1184 - Johannes Gutenberg

Transcription

„Knock down von Desmoglein 2 durch induzierbare
Cre-spezifische Rekombination in der Maus“
Dissertation
zur Erlangung des Grades
„Doktor der Naturwissenschaften“
am Fachbereich Biologie
der Johannes Gutenberg-Universität, Mainz
Dorothe Hameyer
geboren am 07.04.1979 in Remagen
Mainz, 2006
Inhaltsverzeichnis
____________________________________________________________________
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
1
1.1
1.1.1
1.1.2
1.1.3
1.2
1.3
1.3.1
1.3.2
1.4
2
2.1
2.1.1
2.1.2
2.1.3
2.1.4
2.1.5
2.1.6
2.1.7
2.1.8
2.1.9
2.1.10
2.1.11
2.1.12
2.1.13
2.1.14
2.1.15
2.1.16
2.2
2.2.1
2.2.1.1
2.2.1.2
2.2.2
2.2.3
2.2.4
2.2.5
2.2.6
2.2.7
2.2.8
2.2.8.1
2.2.8.2
2.2.9
2.2.10
2.2.11
Einleitung
Zelladhäsion
Die Bedeutung der Zelladhäsion
Ausbildung von Zellverbindungen durch Cadherine
Komponenten und Struktur von Desmosomen
Desmoglein 2
Kleine regulatorische RNAs
Mechanismus der RNA Interferenz
Anwendungsbereiche von RNAi
Zielsetzung
Material und Methoden
Material
Verbrauchsmaterial
Chemikalien
Puffer und Lösungen
Kulturmedien
Enzyme
Radioaktive Nuklide
Oligonukleotide
Vektoren
Antikörper
Molekulargewichtsmarker
Kits
Bakterienstämme
Zelllinien
Tiere
Geräte
Software
Methoden
Präparation von Plasmid – DNA aus Bakterienkulturen
Präparation von DNA aus 2 ml Bakterienkulturen (Plasmid
Minipräparation)
Präparation von DNA aus 400 ml Bakterienkulturen (Plasmid
Maxipräparation)
DNA – Präzipitation
Präparartion von genomischer DNA aus murinen Schwanzbiopsien
Konzentrationsbestimmung von DNA
Polymerasekettenreaktion (PCR)
Agarosegelelektrophorese
Präparative Aufreinigung von DNA aus Agarosegelen (Gelextraktion)
Restriktionsverdau von DNA
Analytischer Restriktionsverdau
Präparativer Restriktionsverdau
Dephosphorylierung von Vektor – DNA
Auswahl der siRNA Zielsequenzen
Annealing von siRNA Oligonukleotiden
I
V
VI
1
1
1
2
4
14
15
17
18
21
22
22
22
23
28
32
33
33
34
35
36
38
38
38
39
39
40
43
45
45
45
45
46
46
47
47
48
49
49
49
50
50
50
51
I
Inhaltsverzeichnis
____________________________________________________________________
2.2.12
2.2.13
2.2.13.1
2.2.13.2
2.2.14
2.2.14.1
2.2.14.2
2.2.15
2.2.16
2.2.17
2.2.18
2.2.19
2.2.19.1
2.2.19.2
2.2.20
2.2.21
2.2.22
2.2.22.1
2.2.22.2
2.2.23
2.2.23.1
2.2.23.2
2.2.24
2.2.24.1
2.2.24.2
2.2.24.3
2.2.24.4
2.2.25
2.2.25.1
2.2.25.2
2.2.25.3
2.2.25.4
2.2.25.5
2.2.26
2.2.26.1
2.2.26.2
2.2.26.3
2.2.26.4
2.2.26.5
2.2.26.6
2.2.27
2.2.28
2.2.29
2.2.30
3
3.1
3.1.1
Ligation
Herstellung kompetenter Bakterien
Herstellung von elektrokompetenten Bakterien (DH5α)
Herstellung von Hitzeschock – kompetenten Bakterien (294 – Cre)
Transformation
Transformation von Bakterienzellen durch Elektroporation
Transformation von Bakterienzellen durch Hitzeschock
Radioaktive Markierung von DNA – Sonden
RNA – Extraktion aus Zellkultur – Zellen
Konzentrationsbestimmung von RNA
Northern Blot
Extraktion von Protein
Proteinextraktion aus Zellkultur – Zellen
Proteinextraktion aus murinem Gewebe
Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford
Acetonpräzipitation von Protein
Western Blot
Analytische SDS – Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS – PAGE)
Durchführung des Western Blots (Semi dry Blotting)
Entfernung von Antikörpern und Sonden von Nitozellulosemembranen
Entfernung von Sonden von Nitozellulosemembranen bei Northern Blots
Entfernung von Antikörpern von Nitrozellulosemembranen bei Western
Blots
Murine Gewebeschnitte
Anfertigung von murinen Gewebeschnitten
Acetonfixierung von murinen Gewebeschnitten
X – Gal – und Fast – Red – Färbung muriner Gewebeschnitte
Immunfluoreszenz von murinen Gewebeschnitten
Zellkultur
Kultivierung von HEK 293, 3T3 und EpH4 Zellen
Kryokonservierung von Zellen
Auftauen von Zellen
Transiente Transfektion von Plasmid – DNA in HEK 293 und
NIH 3T3 – Zellen
Transiente Transfektion von EpH4 Zellen
Generierung transgener Mäuse durch Pronukleusinjektion
Superovulation
Gewinnung der befruchteten Eizellen
Vorbereitung der trangenen DNA für die Pronukleusinjektion
Mikroinjektion des trangenen Konstrukts in Oozyten
Scheinschwangere Leihmütter
Transfer der mikroinjizierten Oozyten
Behandlung von adulten Mäusen mit Tamoxifen
Aktivierung der CreERT2 Rekombinase mit Tamoxifen im Embryo und
anschließende β – Galaktosidase – Färbung
FACS (Fluorescent Activated Cell Sorting) – Analyse von Mausorganen
und Mausembryonen
Induktion von Colitis ulcerosa bei transgenen Mäusen
Ergebnisse
Charakterisierung der Rosa26CreERT2 Maus
Genotypisierung von Rosa26CreERT2 sowie Rosa26Reporter Mäusen
51
52
52
53
53
53
54
54
55
56
56
57
57
58
58
59
59
59
61
62
63
63
63
63
64
64
64
65
65
65
66
66
67
67
68
68
68
68
69
69
70
70
71
72
73
73
74
II
Inhaltsverzeichnis
____________________________________________________________________
3.1.2
3.1.3
3.1.4
Behandlung doppelt transgener Rosa26CreERT2/R26R Mäuse mit
Tamoxifen führt zu unterschiedlich starker Expression des Reportergens
β-Galaktosidase in verschiedenen peripheren Organen
Analyse der Expression von Cre Rekombinase in verschiedenen Organen
der Rosa26CreERT2 Maus zeigt keine detektierbare Expression im
Gehirn
FACS (Fluorescent Activated Cell Sorting)-Analyse hämatopoietischer
Organe von Rosa26CreERT2/RAGE Mäusen zeigt unterschiedlich starke
Aktivierung der Cre Rekombinase in verschiedenen
Blutzellpopulationen
76
80
81
3.1.5
Bereits im Embryo kann Cre Rekombinase durch Injektion von
Tamoxifen ins Muttertier aktiviert werden
86
3.2
Knock down von Dsg 2 mit Hilfe des Expressionsvektors
pTEREGFP
88
3.2.1
3.2.2
3.2.3
3.2.4
3.3
3.3.1
3.3.2
3.3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
3.8
4
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
Klonierung von verschiedenen siRNA Sequenzen gegen Dsg 2 in den
Expressionsvektor pTEREGFP
Herstellung der Dsg 2- und GAPDH-spezifischen Sonden
Knock down von Dsg 2 in den Desmosomen-bildenden EpH4 Zellen
durch transiente Transfektion mit den shRNA Expressionsplasmiden
Verschiedene siRNA Zielsequenzen zeigen unterschiedliche knock down
Effizienz in transienten co-Transfektionen
Knock down von Dsg 2 mit Hilfe des Expressionsvektors pSico
Klonierung der Dsg 2 shRNA Sequenz in den Expressionsvektor pSico
Deletion der Stop-Kassette durch Transfektion des pSico Dsg 2 shRNA
Plasmids in Cre exprimierende Bakterien
Knock down von Dsg 2 im Zellkulturexperiment nach Deletion der StopKassette
Klonierung der shRNA Expressionskassette in einen Vektor mit
humanen MAR (Matrix Attachment Region)-Sequenzen zur
Insulation des Transgens
Generierung der pSicopInsu Dsg 2 shRNA (Dsg 2 knock down)
Mäuse
Genotypisierung und Fluoreszenztest von potenziellen Dsg 2
knock down Mäusen
Knock down von Dsg 2 nach Tamoxifen-Behandlung doppelt
transgener pSicopInsu Dsg 2 shRNA/Rosa26CreERT2 Mäuse
Induktion von Colitis ulcerosa in Tamoxifen-induzierten
Dsg 2 knock down/VillinCreERT2 Mäusen
Diskussion
Induzierbare Expression der Cre Rekombinase in den peripheren
Geweben der Rosa26CreERT2 Mauslinie
Verschiedene siRNA Sequenzen führen auf RNA- und
Proteinebene zu unterschiedlich effizientem knock down von
Dsg 2 unter Anwendung des Expressionsvektors pTEREGFP
Durch Verwendung des Expressionsvektors pSico kann Dsg 2
Cre/lox-induzierbar herunterreguliert werden
Durch Mikroinjektion des pSicopInsu Dsg 2 shRNA Konstrukts
werden induzierbare Dsg 2 knock down Mäuse generiert
Behandlung mit Tamoxifen führt in doppelt transgenen pSicopInsu
Dsg 2 shRNA/Rosa26CreERT2 Mäusen zum knock down von
Dsg 2
89
91
92
95
96
97
99
102
103
108
109
111
115
119
119
124
126
128
129
III
Inhaltsverzeichnis
____________________________________________________________________
4.6
5
6
Tamoxifen-behandelte pSicopInsu Dsg 2 shRNA/VillinCre Mäuse
zeigen nach Induktion von Colitis ulcerosa Entzündungen und
Tumore im Darm
Zusammenfassung
Summary
Literaturverzeichnis
Danksagung
Lebenslauf
132
135
137
139
148
149
IV
____________________________________________________________________
Abb. 1.1
Abb. 1.2
Abb. 1.3
Abb. 3.1
Abb. 3.2
Abb. 3.3
Abb. 3.4
Abb. 3.5
Abb. 3.6
Abb. 3.7
Abb. 3.8
Abb. 3.9
Abb. 3.10
Abb. 3.11
Abb. 3.12
Abb. 3.13
Abb. 3.14
Abb. 3.15
Abb. 3.16
Abb. 3.17
Abb. 3.18
Abb. 3.19
Abb. 3.20
Abb. 3.21
Abb. 3.22
Abb. 3.23
Abb. 3.24
Abb. 3.25
Abb. 3.26
Abb. 3.27
Schematische Darstellung eines Desmosoms
Differenzierungsabhängige Expression desmosomaler Cadherine in der
Epidermis
Mechanismus von siRNA und miRNA
Genotypisierung von Rosa26CreERT2 Mäusen
Genotypisierung von Rosa26Reporter (R26R) Mäusen
Verpaarungs- und Tamoxifenregime-Schema für den auf X-Gal-Färbung
basierenden Funktionalitätstest der Rosa26CreERT2 Maus
X-Gal-Färbung von Kryostatschnitten der mit Tamoxifen behandelten
Rosa26CreERT2/R26R Mäuse
Expression von Cre Rekombinase in verschiedenen Geweben der
Rosa26CreERT2 Maus
FACS-Plots
verschiedener
hämatopoietischer
Organe
der
Rosa26CreERT2/RAGE Maus mit und ohne Tamoxifen-Induktion
FACS-Plots der Blutzellpopulationen von Rosa26CreERT2/RAGE
Mäusen nach Öl- oder Tamoxifenbehandlung
Expressionslevels von EGFP (grünes Fluoreszenzprotein) in
verschiedenen Blutzellpopulationen von Rosa26CreERT2/RAGE Mäusen
X-Gal-Färbung von Rosa26CreERT2/R26R Embryonen
FACS-Analyse 12 Tage alter Rosa26CreERT2/RAGE Embryonen
ShRNA Expressionsplasmid pTEREGFP
PCR zur Suche nach positiven Klonen nach Ligation von shRNA
Sequenzen in pTEREGFP
Restriktionsverdau des Dsg 2- und GAPDH-Expressionsvektors zur
Herstellung von Sonden für den Northern Blot
Relative Dsg 2 RNA-Intensität der EpH4 Zellen nach Transfektion mit
den shRNA Expressionsplasmiden
Western Blot der FACS-sortierten EpH4 Zellen
Western Blot von Proteinextrakten der mit pTEREGFP-shRNA
Konstrukten transfizierten HEK 293-Zellen
Kontrolle der transformierten Bakterien auf Intregration der shRNA in
den pSico Expressionsvektor
Cre-induzierte Rekombination zwischen den loxP sites im shRNA
Expressionsvektor pSico führt zu Deletion der CMV/EGFP/StopKassette
Western Blot zur Kontrolle der Funktionalität des pSico Dsg 2 shRNA
Expressionsvektors
Schematische Darstellung zur Klonierung des pSicopInsu Dsg 2 shRNA
Vektors
Präparative Restriktionsverdaus der Vektoren pSico Dsg 2 shRNA und
pInsu
Analyse potenzieller pSicopInsu Dsg 2 shRNA Bakterienklone
Präparativer Restriktionsverdau des pSicopInsu Dsg 2 shRNA Plasmids
für die Mikroinjektion
Generierung und Genotypisierung der Dsg 2 knock down Mäuse
Western Blot von pSicopInsu Dsg 2 shRNA/Rosa26CreERT2 Mäusen
nach Tamoxifenbehandlung
Immunfluoreszenz von Leberschnitten der bitransgenen knock down
Maus
Endoskopische Untersuchung der Dsg 2 knock down/VillinCreERT2
Mäuse nach Induktion von Colitis ulcerosa
5
8
18
75
76
77
78
81
82
85
86
87
87
89
90
91
93
94
95
98
101
102
105
106
107
108
110
112
114
118
V
____________________________________________________________________
A
Abb
as
bp
bzw
C
Ci
cpm
DNA
dNTP
Dox
fw
g
G
kb
l
M
mg
min
ml
mM
u. a.
µF
µg
µl
µm
N
nt
OD
polyA
rev
RNA
rpm
s
sec
T
Tam
tetO
TetR
U
u
U/min
V
z.B.
Adenin
Abbildung
antisense
Basenpaar/e
beziehungsweise
Cytosin
Curie
counts per minute
Desoxyribonukleinsäure
Desoxynukleosidtriphosphat
Doxyzyklin
forward
Gramm
Guanin
Kilobasenpaare
Liter
Molar
Milligramm
Minute/n
Milliliter
Millimolar
und andere
Mikrofarray
Mikrogramm
Mikroliter
Mikrometer
beliebiges Nukleotid
Nukleotid/e
Optische Dichte
poly adenylation signal
reverse
Ribonukleinsäure
rounds per minute
sense
Sekunde
Thymin
Tamoxifen
Tetrazyklin Operatorsequenz
Tetrazyklin – abhängiger Repressor
Urazil
units
Umdrehungen/Minute
Volt
zum Beispiel
VI
Einleitung
____________________________________________________________________
1 Einleitung
1.1 Zelladhäsion
1.1.1 Die Bedeutung der Zelladhäsion
Damit sich Strukturen und Organe ausbilden können, müssen dreidimensionale
Zellverbände gebildet werden. Dazu ist die Zelladhäsion eine Grundvoraussetzung
(Gumbiner, 1996). Während der Morphogenese entstehen unter Neubildung von
Zellkontakten in Verbindung mit dem Zytoskelett mechanische Kräfte, die
Veränderungen in Zellform und Bewegung modulieren. Durch diese molekularen
Vorgänge werden Zellflächen in räumliche Strukturen umgewandelt. Zellen „kleben“
in einem solchen Zellverband nicht einfach aneinander, sondern sind in
unterschiedlichen
und
komplexen
Mustern
organisiert.
Verschiedene
Adhäsionsmechanismen verhelfen den Zellen zum Zusammenhalt und bestimmen,
gemeinsam mit den internen Zytoskelettstrukturen, die Gesamtarchitektur des
Gewebes. Die funktionellen Einheiten der Zelladhäsion sind Multiproteinkomplexe,
die im wesentlichen aus drei Klassen von Proteinen bestehen: Zelladhäsionsmoleküle
(CAM, cell adhesion molecules), extrazelluläre Matrixproteine (ECM) und
zytoplasmatische Plaqueproteine. Die meisten Zelladhäsionsmoleküle sind an den
Regionen des Zellkontakts lokalisiert. Typischerweise handelt es sich um
transmembrane Glykoproteine, deren extrazelluläre Domäne die Adhäsion mit
benachbarten Zellen vermittelt. Die zytoplasmatische Domäne dieser Proteine ist in
der Regel mit Elementen des Zytoskeletts verknüpft. Bei den fünf Klassen von CAMs
unterscheidet man Mitglieder der Immunglobulin-, Integrin-, Mukin-, Cadherinsowie Selektin-Superfamilien. Bei einer Vielzahl von Zellen wird die Zelladhäsion
durch Verwendung verschiedener CAMs vermittelt (Lodish et al, 2000). Damit
Zellen in einem Gewebe funktionieren können, sind spezialisierte Zellverbindungen
unerlässlich. Als Hauptklassen der Zellverbindungen sind Verschlusskontakte,
Kommunikationskontakte und Adhäsionskontakte zu unterscheiden, wobei adherens
junctions und Desmosomen zu letzteren zu zählen sind (eine Übersicht dazu gibt
Tabelle 1.1). Zell-Zell und Zell-Matrix Verbindungen haben eine Strukturgebende
Funktion. Durch Verknüpfung des Zytoskeletts benachbarter Zellen werden so
assoziierte Zellen in einen Gewebeverband integriert. Die solche Zellverbindungen
1
Einleitung
____________________________________________________________________
vermittelnden
Strukturen
sind
in
die
folgenden
drei
Klassen
unterteilt:
Zelladhäsionsmoleküle, die benachbarte Zellen verbinden, Adapterproteine, die
CAMs mit Aktin- oder Keratinfilamenten verknüpfen, und die Filamente des
Zytoskeletts selbst.
Verschlusskontakte
(occluding junctions)
tight junctions
septate junctions
Adhäsionskontakte
(anchoring junctions)
Aktinfilamente: adherens junctions (Zell-Zell)
focal adhesion (Zell-Matrix)
Intermediärfilamente: Desmosomen (Zell-Zell)
Hemidesmosomen (Zell-Matrix)
Kommunikationskontakte
(communicating junctions)
gap junctions
Tabelle 1.1: Übersicht über die verschiedenen Zellverbindungen
1.1.2 Ausbildung von Zellverbindungen durch Cadherine
Die Zelladhäsionsmoleküle (CAMs) der Cadherinsuperfamilie können adherens
junctions und Desmosomen bilden. Sie stellen die bedeutendsten adhäsiven Zell-Zell
Verbindungen epithelialer Zellen dar. Desmosomen und adherens junctions kommen
zusammen in der gleichen Zelle vor und bewirken, dass Zellform und Gewebeeinheit
beibehalten werden (He et al, 2003). Sowohl adherens junctions als auch
Desmosomen sind mit dem Zytoskelett verbunden und bewirken die notwendige
mechanische Kopplung zwischen den Zellen. Den beteiligten CAMs (klassische und
desmosomale Cadherine) sind die fünf hintereinander angeordneten extrazellulären
Domänen (EC 1-5) mit Kalziumbindemotiv, der Besitz einer Membrandurchspannenden sowie einer zytoplasmatischen Domäne gemeinsam (Ozawa, 1995).
Dabei ist die Homologie von klassischen zu desmosomalen Cadherinen in der
extrazellulären Domäne am größten.
Um die Zellverbindungen zu ermöglichen, sind die adherens junctions und
Desmosomen
aufbauenden
Einzelproteine
ähnlich
angeordnet.
Über
eine
zytoplasmatische Domäne binden die Cadherine an Armadilloproteine, die über
Linkerproteine mit dem Zytoskelett assoziiert sind. Im N-terminalen Bereich stellen
die Glykoproteine Kalzium-abhängige Verbindungen zu Cadherinen benachbarter
2
Einleitung
____________________________________________________________________
Zellen her. Eine Übersicht zu Desmosomen- und adherens junctions-bildenden
Proteine gibt Tabelle 1.2.
In adherens junctions verbindet das zu den klassischen Cadherinen gehörende ECadherin via α- und β-Catenin, Plakoglobin (δ-Catenin) sowie Vinculin und αAktinin, Aktinmikrofilamente benachbarter Zellen miteinander. Die klassischen
Cadherine vermitteln homophile Adhäsion zwischen angrenzenden Zellen und bilden
zusätzlich innerhalb einer Zelle laterale Dimere aus (Angst et al, 2001). Adherens
junctions sind evolutionär älter als Desmosomen und werden sowohl während der
Embryogenese als auch bei Entwicklung adulter Gewebestrukturen aufgebaut
(Ohsugi et al, 1996; Keiffer-Combeau, 2001). Bei Kalzium-induzierter Zell-ZellKontaktbildung werden zuerst adherens junctions geformt. Während dieser ersten
Zellkontaktbildungen interagieren desmosomale Proteine mit denen der adherens
junctions (Hanakawa et al, 2000). Vermittelt durch diesen cross-talk werden dann in
einem zweiten Schritt Desmosomen ausgebildet, welche die zuvor gebildeten
Primäradhäsionen weiter stabilisieren (Garrod et al, 2002).
In der basalen Schicht der Epidermis funktionieren Zellkontaktverbindungen
synergistisch. Ein doppel-knock out von P-Cadherin (klassisches Cadherin) und
Desmoglein 3 (desmosomales Cadherin) im Mausmodell resultierte so in einem
stärkeren, prononcierteren Phänotyp als die beiden einzel-knock outs (Lenox et al,
2000). Des weiteren gibt es Hinweise, dass die Ausbildung von Desmosomen indirekt
durch adherens junctions reguliert wird: Ein gegen E-Cadherin gerichteter Antikörper
blockierte nicht nur die Bildung von adherens junctions, sondern darüber hinaus auch
die Desmosomenformation (Gumbiner et al, 1998).
Zellverbindung
Desmosom
adherens junction
Cadherine
Desmosomale Cadherine:
Desmogleine
Desmocolline
Klassische Cadherine:
E-, N-, P-Cadherin
Armadilloproteine
Plakoglobin
Plakophiline
Linkerproteine
Desmoplakine
Envoplakin
Periplakin
α-Catenin
β-Catenin
Plakoglobin
Vinculin
α-Aktinin
Tabelle 1.2: Übersicht zu den an Desmosomen- und adherens junction-Bildung beteiligten
Proteinen
3
Einleitung
____________________________________________________________________
1.1.3 Komponenten und Struktur von Desmosomen
Desmosomen sind hoch organisierte adhäsive interzelluläre Verbindungen. Sie
vermitteln den direkten Zellkontakt und verleihen Geweben mechanische Integrität
durch Bereitstellen von Anheftungspunkten für Intermediärfilamente. Historisch
gesehen wurden Desmosomen zum ersten Mal aus der Nasenepidermis der Kuh
isoliert (Skerrow und Matolsky, 1974). Heute ist klar, dass die Rolle der
Desmosomen in der Ausbildung interzellulärer Verbindungen besteht, die adhäsive
Festigkeit von Zellstrukturen vermitteln. Belegt wird dies durch verschiedene
Krankheiten des Menschen und experimentelle Mausmodelle. Hierbei werden
desmosomale Proteine durch Genmutationen, Autoimmunantikörper oder bakterielle
Toxine in ihrer Funktion dereguliert. Häufigstes Resultat sind epitheliale Brüchigkeit
und Blasenbildung, besonders bei mechanischem Stress, was zu diversen Haut- und
Herzkrankheiten führt (Amagi et al, 2000; Armstrong et al, 2001; Den et al, 2005;
Gallicano et al, 2001; Gerull et al, 2004; Grossmann et al, 2004; Jahoda et al, 2003;
McGrath, 2005; Polakis, 1995; Ruiz et al, 1996; Stanley, 1995; Zlotogorski et al,
2006).
Eine schematische Übersicht zum Aufbau von Desmosomen ist in Abbildung 1.1
gegeben. Im elektronenmikroskopischen Bild ergibt sich ein symmetrischer,
scheibenförmiger Aufbau bestehend aus zwei Hauptdomänen: Die extrazelluläre
Core-Domäne oder Desmoglea ist 30 nm breit und durch die elektronendichte
Mittellinie halbiert, welche eine Reißverschluss-ähnliche adhäsive Schnittstelle von
desmosomalen
Cadherinen
benachbarter
Zellen
repräsentiert.
Parallel
zur
Plasmamembran verlaufen zytoplasmatische Plaques (outer und inner dense plaque),
die durch weniger kondensierte Bereiche abgegrenzt sind (North et al, 1999). Der
Durchmesser eines Desmosoms beträgt 0,5 bis 1 µm.
4
Einleitung
____________________________________________________________________
Intrazellulärraum
Interzellulärraum
Intrazellulärraum
(Desmoglea)
DP
PP
PG
Dsc
Dsg
IF
Plasmamembran
EDM
ODP
IDP
Abb. 1.1: Schematische Darstellung eines Desmosoms
Angedeutet durch die Plasmamembranen sind zwei benachbarte Zellen gezeigt. Die Desmogleine
(Dsg) und Desmocolline (Dsc) gehen im Interzellulärraum Kalzium-abhängige Verbindungen
ein. Über ihren C-Terminus findet die Interaktion mit den Plakophilinen (PP), Plakoglobin (PG)
und Desmoplakinen (DP) statt. Desmoplakin verknüpft den Multiproteinkomplex mit den
Intermediärfilamenten (IF).
EDM Elektronen-dichte Mittellinie, ODP outer dense plaque, IDP inner dense plaque
Die Adhäsionsmoleküle der Desmosomen sind die desmosomalen Cadherine. Im
Unterschied zu den adherens junctions besitzen Desmosomen zwei Typen von
adhäsiven
Glykoproteinkomponenten,
die
Desmogleine
und
Desmocolline.
Ursprünglich wurde der Begriff Desmoglein für alle desmosomalen Glykoproteine
verwendet. Cowin und Kollegen führten den Terminus Desmocollin ein, um zwei
Typen
von
Glykoproteinen
zu
unterscheiden,
die
in
immunologischen
Untersuchungen verschiedene Eigenschaften zu haben schienen (Cowin et al, 1984).
Die Homologie zwischen ihnen ist nicht größer als zu den klassischen Cadherinen
und liegt bei 51-55 % Identität in der Aminosäuresequenz (Huber, 2003). Gemeinsam
ist den desmosomalen Cadherinen der Besitz von vier extrazellulären CadherinRepeats, bestehend aus je 110 Aminosäuren, sowie je einer extrazellulären
Ankerdomäne, einer Membran-durchspannenden und einer zytoplasmatischen
Domäne. In letzterer liegt der Hauptunterschied zwischen Desmogleinen und
Desmocollinen. Nur die Desmogleine haben eine ausgedehnte intrazelluläre Domäne
5
Einleitung
____________________________________________________________________
mit Prolin-reicher Linkerregion gefolgt von einer repeated unit Domäne und der
Glyzin-reichen Dsg-Terminaldomäne (Rezension in Huber, 2003).
Desmogleine und Desmocolline kommen in verschiedenen Subtypen vor, die
gewebespezifisch und differenzierungsabhängig exprimiert werden (Koch et al,
1991). Bisher wurden für Mensch und Maus drei verschiedene Desmocolline (Dsc 13) beschrieben, die Produkte verschiedener Gene sind und jeweils in zwei alternativen
Spleiß-Formen vorkommen. Man unterscheidet eine längere ´a` von einer kürzeren
´b` Form. Letzterer fehlt das intrazelluläre Cadherinsegment, über welches die
Interaktion mit Plakoglobin, einem Armadilloprotein, stattfindet.
In der Maus sind sechs, beim Menschen vier Desmogleingene zu unterscheiden. Im
Menschen bilden sie zusammen mit den Desmocollingenen ein Kluster auf
Chromosom 18q12 (Hunt et al, 1999). In der Maus sind die desmosomalen Cadherine
auf Chromosom 18 tandemartig angeordnet (Whittock, 2003). Während die
Expression der Isoformen 1 und 3 der Desmocolline (Dsc) und Desmogleine (Dsg)
auf mehrschichtige und differenziertere Epithelien (beispielsweise Epidermis)
beschränkt sind, kommen Dsg 2 und Dsc 2 in allen Desmosomen-bildenden
Geweben, einfachen Epithelien und auch in nicht-Epithelgewebe vor (Schäfer et al,
1994; siehe dazu auch Tabelle 1.3). Bisher wurde die Expression von Dsg 2 und Dsc
2 für Epidermis, Zunge, Tonsillen, Lymphknoten, Luftröhre, Speicheldrüse, Magen,
Darm, Niere, Blase, Leber, Milz und Myokard beschrieben (Schäfer et al, 1994). Dsg
4 besitzt eine hohe Homologie zu Dsg 3 und wird in den differenzierten
Epithelschichten, vor allem in Speicheldrüse, Testis, Prostata und Haut, sowie von
Tag 7 bis 17 während der Mausembryogenese exprimiert (Whittock und Bower,
2003; Whittock, 2003; Yin und Green, 2004). Die erst kürzlich beschriebenen
Desmogleine 5 (Dsg 1β) und 6 (Dsg 1δ) der Maus sind beim Menschen bisher nicht
gefunden worden. Sie besitzen hohe Homologie zu Dsg 1 und werden während
verschiedener Zeitpunkte der Entwicklung gebildet (Pulkkinen et al, 2002; Kljuic und
Christiano, 2003; Whittock, 2003). Dsg 5 wird an Tag 17 der Embryogenese (E17)
sowie in der adulten Epidermis exprimiert (Whittock, 2003). Das Vorkommen von
Dsg 6 ähnelt eher dem Expressionsmuster von Dsg 2, da es in Organen wie
Epidermis, Uterus, Testis, Skelettmuskel und Gehirn zu finden ist. RT-PCR (reverse
Transkriptase PCR) Ergebnisse zeigten Expression von Dsg 6 in der Leber (Kljuic
und Christiano, 2003; Whittock, 2003). In diesem Organ war zuvor nur die
Expression von Dsg 2 beschrieben (Schäfer et al, 1994).
6
Einleitung
____________________________________________________________________
Dsg 1
Dsg 2
Dsg 3
Dsg 4
Dsg 5
Dsg 6
Epidermis, Zunge, Tonsillen, Luftröhre
Epidermis, Zunge, Tonsillen, Lymphknoten, Luftröhre, Speicheldrüse, Magen,
Darm, Niere, Blase, Leber, Milz, Myokard
Epidermis, Zunge, Tonsillen, Luftröhre
Speicheldrüse, Testis, Prostata, Haut, und von Tag 7 bis 17 während der
Mausembryogenese
Epidermis und an Tag 17 der Mausembryogenese
Epidermis, Uterus, Testis, Skelettmuskel, Leber, Gehirn
Tabelle 1.3: Expressionsmuster der Desmoglein-Isoformen
Dsg 1-4 werden sowohl beim Menschen als auch in der Maus exprimiert. Expression von Dsg 5 und 6
ist bisher nur für die Maus beschrieben.
In der Epidermis werden Dsg 2 und Dsc 2 ausschließlich in der Basalschicht
exprimiert (siehe dazu auch Abb. 1.2). Die Expressionslevels von Dsg 3 und Dsc 3
sind in der basalen Schicht der Epidermis hoch und nehmen im Spinosum zum
Granulosum hin stetig ab. Genau umgekehrt verhält es sich für Dsg 1 und Dsc 1,
welche die stärkste Expression in der unterhalb des Corneums liegenden Schicht, dem
Granulosum, haben und im Spinsosum zur Basalmembran hin immer schwächer
exprimiert werden. Dsg 4 wird in Granulosum und Spinosum etwa gleich exprimiert.
Aufgrund dieser unterschiedlichen Verteilung der Isoformen in den verschiedenen
Schichten der Epidermis liegt die Vermutung nahe, dass es während der
Differenzierung zu einem turn-over der einzelnen Isoformen kommt. Ferner muss
eine Interaktion zwischen verschiedenen Isoformen möglich sein, da auch zwischen
Basalschicht und den suprabasalen Schichten Desmosomen ausgebildet werden
(Legan et al, 1994). Eine weiterer Faktor, der zur Regulation der Expression
desmosmaler Cadherine beitragen könnte, sind Hormone, welche im Tiermodell zur
Umverteilung der Desmosomenexpression im Uterusepithel beitrugen (Preston et al,
2004). Verschiedene Isoformen desmosomaler Cadherine können innerhalb eines
Desmosoms vorkommen (North et al, 1996). Dabei werden leichte Veränderungen in
der Cadherinstöchometrie bei der Desmosomenbildung toleriert. Diese ist aber
sensitiv in Bezug auf die Isoform-spezifischen Unterschiede in Dsc und Dsg.
Transfektion von ausschließlich Dsg 2 exprimierenden Zellen mit Dsg 1 verhinderte
die Neubildung von Desmosomen und führte zu Unterbrechung bereits bestehender
Zellkontakte (Ishii et al, 2001).
7
Einleitung
____________________________________________________________________
Corneum
Granulosum
Dsg 1
Dsc 1
Spinosum
Basale
Dsg 4
Dsg 2
Dsc 2
Dsg 3
Dsc 3
Abb. 1.2: Differenzierungsabhängige Expression desmosomaler Cadherine in der Epidermis
Schematische Darstellung der Epidermis, in deren Schichten die verschiedenen desmosomalen
Cadherine zu unterschiedlichen Anteilen exprimiert werden. Die Farbintensität der Balken korreliert
mit der Expressionsstärke. Angelehnt an Yin und Green, 2004.
Dsg Desmoglein, Dsc Desmocollin
Im N-terminalen, glykosylierten, interzellulären Bereich gehen die Desmogleine und
Desmocolline Kalzium-abhängige, heterophile Bindungen miteinander ein (Chitaev
und Troyanovsky, 1997) und formen so die elektronendichte Mittellinie der
Desmoglea (Schäfer et al, 1994; siehe auch Abb. 1.1). Homophile Bindungen wie bei
den adherens junctions kommen kaum vor und sind, wenn sie ausgebildet werden,
sehr schwach (Marcozzi et al, 1998; Syed et al, 2002). Über ihren im Zytoplasma
liegenden C-terminalen Bereich sind die desmosomalen Cadherine mit den
Armadilloproteinen Plakoglobin (PG) und Plakophilin (PP) im outer dense plaque
verbunden. Dabei sind für die Interaktion von Desmogleinen mit Plakoglobin die
letzten 41 Aminosäuren der C-terminalen Domäne des Cadherins notwendig
(Troyanovsky et al, 1994).
Die zur Gruppe der Armadilloproteine gehörenden Moleküle PP und PG stellen
wichtige funktionelle und strukturelle Komponenten des Desmosoms dar und sind im
outer dense plaque lokalisiert. Plakoglobin ist ein 86 kDa großes Protein mit
Homologie zu β-Catenin in adherens junctions und dem in Drosophila melanogaster
vorkommenden Protein Armadillo, welches in einem Signalweg zur Etablierung der
Segmentpolarität beteiligt ist und in Antwort auf die Expression des Proteins wingless
hochreguliert wird (Riggelman et al, 1990). Das Vertebraten-Homolog zu wingless,
Wnt-1, führt zu erhöhter Expression von Plakoglobin und β-Catenin und induziert
Veränderungen in Zellform, Adhäsion und Proliferation (Cowin und Burket, 1996).
Des weiteren führt das Proteinprodukt
eines Tumorsuppressorgens (APC,
adenomatous polyposis coli) in humanem Darmkrebs zur Herunterregulation von PG
und β-Catenin (Polakis, 1995). Mutationen in PG führen zu einer unter dem Namen
Naxos Disease bekannt gewordenen Krankheit, die sich durch Verhornung der Haut,
8
Einleitung
____________________________________________________________________
ARVC (arrhytmogenic right ventricular cardiomyopathy) und Veränderungen in der
Haarstruktur (woolly hair) auszeichnet (Rezension in McGrath, 2005). Plakoglobin
setzt sich aus einem N-terminalen Bereich, einer zentralen Domäne mit 12 Arm
(Armadillo)-repeats sowie einem C-terminalen Bereich zusammen. Ein Arm-repeat
besteht aus 42 Aminosäuren, die 3 α-Helices ausbilden, welche eine rechtsdrehende
Superhelix formen. Zusammen bilden sie eine positiv geladene Grube, die eine
Bindestelle für Liganden wie z.B. Cadherine darstellt (Huber et al, 1997).
Homozygote Plakoglobin Nullmutationsmäuse sterben an Tag 12 bis 16 der
Embryogenese aufgrund von Herzfehlern (Ruiz et al, 1996). Im Herz der knock out
Embryonen werden keine Desmosomen gebildet, wodurch die Herzventrikel
zerplatzen und Blut ins Perikard fließt (Ruiz et al, 1996). Plakoglobin kommt als
einziges an der Desmosomenbildung beteiligtes Protein auch in adherens junctions
vor, wo es E-Cadherin mit Akinfilamenten verbindet (Rezension in Kitajima, 2002).
Die
Vermutung
einer
Interaktion
zwischen
den
Proteinen
dieser
beiden
Zellverbindungen liegt aufgrund dessen nahe. Wie bereits erwähnt, führt Blockade
der adherens junctions dazu, das auch die Desmosomenbildung verhindert wird.
Bindung von Plakoglobin an E-Cadherin und die Ausbildung von adherens junctions
könnte somit Grundvorrausetzung für die Ausformung von Desmosomen sein. Die
Affinität von Plakoglobin für die Bindung an Cadherine ist am größten für Dsg, dann
Dsc und am geringsten für die Assoziation mit E-Cadherin (Chitaev, 1996).
Man unterscheidet drei Spleißvarianten von Plakophilin (PP 1-3), wobei PP 1
ursprünglich als „Bande 6 Protein“ und zusätzliches desmosomales Plaqueprotein aus
komplexen Epithelien in Anbindung an Keratin isoliert wurde (Mertens et al, 1996).
Gleich
den
desmosomalen
Cadherinen,
werden
die
Plakophiline
differenzierungsabhängig exprimiert. Plakophilin 1 findet man in mehrschichtigen
und komplexen Epithelien, PP 2 in den Desmosomen vieler Zelltypen und PP 3 in
einfachen und komplexen Epithelien (North et al, 1999). Die Plakophiline sind
homolog zu p120ctn, einem Tyrosinkinasesubstrat, welches mit E-Cadherin assoziiert
und in Zelladhäsion sowie Signaltransduktion involviert ist (Rezension in Huber,
2003). Ebenso wie Plakoglobin kommen PP 1 und PP 2 auch im Nukleus vor. In
Zellen ohne Desmosomen, wie zum Beispiel Lymphozyten, sind die Plakophiline
ausschließlich im Zellkern lokalisiert (Huber, 2003). Über ihre N-terminale
Kopfdomäne
findet
die
Interaktion
mit
Desmogleinen,
Desmocollinen,
Desmoplakinen und Plakoglobin statt. Diese Brückenfunktion spielt eine Rolle bei
9
Einleitung
____________________________________________________________________
der Organisation des desmosomalen Plaque. Die aus 10 Arm-repeats bestehende
Armadillo-Domäne ist wahrscheinlich zur Regulierung der Interaktion mit
Aktinfilamenten notwendig (Kitajima, 2002). Verlust von PP 1 führt zu einer
autosomal rezessiven Störung in der Haut (skin fragility ectodermal-dysplasia
syndrome), die sich durch Blasenbildung und Verkrustungen der Epidermis,
besonders im Bereich des Mundes sowie an Handflächen und Fußsohlen auszeichnet
(Rezension in McGrath, 2005). Knock out Mäuse von PP 2 zeigten an Tag 10,5
(E10,5) embryonale Letalität (Grossmann et al, 2004). Fehlerhafte Anordnung im
Zytoskelett des Herzens führte in diesen Tieren zum Auslaufen des Blutes in die
Peritonealhöhle. Da Epithelien aber normale Zellverbindungen zeigten, liegt der
Schluss nahe, dass PP 2 eine essenzielle strukturelle Komponente des Herzens
darstellt. In Korrelation dazu wurden bei 32 von 120 Patienten mit ARVC
verschiedene Mutationen in PP 2 gefunden (Gerull et al, 2004). Verlust von PP 2
verhindert die Ausbildung von Zellkontakten im Herzen und kann bei starker
mechanischer Beanspruchung zum plötzlichen Herztod führen, was vor allem bei
Sportlern in der Vergangenheit nachgewiesen wurde (Rezension in McGrath, 2005).
