Dissertation Scherf - TiHo Bibliothek elib

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Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchungen zum Einfluß einer Maedi-Infektion auf die
Funktion und die Morphologie der Lungen verschiedener
Schafrassen
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
-Doctor medicinae veterinariae(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Claudia Scherf
Berlin
Hannover 2010
Wissenschaftliche Betreuung:
Univ.-Prof. Dr. M. Ganter
Klinik für kleine Klauentiere und
Forensische Medizin und Ambulatorische
Klinik, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachter:
Prof. Dr. M. Ganter
2. Gutachter:
Prof. Dr. M. Hewicker-Trautwein
Tag der mündlichen Prüfung: 04.10.2010
Meiner Oma
Was wären wir ohne sie
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................7
1
Einleitung................................................................................................... 9
2
Literaturübersicht ................................................................................... 11
2.1
Maedi.......................................................................................................... 11
Einführung ......................................................................................................... 11
Ätiologie des Maedi-Visna-Virus (MVV)............................................................. 11
Pathogenese und Epidemiologie....................................................................... 12
Zielgewebe ........................................................................................................ 18
Klinische Maedisymptome................................................................................. 18
Pathologie ......................................................................................................... 20
Rassedisposition ............................................................................................... 21
Diagnostik und Nachweisverfahren ................................................................... 23
Sanierungsmöglichkeiten .................................................................................. 31
3
Material und Methoden........................................................................... 33
3.1
Tiere ........................................................................................................... 33
3.2
Auswahlkriterien ......................................................................................... 34
3.3
Klinische Untersuchung .............................................................................. 34
3.4
Röntgenologische Untersuchung des Thorax............................................. 35
3.5
Hämatologische Untersuchung................................................................... 37
3.6
Blutgasanalyse ........................................................................................... 38
3.7
Bronchoalveoläre Lavage (BAL) ................................................................. 38
3.8
Serologische Untersuchung........................................................................ 42
3.9
Virusnachweis............................................................................................. 42
3.10 Parasitologische Kotuntersuchung ............................................................. 47
3.11 Postmortale Untersuchungen ..................................................................... 47
3.12 Statistik ....................................................................................................... 49
4
Ergebnisse............................................................................................... 50
4.1
Auswahlkriterien ......................................................................................... 50
4.2
Klinische Befunde ....................................................................................... 52
Inhaltsverzeichnis
4.3
Röntgenologische Befunde......................................................................... 53
4.4
Hämatologische Befunde............................................................................ 55
4.5
Blutgase...................................................................................................... 56
4.6
Bronchoskopische Befunde ........................................................................ 61
4.7
Zytologische Befunde der bronchoalveolären Lavage ................................ 61
4.8
Lymphozytensubsets .................................................................................. 63
4.9
Serologische und molekularbiologische Befunde ....................................... 70
4.10 Postmortale Befunde .................................................................................. 71
4.11 Beziehungen zwischen den Röngenscoresummen und den
Lungengewichten........................................................................................ 75
5
Diskussion ............................................................................................... 77
5.1
Etablierung einer MVV-PCR ....................................................................... 78
5.2
Auswahl der Versuchstiere ......................................................................... 79
5.3
Klinische Untersuchung .............................................................................. 80
5.4
Blutgase...................................................................................................... 82
5.5
Röntgenuntersuchung Thorax .................................................................... 83
5.6
Hämatologische Untersuchungen............................................................... 85
5.7
Zytologische Untersuchung der BALF ........................................................ 85
5.8
Lymphozytensubsets .................................................................................. 87
5.9
Pathologische Untersuchungen .................................................................. 89
6
Schlussfolgerungen und Bewertung der Methodik............................. 91
7
Zusammenfassung ................................................................................. 94
8
Summary.................................................................................................. 98
9
Literaturverzeichnis.............................................................................. 101
10 Anhang................................................................................................... 117
Materialien....................................................................................................... 117
Abbildungsverzeichnis..................................................................................... 120
Tabellenverzeichnis......................................................................................... 122
Abkürzungsverzeichnis
∆A-aO2
Alveoloarterielle Sauerstoffdruckdifferenz
ad. us.vet.
zum Gebrauch in der Veterinärmedizin
AG
Aktiengesellschaft
AGIDT
Agargelimmunodiffusionstest
AIDS
Aquired Immune Deficiency Syndrome
BAL
Bronchoalveoläre Lavage
BALF
Bronchoalveoläre Lavage-Flüssigkeit
BALT
Bronchusassoziiertes lymphatisches Gewebe
BE
Base excess
BHM
Blackheaded Mutton
bidest.
bidestillata
bp
Basenpaare
CAEV
Caprines Arthritis Encephalitis Virus
CD
Cluster of Differentiation
dest.
destillata
diNaEDTA
Di-Natrium-EDTA
DNAse
Desoxyribonuklease
DNS
Desoxyribonukleinsäure
dNTP
Desoxyribonukleotidtriphosphat
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
eitr.
eitrig
ELISA
enzyme-linked immunosorbant assay
et al.
et alii
ggf.
gegebenenfalls
ggr.
geringgradig
HCO3
Bikarbonat
hgr.
hochgradig
HIV
Human Immunodeficiency Virus
hn
heminested
i.v.
intravenös
JSRV
Jaagsiekte Retrovirus
Kat.-eitr.
katarrhalisch-eitrig
KG
Körpergewicht
Ln.med.caud.
Lymphonodus mediastinalis caudalis
Ln.
Lymphonodus
LTR
long terminal repeat
Max.
Maximum
mgr.
mittelgradig
MHC
Major Histocompatibility Complex
Min.
Minimum
MVV
Maedi-Visna-Virus
n
Anzahl
NaCl
Natriumchlorid
o.b.B.
ohne besonderen Befund
OD
optische Dichte
Orf
open reading frame
PBS
phosphate buffered saline
pCO2
Kohlendioxidpartialdruck
PCR
Polymerasekettenreaktion
PMEA
Phosphonylmetoxyethyladenin
pO2
Sauerstoffpartialdruck
RNS
Ribonukleinsäure
RNAse
Ribonuklease
RT-PCR
PCR nach reverser Transkription
SD
Standardabweichung
SKF
Schwarzköpfiges Fleischschaf
Skg
SKF Maedi negativ
Skk
SKF Maedi positiv
Taq
Thermus aquaticus
TBE
Tris-Borat-EDTA
TE
Tris-EDTA
Texelg
Texelschafe Maedi negativ
Texelk
Texelschafe Maedi positiv
UV
ultraviolett
ZNS
Zentrales Nervensystem
Einleitung
1
Einleitung
Maedi-Visna-Virus-Infektionen verursachen weltweit aufgrund von Pneumonien und
Mastitiden hohe wirtschaftliche Verluste. Primäre Manifestation einer Maediinfektion
sind Lungenveränderungen in Form von interstitiellen Pneumonien mit Hyperplasie
des bronchusassoziierten lymphatischen Gewebes (BALT). Die Milchproduktion ist
aufgrund von Mastitiden vermindert, die somatische Zellzahl ist erhöht und der
Fettgehalt sinkt, da die erhöhte Atemfrequenz einen erhöhten Energieumsatz bei
verringerter Futteraufnahme zur Folge hat. Im Endstadium kommt es bei einigen
Rassen zu starken Gewichtsverlusten, bei trächtigen Tieren zu Aborten oder zur
Geburt unterentwickelter Lämmer (CHRISTODOULOPOULOS 2006).
