée. Pour tous les autres sérums anti-complémentaires, leur
activité doit être titrée. On fait une série dupliquée de dilutions et le prélèvement est retesté en utilisant
l’antigène de T. equiperdum dans la première rangée de la série et seulement le tampon véronal dans la
seconde. La seconde rangée donne le titre de la réaction anti-complémentaire. À condition que la première
rangée donne un point final d’au moins 3 dilutions plus grandes que la seconde, l’effet anti-complémentaire
peut être ignoré et le prélèvement noté comme positif. Si les résultats sont plus serrés, un nouveau
prélèvement de sérum doit être demandé. Une dilution de sérum de 1/2 et une inactivation par la chaleur à
60-63°C peuvent conduire à la réduction ou à l’élimination de l’effet anti-complémentaire.
Tampons et réactifs : le soluté physiologique tampon véronal de 0,15 M à pH 7,4 est utilisé pour diluer les
réactifs et laver les GRMs. L’antigène est prétesté par titrage en échiquier et 2 unités sont utilisées dans le
test. Le complément (C) de cobaye est testé pour son activité hémolytique et dilué pour fournir 2 unités pour
le test. Les GRMs en solution sont lavés 3 fois en solution d’Alsever. Une solution à 3 % est utilisée pour le
système hémolytique. Le sérum titré hémolytique de lapin anti-GRMs est utilisé au double de son titre
hémolytique (2 unités). Tous les sérums du test, y compris les sérums témoins positifs et négatifs, sont
inactivés à une dilution de 1/5 avant le test.
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Chapitre 2.5.2. — Dourine
•
Dilutions primaires
i)
100 µl de sérum à tester sont dilués dans 400 µl de tampon véronal (1/5) ;
ii)
100 µl des sérums témoins positif et négatif sont dilués dans 400 µl de tampon véronal (1/5) ;
iii)
Les solutions sont incubées dans un bain-marie à 58°C pendant 30 min pour inactiver le complément
et détruire les facteurs anti-complémentaires.
•
Protocole pour l’épreuve de dépistage
i)
25 µl du sérum à tester inactivé sont distribués dans chacun des 3 puits ;
ii)
25 µl de sérum témoin inactivé sont distribués dans chacun des 3 puits ;
iii)
25 µl de l’antigène de T. equiperdum dilué de façon à contenir 2 unités sont seulement versés dans le
premier puits pour chaque sérum ;
iv)
25 µl de complément dilué de façon à contenir 2 unités sont ajoutés aux deux premiers puits
seulement pour chaque sérum ;
v)
25 µl de tampon véronal, pH 7,4 sont ajoutés au second puits pour chaque sérum (puits anticomplémentaire) ;
vi)
50 µl de tampon véronal, pH 7,4 sont ajoutés au troisième puits pour chaque sérum (puits d’activité de
la lyse) ;
vii)
Le témoin complément est préparé ;
viii) La plaque est agitée sur un mini-agitateur, suffisamment pour mélanger les réactifs ;
ix)
La plaque est incubée pendant 1 h dans un bain-marie à 37°C ;
x)
Le système hémolytique est préparé. Après les 50 premières minutes d’incubation, les GRMs sont
sensibilisés en mélangeant des volumes égaux de sérum hémolytique de lapin, dilué de façon à
contenir 2 unités par 50 µl, et une suspension à 3 % de GRMs lavés, la solution est bien mélangée et
incubée pendant 10 min à 37°C ;
xi)
Après incubation, 50 µl du système hémolytique sont ajoutés à chaque puits ;
xii)
La plaque est agitée suffisamment sur un mini-agitateur pour mélanger les réactifs ;
xiii) La plaque est incubée pendant 30 min à 37°C ;
xiv) Lecture des résultats : la plaque est regardée par en-dessus avec une source lumineuse proche. La
fixation dans chaque puits est déterminée par estimation de la proportion des cellules non lysées. Le
degré de fixation est exprimé en 0, 1+, 2+, 3+, 4+ (0 %, 25 %, 50 %,75 % ou 100 % des cellules
non lysées). Les réactions sont interprétées comme suit : 4+, 3+, 2+ = positives, 1+ = suspectes,
trace = négatives, hémolyse complète = négatives.
xv)
b)
Point limite de positivité : tous les sérums avec des réactions positives au 1/5 sont dilués en double
série et testés selon la méthode précédente pour leur point limite de positivité.