Plakine
sind
Linkerproteine,
welche
Membranproteine
und
Keratinintermediärfilamente miteinander verbinden. In Desmosomen findet man
hauptsächlich Desmoplakin (DP) 1 und 2, und zu geringeren Anteilen Envoplakin
und Periplakin. Die 250 kDa und 220 kDa großen Isoformen von Desmoplakin
entstehen durch alternatives Splicing und liegen im outer und inner dense plaque des
Desmosoms (Abb. 1.1). In der N-terminalen Plakindomäne befinden sich
Bindestellen für Plakoglobin und Plakophilin. Über den aus drei Plakin-repeat
Domänen bestehenden globulären C-Terminus findet die Interaktion mit den
Intermediärfilamenten statt und durch die zentrale coiled-coiled Domäne können
parallele Dimere gebildet werden (Smith und Fuchs, 1998). Desmoplakine können
über Armadillo-unabhängige Domänen im C-terminalen Bereich von Desmoglein
auch direkt Interaktionen mit diesem eingehen (Garrod et al, 2002). Autosomal
rezessive Mutationen in DP führen zum so genannten Carvajal Syndrom, welches
sich ähnlich der Naxos Disease (Verhornung der Haut, ARVC, woolly hair) äußert
(Rezension in McGrath, 2005).
In Tabelle 1.4 ist eine Übersicht zu den Mutationen in desmosomalen Proteinen und
den daraus resultierenden Phänotypen gegeben.
10
Einleitung
____________________________________________________________________
Gen
Desmoglein 1
Desmoglein 2
Desmoglein 3
Desmoglein 4
Plakoglobin
Plakophilin 1
Plakophilin 2
Desmoplakin
Mutation/Transgen
α-Dsg 1 IgG
Serinprotease (S. aurens)
knock out Maus
Mutationen
α-Dsg 3 IgG
knock out Maus
Mutationen
frameshift Mutation
knock out Maus
Nullmutation
knock out Maus
verschiedene Mutationen
Mutation
Phänotyp
Pemphigus foliaceus
epitheliale Blasenbildung
embryonal letal
ARVC
Pemphigus vulgaris
Hautverkrustung, Haarverlust, orale Läsion
LAH, Monilethrix
Naxos Disease
embryonal letal (Herzfehler)
skin fragility ectodermal-dysplasia syndrome
embryonal letal (keine Zellkontakte im Herz)
ARVC
Carjaval Syndrom
Tabelle 1.4: Desmosomale Proteine in Entwicklung und Krankheit
ARVC arythmogenic right ventricular cardiomyopathy, LAH localized autosomal recessive
hypotrichosis
Desmosomen entstehen ab dem 32 Zell-Stadium im Trophoektoderm der Maus
(Garrod et al, 1996). Durch Regulation der Transkription wird das Expressionsmuster
desmosomaler Cadherine und deren Einbau in die Zellverbindungen spezifiziert.
Dadurch werden die Funktionen der Proteine in Adhäsion und Morphogenese in
verschiedenen Zellen und komplexen Geweben reguliert (Yin und Green, 2004).
Aufbau und Degradation von Desmosomen wird posttranskriptionell durch
Kalziumionen, Kinase/Phosphatase-Aktivität, proteolytische Prozessierung und
cross-talk mit adherens junctions reguliert (Yin und Green, 2004). Bei
Kalziumkonzentrationen unterhalb von 0,1 mM werden in nicht konfluenten
Keratinozytenkulturzellen keine Desmosomen mehr ausgebildet. (Hennings et al,
1983). In vivo spielt dieser regulatorische Mechanismus wahrscheinich nur eine
untergeordnete Rolle, da die physiologische Kalziumkonzentration oberhalb von 0,1
mM liegt. Eine Ausnahme stellen Hailey-Hailey Disease und Darier´s Disease dar.
Durch Mutationen in Kalzium-ATPasen kommt es hier zu desmosomaler
Fehlfunktion und damit zum Verlust der Zelladhäsion (Hu et al, 2000). Durch
Aktivierung und Inhibition von Proteinkinase C (PKC) verändern Desmosomen ihre
Adhäsionseigenschaften. Konfluente Kulturzellen bilden Desmosomen Kalziumunabhängig aus. Durch Verletzung einschichtiger Zellrasen transloziert PKC in die
Zellperipherie, wo die Kinase durch Phosphorylierung desmosomaler Proteine
bewirkt, dass die Bildung von Desmosomen wieder Kalzium-abhängig wird (Garrod
et al, 1996; Gaudry et al, 2001; Wallis et al, 1999). Durch posttranslationale
Ereignisse wird die Menge an nicht in den Desmosomen vorkommendem Plakoglobin
11
Einleitung
____________________________________________________________________
sowie Plakophilin 1 und 2 gesteuert, welche über Importin in den Nukleus gelangen
(Cowin und Burket, 1996; Huber, 2003).
Die Bildung der Desmosomen besteht also aus drei miteinander verwobenen
Prozessen: adhäsive Interakion zwischen den Cadherinen, Cadherinklusterbildung
und Verankerung der Cadherine ans Zytoskelett (Gloushankova et al, 2003). Zuerst
werden die desmosomalen Cadherine an der Zelloberfläche exprimiert und bilden im
Intrazellulärraum Verbindungen miteinander aus. Über Interaktion mit den
zytoplasmatischen desmosomalen Proteinen findet dann die Verknüpfung mit den
Intermediärfilamenten statt (Huber, 2003).
Während der epidermalen Differenzierung migrieren Keratinozyten von der
Basalschicht zum Corneum. Diese dynamische und organisierte Zellwanderung
erfordert ständigen Auf- und Abbau der Desmosomen (Kitajima, 2002). Desmosomen
sind daher keine statischen Strukturen, sondern eher dynamische Einheiten, die
Zellbeweglichkeit innerhalb der Epidermis erlauben. In time-spacing Diagrammen
wurde gezeigt, dass desmosomale Positionierung streng reguliert ist, auch während
Veränderungen in der Zellform (Windoffer et al, 2002).
Wie
bereits
erwähnt,
existieren
mehrere
natürlich
vorkommende
humane
Genmutationen in desmosomale Komponenten, welche in vor allem das Herz und die
Haut betreffenden Krankheiten resultieren. Auf die mit den desmosomalen
Cadherinen verknüpften Krankheiten wird im folgenden näher eingegangen. Bei den
Autoimmunkrankheiten vom Pemphigus-Typ resultiert die Blasenbildung der Haut
aus dem Verlust der Zell-Zell-Kontakte (Stanley, 1995). Bei Pemphigus foliaceus
findet der Verlust der Zellkontaktbildung im Granulosum, der oberen Schichten der
Epidermis, statt und wird durch Autoantikörper gegen Dsg 1 herbeigeführt.
Autoantikörper gegen Dsg 3 führen zum Zelladhäsionsverlust von tiefer in der
Epidermis liegenden Schichten oberhalb der Basalmembran und resultieren im
Krankheitsbild des Pemphigus vulgaris (PV). Die Antikörper binden in beiden
Krankheiten an die extrazelluläre Domäne der Cadherine und können sowohl in der
Haut als auch im Serum der Patienten nachgewiesen werden (Garrod et al, 2002;
Stanley, 1995). Dsg 3 knock out Mäuse zeigten normales Aussehen zum Zeitpunkt
der Geburt, hatten jedoch an Tag 8-10 deutlich geringeres Gewicht als nichttransgene Geschwistertiere (Koch et al, 1997). Dies resultierte aus Inhibition der
12
Einleitung
____________________________________________________________________
Nahrungsaufnahme durch orale Läsionen, welche typisch für Pemphigus vulgaris
sind. Des weiteren zeigten Dsg 3 knock out Mäuse Verkrustung der Haut und
Haarverlust. Dieser Phänotyp ähnelt dem der balding (bal) Mausmutante, welche eine
Mutation im Dsg 3 Gen trägt (Koch et al, 1997). Shimizu und Kollegen zeigten mit
Hilfe eines PV Mausmodells, dass anti-Dsg 3 Antikörper Dsg 3 direkt in den
Desmosomen binden können, wodurch es zu Separierung der Desmosomen und zur
Blasenbildung in der Epidermis kommt (Shimizu et al, 2004). Bei mit Staphylococcus
aurens infizierten Patienten spaltet die bakterielle Serinprotease Dsg 1, was in
Inaktivierung von Dsg 1 resultiert und sich in epithelialer Blasenbildung äußert
(Amagi et al, 2000). Mutationen in Dsg 4 resultieren in Hautkrankheiten wie
localized autosomal recessive hypotrichosis (LAH) und Monilethrix, einem
angeborenen Defekt des Haares (Jahoda et al, 2003; Zlotogorski et al, 2006). Zudem
wurden Autoantikörper gegen Dsg 4 in Pemphigus vulgaris detektiert (Kljuic et al,
2003). Fehlerhafte Regulation von Dsg 2 und mit diesem desmosomalen Cadherin in
Zusammenhang zu bringende Krankheiten werden im Abschnitt über Dsg 2 (1.2)
besprochen und erste funktionelle Daten zur Deregulierung von Dsg 2 in der adulten
Maus werden im Ergebnisteil vorgestellt.
Interessanterweise
stehen
Funktion
und
Deregulierung
von
desmosomalen
Proteinkomplexen nicht nur in ursächlichen Zusammenhang mit Herz-, Haut- und
Autoimmunkrankheiten, sondern sind darüber hinaus mit Krebserkrankungen
assoziiert. Bei wenig differenzierten Karzinomen und schuppigen Zellkarziomen
(SCC, squamous cell carcinoma) wurde berichtet, dass die Expression der
Desmosomen herunterreguliert wird (Davies et al, 1999; Garrod, 1995; Hardman et
al, 2005). Dies deutet auf eine mögliche Funktion desmosomaler Proteine als
Suppressor der Metastasierung hin, welches aufgrund der strukturellen Rolle der
Desmosomen (Zelladhäsion und Gewebestabilität) denkbar wäre. Es gibt aber auch
Tumore mit intakten Desmosomen (Garrod, 1995). Für eine Metastasierung dieser
Tumore müsste ein Mechanismus postuliert werden, welcher temporär die adhäsive
Affinität der metastasierdenden Zellen moduliert. Transfektion von Dsg, Dsc und PG
in nicht-adhärenten Fibroblasten führte zu deren Adhäsion sowie Verhinderung von
Invasion auf Kollagengel (Tselepis et al, 1998). Daraus ist zu schließen, dass
desmosomale Adhäsion die Invasion, zumindest in Kulturzellen, stoppen kann.
Weiter deutet die differenzierungsabhängige und gewebespezifische Verteilung der
verschiedenen Isoformen desmosomaler Cadherine darauf hin, dass desmosomale
13
Einleitung
____________________________________________________________________
Komponenten zusätzlich zu ihrer strukturgebenden Funktion ebenfalls eine wichtige
Rolle für die Morphogenese und Differenzierung verschiedener Gewebe, besonders
der Epidermis, haben könnten.
1.2 Desmoglein 2
Desmoglein 2 ist das größte und am weitesten verbreitete desmosomale Cadherin. Es
wird in allen Desmosomen-tragenden Zellen, auch in einfachen Epithelien wie dem
Darmepithel, gebildet (Schäfer et al, 1994). Damit ist es in einigen Organen
(Lymphknoten, Magen, Darm, Niere, Blase, Myokard) das einzige exprimierte
Desmoglein. Des weiteren unterscheidet es sich in seiner Aminosäuresequenz stärker
von den anderen Desmogleinen als diese untereinander (Schäfer et al, 1994). In
Zusammenhang mit Dsg 2 wurden bisher keine zu einer Hautkrankheit führenden
Autoantikörper beschrieben, wie es für Dsg 1 (Pemphigus foliaceus) und Dsg 3
(Pemphigus vulgaris) der Fall ist. Fehlerhafte Expression von Dsg 2 steht in
Zusammenhang mit anderen Erkrankungen. Davies und Kollegen konnten in
humanem Brustkrebsgewebe kein Dsg 2 detektieren, welches in normalem
Brustgewebe vorhanden war (Davies et al, 1997). Eine Vorraussetzung für die
Bildung von Metastasen ist der Verlust der Zelladhäsion. Reduzierte oder fehlende
Expression von Zelladhäsionsmolekülen wie Dsg 2 scheinen dabei eine Rolle spielen
zu können. In Magenkarzinomen, besonders denen des diffusen Typs, wurde eine
reduzierte und/oder nicht mit der Membran assoziierte Expression von Dsg 2
gefunden (Biedermann et al, 2005). Bei Patienten mit der chronisch entzündlichen
Darmerkrankung Colitis ulcerosa sind einige Gene der Zelldifferenzierung, unter
anderem Dsg 2, dereguliert (Fukushima et al, 2003). In Zusammenhang mit einer
nicht-entzündlichen Erkrankung des Herzens, der ARVC (arrythmogenic right
ventricular cardiomyopathy), wurden Dsg 2 Genmutationen gefunden (Awad et al,
2006; Pilichou et al, 2006). In Kardiomyozyten, in denen Dsg 2 das einzige
Desmoglein ist, führte Dsg 2 Funktionsstörung zum für ARVC typischen Ersatz der
Kardiomyozyten durch Fettzellen sowie zur Umbildung der Desmosomen.
Inaktivierung von Dsg 2 durch homologe Rekombination in embryonalen
Stammzellen führte im Mausmodell zu früher embryonaler Letalität (Eshkind et al,
2002). Alle homozygoten und auch einige heterozygote knock out Embryonen starben
14
Einleitung
____________________________________________________________________
während oder kurz nach der Implantation. Die Blastozysten bildeten zwar eine
normale Trophoektodermschicht aus, in welcher normalerweise die ersten
Desmosomen gebildet werden, doch kam es aufgrund des Fehlens von Dsg 2 zu
gestörter Verteilung von Desmoplakin. Dieses wurde nicht mehr an den Zellgrenzen
zur Ausbildung der Zellkontakte lokalisiert, sondern war diffus im Zytoplasma
verteilt (Eshkind et al, 2002). Des Weiteren wird Dsg 2 für die Proliferation von
embryonalen Stammzellen gebraucht (Eshkind et al, 2002). Dies deutet auf eine
Funktion von Dsg 2 hin, die unabhängig der Desmosomenbildung ist. Diese Funktion
muss darüber hinaus essenziell für die normale Entwicklung des Embryos sein. In der
hier vorliegenden Arbeit sollte die Funktion von Dsg 2 mittels induzierbarem in vivo
knock down untersucht werden. Dazu wurde die Technologie der RNA Interferenz
verwendet, die in den folgenden Kapiteln näher vorgestellt wird.
1.3 Kleine regulatorische RNAs
Die Bezeichnung „RNA Welt“ prägte die Beschreibung eines hypothetischen
Zeitraumes in der Evolution vor vier Milliarden Jahren, als RNA das genetische
Material und Katalysator entstehender Lebensformen war (Gilbert, 1986). Diese
ursprüngliche RNA Welt ist längst vergangen, aber einige Prozesse in unseren Zellen
reflektieren eine RNA Welt, die lebendig ist: RNA Interferenz (RNAi). Dieser in
Eukaryoten evolutionär konservierte Mechanismus spielt eine essenzielle Rolle in der
Vermittlung einer protektiven Antwort als Schutz gegen exogene RNAs,
beispielsweise von Viren, sowie in der Stabilisierung des Genoms durch Repression
des Springens mobiler genetischer Elemente und ist darüber hinaus an der
Etablierung des silencing von Heterochromatinkomponenten beteiligt (Hall et al,
2002; Li et al, 2002; Pal-Badhra et al, 2004; Shi, 2002; Sijen und Plasterk, 2003;
Szittya et al, 2002; Volpe et al, 2002). Exposition mit fremden genetischen Material
führt in den meisten Organismen zum „Silencing“ der fremden Nukleinsäuren. Im
Zentrum dieses „Immunmechanismus“ steht dsRNA (doppelsträngige RNA). Diese
induziert
Sequenz-spezifisches
post-transkriptionelles
Gensilencing,
einen
Mechanismus, der als RNA Interferenz bezeichnet wird (Fire et al, 1998).
15
Einleitung
____________________________________________________________________
Funktionale Beschreibung des RNAi Mechanismus erfolgte nach Untersuchungen in
C. elegans, die zeigten, dass dsRNA eine effektivere Interferenz der Ziel-mRNA
lieferte als die jeweiligen Einzelstränge (Fire et al, 1998; Guo und Kemphus, 1995).
Die sequenzspezifischen Mediatoren von RNAi stellen 21 und 22 Nukleotid (nt)
lange RNA Fragmente dar, welche als small interfering RNA (siRNA) bezeichnet
werden und durch Prozessierung aus dsRNA Molekülen entstehen (Elbashir et al,
2001). Silencing Phänomene wie RNAi, post-transkriptionelles Gen-Silencing
(PTGS) in Pflanzen, Co-Suppression und Quelling in Pilzen haben einen
gemeinsamen Funktionsmechanismus, der wahrscheinlich in einem gemeinsamen
Vorläufer entstanden ist (Elbashir et al, 2001; Mello und Conte, 2004).
Neben den siRNAs gibt es eine weitere Klasse kleiner regulatorischer RNAs, die
microRNAs (miRNAs; Ambros, 2001; Lagos-Quintana et al, 2001). Zu den
ursprünglich als stRNAs (small temporal RNAs) bezeichneten kleinen RNAs lin-4
und let-7, welche die zeitliche Entwicklung von C. elegans regulieren, wurden viele
ähnliche, zum Teil hoch konservierte, Genprodukte in Invertebraten und Vertebraten
gefunden, die nicht nur in unterschiedlichen Entwicklungsstadien, sondern auch
zelltypspezifisch exprimiert wurden. Daher wurde diese Klasse regulatorischer RNAs
unter dem Namen miRNA zusammengefasst (Lagos-Quintana et al, 2001). Die
miRNAs sind definiert als einzelsträngige, 22 nt lange RNAs, welche mittels RNase
III Enzym Dicer aus einem 70 nt langen hairpin-Vorläufer (pre-miRNA) entstehen
(Kim und Nam, 2006; siehe auch Abb. 1.2). Eine der so entstandenen miRNAs wird
abgebaut (miR* oder meer star). Die andere (reife miRNA) assoziiert mit RISC
(RNA-induced silencing complex) und bindet an eine komplementäre mRNA
Sequenz (Tomari und Zamore, 2005). Dabei ist auch partielle Anbindung der miRNA
möglich, so dass die miRNAs je nach Grad der Komplementarität zum Abbau einer
spezifischen mRNA (miRNA Sequenz über die ganze Länge komplementär zur
mRNA) oder Blockade der Translation durch missmatch-Basenpaarungen führen
(Bonetta, 2004; Jackson und Linsley, 2004). Somit kann eine miRNA mehrere
mRNAs zum Ziel haben und umgekehrt eine mRNA von verschiedenen miRNAs
reguliert werden. Transkription der in inter-Gen Regionen oder in antisenseOrientierung eines Gens liegenden miRNAs findet mittels RNA Polymerase II statt
(Lagos-Quintana et al, 2001; Lee et al, 2004). Das Primärtranskript (pri-miRNA)
wird durch Drosha und DGCR8 (Di George Syndrom Critical Region Gen 8; Pasha
in Drosophila und C. elegans) in eine pre-miRNA prozessiert (Tomari und Zamore,
16
Einleitung
____________________________________________________________________
2004), bevor es mittels Exportin 5 aus dem Nukleus ins Zytoplasma transportiert wird
(Lund et al, 2004; Yi et al, 2003; siehe dazu auch Abb. 1.3).
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass bisher zwei post-transkriptionell
wirksame kleine regulatorische RNA-Spezies entdeckt wurden: Die siRNA und die
miRNA.
1.3.1 Mechanismus der RNA Interferenz
Induziert wird die RNAi Silencing Kaskade durch dsRNA, die homolog der
reprimierenden mRNA ist. Dicer, ein Enzym der RNase III Familie, erkennt und
prozessiert die dsRNA unter ATP-Verbrauch in 21 nt lange siRNA Moleküle mit
charakteristischem 3` Überhang von 2 Nukleotiden, einem 5` Phosphat- und einem 3`
Hydroxy-Terminus (Bernstein et al, 2001; Hutvágner und Zamore, 2002). Im
nächsten Schritt bindet die siRNA an einen Multiproteinkomplex bestehend aus
Helikase, Endonuklease, Exonuklease und „homology searching element“, um RISC
(RNA-induced silencing complex) zu formen (Hammond et al, 2000). Die Helikase
führt mittels ATP zur Entwindung der doppelsträngigen siRNA in einzelsträngige
Moleküle (Nykanen et al, 2001), wobei RISC aktiviert wird. Einer der RNA-Stränge
(guide strand) bleibt an den Multiproteinkomplex gebunden, der andere (passanger
strand) wird degradiert. Der aktivierte RISC sucht nach zur siRNA homologen
mRNA Sequenz und bindet an diese (Nykanen et al, 2001). Durch die Aktivität von
Exo- und Endonuklease wird die mRNA anschließend degradiert. Diese mRNA
Degradation resultiert so in einer Blockade der Proteinsynthese und führt somit zu
einer Herunterregulierung des entsprechenden Genprodukts. In Abbildung 1.3 ist der
Mechanismus von siRNA und miRNA schematisch dargestellt.
In Pflanzen und bei Würmern, nicht aber bei Drosophila und Säugern, gibt es einen
zusätzlichen Amplifikationsmechanismus, der als sekundäre oder transitive RNAi
bezeichnet wird (Tomari und Zamore, 2005). Eine RNA-abhängige RNA Polymerase
(RdRP) amplifiziert dabei dsRNA unter Verwendung der mRNA als Matrize und der
im ersten Schritt entstandenen einzelsträngigen siRNA als Primer. Dicer spaltet diese
dsRNA in siRNA Moleküle, welche zu Degradation der mRNA führen (Hutvágner
und Zamore, 2002; Schiebel et al, 1993; Waterhouse et al, 1998).
17
Einleitung
____________________________________________________________________
P
P
siRNA Duplex
dsRNA
Dicer
RISC
Kinase
P
ATP
P
ADP
Exp5
miRNA
P
RISC
pre-miRNA
RISC
P
Drosha
RISC
DGCR8
P
(A)n
7-Me-G
pri-miRNA
Pol II
miRNA Gen
Translationsblock
mRNA Abbau
Abb. 1.2: Mechanismus von siRNA und miRNA
Schematische Darstellung der siRNA (small interfering RNA) und miRNA (microRNA) Maschinerie
in einer Säugerzelle. Zu erkennen ist die unterschiedliche Entstehungsweise der kleinen
regulatorischen RNAs. Beide werden mittels Dicer prozessiert und führen zusammen mit RISC (RNAinduced silencing complex) ihre Funktion, die sequenzspezifische Repression der Genexpression, über
Translationsblock oder Abbau der mRNA, aus.
Pol II RNA Polymerase II, pri-miRNA primary miRNA, 7-Me-G 7-Methylguanosin Cap-Sequenz,
DGCR8 Di George Syndrom Critical Region Gen 8, Exp5 Exportin 5, dsRNA doppelsträngige
RNA, Dicer RNase III Enzym, P Phosphat, ATP Adenosintriphosphat, ADP Adenosindiphosphat
1.3.2 Anwendungsbereiche von RNAi
Bevor RNAi als experimentelles Werkzeug zur Herunterregulation von Genen in
Säugerzellen verwendet werden konnte, waren einige Hürden zu bewältigen, da lange
dsRNA in Säugerzellen einen antiviralen Mechanismus auslöst (Bonetta, 2004;
Elbashir et al, 2002; Li et al, 2002; Manche et al, 1992; Szittya et al, 2002). Diese
angeborene Interferon-regulierte Antwort aktiviert unter anderem die Proteinkinase
PKR und resultiert in unspezifischem Abbau von RNA Transkripten und generellem
18
Einleitung
____________________________________________________________________
shut down der Proteinsynthese in der Wirtszelle (Rezension in Shi, 2002). Die
Existenz des antiviralen Mechanismus war zunächst inkompatibel mit der Nutzung
von RNAi in Säugerzellen (Caplen et al, 2000). Pasquinelli und Kollegen fanden eine
aus Caenorhabditis elegans bekannte kleine regulatorische RNA, die let-7 RNA, in
verschiedenen Tierspezies (Pasquinelli et al, 2000). Dadurch war der Beweis
erbracht, dass kleine dsRNA Moleküle auch in Säugern den RNAi Signalweg
vermitteln können.
Durch Transfektion, Elektroporation oder Mikroinjektion von siRNA Molekülen in
Zellen oder Organismen kann lediglich transiente Repression der Genexpression
erreicht werden (Caplen et al, 2001; Tuschl, 2002). Zudem ist chemische oder
enzymatische und damit kostenintensive Synthese von siRNAs eine Vorraussetzung
dieser Technik. Kontinuierliche Expression von siRNA kann mit Hilfe von Plasmiden
erreicht werden. RNA Polymerase III Promotoren wie U6 (murine small nuclear
RNA) oder H1 (Histon 1) transkribieren kleine, nicht-kodierende Transkripte von bis
zu 400 nt Länge. Transkriptionsinitiation erfolgt an definierten Nukleotiden und die
Termination wird durch 4 oder 5 aufeinander folgende Thymidinnukleotide erreicht
(Shi, 2002; Tuschl, 2002). So wird die Expression konstruierter siRNAs möglich, die
denen der natürlicherweise vorkommenden kleinen RNA-Spezies ähneln. Es gibt
zwei Methoden zur Transkription von siRNA in Plasmiden: entweder werden sense
und antisense Strang von zwei verschiedenen Promotoren transkribiert oder die
Expression erfolgt als hairpin-Struktur (shRNA, short hairpin RNA), die intrazellulär
in eine siRNA prozessiert wird. In der Literatur sind verschiedene, zum Teil virale
Vektorsysteme zur Expression von siRNAs beschrieben, wobei einige durch
Verwendung des Cre/loxP-Systems oder eines Tetrazyklin-induzierbaren Promoters
schaltbare Expression der siRNA zu bestimmten Zeitpunkten oder in bestimmten
Geweben ermöglichen (Bridge et al, 2003; Brummelkamp et al, 2002; Chang et al,
2004; Czauderna et al, 2003; Guo et al, 2003; Hasuwa et al, 2002; Hosono et al,
2004; Rubinson et al, 2003; Stegmeier et al, 2005; van de Wetering et al, 2003;
Ventura et al, 2004).
Beachtet werden muss die Tatsache, dass RNAi keinen kompletten Funktionsverlust
bewirkt wie ein knock out, sondern eher einen knock down, eine Herunterregulation
des Zielgens, erreicht (Shi, 2002). Dies kann für Gendosis Effekt-Studien im Fall
eines graduellen knock downs von Vorteil sein, oder bei mildem knock down die
Untersuchung eines partiellen Genverlusts ermöglichen (Prawitt et al, 2004).
19
Einleitung
____________________________________________________________________
Die Spezifität des Silencing ist nicht absolut. So genannte off-target Effekte,
beispielsweise durch Aktivierung von PKR, wurden auch für dsRNAs, shRNAs oder
siRNAs mit weniger als 30 nt Länge beschrieben (Oates et al, 2000; Zhao et al, 2001;
zusammengefasst in Jackson und Linsley, 2004).
RNAi kann als genetische Methode nicht nur neue Einblicke in die Funktion von
Genen geben, sondern auch praktischen Fortschritt in Behandlung von Krankheiten
bringen. Therapeutische Potenziale von RNAi liegen in Spezifität und Aktivität, mit
der die Genexpression inhibiert wird. Probleme stellen bisher Applikation und
eventuelle Toxizität dar (Hannon und Rossi, 2004). Das wichtigste Argument,
welches den Einsatz von siRNA oder miRNA in der Therapie vielleicht möglich
machen wird, ist, dass kleine regulatorische RNAs nicht vom Immunsystem erkannt
und abgewehrt werden. Diese Eigenschaft macht diese somit den Proteinen
überlegen, welche in vielen Fällen vom Immunsystem erkannt werden und so für den
therapeutischen Zweck im Menschen unbrauchbar sind.
Heute ist RNAi eine Standardmethode zur Repression der Expression spezifischer
Gene (Czauderna et al, 2003; Hasuwa et al, 2002; Hong et al, 2006; Kissler et al,
2006; McCaffrey et al, 2002; Uprichard et al, 2005; Soutschek et al, 2004; Ryo et al,
2005; Sørensen et al, 2003; Urban-Klein et al, 2004; Yano et al, 2004). Diese
Methode eignet sich auch für solche Tiersysteme, bei denen bisher keine
embryonalen Stammzellen zur Generierung von knock outs zu Verfügung standen
(Hasuwa et al, 2002). Die Herunterregulation des Zielgens kann durch Generierung
transgener Tiere (Mikroinjektion des siRNA oder shRNA exprimierenden Plasmids
oder Virus) oder Injektion der siRNA in adulte Tiere (beispielsweise intravenös oder
in das Zielorgan) erreicht werden. In der hier vorliegenden Arbeit wurde RNAi zur
Generierung eines Dsg 2 knock down Mausmodells genutzt.
Der in dieser Doktorarbeit gezeigte in vivo knock down von Dsg 2 und der
beobachtete Phänotyp ist einer der ersten Demonstrationen einer konditionalen
Inaktivierung einer essenziellen Genfunktion.
20
Einleitung
____________________________________________________________________
1.4 Zielsetzung
Ziel der Doktorarbeit war die Untersuchung der Funktion von Desmoglein 2 in
Gewebehomöostase und Karzinogenese. Dies sollte durch Generierung eines über
Cre/lox-induzierbaren siRNA Mausmodells erreicht werden, um die im knock out
detektierte embryonale Letalität zu umgehen. Dazu war geplant, die im Rahmen
dieser Dissertation generierte Dsg 2 knock down Maus mit verschiedenen
Treibermäusen zu verpaaren, die exogene Kontrolle der Cre Rekombinase auf
Proteinebene zulassen. Damit sollte es möglich werden, die embryonale Letalität
zu vermeiden, und die Funktion von Dsg 2, besonders im Hinblick auf
Krankheitsmodelle, zu analysieren.
Bestandteil der hier vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung der
induzierbaren Cre Deleter knock in Maus Rosa26CreERT2 in Zusammenarbeit mit
Prof. Anton Berns (The Netherlands Cancer Institute, Division of Molecular
Genetics and Center of Biomedical Genetics, Amsterdam, NL).
21
____________________________________________________________________
2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Verbrauchsmaterial
Biomax MS Röntgenfilme
Sigma (Deisenhofen, D)
Braun-H2O (Aqua ad iniectabilia Braun)
B. Braun Melsungen AG (Melsungen, D)
Corex II Röhrchen
DuPond (Bad Homburg, D)
Einmalküvetten
Braun (Melsungen, D)
Einmalpipetten
Greiner (Frickenhausen, D)
Elektroporationsküvetten 2mm
PeqLab (Erlangen, D)
Eppendorfreaktionsgefäße (1,5 ml und 2 ml)
Eppendorf (Hamburg, D)
Falkonfilter, steril (100 µm Nylon Zellsieb)
Falkonröhrchen, steril (15 ml und 50 ml)
Glaswolle
Merck (Darmstadt, D)
Injektionsspritzen
Henke Sass Wolf (Tuttlingen, D)
Liquid Blocker Super Pap Pen (Fettstift)
Neubauer Zählkammer
Braun (Melsungen, D)
22
____________________________________________________________________
PCR-Reaktionsgefäße (0,2 ml)
Petrischalen, steril (Durchmesser 82 mm)
PP-Tube, steril (17,0/77 MM, 12 ml)
Protran BA 85 Nitrozellulose 0,45 µm
Schleicher&Schuell (Dassel,D)
Schwamm für Northern Blot
Spontex, MAPA GmbH (Zeven, D)
Spin X Costar 8160 Column
Corning Inc. (Massachusetts, USA)
S&S Rotrand-Sterilfilter (0,22 µm)
Schleicher&Schuell (Dassel, D)
Sterile Spitzen
Henke Sass Wolf (Tuttlingen, D)
Super Frost Plus Objektträger
(25 x 75 x 1 mm)
Menzel GmbH & Co KG (Braunschweig, D)
Pasteurpipetten
Roth (Karlsruhe, D)
Whatman 3MM Chromatografiepapier
Whatman International Ltd. (Maidstone, GB)
Zellkulturbedarf (6- und 96Lochkulturplatten, 6 und 9 cm Kulturschalen,
Einfierröhrchen)
2.1.2 Chemikalien
Aceton
Carl Roth GmbH (Karlsruhe, D)
Agar
LB Broth, Carl Roth GmbH (Karlsruhe,
D)
23
____________________________________________________________________
Agarose
Invitrogen GmbH (Karlsruhe, D)
Ammoniumpersulfat
Ampicillin
Ratiopharm (Ulm, D)
Avertine
Sigma Chemical Co (St. Louis, USA)
Azoxymethan (AOM)
Sigma Chemical Co (St. Louis, USA)
Benzylalkohol (99 %)
Benzylbenzoat (99 %)
β-Mercaptoethanol
Borsäure
Bromphenolblau
Chloroform
Desoxynucleosidtriphosphate (dNTPs)
Fermentas (St. Leon – Rot, D)
Dextransodiumsulfat (DSS)
ICN Biochemicals Inc. (Aurora, USA)
Diethylphosphorylcyanid (DEPC)
Dimethylsulfoxid (DMSO)
Dimethylformamid
Dulbecco´s Mod Eagle Medium (DMEM)
24
____________________________________________________________________
ECL Plus (Western Blot
Detektionssystem)
Amersham (Freiburg, D)
Ethanol
Ethidiumbromid Stammlösung (10 mg/ml) Carl Roth GmbH (Karlsruhe, D)
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)
Fetales Kälberserum (FCS)
Fluoromount-G
Biozol Diagnostika Vertrieb GmbH
(Eching, D)
Formaldehyd
Glutaraldehyd
Glycerol
Glycine
Hepes (1 M)
Invitrogen (Karlsruhe, D)
Isopentan (2-Methylbutan, HPLC-Grad)
Isopropanol
Kaliumchlorid
Kaliumdihydrogenphosphat
Kaliumhexacyanoferrat (II)-Trihydrat
25
____________________________________________________________________
Kaliumhexacyanoferrat (III)
Kalziumchlorid
L-Glutamin (200 mM)
LB (Luria Bertani)-Medium (Pulver)
Magnesiumacetat
Magnesiumchlorid
Milchpulver
Natriumacetat
Natriumchlorid
Natriumhydrogenphosphat
Riedel de Haen (Seelze, D)
Natriumhydroxid
Nuclear Fast Red-Lösung
Opti-MEM
Penicillin-Streptomycin (104 u/ml
Penicillin, 10 g/ml Streptomycin)
PIC (Proteasen-Inhibitoren-Cocktail)Tabletten
Roche (Penzberg, D)
Ponceau
26
____________________________________________________________________
Rinderserumalbumin (BSA)
Rotiphorese Gel 30 (Acrylamidmix)
RNA Sample Loading Buffer
Salzsäure
Sodiumdodecylsulfat (SDS)
Sonnenblumenöl
Vita d´Or, Lidl Stiftung & Co KG
(Neckarsulm, D)
Tamoxifen (99 %)
TEMED ( N, N, N`, N`Tetraethylethylendiamin)
Tissue Tek
Sakura Finetek Europe (Zoeterwoude,
NL)
Tris base
Carl Roth GmbH (Karlsruhe)
TRIzol
Tween 20
X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-DGalactopyranosid)
Xylencyanol
27
____________________________________________________________________
2.1.3 Puffer und Lösungen
Annealing-Puffer (-20°C)
100 mM Natriumacetat
30 mM HEPES-KOH
2 mM Magnesiumacetat
Ammoniumpersulfat (APS, -20°C)
1 g Ammoniumpersulfatpulver in 10 ml Aqua
destillata
Ampicillinlösung (100 µg/ml, -20°C)
10 g in 100 ml autoklaviertem Aqua destillata,
steril filtriert
Church Buffer
7 % SDS
10 mM EDTA
250 mM NaPO4 Puffer
1 % BSA
in DEPC-H2O
DEPC-H2O
0,1 % DEPC in Aqua destillata,
über Nacht bei Raumtemperatur gerührt,
autoklaviert
EDTA (0,5 M)
146 g EDTA in 1 l Aqua destillata,
pH 8 (eingestellt mit NaOH), autoklaviert
Erstantikörperverdünnungspuffer
5 % BSA
0,1 % Tween 20
in 1 x TBS
Fixierlösung für Mausembryos
4 % Formaldehyd
1 % Glutaraldehyd
in PBS pH 7,4
28
____________________________________________________________________
Injektionspuffer
0,1 mM EDTA
10 mM Tris (pH 7,4)
Kalziumchlorid (0,1 M)
11,1 g Kalziumchlorid in 1 l Aqua destillata
gelöst, autoklaviert
Kollagenaselösung (-20°C)
10 mg/ml in PBS
Laemmlipuffer (4°C)
10 % Glycerol
1 % SDS
4 % Tris pH 6,8
10 % β-Mercaptoethanol
0,001 % Bromphenolblau
Laufpuffer für Proteingele (5 x)
25 mM Tris
250 mM Glycine
0,1 % SDS
pH 8 (eingestellt mit HCl), autoklaviert
Magnesiumacetat (1 M)
21,45 g Magnesiumacetat
in 100 ml Aqua destillata
Magnesiumchlorid (2 M)
40,68 g in 100 ml Aqua destillata
MOPS (10 x)
83,8 g MOPS
13,6 g Natriumacetat
20 ml 0,5 M EDTA pH 8
in 1 l DEPC- H2O
pH 7,2 (eingestellt mit NaOH)
NaPO4 Puffer (1 M)
178 g Na2HPO4 x 2 H2O
in 1 l DEPC- H2O
pH 7,2 (eingestellt mit Phosphorsäure)
29
____________________________________________________________________
Natriumacetat (3 M)
246,1 g Natriumacetat in 1 l Aqua destillata,
pH 4,8 (eingestellt mit HCl)
Natriumchlorid (5 M)
292,2 g in 1 l Aqua destillata,
autoklaviert
Northern Waschlösung 1
2 x SSC
0,1 % SDS
Northern Waschlösung 2
0,2 x SSC
0,1 % SDS
Phosphate Buffered Saline
8 g Natriumchlorid
(PBS, pH 7,4)
0,2 g Kaliumchlorid
1,44 g Natriumhydrogenphosphat
0,2 g Kaliumhydrogenphosphat
in 1 l Aqua destillata gelöst
pH 7,4 (eingestellt mit HCl), autoklaviert
Probenpuffer (4°C)
0,25 % Bromphenolblau
0,25 % Xylencyanol
30 % Glycerol
in Aqua destillata
Proteinase K Lösung (-20°C)
10 mg/ml in Aqua destillata
Schwanzlysepuffer
0,05 % Tris ( pH 8)
0,1 % EDTA
0,02 % NaCl
1 % SDS
SDS-Lösung (10 %)
100 g SDS in 1 l Aqua destillata
30
____________________________________________________________________
SDS-Lösung (20 %)
200 g SDS in 1 l Aqua destillata
SSC (20 x)
175 g NaCl
88,2 g Tri Sodium Citrat
in 1 l DEPC- H2O
Stripping Puffer für Western Blot
2,34 ml β-Mecaptoethanol
30 ml 20 % SDS
18,75 ml 1 M Tris pH 6,8
ad 300 ml Aqua destillata
Tamoxifen-Injektionslösung
1 g in 10 ml EtOH vorgelöst,
(10 mg/ml, -20°C)
mit 90 ml autoklaviertem Sonnenblumenöl
über Nacht gemischt
TBE (Tris Borat EDTA) Puffer (10 x)
40 ml 0,5 M EDTA pH 8
108 g Tris base
55 g Borsäure
ad 1 l Aqua destillata
TBS/T
0,1 % Tween 20 in 1 x TBS
Transferlösung /Blotpuffer
20 % Ethanol
(Western Blot)
in 1 x Laufpuffer
Tris (1 M) pH 6,8
121,1 g Tris in 1 l Aqua destillata
Tris (1,5 M) pH 8,8
181,65 g Tris in 1 l Aqua destillata
31
____________________________________________________________________
Tris Buffered Saline (TBS, 10 x)
24,2 g Tris base
80 g Natriumchlorid
in 1 l Aqua destillata
Trypsin/EDTA
0,2 mM EDTA in PBS, autoklaviert
0,025 % Trypsin
X-Gal-Färbelösung
5 mM Kaliumhexacyanoferrat (III)
(Kryostatschnitte)
5 mM Kaliumhexacyanoferrat (II)-Trihydrat 2
mM Magnesiumchlorid
1 mg/ml X-Gal
in PBS (pH 7,4)
X-Gal-Färbelösung
5 mM Kaliumhexacyanoferrat (III)
(Mausembryos)
5 mM Kaliumhexacyanoferrat (II)-Trihydrat 1
mM Magnesiumchlorid
1 mg/ml X-Gal
in PBS (pH 7,4)
X-Gal-Stammlösung
25 mg X-Gal in 1 ml Dimethylformamid
2.1.4 Kulturmedien
LB (Luria Bertani) Medium
25 g in 1 l Aqua destillata, autoklaviert,
nach Bedarf mit Ampicillin
(Endkonzentration 0,1 µg/ml) versetzt
Zellkulturmedium
Dulbecco´s Mod Eagle Medium
(DMEM)
mit 10 % FCS, 1000 u/ml PenicillinStreptomycin und 5,8 mg/ml L-Glutamin
angereichert
32
____________________________________________________________________
Agarplatten
25 g LB Broth in 1 l Aqua destillata
nach dem Autoklavieren mit Ampicillin
(Endkonzentration 0,1 µg/ml) versetzt
2.1.5 Enzyme
Alkaline Phosphatase (1U/µl)
Roche (Penzberg, D)
Proteinase K
Klenow (5U/µl)
Stratagene ( Heidelberg, D)
Kollagenase I
Restriktionsendonukleasen
Fermentas (St. Leon-Rot, D)
T4 DNA Ligase (5 Weiss u/µl)
Taq DNA Polymerase (5 u/µl)
2.1.6 Radioaktive Nuklide
α -32P-dCTP
Amersham Bioscience (Braunschweig, D)
33
____________________________________________________________________
2.1.7 Oligonukleotide
Labor
nr.