Sechs bis acht Monate nach Auftreten der ersten klinischen Symptome können die
Tiere an Anorexie oder durch das Auftreten von bakteriellen Sekundärinfektionen
sterben (DE MARTINI et al. 2000).
Verschiedene Studien an reinrassigen und gekreuzten Schafen zeigten deutliche
Rasseempfindlichkeiten gegenüber der Erkrankung und weniger gegenüber der
Infektion (BRODIE et al. 1998; STRAUB 2004; ZINK et al. 1994). In den letzten
Jahren
gewannen
Untersuchungsverfahren,
welche
Veränderungen
des
Lungengewebes am lebenden Versuchstier qualitativ und quantitativ beschreiben,
immer mehr an Bedeutung (GANTER 1996; SCOTT u. GESSERT 1996).
Ziel dieser Arbeit war es, am lebenden Tier Marker zu finden, die den Grad einer
klinischen Erkrankung an Maedi charakterisieren können. Anhand solcher klinischen
Marker wäre eine züchterische Selektion auf Maedi-Toleranz denkbar. Als Parameter
wurden
die
Lungenauskultationbefunde,
die
zytologischen
Befunde
der
bronchoalveolären Lavage (BAL) incl. der Lymphozytensubsets, die Röntgenbefunde
des Thorax und die arteriellen Blutgaswerte in vivo bestimmt und anschließend mit
den postmortalen pathomorphologischen und histologischen Befunden verglichen.
Zum Nachweis einer Infektion mit dem Maedi-Visna-Virus (MVV) wurden die Tiere
mittels ELISA serologisch auf Antikörper gegen das MVV sowie mittels PCR auf
spezifische Genomabschnitte des MVV untersucht. Die Untersuchungen wurden an
9
Einleitung
Maedi positiven und Maedi negativen Schwarzköpfigen Fleischschafen, die
allgemein als wenig empfänglich gegenüber klinischer Maedi gelten und an Maedi
positiven und Maedi negativen Texelschafen vorgenommen, die als hoch
empfänglich gegenüber Maedi angesehen werden.
10
Literaturübersicht
2
2.1
Literaturübersicht
Maedi
Einführung
Bei Maedi handelt es sich um eine virusinduzierte chronisch progressive interstitielle
Pneumonie des Schafes, die schon 1918 in Holland als Zwoegers beschrieben
wurde (PALSSON 1990). Die Bezeichnung Maedi wurde dieser Erkrankung in Island
gegeben und bedeutet „schwere Atmung“. Maedi wird durch das Maedi-Visna-Virus
(MVV) hervorgerufen, welches zu der Familie der Retroviridae gehört. Weitere
Erkrankungsformen die durch das MVV induziert werden können, sind eine
fortschreitende Encephalomyelitis („Visna“ = „Verfall, Schrumpfung“), interstitielle
Mastitiden und in einzelnen Fällen auch chronisch-nichteitrige Arthritiden.
Seit den 60er Jahren des 20. Jahrhunderts wurde die Infektion in verschiedenen
Ländern nachgewiesen. Bis auf Neuseeland und Australien treten Infektionen mit
dem MVV weltweit auf (DAWSON 1980).
Die Erkrankung ist auch unter den Namen Ovine Progressive Pneumonia (OPP),
Ovine Lentivirus (OvLV), la Bouhite, Graaff-Reinet disease und Zwoegerziekte
bekannt. Aufgrund ihrer Ähnlichkeit hinsichtlich ihrer Genomstruktur, Pathogenität
und ihrer Epidemiologie werden das MVV und das Caprine Arthritis Encephalitis
Virus (CAEV) als Small Ruminant Lentivirus (SRLV) zusammengefaßt.
Ätiologie des Maedi-Visna-Virus (MVV)
Das MVV gehört zur Subfamilie der Lentivirinae. Es ist eng verwandt mit anderen
Lentiviren, wie zum Beispiel dem Caprinen Arthritis Encephalitis Virus (CAEV) der
Ziegen,
dem
Felinen
Immunodeficiency
Virus
(FIV)
und
dem
Human
Immunodeficiency Virus (HIV) (NARAYAN und CLEMENTS 1989). Kreuzinfektionen
von Ziegen mit dem MVV und Schafen mit dem CAEV sind bekannt (PRITCHARD
und DAWSON 2000).
Das MVV ruft eine latente Infektion hervor und wird somit zu den Erregern von
11
Literaturübersicht
Slow-Virus-Diseases gezählt.
Das Genom der Retroviren besteht aus den drei Strukturgenen:
gag - group-specific-antigen, codiert drei Glykoproteine des Prekursors: Capsid p25,
Nucleocapsid p14 und Matrixprotein p17
pol
-
polymerase,
beinhaltet
unter
Anderem
die
Erbinformation
für
die
reverseTranskriptase (VIGNE et al. 1982; BOSGIRAUD et al. 1989), die Integrase,
welche den Einbau der
viralen Doppelstrang-DNS bewirkt und eine dUTPase,
welche wichtig für die
Infektion
der Makrophagen
ist
(DE
LA
CONCHA-
BERMEJILLO 1997; PEPIN et al. 1998) und
env - envelope, codiert zwei Glykoproteine des Virus: das Oberflächenglykoprotein
SU und das glykolisierte transmembrane Protein TM
zusätzliche besteht das Genom aus den drei Regulatorgenen:
tat - transactivation translation
rev - regulator of virion protein expression und
vif - viral infectivity factor, welcher pol und env voneinander trennt (CLEMENTS und
ZINK 1996; PEPIN et al.1998).
Pathogenese und Epidemiologie
Das Virus wird sowohl zellgebunden als auch frei in Flüssigkeiten übertragen.
Hauptansteckungsquellen sind der Respirationstrakt (CUTLIP et al. 1977) über das
Nasensekret und die Milchdrüse via Kolostrum und Milch (PETURSSON et al. 1992)
von infizierten Muttertieren. Die horizontale Übertragung durch das Beweiden der
gleichen Flächen oder eine indirekte Übertragung durch Gegenstände und Personen
konnte nicht nachgewiesen werden (Dawson 1980). Die Übertragung durch
kontaminiertes Trinkwasser wurde beobachtet (SIGURDSSON et al. 1953).
Eine Übertragung durch Insekten und Parasiten wurde bis jetzt nicht beschrieben
und es gibt auch keine epidemiologischen Ereignisse, welche diese als Vektoren in
Betracht ziehen lassen (HOUWERS 1990).
Fälle von iatrogener Übertragung sind nicht bekannt. Eine Übertragung durch
mehrfach genutzte Nadeln beim Impfen ist unwahrscheinlich, da diese Prozedur
meist subcutan erfolgt und das Virus vor allem monozyten- / makrophagenassoziiert
12
Literaturübersicht
vorkommt. Blutprobenentnahmen stellen eine höhere Gefahr dar, wenn auch
geringgradig. Diskutiert wurde auch eine Übertragungsgefahr durch Drenchpistolen,
da an ihnen Speichel haftet und es teilweise zu Verletzungen im Rachenbereich
kommt. Im Allgemeinen ist eine iatrogene Übertragung aber unwahrscheinlich
(HOUWERS 1990).