Épreuve d’immunofluorescence indirecte
Une épreuve d’immunofluorescence indirecte (IFI) peut aussi être utilisée pour le diagnostic de la dourine
(11) comme épreuve de confirmation ou pour résoudre des résultats non concluants obtenus par le test de
FC. Cette épreuve est réalisée comme suit :
Antigène : (pour la méthode à employer : voir la préparation de l’antigène pour le test de FC dans la Section
B.2 a.). Le sang est recueilli dans des vacutainers héparinés ou dans une solution d’acide-citrate-dextrose à
partir d’un animal chez lequel le nombre de trypanosomes est encore en augmentation (il doit y avoir
environ 10 parasites par 10 champs microscopiques).
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i)
Le sang est centrifugé pendant 10 min à 800 g.
ii)
1 à 2 volumes de PBS sont ajoutés au dépôt de GRMs, le mélange est agité et l’on fait des frottis qui
recouvrent toute la lame.
iii)
Les frottis sont séchés à l’air et enveloppés par paquets de quatre, avec du papier pour séparer
chaque lame. Les paquets de lames sont enveloppés dans des feuilles d’aluminium, scellés dans un
conteneur à l’abri de l’air sous gel de silice et conservés à –20°C ou –76°C.
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Chapitre 2.5.2. — Dourine
iv)
Les lames conservées à –20°C doivent garder leur activité pendant environ 1 an, celles conservées à
–76°C peuvent demeurer utilisables plus longtemps.
Solution d’acide-citrate-dextrose : Utiliser 15 ml par 100 ml de sang.
Conjugué : immunoglobulines de mouton anti-cheval marquées à la fluorescéine.
•
Protocole
i)
Les lames d’antigène doivent revenir à la température du laboratoire dans un dessiccateur ;
ii)
Les lames sont marquées ;
iii)
Des gouttes épaisses de sérum à tester diluées en PBS sont déposées sur des lames qui sont alors
incubées dans une chambre humide au bain-marie à 37°C pendant 30 min ;
iv)
Les lames sont lavées dans du PBS, pH 7,2 ; 3 fois pendant 5 min à chaque fois et séchées à l’air ;
v)
Le conjugué marqué à la fluorescéine est ajouté à une dilution correcte. Des lots individuels d’antigène
et de conjugué doivent être titrés chacun l’un contre l’autre en utilisant les sérums témoins pour
optimiser la dilution du conjugué. Les lames sont incubées dans une chambre humide au bain-marie à
37°C pendant 30 min ;
vi)
Les lames sont lavées en PBS, 3 fois pendant 5 min chacune et séchées à l’air ;
vii)
Les lames sont montées sous huile à immersion (disponible dans le commerce) ;
viii) Les lames sont alors examinées en éclairage UV. Un éclairage en lumière incidente est utilisé avec un
filtre barrière K 530 et un filtre excitateur BG 12. Les lames peuvent être conservées à 4°C pendant 4 à
5 jours. Les sérums à tester dilués au 1/80 et au-dessus montrant une forte fluorescence des parasites
sont généralement considérés comme positifs. L’estimation de l’intensité de la fluorescence demande
de l’expérience de la part de l’observateur.
Les sérums témoins standards positifs et négatifs doivent être inclus dans chaque lot de tests et une
considération particulière doit être accordée au mode de fluorescence de ces témoins quand on apprécie
les résultats des sérums à tester.
c)
Méthode immuno-enzymatique
Une épreuve immuno-enzymatique (ELISA) a été développée et comparée avec d’autres épreuves
sérologiques pour la dourine (12, 14).
Tampon carbonate, pH 9,6, pour enrobage de l’antigène sur les plaques à microtitrage : Na2CO3 (1,59 g),
NaHCO3 (2,93 g) et eau distillée (1 litre).
Tampon de blocage : tampon carbonate + 3 % de sérum fœtal de veau (FCS).
PBS, pH 7,4, avec Tween 20 (PBST) pour lavage : KH2PO4 (0,2 g) ; Na2HPO4 x 12 H2O (2,94 g) ;
NaCl (8,0 g) ; KCl (0,2 g dans 1 litre d’eau distillée) et Tween 20 (0,5 ml).
Prélèvement et tampon conjugué : PBST + 6 % FCS.