Bezeichnung
55
EGFP fw
5´-CTGAAGTTCATCTGCACCACC-3´
56
EGFP rev
5´-CGTTCTTCTGCTTGTCGGCC-3´
143
Ssexon4mD2
144
Asexon4mD2
145
Ssexon9AmD2
146
Asexon9AmD2
147
Ssexon9BmD2
148
Asexon9BmD2
185
pTERH1c
186
pTEREGFPnc
201
Actin fw
5´-TCATCAGGTAGTCAGTGAGGTCGC-3´
202
Actin r
5´-CACCACACCTTCTACAATGAGCTG-3´
243
pSicofw1
5´-GAGCTGTACAAGTAGCGGCCGCAT-3´
244
pSicorev1
5´-ATGAGTTCCGCCGTGGCAATAG-3´
247
pS9as
5´-TCGAGCTTTCCACAAGTACATTCAAGA
GATGGACTTGTGGAAAGCTGCTTTTTTC-3´
248
pS9aas
5´-TCGAGAAAAAGCAGCTTTCCACAAGTCC
ATCTCTTGAATGGACTTGTGGAAAGCTGC
A-3´
251
Rosa1
5´-ACCAGCCAGCTATCAACTC-3´
252
Rosa2
5´-TATACGCGTGCTAGCGAAGATCTCCAT
CTTCCAGCAG-3´
253
Villi 01
5´-CAAGCCTGGCTCGACGGCC-3´
254
Villi 02
5´-CGCGAACATCTTCAGGTTCT-3´
Sequenz
5´-GATCCCGGGAATTACAGAACCGCCTTTC
AAGAGAAGGCGGTTCTGTAATTCCTTTTTT
GGAAT-3´
5´-AGCTATTCCAAAAAGGGAATTACAGA
ACCGCCTTCTCTTGAAAGGCGGTTCTGTAA
TTCCCGG-3´
5´-GATCCCGCAGCTTTCCACAAGTCCATTC
AAGAGATGGACTTGTGGAAAGCTGCTTTTT
GGAAT-3´
5´-AGCTATTCCAAAAAGCAGCTTTCCACAA
GTCCATCTCTTGAATGGACTTGTGGAAAGC
TGCGG-3´
5´-GATCCCCGTGGTTGAAGGCATTCATTTC
AAAGAATGAATGCCTTCAACCACGTTTTTG
GAAT-3´
5´-AGCTATTCCAAAAACGTGGTTGAAGGCA
TTCATTCTCTTGAAATGAATGCCTTCAACC
ACGGG-3´
5´-AATTCGAACGCTGACGTCATCAAC-3´
5´-CTATGGGAACATACGTCATTATTGAC-3´
275
Rosa Rep 1
5´-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT-3´
276
Rosa Rep 2
5´-GCGAAGAGTTTGTCCTCAACC-3´
277
Rosa Rep 3
5´-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3´
291
pSkfw1
5´-GGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAA-3´
Verwendung
Genotypisierungsprimer
RAGE-Mäuse
RAGE-Mäuse
shRNA Oligo für mDsg2
(Exon 4) zur Ligation in
pTER
pTER
pTER
pTER
pTER
pTER
Primer für siRNAOligointegration in pTER
Primer für siRNAOligointegration in pTER
Aktinprimer für
Genotypisierungs-PCR
Aktinprimer für
Genotypisierungs-PCR
Primer für siRNAOligointegration in pSico
Primer für siRNAOligointegration in pSico
pSico
shRNA Oligo mDsg2
pSico
Rosa26Cre-Mäuse
Rosa26Cre-Mäuse
Villin- Mäuse
Villin- Mäuse
R26R-Mäuse
R26R-Mäuse
für R26R-Mäuse
für Dsg2 knock down
Mäuse
34
____________________________________________________________________
292
pSkrev1
5´-GTCAATGGGCGGGGGTCGTT-3´
für Dsg2 knock down
Mäuse
2.1.8 Vektoren
pBSK GAPDH
Plasmid zur Expression von GAPDH, freundlicherweise
zu Verfügung gestellt durch Dr. Christian Spangenberg
(Kinderklinik des Universitätsklinikums Mainz, D)
pCAGGmDsg2
mDsg2
Expressionsvektor,
freundlicherweise
zu
Verfügung gestellt durch Dr. Z. Nie (School of Biological
Sciences, Manchester, GB)
pINSU
Plasmid mit humanen MAR-Sequenzen zur Isolation
eines Transgens, kloniert von Dr. Marko Maringer
(Institut für Toxikologie, Mainz, D; Fleenor und
Kaufman, 1993)
pSico
Vektor zur Expression von siRNA, freundlicherweise zu
Verfügung gestellt durch Dr. Tyler Jacks (Massachusetts
Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts,
USA; Ventura et al, 2004)
pTEREGFP
Vektor zur Expression von siRNA, freundlicherweise zu
Verfügung gestellt durch Marc van de Wetering
(Hubrecht Laboratory, Utrecht, NL; van de Wetering et
al, 2003); Einklonierung von CM-Promoter und EGFPSequenz durch Louise Griffin (Institut für Toxikologie,
Mainz, D)
35
____________________________________________________________________
2.1.9 Antikörper
α-CD3-PE
Phycoerythrin (PE)-gekoppelter monoklonaler Antikörper
gegen CD3 ε-Kette (T-Zellen), Klon 145-2C11 (Lot # 50121),
BD Biosciences (Pharmingen, D)
α-CD11b-PE
Phycoerythrin-gekoppelter Ratten-Antikörper gegen CD11b
(Makrophagen), Klon M1/70, BD Biosciences (Pharmingen,
D)
α-CD19-PE
Phycoerythrin-gekoppelter Ratte IgG2a gegen CD19 (BZellen), Klon 1D3, BD Biosciences (Pharmingen, D)
α-CD31-PE
Phycoerythrin-gekoppelter
Ratte
IgG2a
gegen
CD31
(Endothelzellen, Megakaryozyten, u.a.), Klon 390, Invitrogen
GmbH (Karlsruhe, D)
α-CD41
Monoklonaler
Ratte
Megakaryozyten),
IgG1
Klon
gegen
MWReg30,
CD41
BD
(Platelets,
Biosciences
(Pharmingen, D)
α-CD117-APC
Allophycocyanin (APC)-gekoppelter Ratte IgG2b gegen
CD117
(humane
Stammzellen,
u.a.),
Klon
2B8,
BD
Biosciences (Pharmingen, D)
α-Cre
Polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen Cre Rekombinase,
PRB-106C, Covance (Berkeley, USA)
α-Dsg 1/2
Monoklonaler Maus Antikörper gegen Dsg 1 und 2, Klon DG
3.10 (Lot # 405270) Progen (Heidelberg, D; Schmelz et al,
1986)
36
____________________________________________________________________
α-Gr-1-PE
Phycoerythrin-gekoppelter Ratte IgG2b gegen Granulozyten,
Klon RB6-8C5, BD Biosciences (Pharmingen, D)
α-HA tag
Polyklonaler Kaninchen-α-HA tag Antikörper, # 14-6756-81
(Lot # E014105) NaTuTec (Frankfurt, D)
α-mouse-Alexa
Alexa-Fluor
gekoppelter
Ziege-anti-Maus
Antikörper,
MoBiTec GmbH (Göttingen, D)
α-mouse-HRP
Polyklonaler
Kaninchen-anti-Maus
Antikörper,
HRP
(horseradish peroxidase)-gekoppelt, DaKoCytomation GmbH
(Hamburg, D)
α-p38
Polyklonaler Kaninchen-Antiköper gegen das house keeping
Protein p38, SC-535 (Lot # J264), Santa Cruz Biotechnology
(Heidelberg, D)
α-Pan NK-PE
Phycoerythrin-gekoppelter Ratte IgGM gegen natürliche
Killerzellen, Klon DX5, Invitrogen GmbH ( Karlsruhe, D)
α-rabbit
Donkey
α-rabbit
IgG,
HRP
(horseradish
peroxidase)-
gekoppelt, SC- 2313 (Lot # H311), Santa Cruz Biotechnology
(Heidelberg, D)
α-TER119-PE
Phycoerythrin-gekoppelter
Maus-Antikörper
gegen
Erythrozyten, BD Biosciences (Pharmingen, D)
37
____________________________________________________________________
2.1.10 Molekulargewichtsmarker
DNA
Gene Ruler 100 bp DNA ladder Plus,
Gene Ruler 1 kb DNA ladder
Protein
Prestained Protein Ladder (10-180
kDa)
2.1.11 Kits
Lipofectamine™ 2000
Plasmid Maxi Kit
Qiagen (Hilden, D)
Polyfect Transfection Reagent
Qiagen (Hilden, D)
Prime-it II Random Primer Labelling Kit
Stratagene (Heidelberg, D)
Qiaex II Gel Extraction Kit
Qiagen (Hilden, D)
QIAprep Spin Miniprep Kit
Qiagen (Hilden, D)
QIAquick Nucleotide Removal Kit
Qiagen (Hilden, D)
2.1.12 Bakterienstämme
DH5α
supE44 λlacU169 (Φ80lacλZM15)
hsdR17recA1endA1 gyrA96 thi-1 relA1
38
____________________________________________________________________
MM294, F-, λ-, supE44 endA1 thi-1
294-Cre
hsdR17 lacZ::cI857-cre
(Buchholz et al,1996)
2.1.13 Zelllinien
EpH4
Murine Epithelzelllinie, freundlicherweise zu Verfügung
gestellt durch Hartmut Beug (Institut für molekulare
Pathologie, Vienna, Österreich; Lopez-Barahona et al, 1995)
HEK 293
Menschliche embryonale Nierenzelllinie, freundlicherweise
zu Verfügung gestellt durch Dr. Carsten Weiss (Institut für
Toxikologie, Mainz)
NIH 3T3
Maus Fibroblasten, ATCC (Nummer CRL-1658)
2.1.14 Tiere
Die Mäuse stammten entweder aus eigener Zucht oder wurden von der Firma
Charles River (Sulzfeld, D) oder der Firma Janvier (Le Genest-St-Ile, F) bezogen.
Die Tierhaltung erfolgte in Filterkopfkäfigen und wurde entsprechend den Regeln
des Deutschen Tierschutzgesetzes durchgeführt.
Zur Generierung der transgenen Linien wurden die folgenden Inzuchtstämme
verwendet:
Zur Mikroinjektion:
FVB
Scheinschwangere Ammenmütter:
NMRI
39
____________________________________________________________________
Des weiteren wurden folgende Mauslinien verwendet:
Rosa26CreERT2
Freundlicherweise zu Verfügung gestellt
durch Anton Berns (The Netherlands
Cancer Institute, Amsterdam, NL)
R26R (Rosa26 Reporter)
(P. Soriano, 1999)
RAGE (Receptor for advanced glycation
end products)
(Constien et al, 2001)
VillinCreERT2
Freundlicherweise zu Verfügung gestellt
durch Sylvie Robine (Institut Curie,
Paris, F; El Marjou et al, 2004)
2.1.15 Geräte
Autoklav
KSG Sterilisatoren GmbH (Olching, D)
Bakterienbrutschrank
Heraeus (Hanau, D)
Bakterienschüttler
Certomat BS-T, B. Braun Biotech
(Melsungen, D)
Binokular
Olympus S2X9 (Hamburg, D)
Coloview (Mausendoskop)
Karl Storz (Tuttlingen, D)
Computer
Power Macintosh G3
Siemens LapTop Amilo M 7400
40
____________________________________________________________________
Counter für Radioaktivität
Modell TRI-CARB 2100 TR Liquid
Scintillation Analyser, Canberra Rochard
GmbH (Dreieich, D)
Crosslinker
Modell Amplirad, Genetic Research
Instrumentation Ltd (Essex, GB)
Elektrophoresekammern
Werkstatt der Institute
Toxikologie/Pharmakologie (Mainz, D)
Elektroporator
Gene Pulser II, Bio Rad (München, D)
Eppendorf Pipetten
Eppendorf (Hamburg, D)
FACS Calibur
Becton Dickinson BD (Heidelberg, D)
FACS Vantage
Gefrierschrank (-20°C)
Liebherr Deutschland
Gefrierschrank (-70°C)
Snijders (Tilburg,NL)
Hybridisierungsofen
Modell BFD-53, WTC Binder
(Tuttlingen, D)
Kryostat
Modell 1720 Digital, Leica (Wetzlar, D)
Kühlschrank
Liebherr (Bieberach, D)
Laborschüttler
Unimax 2010, Heidolph (Kehlheim, D)
Mikromanipulationsanlage
Leica (Wetzlar, D)
41
____________________________________________________________________
Mikroskop
Modell Olympus CK2
und Olympus BX50 WI (Hamburg, D)
Netzgerät (Power Supply)
Consort E844, Labotec (Wiesbaden, D)
pH-Meter
Multical Typ 538, Wiss. Tech.
Werkstätten (Weilheim, D)
Phosphorimager
Typ STORM 840, Molecular Dynamics
(Sunnyvale, USA)
Photometer
Spectrometer Spectronic Genesys 5,
Spectronic Instruments Inc. (USA)
Pipetboy
Pipetus-akku, Hirschmann Laborgeräte
(Eberstadt, D)
Semi dry Elektroblotter
Perfect Blue™, Modell SEDEC M,
PeqLab (Erlangen, D)
Sequenzierer
Kapillarsequenziergerät ABI Prism3730,
Genterprise (Mainz, D)
Sicherheitswerkbank
Micoflow Advanced Bio Safety Cabinet,
Nunc (Wiesbaden, D)
Sonikator
Branson Sonifier 250, Heinemann
Laboratoriums-Ausrüstungen
(Schwäbisch Gmünd, D)
Stickstofftank
Air Liquide Kryotechnik GmbH
(Düsseldorf, D)
42
____________________________________________________________________
Thermoblock
Dri-Block DB-3A,Techne (Cambridge,
GB)
Thermocycler
Typ Gradient, Eppendorf (Hamburg, D)
Typ UNO 96, Biometra (Göttingen, D)
Tischzentrifuge
Eppendorf 5417 C und
Eppendorf 5417 R, Eppendorf (Hamburg,
D)
Ultrazentrifuge
Sorvall Superspeed RC2-B, DuPond
(Bad Homburg, D)
UV-Transluminator
LTF Labortechnik (Wasserburg, D)
Vortex
Heidolph (Kehlheim, D)
Wasserbad
Grant Science Services (München, D)
Zellkultur Inkubator
Nunc (Wiesbaden, D)
Zentrifuge
Laborzentrifuge 400 R, Heraeus (Hanau,
D)
2.1.16 Software
alalySIS Software Package
Soft Image Systems (Münster, D)
Cellquest Pro
DNA Strider 1.2
CEA (Gif-sur-Yvette, F)
43
____________________________________________________________________
Edit View 1.0.1
Perkin Elmer (USA)
Image Quant 5.2
Molecular Dynamics (Sunnyvale, USA)
Lucia Version 4.51
Image Archive Plus, Olympus (Hamburg,
D)
Mac-Plasmap 2.1
CGC Scientific Ltd. (St. Louis, USA)
44
____________________________________________________________________
2.2 Methoden
2.2.1 Präparation von Plasmid-DNA aus Bakterienkulturen
2.2.1.1 Präparation von DNA aus 2 ml Bakterienkulturen (Plasmid
Minipräparation)
Für DNA-Präparationen aus 2 ml Bakterienkulturen wurde das QIA Spin Miniprep
Kit von Qiagen verwendet. Dazu wurden 2 ml LB/Amp-Medium mit einer
Einzelkolonie angeimpft und diese über Nacht bei 37°C im Bakterienschüttler (225
U/min) gewachsen. Die Kulturen wurden am nächsten Tag in Eppendorf
Reaktionsgefäße überführt und bei 14000 rpm und Raumtemperatur für 2 min
zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das Pellet in jeweils 250 µl
vorgekühltem (4°C) Puffer P1 resuspendiert. Nach Zugabe von 250 µl Puffer P2
wurden die Kulturen invertiert und 5 min bei Raumtemperatur lysiert. Dann wurden
350 µl Puffer N3 zugegeben, nochmals invertiert und für 10 min bei 13000 rpm
zentrifugiert. Der Überstand wurde auf eine QIAprep Spin-Säule geladen und für 1
min bei 13000 rpm zentrifugiert. Nach Entfernen des Durchlaufs wurde die Säule
zuerst mit 500 µl Puffer PB und anschließend mit 750 µl Puffer PE gewaschen, wozu
die Zentrifugation unter den gleichen Bedingungen wie zuvor erfolgte. Nach
Entfernen des Durchlaufs wurde erneut zentrifugiert, um den restlichen Waschpuffer
zu entfernen, und die Säulen anschließend in sterile Eppendorfgefäße gestellt. Um
die DNA zu eluieren, wurden 50 µl Puffer EB in die Mitte der Säule pipettiert, für
eine Minute stehen gelassen und danach für 1 min bei 13000 rpm zentrifugiert.
2.2.1.2 Präparation von DNA aus 400 ml Bakterienkulturen (Plasmid
Maxipräparation)
Zur Präparation von DNA aus einer 400 ml-Bakterienkultur wurde das Plasmid Maxi
Kit von Qiagen verwendet. Es wurden dazu 400 ml LB/Amp-Medium mit einer
Einzelkolonie angeimpft und über Nacht bei 37°C im Bakterienschüttler (225U/min)
gewachsen. Am nächsten Tag wurde die Bakterienkultur bei 4500 rpm und 4°C für
15 min zentrifugiert. Nach Entfernen des Überstandes wurde das Pellet in 20 ml
45
____________________________________________________________________
vorgekühltem (4°C) Puffer P1 resuspendiert, mit 20 ml Puffer P2 versetzt, invertiert
und für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert, um die Bakterienzellen zu lysieren.
Nach Zugabe von 20 ml vorgekühltem (4°C) Puffer P3 wurde das Lysat wieder
invertiert und während einer Inkubation für 20 min auf Eis präzipitiert. Die Lösung
wurde dann durch eine mit Glaswolle gefüllte Spritze gedrückt und auf die mit 10 ml
Puffer QBT äquilibrierte Quiagen-Tip-500-Säule aufgetragen, so dass der die
Plasmid-DNA enthaltende Durchlauf von Zelltrümmern und bakterieller DNA
getrennt wurde. Die Säule wurde zweimal mit 30 ml Puffer QC gewaschen und die
DNA mit 15 ml vorgewärmten (65°C) Puffer QF eluiert. Anschließend wurde die
DNA durch Zugabe von 10,5 ml Isopropanol und invertieren präzipitiert und bei
10000 rpm und 4°C für 60 min abzentrifugiert. Nach Entfernen des Überstandes
wurde das Pellet in 500 µl Braun-H2O durch vortexen gelöst.
2.2.2 DNA-Präzipitation
Die DNA wurde durch Zugabe von 1/10 Volumen Natriumacetat (3 M, pH 4,8) und
3 Volumen Ethanol (100 %) gefällt. Nach mindestens 30-minütiger Lagerung bei 20°C wurde die DNA pelletiert (14000 rpm, 15 min), dreimal mit Ethanol (70 %)
gewaschen, getrocknet und in Braun-H2O aufgenommen.
2.2.3 Präparartion von genomischer DNA aus murinen Schwanzbiopsien
Um die Genotypisierung der verschiedenen transgenen Mauslinien mittels PCR
durchführen zu können, musste zunächst DNA aus den Schwanzproben von drei
Wochen alten Mäusen isoliert werden. Dazu wurde jeweils eine etwa 0,5 cm lange
Schwanzbiopsie
entnommen
und
in
ein
Eppendorfgefäß
mit
750
µl
Schwanzlysepuffer überführt. Die Proben wurden anschließend mit je 26 µl
Proteinase K Lösung (10 mg/ml) versetzt und über Nacht bei 55°C auf dem
Laborschüttler inkubiert, um das Gewebe aufzuschließen. Am nächsten Tag wurden
die verdauten Proben für 10 min gevortext, mit 250 µl NaCl (5 M) versetzt und
nochmals für 10 min gemischt. Anschließend wurde bei 14000 rpm für 10 min bei
Raumtemperatur zentrifugiert, wodurch das unverdaute Material pelletiert wurde.
46
____________________________________________________________________
Vom die DNA enthaltenden Überstand wurden 750 µl abgenommen, in ein frisches
Eppendorfgefäß überführt und mit 500 µl Isopropanol für 5 min bei Raumtemperatur
gemischt. In diesem Schritt wurde die DNA präzipitiert und anschließend bei 14000
rpm für 5 min bei Raumtemperatur abzentrifugiert. Das so erhaltene DNA-Pellet
wurde zweimal mit Ethanol (70 %) gewaschen und danach 1 min bei 14000 rpm
pelletiert. Nach dem letzten Waschschritt wurde das Ethanol/H2O-Gemisch
vollständig entfernt, das Pellet mit 50 µl Braun H2O versetzt und für 30 min bei 55°C
gelöst. Zur vollständigen Lösung wurde die DNA vor der Genotypisierung mittels
PCR mindestens über Nacht bei 4°C gelagert.
2.2.4 Konzentrationsbestimmung von DNA
Die Bestimmung der Konzentration von DNA erfolgte entweder nach dem von
Sambrook et al. beschriebenen photometrischen Verfahren (Sambrook et al, 1989)
oder über eine Verdünnungsreihe auf einem Agarosegel. Bei dem Verfahren nach
Sambrook wurde unter Berücksichtigung der jeweiligen Verdünnung mit Hilfe
folgender Formel die DNA-Konzentration berechnet:
DNA-Konzentration [µg/µl] = OD260 x Verdünnung x 0,05
Erfolgte die Bestimmung der DNA-Konzentration über eine Verdünnungsreihe auf
einem Agarosegel, wurde dies mittels UV-Transluminator dokumentiert und die
Konzentration der letzten sichtbaren Bande als Equivalent von 10 ng DNA definiert.
Die Konzentration der DNA wurde dann mit folgender Formel bestimmt:
DNA-Konzentration [ng/µl] = Verdünnung (letzte sichtbare Bande) x 10/eingesetztes Volumen DNA
2.2.5 Polymerasekettenreaktion (PCR)
Mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion können unter Verwendung geeigneter
Oligonukleotide definierte DNA-Abschnitte gezielt amplifiziert werden. Die
Oligonukleotide, oder Primer, dienen dabei der DNA-Polymerase als Starthilfe, um
an
die
einzelsträngige
DNA
anzudocken
und
unter
Verbrauch
von
47
____________________________________________________________________
Desoxynukleosidtriphosphaten (dNTP) den zur DNA komplementären Strang zu
synthetisieren. Durch wiederholtes Durchlaufen des PCR-Zyklus, der aus
Denaturierung der DNA, Annealing der Oligonukleotide an den Einzelstrang und
Elongation (Synthese des komplementären Strangs) besteht, werden eine
exponentiell anwachsende Anzahl Moleküle des definierten DNA-Abschnittes
erhalten, welche im Anschluss auf einem Agarosegel sichtbar gemacht werden
können. Dieses Verfahren kann Beispielsweise dazu genutzt werden, um Transgene
in Mäusen zu detektieren (Genotypisierung).
Die PCR wurde nach der Methode von Saiki et al. 1988 (Saiki et al, 1988) in einem
Volumen von 25 µl durchgeführt. Jede Reaktion setzte sich wie folgt zusammen:
1/10 Volumen 10 x PCR Puffer, 5 mM MgCl2, 0,2 mM von jedem dNTP, 10 pmol
der jeweiligen Primer und 0,25 µl Taq Polymerase (5 u/µl).
Eine Standart PCR-Reaktion begann mit einem Denaturierungsschritt von 4 min bei
94°C. Darauf folgten 30 Zyklen mit jeweils 1 min Denaturierung bei 94°C, 30-60 sec
Annealing bei 58-60°C und 1 min Elongation bei 72°C, woran sich ein finaler
Elongationsschritt von 8 min anschloss. Alle PCR Reaktionen wurden in einem
Eppendorf Mastercycler Gradient durchgeführt.
Zur Analyse wurden 10 µl der PCR-Produkte auf ein 2 % Agarosegel aufgetragen,
mittels UV-Transluminator dokumentiert und ausgewertet.
2.2.6 Agarosegelelektrophorese
Mit Hilfe der Agarosegelelektrophorese können DNA-Moleküle entsprechend ihrer
Molekülgröße aufgetrennt werden (Fisher und Dingman, 1971). Sowohl zur Analyse
als auch zur Aufreinigung von DNA-Fragmenten wurden horizontale Agarosegele
verwendet. Die dabei verwendete Agarosekonzentration ergab sich aus der Größe der
aufzutrennenden Fragmente. Die entsprechende Menge Agarose wurde in 1 x TBEPuffer aufgekocht und mit 4 µl/100 ml Ethidiumbromidlösung (10 mg/ml) versetzt.
Anschließend wurde die flüssige Agarose in die Gelkammer gegossen, wobei durch
einen Kamm die Probentaschen ausgespart blieben. Nach Erstarren des Gels wurde
dieses in die mit 1 x TBE-Puffer gefüllte Elektrophoresekammer gesetzt, der Kamm
herausgezogen und die Proben aufgetragen, welche zuvor mit 1/10 Volumen
Probenpuffer gemischt worden waren. Die DNA-Fragmente wurden dann zusammen
48
____________________________________________________________________
mit dem neben den Proben aufgetragenen Größenmarker bei 40-80 Volt Spannung
aufgetrennt, mittels UV-Transluminator dokumentiert und ausgewertet.
2.2.7 Präparative Aufreinigung von DNA aus Agarosegelen (Gelextraktion)
Die Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen erfolgte mit dem QIAEX
II DNA Gel Extraction Kit von Qiagen. Die entsprechenden DNA-wurden unter UVLicht aus dem Gel geschnitten, in ein Eppendorfgefäß überführt, gewogen und mit
der entsprechenden Menge Puffer QX1 (30 µl je 10 mg Gel) versetzt. Nach
einminütigem vortexen der QIAEX II Beats wurden 15 µl davon zum Gelstück
gegeben und bei 55°C für 10 min inkubiert, wobei alle 2 min kurz durch vortexen
gemischt wurde. Dies war notwendig, um die Agarose im Puffer aufzulösen und die
DNA-Fragmente an die Beats binden zu lassen. Im Anschluss an die Inkubation
wurde für 10 min bei 14000 rpm und Raumtemperatur zentrifugiert, der Überstand
entfernt und das Pellet zuerst mit 500 µl Puffer QX1 und dann zweimal mit 500 µl
Puffer PE gewaschen, wozu jeweils für 1 min bei 14000 rpm zentrifugiert wurde.
Nach dem letzten Waschschritt wurde der Puffer komplett entfernt, das Pellet
getrocknet und in 15 µl Brau-H2O gelöst, wozu je nach Fragmentgröße für 5 min bei
Raumtemperatur oder für 5 min bei 50°C inkubiert wurde. Anschließend wurde bei
14000 rpm für 1 min zentrifugiert und der die DNA enthaltende Überstand in ein
steriles Eppendorfgefäß überführt.
2.2.8 Restriktionsverdau von DNA
2.2.8.1 Analytischer Restriktionsverdau
Für analytische Restriktionsverdaus von Plasmid-DNA wurden die entsprechenden
Restriktionsendonukleasen und die dazugehörigen Puffer gemäß Herstellervorschrift
in einem Reaktionsvolumen von 20 µl eingesetzt.
49
____________________________________________________________________
2.2.8.2 Präparativer Restriktionsverdau
Bei
präparativen
Restriktionsverdaus
wurden
die
verwendeten
Restriktionsendonukleasen und die dazugehörigen Puffer gemäß Herstellervorschrift
in einem Reaktionsvolumen von 50 µl eingesetzt. Bei der Verwendung von zwei
Enzymen wurde der Ansatz nach dem ersten Verdau gefällt (2.2.2), in
Restriktionspuffer aufgenommen und mit dem zweiten Enzym verdaut.
2.2.9 Dephosphorylierung von Vektor-DNA
Bei einer Ligation zwischen Vektor- und Insert-DNA, welche mit einem
Restriktionsenzym geschnitten wurden, kann es zur Religation des Vektors kommen.
Um dies zu verhindern, entfernt man die terminalen 5´-Phosphatgruppen der Vektor
DNA mit Hilfe der alkalischen Phosphatase. Dadurch kann die Religation des
Plasmids verringert werden.
Die Dephosphorylierungsreaktion wurde direkt nach dem Restriktionsverdau
durchgeführt. Dazu wurde der Restriktionsansatz im Anschluss an die gewünschte
Inkubationsdauer mit 1 µl alkalischer Phosphatase (1u/µl) versetzt. Nach einer
Inkubation von 1 Stunde bei 37°C wurde die Reaktion durch Hitzeinaktivierung
(75°C für 15 Minuten) gestoppt.
2.2.10 Auswahl der siRNA Zielsequenzen
Die Auswahl der siRNA Zielsequenzen orientierte sich hauptsächlich an denen bis zu
diesem
Zeitpunkt
durch
Tuschl
und
Kollegen
publizierten
Richtlinien
(http://www.rockefeller.edu/labheads/tuschl/sirna.html). Zugrunde gelegt wurde die
mRNA Sequenz, von der die jeweils ersten und letzten 100 Nukleotide zur Auswahl
der siRNA Zielsequenz unbeachtet blieben. Es wurde nach Sequenzmotiven der
Folge AA(N19)TT gesucht, wobei N für jedes beliebige Nukleotid steht. Diese 23 nt
lange Sequenzen sollten einen G/C-Gehalt von 40-60 % aufweisen und keine vier
Thymidin- oder Adeninmoleküle in Folge beinhalten. Die so erhaltenen potentiellen
siRNA Zielsequenzen wurden dann auf eine mögliche Sequenzhomologie mit
50
____________________________________________________________________
anderen
nicht
Ziel-mRNA
Sequenzen
überprüft
(BLAST-Suche,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) und bei mehr als 12 übereinstimmenden
Nukleotiden nicht für eine Verwendung in Betracht gezogen. Dabei spielten die zwei
Adeninmoleküle am Anfang der Sequenz für das spätere synthetische einzelsträngige
shRNA Oligonukleotid keine Rolle und blieben daher auch in der BLAST-Suche
unberücksichtigt.
2.2.11 Annealing von shRNA Oligonukleotiden
Zur
Ligation
von
shRNA
Oligonukleotiden
in
den
dafür
vorgesehenen
Expressionsvektor mussten zuerst die einzelsträngigen Oligonukleotide (sense und
antisense) zu einem doppelsträngigen Molekül vereint werden. Dafür wurden je 1 µl
sense und antisense Oligonukleotid (10 pmol/µl) mit 48 µl Annealing-Puffer
gemischt, für 4 min bei 94°C und dann für 10 min bei 70°C inkubiert, wonach die
Reaktion langsam auf 4°C gekühlt wurde. Die so über komplementäre Basenpaarung
aneinander gebundenen Oligonukleotide konnten nach Fällung (2.2.2) für die
Ligation mit dem jeweiligen shRNA Expressionsvektor verwendet werden.
2.2.12 Ligation
DNA-Ligasen katalysieren die Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen
freien 5´-Phosphat- und 3´-Hydroxyltermini
in DNA- oder RNA-Duplexen. Im
Labor wurde für die Ligation von DNA-Fragmenten in linearisierte Plasmid-DNA
die aus einem Escherichia coli-Stamm isolierte T4 DNA-Ligase verwendet. Das
Verhältnis von Vektor-DNA zu Insert-DNA betrug dabei immer 1:3. Jede Ligation
wurde in einem Gesamtvolumen von 10 µl angesetzt, wobei jeweils 15 Weiss
Einheiten des Enzyms eingesetzt wurden. Die Inkubation erfolgte entweder über
Nacht bei 16°C oder 4 h bei Raumtemperatur.
51
____________________________________________________________________
2.2.13 Herstellung kompetenter Bakterien
Damit Bakterien Plasmid-DNA oder Ligationsansätze aufnehmen können, müssen
die Bakterienzellen zuerst vorbereitet (kompetent gemacht) werden. Es gibt
verschiedene Möglichkeiten der Transformation von Bakterienzellen. Im Labor
wurden hierzu aufgrund der verwendeten Bakterienstämme (DH5α und 294-Cre)
zwei unterschiedliche Verfahren durchgeführt. Zum einen die Transformation durch
Elektroporation und des weiteren die Transformation durch Hitzeschock. Die
Bakterienzellen werden dazu in unterschiedlicher Art und Weise vorbereitet, weshalb
im folgenden beide Methoden der Vorbereitung beschrieben werden.
2.2.13.1 Herstellung von elektrokompetenten Bakterien (DH5α)
Zur Herstellung von elektrokompetenten Bakterienzellen wurde eine Kultur einer E.
coli DH5α Einzelkolonie mit 1 µl Glyzerol in 10 ml LB-Medium angesetzt und
diese über Nacht bei 37°C und 225 U/min im Bakterienschüttler gewachsen. Von der
Übernachtkultur wurden 4 ml in 400 ml frisches LB-Medium in einem
Erlenmeyerkolben überführt und so lange bei 37°C gewachsen, bis eine OD600 von
0,5-1 erreicht war. Die Bakterienlösung wurde dann auf 50 ml-Falkonröhrchen
verteilt und 10 min auf Eis inkubiert. Alle folgenden Arbeitsschritte wurden
ebenfalls bei 4°C oder auf Eis ausgeführt. Nach der Inkubation wurden die Bakterien
bei 4500 rpm für 10 min zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet
wurde in je 25 ml gekühltem 1 mM Hepes-H2O (pH 7) resuspendiert und immer
zwei dieser Suspensionen vereint. Diese beiden Arbeitsschritte wurde genauso
wiederholt. Danach wurde bei 4000 rpm für 10 min zentrifugiert, der Überstand
verworfen, die Pellets in je 10 ml eiskaltem 10 % Glycerol 1 mM Hepes-H2O (pH 7)
resuspendiert und die Suspensionen zusammengeschüttet. Nach zehnminütiger
Zentrifugation bei 4000 rpm und entfernen des Überstandes wurde das Pellet in 1 ml
eiskaltem 10 % Glycerol 1 mM Hepes-H2O (pH 7) aufgenommen und als 52 µlAliquots in vorgekühlten (4°C) Eppendorfgefäßen in N2 schockgefroren. Die so
gewonnenen kompetenten Bakterienzellen wurden bei -80°C gelagert.
52
____________________________________________________________________
2.2.13.2 Herstellung von Hitzeschock-kompetenten Bakterien (294-Cre)
Eine weitere Methode für das Einbringen von fremd-DNA in Bakterien ist der
Hitzeschock.
Zur
Herstellung
von
294-Cre
Hitzeschock-kompetenten
Bakterienzellen wurde eine 10 ml Übernachtkultur einer Bakterieneinzelkolonie
angeimpft, von dieser am nächsten Tag 800 µl in 100 ml LB-Medium verdünnt und
für weitere 3 Stunden bei 30°C und 225 U/min im Bakterienschüttler gewachsen. Die
Bakteriensuspension wurde in 50 ml Falkonröhrchen verteilt und alle folgenden
Arbeitsschritte bei 4°C durchgeführt. Nach Zentrifugation für 10 min bei 4500 rpm
und entfernen des Überstandes wurde das Pellet in jeweils 10 ml vorgekühltem (4°C)
Kalziumchlorid (0,1 M) resuspendiert und für 5 min auf Eis inkubiert. Nach
nochmaliger Zentrifugation unter gleichen Bedingungen und entfernen des
Überstandes wurde das Pellet in 2 ml der gleichen Lösung aufgenommen und unter
vortexen mit 70 µl DMSO versetzt. Nach zehnminütiger Inkubation auf Eis wurden
nochmals 70 µl DMSO zupipettiert, gevortext und weitere 10 min auf Eis inkubiert.
Anschließend wurden 200 µl Aliquots in N2 schockgefroren. Bis zur Verwendung
wurden die kompetenten Bakterienzellen bei -80°C gelagert.
2.2.14 Transformation
Zum Einschleusen von Plasmid-DNA in Bakterienzellen wurden für die verwendeten
Bakterienstämme
zwei
unterschiedliche
Methoden,
Transformation
durch
Elektroporation sowie Transformation durch Hitzeschock, gewählt, die im folgenden
beschrieben werden.
2.2.14.1 Transformation von Bakterienzellen durch Elektroporation
Für die Transformation durch Elektroporation wurde ein Aliquot elektrokompetenter
Bakterienzellen auf Eis aufgetaut und zusammen mit 1 µl der entsprechenden
Vektor-DNA oder eines Ligationsansatzes in eine Elektroporationsküvette (2 mm)
gebracht. Die Elektroporation erfolgte bei 200 Ω, 25 µF und 2,5 V in einem Gene
Pulser II Elektroporator. Um die Expression des β-Lactamase-Resistenzgens zu
53
____________________________________________________________________
induzieren, wurden die transformierten Bakterien mit 200 µl LB-Medium versetzt
und für 30 min bei 37°C im Bakterieninkubator gewachsen. Dann wurde die
Bakteriensuspension auf Ampicillin-Agarplatten ausplattiert, wobei je nach zu
erwartender Ligation- und Transformationseffizienz 50-100 µl der Suspension je
Platte verwendet wurde. Die Agarplatten wurden über Nacht bei 37°C im
Bakterienbrutschrank inkubiert. Einzelkolonien konnten am nächsten Tag analysiert
(PCR) oder zum Animpfen einer 2 ml- oder 400 ml-Übernachtkultur verwendet
werden. Für weitere Verwendung wurden die Platten für mehrere Monate bei 4°C
gelagert.
2.2.14.2 Transformation von Bakterienzellen durch Hitzeschock
Ein Aliquot der Hitzeschock-kompetenten Cre-Bakterien wurde auf Eis aufgetaut
und 1 µl der zu transformierenden DNA zupipettiert. Nach einer Inkubation von 20
min auf Eis erfolgte der Hitzeschock, wozu die Bakterien-DNA-Suspension für 2
min in den 42°C warmen Thermoblock überführt wurde. Darauf folgte eine weitere
Inkubation der Bakterien für 5 min auf Eis. Nach Zugabe von 500 µl LB-Medium
wurden die Bakterien für 20 min bei 30°C und 225 U/min im Bakterienschüttler zur
Induktion der Expression des β-Lactamase-Resistenzgens inkubiert. Von den
gewachsenen und transformierten Cre – Bakterien wurden 200 µl, 100 µl und 10 µl
auf Ampicillin – Agarplatten ausplattiert und bei 30°C im Bakterieninkubator
belassen. Einzelkolonien konnten am nächsten Tag zum Animpfen von 2 ml- oder
400 ml-Kulturen verwendet werden. Die Platten wurden für diesen Zweck für
mehrere Monate bei 4°C gelagert.
2.2.15 Radioaktive Markierung von DNA-Sonden
Zunächst wurde die durch Restriktionsverdau mit anschließender Gelextraktion
gewonnene Sonden-DNA auf eine Konzentration von 20 ng/µl eingestellt. Für die
radioaktive Markierung wurde das Prime-it II Random Primer Labeling Kit von
Stratagene verwendet. DNA-Volumen von 0,5-1,5 µl wurden mit 10 µl Random
Oligonucleotid Primers gemischt und mit Aqua destillata auf ein Endvolumen von
54
____________________________________________________________________
34 µl gebracht. Nach kurzer Zentrifugation bei 6000 rpm wurden die Proben für 5
min bei 100°C inkubiert und nach erneuter Zentrifugation mit 10 µl 5 x Buffer, 5 µl
α-32-P-dCTP und 1 µl Klenow (5 U/µl) gemischt. Nach Inkubation bei 37°C für 30
min wurde die Sonden-DNA mit dem QIAquick Nucleotide Removal Kit von Qiagen
gereinigt. Nach Zugabe von 500 µl Puffer PN wurde die Lösung auf ein Säulchen
gegeben und für 1 min bei 6000 rpm zentrifugiert. Der Durchlauf wurde verworfen
und die an die Säule gebundene DNA zweimal mit Puffer PE gewaschen und wie
zuvor zentrifugiert. Nach entfernen des letzten Waschpuffers wurde für 1 min bei
13000 rpm zentrifugiert und im Anschluss die DNA durch Zugabe von 200 µl Puffer
EB und erneute Zentrifugation eluiert. Von der eluierten Sonden-DNA wurden 2 µl
für die Messung im Counter (Liquid Scintillation Analyser) verwendet, um die
Inkorporationseffizienz zu überprüfen. Für Northern Blots wurden Sonden mit 106
bis 107 cpm verwendet.
2.2.16 RNA-Extraktion aus Zellkultur-Zellen
Für die Isolation von RNA aus Zellkultur-Zellen wurde das phenolhaltige TRIzol
Reagenz von Invitrogen verwendet. Dazu wurden, um Kontamination mit RNasen zu
vermeiden,
alle
Puffer
mit
DEPC-behandeltem
H2O
angesetzt
und
alle
Labormaterialien mit DEPC-H2O (0,1 %) gereinigt. Die Zellen wurden mit Trypsin
von der Kulturschale gelöst, mit PBS gewaschen und für 10 min bei 1200 rpm und
Raumtemperatur zentrifugiert. Anschließend wurde das PBS entfernt und alle
weiteren Arbeitsschritte auf Eis durchgeführt. Für die RNA-Extraktion wurde das
Zellpellet in 1-2 ml TRIzol gelöst. Nach fünfminütiger Inkubation wurden 200-400
µl Chloroform zugegeben, das Tube für 15 sec geschüttelt und erneut für 2 min
inkubiert. Anschließend wurde das Gemisch in Eppendorfgefäße überführt und für
15 min bei 12000 rpm und 4°C zentrifugiert, um Phenol/Chloroform- und wässrige
Phase voneinander zu trennen. Letztere wurde in ein frisches Eppendorfgefäß
überführt und mit 500 µl Isopropanol gemischt. Nach 10-minütiger Inkubation wurde
für 10 min bei 12000 rpm zentrifugiert, das RNA-Pellet mit 75 % Ethanol gewaschen
und bei 7500 rpm für 5 min zentrifugiert. Nach trocknen des Pellets wurde dieses in
25 µl DEPC-H2O bei 55°C für 10 min gelöst.