Die Vermutung, dass es zu einer venerischen Übertragung des MVV durch den
Deckakt oder künstliche Besamung von einem serologisch MVV positiven Bock auf
serologisch MVV negative weibliche Tiere kommt, konnte nicht bestätigt werden
(BLACKLAWS et al. 2004). TRAVASSOS et al. (1998) untersuchten die
Samenflüssigkeit von 6 experimentell infizierten Böcken. Sie fanden des CAEV im
Seminalplasma und in der spermatozoonfreien Zellfraktion bei einem Bock und bei
einem zweiten Bock nur in der spermatozoonfreien Zellfraktion. Ein Jahr später
konnte das Vorhandensein von CAEV-DNS und dem CAEV in diesen beiden
Fraktionen bei 8 von 15 Böcken bestätigt werden (TRAVASSOS et al. 1999). Das
Gleiche wurde auch bei 10 serologisch Maedi positiven Schafböcken beobachtet, die
experimentell mit Brucella ovis infiziert worden waren (PREZIUSO et al. 2003).
Provirale CAEV-DNS konnte nicht in den Spermatozoon nachgewiesen werden
(TRAVASSOS et al. 1999).
Auch DE LA CONCHA-BERMEJILLO et al. (1996) berichten über das seltene
Auftreten von MVV im Sperma von Böcken, die eine sehr hohe Virusmenge in der
Lunge hatten und bei denen es gleichzeitig aufgrund einer Brucella ovis Infektion zu
einer Leukozytospermie gekommen war.
CUTLIP et al. (1981) und BRODIE et al. (1994) berichten von einer vertikalen
intrauterinen Übertragung von der Mutter auf den Foetus. BLACKLAWS et al. (2004)
gehen davon aus, dass bereits 5-10% der Infektionen intrauterin erfolgen. Bei einer
Studie von BRODIE et al. (1994) waren 11% der neugeborenen Lämmer aus einer
Herde mit endemisch auftretenden MVV-Infektionen in der Maedi-PCR positiv.
Die Wahrscheinlichkeit einer Infektion ist in den ersten Lebenswochen am höchsten,
da der enge Kontakt zum Muttertier und das Saugen der Lämmer eine hohe
Aufnahme virushaltiger Sekrete und Exkrete bedingt. ALVAREZ et al. (2005) haben
beobachtet, dass Lämmer, die zwar bei der serologisch positiven Mutter leben, aber
13
Literaturübersicht
bovines Kolostrum bekommen, seltener infiziert werden als Lämmer, die bei ihren
serologisch positiven Müttern Kolostrum und Milch saugen. Lämmer die nach der
Geburt von ihren positiven Müttern isoliert werden und virushaltiges Kolostrum in
großen Mengen bekommen, haben wiederum ein signifikant höheres Risiko sich zu
infizieren als Lämmer, die bei ihren Müttern bleiben und physiologische Mengen
Milch aufnehmen. Wo hierin die Ursache liegt, konnte noch nicht geklärt werden.
Eine Vermutung ist, dass der Speichel antivirale Stoffe enthält, die bei der
Flaschenfütterung
aufgrund
der
geringeren
Speichelproduktion
und
der
mengenmäßig größeren Aufnahme von Kolostrum / Milch pro Fütterung nicht
ausreichend wirken können.
Eine Studie von PREZIUSO et al. (2004) hat die initiale virale Absorption durch die
Apex
der
Villi
der
intestinalen
Epithelzellen
bei
neugeborenen
Lämmern
demonstriert, die mit infiziertem Kolostrum gefüttert wurden. Anschließend erfolgte
die Passage zu den mononukleären Zellen der Lamina propria unter Beteiligung der
ilealen Peyer`schen Platten und der mesenterialen Lymphknoten.
Sind die Tiere entwöhnt, stellt der direkte Kontakt zum Nasensekret eines infizierten
Tieres
oder
die
Aerosolaufnahme
hustender
Virusausscheider
die
Hauptansteckungsquelle dar. Diese aerosole Übertragung führt zu großen
Problemen in Regionen mit Winteraufstallung (HOUWERS 1990).
Nach Übertragung von Viruspartikeln werden diese in die Monozyten aufgenommen
und persistieren dort für eine unbestimmte Zeit als Provirus. Solange die provirale
DNS sich in den Monozyten befindet, ist die Vermehrung der DNS durch einen
transkriptalen Block inhibiert. Da die viralen Proteine somit auch nicht exprimiert
werden, gelangen die infizierten Zellen in die Gewebe, ohne vom Immunsystem
erkannt zu werden. Wenn die Monozyten in das Lymphgewebe des Organes
eindringen, reifen sie zu Makrophagen und der transkriptale Block wird beseitigt. Es
wird vermutet, dass zelluläre Transkriptionsfaktoren an die Bindungsstelle des
Viruspromotors binden und damit die Transkription des Virusgenomes initiieren
(CLEMENTS et al. 1994).
THORMAR (2005) erklären die Latenz und Persistenz der MVV–Infektion dadurch,
dass sich ein Reservoir an infizierten Blut-und Knochenmarkmonozyten bildet,
14
Literaturübersicht
welche in das Zielgewebe einwandern und dort zu Makrophagen reifen. In diesen
Makrophagen erfolgt dann zwar eine provirale DNS-Transkription, aber nur eine
geringe Virusreplikation. Die geringe Virusproduktion im infizierten Gewebe könnte
das langsame Fortschreiten dieser Erkrankung erklären.
Versuche in Island zeigten, dass immunsupprimierte Tiere geringe bis gar keine
Veränderungen im Gehirn nach einer intracerebellären Infektion mit dem MVV
hatten, wobei die Virusreplikation nicht beeinträchtigt wurde. Diese Beobachtung legt
nahe, dass die Veränderungen, zumindest bei Visna, immunvermittelt sind
(NATHANSON et al. 1976; PÉTURSSON et al. 1978).
TORSTEINSDÓTTIR et al. (1992) fanden heraus, dass der Grad der ZNSVeränderungen nach Infektion mit dem MVV eher mit dem Anstieg der
zellvermittelten Immunität, als mit der Bildung virusspezifischer Antikörper korreliert.
Daraus wurde geschlossen, dass die zellvermittelte Immunität eine große Rolle in
der Induktion der pathologischen Veränderungen bei Visna hat und dass die CD8+zytotoxischen T-Lymphozyten wichtige Effektorzellen sind (BLACKLAWS et al.
1994).
Spätere Versuche haben gezeigt, dass schnell replizierende MVV-Stränge stärkere
lymphoproliferative Veränderungen in der Lunge hervorrufen, wie langsamer
replizierende Stränge (LAIRMORE et al. 1987).
Laut WATT et al. (1992) ist bei MVV infizierten Tieren die Zahl der Lymphozyten in
der Lunge, sowohl im bronchusassoziierten lymphatischen Gewebe ( BALT ) wie
auch in den Alveolarsepten erhöht. Vor allem bei den Tieren mit klinischen
respiratorischen Problemen ist die Zahl der CD4+ und der CD8+ T-Zellen in den
Alveolarsepten erhöht. Das Verhältnis CD4+ / CD8+ hingegen unterschied sich nicht
von dem der gesunden Kontrollgruppe.
Im regionalen Lymphgewebe gab es eine erhöhte Anzahl von CD8+ und gammadelta exprimierenden T-Zellen.
WATT et al. (1992) kamen zu der Erkenntnis, dass aktivierte T-Lymphozyten, und
hier vor allem die CD8-Subsets, einen großen Anteil an der Pathogenese der durch
das MVV induzierten Lungen- und Lymphknotenveränderungen haben.