Tampon citrique phosphate : acide citrique monohydraté (4,2 g dans 200 ml d’eau distillée) ;
Na2HPO4 x 12 H2O (dans 200 ml d’eau d’eau distillée). Les 2 composants sont mélangés à volumes égaux.
Substrat indicateur : l’ABTS (2,2’-azino-bis-[3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique acide]) (40 mg) est dissout
dans le tampon citrique phosphate (100 ml) et conservé à 4°C à l’abri de la lumière. Juste avant l’emploi,
100 µl de H2O2 à 1/40 sont ajoutés à 10 ml d’ABTS.
Conjugué : PO de lapin anti-IgG de cheval (H + L) ou IgY anti-cheval Ig-PO.
Antigène : l’antigène de T. equiperdum lyophilisé (0,5 ml) est reconstitué avec un tampon d’enrobage (5 ml),
soumis aux ultrasons 2 fois pendant 10 s à chaque fois à 12 µm de pic à pic et centrifugé à 10 000 g
pendant 4 min. Le surnageant est ensuite dilué à une dilution prétestée pour essai (par exemple à 1/500).
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Chapitre 2.5.2. — Dourine
•
Protocole
i)
Les puits dans les colonnes 2, 4, 6, etc. sont chargés de 50 µl d’antigène, ceux des colonnes
1, 3, 5, etc. sont chargés de la même quantité de tampon carbonate. La plaque est incubée pendant
40 min à 37°C dans une chambre humide, lavée à l’eau du robinet, et 50 µl de tampon de blocage sont
ajoutés à chaque puits. La plaque est incubée pendant 20 min, lavée à l’eau du robinet, suivie de
3 cycles de lavage au PBST à raison de 3 min par cycle.
ii)
50 µl de prélèvements de sérum à tester et de sérum témoin de cheval prédilué à 1/100 en tampon
conjugué/prélèvement sont ajoutés en parallèle aux puits avec et sans antigène. La plaque est incubée
pendant 30 min, lavée à l’eau du robinet, suivie de 3 cycles de lavage au PBST.
iii)
Le conjugué convenablement dilué en tampon prélèvement/conjugué est ajouté à tous les puits en
volumes de 50 µl. La plaque est incubée pendant 30 min avec lavage consécutif comme
précédemment.
iv)
100 µl du système substrat indicateur est ajouté à tous les puits.
v)
La réaction à la température du laboratoire est arrêtée au bout de 15 min par addition de 25 µl de
37 mM de NaCN. Alternativement, des détergents du commerce peuvent être utilisés après
pré-testage. Les résultats sont lus par photométrie à une longueur d’onde de 405 nm.
vi)
Calcul des résultats : l’absorption (avec l’antigène) moins l’absorption (sans l’antigène) = extinction
nette. Une réaction excédant une extinction nette de 0,3 est considérée comme un résultat positif.
Un ELISA de compétition a également été décrit pour détecter les anticorps contre Trypanosoma
equiperdum (9).
d)
Autres épreuves sérologiques
D’autres épreuves sérologiques ont été utilisées dont l’épreuve radio-immune, l’immuno-électrophorèse et
l’immunodiffusion en gélose (IDG) (2, 4). L’IDG a été utilisée pour confirmer des résultats positifs et pour
tester des sérums anti-complémentaires. Un mode opératoire en 7 puits en agarose à 8 % en tris tampon
est utilisé, avec l’antigène de la FC dans le puits central et les sérums témoins positifs et inconnus en
alternance dans les puits périphériques. Une méthode utilisant l’immunoblot (8) a été publiée pour
diagnostiquer en même temps la piroplasmose équine, la morve et la dourine.
C. SPÉCIFICATIONS APPLICABLES AUX VACCINS ET AUX PRODUITS
BIOLOGIQUES À USAGE DIAGNOSTIQUE
Il n’y a pas de produits biologiques actuellement disponibles. La lutte contre la maladie dépend de sa déclaration
obligatoire et de l’abattage des animaux infectés. Une bonne hygiène de la monte est également essentielle.
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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Chapitre 2.5.2. — Dourine
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Verbraucherschutz u. Veterinärmedizin (BgVV). PO Box 33 00 13, D-14191 Berlin, Germany.
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NB : Il existe un Laboratoire de référence de l’OIE pour la dourine (se reporter à la liste de la partie 3 de ce
Manuel terrestre ou consulter le site internet de l’OIE pour une liste actualisée : www.oie.int).
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