55
____________________________________________________________________
2.2.17 Konzentrationsbestimmung von RNA
Die Konzentration von RNA wurde nach dem von Sambrook et al. beschriebenen
photometrischen
Verfahren
bestimmt
(Sambrook
et
al,
1989).
Unter
Berücksichtigung der jeweiligen Verdünnung wurde mittels folgender Formel die
RNA-Konzentration bestimmt:
RNA-Konzentration [µg/µl] = OD260 x Verdünnung x 0,04
2.2.18 Northern Blot
Mit Hilfe eines Northern Blots kann die Expression von RNA in verschiedenen
Geweben oder Zellen quantifiziert werden (Alwine, 1979). Die aus Zellen oder
Gewebe extrahierte RNA wird mittels eines Agarose-Formaldehydgels aufgetrennt
und
auf
eine
Nitrozellulosemembran
geblottet
(Thomas,
1980).
Durch
Hybridisierung mit einer markierten Sonde können die Expressionslevels in den
einzelnen Proben detektiert werden.
Für das RNA – Gel wurden 4 g Agarose in 250 ml DEPC-H2O durch aufkochen
gelöst. Nach Abkühlen der Lösung auf annähernd 55°C wurde diese mit 30 ml 10 x
MOPS, 17,5 ml Formaldehyd und 6 µl EtBr (10 mg/ml) versetzt und das Gemisch in
eine Geltrageschale gegossen, wobei die Probentaschen mit Hilfe eines Kamms
ausgespart blieben. Zur Vorbereitung der Proben wurden jeweils 50 µg RNA im
Verhältnis 1:2 mit RNA sample loading buffer gemischt, für 10 min bei 65°C
inkubiert und dann bis zum Beladen des Gels auf Eis aufbewahrt. Nach erhärten des
Gels wurde der Probenkamm entfernt, die RNA-Proben aufgetragen und in 1 x
MOPS bei 40-50 V für 8 Stunden aufgetrennt. Dann wurde das Gel für 15 min in
DEPC-H2O und zweimal für je 15 min in 10 x SSC bei Raumtemperatur auf einem
Laborschüttler gewaschen. Der Blot wurde anschließend wie folgt aufgebaut:
Schwamm in 20 x SSC
– oben –
1 x Whatmanpapier in 20 x SSC
RNA - Gel
Nitrozellulosemembran in 20 x SSC
1 x Whatmanpapier in 20 x SSC
2 x Whatmanpapier
½ Stapel Handtuchpapier
– unten –
56
____________________________________________________________________
Um ein Austrocknen des mit Transferlösung (20 x SSC) getränkten Schwammes zu
verhindern und den Transfer der RNA auf die Membran zu gewährleisten, wurde der
gesamte Blot mit Frischhaltefolie umwickelt. Der Transfer erfolgte über Nacht bei
Raumtemperatur. Am folgenden Tag wurde die RNA auf der Membran im
Crosslinker bei 40 W für 3 min fixiert. Für die Prähybridisierung wurde die
Membran für 30 min bei 65°C mit 20 ml Church Buffer inkubiert. Die
Hybridisierung mit der radioakiv markierten Sonde erfolgte im Anschluß über Nacht
bei 65°C in 5-10 ml Church Buffer. Am folgenden Tag wurde die Membran zweimal
für 15 min bei 65°C mit Waschlösung 1 (2 x SSC, 0,1 % SDS) und zweimal unter
den gleichen Bedingungen mit Waschlösung 2 (0,2 x SSC, 0,1 % SDS) gewaschen,
wonach die Nitrozellulose mit Frischhaltefolie verpackt wurde. Die Exposition auf
den Phosphorimager erfolgte über Nacht.
2.2.19 Extraktion von Protein
2.2.19.1 Proteinextraktion aus Zellkultur-Zellen
Für die Gewinnung von Gesamtzelllysat wurde das Medium von den Zellen entfernt,
diese zweimal mit PBS gewaschen und trypsiniert. Die von der Platte gelösten Zellen
wurden in PBS aufgenommen, gezählt und bei 1200 rpm und 4°C für 10 min
zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das Zellpellet entsprechend der
Zellzahl
in
vorgekühltem
(4°C)
Laemmlipuffer
aufgenommen
(100
µl
Lämmlipuffer/106 Zellen). Nach Sonifikation der Proben, die bei 5-10 Watt und auf
Eis durchgeführt wurde, konnten die Extrakte für einen Western Blot verwendet
werden oder wurden bei -20°C gelagert.
2.2.19.2 Proteinextraktion aus murinem Gewebe
Um Proteine aus murinen Geweben zu extrahieren, wurde die Maus euthanasiert, die
betreffenden Organe entnommen und in N2 schockgefroren. Anschließend wurden
die Gewebe zusammen mit flüssigem Stickstoff in einen Mörser gegeben und darin
zerkleinert. Das zerhackte Gewebe wurde zusammen mit dem Stickstoff in ein
57
____________________________________________________________________
Falkonröhrchen überführt, wo man diesen verdunsten ließ. Unmittelbar darauf
wurden die Gewebeteile auf Eis gestellt, mit 1-2 ml Proteinlysepuffer versetzt und
die Proben für 10 min gekocht. Anschließend wurden die Lysate auf Eis gekühlt und
mehrmals bei 25-35 Watt sonifiziert, um das Gewebe weiter aufzuschließen. Nach
überführen des Proteinlysats in ein steriles Eppendorf Gefäß wurde für 10 min bei
10000 rpm und 4°C zentrifugiert und auf diese Weise Zelltrümmer aus der Lösung
entfernt. Der das Protein enthaltende Überstand wurde in ein frisches Eppendorf
pipettiert und das Pellet verworfen. Dieser Zentrifugationsschritt wurde so lange
wiederholt, bis der Überstand eine klare Lösung war.
2.2.20 Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford
Es gibt mehrere Möglichkeiten, die Proteinkonzentration einer Lösung zu
bestimmen. Eine Möglichkeit ist die photometrische Methode nach Bradford
(Bradford, 1976). Dabei wird der Farbstoff Coomassie-Blau verwendet, der an die in
der Suspension enthaltenen Proteine bindet, so das sich dessen Absorptionsmaximum
von 465 nm auf 595 nm verschiebt und somit eine indirekte photometrische
Quantifizierung des Proteingehalts möglich ist.
Die Messungen wurden in Einmalküvetten durchgeführt, wozu jeweils 200 µl
Bradford-Reagenz (Roti Quant), 790 µl Aqua destillata und 10 µl der zu messenden
Proteinlösung gemischt wurden. Für die Quantifizierung von Protein aus
Mausgewebe wurden 2-4 µl der Proteinlösung vorher 1:10 in Aqua destillata
verdünnt, um ein verklumpen mit dem Bradford-Reagenz zu verhindern.
Nach
vortexen und 15 min Ruhezeit bei Raumtemperatur erfolgte die Messung bei OD595.
Zuvor wurde eine Eichgerade mit unterschiedlichen Mengen an BSA (0 µg, 20 µg,
40 µg, 60 µg, 80 µg, 100 µg und 200 µg pro ml) erstellt. Die Daten wurden mit der
Software Microsoft Excel ausgewertet.
2.2.21 Acetonpräzipitation von Protein
Um eine Proteinlösung zu reinigen oder zu konzentrieren, wurde die Methode der
Acetonpräzipitation gewählt. Dazu wurden zu 1 Volumen Protein 4 Volumen
58
____________________________________________________________________
vorgekühltes (-20°C) Aceton gegeben und nach vortexen für mindestens 90 min bei
-20°C inkubiert. Anschließend wurde bei 14000 rpm und 4°C für 15 min
zentrifugiert, der Überstand verworfen und das getrocknete Pellet in Laemmlipuffer
aufgenommen. Die Proben wurden dann bis zur weiteren Verwendung bei -20°C
gelagert.
2.2.22 Western Blot
Mit Hilfe von Western Blots können Proteine selbst in so komplexen
Proteingemischen wie Gesamtproteinextrakt effizient nachgewiesen und quantifiziert
werden. Die Proteingemische werden dazu mittels analytischer, denaturierender
SDS-PAGE (Polyacrylamidgelelektrophorese) entsprechend der Molekülgröße der
enthaltenen Proteine aufgetrennt und anschließend mit der semi dry BlottingMethode (Khyse-Andersen, 1984) im elektrischen Feld vom Gel auf eine
Nitrozellulosemembran transferiert. Die immobilisierten Proteine sind dann
zugänglich für Antigen-Antikörper-Bindungen.
2.2.22.1 Analytische SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)
Durch analytische SDS-PAGE werden die Proteine eines Proteingemischs
größenabhängig im elektrischen Feld aufgetrennt. Dabei bewirkt das anionische
Detergenz SDS zum einen, das Quartär- und Tertiärstrukturen der Proteine aufgelöst
werden, wodurch diese eine gestreckte Konformation erhalten. Des weiteren bindet
SDS in konstantem Verhältnis an Proteine (1,4 g SDS/1 g Protein), wodurch eine
einheitliche negative Ladung je Proteinmenge entsteht. Im Polyacrylamidgel
wandern die negativ geladenen Proteine umgekehrt proportional ihrer molekularen
Masse zur Anode. An der Trennlinie zwischen Sammelgel und Trenngel kommt es
aufgrund des diskontinuierlichen Puffersystems nach Laemmli (Laemmli, 1970) zur
Konzentrierung der Proteine, so dass diese anschließend hochauflösend getrennt
werden. Zur Molekulargewichtsbestimmung
wird parallel ein Proteinmarker
aufgetragen.
59
____________________________________________________________________
Zunächst wurde für die Durchführung der SDS-PAGE zwischen die mit Ethanol (70
%) gereinigten Glasplatten das Trenngel gegossen (Zusammensetzung der
Polyacrylamidgele siehe Tabelle 1). Dabei richtete sich der Anteil an Acrylamid für
das Trenngel nach der Größe des nachzuweisenden Proteins. Das Trenngel wurde
nach dem Einfüllen in die Gelplatten mit Isopropanol überschichtet, um eine klare
Trennlinie zwischen Trenngel und Sammelgel zu erzeugen. Nachdem das Gel
auspolymerisiert war, wurde der Isopropylalkohol dekantiert und das Sammelgel
gegossen, wobei durch Einstecken eines Kunststoffkamms die Taschen für das
Beladen mit Protein geformt wurden. Nach Polymerisation wurde das Gel in der
Gelkammer befestigt und diese mit Laufpuffer befüllt, wonach der Kamm entfernt
und die Geltaschen mit Laufpuffer ausgespült wurden. Anschließend wurden die
Proteinproben vorbereitet, wozu diese, sofern nicht bereits geschehen, mit
Laemmlipuffer (2x oder 6x) versetzt und 5 min bei 95°C gekocht wurden.
Anschließend wurden die Proben neben dem gefärbten Proteinmarker (5 µl/Gel) auf
das Gel aufgetragen. Die Kammer wurde dann an das Netzgerät angeschlossen und
die Proteine bei 40 V (Sammelgel) bis 80 V (Trenngel) getrennt, wobei die Laufzeit
anhand der Markerbanden bestimmt wurde.
Trenngel
6 % (5 ml)
H2O
2,7 ml
2,3 ml
Acrylamidmix (30 %)
1 ml
1,3 ml
1,5 M Tris (pH 8,8)
1,3 ml
1,3 ml
SDS (10 %)
50 µl
50 µl
Ammoniumpersulfat (10 %)
50 µl
50 µl
TEMED
4 µl
3 µl
Sammelgel
1 ml
H2O
680 µl
Acrylamidmix (30 %)
170 µl
1 M Tris (pH 6,8)
130 µl
SDS (10 %)
10 µl
Ammoniumpersulfat (10 %)
10 µl
TEMED
1 µl
8 % (5ml)
Tabelle 2.1: Zusammensetzung von SDS-Polyacrylamid-Gelen
60
____________________________________________________________________
2.2.22.2 Durchführung des Western Blots (semi dry Blotting)
Der Western Blot wurde mit der semi dry Blotting-Methode durchgeführt (KhyseAndersen, 1984). Die Proteine wurden dabei im elektrischen Feld vom
Polyacylamidgel auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Der semi dry Blot
wurde wie folgt auf die Platium Titanium Anode geschichtet, wobei alle Elemente
zuvor mit Transferlösung befeuchtet und die Nitozellulosemembran zusätzlich zuvor
für 2 min in Aqua destillata inkubiert wurden:
3 Filterpapiere (Whatman 3MM, 6 x 9 cm)
- oben -
Proteingel (ohne Sammelgel)
Nitrozellulosemembran (6 x 9 cm)
3 Filterpapiere (Whatman 3MM, 6 x 9 cm)
- unten -
Luftblasen wurden mit Hilfe einer Pipette durch Rollen entfernt. Nach Aufsetzen der
Kathode und befestigen der Kontakte erfolgte der elektrophoretische Transfer, wozu
die verwendete Stromstärke entsprechend der Fläche des Blots berechnet wurde:
Stromstärke [mA] = (Breite x Höhe) x Anzahl der Blots x 1,5
Der Transfer wurde für zwei bis drei Stunden bei maximal 10 Volt durchgeführt.
Danach wurde die Membran zum Visualisieren der transferierten Proteine mit
Ponceaulösung gefärbt. Nach Entfärben der Membran mit Aqua destillata wurden
auf dieser die freien Bindungsstellen eine Stunde bei Raumtemperatur in 5 % FCSTBS/T auf dem Laborschüttler geblockt. Alle folgenden Arbeitsschritte wurden
ebenfalls auf dem Laborschüttler durchgeführt. Die Inkubation mit dem
Erstantikörper erfolgte über Nacht bei 4°C in entsprechender Verdünnung (1:501:1000) in Erstantikörperverdünnungslösung. Die weiteren Arbeitschritte wurden bei
Raumtemperatur ausgeführt. Nach dreimaligem Waschen mit TBS/T für 15 min
wurde mit dem HRP-gekoppelten Zweitantikörper für 30-45 min in entsprechender
Verdünnung (1:2000-1:5000) in 2 % BSA-TBS/T inkubiert. Dann wurde die
Membran dreimal für 10 min mit TBS/T gewaschen und für eine Minute mit
frischem ECL-Reagenz inkubiert. Darauf folgte unmittelbar die Exposition auf
einem Autoradiographiefilm, wobei sich die Expositionszeit nach der zu erwartenden
61
____________________________________________________________________
Bandenintensität richtete. Die Filme wurden unmittelbar nach der Exposition
entwickelt und ausgewertet.
2.2.23 Entfernung von Antikörpern und Sonden von Nitozellulosemembranen
Nitrozellulosemembranen können sowohl Nukleinsäuren als auch Proteine binden. In
der vorliegenden Arbeit wurden diese Membranen für die Durchführung von
Northern Blots sowie Western Blots genutzt, um RNA- und Proteinexpression von
Dsg 2 zu untersuchen. Um den Nachweis zu erbringen, dass für einen Blot homogene
Probenmengen verwendet wurden (Ladekontrolle), mussten gebundene SondenDNA bzw. Antikörper von der Membran gewaschen und mit einer internen Kontrolle
(Sonde
oder
Antikörper)
inkubiert
werden.
Im
folgenden
werden
die
Verfahrensweisen für beide Blotting-Methoden beschrieben.
2.2.23.1 Entfernung von Sonden von Nitozellulosemembranen bei Northern
Blots
Um radioaktiv markierte DNA von Nitrozellulosemembranen zu entfernen, wurde
SDS-Lösung (0,1 %) zum kochen gebracht, die Membran für 2 min in der kochenden
Lösung inkubiert und beides auf 55°C abkühlen gelassen. Die Membran konnte dann
für die Hybridisierung mit einer Sonde genutzt werden, die gegen eine konstitutiv
exprimierte RNA gerichtet ist (Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase, GAPDH).
2.2.23.2 Entfernung von Antikörpern von Nitrozellulosemembranen bei
Western Blots
Im Anschluss an einen Western Blot wurden die Nitrozellulosemembranen mit einem
Antikörper inkubiert, der gegen ein konstitutiv exprimiertes, endogenes Protein, z.B.
p38, gerichtet ist. Dazu mussten zunächst die bereits gebundenen Antikörper von den
Membran entfernt werden. Diese wurden hierfür mit 50 ml Stripping Puffer für 3060 Minuten bei 50°C inkubiert und anschließend dreimal mit 100 ml PBS für 15
62
____________________________________________________________________
Minuten bei Raumtemperatur gewaschen. Danach konnten die Membranen wie
beschrieben geblockt und mit α-p38 Antikörper inkubiert werden.
2.2.24 Murine Gewebeschnitte
2.2.24.1 Anfertigung von murinen Gewebeschnitten
Die Mäuse wurden euthanasiert und die entnommenen Gewebe zuerst für 3-5 min in
kaltem Isopentan (Behälter in flüssigem Stickstoff stehend) eingefroren und
anschließend in flüssigen Stickstoff überführt. Für langfristige Lagerung wurden die
Organe im -80°C Gefrierschrank tiefgefroren. Die Gewebe wurden bei -20°C an
einem Kryostat der Firma Leica (Modell 1720 Digital) mit einer Dicke von 10 µm
geschnitten, auf Super Frost Plus-Objektträger transferiert und bei -20°C gelagert.
2.2.24.2 Acetonfixierung von murinen Gewebeschnitten
Die murinen Gewebeschnitte wurden zunächst mit einem Fettstift auf dem
Objektträger umrandet, um ein späteres Auslaufen der Färbelösung zu verhindern.
Anschließend wurden die Schnitte in kaltes Aceton (-20°C) überführt und 10 min bei
4°C fixiert. Dann wurden die Schnitte dreimal für 5 min in PBS (pH 7,4) bei
Raumtemperatur gewaschen, worauf die Anfärbung des Gewebes folgte.
2.2.24.3 X-Gal- und Fast Red-Färbung muriner Gewebeschnitte
Von den fixierten und mit PBS gewaschenen Gewebeschnitten wurde die
Waschlösung abgetropft und pro Objektträger etwa 1 ml der jeweils frisch
angesetzten X-Gal-Färbelösung direkt auf das Gewebe pipettiert. Die Inkubation
erfolgte über Nacht bei 37°C in einer feuchten Kammer. Am nächsten Tag wurden
die Schnitte nochmals dreimal für 5 min mit PBS gewaschen. Anschließend wurde
das Zytoplasma mit Fast Red angefärbt, indem wenige Tropfen der Lösung für 3 min
bei Raumtemperatur auf die Schnitte gegeben wurde. Anschließend wurde die
63
____________________________________________________________________
Färbelösung durch Waschen mit PBS entfernt, die Schnitte mit Glycerol
eingedeckelt, dokumentiert und ausgewertet.
2.2.24.4 Immunfluoreszenz von murinen Gewebeschnitten
Die Immunfluoreszenz wurde freundlicherweise von Frau Christine Grund
(Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg, D) als indirekte Immunfluoreszenz
durchgeführt. Hierbei wird das Antigen von einem Antikörper erkannt, welcher
wiederum in einem zweiten Färbeschritt von einem Spezies-spezifischen
Zweitantikörper gebunden wird. Dieser ist gegen den Fc-Teil des Erstantikörpers
gerichtet und mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert. Durch Licht bestimmter
Wellenlänge wird der Farbstoff angeregt, wodurch das gesuchte Antigen detektiert
werden kann.
Die Immunfärbung wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Dazu wurden die
fixierten Mausgewebeschnitte zunächst für 1 Stunde mit PBS/5 % FCS blockiert.
Nach Entfernen der Blockierlösung wurden die Schnitte mit dem Primärantikörper
(DG 3.10, 1:10 in PBS) inkubiert. Nach 30 min erfolgten drei Waschschritte mit PBS
für jeweils 10 min. Der Zweitantikörper (Ziege-anti-Maus-Alexa Fluor) wurde 1:500
in PBS verdünnt und für 30 min inkubiert. Nachdem einmal mit PBS gewaschen und
dieses vom Schnitt abgetropft war, erfolgte das Eindeckeln mit Fluoromount-G,
wonach die gefärbten Schnitte dokumentiert werden konnten.
2.2.25 Zellkultur
Zur Verhinderung von Kontaminationen wurden alle Arbeitsschritte unter einer
sterilen Sicherheitswerkbank durchgeführt. Die Kultivierung der Zellen erfolgte in
einem Zellinkubator bei 37°C und 5 % CO2.
64
____________________________________________________________________
2.2.25.1 Kultivierung von HEK 293, 3T3 und EpH4 Zellen
Die Zellen wurden in 10 % FCS DMEM gehalten und im Zellinkubator kultiviert.
Um die Zellen umzusetzen oder zu ernten, wurde das Medium entfernt und die
Zellen zweimal mit PBS gewaschen. Dann erfolgte die Überschichtung der Zellen
mit Trypsin/EDTA, wobei für eine P 100 Kulturschale 1 ml der Lösung verwendet
wurde, für kleinere Kulturschalen entsprechend weniger. Anschließend wurden die
Zellen für mehrere Minuten im Zellinkubator belassen. Nach Ablösen der Zellen von
der Kulturschale wurden diese in Medium aufgenommen und im gewünschten
Verhältnis neu ausplattiert. Zur Bestimmung der Zellzahl wurden die Zellen in der
Neubauerkammer gezählt und die Zellzahl wie folgt berechnet:
Zellzahl/ml Medium = Zellzahl x 104 x Verdünnungsfaktor
2.2.25.2 Kryokonservierung von Zellen
Nach dem Trypsinieren der Zellen wurden diese in Medium aufgenommen, in ein 15
ml Falcon -Röhrchen überführt und die Zellzahl bestimmt. Dann wurde bei 1200 rpm
für 10 min zentrifugiert und der Überstand abgesaugt. Das Zellpellet wurde in
entsprechender Menge Einfriermedium (FCS 10% DMSO, 1 ml je 7,5 x 105 Zellen)
aufgenommen und 1 ml Suspension in je ein Kryoröhrchen aliquotiert. Diese wurden
dann mindestens über Nacht bei -80°C langsam in einer Styroporbox eingefroren,
bevor sie zur langfristigen Lagerung in N2 überführt wurden.
2.2.25.3 Auftauen von Zellen
Die in flüssigem Stickstoff oder bei -80°C gelagerten Zellen wurden in einem 37°C
warmen Wasserbad aufgetaut und der Inhalt des Kryoröhrchens in ein 15 ml FalconRöhrchen mit 10 ml vorgewärmtem (37°C) Medium überführt. Nach Zentrifugation
für 10 min bei 1200 rpm und Raumtemperatur wurde der Überstand abgesaugt, das
Zellpellet in 8 ml Medium resuspendiert und in eine P 100 Kulturschale überführt.
65
____________________________________________________________________
2.2.25.4 Transiente Transfektion von Plasmid-DNA in HEK 293- und
NIH 3T3-Zellen
Die Transfektion von HEK 293- und NIH 3T3-Zellen erfolgte mit dem PolyFect
Transfektionsreagenz von Qiagen. Am Tag vor der Transfektion wurden im Fall der
HEK 293 Zellen 6 x 105 Zellen, im Fall der 3T3 Zellen 4 x 105 Zellen, in 3 ml
Zellkulturmedium in jeweils eine Aussparung einer 6-Lochkulturplatte ausgesät, so
dass die Zellen am folgenden Tag 80 % Konfluenz erreicht hatten. Von der in
zirkulärer Form vorliegenden Plasmid-DNA wurden je Transfektionsansatz 2 µg in
100 µl DMEM verdünnt, welches weder FCS noch Antibiotika enthielt. Nach
vortexen der Lösung wurden 20 µl PolyFect Reagenz zugegeben, durch pipettieren
gemischt und die Lösung zur Bildung des Tranfektionskomplexes für 10 min bei
Raumtemperatur inkubiert. Währenddessen wurde das Medium von den Zellen
entfernt und durch 3 ml frisches Medium ersetzt. Darauf folgte die Zugabe von 1 ml
Medium zum Transfektionsgemisch, welches nach kurzem Mischen durch
pipettieren direkt zu den Zellen gegeben und durch bewegen der Platte im Medium
verteilt wurde. Die Zellen wurden dann für 48 h bei 37°C und 5 % CO2 im
Zellinkubator gewachsen.
2.2.25.5 Transiente Transfektion von EpH4 Zellen
Die Transfektion von EpH4 Zellen wurde mit Lipofectamine™ 2000 von Invitrogen
durchgeführt. Am Tag vor der Transfektion wurden 4,5 x 105 Zellen in einer P 100
Kulturschale ausgesät, um zum Zeitpunkt der Transfektion 40-50 % Konfluenz zu
erreichen. Je P 100 Kulturschale wurde ein Eppendorf Reaktionsgefäß mit 8 µg DNA
und 500 µl Opti – MEM vorbereitet. In dem zweiten, separaten Röhrchen wurden 20
µl Lipofectamine Reagenz in 500 µl Opti-MEM verdünnt und 5 min bei
Raumtemperatur stehen gelassen. Anschließend wurden DNA- und LipofectamineLösung miteinander gemischt und zur Komplexbildung 20 min bei Raumtemperatur
inkubiert. Während dieser Zeit wurde das Medium von den Zellen entfernt und durch
5 ml frisches, Penicillin/Streptomycin-freies DMEM ersetzt. Dann wurde das
Transfektionsgemisch im Medium auf den Zellen verteilt und diese bei 37°C und 5
66
____________________________________________________________________
% CO2 inkubiert. Etwa 7 Stunden nach der Transfektion wurde jede Kulturschale mit
weiteren 5 ml Medium versetzt.
2.2.26 Generierung transgener Mäuse durch Pronukleusinjektion
Die Mikroinjektion transgener DNA in den männlichen Vorkern befruchteter
muriner Eizellen (d 0,5) und die damit verbundene Vorbereitung der Mäuse wurde
im
Institut
für
Toxikologie
der
Johannes
Gutenberg-Universität
Mainz
freundlicherweise von Swetlana Ohngemach und Dr. Leonid Eshkind durchgeführt.
Im Folgenden werden die zur Generierung transgener Mäuse erforderlichen
Biotechniken vorgestellt.
2.2.26.1 Superovulation
Um eine möglichst große Anzahl befruchteter Eizellen gewinnen zu können, wurden
die weiblichen Tiere durch Hormongabe in einen induzierten Sexualzyklus gebracht.
Dazu wurden drei Tage vor der Verpaarung jeweils etwa 100 µl PMSG (Pregnant
Mare`s Serum Gonadotropin) und am Tag der Verpaarung HCG (Human Chorionic
Gonadotropin) intraperitoneal injiziert.
2.2.26.2 Gewinnung der befruchteten Eizellen
Die superovulierten Mäuse wurden am Tag nach der Verpaarung getötet, die Uteri
mit den befruchteten Eizellen entnommen und in eine Zellkulturplatte mit Medium
überführt. Die Eizellen konnten dann aus den Uteri herausgespült und zur weiteren
Manipulation vorbereitet werden.
67
____________________________________________________________________
2.2.26.3 Vorbereitung der transgenen DNA für die Pronukleusinjektion
Zunächst wurde die Plasmid-DNA durch präparativen Restriktionsverdau linearisiert
(2.2.8.2) und anschließend über ein Agarosegel aufgereinigt (2.2.7). Nach Fällung
der DNA (2.2.2) und dreimaligem waschen mit Ethanol (70 %) wurde das DNAPellet in 160 µl Injektionspuffer aufgenommen, zur weiteren Reinigung auf eine
Spin X-Säule gegeben und für eine Minute bei 14000 rpm zentrifugiert.
Die Konzentration der DNA wurde über eine Verdünnungsreihe auf einem 1 %
Agarosegel bestimmt (2.2.4) und für die Mikroinjektion auf 2,5 ng/µl eingestellt.
2.2.26.4 Mikroinjektion des transgenen Konstrukts in Oozyten
Die transgene DNA wurde mit Hilfe einer Mikromanipulationsanlage in den
männlichen Vorkern der befruchteten Eizellen injiziert. Zu dieser Anlage gehörten
zwei Mikromanipulatoren mit Halte- und Injektionskapillare, ein Stereomikroskop,
sowie die die Oozyten enthaltende Objektkammer. Für die Injektion wurde die
Injektionskapillare mit transgener DNA (2,5 ng/µl) befüllt und eine befruchtete
Eizelle mit der Haltekapillare angesaugt. Dann wurde die Injektionskapillare in den
männlichen Vorkern der Eizelle gestochen und das transgene Konstrukt injiziert. Die
so veränderten Eizellen wurden anschließend in scheinschwangere Mäuse
transferiert.
2.2.26.5 Scheinschwangere Leihmütter
Für den Transfer der manipulierten Oozyten wurden scheinträchtige Weibchen
benötigt. Diese wurden durch Verpaarung mit vasektomierten Böcken erhalten.
Männliche Tiere, denen beide Vasa deferentia durchtrennt worden waren, wurden
nach verheilen der Operationswunde mit den Weibchen verpaart. Die Weibchen
wurden jeweils morgens auf einen Vaginalpfropf untersucht, der auf eine vollzogene
Verpaarung hinweist.
68
____________________________________________________________________
2.2.26.6 Transfer der mikroinjizierten Oozyten
Mikroinjizierte Oozyten wurden ins Infundibulum scheinschwangerer Weibchen
übertragen. Dazu wurde die scheinschwangere Maus betäubt, durch einen kurzen
Schnitt die Bauchhöhle geöffnet und der Uterus vorsichtig herausgezogen. Die
mikroinjizierten Oozyten konnten dann mit einer Transferkapillare in das
Infundibulum gebracht und der Uterus anschließend in das Tier zurückgeschoben
werden. Zuletzt wurde die Wunde verklammert. Nach einer Tragezeit von annähernd
20 Tagen wurden die Jungen geboren. Da die in die Oozyten eingebrachte transgene
DNA das grüne Fluoreszenzprotein (EGFP) als Indikatorgen enthielt, konnte bereits
durch einen Fluoreszenztest eine erfolgreiche Integration der transgenen DNA in das
Mausgenom festgestellt werden. Dazu wurden Ohrproben der Jungen im Binokular
unter Zuhilfenahme der Fluoreszenzlampe untersucht. Des Weiteren wurde DNA aus
Schwanzbiopsien der Tiere isoliert und mittels PCR die Integration des Transgens
geprüft.
2.2.27 Behandlung von adulten Mäusen mit Tamoxifen
Zur Herstellung der Tamoxifen-Injektionslösung wurde 1 g Tamoxifenpulver in 10
ml Ethanol bei 37°C gelöst und anschließend über Nacht mit 90 ml autoklaviertem
Sonnenblumenöl bei Raumtemperatur gemischt. Die Lösung wurde aliquotiert und
bei -20°C gelagert. Für die Behandlung ausgewählte Tiere wurden in separaten
Käfigen gehalten, um Kontaminationen zu vermeiden. Den Mäusen wurden täglich
für 5 oder 10 aufeinander folgende Tage 100 µl der Injektionslösung (entspricht 1
mg Tamoxifen) intraperitoneal injiziert. Während den Injektionsintervallen wurde
die Lösung bei 4°C aufbewahrt, wobei jedes Aliquot nach 6 Tagen bei 4°C
verworfen wurde.
69
____________________________________________________________________
2.2.28 Aktivierung der CreERT2 Rekombinase mit Tamoxifen im Embryo und
anschließende β-Galaktosidase-Färbung
Zwei Tage vor Präparation der Embryos wurde den Mausweibchen 1 mg Tamoxifen
(10 mg/ml autoklaviertes Sonnenblumenöl) intraperitoneal injiziert. Die Präparation
erfolgte an Tag 9,5 und 12,5 der Schwangerschaft. Die Dauer der Schwangerschaft
wurde durch Untersuchung der Weibchen auf einen Vaginalpfropf am Morgen nach
der Verpaarung genau bestimmt.
Zur Präparation der Embryonen wurde das Muttertier euthanasiert, mittels
Bauchdeckenschnitt geöffnet, der Uterus entnommen und in PBS/5 % FCS überführt.
In dieser Lösung wurden die Embryos vom umgebenden maternalen Gewebe frei
präpariert und in frisches PBS/5 % FCS überführt.
Zur Fixierung wurden die Embryos für eine Stunde bei 4°C in der Fixierlösung
inkubiert. Nach einem Waschschritt in PBS/5 % FCS für 5 min bei Raumtemperatur
wurden die Embryos über Nacht bei 37°C mit X-Gal-Färbelösung behandelt. Darauf
folgte eine weitere Inkubation in der Fixierlösung über Nacht bei 4°C. Die Embryos
wurden dann dreimal in PBS für 10 min bei Raumtemperatur gewaschen und
anschließend mittels Methanol-Reihe dehydriert (25 %, 50 %, 75 % Methanol in
PBS, 100 % Methanol). Um die inneren Strukturen der Embryonen sichtbar zu
machen, wurden diese in ein 2:1 Gemisch aus Benzylbenzoat und Benzylalkohol
transferiert. Nach kurzer Inkubationszeit erfolgte die Dokumentation mittels
Binokular.
2.2.29 FACS (Fluorescent Activated Cell Sorting)-Analyse von Mausorganen und
Mausembryonen
Um Mausorgane und Embryonen mit Hilfe des Fluorescent Activated Cell Sortings
zu analysieren, müssen diese als Einzelzelllösungen vorliegen. Dazu wurden die
Mäuse euthanasiert und die Embryos und Gewebe (Milz, Knochenmark, Thymus
und Lymphknoten) entnommen.
Die Embryos wurden wie unter 2.2.22 beschrieben präpariert und anschließend
halbiert. Der Kopfbereich des Embryos wurde in 750 µl Schwanzlysepuffer mit 26 µl
Proteinase K (10 mg/ml) überführt und über Nacht bei 55°C auf einem Laboschüttler
70
____________________________________________________________________
inkubiert, um daraus DNA für die Genotypisierung mittels PCR zu extrahieren
(2.2.3). Die zweite Embryohälfte wurde zum Verdauen mit einer Schere auf einem
Objektträger zerkleinert, in ein 12 ml PP-Tube mit 3 ml PBS/5 % FCS überführt, mit
50 µl Kollagenase (10 mg/ml) versetzt und für 40 min in einem 37°C warmen
Wasserbad geschüttelt. Nach der Inkubation wurde die Gewebelösung mit 5 ml
PBS/5 % FCS verdünnt und über einen Falkonfilter in ein 50 ml Falkonröhrchen
gebracht. Nach Zentrifugation für 10 min bei 1200 rpm und 4°C wurde der
Überstand verworfen, das Pellet in 2-5 ml PBS/5 % FCS aufgenommen und bis zur
weiteren Verwendung auf Eis aufbewahrt.
Um Einzelzellsuspensionen von Milz und Thymus zu gewinnen, wurden die Organe
in Zellkulturschalen mit PBS/5 % FCS gebracht und über einen Falkonfilter darin
zerkleinert. Die Suspension wurde dann über den Filter in ein 50 ml Falkonröhrchen
überführt. Die Lymphknoten wurden zwischen zwei Objektträgern homogenisiert
und ebenfalls über einen Falkonfilter in ein 50 ml Falkonröhrchen gebracht. Zur
Präparation des Knochenmarks wurde eine Spritze mit PBS/5 % FCS gefüllt, mit
dieser mehrmals der Knochen ausgespült und die Zellösung in ein 50 ml
Falkonröhrchen überführt. Die Zellsuspensionen der lymphatischen Organe wurden
wie oben beschrieben zentrifugiert und bis zur Antikörperfärbung auf Eis
aufbewahrt.
Für jede Antikörperfärbung wurden 106 Zellen (in 100 µl PBS/5 % FCS) der
jeweiligen Zelllösung in eine 96-Lochkulturplatte pipettiert und bei 1200 rpm und
4°C für 10 min zentrifugiert. Die gegen die unterschiedlichen hämatopoietischen
Zellen gerichteten Antikörper wurden in PBS/5 % FCS verdünnt (1:100-1:400). Die
Zellpellets wurden in je 50 µl der Antikörperlösungen resuspendiert und für 10 min
auf Eis inkubiert. Nach anschließender Zentrifugation bei 1200 rpm und 4°C für 10
min wurden die Zellen in 400 µl PBS/5 % FCS aufgenommen und bis zur Analyse
auf Eis stehen gelassen oder, wenn nötig, mit einem Zweitantikörper behandelt.
Die Analyse erfolgte in einem FACS Calibur der Firma Becton Dickinson.
2.2.30 Induktion von Colitis ulcerosa bei transgenen Mäusen
Für einen Darm-spezifischen Untersuchungsansatz der Dsg 2 knock down Mäuse
wurde bei den Tieren die chronische und entzündliche Darmerkrankung Colitis
71
____________________________________________________________________
ulcerosa induziert. Dazu wurden die Dsg 2 knock down Tiere zunächst verpaart mit
VillinCreERT2 Mäusen, die Tamoxifen-induzierbar und gewebespezifisch im Darm
Cre Rekombinase exprimieren (El Marjou et al, 2004). Die Translokation des über
den Villin Promoter transkribierten CreERT2 Fusionsmoleküls, bestehend aus Cre
Rekombinase und modifiziertem Östrogenrezeptor, in den Zellkern wurde bei
bitransgenen Tieren durch Injektion von Tamoxifen (1 mg in 100 µl
Sonnenblumenöl/Tag an 5 aufeinander folgenden Tagen) stimuliert. Durch die
Translokation von CreERT2 in den Zellkern sollte die CMV/EGFP/Stop-Kassette des
pSicopInsu Dsg 2 shRNA Transgens entfernt und so die Dsg 2 shRNA exprimiert
werden. Während der folgenden Colitis-Induktion wurden die Tiere weiter mit
Tamoxifen behandelt, um in den sich ständig erneuernden Darmzellen die
Expression der Dsg 2 shRNA zu gewährleisten. Für die Induktion von Colitis
ulcerosa wurde den Mäusen eine einmalige Dosis Azoxymethan (AOM, 7,4 mg/kg)
intraperitoneal injiziert und für die nachfolgenden 7 Tage das Trinkwasser mit 3 %
Dextransodiumsulfat (DSS) versetzt. In den darauf folgenden Wochen bekamen die
Mäuse normales Trinkwasser. Die endoskopischen Untersuchungen erfolgten 3 und
5 Wochen nach Gabe von AOM und wurden freundlicherweise von Alexej Nikolaev
und Dr. Christof Becker (I Med Klinik, Arbeitsgruppe Prof. Neurath,
Universitätsklinik
Mainz)
an
einem
speziellen
Miniendoskop
(Coloview)
durchgeführt.
72
Ergebnisse
____________________________________________________________________
3 Ergebnisse
3.1 Charakterisierung der Rosa26CreERT2 Maus
Um den Dsg 2 knock down Phänotyp in der Maus zu verschiedenen
Entwicklungszeitpunkten induzieren zu können und besonders um mögliche
phänotypische Effekte in der Adultmaus zu entdecken, war die Verfügbarkeit einer
konditionalen allgemeinen Cre-Deletermaus notwendig.
In Zusammenarbeit mit Prof. Anton Berns (The Netherlands Cancer Institute,
Division of Molecular Genetics and Center of Biomedical Genetics, Amsterdam, NL)
und dessen Mitarbeitern wurde die Rosa26CreERT2 Maus generiert und analysiert.
Dabei fanden die Vorarbeiten (Klonierung, ES-Zellkultur und Injektion der
manipulierten ES-Zellen) im Netherlands Cancer Institute statt. Die Analyse der
Maus wurde am Institut für Toxikologie, Universität Mainz, durchgeführt und wird
im folgenden Ergebnisteil beschrieben.
Es wurden verschiedene Fusionsmoleküle bestehend aus Cre Rekombinase und
modifizierten Ligandenbindedomänen des humanen Östrogenrezeptors hergestellt
(CreERT1, CreERT2, CreERT∆) und in den Rosa26 Lokus von ES-Zellen gebracht
(knock in). Die verschiedenen ES-Zellklone zeigten im Vergleich mit nicht
transfizierten ES-Zellen keinen Unterschied in Zellgröße und Morphologie. In
Gegenwart des synthetischen Östrogenantagonisten Tamoxifen, nicht aber durch den
natürlichen Liganden 17-β-Östradiol, wurde die Translokation der Cre/ERFusionsmoleküle in den Zellkern bewirkt. Zudem konnte für die WT-Cre, CreERT1
und CreERT2 exprimierenden ES-Zellen keine Veränderung im Zellwachstum
festgestellt
werden.
Bei
Zellen,
welche
die
CreERT∆
Mutante
(ohne
Ligandenbindedomäne D des Östrogenrezeptors) exprimierten, kam es zu einem
deutlichem Rückgang der Proliferation kultivierter ES-Zellen. Da CreERT2
exprimierende Rosa26 knock in ES-Zellen weder einen antiproliferativen noch
genotoxischen Effekt zeigten und zudem im Vergleich mit CreERT1 ES-Zellen
sensitiver auf Tamoxifen reagieren (Feil et al, 1997; Indra et al, 1999), wurden sie
zur Generierung der hier vorgestellten Rosa26CreERT2 Deletermauslinie verwendet.