15
Literaturübersicht
Aufgrund solcher Beobachtungen wurde bisher angenommen, dass die CD8+
Lymphozyten durch das Abtöten von infizierten Zellen, die Sekretion von
Inhibitorchemokinen und Cytokinen die Virusladung kontrollieren. Um die Rolle der
CD8+ Lymphozyten zu untersuchen, haben ERIKSON et al. (1999a) Schafe in vivo
CD8+ -supprimiert.
Weder in den Lymphknoten, noch in der efferenten Lymphe konnten Unterschiede in
der Virusreplikation festgestellt werden. Überraschenderweise zeigten diese Tiere
eine normale Induktion von Precursor cytotoxischen T- lymphocyten (pCTL),
während die virusspezifische Proliferationsantwort reduziert war.
Daraus folgerten ERIKSON et al. (1999a), dass noch CD8+ -Zellen verblieben waren
oder dass CD8+ -Zellen keine Relevanz bei der Kontrolle einer primären MVVInfektion haben.
In weiteren in vivo Versuchen von ERIKSON et al. (1999b) bei denen sie CD4+ supprimierte Schafe verwendeten, fanden sie heraus, dass CD4+ Lymphozyten für
die Infektion von Makrophagen benötigt werden, jedoch nicht für die Infektion von
dendritischen Zellen. Diese CD4+ supprimierten Tiere hatten eine signifikant
geringere Anzahl MVV infizierter Zellen in den Lymphknoten und den efferenten
Lymphbahnen, nachdem die von ihnen drainierten Bereiche dem Virus ausgesetzt
wurden.
Im Zuge der Abwesenheit des Virus und dem Mangel an CD4+ -Helferzellen bei
CD4+ supprimierten Tieren ergaben sich folgende Veränderungen :
1. die virusspezifische Immunantwort war reduziert,
2. verringerte Induktion von cytotoxischen T-Zell-Vorläufern,
3. verringertes Auftreten MVV-spezifischer Antikörper.
ZHANG et al. (2000) haben die MVV-DNS Menge in den peripheren Blutmonozyten
(PBM) und in den Alveolarmakrophagen mit Hilfe einer QC-PCR (quantitative
competetive - PCR) gemessen.
Im Gesamtvergleich war die Virus-DNS-Menge in den Alveolarmakrophagen
signifikant höher als die in den PBM. Alveolarmakrophagen sind gegenüber der
DNS-Replikation wesentlich toleranter als PBM. Weiterhin erfolgte ein Vergleich
16
Literaturübersicht
zwischen
Alveolarmakrophagen
seropositiver
Tiere
mit
und
ohne
histopathologischen Lungenveränderungen. Dabei stellte sich heraus, dass die Tiere
mit den histopathologischen Veränderungen signifikant mehr Virus-DNS in ihren
Alveolarmakrophagen hatten als die Vergleichstiere ohne Lungenveränderungen.
Diese Korrelation von MVV-DNS-Menge und Lungenveränderungen lässt vermuten,
dass die Anzahl der infizierten Alveolarmakrophagen eine Schlüsselrolle in der
Pathogenese der interstitiellen Pneumonie spielen. Zu der gleichen Vermutung
kamen auch BRODIE et al. (1992), sie konnten eine Korrelation zwischen der
Virusmenge
in
Lungenmakrophagen
und
dem
Grad
der
Veränderungen
demonstrieren.
Geringe
Virusreplikation in
den Makrophagen
induziert
Entzündungs kaskade
kommt zum
Anstieg der Immunzellen
Anstieg der
Lymphokinproduktion
stimuliert
Immunkomplexe zwischen
viralem Antigen und
Antikörpern
plus
Expression MHC-II-Antigene
Proliferation von B-und CD8+Lymphozyten
ergibt
Schädigung
des
Lungengewebes
Abb. 1: Pathogenese der Schädigung des Lungengewebes nach THORMAR
(2005).
17
Literaturübersicht
Zielgewebe
Die am häufigsten mit dem MVV befallenen Zellen sind die Makrophagen des
Gehirns, der Lunge, des Euters und der Gelenke (EXTRAMIANA et al. 2002). Im
Lymphgewebe MVV infizierter Lungen ist das Virus fast ausschließlich auf
Makrophagen beschränkt, wobei aber nur rund 1% der Makrophagen Virusträger
sind (CLEMENTS und ZINK 1996).
Weiterhin konnte das Virus aus dem Gewebe von Lymphknoten, Milz, Knochenmark
(EXTRAMIANA et al. 2002; PREZIUSO et al. 2003), den Lymphfollikeln des dritten
Augenlides (CAPUCCHIO et al. 2003) und den Nieren (ANGELOPOULOU et al.
2006) isoliert werden.
Laut CARROZZA et al. (2003) werden in der Lunge die Typ I- und Typ IIPneumozyten, Interstitial- und Alveolarmakrophagen, Endothelzellen, Fibroblastenähnliche Zellen und in der Mamma Epithel-, Endothelzellen und Fibroblastenähnliche Zellen infiziert.
Die Tatsache, dass das Virus an eine solche Reihe ganz verschiedener Zellarten
adsorbieren und eindringen kann lässt vermuten, dass die Rezeptoren ganz ordinäre
Zellmembranmoleküle, eventuell Proteine, sind und somit kein determinierender
Faktor für den Zelltropismus. Der Zelltropismus beruht wahrscheinlich eher auf einem
zellspezifischen Replikationsfaktor (AGNARSDÓTTIR et al. 2000).
Trotz intensiver Studien und der Vorreiterrolle der HIV Forschung bei der
Untersuchung von Lentivirusinfektionen konnten die Rezeptoren für die Adsorption
und das Eindringen in die Zelle noch nicht genau identifiziert werden.
Klinische Maedisymptome
Es handelt sich hierbei um eine latente, nichtfebrile Erkrankung mit einer
Prodromalphase von mehreren Monaten bis einigen Jahren. Die Tiere infizieren sich
meist bei der Mutter. Klinisch äußert sich eine Infektion im Endstadium in
Abmagerung trotz guter Futteraufnahme und fortschreitender Dyspnoe (BULGIN
1990). Diese beginnt mit Tachypnoe (40-120 Atemzüge pro Minute), welche anfangs
nur bei verstärkter Bewegung des Tieres auftritt. Im fortgeschrittenen Stadium der
18
Literaturübersicht
Erkrankung bleiben die Tiere hinter der Herde zurück und zeigen bereits in Ruhe
Tachypnoe. Im Endstadium besteht eine kontinuierliche Dyspnoe mit vermehrtem
Einsatz der Abdominalmuskulatur und gelegentlich tritt Maulatmung auf.
Bei trächtigen Tieren kommt es zu Aborten oder zur Geburt unterentwickelter
Lämmer. Die Milchproduktion ist vermindert und der Fettgehalt sinkt durch die
verminderte Nahrungsaufnahme und den erhöhten Energiebedarf durch die
verstärkte Atmung (CHRISTODOULOPOULOS 2006).
Mehr als 60 % der Muttern in MVV-infizierten Milchschafherden haben eine
chronische lymphoide Mastitis mit daraus resultierender verringerter Milchproduktion
(DAWSON 1987) und erhöhter somatischer Zellzahl (CHRISTODOULOPOULOS
2006). Es liegen bilateral diffuse, indolente Indurationen mit teilweise festen Knoten
im ventralen Bereich des Euters vor. Die regionalen Lymphknoten sind geringgradig
vergrößert (VAN DER MOLEN et al. 1985).
Einige Tiere entwickeln eine Lentivirus-assoziierte Arthritis, welche meist 2 – 3 Jahre
post infectionem beginnt und mit geschwollenen Gelenken einhergeht (KENNEDYSTOSKOPF 1989). Die Karpalgelenke sind am häufigsten betroffen (PRITCHARD
und DAWSON 2002).
Die Gelenke sind nicht schmerzhaft, die Gelenkkapsel und die Synovialmembran
sind verdickt, mit einer periartikulären Fibrose. Es treten unterschiedliche
Lahmheitsgrade auf (PALSSON 1990).
Sechs bis acht Monate nach dem Auftreten der ersten klinischen Symptome sterben
die Tiere an Anorexie oder durch auftretende bakterielle Sekundärinfektionen (DE
MARTINI et al. 2000). Diese Sekundärinfektionen werden durch die verringerte
bronchiale Clearance gefördert und sind der Grund dafür, dass es infolge einer
Maedierkrankung oft zu einer sekundären katarrhalisch-eitrigen Bronchopneumonie
mit den entsprechenden klinischen Symptomen kommt (GANTER 1996).
In fortgeschrittenen Fällen wird oft eine hypochromatische Anämie beobachtet.
Weiterhin zeigt sich eine verlängerte Leukozytose vom lymphozytären Typ
(PALSSON 1990).
19
Literaturübersicht
Pathologie
Im
fortgeschrittenen
Stadium
sind
die
Veränderungen
makroskopisch
und
palpatorisch deutlich erkennbar. Das Volumen der Lunge ist stark vergrößert und das
Gewicht kann bis auf das 3,5-fache des Normalgewichtes ansteigen. Nach
CHRISTODOULOPOULOS (2006) gibt es drei Muster für die makroskopisch
sichtbaren Veränderungen.
1. Die Lungen zeigen scharf abgegrenzte verfestigte Bereiche. Diese Bereiche
betreffen den cranialen Teil der caudalen Lobi, die mittleren Lobi und die cranialen
Lobi. Das Gewebe ist gummiartig fest mit grau-blauer oder grau-brauner Farbe. Der
größere Anteil dieser Veränderungen befindet sich dorsocaudal im rechten
Lungenflügel. Schneidet man diese Bereiche transvers an, zeigen sie sich deutlich
abgesetzt vom umliegenden Gewebe. Sie sind kirschrot und es sind diffus verteilte
weiße Knötchen sichtbar mit einem Durchmesser von 1-4 mm.
2. Die Lunge ist im Ganzen vergrößert, die Konsistenz ist gummiartig und die Farbe
ist rosa. Meist sind deutliche Rippenabdrücke zu sehen.
3. Auf der Oberfläche verstreut sind fokale blaß-weiße granuläre Veränderungen
sichtbar. Diese sind meist nur oberflächlich, in wenigen Fällen erstrecken sie sich bis
in das Parenchym. Sie sind meist rund, mit einem Durchmesser von 0,5-8 cm. Die
Lungen sind meist geschwollen.
Die Lungenlymphknoten sind aufgrund einer gesteigerten Produktionsrate und damit
erhöhten Anzahl von B-Zellen und T-Zellen in den Lymphfollikeln, den germinalen
Zentren und im Paracortex beträchtlich vergrößert (ELLIS und DE MARTINI 1985).
Mikroskopisch betrachtet besteht diese lymphoide interstitielle Pneumonie in erster
Linie aus einer Lymphozytenhyperplasie im Bereich der Atemwege und der
Blutgefäße. Neben dieser lymphoretikulären Hyperplasie zeigt sich meist auch eine
deutliche
interstitielle
Hyperplasie,
die
durch
Infiltration
von
Makrophagen,
Lymphozyten und Plasmazellen gekennzeichnet ist. Die starke Gewichtszunahme
der Lunge wird hauptsächlich durch die Hypertrophie der Muskelfasern der
Alveolargänge und durch die Verdickung der interalveolären Septen hervorgerufen.
Oft tritt eine Fibrosierung auf (WATT et al. 1992b).
20
Literaturübersicht
Rassedisposition
Eine Rassedisposition wir seit langem kontrovers diskutiert. Verschiedene Studien in
den Niederlanden, Deutschland und den USA an reinrassigen und gekreuzten
Schafen zeigten eine deutliche Rasseempfindlichkeit gegenüber der Erkrankung und
weniger gegenüber der Infektion (BRODIE et al. 1998; STRAUB 2004; ZINK et al.
1994; HOUWERS et al.1989).
Dass es Rasseunterschiede in der Ausprägung der klinischen Symptome gibt,
erhärtet den Verdacht, dass diese auch auf genetischen Faktoren des Wirtes
beruhen. Beobachtungen von GATES et al. (1978) und HOUWERS et al. (1989)
lassen vermuten, dass Finnische Rassen wesentlich empfänglicher sind als
Rambouillet, Ile de France oder Schafe der Rasse Columbia.
Auch Studien in Island unterstützen die These einer Rasseabhängigkeit. 1933
wurden 20 klinisch unauffällige Karakulschafe aus Halle an der Saale nach Island
exportiert. Sechs Jahre später zeigten Tiere der bodenständigen Rassen eine bis
dahin unbekannte Erkrankung, welche als „Maedi“ bezeichnet wurde. Weder die
importierten Tiere, noch ihre in Deutschland verbliebenen Nachkommen zeigten bis
1970 klinische Symptome einer Maedi. In Island konnte man beobachten, dass das
Fortschreiten der Lungenveränderungen durch Maedi bei Tieren der Kreuzung
Islandschaf x Border Leicester gegenüber den reinen Islandschafen verlangsamt war
(PALSSON 1976). In einer 20-jährigen Studie von PERK et al. (1996) zeigte sich,
dass bei reinrassigen Awassischafen die Erkrankung nicht ausbricht, die Tiere
zeigen keine klinischen Symptome. KENIGSWALD et al. (2009) verglichen die
Milchproduktion und die Ablammrate von 43 serologisch (ELISA) Maedi positiven
und 35 serologisch Maedi negativen Muttern einer Assaf-Milchschafherde. Dabei
konnten sie weder in der Milchproduktion noch in der Ablammrate einen signifikanten
Unterschied zwischen den serologisch Maedi positiven und den Maedi negativen
Tieren feststellen. In den letzten sechs Jahren wurde kein Tier aufgrund klinischer
Maedisymptome selektiert oder getötet. In dieser intensiv gehaltenen Herde hat die
MVV-Infektion keinen registrierbaren Effekt auf die Tiergesundheit und die
Milchproduktion.
21
Literaturübersicht
Von 1970 bis 2000 führte die Bundesforschungsanstalt für Viruserkrankungen der
Tiere in Tübingen eine Studie zur Ausbreitung von Maedi bei den Rassen Texel,
Finnschaf, Ile de France und Merino-Landschaf durch. Alle 4 Rassen waren
serologisch positiv, klinische Symptome zeigten Tiere der Rassen Texel, Finnschaf
und Ile de France, nicht jedoch die Merino-Landschafe (STRAUB 2004).
Die Erforschung der Rasseempfänglichkeit wird zusätzlich durch das Auftreten
verschiedener Virustypen und der genetischen Varianz der Virusträger erschwert.