73
Ergebnisse
____________________________________________________________________
3.1.1 Genotypisierung von Rosa26CreERT2 sowie Rosa26Reporter Mäusen
Im Labor wurden alle Mäuse standardmäßig mit Hilfe von PCR (2.2.5) genotypisiert.
Mit dieser Methode ist es, im Gegensatz zur Genotypisierung mittels Southern Blot,
möglich, innerhalb kurzer Zeit Transgene in Mäusen zu detektieren. Als template für
die PCR diente dabei die aus den Schwanzbiopsien isolierte DNA (2.2.3). Zur
Detektion des jeweiligen Transgens wurden spezifische Primerpaare ausgewählt, die
ausschließlich an das jeweilige Transgen anbinden und nur in diesem Fall ein
entsprechendes PCR-Produkt liefern. Durch ein fehlendes PCR-Produkt wiederum
wird angezeigt, das dieses Transgen nicht vorhanden ist. Um zu überprüfen, ob ein
Transgen tatsächlich nicht vorhanden ist oder andere Faktoren dazu führten, das kein
Amplifikationsprodukt entstand, wurde für jede PCR ein weiteres Primerpaar
verwendet, welches an ein endogenes Gen anbindet. Dadurch entstand ein
zusätzliches PCR-Produkt, welches als interne PCR-Kontrolle diente. Eine weitere
Kontrolle für die PCR war die Verwendung von DNA bereits getesteter Mäuse.
Diese wurden als Positiv- (Träger des Transgens) und Negativ- (nicht Träger des
Transgens) Kontrollen in jeder PCR mitgeführt. Ebenso wie die Leerkontrolle, die
alle PCR-Reagenzien mit Ausnahme von DNA enthielt, wodurch eventuelle
Kontaminationen sichtbar gemacht werden konnten.
Zur Genotypisierung potentieller Rosa26CreERT2 Mäuse wurden Primer gewählt, die
an Cre Rekombinase anbinden und ein 300 bp großes PCR-Produkt lieferten. Als
interne Kontrolle wurden die Primerpaare für Aktin verwendet, wodurch eine 450
bp-Bande entstand. Die PCR-Reaktionen wurden wie unter 2.2.5 beschrieben
durchgeführt. Die Produkte wurden im Anschluss auf einem 2 % Agarosegel (2.2.6)
aufgetrennt und das Ergebnis mittels UV-Transluminator dokumentiert. Abbildung
3.1 zeigt ein Agarosegelbild mit den Genotypisierungsproben einiger potenzieller
Rosa26CreERT2 Mäuse (Nummer 13204-13213). Zur Orientierung der Bandengröße
wurde neben den Proben und Kontrollen (Positiv-, Negativ- und Leerkontrolle) ein
Marker auf das Gel aufgetragen. Mit Ausnahme der DNA-Probe 13205 sind alle
getesteten Mäuse positiv für das Transgen (300 bp-Bande). Da die Probe 13207 nur
eine schwache Bande lieferte, wurde diese Probe in einem späteren PCR-Ansatz
wiederholt und bestätigt.
Um die Aktivität der Cre-Rekombinase in den Rosa26CreERT2 Mäusen testen zu
können, wurden diese zunächst mit einer Reportermaus verpaart. Rosa26Reporter
74
Ergebnisse
____________________________________________________________________
(R26R) Mäuse (Soriano, 1999) besitzen ein in den Rosa26 Lokus integriertes
Transgen, das es ermöglicht, die Expression von Cre-Rekombinase durch X-GalFärbung sichtbar zu machen. Der Promoter ist von dem Reportergen β-Galaktosidase
durch eine von loxP sites flankierte Stop-Kassette (Neomycinkassette) getrennt. Nur
durch Cre-induzierte Rekombination zwischen den loxP sites kommt es zur Deletion
der Stop-Kassette und damit zur Expression des Transgens. Auf diesen
Funktionalitätstest wird unter 3.1.2 genauer eingegangen. Da für diesen Test doppelt
transgene Mäuse benötigt werden, wurden die Tiere zunächst mit Hilfe von PCR
-K
+K
H 2O
13213
13212
13211
13210
13209
13208
13207
13206
13205
M
13204
genotypisiert. Für diese PCR wurden drei Primer je Reaktion verwendet.
Aktin (450 bp)
RosaCre (300 bp)
Abb. 3.1: Genotypisierung von Rosa26CreERT2 Mäusen
Agarosegel mit den Produkten einer Genotypisierungs-PCR. Die verwendete DNA stammt von
Mausschwanzbiopsien potentieller Rosa26CreERT2 Mäuse. Zahlen geben die Nummern der Mäuse
an. Als Leerkontrolle wurde ein PCR-Ansatz anstelle von DNA mit Wasser versetzt (H2O). Als
Positivkontrolle (+ K) diente DNA einer bereits für das Transgen positiv getesteten Maus. Als
Negativkontrolle (- K) wurde DNA einer Maus verwendet, die nicht Träger des Transgens ist. Mäuse,
die Träger des Rosa26CreERT2 Transgens sind, liefern neben dem Produkt der internen PCRKontrolle (Aktin, 450 bp) eine weiteres, 300 bp großes PCR-Produkt (RosaCre).
M Marker (100 bp ladder)
Von diesen bindet ein Primer im Wildtyp-Rosa26 Lokus, der zweite Primer bindet
ausschließlich im genetisch veränderten Bereich und der dritte Primer bindet in
beiden Fällen an den Rosa26 Lokus auf der DNA. Für das Transgen entstand dabei
eine Bande von 300 bp, für den Wildtyp eine von 600 bp. Dies bedeutet zum einen,
dass in diesen Genotypisierungen keine weitere interne PCR-Kontrolle verwendet
werden musste, da für nicht transgene Mäuse die Wildtyp-Bande erschien. Des
weiteren konnte mit diesem PCR-Ansatz festgestellt werden, ob die betreffende
Maus homo- oder heterozygot für das Transgen ist. In Abbildung 3.2 ist das Ergebnis
einer solchen Genotypisierungs-PCR in Form eines Agarosegelbildes für die Proben
11510 bis 11515 dargestellt. Es ist zu erkennen, dass die Mäuse heterozygot für das
75
Ergebnisse
____________________________________________________________________
Transgen sind, da in allen Fällen neben der transgenen (Mut) auch die Wildtyp-
+K
11515
11514
11513
11512
H 2O
11511
M
11510
Bande (WT) erscheint.
WT (600 bp)
Mut (300 bp)
Abb. 3.2: Genotypisierung von Rosa26Reporter (R26R) Mäusen
Agarosegels mit PCR-Produkten von R26R Mäusen. Neben dem Marker (M, 100 bp ladder) sind die
Produkte der verschiedenen Mäuse (11510-15) sowie die Positiv- (+ K) und Leerkontrolle (H2O) der
PCR aufgetragen. Die verwendeten Primer binden an den Rosa26 Lokus auf der DNA und liefern für
den Wildtyp-Lokus (WT) ein 600 bp- und für den transgenen Lokus (Mut) ein 300 bp-Produkt.
3.1.2 Behandlung doppelt transgener Rosa26CreERT2/R26R Mäuse mit
Tamoxifen führt zu unterschiedlich starker Expression des Reportergens
β-Galaktosidase in verschiedenen peripheren Organen
Um
die
Aktivtät
der
Cre-Rekombinase
in
verschiedenen
Geweben
der
Rosa26CreERT2 Maus untersuchen zu können, wurde diese mit entsprechenden
Reportermäusen verpaart. Für den im folgenden beschriebenen Funktionalitätstest
wurden zur Verpaarung R26R Mäuse gewählt, welche als Reportergen βGalaktosidase exprimieren. Da zwischen Reportergen und Promoter eine von loxP
sites flankierte Neomycin/Stop-Kassette liegt, kommt es zunächst nicht zur
Expression des Reportergens. Erst nach Cre-vermittelter Rekombination zwischen
den loxP sites wird die Stop-Kassette aus der DNA entfernt und β-Galaktosidase
kann exprimiert werden.
Das Gen für Cre-Rekombinase in Rosa26CreERT2 Mäusen ist an eine modifizierte
Ligandenbindedomäne
des
humanen
Östrogenrezeptors
Glycin400Valin/Methionin543Alanin/Leucin544Alanin;
Indra
(tripel-Mutation:
et
al,
1999)
gekoppelt. Aufgrund dieser Fusion gelangt die Cre-Rekombinase erst dann in den
Zellkern, wenn der synthetische Ligand Tamoxifen (Tam) an den Rezeptor gebunden
hat. Durch die Anbindung des Liganden kann das Molekül in den Zellkern
76
Ergebnisse
____________________________________________________________________
translozieren und dort seine Funktion, die Rekombination zwischen zwei loxP sites,
ausführen. Aus der Literatur sind bereits ähnliche Fusionsmoleküle bekannt
(Danielian et al, 1998; Feil et al, 1996 und 1997; Indra et al, 1999; Littlewood et al,
1995; Vasioukhin et al, 1999). Bei der Zubereitung der Tamoxifen-Injektionslösung
konnte daher auf bereits publizierte Ansätze zurückgegriffen werden (Danielian et al,
1998; Indra et al,1999). Um die Effizienz des hier verwendeten CreERT2 Systems zu
testen und Cre-Aktivität in möglichst vielen Zellen zu erreichen, wurde doppelt
transgenen Rosa26CreERT2/R26R Tieren für 5 oder 10 aufeinander folgende Tage je
1 mg Tamoxifen (100 µl, in autoklaviertem Sonnenblumenöl) oder als Kontrolle das
gleiche Volumen autoklaviertes Sonnenblumenöl intraperitoneal injiziert und diese 5
oder 15 Tage nach der letzten Injektion analysiert (Abb. 3.3). Zur Vermeidung von
Kontaminationen wurde darauf geachtet, die Tiere während der Behandlungszeit in
getrennten Käfigen zu halten, da in der Literatur Kreuzkontaminationen durch coHabitation von aktivierten Tieren und Kontrolltieren beschrieben wurde (Brake et al,
2004). Für die Analyse wurden die Mäuse euthanasiert, die Organe in Isopentan
eingefroren und Kryostat-Gewebeschnitte angefertigt, die im Anschluss fixiert und
mit X-Gal gefärbt wurden (2.2.24). In den Zellen, in welchen Cre Rekombination
stattgefunden hat und die daher β-Galaktosidase exprimieren, ist eine Blaufärbung
aufgrund der Umsetzung des Substrats X-Gal zu erwarten.
Tamoxifen
Rosa26Cre
x
Rosa26Reporter
Doppelt transgene
Tamoxifen-induzierbare
Cre/Reporter Maus
+ Tam
5d
5d
10 d
Analyse
post-Injektion
5d
15 d
15 d
Abb. 3.3: Verpaarungs- und Tamoxifenregime-Schema für den auf X-Gal-Färbung basierenden
Funktionalitätstest der Rosa26CreERT2 Maus
Rosa26CreERT2 Mäuse wurden für einen Funktionalitätstest mit R26R Mäusen verpaart (links).
Doppelt transgenen Tieren (Mitte) wurde für 5 oder 10 Tage (d) 1 mg Tamoxifen (pro Tier und Tag)
intraperitoneal injiziert. Die Tiere wurden 5 oder 15 Tage nach der letzten Injektion analysiert.
77
Ergebnisse
____________________________________________________________________
Tamoxifen (1 mg/d)
Analyse post-Injektion
-
5d
5d
10 d
5d
5d
15 d
15 d
Haut
Zunge
Luftröhre
Herz
Leber
Niere
Blase
Magen
Dünndarm
Dickdarm
Muskel
Gehirn
Abb. 3.4: X-Gal-Färbung von Kryostatschnitten der mit Tamoxifen behandelten
Rosa26CreERT2/R26R Mäuse
Doppelt transgenen Tieren wurde an 5 oder 10 aufeinander folgenden Tagen je 1 mg Tamoxifen (in
100 µl autoklaviertem Sonnenblumenöl) intraperitoneal injiziert. Als Kontrolle wurde das gleiche
Volumen autoklaviertes Sonnenblumenöl gespritzt (linke Spalte). Dargestellt sind mit X-Gal gefärbte
Kryostatschnitte verschiedener Organe für die unterschiedlichen Behandlungsprotokolle.
78
Ergebnisse
____________________________________________________________________
In Abbildung 3.4 ist das Ergebnis der unterschiedlichen Tamoxifenbehandlungen
dargestellt. Bei den Kontrollmäusen, die nur mit autoklaviertem Sonnenblumenöl
behandelt wurden, sind keine blau gefärbten Zellen auf den Kryostatschnitten zu
sehen (Abb. 3.4 links). Bereits eine 5 Tage andauernde Behandlung mit Tamoxifen
mit anschließender Wartezeit von 5 Tagen führte in der Mehrzahl der Organe zu βGalaktosidase-Expression (Abb. 3.4 zweite Spalte). Die Anzahl an β-Galaktosidase
exprimierenden Zellen variierte dabei stark zwischen den einzelnen Geweben. Niere,
Blase, Magen und Muskel zeigten nur wenige blau gefärbte Zellen. In Zunge,
Luftröhre und Herz konnten deutlich mehr blaue Zellen detektiert werden. Die
Färbung führte in Haut, Leber, Dünn- und Dickdarm zu über 30 % β-Galaktosidase
exprimierender Zellen. Wurde die Analyse 15 Tage nach der letzten über 5 Tage
laufenden Tamoxifeninjektion durchgeführt, kam es in Luftröhre, Herz, Niere, Blase
und Magen zu einem deutlichem Anstieg an blauen Zellen (Abb. 3.4, dritte Spalte
von links). Im Muskel war die Expression es Reportergens auch nach 15 Tagen sehr
gering. In den nach 5 Tagen stark blau gefärbten Organen (Haut, Leber, Dünn- und
Dickdarm) konnte keine wesentliche Steigerung der β-Galaktosidaseexpression
erreicht werden. Die Gesamtdauer der Tamoxifenbehandlung (5 oder 10 Tage) hatte
ebenfalls nur wenig Einfluss auf den Anteil blauer Zellen auf dem Gewebeschnitt
(vergleiche Spalte drei und vier in Abb. 3.4). Mit Ausnahme von Leber und Blase,
wo es zu einer leichten Steigerung an blauen Zellen kam, veränderten sich die
Expressionslevels des Reportergens im Vergleich mit der fünftägigen Behandlung
nicht. Auffällig ist das Fehlen von blauen Zellen in allen Gehirnschnitten. Auch nach
mehrmaliger Wiederholung der Färbung mit geeigneten Positivkontrollen konnten
keine blauen Zellen auf diesen Schnitten detektiert werden. Zusammenfassend fällt
im Vergleich der verschiedenen Organe miteinander auf, dass in einigen Geweben
mehr blaue Zellen zu finden sind als in anderen. Des weiteren ist festzustellen, dass
unterschiedliche Behandlungsweisen zu unterschiedlich ausgeprägter Blaufärbung
führten.
Um zu überprüfen, ob das Fehlen von blauen Zellen im Gehirn auf ein niedriges
Expressionslevel der Cre Rekombinase zurückzuführen ist, wurden die Organe
deshalb mittels Western Blot analysiert.
79
Ergebnisse
____________________________________________________________________
3.1.3 Analyse der Expression von Cre Rekombinase in verschiedenen Organen
der Rosa26CreERT2 Maus zeigt keine detektierbare Expression im Gehirn
Aufgrund der fehlenden blauen Zellen auf den Kryostatschnitten vom Gehirn der
Rosa26CreERT2 Maus wurden Western Blots verschiedener Gewebe durchgeführt,
um so Cre Proteinexpression nachzuweisen. Dazu wurden die Organe transgener
Tiere in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und die Proteinextraktion wie unter
2.2.19.2
beschrieben
durchgeführt.
Durch
photometrische
Konzentrationsbestimmung der Proteinlösung (2.2.20) wurde das zu verwendende
Proteinvolumen ermittelt und je Probe 100 µg Protein auf einem 8 % SDSPolyacrylamidgel aufgetrennt (2.2.22.1). Der Western Blot wurde dann unter
Verwendung eines α-Cre Antikörpers (1:1000 in Erstantikörperverdünnungslösung)
wie dargestellt durchgeführt (2.2.22.2). Die Ergebnisse sind in Abbildung 3.5
zusammengefasst. Im Fall der Rosa26CreERT2 Maus sind für Haut, Zunge, Leber,
Herz, Blase, Muskel, Magen, Dünn- und Dickdarm deutliche Banden für das
modifizierte Cre Protein, das eine Größe von 74 kDa hat, erkennbar. In den Spuren
der Negativkontrolle (Proteinextrakte einer Wildtyp Maus, in der Abbildung die
jeweils linke Spur) sind keine Banden auf der mit Cre-Antikörper behandelten
Membran zu sehen. Im Gehirn konnte keine Cre Expression detektiert werden, was
die Ergebnisse aus den Gefrierschnitten dieses Organs wiederum bestätigte. Zur
Ladekontrolle wurde der gebundene Cre-Antikörper im Anschluss an die
Dokumentation der Cre Expression vom der Membran gewaschen und mit p38Antikörper (1:200 in Erstantikörperverdünnungslösung) re-inkubiert (2.2.23). Das
Ergebnis ist jeweils unter dem Cre Blot dargestellt und zeigt in jedem Gewebe eine
vergleichbare Konzentration von Kontroll- und Testprotein. Aufgrund dieses
Western Blot Ergebnisses ist festzustellen, dass das unter 3.1.2 beobachtete Fehlen
von X-Gal positiven Zellen im Gehirn durch fehlende Expression oder sehr geringe
(nicht im Western Blot detektierbare) Mengen an Cre Expression erklärt werden
kann.
80
Ergebnisse
____________________________________________________________________
Haut
Zunge
Gehirn
Leber
Herz
CreER (74 kDa)
p38
Blase
Muskel
Magen
Dünndarm
Dickdarm
CreER (74 kDa)
p38
Abb. 3.5: Expression von Cre Rekombinase in verschiedenen Geweben der Rosa26CreERT2
Maus
Gezeigt sind die Ergebnisse von Western Blots, wobei für jedes Organ Proteinextrakt einer Wildtyp
Maus (links) neben dem der Rosa26CreERT2 Maus (rechts) aufgetragen wurde. Der jeweils obere Blot
zeigt die Expressionslevels der Cre Rekombinase, darunter ist der gleiche Blot mit p38Antikörperbehandlung zu sehen.
3.1.4 FACS (Fluorescent Activated Cell Sorting)-Analyse hämatopoietischer
Organe von Rosa26CreERT2/RAGE Mäusen zeigt unterschiedlich starke
Aktivierung der Cre Rekombinase in verschiedenen Blutzellpopulationen
Zur weiteren Charakterisierung der Rosa26CreERT2 Maus sollten hämatopoietische
Organe auf Cre-Aktivität analysiert werden. Dazu wurden die Tiere mit einer
weiteren Reportermaus, der RAGE Maus (Constien et al, 2001), verpaart. Diese
exprimiert das grüne Fluoreszenzprotein (EGFP) nach Cre-vermittelter Exzision
einer Neomycin/Stop-Kassette. Mit Hilfe des FACS kann EGFP Expression leicht in
Einzelzellsuspensionen detektiert werden. Des weiteren ist die FACS-Analyse sehr
sensitiv, so dass wenige grüne Zellen in einem Zellgemisch detektiert werden
können.
Um die Translokation der Cre Rekombinase in den Zellkern zu induzieren, wurde
doppelt transgenen Rosa26CreERT2/RAGE Mäuse an 5 aufeinander folgenden Tagen
je 1 mg Tamoxifen (in 100 µl autoklaviertem Sonnenblumenöl) intraperitoneal
injiziert. Als Kontrolle wurden doppelt transgene Tiere mit je 100 µl autoklaviertem
Sonnenblumenöl behandelt. Fünfzehn Tage nach der letzten Injektion wurden die
Tiere
euthanasiert,
die
hämatopoietischen
Organe
(Milz,
Knochenmark,
Lymphknoten und Thymus) entnommen und Einzelzellsuspensionen hergestellt,
welche mit den gegen die verschiedenen Blutzellpopulationen gerichteten
81
Ergebnisse
____________________________________________________________________
Antikörpern inkubiert wurden (2.2.28). Die Messung der Proben erfolgte in einem
FACS Calibur. Ausgewertet wurden die erhaltenen Ergebnisse mit der Software
Cellquest Pro.
A
Knochenmark
Milz
32,16
10 2
GFP
10 3
10 0
10 4
10 1
0,08 %
10 3
10 4
10 1
10 2
GFP
10 3
10 1
10 2
GFP
10 4
10 3
10 4
10 0
10 1
10 2
GFP
10 3
10 4
10 0
10 1
10 2
GFP
10 3
10 4
0
0,01 %
%
0,04%
-PE
-PE
10 0
10 0
0,06%
-PE
+ Öl
10 2
GFP
-PE
-PE
-PE
10 1
22,4 %
-PE
10 0
Thymus
21,24%
7,99%
-PE
+ Tam
Lymphknoten
10 0
10 1
10 2
GFP
10 3
10 4
10 0
10 1
10 2
GFP
10 3
10 4
B
+ Tamoxifen
lineage Zellen
+ Öl
Stammzellen
+ Tamoxifen
Stammzellen
4,85 %
10 1
10 2
GFP
10 3
CD117-APC
CD117-APC
lin-PE
1,3 %
R2
10 0
0,02 %
10 4
10 0
10 1
10 2
GFP
10 3
10 4
10 0
10 1
10 2
GFP
10 3
10 4
Abb. 3.6: FACS-Plots verschiedener hämatopoietischer Organe der Rosa26CreERT2/RAGE
Maus mit und ohne Tamoxifen-Induktion.
(A) Dotplots von ungefärbten Zellen aus Knochenmark, Milz, Lymphknoten und Thymus. Grünes
Fluorezenzprotein (EGFP) ist jeweils gegen Zellgranularität aufgetragen. Die obere Reihe zeigt Plots
einer mit Tamoxifen-induzierten Maus, darunter sind die entsprechenden Plots einer mit Öl
behandelten Maus zu sehen. Die Prozentwerte (oben rechts im jeweiligen Plot) geben den Anteil an
grünen Zellen in der jeweiligen Probe wieder.
(B) Die Plots zeigen Einstellungen für die Definition von Stammzellen aus dem Knochenmark. Im
linken Plot wurden Knochenmarkzellen mit den PE-gekoppelten Antikörpern gegen die verschiedenen
Blutzellen (so genannte lineage Zellen) gefärbt (lin-PE). Der Anteil an PE-negativen, im unteren
rechten Quadranten (R2) liegenden Zellen (1,3 %) wurden in einem weiteren Dotplot gegen CD117APC aufgetragen. Der mittlere Plot stellt die Färbung einer Tamoxifen-induzierten Maus dar, der
rechte die einer mit Öl behandelten Maus. Die Prozentwerte im mittleren und rechten Plot geben den
Anteil an grünen Stammzellen an.
82
Ergebnisse
____________________________________________________________________
Die Dotplots der verschiedenen ungefärbten hämatopoietischen Organe sind in
Abbildung 3.6A dargestellt. Untereinander sind nach gleicher Behandlungsweise die
Plots für eine mit Tamoxifen (induziert) und eine mit Öl behandelte Maus
(Kontrolle) zu sehen. Die Prozentwerte geben den Anteil an allen in der Population
vorhandenen grünen Zellen an. Im Knochenmark der Tamoxifen-induzierten Maus
wurden 32,16 % grüne Zellen gemessen, in der Milz 7,99 %, im Lymphknoten 21,24
% und im Thymus 22,4 %. Für die mit Öl injizierte Maus wurden im Knochenmark
0,08 %, in der Milz 0,06 %, im Lymphknoten 0,04 % und im Thymus 0,01 % EGFPpositive Zellen detektiert.
In Abbildung 3.6B ist für eine Tamoxifen-induzierte Maus demonstriert, wie die
Population der Stammzellen im Knochenmark definiert wurde. Zunächst wurden die
Zellen mit allen gegen die verschiedenen reifen Blutlinien (so genannte lineage
Zellen) gerichteten PE-gekoppelten Antikörpern gefärbt und in einem Dotplot PE
(Ordinate) gegen EGFP (Abszisse) aufgetragen (linker Plot in Abb. 3.6B). Zusätzlich
waren die Zellen mit α-CD117-APC gefärbt, der als potenzieller Stammzellmarker
beschrieben ist (Crosby et al, 2001; Dirnhofer et al, 2006). Die PE-negativen, und
damit nicht lineage Zellen (R2; 1,3 %) wurden dann in einem weiteren FACS-Plot
APC gegen GFP gemessen (mittlerer Dotplot). Die APC-positiven, PE-negativen
Zellen wurden als Stammzellen definiert. Bei der verwendeten mit Tamoxifen
injizierten Maus waren 4,85 % der Stammzellen positiv für EGFP, in der ÖlKontrollmaus wurden 0,02 % grüne Stammzellen gemessen.
Abbildung 3.7 zeigt die Dotplots der verschiedenen Blutzellsubpopulationen unter
Angabe des prozentualen Anteils grüner Zellen in der jeweiligen Population.
Zusammenfassend sind in Abbildung 3.8 die im Durchschnitt erhaltenen
prozentualen Anteile EGFP-positiver Zellen für die einzelnen Blutzellpopulationen
der Tamoxifen- und Öl-induzierten Rosa26CreERT2/RAGE Mäuse in Form eines
Balkendiagramms dargestellt. Hier ist die unterschiedliche Skalierung der
Diagramme zu beachten, die im Fall der Tamoxifen-induzierten Tiere von 0 bis 40 %
und bei den Kontrolltieren von 0 bis 0,2 % reicht. Nach Tamoxifen-Behandlung
exprimieren durchschnittlich 32,16 % der Knochenmarkzellen EGFP. Ohne
Induktion wurden im Knochenmark 0,08 % grüne Zellen gemessen (Abb. 3.6). Die
einzelnen
Populationen
hämatopoietischer
Zellen
variieren
stark
in
den
Expressionslevels. In der T-Zell Population wurden nach Tamoxifen-Injektion 5,88
% EGFP exprimierende Zellen detektiert (ohne Tamoxifen 0,15 %). Makrophagen
83
Ergebnisse
____________________________________________________________________
zeigten mit Tamoxifen einen Anteil grüner Zellen von 35,9 % (ohne Tamoxifen 0,02
%), B-Zellen von 1,95 % (0,09 %), Mastzellen von 0,16 % (0,01 %), Endothelzellen
von 5,07 % (0,03 %), Platelets/Megakaryozyten von 1,62 % (0,01 %), Granulozyten
von 34,5% (0,02 %), Erythrozyten von 1,15 % (0,06 %) und Stammzellen bildeten
4,85 % (0,02 %) EGFP exprimierende Zellen.
Die
Färbungen
wurden
dreimal
an
unterschiedlichen
Versuchstagen
mit
unterschiedlichen Mäusen durchgeführt und zeigten reproduzierbare Werte.
Anhand der so erhaltenen Ergebnisse ist festzuhalten, dass es in den verschiedenen
Blutzellpopulationen zu unterschiedlich starker Cre Rekombinase-vermittelter
Induktion des EGFP-Reportergens kam. Darüber hinaus kam es in den untersuchten
Zellen zu einer Aktivierung des Reportergens in Abwesenheit von Tamoxifen, was in
der Literatur bereits für ein anderes Cre/ER-Fusionsmolekül beschrieben ist
(Schwenk et al, 1998). Dieses Ergebnis ist wichtig, da es zeigt, dass das Cre/ERSystem eine gewisse „unerwünschte“ Hintergrundaktivität hat, welche es deshalb für
manche Versuche (z.B. für Krebsmodelle) disqualifiziert.
84
Ergebnisse
____________________________________________________________________
+ Öl
+ Tam
0,15%
CD3-PE
CD3-PE
T -Zellen
5,88%
10 0
10 1
10 2
GFP
10 3
10 4
10 0
10 1
10 2
GFP
0,02%
CD11b-PE
10 0
10 1
10 2
GFP
10 3
10 4
10 0
10 1
10 2
GFP
0,09%
10 0
10 1
10 2
GFP
10 3
10 4
10 0
10 1
10 2
GFP
10 0
10 3
0,03%
10 1
10 2
GFP
10 3
10 0
10 4
10 4
10 1
10 0
10 1
10 4
10 2
GFP
10 3
10 4
CD41-PE
10 1
10 2
GFP
10 3
10 4
10 0
10 1
10 2
GFP
10 3
10 4
34,5%
Gr1-PE
Gr1-PE
10 0
10 1
10 2
GFP
10 3
10 4
10 0
10 1
10 2
GFP
10 4
10 3
1,15%
Ter119-PE
Ter119-PE
0,06%
100
10 2
GFP
10 3
10 4
0,02 %
101
102
GFP
10 3
10 4
10 0
10 1
100
10 2
GFP
10 3
10 4
4,85 %
CD117-APC
10 1
CD117-APC
10 0
Stammzellen
10 3
1,62%
0,02%
Erythrozyten
10 2
GFP
5,07%
CD31-PE
10 2
GFP
CD41-PE
10 0
Granulozyten
10 4
0,16%
0,01%
Platelets/
Megakaryozyten
10 3
CD23-PE
CD23-PE
10 1
CD31-PE
10 0
Endothelzellen
10 4
1.95%
0,01%
Mastzellen
10 3
CD19-PE
CD19-PE
B-Zellen
10 4
35,9%
CD11b-PE
Makrophagen
10 3
101
102
GFP
103
104
Abb. 3.7: FACS-Plots der Blutzellpopulationen von Rosa26CreERT2/RAGE Mäusen nach Öloder Tamoxifenbehandlung. Untereinander sind die Plots für die Blutzellen dargestellt. Links die
einer mit Öl behandelten (+ Öl), rechts die der Tamoxifen-induzierten Maus (+ Tam). Prozentwerte
(jeweils im oberen rechten Quadrant) geben den Anteil grüner Zellen in der Population an.
85
Ergebnisse
____________________________________________________________________
0,2
% GFP+ Zellen
0,16
0,12
0,08
0,04
0
ge
sa
m
T
M
t
Z
ak
e
ro l le
ph n
a
B- gen
M Zel
En as t l en
d o ze
th lle n
el
ze
l le
P
G
l
n
a
ra
n u tel e
Er loz ts
y t yte
h
St ro z n
a m yt
m en
ze
lle
n
KM
T2
Rosa26CreER /RAGE Öl
KM
40
35
30
25
20
15
10
5
0
ge
s
M T- am
ak Ze t
ro l le
ph n
a
B- gen
Z
M e
En as ll en
d o tze
th lle
el n
ze
l le
P
G
l
ra ate n
n u le
Er loz ts
y t yt
h e
St ro z n
a m yt
m en
ze
lle
n
% GFP+ Zellen
Rosa26CreERT2/RAGE Tam
Abb. 3.8: Expressionslevels von GFP (grünes Fluoreszenzprotein) in verschiedenen
Blutzellpopulationen von Rosa26CreERT2/RAGE Mäusen
Dargestellung des durchschnittlichen prozentualen Anteils grüner Zellen an der jeweils gemessenen
Zellpopulation in Form eines Balkendiagramms. Das linke Diagramm zeigt die Werte nach
Tamoxifen-Behandlung (Tam). Im rechten Graph sind die Werte der Kontrollmäuse (Öl) zu sehen. Zu
beachten ist die unterschiedliche Skalierung der Diagramme.
3.1.5 Bereits im Embryo kann Cre Rekombinase durch Injektion von
Tamoxifen ins Muttertier aktiviert werden
Neben der induzierbaren Expression oder Deletion von Genen im adulten Tier ist die
Analyse früh exprimierter Gene von besonderem Interesse. Es galt daher zu
untersuchen, ob die Cre Rekombinase bereits im Embryo eingeschaltet werden kann
und RosaCreERT2 Mäuse sich somit auch für die Analyse von Genen eignen, die
auch oder ausschließlich in der frühen Ontogenese eine Rolle spielen. Um dies zu
testen, wurden RosaCreERT2 Mäuse mit den bereits in 3.1.2 und 3.1.4 beschriebenen
Reporterlinien verpaart. Die Weibchen wurden am Tag nach der Verpaarung auf
einen Vaginalpropf untersucht, so dass die Dauer der Schwangerschaft genau
bestimmt werden konnte. An Tag E7,5 und E10,5 der Tragezeit wurde den
Muttertieren 1 mg Tamoxifen (in 100 µl autoklaviertem Sonnenblumenöl)
intraperitoneal injiziert (Hayashi und McMahon, 2002) und zwei Tage darauf die
Embryonen (E9,5 und E12,5) präpariert (2.2.27). Die potenziell doppelt transgenen
RosaCreERT2/R26R Embryonen wurden wie beschrieben fixiert und mit X-Gal
gefärbt (2.2.27). Nachkommen aus RosaCreERT2/RAGE Verpaarungen wurden mit
Hilfe von FACS analysiert (2.2.28) und per PCR genotypisiert. Um für den
beobachteten Hintergrund an EGFP-positiven Zellen in Abwesenheit von Tamoxifen
86
Ergebnisse
____________________________________________________________________
einen Vergleichswert in den Embryonen zu bekommen, wurde einigen Tieren nach
diesen Verpaarungen zur Kontrolle anstelle von Tamoxifen 100 µl autoklaviertes
Sonnenblumenöl injiziert.
B
Dottesack
Embryo
A
1mm
1mm
RAGE + Öl
FL3-H
FL3-H
FL3-H
R2
100
101
102
EGFP
RosaCreERT2/RAGE
+ Tam
RosaCreERT2/RAGE
+ Öl
103
104
100
101
102
EGFP
103
R2
104
0,07 %
100
101
102
EGFP
103
104
R1
0
200
400
600
Side Scatter
800
1000
24,5 %
% GFP+ Zellen
0%
R2
Forward Scatter
Abb. 3.9: X-Gal-Färbung von Rosa26CreERT2/R26R Embryonen
(A) Der E9,5 Tage alte Embryo wurde zum Teil vom Dottersack, der im unteren Bereich der
Abbildung zu erkennen ist, frei präpariert.
(B) An Tag E12,5 hat der Embryo stark an Größe zugenommen. Zum Vergleich sind Linien, die 1
mm der Normalgröße entsprechen, angegeben.
Abb. 3.10: FACS-Analyse 12 Tage alter Rosa26CreERT2/RAGE Embryonen
Im oberen Bereich der Abbildung sind drei FACS-Dotplots von Zellen gezeigt, die aus E12,5
Embryonen präpariert wurden, welche 2 Tage zuvor mit Tamoxifen oder Öl behandelt worden waren.
Es ist jeweils EGFP (Abszisse) gegen Zellgranularität (Ordinate) aufgetragen. Die im Bereich von R2
liegenden Zellen wurden als EGFP-positiv betrachtet. Unter den Dotplots ist in einem
Balkendiagramm der zugehörige durchschnittliche Anteil an grünen Zellen dargestellt. Der im rechten
Teil der Abbildung zu sehende Plot zeigt die Zellen im Forward/Side Scatter. Nur Zellen, welche im
Bereich R1 liegen (in blau dargestellt), wurden in den EGFP/Zellgranulärität Dotplot übertragen.
Die Abbildungen 3.9 und 3.10 zeigen die Ergebnisse dieser Embryo-Analyse.
Rosa26CreERT2/R26R Embryonen zeigen nach X-Gal-Färbung eine starke
Blaufärbung
im
gesamten
Körper.
Aufgrund
von
Behandlung
mit
Benzylalkohol/Benzylbenzoat im Anschluss an die Färbung können zum Teil auch
innere Strukturen erkannt werden. Der E12,5 Embryo wurde komplett vom
87
Ergebnisse
____________________________________________________________________
Dottersack frei präpariert. Aufgrund der geringen Größe und um den Embryo in
seiner Struktur nicht zu schädigen, wurde bei 9,5 Tage alten Embryonen der
Dottersack nur zum Teil entfernt.
Die
FACS-Analyse
der
Einzelzellsuspensionen
aus
Rosa26CreERT2/RAGE
Embryonen ergab im Durchschnitt 24,5 % EGFP-positive Zellen für Tamoxifeninduzierte und 0,07 % grüne Zellen für Öl behandelte Embryonen. In Abbildung
3.10 ist zusätzlich ein Dotplot eines RAGE-Embryos als Kontrolle aufgeführt (links),
um so eine Hintergrundaktivität der RAGE Maus ausschließen zu können. Unterhalb
der FACS-Plots sind in einem Balkendiagramm die durchschnittlichen Anteile
grüner Zellen der Öl- und Tamoxifen-behandelten Embryonen dargestellt. Der rechte
FACS-Plot zeigt beispielhaft die Zellen im Forward/Side Scatter, in dem nur die in
R1 liegenden Zellen (in blau dargestellt) zur Analyse ausgewählt wurden.
Diese Ergebnisse zeigen, dass ein hoher prozentualer Anteil der embryonalen Zellen
schon nach einmaliger Injektion von Tamoxifen zur Expression der Reportergene
EGFP und β-Galaktosidase induziert wird. Ferner wurde durch FACS-Analyse der
E12,5
Rosa26CreERT2/RAGE
Embryonen
eine
geringe
Aktivierung
des
Reportergens auch in Absenz von Tamoxifen beobachtet.
3.2 Knock down von Dsg 2 mit Hilfe des Expressionsvektors pTEREGFP
Durch Verwendung des Expressionsvektors pTEREGFP (Tet-inducible RNAi) kann
eine spezifische Inhibition der Genexpression erreicht werden. Dieser Vektor wurde
freundlicherweise von Marc van de Wetering (Hubrecht Laboratory, Centre for
Biomedical Genetics, Utrecht, NL) zu Verfügung gestellt (van de Wetering et al,
2003) und bedient sich des Tet-Systems zur konditionalen Regulierung der
Expression von shRNA (Gossen und Bujard, 1992). Der Vektor besitzt zur
Expression der shRNA (small hairpin RNA) einen Doxycyclin (Dox)-abhängigen
RNA Polymerase III H1 Promoter. Dieser beinhaltet eine Bindestelle (TetO,Tet
Operatorsequenz) für den Tet-Repressor (TetR), welcher die Expression der shRNA
blockiert. In Gegenwart von Dox verändert das Repressormolekül seine
dreidimensionale Struktur, wonach ein Anbinden an TetO nicht mehr möglich ist und
es zur Expression der shRNA kommt. Um dieses über Dox induzierbare System zu
nutzen, ist neben dem shRNA Expressionsvektor ein TetR Molekül notwendig. Da in
88
Ergebnisse
____________________________________________________________________
der hier vorliegenden Arbeit der Vektor pTEREGFP ausschließlich dazu genutzt
wurde, verschiedene siRNA Zielsequenzen in Zellkulturexperimenten auf deren
Funktionalität zu testen, wurde auf die Verwendung des Repressormoleküls und
damit auf die Induzierbarkeit des Systems verzichtet.
3.2.1 Klonierung von verschiedenen siRNA Sequenzen gegen Dsg 2 in den
Expressionsvektor pTEREGFP
Um den optimalen knock down von Dsg 2 erreichen zu können, wurden drei
verschiedene siRNA Zielsequenzen anhand der mRNA Sequenz ausgewählt (2.2.10).
Die zur Insertion in den Expressionsvektor synthetisch hergestellten shRNA (short
hairpin RNA) Oligonukleotide beinhalten neben der siRNA Sequenz (19 bp) eine 9
bp lange Sequenz für den so genannten hairpin oder loop im shRNA Molekül (Abb.
3.11). Die Sequenz dieses hairpins, die für die Insertion in den Vektor notwendigen
Nukleotide sowie die aus Verwendung des H1 Promoters resultierende
Terminatorsequenz waren bereits vorgegeben (van de Wetering et al, 2003).
Bgl II
Hind III
gatcccGCAGCTTTCCACAAGTCCAttcaagagaTGGACTTGTGGAAAGCTGCtttttggaaa
ggCGTCGAAAGGTGTTCAGGTaagttctctACCTGAACACCTTTCGACGaaaaaccttttcga
Dsg 2 shRNA Oligonukleotid
H1 Promoter
Dsg2 shRNA
Amp R
pUC ori
CMV-IE
EGFP
pTEREGFP shRNA 2
5742 bp
BGH pA
f1 ori
SV40 pA
Zeocin R
Transkription
GCAGCUUUCCACAAGUCCA
uuCGUCGAAAGGUGUUCAGGU
u
a
uc
g a
a
a
g
SV40 Promoter + ori
EM-7 Promoter
Abb. 3.11: ShRNA Expressionsplasmid pTEREGFP
Im linken Teil der Abbildung ist der shRNA Expressionsplasmid schematisch dargestellt. In der
Sequenz des Dsg 2 shRNA Oligonukleotids (oben) stehen Großbuchstaben für die siRNA Sequenz,
kleine Buchstaben für die vorgegebenen Sequenzbereiche und unterstrichene Schriftzeichen für die
Sequenz des hairpins. Rechts ist die shRNA als stem-loop-Struktur nach der Transkription abgebildet.