DE LA CONCHA-BERMIJILLO et al. (1995) infizierten 6 künstlich erzeugte
isogenetische Zwillingslämmer (Paare B/B, C/C, D/D) mit 2 verschiedenen MVVStämmen (lysierender Stamm OvLV 85/34 oder persistierender Stamm OvLV 84/28).
Je ein Zwilling wurde mit dem lytischen Stamm und der zweite Zwilling mit dem
persistierenden Stamm infiziert. Bei einem weiteren Paar (A/A) wurde ein Kontrolltier
mit einer Zellsuspension und das zweite Tier mit dem lysierenden Stamm OvLV
85/34 infiziert. Es zeigte sich, dass das Ausmaß der interstitiellen Pneumonie bei den
jeweiligen Geschwisterpärchen unabhängig von dem verwendeten Virusstamm
(OvLV 85/34 oder OvLV 84/28) war. Der Grad der Lungenveränderungen bei den
verschiedenen
Paaren
korrelierte
aber
mit
der
MVV-Menge
in
den
Alveolarmakrophagen. Die Zwillinge B/B zeigten hochgradige Veränderungen in der
Lunge, die Paare C/C und D/D zeigten nur geringgradige Veränderungen. Die
Lungenlymphknoten waren bei allen Tieren, das Kontrolltier ausgenommen,
vergrößert.
Aufgrund dieser Ergebnisse kommen DE LA CONCHA-BERMIJILLO et al. (1995) zu
folgenden Schlussfolgerungen:
1. Der Unterschied in der Antikörperantwort zwischen den Paaren lässt vermuten,
dass die beiden Virusstränge in vivo verschiedene immunogene Eigenschaften
haben
2. Die Tatsache, dass der Grad der interstitiellen Pneumonie bei den Zwillingen
gleich war lässt die Vermutung zu, dass die Genetik des Wirtes entscheidend für die
Ausprägung der Entzündungsreaktion in der Lunge ist.
22
Literaturübersicht
Ein Ansatz zur Aufklärung einer Rasseempfänglichkeit ist die Erkenntnis, dass der
major histocompatibility complex (MHC) einen großen Einfluß auf das Fortschreiten
der Erkrankung zu haben scheint. Beim Menschen ist bekannt, dass bei HIVpositiven Personen, welche den MHC A1B8DR3 besitzen, die Entwicklung zum
klinischen Stadium, dem Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS), schneller
voranschreitet als bei Personen, die diesen MHC nicht haben (PEIXINHO und
MENDES 2005). Bei HIV-infizierten Kindern ist das DR3 Allel mit schnellem
Fortschreiten zum klinischen AIDS verknüpft, das DPB1 hingegen sorgt für eine gute
Überlebenschance (JUST et al. 1995).
Auch bei mit dem Simian Immunodeficiency Virus (SIV)-infizierten Affen scheint das
Voranschreiten der Erkrankung vom MHC-Genotyp abhängig zu sein. Bei Tieren, die
kein Mamu-A26-Allel besitzen, schreitet die Erkrankung schneller zum SAIDS voran
als bei ihren Artgenossen mit diesem Allel (BONTROP et al. 1996).
Bei Ziegen weiß man, dass im Falle einer CAEV-Infektion die Anfälligkeit gegenüber
Arthritis mit Unterschieden in der Frequenz bestimmter capriner Leucozytenantigene
assoziiert ist. Die Saanenziegen tragen häufig das Leucozytenantigen Be7 und sind
wesentlich weniger gefährdet eine CAEV-induzierte Arthritis zu bekommmen wie ihre
Artgenossen, welche dieses Antigen nicht besitzen (RUFF und LAZARY 1988).
Ein genetischer Hintergrund für die Empänglichkeit oder Toleranz zu klinischen
Symptomen konnte von PEPIN et al. (1998) nicht bestimmt werden.
Diagnostik und Nachweisverfahren
Klinische Untersuchung
Während sich die Tiere in der langen Inkubationszeit befinden, ist keine klinische
Diagnose möglich. Geht die Infektion von der symptomlosen Prodromalphase in die
klinische Phase über, zeigen die Tiere Tachypnoe (40-120 Atemzüge pro Minute)
und später Dyspnoe als Leitsymptom. Die Tiere liegen vermehrt, was eine
verringerte Futteraufnahme und dadurch bedingt eine Abmagerung zur Folge hat
(CHRISTODOULOPOULOS 2006).
Es treten fauchende Atemgeräusche auf, die im fortgeschrittenen Stadium bereits
ohne Phonendoskop zu hören sind. Diese Atemgeräusche sind Folge der
23
Literaturübersicht
Lungenveränderungen und nicht beweisend für das MVV als Ursache (GANTER
2006).
Untersuchungen mit Hilfe der Lungenperkussion haben gezeigt, dass dezentere
Verdichtungen, wie sie z.B. bei einer durch das MVV hervorgerufenen interstitiellen
Pneumonie auftreten, zu keiner hörbaren Dämpfung des normalen Lungenschalls
führen (GANTER 1996).
Röntgenuntersuchung
Röntgenbilder des Thorax können Hinweise auf Veränderungen geben, die unter
anderem
durch
das
MVV
hervorgerufen
werden.
Durch
Vorziehen
der
Vordergliedmaße kann der gesamte Thorakalbereich röntgenologisch dargestellt
werden (PRINGLE 1992). Veränderte Befunde bei lungenkranken Tieren beinhalten
je nach Art der Erkrankung Verdichtungsherde (Verschattungen) unterschiedlichen
Grades, Verteilungsmusters und unterschiedlicher Abgrenzbarkeit, Bronchographie,
sowie eine diffuse, eher granuläre Strukturierung des Lungenparenchyms. Nach
GANTER (1996) ist bei Maedi positiven Tieren gelegentlich im Bereich der
Zwerchfelllappen eine fein granulierte Struktur des Lungengewebes und eine
wallartige Verdichtung der Umgebung der Hauptbronchien erkennbar. Diese Befunde
lassen zwar oftmals eine Verdachtsdiagnose zu, eine ätiologische Diagnose kann
damit aber nicht gestellt werden (GANTER 1996).
Ultraschall
SCOTT u. GESSER (1998) führten Ultraschalluntersuchungen an 15 klinisch
gesunden Schafen und an 10 Tieren mit respiratorischer Symptomatik durch. Die
Diagnose wurde durch eine Sektion gestellt und durch pathohistologische und
mikrobiologische Untersuchungen abgesichert.
Bei diesen Untersuchungen zeigte sich, dass die Diagnosen Pleuritis, Pleuraabszess
und Lungenadenomatose mit dem Ultraschallgerät zuverlässig gestellt werden
können, nicht jedoch die Diagnose Maedi.
Beim Pferd stellt sich eine interstitielle Pneumonie im Ultraschall als leberähnliches
(homogenes Weichteilgewebe) echogenes Gewebe dar (NYKAMP et al. 1998). Für
24
Literaturübersicht
eine interstitielle Pneumonie beim Schaf sind ähnliche echogene Strukturen zu
erwarten. Untersuchungen wurden dazu bislang nicht veröffentlicht.
Bronchoskopie mit Bronchoalveolärer Lavage (BAL)
Mithilfe flexibler Endoskope ist eine Beurteilung von Nase, Kehlkopf, Trachea und
Bronchien möglich. Die normale Trachealschleimhaut des Wiederkäuers ist
feuchtglänzend, weiß bis graurosa und von feinen Blutgefäßen durchzogen
(STÖBER 1990; PRINGLE 1992).
Die Bronchoskopie ist für alle großen Haussäugetiere einschließlich des Schafes
beschrieben worden und wird vielfach angewendet (PRINGLE et al. 1988; GANTER
1996). Nach GANTER (1996) ist die Bronchoskopie beim Schaf am stehenden, mit
Hilfe eines Halfters und eines Helfers fixierten Tieres nach Lokalanästhesie der
Nasenschleimhaut und des Kehlkopfes einfach durchzuführen. Nach seinen
Angaben verhalten sich die Tiere dabei erstaunlich ruhig. Einige Schafe bekamen
durch die mechanische Reizung Hustenanfälle, welche jedoch mit Hilfe weiterer
Oberflächenanästhesie behoben werden konnten. Er verwendete jeweils 100 ml 0,9
% -ige NaCl-Lösung in 5 Fraktionen zu je 20 ml. Die gesamte Spülflüssigkeit kann
nur selten zurückgewonnen werden. Das zurück gewonnene Flüssigkeitsvolumen
liegt zwischen 55 % und 90 % des Instillationsvolumens (CHANANA et al. 1981;
GLAUSER
et
al.
1988).
Nach
GANTER
(1996)
sind
70-80
%
Rück-
gewinnungsvolumen beim Schaf realistisch. Der Rest wird zum Teil ausgehustet
oder verbleibt in der Lunge und wird resorbiert.
Zellzusammensetzung in der bronchoalveolären Spülflüssigkeit (BALF)
Die Gesamtzellzahl in der aspirierten BALF beträgt bei gesunden Schafen nach
segmentaler fiberoptischer Spülung ca. 0,2 G/l. Bei der posmortalen Spülung der
gesamten exenterierten Lunge liegt der Zellgehalt höher (BURRELS 1985). Bei
GANTER (1996) variierte die Gesamtzellzahl von 0,1 bis 0,65 G/l. Bei kranken Tieren
erhöhte sie sich um ungefähr eine Zehnerpotenz.
Im Differenzialzellbild der BALF überwiegen die Alveolarmakrophagen, wobei der
Anteil bei gesunden Schafen über 70 % liegt (CHANANA et al. 1981; BURRELS
25
Literaturübersicht
1985). Mit einem Mittel von 2,8 % ± 3,6% stellen die Lymphozyten die zweitgrößte
Fraktion dar (GANTER 1996). Der Anteil der Lymphozyten scheint bei Lämmern
höher zu liegen als bei erwachsenen Schafen (CHANANA et al. 1981; BURRELS
1985). Die Verhältnisse der Lymphozytensubpopulationen bei den verschiedenen
Altersklassen sind unterschiedlich. Das Verhältnis zwischen T- und B-Lymphozyten
wird von 72 : 1 bei Lämmern unter 8 Wochen auf 9 : 1 bei über 2 Jahre alten Schafen
reduziert. Gleichzeitig nimmt der Anteil sog. Null-Lymphozyten von 35 % auf 20-23 %
ab (BURRELS 1985). Bronchialepithelzellen mit 2,2 ± 3,1% stehen an dritter Stelle,
gefolgt von den neutrophilen Granulozyten mit 2,0 ± 3,1% und vereinzelten
eosinophilen Granulozyten mit 0,5 ± 1% (GANTER 1996).
Veränderungen in der Zusammensetzung nach einer MVV-Infektion
Nach DAWSON et al. (2005) ist die BALF bei Maedi charakterisiert durch einen
signifikanten Anstieg im Zellgehalt und in einem leichten aber signifikanten Anstieg
im Prozentsatz der Lymphozyten. Aufgrund dieses typischen Zytologieprofiles gibt es
nur eine Falschklassifizierung von 10%.
Bei Maedi kranken Tieren ist die Zellzahlerhöhung in erster Linie auf den Einstrom
von Lymphozyten zurückzuführen, gefolgt von den neutrophilen Granulozyten und
Alveolarmakrophagen. Mit einem Anteil von 11,0 ± 15,1% ist der Anteil der
Lymphozyten an der Gesamtzellzahl im Vergleich zu der gesunden Kontrollgruppe
signifikant erhöht (GANTER 1996).
LUJAN et al. (1993) konnten zeigen, dass eine MVV-Infektion zu Veränderungen in
den Lymphozyten-Subpopulationen führt.
Bei den Versuchen von BEGARA et al. (1995) zeigte sich in der BALF ein
signifikanter Verlust an CD5+ Lymphozyten und eine Hochregulierung der DR und
DQ MHC Klasse-II Moleküle.
BEGARA et al. (1996) haben bei weiteren Versuchen 6 Texelschafe experimentell
mit dem infektiösen MVV Stamm EV1 (Gruppe 1), zwei Schafe mit einem
hitzeinaktivierten EV1-Stamm (Gruppe 2) und zur Kontrolle weitere 4 Schafe mit
virusfreiem Kulturmedium (Gruppe 3) belastet. Die Infektion wurde anschließend
26
Literaturübersicht
über 4 Monate beobachtet. 4 Wochen vor sowie 2, 4, 6, 8, 12 und 16 Wochen nach
der Infektion erfolgte eine BAL des linken Zwerchfelllappens.
Infizierte Tiere (Gruppe 1) hatten einen signifikant gesunkenen Prozentsatz an
Makrophagen und einen signifikant angestiegenen Prozentsatz von Lymphozyten in
der BALF 4 Wochen nach der Inokulation.
Phänotypische Veränderungen an den T-Lymphozyten äußerten sich in einem
signifikanten Abfall des Prozentsatzes von CD4+ und gammadelta+ T-Lymphozyten,
einem signifikanten Anstieg von CD8+ Lymphozyten und einer Umkehr des
Verhältnisses von CD4+/CD8+. Diese Veränderungen traten zwischen der 2. und 12.
Woche nach Belastung auf. Der Abfall des Anteils der Makrophagen und der Anstieg
des Anteils der Lymphozyten zeigte sich sofort nach der Inokulation und hatte sein
Maximum 4 Wochen danach. Anschließend kehrten die Werte wieder zu ihrer
Ausgangslage zurück. Der Prozentsatz an neutrophilen Granulozyten veränderte
sich während des Experimentes kaum.
Präzipitierende Antikörper wurden bei drei der sechs mit dem infektiösen Stamm
infizierten Schafe (Gruppe 1) innerhalb der ersten 2 Wochen und bei den drei
weiteren Tieren zwischen der 2. und 4. Woche post inoc. gefunden.
Alle drei Hauptlymphozytensubsets (CD4+, CD8+ und gammadelta+ T-Zellen)
zeigten einen Anstieg in der Expression von MHC-Klasse II Molekülen bei den Tieren
der Gruppe 1. Diese Hochregulation zeigte sich als signifikanter Unterschied zu den
Gruppen 2 und 3 für die Parameter CD4+/MHC II-DQ+ zwei Wochen post inoc. und
für gammadelta+/MHC II-DR+ vier Wochen post inoc.