AmpR Ampicillinresistenzgen, H1 Promoter Histon 1 Promoter, CMV-IE Cytomegalusvirus Promoter
Immediate Early, BGH bovine growth hormone, f1 ori F1 Einzelstrang-DNA Origin, SV40 Simian
Virus 40, EM-7 Promoter synthetischer prokaryotischer Promoter, Zeocin R Zeocinresistenzgen, pUC
ori plasmid replication orgin, ori origin of replication, pA Polyadenylierungssignal
89
Ergebnisse
____________________________________________________________________
Durch Annealing der shRNA Oligonukleotide (2.2.11) wurden doppelsträngige
Moleküle erhalten, die dann mit dem Bgl II/Hind III-verdauten Plasmid ligiert
wurden (2.2.9.2 und 2.2.12). Vom Ligationsansatz wurde 1 µl zur Transformation
elektrokompetenter
Bakterienzellen
verwendet
(2.2.14.1).
Ein
Teil
jeder
gewachsenen Bakterienkolonie wurde am nächsten Tag in 5 µl Aqua destillata gelöst
und 1 µl davon als template für die PCR zur Überprüfung auf positive Klone
verwendet (2.2.5). Dabei wurden die PCR Primer so gewählt, dass für den leeren
Vektor ein PCR-Produkt von 489 bp und im Fall der Integration des Inserts eines von
549 bp entsteht. Die PCR-Produkte wurden auf einem 2 % Agarosegel aufgetrennt
und mittels UV-Transluminator dokumentiert.
pTEREGFP + shRNA 1(Exon 4)
M K
1 2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16
549 bp
489 bp
pTEREGFP + shRNA 2 (Exon 9/1)
M K
1 2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
549 bp
489 bp
pTEREGFP + shRNA 3 (Exon 9/2)
M K
1*
2
3* 4
5
6* 7
8* 9
10 11 12* 13 14 15 16
549 bp
489 bp
Abb. 3.12: PCR zur Suche nach positiven Klonen nach Ligation von shRNA Sequenzen in
pTEREGFP
Untereinander sind Gelbilder für PCR-Produkte von Bakterienkolonien dargestellt, welche nach
Ligation der drei shRNA Sequenzen mit dem Expressionsvektor und anschließender Elektroporation
erhalten wurden. Positive Klone, welche das shRNA Oligonukleotid enthalten, sind mit *
gekennzeichnet.
M Marker (1 kb ladder), K Negativkontrolle
Die Bilder der Agarosegele sind in Abbildung 3.12 dargestellt und zeigen die
Ergebnisse der Klon-Screening-PCR. Als Kontrolle wurde jeweils eine PCRReaktion mit DNA des leeren Vektors durchgeführt, welche ein PCR-Produkt von
489 bp liefert (K). Hat ein shRNA Insert in den Expressionsvektor integriert, entsteht
ein 549 bp langes Fragment. Für die drei shRNAs, die eine Sequenz in Exon 4 und 9
90
Ergebnisse
____________________________________________________________________
der Dsg 2 mRNA als Zielsequenz beinhalten, standen nach der Ligation zwei, fünf
und fünf positive Klone zu Verfügung, was anhand des 60 bp-shifts zu erkennen ist.
Für die weiteren Versuche wurde jeweils ein positiver Klon zum Animpfen einer 400
ml Bakterienkultur verwendet und aus dieser DNA präpariert (2.2.1.2).
3.2.2 Herstellung der Dsg 2- und GAPDH-spezifischen Sonden
Da die Effektivität der shRNA Expressionsvektoren auf RNA-Ebene mit Hilfe von
Northern Blots getestet werden sollte, mussten zunächst geeignete Sonden hergestellt
werden. Dazu wurden die Expressionsvektoren für Dsg 2 und GAPDH
(Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase) mit Not I/Bgl II bzw. Xho I über Nacht
verdaut und die DNA-Fragmente auf einem 0,7 % Agarosegel aufgetrennt. Die
gewünschten Banden wurden aus dem Gel geschnitten und die DNA mittels
Gelextraktion daraus gewonnen (2.2.7). Das Ergebnis der Restriktionsverdaus ist in
Abbildung 3.13 zu sehen. Aufgrund der gewählten Enzyme entstanden für den Dsg 2
Expressionsvektor drei DNA-Fragmente, wobei die 2500 bp Bande aus dem Gel
extrahiert und später als Sonde für den Northern Blot verwendet wurde. Aus dem
Restriktionsverdau des GAPDH Vektors mit Xho I resultierten zwei DNAFragmente, von denen das 1100 bp große Fragment extrahiert wurde. Nach
Konzentrationsbestimmung der Sonden-DNA (2.2.4) wurde diese bis zur
Verwendung bei -20°C gelagert.
M
Dsg 2
GAPDH
2500 bp
1100 bp
Abb. 3.13: Restriktionsverdau des Dsg 2- und GAPDH- Expressionsvektors zur Herstellung von
Sonden für den Northern Blot
Die Plasmide wurden mit Not I/Bgl II (Dsg 2) bzw. Xho I (GAPDH) verdaut und die Fragmente auf
einem Agarosegel aufgetrennt.
M Marker (1 kb ladder)
91
Ergebnisse
____________________________________________________________________
3.2.3 Knock down von Dsg 2 in den Desmosomen-bildenden EpH4 Zellen durch
transiente Transfektion mit den shRNA Expressionsplasmiden
Die knock down Effizienz der verschiedenen pTEREGFP-shRNA Konstrukte sollte
zunächst auf RNA-Ebene getestet werden. Dazu wurden Dsg 2-exprimierende,
Desmosomen-bildende murine Epithelzellen (EpH4; Lopez-Barahona et al, 1995;
Leder et al, 2002) mit den drei anti-Dsg 2 pTEREGFP Plasmiden transient transfiziert.
Da der shRNA Expressionsvektor als Reportergen EGFP trägt, werden transfizierte
Zellen neben der shRNA auch EGFP exprimieren. Durch Anregung von Licht der
geeigneten Wellenlänge, in diesem Fall Licht einer Wellenlänge von 550 nm,
leuchten die Zellen, welche den Vektor aufgenommen haben, grün. Diese
Eigenschaft wurde genutzt, um die Zellen mit Hilfe eines FACS (Fluorescent
Activated Cell Sorting) Gerätes (Modell FACS Vantage) präparativ zu sortieren. Zu
diesem Zweck wurden die Zellen 48 Stunden nach der Transfektion trypsinisiert,
gewaschen und in PBS aufgenommen. Die EGFP-exprimierenden Zellen wurden
dann mittels FACS Vantage in ein gekühltes FACS-Röhrchen sortiert. Nach
Bestimmung der Zellzahl wurden die Zellen zentrifugiert (1200 rpm, 10 min bei
4°C), in TRIzol aufgenommen und über Nacht bei -70°C gelagert. Die RNAPräparation erfolgte dann weiter wie beschrieben (2.2.16). Je 50 µg der RNA wurde
auf einem RNA-Gel bei maximal 50 Volt für etwa 8 Stunden aufgetrennt. Der
Northern Blot wurde anschließend wie beschrieben aufgebaut und durchgeführt
(2.2.18). Verschiedene DNA-Konzentrationen der Dsg 2 Sonde (10, 20 und 30 ng)
wurden mittels α-32P-dCTP radioaktiv markiert (2.2.15) und die Probe mit der
höchsten spezifischen Aktivität für die Hybridisierung über Nacht bei 65°C
verwendet. Nachdem die Membran mit verschiedenen Puffern gewaschen war,
erfolgte die Inkubation auf dem Phosporimager (Typ STORM 840). Um auf gleiche
RNA-Mengen in den verschiedenen Proben zu testen, wurde die gebundene Sonde
von der Membran gewaschen und mit einer weiteren Sonde inkubiert, welche gegen
das endogene Gen GAPDH gerichtet ist. Die Auswertung erfolgte mit Hilfe der
Software Image Quant. Das dargestellte Ergebnis (Abb. 3.14) gibt die relative Dsg 2Intensität an. Die relative Dsg 2 mRNA Expression wurde dazu mit Hilfe der
GAPDH Expression normalisiert. Die knock down-Effizienz wurde auf die in
pTEREGFPleer transfizierten Zellen gemessene RNA-Expression bezogen. Im
92
Ergebnisse
____________________________________________________________________
Vergleich zu diesen Zellen betrug die Dsg 2 Expression bei pTEREGFPshRNA1 76 %,
bei pTEREGFPshRNA2 59,9 % und bei pTEREGFPshRNA3 66 %.
pTEREGFP shRNA 3
pTEREGFP shRNA 2
pTEREGFP shRNA 1
66 %
59,9%
76 %
100 %
pTEREGFP leer
0
50
100
Relative Dsg 2 – Intensität [%]
Abb. 3.14: Relative Dsg 2 RNA-Intensität der EpH4 Zellen nach Transfektion mit den shRNA
Expressionsplasmiden
RNA der EGFP-exprimierenden EpH4 Zellen wurde mittels Northern Blot auf Dsg 2 mRNA
Expressionslevels untersucht. Die Normalisierung erfolgte über die RNA-Intensität von GAPDH.
Die reduzierten Dsg 2 RNA-Mengen in den EGFP-positiven Zellen zeigen, dass die
shRNA exprimiert wurde und zur Degradierung der endogenen Dsg 2 mRNA führte.
Um zu prüfen, ob dies zum Rückgang von Dsg 2 Protein führt, wurde die
Wirksamkeit der shRNA Expressionsvektoren zusätzlich auf Proteinebene
untersucht. Dazu wurde genauso verfahren wie bereits erwähnt. EpH4 Zellen wurden
zunächst mit einem der shRNA Vektoren transfiziert und die EGFP-positiven von
den EGFP-negativen Zellen mittels FACS Vantage getrennt. Die Zellen wurden in
Laemmlipuffer aufgenommen (100 µl/106 Zellen) und jeweils 20 µl des
Proteinextrakts auf einem 6 % SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt. Der Western Blot
wurde wie beschrieben unter Verwendung des Dsg 1/2-Antikörpers (DG 3.10, 1:50
in Erstantikörperverdünnungslösung) durchgeführt (2.2.22).
93
amt
ges
A2
shRN
EGF
PA2
shRN
shRN
WT
A2
EGF
P+
Ergebnisse
____________________________________________________________________
Dsg 2
p38
Abb. 3.15: Western Blot der FACS-sortierten EpH4 Zellen
Die Intensität der Dsg 2 Proteinexpression ist in EGFP-positiven und EGFP-negativen Zellen nicht zu
unterscheiden. Als Kontrolle wurden untransfizierte Zellen (WT) sowie die nicht FACS-sortierte
Zellpopulation (shRNA 2 gesamt) aufgetragen. Der obere Kasten gibt die Expressionslevels für Dsg 2,
der untere für p38 wieder.
Da kein Unterschied in der Intensität an Dsg 2 Protein in EGFP-exprimierenden und
EGFP-negativen Zellen festzustellen war (Abb. 3.15), wurde die Western Blot
Membran mit einem Antikörper inkubiert, der gegen ein konstitutiv exprimiertes
endogenes Protein gerichtet ist (p38 Kinase). So konnte kontrolliert werden, ob
gleiche Proteinmengen geladen wurden. Die Intensität der Banden für p38 ist in allen
Proben
gleich.
Dieses
Ergebnis
beweist
einerseits
eine
etwa
identische
Proteinkonzentration für alle vier geladenen Proben. Des Weiteren bedeutet es, dass
die Dsg 2 Proteinmenge durch die Expression der shRNA nicht verändert wurde.
Eine Ursache dafür könnte eine lange Halbwertzeit (Stabilität) des endogenen Dsg 2
Proteins sein. Da die EpH4 Zellen nur transient transfiziert und bereits nach 48
Stunden analysiert wurden, ist es denkbar, dass bei einer langen Halbwertzeit des
Dsg 2 Proteins keine Unterschiede in der Dsg 2 Proteinmenge zu detektieren sind.
Eine Möglichkeit, um dennoch die knock down Effizienz der drei shRNAs auf
Proteinebene testen zu können, bestand in transienter co-Transfektion von Dsg 2
Expressionsvektor und shRNA Vektor in Zellen, welche per se kein Dsg 2
exprimieren. Diese Methode ist schnell und einfach durchzuführen und hat den
Vorteil, das shRNA und Ziel-mRNA zur gleichen Zeit in die Zelle kommen.
94
Ergebnisse
____________________________________________________________________
3.2.4 Verschiedene siRNA Zielsequenzen zeigen unterschiedliche knock down
Effizienz in transienten co-Transfektionen
Um die knock down Effizienz der drei verschiedenen siRNAs zu testen, wurden HEK
293-Zellen
transient
mit
den
pTEREGFP-shRNA
Konstrukten
transfiziert,
Proteinextrakt aus den Zellen gewonnen und die Expressionslevels von Dsg 2 mittels
Western Blot kontrolliert. Dabei wurden für die co-Transfektion identische Mengen
an Dsg 2-Expressionsvektor (1 µg DNA je 6 x 105 Zellen) und abnehmende
Konzentrationen an siRNA Vektor (1, 0,75 und 0,5 µg DNA je 6 x 105 Zellen)
verwendet. Die Zellen wurden wie beschrieben behandelt (2.2.25.4) und 48 Stunden
nach der Transfektion Proteinextrakte daraus erzeugt, wobei jeweils 106 Zellen in
100 µl Laemmlipuffer aufgenommen wurden (2.2.19.1). Um gleiche Proteinmengen
zu laden, wurden jeweils 20 µl des so gewonnenen Proteingemischs auf analytischen
6 % SDS-Polyacrylamidgelen aufgetrennt. Da in dem verwendeten Dsg 2
Expressionsvektor an die Dsg 2 Sequenz ein HA (Hämaglutinin) tag gekoppelt ist,
wurde der Western Blot unter Verwendung des α-HA tag Antikörpers (1:1000 in
shRNA 1
+K -K
shRNA 2
shRNA-SCL
Erstantikörperverdünnungslösung) durchgeführt (2.2.22).
shRNA 3
Dsg 2
pDsg 2
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
pshRNA
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Zielsequenz
Exon 4
Exon 9/1
Exon 9/2
Abb. 3.16: Western Blot von Proteinextrakten der mit pTEREGFP-shRNA Konstrukten
transfizierten HEK 293-Zellen
Bei identischen Mengen Dsg 2 Expressionsvektor wurde mit abnehmende Mengen der jeweiligen
shRNA Vektoren transfiziert. Als Kontrolle wurden Zellen mit einer unspezifischen shRNA (shRNASCL) transfiziert.
+K Positivkontrolle, - K Negativkontrolle
95
Ergebnisse
____________________________________________________________________
Das Ergebnis der Western Blots ist in Abbildung 3.16 zusammengefasst. Als
Positivkontrolle für den Antikörper wurden HEK 293-Zellen nur mit Dsg 2
Expressionsvektor transfiziert, was in einer deutlichen Bande auf dem Western Blot
von 120 kDa Größe resultierte. Negativkontrolle stellen untransfizierte Zellen dar,
die auf dem Blot keine Bande in der entsprechenden Größe zeigen. Nebeneinander
sind
die
drei
shRNA
Expressionsplasmide,
die
zusätzlich
zum
Dsg
2
Expressionsplasmid in absteigender Konzentration transfiziert wurden, aufgetragen.
ShRNA 1, deren Zielsequenz in Exon 4 der Dsg 2 mRNA liegt, zeigte in dieser
Analyse keinen signifikanten knock down des Dsg 2 Proteins. Im Fall von shRNA 2
ist bei der Transfektion mit 0,5 µg shRNA Plasmid eine minimale Bande für Dsg 2
Protein sichtbar. Die ebenso wie shRNA 2 eine Sequenz in Exon 9 als Ziel
aufweisende shRNA 3 zeigt auch bei der geringsten verwendeten shRNAKonzentration (0,5 µg DNA) noch keine Dsg 2 Proteinbande. Als Kontrolle für die
Spezifität der shRNAs wurden Zellen mit Dsg 2 Expressionsvektor und einem
unspezifischen shRNA Expressionsvektor transfiziert, dessen shRNA gegen SCL
(stem cell leucemia) mRNA gerichtet ist. Hier konnte eine Bande für Dsg 2 Protein
detektiert werden. Die verschiedenen gegen Dsg 2 gerichteten shRNAs zeigten in
wiederholten Ansätzen ähnliche Ergebnisse. Was die Effizienz des Dsg 2 knock
downs betrifft, kam es reproduzierbar zu den gleichen Unterschieden zwischen den
drei shRNA Expressionsplasmiden.
3.3 Knock down von Dsg 2 mit Hilfe des Expressionsvektors pSico
Ziel der Doktorarbeit war es, eine induzierbare Dsg 2 siRNA Maus zu generieren,
um die Funktion von Dsg 2 genauer zu untersuchen. In den Zellkultur-Vorversuchen
wurde der shRNA Expressionsvektor pTEREGFP verwendet, um die siRNA Sequenz
zu finden, welche Dsg 2 am besten herunterreguliert. Um die Expression der shRNA
in diesem Vektor schaltbar zu machen, ist, wie bereits beschrieben, das
Repressormolekül TetR notwendig, welches die Transkription der shRNA verhindert
(van de Wetering et al, 2003). Erst durch Bindung von TetR an Doxycyclin (Dox),
wodurch der Repressor seine Konformation verändert und nicht mehr als
Homodimer an die TetO Bindestelle im Promoterbereich anbinden kann, kommt es
zur
Expression
der
shRNA.
Konditionale
Induzierbarkeit
des
Dsg
2
96
Ergebnisse
____________________________________________________________________
Funktionsverlustes war notwendig, da Dsg 2 bereits in der frühen Entwicklung des
Mausembryos eine essenzielle Rolle spielt und ein kompletter Funktionsverlust von
Dsg 2 zu embryonaler Letalität führt (Eshkind et al, 2002). Um den mit Tetrazyklin
induzierbaren pTEREGFP shRNA Expressionsvektor in der Maus verwenden zu
können, sind geeignete Repressormäuse nötig, welche nach Abschluss der
Vorversuche nicht zu Verfügung standen. Daher wurde die zuvor in pTEREGFP auf
knock down von Dsg 2 getestete siRNA Sequenz 2 (Zielsequenz in Exon 9/1) in
einen anderen, zu diesem Zeitpunkt veröffentlichten shRNA Expressionsvektor
einkloniert. Dieser Vektor (pSico, plasmid for stable RNAi, conditional) ermöglicht
eine Cre/lox-regulierte Expression der shRNA (Ventura et al, 2004). Dazu waren
modifiziete loxP sites im Bereich des Polymerase III U6 Promoters und vor der
shRNA Sequenz in einen lentiviralen Vektor (lentilox 3.7; Rubinson et al, 2003)
eingebracht worden, die eine Stop-Kassette, bestehend aus CMV-Promoter und für
EGFP kodierender Sequenz, flankieren. Aufgrund dieser Stop-Kassette kommt es
zunächst nicht zur Expression der shRNA. Den Vektor tragende Zellen können durch
EGFP-Fluoreszenz detektiert werden. Wird in der EGFP-positiven Zelle zusätzlich
Cre Rekombinase exprimiert, kommt es zur Deletion der CMV/EGFP/Stop-Kassette
durch Rekombination zwischen den loxP sites, wodurch der U6 Promoter in
physische Nähe der shRNA kodierenden Kassette gebracht, und damit die
Expression der shRNA initiiert wird. Für dieses System ist kein zusätzliches
Repressormolekül notwendig, da die Expression der shRNA erst nach Cre
Rekombination erfolgt. Benötigt wird in diesem System hingegen eine schaltbare Cre
Deleter Maus, um die shRNA Expression zum gewünschten Zeitpunkt induzieren zu
können. Da verschiedene induzierbare Cre Deleter Mäuse aus der Literatur bekannt
waren (Casanova et al, 2002; Hayashi und MacMahon, 2002; Kellendonk et al,
1999; Kuhn et al, 1995; El Marjou et al, 2004; Metzger und Chambon, 2001; Utomo
et al, 1999), wurde der lentivirale Vektor pSico für die weiteren Versuche und zur
Generierung der Dsg 2 knock down Maus gewählt.
3.3.1 Klonierung der Dsg 2 shRNA Sequenz in den Expressionsvektor pSico
Aufgrund der Vorversuche, in denen die verschiedenen Dsg 2 siRNA Sequenzen auf
deren knock down Effizienz getestet wurden und der Vorgaben für die Klonierung in
97
Ergebnisse
____________________________________________________________________
den neuen shRNA Expressionsvektor, wurde die Sequenz der siRNA 2 für den
späteren knock down in der Maus ausgewählt. Mit dieser Sequenz konnte ein
deutlicher knock down auf Proteinebene in Zellkulturexperimenten erreicht werden.
Zudem beginnt diese siRNA Sequenz mit dem Nukleotid Guanin, was idealerweise
für die Expression einer siRNA oder shRNA mittels U6 Promoter der Fall sein sollte,
um die Wildtyp-Sequenz des Promoters zu erhalten (+1 Guanin) und so die durch
bestimmte Nucleotidfolgen am Anfang der Sequenz erzeugte Interferonantwort zu
verhindern (Pebernard und Iggo, 2004; Tuschl, 2002; Yu et al, 2002). Gleichermaßen
wie die Klonierung bei dem zuvor verwendeten Vektor wurden auch hier
synthetische shRNA Oligonukleotide, deren Sequenz sich aus siRNA, loop und
Klonierungsstellen
zusammensetzen,
nach
dem
Annealing
(2.2.11)
als
doppelsträngige Moleküle mit dem Xho I/Hpa I-verdauten Vektor pSico ligiert
(2.2.8.2 und 2.2.12) und in elektrokompetente Bakterien gebracht (2.2.14.1). Am Tag
darauf wurden die gewachsenen Kolonien in 5 µl Aqua destillata resuspendiert und 1
µl davon für eine PCR verwendet, um die Integration der shRNA Sequenz zu
bestätigen. Die PCR wurde wie beschrieben durchgeführt (2.2.5) und die PCRProdukte neben einem Größenmarker auf einem 2 % Agarosegel aufgetrennt.
Abbildung 3.17A zeigt das Ergebnis der PCR, wobei für den leeren Vektor, welcher
zur Kontrolle in der PCR mitgeführt wurde, eine Bande in von 492 bp und für Vektor
B
M
K
1*
M´
2
Klon
A
pSico
mit integrierter shRNA ein 546 bp-Produkt erwartet wurde.
6035 bp
546 bp
492 bp
1600 bp
Abb. 3.17: Kontrolle der transformierten Bakterien auf Intregration der shRNA in den pSico
Expressionsvektor
(A) PCR-Produkte zweier Bakterienkolonien und des leeren pSico Vektors (K). Der positive Klon ist
durch * gekennzeichnet.
(B) Gezeigt werden Restriktionsverdaus des leeren pSico Vektors und des positiven Klons mit Xcm
I/Xba I.
M Marker (100 bp ladder), M´ Marker (1 kb ladder)
98
Ergebnisse
____________________________________________________________________
Von den nach Transformation gewachsenen Bakterienkolonien konnte Klon 1 mit
Hilfe von PCR als positiv für die Integration der shRNA bestätigt werden. Um sicher
zu gehen, dass die shRNA in den Vektor integriert hatte, wurde diese Kolonie zum
Animpfen einer 2 ml Übernachtkultur verwendet und DNA daraus präpariert
(2.2.1.1). Im Anschluss daran wurden zwei Restriktionsverdaus mit der DNA von
Klon 1 und zur Kontrolle mit der des leeren Vektors durchgeführt. Die DNA wurde
dazu wie beschrieben mit Xcm I und Xba I für 3 Stunden bei 37 °C verdaut (2.2.8.1)
und die entstandenen Fragmente später auf einem 1 % Agarosegel aufgetrennt. Xcm
I schneidet nur im shRNA Insert. Da zusätzlich Xba Inur eine Schnittstelle im pSico
Vektor hat, wird für den leeren Vektor im Restriktionsverdau mit Xcm I/Xba I eine
Linarisierung, und damit eine 7600 bp Bande erwartet. Im Fall der Integration der
shRNA entstehen aufgrund der zwei Schnittstellen (Xba I und Xcm I) ein 6035 bp
und 1600 bp Fragment, welche deutlich auf dem Gelbild zu erkennen sind. Aufgrund
der mit Hilfe des Restriktionsverdaus detektierten Integration des shRNA
Oligonukleotids wurde Klon 1 zum Animpfen einer 400 ml Bakterienkultur
verwendet und die daraus präparierte DNA in den weiteren Versuchen genutzt. Um
die Nukleotidsequenz des pSico Dsg 2 knock down Vektors zu verifizieren, wurde
eine Analyse der Sequenz durchgeführt (Genterprise, Mainz). Diese Analyse
bestätigte die erwartete Nukleotidsequenz.
3.3.2 Deletion der Stop-Kassette durch Transfektion des pSico Dsg 2 shRNA
Plasmids in Cre exprimierende Bakterien
Um die Funktionalität des pSico-shRNA Konstrukts testen zu können, muss eine den
Expressionsvektor tragende Zelle zusätzlich Cre Rekombinase exprimieren, damit es
zur Deletion der CMV/EGFP/Stop-Kassette und damit zur Expression der shRNA
kommt. Eine Möglichkeit, das System zu testen, besteht in Verwendung einer Cre
exprimierenden Zelllinie (Ouvrard-Pascaud et al, 2003; Sauer und Henderson, 1988).
Eine weitere Möglichkeit ist die Transfektion des Plasmids in Cre exprimierende
Bakterien, welche im Labor zu Verfügung standen (294-Cre, Buchholz et al, 1996).
Dieser Ansatz wurde genutzt, um die CMV/EGFP/Stop-Kassette aus dem pSico
shRNA Expressionsvektor zu entfernen. Dazu wurden 294-Cre Bakterien mittels
Hitzeschock transformiert (2.2.14.2), ausplattiert, bei 30°C über Nacht inkubiert und
99
Ergebnisse
____________________________________________________________________
die gewachsenen Kolonien zum Animpfen von 2 ml Bakterienkulturen verwendet
(2.2.1.1). Die daraus präparierte DNA wurde mit Pst I/Kpn I für 3 Stunden bei 37°C
verdaut (2.2.8.1) und die DNA Fragmente auf einem 1 % Agarosegel aufgetrennt.
Die aus CMV Promoter und EGFP bestehende Stop-Kassette hat eine Größe von
1598 bp. Aufgrund der für den analytischen Verdau gewählten Enzyme waren für
den Vektor mit Stop-Kassette Banden in der Größe von 5006 bp und 2600 bp und für
den Vektor nach Cre Rekombination 5006 bp- und 1002 bp-Fragmente zu erwarten.
In Abbildung 3.18 ist zum einen der shRNA Expressionsvektor pSico Dsg 2 shRNA
vor und nach Cre Expression dargestellt. Ferner wird das Agarosegelbild mit dem
Ergebnis des Restriktionsverdaus gezeigt. In allen getesteten Bakterienkolonien
(Banden der Klone 2 und 4 sind sehr schwach) kam es zur Expression von Cre
Rekombinase und damit zur Deletion der CMV/EGFP/Stop-Kassette. Von einem der
Klone wurde aus einer 400 ml Bakterienkultur DNA präpariert (2.2.1.2), die in den
weiteren Versuchen verwendet wurde.
100
Ergebnisse
____________________________________________________________________
CMV Promoter
Amp R
5`LTR
3`SIN LTR
pSico Dsg2 shRNA
7606 bp
Psi
Cre Rekombination
Pst I
Kpn I
cPPT
U6 Promoter
WRE
Dsg2 shRNA
TATA lox
CMV Promoter
EGFP
TATA lox
CMV Promoter
Amp R
5´LTR
pSico Dsg2 shRNA
+ Cre
6008 bp
Psi
3´SIN LTR
Kpn
Pst
WRE
Dsg2 shRNA
cPPT
U6 Promoter
TATA lox
M
K
1*
2
3*
4
5*
6*
5006 bp
2600 bp
1002 bp
Abb. 3.18: Cre-induzierte Rekombination zwischen den loxP sites im shRNA Expressionsvektor
pSico führt zu Deletion der CMV/EGFP/Stop-Kassette
Schematisch dargestellt ist der Vektor pSico Dsg 2 shRNA vor (links) und nach (rechts) Cre
Rekombination zwischen den loxP sites, was zur Deletion der CMV/EGFP/Stop-Kassette führt. Das
Agarosegelbild zeigt das Ergebnis des Restriktionsverdaus mit Kpn I/Pst I nach Transfektion von
pSico Dsg 2 shRNA in Cre exprimierende Bakterien. Als Kontolle (K) wurde DNA des Vektors vor
dieser Transfektion verdaut. Rekombinierte Klone sind mit * markiert.
M Marker (1 kb ladder), Amp R Ampicillinresistenzgen, CMV Cytomegalovirus, LTR Long Terminal
Repeat, Psi für virale RNA Verpackung, cPPT central Polypurine Tract, WER Woodchuck hepatitis
virus Response Element, SIN self- inactivating
101
Ergebnisse
____________________________________________________________________
3.3.3 Knock down von Dsg 2 im Zellkulturexperiment nach Deletion der StopKassette
Bevor der pSico Dsg 2 shRNA Expressionsvektor Anwendung im Mausmodell
finden konnte, musste zunächst die Funktionalität dieses Vektors in der Zellkultur
getestet werden. Dazu wurden NIH 3T3 Zellen mit dem Dsg 2 Expressionsvektor
sowie dem shRNA Expressionsplasmid vor und nach Cre Rekombination transient
co-transfiziert (2.2.25.4). Je 4 x 105 Zellen wurden mit 1 µg Dsg 2 Expressionsvektor
und 1 µg shRNA Vektor transfiziert und 48 Stunden später Protein aus den Zellen
extrahiert (2.2.19.1). Um die Expressionslevels von Dsg 2 zu untersuchen, wurden
jeweils 20 µl der Proteinextrakte auf 6 % SDS-Polyacrylamidgelen aufgetrennt und
ein Western Blot wie beschrieben unter Verwendung des Dsg 1/2-Antikörpers DG
3.10 (1:50 in Erstantikörperverdünnungslösung) durchgeführt (2.2.22). Als weitere
Kontrolle für die geladenen Proteinmengen wurde der gebundene Dsg 2 Antikörper
nach erfolgter Exposition von der Western Blot Membran entfernt und wie dargestellt
mit einem Antikörper inkubiert, der gegen ein konstitutiv exprimiertes, endogenes
Protein gerichtet ist (2.2.23). Durch Vergleich der Expressionslevels dieses Proteins
(p38 Kinase) kann die Menge an geladenem Protein in den verschiedenen Taschen
Dsg2 + pSico
shRNA dsg2
Dsg2 + pSico-StopshRNA dsg2
Dsg2 + pSico-Stop
Dsg2
WT
verglichen werden.
Dsg 2
p38
Abb. 3.19: Western Blot zur Kontrolle der Funktionalität des pSico Dsg 2 shRNA
Expressionsvektors
NIH 3T3 Zellen wurden mit dem Dsg 2 Expressionsvektor (Dsg 2), dem leeren pSico Plasmid (pSicoStop), dem pSico Dsg 2 shRNA Vektor vor (pSico-Stop-Dsg 2 shRNA) und nach (pSico Dsg 2
shRNA) Cre Rekombination transfiziert. Als Kontrolle wurden untransfizierte Zellen (WT)
verwendet. Das obere Fenster zeigt die Expression von Dsg 2, darunter ist die Expression des
Kontrollproteins p38 dargestellt.
102
Ergebnisse
____________________________________________________________________
Durch Vergleich der für das Kontrollprotein p38 erhaltenen Banden kann von
annähernd gleichen Proteinmengen in den verschiedenen Proben ausgegangen
werden (Abb. 3.19). Als Kontrolle für die Spezifität des Antikörpers wurde
Proteinextrakt untransfizierter NIH 3T3 Zellen aufgetragen (WT). Im Western Blot
wurde für diese Probe kein Dsg 2 Signal detektiert. Die Positivkontrolle (Protein von
mit Dsg 2 Expressionsvektor transfizierten Zellen) lieferte eine deutliche Bande in
der erwarteten Größe von 120 kDa. Proteinextrakte der mit dem leeren pSico (pSicoStop) sowie dem shRNA und Stop-Kassette beinhaltenden Vektor (pSico-Stop-Dsg 2
shRNA) transfizierten Zellen ergaben ebenfalls Banden für Dsg 2 Protein. Zellen, die
mit dem Vektor nach Cre Rekombination (pSico Dsg 2 shRNA) transfiziert wurden,
zeigten keine Bande in entsprechender Größe. Dieses Ergebnis zeigt, das der
generierte pSico Dsg 2 knock down Vektor nach Entfernen der CMV/EGFP/StopKassette die Expression von Dsg 2 Protein im verwendeten Zellkulturansatz
vollständig unterdrücken konnte.
3.4 Klonierung der shRNA Expressionskassette in einen Vektor mit humanen
MAR (Matrix Attachment Region)-Sequenzen zur Insulation des Transgens
Bei der Herstellung transgener Mäuse erfolgt die Integration eines Transgens in die
murine DNA stochastisch. Dies hat zur Folge, dass die Transkription des Transgens
verändert sein kann und die das Transgen umgebenden Elemente Einfluss auf dessen
Expression nehmen (variegationaler Effekt). Jedes Gen ist innerhalb des Chromatins
von DNA Sequenzen umgeben, die das Potenzial haben, auf dessen Expression
Einfluss zu nehmen. Beispielsweise kann die Expression eines Transgens durch
regulatorische Elemente wie Enhancer oder Silencer sowie durch Integration nahe
eines transkriptionell aktiven Gens oder in kondensierte Chromosomenstrukturen
determiniert werden. Um dies zu umgehen, kann ein Transgen in einen ausgewählten
Lokus auf der DNA zielgerichtet eingebracht oder von Insulatorelementen umgeben
werden (Bronson et al, 1996; Bell et al, 2001). Insulatoren fungieren als eine Art
Barriere gegen umgebende DNA Domänen. Sie können zum einen als „positional
enhancer blocker“ wirken, indem sie als neutrale Barriere zwischen Promoter und
Enhancer liegend, dessen Einfluss auf den Promoter unterbinden. Des weiteren
können Insulatoren gegen PEV (Positions-Variegations-Effekt) schützen, so dass die
103
Ergebnisse
____________________________________________________________________
Expression des Transgens nicht von der umgebenden Chromatinstruktur oder
Transkriptionselementen beeinflusst wird. Die Sequenz von Insulatoren ist
uneinheitlich und meist werden künstliche Konstrukte verwendet, um die oben
genannten Eigenschaften zu vermitteln. Mit Hilfe von humanen Matrix Attachment
Region (MAR)-Sequenzen, die ursprünglich aus dem humanen Globingenlokus
stammen, kann ein Transgen von umgebenden DNA Elementen isoliert und somit
deren Einfluss auf die Expression des Transgens verhindert werden (Fleenor et al,
1993; Fukumura et al, 1998). Da ein Vektor mit MAR Sequenzen im Labor zu
Verfügung stand, wurde die Möglichkeit genutzt, die Expression von Dsg 2 shRNA,
unabhängig von umgebenden Sequenzelementen, zu verbessern. Dazu wurden die für
die Expression der Dsg 2 shRNA wichtigen Sequenzelemente mit Hilfe eines
präparativen Restriktionsverdaus aus dem shRNA Expressionsvektor entfernt und
mit dem die humanen MAR-Sequenzen tragenden Vektor pInsu ligiert (Abb. 3.20).
Für diese Klonierung wurden beide Vektoren mit Hind III über Nacht bei 37°C
inkubiert und die entstandenen DNA Fragmente auf einem 0,7 % Agarosegel
aufgetrennt (2.2.8.2 und 2.2.6). Im Fall des pInsu Plasmids erfolgte nach dem
Restriktionsverdau eine Dephosphorylierung, um einer Religation des Vektors
vorzubeugen (2.2.9).
104
Ergebnisse
____________________________________________________________________
CMV Promoter
Amp R
Xmn I Bgl II
Pvu I
Bgl II
Hind III
5`LTR
Xmn I
Hind III
3`SIN LTR
Hind III
Bgl II
Psi
pSico Dsg 2 shRNA
Hind III
7606 bp
Bgl II
Kpn I
Pvu I
Hind III
WRE
Xho I
Xcm I
Pst I
Xba I
cPPT
U6 Promoter
TATA lox
CMV Promoter
Not I
Dsg2 shRNA
EGFP
Sca I
Pvu I
TATA lox
Pvu I
Sac I
Insulator
pInsu
AmpR
4564 bp
Kpn I
Xho I
Not I
Spe I
Xma I
Sma I
Pst I
EcoR I
EcoR V
Hind III
Cla I
Insulator
Sca I
Pvu I
Pvu I
Sac I
Amp R
pSicopInsu Dsg 2
shRNA
Not I
EcoR I
Hind III
Psi
cPPT
6949 bp
Kpn I
EcoR I
Xho I
Insulator
Insulator
Hind III
Xho I
Xcm I
Dsg2 shRNA
U6 Promoter
TATA lox
CMV Promoter
Not I
EGFP
TATA lox
Abb. 3.20: Schematische Darstellung zur Klonierung des pSicopInsu Dsg 2 shRNA Vektors
Die Abbildung zeigt schematisch die Klonierung des pSicopInsu Dsg 2 shRNA Vektors aus pSico
Dsg 2 shRNA und pInsu (die Hind III Klonierungssequenz ist unterstrichen).
Amp R Ampicillinresistenzgen, CMV Cytomegalusvirus, LTR Long Terminal Repeat, Psi für virale
RNA Verpackung, cPPT central Polypurine Tract, WER Woodchuck hepatitis virus Response
Element, SIN sefl- inactivating, Insulator humane MAR (Matrix Attachment Region) Sequenz
105
A
B
M
pSico
Hind III
M
2900 bp
2385 bp
pSico Fragment
Präzipitat
Ergebnisse
____________________________________________________________________
pInsu
Hind III
4564 bp
2385 bp
1200 bp
590 bp
550 bp
Abb. 3.21: Präparative Restriktionsverdaus der Vektoren pSico Dsg 2 shRNA und pInsu
(A) Präparativer Verdau von pSico Dsg2 shRNA mit Hind III. Es entstehen 5 Fragmente, von denen
das 2385 bp Fragment die shRNA Expressionkassette beinhaltet.
(B) Abgebildet ist das aus dem Gel extrahierte und präzipitierte DNA Fragment des pSico Dsg 2
shRNA Vektors sowie der mit Hind III linearisierte pInsu Vektor.
Das Restriktionenzym hat lediglich eine Schnittstelle im pInsu Vektor, wodurch
dieser linearisiert und auf dem Agarosegel als 4564 bp großes DNA Fragment
sichtbar wird (Abb. 3.21). Für den pSico Dsg 2 shRNA Vektor entstehen nach
Verdau mit Hind III 5 DNA Fragmente (2900 bp, 2385 bp, 1200 bp, 590 bp und
550 bp).
Die shRNA Expressionskassette enthaltende Bande ist 2385 bp groß und wurde,
ebenso wie die DNA des linearisierten pInsu Vektors, wie beschrieben aus dem Gel
extrahiert (2.2.7). Die Fragmente wurden präzipitiert (2.2.2), anschießend über Nacht
bei 16°C ligiert (2.2.12) und 1 µl des Ligationsansatzes für die Transformation
elektrokompetenter Bakterienzellen verwendet (2.2.14.1). Mit denen auf den
Agarplatten gewachsenen Kolonien wurden 2 ml Bakterienkulturen angeimpft und
die DNA wie dargestellt präpariert (2.2.1.1). Für einen analytischen Verdau mit Xho
I wurden 5 µl der so gewonnenen DNA verwendet. Für die Integration der shRNA
Expressionskassette in richtiger Orientierung wurden Banden der Größe 6000 bp und
949 bp erwartet, bei falscher Orientierung sollten 3700 bp und 3249 bp große
Fragmente zu sehen sein. Wie in Abbildung 3.22A zu erkennen ist, konnten für die
Klone 6 und 11 die nach erfolgreicher Integration des Inserts in pInsu erwarteten
DNA Fragmente von 6000 bp und 949 bp erhalten werden. Als Kontrolle wurde
unverdaute und mit Xho I geschnittene DNA des leeren pInsu auf dem 0,7 %
Agarosegel aufgetrennt. Klon 11 wurde in weiteren Restriktionsverdaus (Abb. 3.22
106
Ergebnisse
____________________________________________________________________
B) genauer untersucht. Die DNA wurde mit Eco RI/Xcm I (Spur 2), Sac I/Hind III
(Spur 3), Xho I/Pvu I (Spur 4), Hind III/Kpn I (Spur 5) und Sca I (Spur 6) für 3
Stunden bei 37°C inkubiert und die Fragmente anschließend auf einem 0,7 %
Agarosegel aufgetrennt. Es wurden dabei Banden für DNA Fragmente von 4680
bp/1424 bp/896 bp (Spur2), 3718 bp/2425 bp/857 bp (Spur 3), 3361 bp/1673
bp/1015 bp/951 bp (Spur 4), 3690 bp/2425 bp/885 bp (Spur 5) Größe erwartet, sowie
eine Linearisierung des Vektors (6949 bp, Spur 6). Als Kontrolle wurde nicht
verdaute DNA des Vektors (Spur 1) aufgetrennt. Aufgrund der geringen Intensität ist
die 896 bpBande in Spur 2 nicht zu erkennen. Durch addieren der sichtbaren DNA
Fragmente aus diesem Verdau erhält man also nicht den Wert der gesamten Größe
des Vektors (6949 bp). Die weiteren Restriktionsverdaus (Spur 3 bis 6) zeigen
M1
pInsu XhoI
A
pInsu unverdaut
Banden, die der erwarteten DNA Fragmentgröße entsprachen.
1
2
3
4
5
6*
7
8
9
10 11* 12 13 14
6000 bp
949 bp
B
M1
1
2
3
4
5
6
M2
6700 bp
4600 bp
1600 bp
880 bp
Abb. 3.22: Analyse potenzieller pSicopInsu Dsg 2 shRNA Bakterienklone
(A) Analytischer Restriktionsverdau von 14 potenziellen pSicopInsu Dsg 2 shRNA Klonen mit Xho I.
Die mit * markierten Klone 6 und 11 zeigen die nach erfolgreicher Integration der shRNA
Expressionskassette in pInsu erwarteten Banden (6000 bp und 949 bp).
(B) Klon 11 wurde durch weitere Restriktionsverdaus genauer analysiert. Gezeigt sind (1) unverdaute,
sowie mit (2) Eco RI/Xcm I, (3) Sac I/Hind III, (4) Xho I/Pvu I, (5) Hind III/Kpn I und (6) Sca I
verdaute DNA des Klons.
M1 Marker (1 kb ladder), M2 Marker (100 bp ladder)
107
Ergebnisse
____________________________________________________________________
3.5 Generierung der pSicopInsu Dsg 2 shRNA (Dsg 2 knock down) Mäuse
Um transgene Mäuse zu generieren, sind verschiendenartige Vorbereitungen und
Techniken notwendig, welche unter 2.2.26 im Detail beschrieben werden. Damit die
transgene DNA ins Mausgenom integriert, muss sie in linearer Form vorliegen. Dazu
wurde die Plasmid DNA (pSicopInsu Dsg 2 shRNA) mittels präparativen
Restriktionsverdau linearisiert, wozu 5 µg DNA über Nacht mit Sca I inkubiert
wurden. Nach Auftrennung auf einem 0,7 % Agarosegel und anschließender
Gelextraktion (2.2.7) wurde die nun lineare DNA präzipitiert und in Injektionspuffer
(0,1 mM EDTA, 10mM Tris, pH 7,4) aufgenommen. Dann erfolgte die Reinigung
der DNA über eine Spin X-Säule, wonach die Konzentration über eine
Verdünnungsreihe auf einem Agarosegel bestimmt (2.2.26.3) und für die
Mikroinjektion auf 2,5 ng/µl eingestellt wurde. In Abbildung 3.23 ist das
Agarosegelbild des präparativen Restriktionsverdaus zu sehen. Neben der mit Sca I
linearisierten DNA wurde zur Kontrolle DNA des unverdauten Plasmids aufgetrennt.
M
Sca I
unverdaut
6949 bp
Abb. 3.23: Präparativer Restriktionsverdau des pSicopInsu Dsg 2 shRNA Plasmids für die
Mikroinjektion
Zu sehen ist die mit Sca I linerisierte DNA des 6949 bp großen Vektors; daneben zur Kontrolle
unverdaute Plasmid-DNA.
Die gereinigte DNA (2,5 ng/µl) wurde wie beschrieben in den männlichen Vorkern
befruchteter muriner Eizellen (d 0,5) mikroinjiziert (2.2.26.4) und die so
manipulierten Oozyten in scheinschwangere Mäuse transferiert (2.2.26.6). Die
Jungen wurden nach einer Tragezeit von etwa 20 Tagen geboren.
108
Ergebnisse
____________________________________________________________________
3.6 Genotypisierung und Fluoreszenztest von potentiellen Dsg 2 knock down
Mäusen
Um festzustellen, welche der von den Leihmüttern geborenen Mäuse Träger des
Transgens waren, wurden Schwanzbiopsien der zwei bis drei Wochen alten Mäuse
entnommen und aus diesen für die Genotypisierung mittels PCR wie beschrieben
DNA präpariert (2.2.3). Die PCR wurde unter Verwendung der pSico Primer (5´GAGCTGTACAAGTAGCGGCCGCAT-3´ und 5´-ATGAGTTCCGCCGTGGCAA
TAG-3´) durchgeführt (2.2.5), welche für das Transgen ein 620 bp Produkt liefern.
Als interne Kontrolle wurden in jeder PCR Reaktion zusätzlich Primer verwendet,
die das endogene Gen Aktin amplifizierten. Als Negativkontrolle wurde DNA einer
Wildtyp Maus und zur Positivkontrolle DNA des injizierten pSicopInsu Dsg 2
shRNA Vektors mitgeführt. Abbildung 3.24 zeigt exemplarisch ein Agarosegelbild
einer solchen Genotypisierungs-PCR.
Die durch Mikroinjektion in murine Oozyten eingebrachte DNA enthielt neben der
shRNA Sequenz das grüne Fluoreszenzprotein EGFP als Indikatorgen. In der
Fluoreszenzanalyse bestand daher neben der Genotypisierung mittels PCR eine
weitere Möglichkeit, auf Integration des Transgens zu prüfen. Dazu wurden Biopsien
der Mausohren unter der Fluoreszenzlampe auf EGFP-Expression untersucht.
In Abbildung 3.24B ist das Agarosegelbild eines PCR Ergebnisses zur
Genotypisierung potenzieller Dsg 2 knock down Tiere zu sehen. Für drei der
untersuchten Mäuse erscheint neben der Bande für die internen PCR Kontrolle
(Aktin, 450 bp) das 620 bp große Produkt des Transgens. Negativkontrolle in der
PCR Reaktion war DNA einer Wildtyp Maus, wobei nur die Aktin-Bande entstehen
sollte. Als Positivkontrolle wurde DNA des injizierten Vektors verwendet, wobei
hier nur das Transgen amplifiziert werden kann. Für eine der in der PCR positiv für
das Transgen getesteten Mäuse ist in Abbildung 3.24C die Fluoreszenzanalyse einer
Ohrbiopsie beispielhaft dargestellt. Links sieht man zur Kontrolle die Ohrprobe einer
nicht das Transgen tragenden Maus. Im oberen Teil der Abbildung ist die Biopsie im
Durchlicht des Binokulars gezeigt, darunter bei Licht einer Wellenlänge von 550 nm.
Bei der Dsg 2 knock down Maus ist im Vergleich mit der Wildtyp Maus deutlich die
Expression von EGFP zu erkennen. Abbildung 3.24A zeigt, wie DNA in den
männlichen Vorkern einer befruchteten Oozyte injiziert wird. Daneben sind
nochmals schematisch die zur shRNA Expression notwendigen mikroinjizierten
109
Ergebnisse
____________________________________________________________________
DNA
Elemente,
bestehend
aus
den
beiden
das
Transgen
umgebende
Insulatorsequenzen, der von loxP sites flankierten CMV/EGFP/Stop-Kassette, sowie
U6 Promoter und shRNA, dargestellt.
A
11426
11427
11425
11423
11424
11406*
11407
11408*
11420*
11421
11432
11433
11434
11435
shRNA Insulator
11422
11403
11404
11405
EGFP
11429
M
CMV
11402
B
U6
11428
Insulator
siRNA (620 bp)
Aktin (450 bp)
11472
11473
11474
11437
11436
M
11430
11431
siRNA (620 bp)
Aktin (450 bp)
-K +K
C
Durchlicht
Fluoreszenz
(550nm)
WT Maus
Dsg 2
knock down
Maus
Abb. 3.24: Generierung und Genotypisierung der Dsg 2 knock down Mäuse
(A) Schematische Dargstellung der für die shRNA Expression essentiellen DNA Elemente des
mikroinjizierten Konstrukts. Links davon sieht man, wie DNA in den männlichen Vorkern einer
befruchteten murinen Eizelle injiziert wird.
(B) Ergebnis einer Genotypisierungs-PCR potenzieller Dsg 2 knock down Mäuse. Transgene Tiere
sind mit * gekennzeichnet.
(C) Fluoreszenzanalyse einer Wildtyp (WT) und einer Dsg 2 knock down Maus. Im oberen Bereich
sind die Ohrbiopsien im Durchlicht des Binokulars gezeigt, darunter mit Licht von 550 nm
Wellenlänge.
- K Negativkontrolle, +K Positivkontrolle, M Marker (100 bp ladder) Insulator MAR Sequenzen, U6
U6 Promoter, CMV Cytomegalusvirus Promoter, EGFP enhanced green fluorescent protein Gen,
shRNA Dsg 2 shRNA Oligonukleotid
110
Ergebnisse
____________________________________________________________________
Insgesamt wurden nach der Mikroinjektion 69 Founder-Tiere erhalten, von denen
drei mittels PCR und Fluoreszenzanalyse positiv für das Transgen getestet wurden.
Eine Maus starb bereits nach wenigen Wochen, so dass für die Analyse zwei Linien
zu Verfügung standen.
3.7 Knock down von Dsg 2 nach Tamoxifen-Behandlung doppelt transgener
pSicopInsu Dsg 2 shRNA/Rosa26CreERT2 Mäuse
Wie bereits zu Beginn erwähnt, exprimieren die das pSicopInsu Dsg 2 shRNAKonstrukt tragenden Mäuse noch nicht die Dsg 2 shRNA. Erst wenn die
CMV/EGFP/Stop-Kassette mittels Cre Rekombination zwischen den loxP sites
deletiert wird, kommt der U6 Promoter in physische Nähe der shRNA Sequenz,
wodurch diese transkribiert werden kann. Zur Expression der shRNA ist somit Cre
Rekombinase notwendig. Durch Verpaarung der Dsg 2 knock down Tiere mit den
unter 3.1 beschriebenen Rosa26CreERT2 Mäusen wurden bitransgene Tiere erhalten,
die zum einen das Dsg 2 knock down-Konstrukt und des weiteren die über
Tamoxifen induzierbare Cre Rekombinase (CreERT2) trugen. Diesen bitransgenen
Mäusen wurde über einen längeren Zeitraum wiederholt für jeweils 5 Tage 1 mg
Tamoxifen
(gelöst
in
100
µl
autoklaviertem Sonnenblumenöl)
pro
Tag
intraperitoneal injiziert. Dabei lag der Zeitraum zwischen den Behandlungen
zwischen 16 und 23 Tagen. Durch diese Mehrfachbehandlung sollte in möglichst
vielen Zellen CreERT2 aktiviert werden, in den Zellkern translozieren und dort die
Deletion der CMV/EGFP/Stop-Kassette durch Rekombination zwischen den loxP
sites vermitteln. Nur in den Cre exprimierenden Zellen kann auch die shRNA
exprimiert und damit Dsg 2 herunterreguliert werden.
Um zu testen, in wieweit die Proteinexpression von Dsg 2 nach der
Tamoxifenbehandlung reduziert werden konnte, wurden zwei unterschiedliche
Detektionsmethoden gewählt. Zum einen wurden Western Blots durchgeführt. Dazu
wurden die Mäuse 15 Tage nach der letzten Tamoxifeninjektion euthanasiert und aus
den entnommenen Geweben Proteinextrakte hergestellt (2.2.19.2). Von diesen wurde
je 100 µg Gesamtprotein auf 6 % SDS-Polyacrylamidgelen aufgetrennt und der
Western Blot wie beschrieben unter Verwendung des Dsg 1/2-Antikörpers (DG 3.10,
1:50 in Erstantikörperverdünnungslösung) durchgeführt (2.2.22). Zur Kontrolle auf
111
Ergebnisse
____________________________________________________________________
homogene Proteinmengen wurde der Antikörper DG 3.10 von der Membran entfernt
und diese im Anschluss mit p38 Antikörper inkubiert (2.2.22).
Leber
K
Darm
1
2
K
1
2
Dsg 2
p38
Niere
K
1
Haut
2
K
1
2
Dsg 2
p38
Herz
K
1
2
Dsg 2
p38
Abb. 3.25: Western Blot von pSicopInsu Dsg 2 shRNA/Rosa26CreERT2 Mäusen nach
Tamoxifenbehandlung
Western Blot von Proteinextrakten verschiedener Gewebe Tamoxifen-behandelter, doppelt transgener
Dsg 2 knock down/Rosa26CreERT2 Mäuse. Als Kontrolle (K) wurden die Proteinproben einer
bitransgenen mit Öl behandelten Maus verwendet. Die Membranen wurden mit Dsg 1/2- sowie p38Antikörper behandelt.
1 pSicopInsu Dsg 2 shRNA Mauslinie 1, 2 pSicopInsu Dsg 2 shRNA Mauslinie 2
Das Ergebnis eines Western Blots für Proteinextrakte aus Leber, Darm, Niere, Haut
und Herz der beiden Dsg 2 knock down Linien ist in Abbildung 3.25 gezeigt. Um
eine Referenz für die Dsg 2 Expression ohne induzierten knock down zu haben,
wurden Mäuse mit gleichem genetischen Hintergrund (doppelt transgene
Geschwistertiere) mit autoklaviertem Sonnenblumenöl anstelle von Tamoxifen
behandelt (K). Die Dsg 2 Proteindetektion ist in dem jeweils oberen Ausschnitt
dargestellt. In der Leber kommt es nur zu geringen Veränderungen der Proteinlevels
in den beiden Linien. Die Proteinextrakte des Darms zeigen, dass es in Linie 1 zu
drastischer Reduktion der Dsg 2 Proteinkonzentration gekommen war. Linie 2 zeigte
kaum Abweichungen im Vergleich mit der Öl-behandelten Maus. In der Niere
konnten in beiden transgenen Linien keine Veränderungen in den Expressionslevels
nach Tamoxifenbehandlung detektiert werden. In den Extrakten der Haut kommt es
zu geringer Verminderung des Proteins in beiden Linien. Beim Vergleich der
112
Ergebnisse
____________________________________________________________________
Proteinlevels im Herz kann man eine deutliche Reduktion in der Dsg 2 Expression in
Extrakten der Linie 1 sehen. Die geladenen Proteinmengen wurden mittels p38
Antikörper kontrolliert. Gleichartige Stärke der Banden deutet auf etwa identische
Proteinmengen hin. Die Proteinmengen in den verschiedenen Organen lassen die
Folgerung zu, dass Dsg 2 knock down Mäuse der Linie 1 eine bessere Reduktion in
Dsg 2 Protein bewirken als die Tiere der Linie 2. Die knock down Effizienz in Dsg 2
Protein korreliert zudem mit der in 3.1 beschriebenen Ergebnissen zur Funktionalität
der Rosa26CreERT2 Maus. In den Funktionalitätstests wurde gezeigt, dass die
Expression von Cre Rekombinase in verschiedenen Organen unterschiedlich stark
ausgeprägt ist. In der Niere konnten nur wenige Cre exprimierende Zellen detektiert
werden (Abb. 3.4). Da die Cre Expression notwendig ist, um die Transkription der
siRNA zu ermöglichen, liegt nahe, dass es in diesem Organ aufgrund fehlender Dsg
2 siRNA kaum zu einer drastischen Reduktion des Dsg 2 Proteins kommen kann. In
Haut und Herz konnten deutlich mehr Cre exprimierende Zellen gefunden werden.
Für Mäuse der Dsg 2 knock down Linie 1 kann im Proteinextrakt aus Herzgewebe
eine klare Reduktion in Dsg 2 Protein erreicht werden. Im Fall der Linie 2 ist die
Proteinreduktion in diesem Organ nicht signifikant. In der Haut sind nur schwer
Unterschiede in den Dsg 2 Proteinmengen von Kontrolltieren zu Linie 1 und 2
festzustellen. Dies könnte auch eine Ursache in der Spezifität des Antikörpers haben,
da dieser auch Dsg 1 detektiert, welches in den oberen, differenzierteren Schichten
der Epidermis (Granulosum und Spinosum) exprimiert wird (siehe Abb. 1.3). In
Leber und Darm konnten im β-Galaktosidase Funktionalitätstest der Rosa26CreERT2
Mäuse über 30 % Cre-positive Zellen detektiert werden. In Proteinextrakten aus der
Leber von pSicopInsu Dsg 2 shRNA/Rosa26CreERT2 Mäusen kam es in Linie 1 zu
einer sichtbaren, in Linie 2 weniger starken Reduktion des Dsg 2 Proteins. Im
Darmgewebe der Linie 1 wurde Dsg 2 Protein drastisch reduziert. In diesem Fall
führte die Expression der shRNA fast zur vollständigen Unterdrückung des Dsg 2
Proteins. In Linie 2 konnte keine solch dramatische Proteinreduktion festgestellt
werden.
Die zweite Methode, um eventuell veränderte Proteinlevels nachzuweisen, bestand in
der Durchführung von Immunfärbungen. Diese wurden am DKFZ (Deutsches
Krebsforschungszentrum, Heidelberg) freundlicherweise von Christine Grund
durchgeführt. Die Mäuse wurden dazu euthanasiert und die Gewebe wie beschrieben
eingefroren (2.2.24.1). Von der Leber wurden Kryostatschnitte angefertigt, die mit
113
Ergebnisse
____________________________________________________________________
dem gegen Dsg 1 und 2 gerichteten Antikörper (DG 3.10) inkubiert wurden
Fluoreszenz
DG 3.10
Durchlicht
(2.2.24.4).
WT Maus
Tamoxifen – induzierte
bitransgene
Dsg 2 knock down Maus
Abb. 3.26: Immunfluoreszenz von Leberschnitten der bitransgenen knock down Maus
Abgebildet sind mit Dsg 1/2-Antikörper (DG 3.10) gefärbte Kryostatschnitte der Leber. Links sieht
man die Schnitte der Kontrollmaus (WT, Wildtyp), daneben die der mit Tamoxifen behandelten Dsg 2
knock down Maus. Über den Fluoreszenzaufnahmen ist das dazugehörige Durchlichtbild zu sehen.
Die Immunfluoreszenzaufnahmen mit den zugehörigen Durchlichtbildern sind in
Abbildung 3.26 gezeigt. Um einen Vergleichswert für die Expressionslevels von Dsg
2 in der Leber zu haben, wurden Kryostatschnitte einer Wildtypmaus mitgeführt.
Diese sind im linken Teil der Abbildung zu sehen. Beim Vergleich der beiden
Proben ist eine weniger intensive Rotfärbung in der knock down Maus an den
Zellgrenzen, welche die Desmosomen als punktuelle Strukturen erkennen lassen, zu
erfassen.
Mit Hilfe der Immunfluoreszenz von Leberschnitten konnte das Ergebnis der
Western Blots bestätigt werden. In diesen beiden unabhängigen Methoden wurde
eine klare Reduktion des Dsg 2 Proteins nachgewiesen.
114
Ergebnisse
____________________________________________________________________
3.8 Induktion von Colitis ulcerosa in Tamoxifen-induzierten Dsg 2 knock
down/VillinCreERT2 Mäusen
Aufgrund der erfolgreichen Reduktion von Dsg 2 Protein sollte eine erste funktionale
Untersuchung der Dsg 2 knock down Mäuse erfolgen.
Colitis ulcerosa ist eine chronisch entzündliche Darmerkrankung, die meist im
unteren Abschnitt des Dickdarms beginnt und sich von dort aus über den gesamten
Dickdarm ausbreitet (Price und Morson, 1975). Im Verlauf der Krankheit kann es zu
Ausbildung von Darmtumoren kommen (Price und Morson, 1975). Die Ursachen für
die Erkrankung sind weitgehend ungeklärt. Als Auslöser werden unter anderem
Störungen der Immunabwehr, Bakterien und Umwelteinflüsse vermutet (Karlinger et
al, 2000). Darmepithelzellen müssen ständig an unterschiedliche Situationen in der
Mukosa-Umgebung adaptieren und sind somit aktiv involviert in die Pathogenese
entzündlicher
Darmerkrankungen.
Als
Konsequenz
der
proliferativen,
metabolischen, immunologischen, entzündlichen oder genetischen Veränderungen
kann es zur Modulation der epithelialen Genexpression kommen (Fukushima et al,
2003). Untersuchungen mit Colitis ulcerosa Patienten ergab im Vergleich mit der
Kontrollgruppe
im
differential
display
eine
Deregulation
von
an
der
Zelldifferenzierung beteiligter Moleküle, unter anderem Dsg 2 (Fukushima et al,
2003).
Für die funktionale Untersuchung der Dsg 2 knock down Mäuse in Zusammenhang
mit Colitis ulcerosa wurden die Mäuse der Linie 1 zunächst mit VillinCreERT2
Mäusen verpaart (El Marjou et al, 2004). Diese exprimieren mittels Villin Promoter
gewebespezifisch im Darm (und auch in der Niere) ein Fusionsmolekül aus Cre
Rekombinase
und
modifizierter
Ligandenbindedomäne
des
humanen
Östrogenrezeptors (CreERT2), welches über den synthetischen Östrogenantagonisten
Tamoxifen, nicht aber durch den natürlichen Liganden 17-β-Östradiol, exogen
aktivierbar ist. Um Cre Aktivität im Darm zu induzieren, wurde bitransgenen
Mäusen an fünf aufeinander folgenden Tagen jeweils 1 mg Tamoxifen injiziert (in
100 µl autoklaviertem Sonnenblumenöl). Nach Anbindung des Liganden Tamoxifen
an das CreERT2-Fusionsmolekül transloziert dieses in den Zellkern und führt durch
Exzision der CMV/EGFP/Stop-Kassette zur Expression der shRNA in den
Darmzellen. Während der anschließenden Induktion einer experimentellen Colitis
wurde die Tamoxifeninjektion beibehalten, um die sich schnell erneuernden
115
Ergebnisse
____________________________________________________________________
Darmzellen zur Expression der shRNA zu stimulieren. Die Induktion von Colitis
ulcerosa erfolgte wie beschrieben (2.2.30). Endoskopische Untersuchungen wurden
3 und 5 Wochen nach Beginn der Induktion und freundlicherweise von Alexej
Nikolaev und Dr. Christof Becker (I Med Klinik, Arbeitsgruppe Prof. Neurath,
Universität Mainz) an einem speziellen Miniendoskop (Coloview) durchgeführt. Als
Kontrolle wurden Tiere des gleichen genetischen Hintergrundes untersucht, die mit
Ausnahme
der
Tamoxifeninjektion
gleich
behandelt
worden
waren.
Die
endoskopische Analyse erfolgte unter Berücksichtigung von Tumorbildung und
Entzündungsstatus nach vorgegebenen Kriterien (Becker et al, 2005). Der so
genannte tumour score ergab sich aus Anzahl und Größe der Tumore, wobei die
Größe Werte von 1 (gerade detektierbar), 2 (nimmt 1/8 des Darmdurchmessers ein),
3 (nimmt 1/4 des Darmdurchmessers ein), 4 (nimmt bis zur Hälfte des
Darmdurchmessers ein), bis 5 (der Tumor nimmt mehr als die Hälfte des
Darmdurchmessers ein) erreichen konnte. Der Entzündungsstatus oder colitis score
ergab sich aus Wertung verschiedener Parameter: Dicke der Darmmukosa, vaskuläre
Veränderungen, Vorhandensein von Fibrin, Granularität der Mukosaoberfläche und
Konsistenz des Stuhls (beurteilt mit Werten zwischen 0 und 3). Durch Addition
ergab sich für den colitis score ein Gesamtwert, mit Hilfe dessen Aussagen über den
Grad der Entzündung des Darmepithels gemacht werden konnten.
Tumor score (nach 3 Wochen):
15359 15357 15360 15284 15287 15285 15358 15283
- Tam - Tam - Tam + Tam + Tam + Tam + Tam + Tam
6x2
1x2
3x2
Tumor
0
0
0
1x2
5x2
2x1
1x1
2x1
(Anzahl x Größe)
0
0
0
2
10
14
3
8
Summe
Maus
Tabelle 3.1: Bewertung der Tumore im Darmepithel der Dsg 2 knock down/VillinCreERT2
Mäuse nach Colitis-Induktion
-Tam ohne Tamoxifen, + Tam mit Tamoxifen
116
Ergebnisse
____________________________________________________________________
Colitis score (nach 3 Wochen):
Maus
Mukosadicke
Granularität
Fibrin
Vaskularität
Stuhl
Summe
15359 15357 15360 15284 15287 15285 15358 15283
- Tam - Tam - Tam + Tam + Tam + Tam + Tam + Tam
0-1
1
0-1
1-2
2-3
2
1-2
2
1
1
0
2-3
3
3
1-2
2-3
1
1
1
1-2
2-3
3
1-2
2
1
1
0-1
2
2
2-3
1-2
2
0
0
0
1
3
2
0
1
3,5
4
2
8,5
13
12,5
6
9,5
Tabelle 3.2: Bewertung der Entzündung der Darmmukosa in Dsg 2 knock down/VillinCre ERT2
Mäusen nach Colitis-Induktion
- Tam ohne Tamoxifen, + Tam mit Tamoxifen
Die beiden Tabellen (Tabelle 3.1 und 3.2) geben die für tumour score und colitis
score erhaltenen Untersuchungswerte für drei Kontrollmäuse (ohne Tamoxifen, Tam) sowie fünf Tamoxifen-induzierte (und damit die Dsg 2 shRNA exprimierende)
Mäuse (+ Tam) an. In den untersuchten Kontrollmäusen konnten bei der ersten
Endoskopie (drei Wochen nach AOM-Injektion) keine Tumore festgestellt werden.
Aufgrund der Induktion von Colitis ulcerosa mit Azoxymethan (AOM) und
Dextransodiumsulfat (DSS, siehe dazu auch 2.2.30) kam es in den Kontrollmäusen
zur Entzündung der Darmmukosa, welche sich zum Zeitpunkt der ersten Endoskopie
bereits im verheilenden Stadium befand. Die Entzündungswerte der Kontrollmäuse
lagen zu diesem Zeitpunkt zwischen zwei und vier. Bei den mit Tamoxifen
behandelten Mäusen konnten bereits drei Wochen nach Colitis-Induktion Tumore der
Größe 1 und 2 detektiert werden. Aufgrund der Anzahl der Tumore im Darmepithel
ergaben sich Werte von 2 bis 8 beim tumour score. Aussehen und der Stand der
Entzündung der Darmmukosa in den Dsg 2 shRNA exprimierenden Mäusen zeigte
schon 3 Wochen nach der Induktion drastische Unterschiede zu der Kontrollgruppe.
In Abbildung 3.27 sind Aufnahmen während der Endoskopie 3 und 5 Wochen nach
AOM-Injektion dargestellt. Man konnte deutliche Unterschiede in der Morphologie
des Darmepithels erkennen. In den mit Tamoxifen behandelten Tieren war eine
Verdickung der Mukosa festzustellen. Nicht mit Tamoxifen induzierte Tiere zeigten
ein dünnwandiges, mit vielen Blutgefäßen durchzogenes Darmgewebe. In der
zweiten endoskopischen Untersuchung zeigte sich, dass es aufgrund der Behandlung
mit AOM, einem Tumor-inducer, auch in den Kontrollmäusen zur Ausbildung von
Tumoren gekommen war. Diese unterschieden sich jedoch in Anzahl und Größe
deutlich von den in Dsg 2 shRNA exprimierenden Mäusen detektierten Tumoren. In
den Kontrolltieren waren fünf Wochen nach AOM-Injektion nur wenige Tumore der
117
Ergebnisse
____________________________________________________________________
Größe 1 und 2 zu finden, während die Ausprägung der Tumore in den Dsg 2 shRNA
Mäusen mit der Zeit fort schritt, was beim Vergleich der Aufnahme nach 3 und 5
Wochen auffällt. In der zweiten Untersuchung der Tamoxifen-induzierten Tiere
stiegen Frequenz und Größe der Tumore (Tumorgröße 3 und 4) im Vergleich mit
dem ersten Untersuchungsergebnis. Das Wachstum der Tumore in den induzierten
Tieren gestaltete sich eher flächig als polypartig. Aufgrund dieser dramatischen
Unterschiede in den die Dsg 2 siRNA bildenden Mäuse ist ein Zusammenhang von
Dsg 2 Expression und entzündlicher Darmerkrankung mit assoziierter Induktion von
Tumoren zu postulieren.
Abb. 3.27: Endoskopische Untersuchung der Dsg 2 knock down/VillinCreERT2 Mäuse nach
Induktion von Colitis ulcerosa
Bei bitransgenen Dsg 2 knock down/VillinCreERT2 Mäusen wurde durch Gabe von Azoxymethan
(AOM) und Dextransodiumsulfat Colitis ulcerosa induziert. Die endoskopische Untersuchung
erfolgte 3 (links) und 5 (rechts) Wochen nach Injektion von AOM. Die jeweils oberen Aufnahmen
zeigen den Darm der nicht mit Tamoxifen behandelten Kontrollmäuse. Darunter sind Bilder des
Darms der Dsg 2 shRNA exprimierenden Mäuse zu sehen.
118
Diskussion
____________________________________________________________________
4 Diskussion
4.1 Induzierbare Expression der Cre Rekombinase in den peripheren Geweben
der Rosa26CreERT2 Mauslinie
Rekombination ist ein die DNA betreffender Prozess, der durch spezialisierte
Enzyme (Rekombinasen) katalysiert wird. Durch Spaltung und Neuverknüpfung von
DNA wird genetische Diversität und Reparatur von Mutationen ermöglicht. Viele zu
Laborzwecken verwendete Rekombinasen stammen aus Bakteriophagen und binden
an konservierte DNA Erkennungssequenzen. Ein häufig verwendetes Cre
(cyclisation rekombination) Rekombinationssystem leitet sich vom Bakteriophagen
P1 ab. Dabei katalysiert Cre die Rekombination zwischen zwei loxP (locus of X-over
of P1) Erkennungssequenzen, welche je aus einem zentralen Basenoktamer, flankiert
von zwei palindromischen Sequenzen von 13 bp Länge, bestehen (Hamilton und
Abremski, 1984). Je nach Orientierung des zentralen Elements kommt es zu
Exzision/Integration oder Inversion von zwischen den loxP sites liegenden
Sequenzen. Da dieses System sowohl in eukaryotischen Zellen als auch im
Tiermodell funktioniert (Sauer und Henderson, 1988; Lakso et al, 1992), wird es in
der medizinischen Grundlagenforschung zahlreich eingesetzt (Chang et al, 2004;
Kemp et al, 2004; Ouvrard-Pascaud et al, 2002; Schwenk et al, 1998; Silver und
Livingston, 2001). Für die Funktionalität des Systems sind normalerweise zwei
transgene Mäuse notwendig. Eine trägt das mit loxP Elementen flankierte Transgen
(so genannter „Reporter“), die andere exprimiert Cre Rekombinase. Durch
Verpaarung der Tiere kommt es in den Nachkommen zur Rekombination zwischen
den loxP Erkennungssequenzen. Werden für die Expression der Rekombinase Zeitoder Gewebe-spezifische Promotoren verwendet, so findet die Rekombination
während eines bestimmten Zeitpunkts der Entwicklung oder nur in bestimmten
Organen statt (Indra et al, 1999; Lakso et al, 1992; Utomo et al, 1999). Dieser
Vorteil des Systems ist gleichzeitig auch ein Nachteil, da für die jeweilige
Anwendung die entsprechenden Cre exprimierenden Mauslinien zu Verfügung
stehen
müssen.
Durch
Fusion
der
Cre
Rekombinase
mit
modifizierten
Hormonrezeptoren kann das System zusätzlich schaltbar gemacht werden (Brake et
al, 2004; Brocard et al, 1998; Feil et al, 1996; Kellendonk et al, 1999; Metzger und
Chambon, 2001; Vasiokhin, 1999). Dies ist vor allem dann sinnvoll und auch
119
Diskussion
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notwendig, wenn das Gen, welches durch knock out oder knock down untersucht
werden soll, embryonal letal ist.
Die im Rahmen dieser Doktorarbeit analysierte Rosa26CreERT2 Maus wurde
generiert, um die Cre Rekombinase temporär kontrolliert und ubiquitär zu
exprimieren. Dazu wurde ein modifizierter Östrogenrezeptor (ERT2) mit Cre
Rekombinase des Bakteriophagen P1 fusioniert und in den Rosa26 Lokus der Maus
eingebracht (knock in). Für den Rosa26 Lokus ist ubiquitäre und moderate
Expression von Transgenen beschrieben (Soriano, 1999). Das ERT2 Molekül bewirkt,
dass die mit ihm fusionierte Cre Rekombinase erst nach Induktion, das heißt durch
Bindung des synthetischen Liganden Tamoxifen, in den Zellkern transloziert und die
Rekombination zwischen den loxP sites katalysiert (Feil et al, 1997; Indra et al,
1999). Dadurch wird die Aktivität der Cre Rekombinase zeitlich regulierbar.
Durch Verpaarung der Rosa26CreERT2 Tiere mit so genannten „Reportermäusen“
(R26R und RAGE) wurde die Expression der Cre Rekombinase nach Induktion mit
Tamoxifen in verschiedenen Organen und Zelltypen untersucht. Bitransgenen
Rosa26CreERT2/R26R Mäusen wurde für 5 oder 10 Tage je 1 mg Tamoxifen
intraperitoneal injiziert (siehe dazu 2.2.27) und diese 5 oder 15 Tage nach der letzten
Injektion analysiert, wozu Kryostatschnitte der Organe angefertigt und diese mit XGal gefärbt wurden. In den Zellen, in welchen Cre Rekombination stattgefunden
hatte, kam es zu einer Blaufärbung. Dabei war eine starke Variation im Anteil der βGalaktosidase exprimierenden, blauen Zellen in verschiedenen Organen zu
beobachten (Abb. 3.4). In Niere, Blase, Magen und Muskel konnten nur wenige, in
Zunge, Luftröhre und Herz deutlich mehr blaue Zellen detektiert werden. Am
effizientesten war die Rekombination in Haut, Leber, Dünn- und Dickdarm. Dort
exprimierten über 30 % der Zellen β-Galaktosidase. Wurde die Analyse 15 Tage
nach der fünftägigen Tamoxifenbehandlung durchgeführt, kam es in einigen Organen
zum Anstieg des Anteils blauer Zellen (Luftröhre, Herz, Niere, Blase und Magen).
Eine länger andauernde Behandlung mit dem Liganden führte zu keinem
signifikanten Anstieg der β-Galaktosidase exprimierenden Zellpopulation. Das
Fehlen von blauen Zellen im Gehirn deutete auf fehlende Rekombination in diesem
Organ hin. Verursacht werden könnte dies durch zu geringe Konzentrationen von
Tamoxifen oder ungenügende Expression des CreERT2 Fusionsmoleküls. Um zu
prüfen, ob die Rekombinase im Gehirn exprimiert wird, wurden Western Blots
durchgeführt. Hier konnte das 74 kDa große Fusionsprotein in allen untersuchten
120
Diskussion
____________________________________________________________________
Organen mit Ausnahme des Gehirns detektiert werden. Das fehlen von X-Gal
positiven Zellen im Gehirn ist damit auf fehlende oder ungenügende Expression von
CreERT2 zurückzuführen. Für eine ähnliche knock in Maus wurde Expression in dem
betreffenden Organ beschrieben (Seibler et al, 2003). Unzureichende Mengen
Tamoxifen im Gehirn kann als Verursacher der fehlenden Rekombination
ausgeschlossen werden, da beschrieben wurde, dass Tamoxifen im Gehirn zu
Aktivierung von Cre und damit zu Rekombination führen kann (Casanova et al,
2002). Die hier erhaltenen Daten zeigen, dass mit der Rosa26CreERT2 Mauslinie
Rekombination in allen peripheren Organen erreicht werden kann. Die Expression im
Gehirn fehlt aber oder ist zu gering, um sie mit den verwendeten Methoden zu
detektieren.
Weitere Analyse der Rosa26CreERT2 Maus durch Verpaarung mit RAGE Mäusen
zeigte unterschiedlich starke Aktivierung der Cre Rekombinase in verschiedenen
Blutzellpopulationen. Zudem wurde mit Hilfe des FACS eine sehr geringe
Hintergrundaktivität der Cre Rekombinase in Abwesenheit des Liganden detektiert
(0,01-0,15 % in Blutzellen). Eine Kontamination der Kontrolltiere mit Tamoxifen
konnte ausgeschlossen werden, da die Tiere während der Behandlungszeit in
getrennten Käfigen gehalten wurden. Da in einer FACS-Analyse wesentlich mehr
Zellen untersucht werden und diese Methode vergleichsweise sehr sensitiv ist,
können hier auch sehr kleine, das Reportergen exprimierende Zellpopulationen
detektiert werden, was bei einem Gewebeschnitt nicht der Fall ist. Zellen mit
Basalaktivität der Rekombinase werden bei einem Schnitt nur per Zufall detektiert,
was die Tatsache erklärt, dass bei Analyse der Organe mittels X-Gal Färbung keine
blauen Zellen in den Kontrolltieren zu sehen waren. Die unterschiedliche
Aktivierung der Cre Rekombinase in den verschiedenen hämatopoietischen Linien,
und dem daraus resultierenden Anteil an Reportergen-exprimierenden Zellen, ist
wahrscheinlich mit dem ungleichen Umsatz der einzelnen Zellen zu erklären (turn
over). Auch spielt der Zeitpunkt der Tamoxifeninjektion in Zusammenhang mit dem
jeweiligen Differenzierungsstatus der Zelle eine Rolle. Eine noch nicht ganz gereifte,
sich häufig teilende Blutzelle gibt den rekombinierten Lokus an alle aus ihr
hervorgehenden Zellen weiter, während eine differenzierte, sich nicht mehr teilende
Effektorzelle dies nicht tut. Zudem ist Rekombination ein stochastisches Ereignis. Es
findet nicht in allen Zellen zum selben Zeitpunkt statt, was auch die durch X-Gal
Färbung erhaltenen Daten belegten (Abb. 3.4).
121
Diskussion
____________________________________________________________________
Weiterhin wurde untersucht, ob sich die Rosa26CreERT2 Mauslinie für
Untersuchungen von Genen eignet, die in der frühen Ontogenese eine Rolle spielen.
Durch Verpaarung mit den Reporterlinien und Injektion von Tamoxifen an Tag E7,5
und E10,5 der Tragezeit konnten zwei Tage später die potenziell bitransgenen Tiere
auf Cre Rekombination untersucht werden. Dazu wurden die an E9,5 und E12
präparierten Embryonen in einem Versuchsansatz fixiert und mit X-Gal gefärbt. In
doppelt transgenen Tieren war eine starke Blaufärbung im gesamten Embryo zu
sehen (Abb. 3.9). Dies zeigt, dass durch Injektion von 1 mg Tamoxifen in das
Muttertier die Aktivität des ERT2 Fusionsmoleküls induziert und die Rekombination
im Nukleus katalysiert wird. Damit ist die Anwendung dieses Systems bereits in
frühen Entwicklungsstadien möglich. Die starke und über den gesamten Embryo
verteilte β-Galaktosidase-Aktivität bereits 2 Tage nach der Injektion des Liganden,
ermöglicht eine Induktion in allen Geweben des Embryos und eine kurz darauf
folgende Analyse eines Phänotyps. Untersuchung der Cre Rekombination im
Embryo mittels RAGE Reportermäusen führte in der FACS-Analyse zu 24,5 % das
Reportergen exprimierenden Zellen. Dieser Unterschied zu der kompletten
Blaufärbung und damit auf Rekombination in jeder Zelle hindeutenden Ergebnis mit
der R26R Maus könnte in der Reportermaus bzw. in den verschiedenen
Reportergenen (β-Galaktosidase und EGFP) begründet sein, deren Expression
wiederum von dem jeweiligen genetischen Lokus, in dem sie liegen (ROSA26 Lokus
und RAGE Lokus), abhängt. Auch ohne Induktion mit Tamoxifen wurden mittels
FACS 0,07 % EGFP-exprimierende Zellen in E12 Rosa26CreERT2/RAGE
Embryonen gemessen. Einzeltransgene RAGE Embryonen lieferten jedoch keine
grünen Zellen (Abb. 3.10). Zum einen bestätigt dies vorangegangene Versuche der
Arbeitsgruppe in Zusammenhang mit der RAGE Mauslinie, die auch dort keine
Hintergrundaktivität zeigte. Des Weiteren korrelieren diese Ergebnisse mit der
bereits in den Blutzellen detektierten geringen Aktivität des Fusionsmoleküls in
Abwesenheit des Liganden. Die hier gezeigte unerwünschte Hintergrundaktivität
ohne Induktion hat für alle Versuchsreihen, welche eine stringente Kontrolle der
Rekombinationsaktivität erfordern, eine Verschiebung der Nulllinie zur Folge und
kann dadurch möglicherweise die Interpretation von geringen Effekten erschweren.
Die Rosa26CreERT2 Maus zeigte induzierbare Rekombination in allen untersuchten
peripheren Geweben. Dadurch können auch Gene untersucht werden, die ansonsten
zu embryonaler Letalität führen. Rekombination konnte bereits in Embryonalstadien
122
Diskussion
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induziert werden, wodurch die Analyse von Genen möglich wird, die zu frühen
Entwicklungsvorgängen
beitragen.
Die
geringen
Mengen
an
aktiver
Cre
Rekombinase ohne Tamoxifen von bis zu 0,15 % grenzen die Anwendbarkeit im
Hinblick beispielsweise auf Krebs-Mausmodelle ein, da in Krebsstudien das Ziel ist,
Ätiologie und Verlauf der Krankheit zu simulieren, und daher die Einführung
beispielsweise einer Mutation, zu einem bestimmten Zeitpunkt erfolgen muss, um
die sich entwickelnde Pathologie dokumentieren zu können. Die sporadische
Rekombination ohne Induktion könnte durch hohe Expressionslevels des
Fusionsmoleküls CreERT2 erklärt werden. Bereits publizierte Mausmodelle für
Tamoxifen-induzierbare Cre Rekombination zeigten ähnliche Hintergrundaktivitäten
(Hayashi und McMahon, 2002; Vooijs et al, 2001). Durch Kombination eines
gewebespezifischen Promoters und induzierbarer Cre Rekombinase können zwar
Rekombinationsereignisse ohne Induktion vermindert oder beseitigt werden, die
Rekombination ist aber auf die Organe beschränkt, in denen der gewählte Promoter
aktiv ist (Casanova et al, 2002; Kemp et al, 2004). Eine weitere Limitation des
Rosa26CreERT2 Systems liegt in der Effizienz der Rekombination. Partielle Exzision
eines Transgens erschwert die Analyse von Phänotypen, da nicht alle Zellen eines
Gewebes oder eines Zelltyps erfolgreich rekombiniert haben. So entstehen MosaikGewebe mit unterschiedlichem Anteil an Wildtyp-Zellen, deren Interpretation sich
schwierig gestaltet. In anderen Tiermodellen, in denen Cre/ER-Fusionsmoleküle zur
induzierbaren
Rekombination
zwischen
loxP-sites
führen
sollten,
wurden
vergleichbare Probleme in der Effizienz der Rekombination beobachtet (Casanova et
al, 2002; Guo et al, 2002; Hayashi und McMahon, 2002; Kemp et al, 2004; Schwenk
et al, 1998). Im Vergleich mit nativer Cre Rekombinase zeigte ein CreERTFusionsmolekül reduzierte Rekombinationseffizienz (Kemp et al, 2004). Bisher ist
kein Mausmodell publiziert, in dem induzierbare ubiquitäre Cre Rekombination ohne
Hintergrundaktivität möglich ist, und in dem es nicht zu mosaikartiger Aktivität der
Cre Rekombinase kommt. Die hier beschriebene mosaikartige Rekombination in
peripheren Geweben mit der Rosa26CreERT2 Maus kann hilfreich für die Analyse
von partiellen Phänotypen sein, welche bei kompletter Deletion letal wären.
123
Diskussion
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4.2 Verschiedene siRNA Sequenzen führen auf RNA- und Proteinebene zu
unterschiedlich effizientem knock down von Dsg 2 unter Anwendung des
Expressionsvektors pTEREGFP
Der von van de Wetering und Kollegen generierte Expressionsvektor pTEREGFP
ermöglicht über Doxyzyklin induzierbare Expression einer shRNA (van de Wetering
et al, 2003). In der hier vorliegenden Arbeit wurde der pTEREGFP Vektor dazu
verwendet, drei unterschiedliche gegen Desmoglein 2 gerichtete shRNAs auf ihre
knock down Effizienz zu testen. Dabei wurde auf die Schaltbarkeit des Systems
verzichtet,
und
das
dafür
notwendige
Repressormolekül
in
den
Zellkulturexperimenten nicht eingesetzt. Die Auswahl der siRNA Sequenzen richtete
sich nach den bis zu diesem Zeitpunkt bekannten Kriterien. Die synthetischen
shRNA Oligonukleotide bestehend aus Sequenzen für siRNA, loop und
Klonierungsstelle, wurden zunächst in den Expressionsvektor eingebracht. Um zu
testen, wie effizient der knock down auf RNA Ebene ist, wurden murine Dsg 2
exprimierende EpH4 Zellen transient mit den drei hergestellten shRNA Vektoren
transfiziert. Da das Plasmid zusätzlich zur shRNA EGFP (enhanced green
fluorescent protein) exprimiert, konnten 48 Stunden nach der Transfektion grüne, mit
dem Vektor transfizierte und damit die shRNA exprimierende Zellen mittels FACS
sortiert, und so von den nicht-transfizierten Zellen getrennt werden. Aus den so
gewonnenen Zellpopulationen wurde RNA extrahiert und Northern Blots
durchgeführt, welche mit einer Dsg 2 und einer GAPDH Sonde inkubiert wurden.
Das Ergebnis aus diesen Versuchen zeigte, dass es durch Expression der drei
shRNAs zu einer Reduktion der Dsg 2 mRNA um 24 % bei shRNA1, 40,1 % bei
shRNA2 und 34 % bei shRNA3 kam. Diese deutliche Verminderung der Ziel-mRNA
konnte bereits 48 Stunden nach transienter Transfektion erreicht werden. Ob
verminderte mRNA Menge auch nach 48 Stunden zu reduzierten Proteinlevels
führte, wurde in einem zweiten Versuch getestet. Dazu wurden aus den FACSsortierten EpH4 Zellen Proteinextrakte hergestellt und diese in Western Blots
analysiert. Mit dem gewählten Versuchsansatz konnten keine Unterschiede in den
Dsg 2 Proteinmengen zwischen grünen und nicht EGFP-exprimierenden Zellen
detektiert werden. Auch hier wurde eine transiente Transfektion durchgeführt und die
Zellen 48 Stunden später für die FACS-Analyse geerntet. Daher liegt der Verdacht
nahe, dass die Ursache in der Stabilität des Dsg 2 Proteins zu suchen ist. Bereits
124
Diskussion
____________________________________________________________________
vorhandenes Dsg 2 Protein wurde wahrscheinlich in einer Versuchszeit von 48
Stunden nicht abgebaut, so dass reduzierte mRNA Mengen, welche verminderte
Proteinmengen nach sich ziehen sollten, keinen unmittelbaren Einfluss auf den
Protein „steady state“ hatte. Daher wurde versucht, die Zellen stabil mit den shRNA
Vektoren zu transfizieren, um durch ständige Expression der shRNA einen
möglichen Einfluss auf die Proteinmengen messen zu können. Die murinen
Epithelzellen EpH4 benötigten zur Transfektion besondere Bedingungen (maximal
40 % Konfluenz zum Zeitpunkt der Transfektion) und es konnte nur durch
Verwendung von Lipofectamine2000 eine erfolgreiche Transfektion von bis zu 40 %
erreicht werden. Leider war es nicht möglich, innerhalb der veranschlagten Zeit
stabile Klone zu generieren. Zum einen war ein sortieren der EGFP-positiven Klone
kurz nach der Transfektion oder picken von Einzelklonen nicht möglich, da die
Zellen ohne Verbindungen zu anderen Zellen starben, was bereits durch zu dünnes
Aussäen hervorgerufen wurde. Zudem verloren die Zellen nach wenigen Tagen im
Selektionsmedium die Fluoreszenz, so dass eine Expression der shRNA nicht mehr
nachvollzogen, und grüne Einzelklone auch nicht in untransfizierte Zellrasen
eingebracht werden konnten, und so ein sterben der Zellen verhindert werden könnte.
Um trotzdem den Einfluss der shRNA Expression auf die Proteinmenge messen zu
können, wurden Zellen, welche normalerweise kein Dsg 2 bilden, mit gleichen
Mengen Dsg 2 Expressionsvektor und unterschiedlichen Mengen der drei shRNA
Plasmide co-transfiziert und die daraus gewonnenen Proteinextrakte im Western Blot
analysiert. Mit Hilfe dieses Versuchsansatzes war es möglich, Reduktionen in der
Dsg 2 Proteinmenge aufgrund der shRNA Expression zu detektieren. Des weiteren
wurde deutlich, dass die verschiedenen, ausgewählten siRNA Sequenzen zu
unterschiedlich starkem knock down von Dsg 2 Protein führten. ShRNA1 mit
Zielsequenz in Exon 4 der Dsg 2 mRNA führte kaum zum knock down von Dsg 2.
Mit Unterschied zu shRNA1 führte Expression von shRNA2 und 3 zu drastischer
Reduktion der Dsg 2 Proteinmenge. Mit abnehmender Konzentration des shRNA
Vektors nahm im Fall der shRNA2 die Dsg 2 Proteinmenge wieder minimal zu. Bei
shRNA3 konnte auch bei einer Konzentration von 0,5 µg transfiziertem shRNA
Expressionsplasmid kein Dsg 2 Protein detektiert werden. Beide den shRNAs
zugrunde liegenden siRNA Zielsequenzen liegen in Exon 9 der Dsg 2 mRNA. Für
die Funktionalität einer shRNA spielen Stabilität und dreidimensionale Struktur von
125
Diskussion
____________________________________________________________________
shRNA und mRNA eine Rolle (Qiu et al, 2005; Schwarz et al, 2003; Tomari und
Zamore, 2005).
Die hier in der Zellkultur erhaltenen Ergebnisse zeigen den knock down von Dsg 2
auf Proteinebene. Dies wurde durch transiente co-Transfektion eines Dsg 2
Expressionsvektors und den drei shRNA Plasmiden erreicht. Durch gleichzeitiges
Einbringen von mRNA und shRNA in eine Zelle konnte die auf RNA-Ebene
detektierte Herunterregulation von Dsg 2 mRNA in den konstitutiv Dsg 2
exprimierenden EpH4 Zellen auch auf Proteinebene bei transienten coTransfektionen nachgewiesen werden. Verwendung eines shRNA Vektors, welcher
nicht gegen Dsg 2 sondern gegen SCL (stem cell leucemia) gerichtet war, führte in
der co-Transfektion nicht zu verminderten Dsg 2 Proteinmengen. Die Stärke der
Bande auf dem Western Blot war nicht von der durch Transfektion mit Dsg 2
Plasmid allein transfizierten Zellen zu unterscheiden (Abb. 3.16). Dadurch wurde
gezeigt, dass die reduzierte Dsg 2 Proteinmenge durch sequenzspezifischen Abbau
der Dsg 2 mRNA hervorgerufen wurde.
4.3 Durch Verwendung des Expressionsvektors pSico kann Dsg 2 Cre/loxinduzierbar herunterreguliert werden
Ziel der Doktorarbeit war es, die Funktion von Dsg 2 mit Hilfe eines induzierbaren
siRNA Mausmodells zu untersuchen. Um ein schaltbares System zu generieren,
welches später in der Maus Anwendung finden konnte, wurde die siRNA2 Sequenz
in einen Cre/lox-induzierbaren shRNA Expressionsvektor einkloniert (pSico;
Ventura et al, 2004). Mit Hilfe dieses Vektors ist die Expression der shRNA zeitlich
exogen regulierbar. Der pSico Expressionsvektor besitzt modifizierte loxP sites, die
im Bereich des Polymerase III U6 Promoters und vor der shRNA Sequenz liegen,
und eine Stop-Kassette, bestehend aus CMV Promoter und EGFP Sequenz,
flankieren. So wird zunächst zwar EGFP exprimiert, was die Detektion der den
Vektor tragenden Zellen ermöglicht, aber die Produktion der siRNA ist aufgrund der
zwischen U6 Promoter und shRNA liegenden CMV/EGFP/Stop-Kassette blockiert.
Erst durch Aktivierung/Expression von Cre Rekombinase wird die Rekombination
zwischen den loxP sites katalysiert, wodurch die Stop-Kassette entfernt und die
shRNA exprimiert werden kann. Dieses System eignet sich gut für die Anwendung
126
Diskussion
____________________________________________________________________
in der Maus, da bereits mehrere transgene Mauslinien existieren, welche Cre exogen
induzierbar exprimieren (Casanova et al, 2002; Hayashi und MacMahon, 2002;
Kellendonk et al, 1999; El Marjou et al, 2004; Metzger und Chambon, 2001). Für
den knock down mittels pSico wurde die siRNA2 mit der Zielsequenz in Exon9/1
gewählt. Zum einen lieferte sie in den transienten Zellkulturversuchen einen
reproduzierbaren und effizienten knock down sowohl auf RNA als auch auf
Proteinebene. Im pSico Vektor wird die shRNA mittels U6 Promoter exprimiert. Für
die Expression einer funktionellen shRNA, die in der Zelle zur siRNA prozessiert
wird, sollte die Wildtyp-Struktur des Promoters erhalten bleiben (Pebernard und
Iggo, 2004; Tuschl, 2002; Yu et al, 2002). Das +1 Nukleotid ist in diesem Fall
Guanin. Da die Sequenz der siRNA2 mit Guanin beginnt, schafft dies ideale
Vorraussetzungen für eine funktionelle siRNA und damit für den in vivo knock down
von Dsg 2. Nach Integration des Dsg 2 shRNA Oligonukleotids in den
Expressionsvektor pSico (siehe dazu 2.2.11 und 2.2.12) wurde dieser in der
Zellkultur getestet, bevor es zur Generierung transgener knock down Mäuse kam. Der
Vektor wurde zur Deletion der CMV/EGFP/Stop-Kassette in Cre exprimierende
Bakterien transfiziert (294-Cre; Buchholz et al, 1996) und die daraus gewonnene
DNA in transienten Transfektionsexperimenten genutzt. Durch co-Transfektion der
verschiedenen pSico Plasmide zusammen mit dem Dsg 2 Expressionsvektor konnte
auch hier die knock down Effizienz auf Proteinebene mittels Western Blot getestet
werden. Diese Versuche zeigten eine drastische Reduktion des Dsg 2 Proteins nach
Deletion der CMV/EGFP/Stop-Kassette (Abb. 3.19). Der pSico Vektor ohne Dsg 2
shRNA und der pSico Vektor mit CMV/EGFP/Stop-Kassette hingegen führen in
keinem Fall zu verminderten Dsg 2 Proteinmengen. Diese Versuchsergebnisse
zeigten, dass die Sequenz der shRNA 2 auch in dem Cre/lox-induzierbaren
Vektorsystem zu sequenzspezifischem Abbau der Dsg 2 mRNA und damit zu
verminderten, in den Western Blot Experimenten nicht mehr detektierbaren Mengen
von Dsg 2 Protein führen.
127
Diskussion
____________________________________________________________________
4.4 Durch Mikroinjektion des pSicopInsu Dsg 2 shRNA Konstrukts werden
induzierbare Dsg 2 knock down Mäuse generiert
Da die Integration eines Transgens bei der Generierung transgener Mäuse
stochastisch erfolgt, wird die Expression des Transgens nicht nur durch den
jeweiligen Promoter bestimmt, sondern auch von umgebenden DNA-Elementen wie
Enhancern oder Silencern beeinflusst. Um die Expression der Dsg 2 shRNA
weitgehend unabhängig gegenüber solchen Sequenzen zu machen, wurde der für die
Expression der Dsg 2 shRNA notwendige Bereich des pSico Vektors in einen
Plasmid mit humanen MAR (martrix attachment region)-Sequenzen subkloniert.
Diese ursprünglich aus dem humanen Globingenlokus stammenden Sequenzen
gehören zur Gruppe der Insulatoren. Sie grenzen das Transgen gegen die umgebende
Chromatinstruktur weitgehend ab und ermöglichen damit eine vom Integrationsort
unabhängige Funktionsweise (Fleenor et al, 1993; Fukumura et al, 1998). Nach
erfolgreicher Klonierung der shRNA Expressionskassette in den Vektor mit
Insulatorsequenzen wurde die DNA des Plasmids linearisiert und für die
Mikroinjektion vorbereitet. Die gereinigte DNA wurde in den männlichen Vorkern
befruchteter Eizellen mikroinjiziert und diese anschließend in scheinschwangere
Mäuse transferiert. Die nach etwa 20 Tagen Tragezeit geborenen Nachkommen
wurden mittels PCR genotypisiert und Ohrbiopsien der Mäuse für die
Fluoreszenzanalyse genommen, um die Expression des Reportergens EGFP, welches
in der CMV/EGFP/Stop-Kassette liegt, zu überprüfen. In drei der 69 Founder-Tiere
wurde die Integration des pSicopInsu Dsg 2 shRNA Plasmids per PCR nachgewiesen
und grüne Fluoreszenz in den Ohrbiopsien detektiert. Da ein Tier nach wenigen
Wochen starb, blieben zwei Founder-Tiere und damit zwei Mauslinien für die
Analyse. Mikroinjektion des Dsg 2 knock down Plasmids führte damit zu
erfolgreicher Integration in das Mausgenom. Aufgrund der im Foundertier
detektierten grünen Fluoreszenz kann gefolgert werden, dass zum einen die
Expression des Transgens nicht durch die umgebende Chromatinstruktur reprimiert
wurde und deshalb wahrscheinlich auch die shRNA nach erfolgter Cre
Rekombination exprimiert werden kann. Ohne Cre Rekombination kam es nicht zur
Expression der shRNA, da die positiv für das Transgen getesteten Tiere kein
verändertes Aussehen im Vergleich mit Geschwistertieren zeigten und die F1
128
Diskussion
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Generationen eine normale Mendel´sche Verteilungsfrequenz für das Transgen
zeigte.
4.5 Behandlung mit Tamoxifen führt in doppelt transgenen pSicopInsu Dsg 2
shRNA/Rosa26CreERT2 Mäusen zum knock down von Dsg 2
Um die shRNA zu exprimieren, ist die durch Cre Rekombinase katalysierte
Rekombination zwischen den loxP Elementen nötig. Da das Abschalten von Dsg 2
embryonal letal ist (Eshkind et al, 2002), wollten wir die Aktivität der Cre
Rekombinase zudem zeitlich regulieren. Zur induzierbaren Expression der shRNA
wurden die Dsg 2 knock down Mäuse mit den Tamoxifen induzierbaren
Rosa26CreERT2 Tieren verpaart. Diese exprimieren in peripheren Organen ein
Fusionmolekül (bestehend aus modifizierter Ligandenbindedomäne des humanen
Östrogenrezeptors und Cre Rekombinase), welches nach Bindung von Tamoxifen in
den Zellkern transloziert und dort zur Rekombination zwischen loxP sites führt.
Dadurch wird die CMV/EGFP/Stop-Kassette des Transgens entfernt, die shRNA
codierenden Sequenz kommt in physische Nähe des U6 Promoters, und wird
transkribiert. Dazu wurden bitransgene pSicopInsu Dsg 2 shRNA/Rosa26CreERT2
Mäuse wiederholt für fünf aufeinander folgende Tage mit Tamoxifen behandelt
(siehe dazu 2.2.27), um in möglichst vielen Zellen Cre Rekombinase zu aktivieren
und damit die Produktion der shRNA zu induzieren. Nach vier bis fünf
Behandlungszyklen wurden die Gewebe entnommen und Proteinextrakte daraus
hergestellt, welche im Western Blot auf Dsg 2 Expression untersucht wurden. Zur
Kontrolle auf adäquate Proteinmengen in den aufgetragenen Proben wurden die
Membranen zusätzlich mit einem Antikörper behandelt, welcher gegen ein
endogenes Gen gerichtet ist (p38 Kinase). Als Vergleichswert für die Dsg 2
Proteinmengen ohne induzierten knock down wurde für jedes Organ Proteinextrakt
von Öl-behandelten, doppelt transgenen Mäusen parallel mitgeführt. Beide Linien
zeigten nach Tamoxifen-Behandlung in den untersuchten Geweben (Leber, Darm,
Niere, Haut und Herz) verschieden starke knock down Effizienz (Abb. 3.25), was mit
den aus Untersuchung der Rosa26CreERT2 Maus gewonnenen Daten korrelierte,
welche starke Zelltyp-spezifische Unterschiede der Reportergeninduktion zeigten
(Abb. 3.4, Abb. 3.7 und Abb. 3.8). Nur durch Translokation des Fusionsmoleküls in
129
Diskussion
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den Zellkern und die durch Cre katalysierte Rekombination zwischen den loxP sites
kann die shRNA exprimiert und eine Reduktion der Dsg 2 Proteinmenge erreicht
werden.
Die knock down Tiere der Linie 1 zeigten erkennbare Verminderung der Dsg 2
Proteinmenge in der Leber. Linie 2 zeigte in diesem Organ kaum Unterschiede in der
Dsg 2 Expression, verglichen mit dem Proteinextrakt der Kontrolltiere. In der Niere
ist für beide Linien keine Reduktion in der Dsg 2 Proteinmenge festzustellen. Sowohl
in der Niere als auch der Leber wurde bei der Charakterisierung der Rosa26CreERT2
Maus mosaikartige Aktivität der Cre Rekombinase in etwa 10-15 % der Zellen
detektiert. Damit ist in 85-90 % der Zellen dieser Gewebe Cre nicht aktiv, so dass es
dort nicht zu ausreichender Expression der shRNA kommt und sich die Mengen an
Dsg 2 mRNA und Protein damit nicht signifikant veränderten. In der Haut kommt es
bei beiden Dsg 2 knock down Linien zu geringer Verminderung der Dsg 2
Proteinmenge. Aufgrund der im Vergleich mit anderen Geweben relativ starken βGalaktosidasefärbung der Haut in Rosa26CreERT2/R26R Tieren konnte auf hohe
Aktivität der Cre Rekombinase in diesem Gewebe geschlossen werden. In der Haut
werden neben Dsg 2 auch alle anderen Desmogleine zu unterschiedlichen Anteilen in
den verschiedenen Schichten der Epidermis exprimiert (siehe dazu Abb. 1.2). Daher
war die Haut als Zielorgan für einen möglichen Phänotyp durch Dsg 2 knock down
eher zweitrangig. Es kann vermutet werden, dass bei geringen Abweichungen in den
Proteinmengen die Funktion von Dsg 2 in der Haut von einem anderen Desmoglein,
beispielsweise Dsg 3, welches in den unteren Schichten der Epidermis exprimiert
wird, übernommen oder zumindest ausgeglichen wird. Anders gestaltet sich es bei
Organen, in denen Dsg 2 das einzige exprimierte Desmoglein ist, z.B. Darm und
Herz. Für Linie 1 ist im Western Blot eine drastische Reduktion, für Linie 2 eine
geringere Verminderung, in den Dsg 2 Proteinmengen aus Extrakten von Darm und
Herz zu sehen (Abb. 3.25). In diesen Organen konnte gleichfalls bei der
Charakterisierung der Rosa26CreERT2 Maus in Verbindung mit X-Gal-Färbung eine
starke Cre Aktivität festgestellt werden (siehe Abb. 3.4). Es liegt deshalb nahe, dass
in Herz und Darm die Exzision der CMV/EGFP/Stop-Kassette und damit die
Expression der Dsg 2 shRNA signifikant war. Diese wiederum reduzierte dort die
Dsg 2 Proteinmengen. Die hier dargestellten Western Blot Ergebnisse zeigten
deutlich, dass es durch Expression der Dsg 2 shRNA zu verminderten Dsg 2
Proteinmengen in Herz, Darm und auch in der Leber kommt. Die mit Öl anstelle von
130
Diskussion
____________________________________________________________________
Tamoxifen behandelten Kontrolltiere zeigen dagegen normale Expression des
Proteins (Abb. 3.25). In den beiden generierten knock down Linien kam es zu
unterschiedlich starker Herunterregulation von Dsg 2. Dies könnte mit dem
Integrationsort des Transgens auf der DNA zusammenhängen, der trotz den
Insulatorelementen, die das Transgen umgeben, Einfluss auf die Expressionsstärke
ausüben könnte.
Um weiteren Einblick in die durch Dsg 2 knock down ausgelösten Veränderungen
auf zellulärer Ebene zu bekommen, wurden Immunfärbungen der Leber von
Tamoxifen-behandelten
pSicopInsu
Dsg
2
shRNA/Rosa26CreERT2
Mäusen
durchgeführt. Die Kryostatschnitte wurden mit einem gegen Dsg 1 und 2 gerichteten
Antikörper behandelt und zeigen die Desmosomen als punktartige Strukturen an den
Zellgrenzen benachbarter Zellen. Im Vergleich mit einer Wildtyp Maus wurden in
der Dsg 2 knock down Maus (Linie 1) weniger Desmosomen gebildet (Abb. 3.26).
Dies bestätigt die Ergebnisse der Western Blots und zeigt zudem, dass verminderte
Dsg 2 Proteinmengen, hervorgerufen durch die Expression einer sequenzspezifischen
siRNA, in reduzierter Anzahl an Desmosomen resultieren. Der Begriff der Reduktion
in Zusammenhang mit der Aktivität der siRNA wurde bewusst gewählt, da RNA
Interferenz eher zu einer Herunterregulation als einem „Ausschalten“ des
Zielproteins führt (Shi, 2002). Bei der Bewertung des Phänotyps muss diese Tatsache
beachtet werden. Durch geringere Ausbildung von Desmosomen sollte sich der
Kontakt zwischen den Zellen lockern und zu Verminderung der Gewebestabilität
führen. Bei Verwendung der Rosa26CreERT2 Maus als Cre Deleter Mauslinie kann
nicht in allen Zellen eines Gewebes die shRNA exprimiert werden, da die Aktivität
der Cre Rekombinase mosaikartig ist und so in verschiedenen Geweben
unterschiedlich stark wirkt. In vielen Zellen wird somit Dsg 2 mRNA nicht abgebaut,
so dass weiterhin ausreichend Desmosomen gebildet werden, welche die
benachbarten Zellen eines Gewebes verknüpfen und durch Verankerung mit den
Intermediärfilamenten Gewebestabilität vermitteln. Mit diesem Versuchsansatz
konnte trotz der gewählten Deleterlinie und der damit verbundenen Limitationen
gezeigt werden, dass Expression der Dsg 2 shRNA zu Reduktion von Dsg 2 Protein
und verminderter Desmosomenanzahl führt. Ein offensichtlicher Phänotyp war
allerdings mit diesem Ansatz bisher nicht zu detektieren. Daher wurden Dsg 2 knock
down Mäuse für eine weitere Analyse mit den VillinCreERT2 Mäusen verpaart,
131
Diskussion
____________________________________________________________________
welche induzierbar spezifisch im Darm Cre Rekombinase exprimieren, und so eine
gezielte Analyse eines denkbaren Phänotyps ermöglichen.
4.6 Tamoxifen-behandelte pSicopInsu Dsg 2 shRNA/VillinCreERT2 Mäuse
zeigen nach Induktion von Colitis ulcerosa Entzündungen und Tumore im
Darm
Da gezeigt werden konnte, das die Dsg 2 Proteinmengen in Dsg 2 knock down
Mäusen reduziert und weniger Desmosomen zwischen den Zellen gebildet werden,
wurde eine erste funktionale Untersuchung der pSicopInsu Dsg 2 shRNA Mäuse
durch Induktion der chronischen und entzündlichen Darmerkrankung Colitis
ulcerosa durchgeführt. Fukushima und Kollegen fanden eine Deregulation von Dsg 2
in Patienten mit Colitis ulcerosa (Fukushima et al, 2003), was Hinweis auf eine
mögliche Rolle von Dsg 2 bei dieser Erkrankung gab. Um eine gezielte Reduktion
von Dsg 2 spezifisch nur in dem die Krankheit betreffenden Organ (Darm) zu
erzielen, und damit Sekundäreffekte, hervorgerufen durch knock down von Dsg 2 in
nicht-Darmzellen, zu vermeiden, wurden die Dsg 2 knock down Mäuse zunächst mit
VillinCreERT2 Mäusen verpaart, die im Darm Tamoxifen induzierbar Cre
Rekombinase exprimieren (El Marjou et al, 2004). Die bitransgenen Mäuse wurden
für fünf aufeinander folgende Tage mit Tamoxifen behandelt (siehe 2.2.27), um Cre
zu aktivieren und so die Expression der Dsg 2 shRNA zu stimulieren. Colitis
ulcerosa wurde anschließend durch einmalige Injektion von Azoxymethan (AOM,
7,4 mg/kg) gefolgt von einer Woche mit 3 % Dextransodiumsulfat (DSS) im
Trinkwasser, induziert. Zwei und vier Wochen später erfolgten die endoskopischen
Untersuchungen. Als Kontrolle waren doppelt transgene Mäuse mit Öl anstelle von
Tamoxifen behandelt und im Parallelversuch für die Colitis-Induktion verwendet
worden. Bereits drei Wochen nach AOM-Injektion war ein deutlicher Unterschied in
der Morphologie der Darmmukosa im Vergleich der Tamoxifen induzierten Mäuse
zur Kontrollgruppe zu erkennen. Die Tamoxifen-behandelten und damit die Dsg 2
shRNA exprimierenden Mäuse bildeten flächig wachsende Tumore in einer
entzündeten Epithelumgebung. Die Darmmukosa war verdickt und das Wachstum
der Tumore schritt mit der Zeit fort, was die spätere endoskopische Untersuchung (5
Wochen nach AOM-Injektion) zeigt. Bei den Kontrolltieren wurden erst in der
132
Diskussion
____________________________________________________________________
zweiten endoskopischen Untersuchung Tumore geringer Größe detektiert, die zudem
seltener auftaten als die Tumore der Dsg 2 shRNA exprimierenden Mäuse. Die
induzierte Entzündung befand sich bei den Kontrolltieren 3 Wochen nach AOMInjektion in einer abheilenden Phase. Die Darmmukosa dieser Tiere war dünnwandig
und mit vielen Blutgefäßen durchzogen (Abb. 3.27). Tumorbildung und
Entzündungsstatus des Darmgewebes wurden nach vorgegebenen Kriterien bewertet
(Becker et al, 2005) und für die erste endoskopische Untersuchung dokumentiert.
Der tumour score, welcher Anzahl und Größe der detektierten Tumore wiedergibt,
lag in den Kontrolltieren bei null, da zu diesem Zeitpunkt keine Tumore gewachsen
waren. Im Gegensatz dazu entstanden bei Dsg 2 shRNA produzierenden Tieren
Tumore der Größe 1 (gerade detektierbar) und 2 (nimmt 1/8 des Darmvolumens ein)
in unterschiedlicher Anzahl. Der Entzündungstatus, welcher als colitis score
bezeichnet wird, ergab sich durch Bewertung von Dicke der Darmmukosa,
vaskulären
Veränderungen,
Vorhandensein
von
Fibrin,
Granularität
der
Mukosaoberfläche und Konsistenz des Stuhls. Der daraus resultierende Gesamtwert
des colitis score war Maß für den Stand der Entzündung des Darmepithels. Die
bereits verheilende Entzündung des Darmgewebes der Kontrollmäuse ergab Werte
zwischen 2 und 4 während die der Tamoxifen-induzierten zwischen 6 und 13 lag.
Diese Werte, zusammen mit den endoskopischen Bildern, zeigten eindeutig, das es in
Dsg 2 knock down Mäusen bereits nach einmaliger Induktion von Colitis ulcerosa zu
starken Entzündungsreaktionen im Darm und Ausbildung von Tumoren kommt.
Die flächige Ausbreitung der Tumore könnte durch verminderte Zelladhäsion und
Gewebestabilität ausgelöst werden, die durch verringerte Desmosomenbildung
resultierend aus dem knock down von Dsg 2 entsteht, und Hyperproliferation nach
sich ziehen könnte. In Zellkulturversuchen konnte gezeigt werden, dass Transfektion
von desmosomalen Komponenten (Dsg, Dsc und PG) in nicht-adhärente Fibroblasten
diese an Invasion auf dem Kollagengel hinderte (Tselepis et al, 1998). Des Weiteren
wurde verminderte Desmosomenbildung bei schuppigen Zellkarzinomen (Davies et
al, 1999; Garrod, 1995; Hardman et al, 2005), Deregulation der Expression von Dsg
2 in Zusammenhang mit Magenkarzinomen (Biedermann et al, 2005), und fehlende
Dsg 2 Expression in Mammakarzinomen beobachtet (Davies et al, 1997). Diese
Ergebnisse deuten alle auf eine Metastasen-Suppressor-Funktion desmosomaler
Komponenten hin. Fehlende Desmosomenbildung, und damit Verlust der
Zelladhäsion
sowie
der
Zell-Zell-Kontakte,
könnten
daher
in
direktem
133
Diskussion
____________________________________________________________________
Zusammenhang
mit
Metastasierung
und
Ausbildung
von
Tumoren
(Hyperproliferation) stehen.
Die Entzündung des Darmgewebes wird wahrscheinlich durch eindringende
Bakterien verstärkt, welche die Epithelbarriere durch verminderte Zelladhäsion
durchdringen können. In weiteren Experimenten sollten nun die Ursachen von
Tumorbildung und Entzündung im Detail betrachtet und Folgen des Dsg 2 knock
downs genau analysiert werden.
Das Ergebnis dieser Versuchsreihe zeigt nicht nur erstmals den ursächlichen
Zusammenhang zwischen Dsg 2 Expression und Colitis ulcerosa/Colitis ulcerosainduzierter Tumorbildung, sondern ist das erste experimentelle Modell, welches die
Colitis ulcerosa-assoziierte Tumorinduktion im Menschen, und was hier besonders
interessant ist, den flachzellig wachsenden Tumortyp, in einem konditionalen
Tiermodell rekapituliert.
Es ist zu erwarten, dass das im Rahmen dieser Doktorarbeit entwickelte Tiermodell
in Zukunft viele wichtige Erkenntnisse über die Pathologie von Darmtumoren liefern
wird und so unser Verständnis der Colitis-induzierten Tumorentstehung wesentlich
verbessert wird.
134
Zusammenfassung
____________________________________________________________________
5 Zusammenfassung
Desmosomen sind hoch organisierte adhäsive interzelluläre Verbindungen, die
benachbarte Zellen durch Verankerung mit den Intermediärfilamenten des
Zytoskeletts miteinander verknüpfen und so Zellen und Geweben Stabilität
verleihen. Die Adhäsionsmoleküle der Desmosomen sind die desmosomalen
Cadherine. Diese transmembranen Glykoproteine gehen im Interzellulärraum
Verbindungen mit den desmosomalen Cadherinen der Nachbarzelle ein und sind im
zytoplasmatischen
Bereich
Anheftungspunkte
für
weitere
an
der
Desmosomenbildung beteiligte Proteine.
Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Rolle von Desmoglein 2 (Dsg 2), einem
in allen Epithelien exprimierten desmosomalen Cadherin. Da der konstitutive knock
out von Dsg 2 embryonal letal ist, wurde im Rahmen dieser Doktorarbeit eine
transgene Maus generiert, in der die Reduktion von Dsg 2 temporär regulierbar war
(konditionaler knock down). Dazu wurde der Mechanismus der RNA Interferenz
genutzt, wodurch Sequenz-spezifische, post-transkriptionelle Regulation von Genen
möglich ist. Unter Verwendung eines über Cre/lox-induzierbaren Vektors wurden
transgene Mäuse generiert, welche nach Induktion Dsg 2 shRNA exprimieren, die in
der Zelle in siRNA umgewandelt wird und zum Abbau der Dsg 2 mRNA führt.
Durch Verpaarung der generierten Dsg 2 knock down Maus mit der über Tamoxifen
induzierbaren Cre Deleter knock in Mauslinie Rosa26CreERT2 konnte deutliche
Reduktion der Dsg 2 Proteinmenge in Leber, Darm und Herz erreicht werden. In
Immunfärbungen der Leber wurde zudem eine reduzierte Desmosomenbildung durch
Expression der Dsg 2 shRNA detektiert. Die für diese Versuche generierte und
getestete Rosa26CreERT2 Mauslinie ermöglichte jedoch nicht in allen Zellen eines
Gewebes die komplette Aktivierung der Cre Rekombinase und damit die Expression
der shRNA. Dadurch entstanden mosaikartige Wildtyp/knock down-Gewebe, in
denen noch ausreichend Desmosomen gebildet wurden, um die Gewebestabilität und
-struktur zu erhalten.
Für eine funktionale Untersuchung von Dsg 2 in Zusammenhang mit der chronisch
entzündlichen Darmerkrankung Colitis ulcerosa wurden die Dsg 2 knock down
Mäuse mit Darm-spezifischen, induzierbaren Cre Deleter Mäusen (VillinCreERT2)
verpaart. Nach Aktivierung der Cre Rekombinase mittels Tamoxifen wurde in
bitransgenen Tieren über Gabe von Azoxymethan (AOM) und Dextransodiumsulfat
135
Zusammenfassung
____________________________________________________________________
(DSS) Colitis ulcerosa induziert. Diese entzündliche Erkrankung des Darms ist mit
der Induktion von Darmtumoren assoziiert. Bereits nach einmaliger Induktion mit
AOM/DSS wurde in der ersten endoskopischen Untersuchung eine starke
Entzündung des Darmgewebes und die Ausbildung von flächig wachsenden
Tumoren in den Dsg 2 knock down Tieren hervorgerufen. In den Kontrolltieren
wurden erst zu einem späteren Zeitpunkt Tumore geringerer Größe und Frequenz
beobachtet. Es ist anzunehmen, dass durch knock down von Dsg 2, und die damit
verbundene verminderte Desmosomenbildung und Zelladhäsion, Infiltration von
Bakterien durch die epitheliale Barriere des Darms möglich war, und so die
Entzündungsreaktion in der Darmmukosa verstärkte. In Zusammenhang mit Verlust
der
epithelialen
Festigkeit
durch
verringerte
Zellkontakte
kam
es
zur
Hyperproliferation der Darmmukosa, die sich in Ausbildung von flächigen Tumoren
äußerte. In weiteren Experimenten müssen nun die Tumore und das entzündete
Gewebe der Colitis-induzierten Mäuse mittels Immunfluoreszenz untersucht werden,
um Veränderungen in der Desmosomenformation in situ detektieren zu können. Des
Weiteren sind Verpaarungen der Dsg 2 knock down Maus mit anderen Cre
Rekombinase exprimierenden Mauslinien möglich, um den Einfluss von Dsg 2 auch
in anderen Geweben, beispielsweise im Herzen, zu untersuchen.
Die hier vorgelegte Arbeit zeigt also erstmalig den ursächlichen Zusammenhang
zwischen Dsg 2 und dem Auftreten von Colitis-assoziierten Tumoren in einem
konditionalen RNAi-vermittelten knock down Tiermodell. Die Etablierung dieser
Maus ist somit das erste konditionale Mausmodell, welches die bei vielen
Krebspatienten gefundenen flachzellig wachsenden Tumore in vivo rekapituliert.
Vorausschauend kann man sagen, dass mit Hilfe des im Rahmen dieser Doktorarbeit
entwickelten Tiermodells wichtige Erkenntnisses über die Pathologie von
Darmtumoren erbracht werden können, die unser Verständnis der Colitis-induzierten
Tumorentstehung verbessern.
136
Zusammenfassung
____________________________________________________________________
Summary
Desmosomes are highly organised inter-cellular adhesion junctions that connect
neighbouring cells with each other and also provide additional mechanical
reinforcement to the cell by anchoring the intermediate filaments of the cytoskeleton
to the plasma membrane. The adhesion function of desmosomes is accomplished by
the desmosomal cadherin molecules, transmembrane glycoproteins that interact
through their extra-cellular domain with desmosomal cadherins of adjacent cells and
through their inter-cellular domain with other desmosomal proteins.
As the desmosomal cadherin desmoglein 2 (Dsg 2), which is expressed in all
epithelial cells, is embryonically lethal in knock out mice, the aim of this project was
to generate transgenic knock down mice where the knock down of Dsg 2 is inducible
(conditional knock down). To this end, the elegant method of RNA interference
(RNAi) was used. RNAi allows for sequence specific and post-transcriptional downregulation of protein expression. Employing a Cre/lox-inducible vector system, the
transcribed shRNA specific for Dsg 2 will be processed to siRNA by the mouse cells
and this will lead to the degradation of Dsg 2 mRNA and finally to a decrease in Dsg
2 protein level. We therefore generated a transgenic Dsg 2 siRNA mouse. The
transcription of Dsg 2 specific shRNA was switched on by crossing the transgenic
Dsg 2 shRNA mice with the Tamoxifen inducible Cre deleter knock in mouse-line
Rosa26CreERT2. The double-transgenic offspring showed significant decrease in the
Dsg 2 protein levels in the liver, colon and heart. Although it was not possible to
generate mice that expressed the Dsg 2 shRNA in all the cells of the organ by
crossing with the Rosa26CreERT2 mice, mosaic wild-type/knock down tissue was
observed, the liver of the offspring mice did show reduced desmosome formation as
determined by immuno-fluorescence.
To determine the consequences of specifically knocking down Dsg 2 in connection
with the inflammatory bowel disease Colitis ulcerosa, the transgenic Dsg 2 shRNA
mouse was crossed with a colon-specific inducible Cre deleter mouse
(VillinCreERT2). Following activation of Cre recombinase by Tamoxifen-injection,
Colitis ulcerosa, which is associated with colon tumour formation, was induced in
double-transgenic mice via azoxymethane (AOM)/dextran sulphate sodium (DSS). A
single induction with AOM/DSS in the double-transgenic mice led to a strong
inflammatory response in the intestine as well as the formation of intestinal tumours
137
Zusammenfassung
____________________________________________________________________
in Dsg 2 shRNA expressing mice. In control mice, tumour formation following
AOM/DSS induction was observed in the second round of colonscopy, with less big
and less frequent tumours. The inflammation observed in the shRNA expressing
mice can be explained by the decrease in the desmosomal adhesion function, bacteria
can infiltrate the intestine tissue via the epithelial barrier and this will lead to
inflammation. The increased tumour incidence can be explained via the decrease in
cell contact inhibition, which might lead to hyper-proliferation of the colon mucosa,
thereby, leading to plane tumours.
In future studies, the tumour and inflammatory tissue of the double-transgenic mice
specific for colon Dsg 2 knock down can be examined by immuno-histochemistry,
which should lead to a further understanding of how changes in desmosome
formation in situ contributes to these conditions. Furthermore, crossing the
transgenic Dsg 2 siRNA mouse with Cre recombination mice specific for other organ
tissue knock down can teach us about the function of desmosomes in these tissues,
for example in the heart.
This thesis shows, for the first time, the connection between Dsg 2 and the
occurrence of Colitis-associated tumours. In order to show this, a novel mouse model
was established, which is the first conditional mouse model where the tumour
formation seen in many cancer patients is mirrored in an in vivo animal system. It is
envisioned that this in vivo model will be used in future for answering questions
relating to colon tumour pathology and to improve our knowledge of Colitis-induced
tumour formation.
138
____________________________________________________________________
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Ich versichere hiermit, die vorliegende Arbeit selbständig durchgeführt und verfasst
zu haben, und dass außer den angegebenen Quellen und Hilfsmitteln keine weiteren
zur Anwendung kamen.
Dorothe Hameyer

1184 - Johannes Gutenberg

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