Alle Gruppen zeigten einen Anstieg in der Interleukin-2R Expression auf allen
Lymphozytensubsets. Die Resultate dieses Versuches zeigen, dass in der
Schaflunge nach MVV-Inokulation eine kurze zelluläre Reaktion erfolgt und
mindestens 8 Wochen andauert. Auch bei natürlichen Infektionen zeigen sich die
beschriebenen Phänomene wie das Absinken des Anteils der Makrophagenzahl, der
Lymphozytensubsets CD4+, CD5+ und gammadelta+ sowie dem gleichzeitigem
Anstieg des Anteils der Lymphozyten. Die nachweisbaren Zellveränderungen in der
BALF gegen das MVV wurden vor allem von den CD8+ Lymphozyten
vorangetrieben. Auch bei natürlichen Infektionen wurde eine Lymphozytenaktivierung
27
Literaturübersicht
in der BALF beobachtet. Diese ist charakterisiert durch die Hochregulation von DR
und DQ MHC II Molekülen auf BALF Lymphozyten, ohne Anstieg der Expression von
IL-2 Molekülen.
Die beobachteten phänotypischen Veränderungen der Zellsubpopulationen in der
BALF näherten sich gegen Ende der Versuche wieder der Normalität an. Die
Vermutung liegt nahe, dass es kurz nach der Infektion zu einer starken Virämie
kommt und anschließend zu einer Latenz. Bei HIV wurde beobachtet, dass es nach
der Infektion zu einem starken Abfall der CD4+ Lymphozyten im Blut kommt. Die
Virämie verschwindet nach kurzer Zeit und die CD4+ Lymphozyten kehren wieder zu
ihrer normalen Konzentration zurück.
Zu einem ähnlichen Ergebnis kamen auch LUJAN et al. (1995). Nachdem sie 16 von
insgesamt
21
natürlich
infizierten
Schafen
Blutproben
entnommen
hatten,
entnahmen sie die Lungen von allen 21 Tieren und unterzogen sie einer BAL. Die
Lymphozyten in der BALF und im Blut wurden mit monoclonalen Antikörpern gegen
die Hauptuntereinheiten CD4+, CD5+, CD8+ und gammadelta-TCR markiert.
Anschließend erfolgte eine Flow-Zytometrie. Der Prozentsatz von CD4+, CD5+,
gammadelta +T Zellen und das Verhältnis von CD4+/CD8+ in der BAL waren
signifikant gesunken im Vergleich zu den Kontrolltieren. Im Gegensatz dazu war der
Prozentsatz an CD8+ Lymphozyten erhöht. Es wurde beobachtet, dass nur die
CD8+T-Zell-Untereinheiten in der BALF und dem Blut signifikant mit dem Grad der
Lungenveränderungen korrelieren. Somit besteht die Vermutung, dass der
Prozentsatz an CD8+ Lymphozyten in vivo ein Indikator für den Grad der
Veränderungen im Lungengewebe bei einer MVV-Infektion darstellt.
Blutgasanalyse
Mit Hilfe der Blutgasanalyse werden die Säure-Basen-Verhältnisse im Blut
untersucht.
Parameter
sind
der
pH-Wert,
Sauerstoffpartialdruck
(pO²),
Kohlendioxidpartialdruck (pCO²) und das aktuelle Bikarbonat.
Soll die Lungenfunktion untersucht werden, ist arterielles Blut unabdingbar (KRAFT
u. DÜRR 2005).
28
Literaturübersicht
Laut GANTER (1996) bewährt sich zur arteriellen Blutgewinnung die Punktion der
Ohrarterie. Die Tiere müssen weder abgesetzt noch umgelegt werden. Meist genügt
eine ruhige Fixation durch einen Helfer.
Die alveoloarterielle O²-Differenz ist bei kranken Schafen der empfindlichste Indikator
für eine Beeinträchtigung der Atmung. Sie berechnet sich aus den Parametern
Luftdruck,
Partialdruck
des Wassers,
Sauerstoffgehalt der Luft, arteriellem
Kohlendioxidpartialdruck und dem arteriellen Sauerstoffpartialdruck nach folgender
Formel
∆A-aO2 (mmHg) =
[Barometerdruck-47(Partialdruck H2O)] x 0,2095(O2-Gehalt Luft) - art. pCO2 - art. pO2.
Laut GANTER (1996) stellt sie den einzigen Parameter dar, der einen signifikanten
Unterschied zwischen gesunden Tieren und den Maedi kranken Schafen zeigt.
Referenzwerte der arteriellen Blutgase liegen für das Schaf nicht vor.
Nachweis einer MVV-Infektion in vivo
Am lebenden Tier wird die Diagnose meist durch den Nachweis von Antikörpern
gegen das MVV gestellt. Am weitesten verbreitet ist der Nachweis mit Hilfe eines
Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), aber auch andere serologische
Verfahren wie der indirekte Immunofluoreszenztest, der Agargelimmunodiffusionstest
(AGIDT) und der Western Blot finden Anwendung. Eine Serokonversion tritt bei
experimentellen Infektionen bereits zwei bis acht Wochen p. infect. auf (BRODIE et
al.1993; DE MARTINI et al. 1999). Nach natürlichen Infektionen erfolgt eine
Serokonversion erst Monate später.
Probleme bei diesen Nachweisverfahren macht die unbekannte Anzahl der Tiere, die
noch keine Antikörper gebildet haben oder die lebenslang latent infiziert bleiben und
dabei keine serologisch nachweisbare Antikörpermenge produzieren. Bei einer
Studie von BRODIE et al. (1994) machten dies 42% der Muttern einer Herde mit
endemischer OvLV–Infektion aus.
29
Literaturübersicht
Seit
einigen
Jahren
gewinnt
der
Antigennachweis
mit
Hilfe
der
Polymerasekettenreaktion (PCR) immer mehr an Bedeutung.
Polymerasekettenreaktion (PCR)
Die PCR ist eine in-vitro-Methode zur Vervielfältigung spezifischer DNS-Fragmente.
Sie wird seit einigen Jahren für den Nachweis des MVV angewendet. Aufgrund des
erhöhten Kosten- und Arbeitsaufwandes gegenüber den serologischen Methoden
und der hohen Rekombinationsrate des MVV-Genoms konnte sich diese Methode
bisher jedoch nicht in der Routinediagnostik durchsetzen.
Weitestgehend stabile Regionen des Genomes werden als Primervorlagen
verwendet. Im Falle des MVV sind dies die LTR, gag, pol und env Gene.
EXTRAMIANA et al. (2002) beschreiben eine single step, single-primer-set PCR die
in der long terminal repeat –LTR- region des MVV Provirus ansetzt. Die untersuchten
Substanzen waren Blut, Milch und Gewebe (Zwerchfelllappen der Lunge,
periventrikuläre Bereiche des Dienzephalon mit choroiden Plexuszellen, zentrales
Eutergewebe, zentrales Milzgewebe und Lymphknotengewebe) von natürlich
infizierten
Schafen. Ihre
Ergebnisse haben die
Autoren mit
den
parallel
durchgeführten serologischen AGIDT und ELISA-Tests verglichen. Je nach
klinischem Status erzielte die PCR mit Virus-RNS aus peripheren Blutleukozyten bei
Tieren mit Maedisymptomen eine Sensitivität von 90% und bei subklinisch infizierten
Tieren 78% im Vergleich zur Serologie. Betrachtet man die Ergebnisse aus allen
untersuchten Materialien, so kommen EXTRAMIANA et al. (2002) auf eine
Sensitivität von 97,7% (42 von insgesamt 43 serologisch positiven Tieren wurden
richtig positiv diagnostiziert). Betrachtet man nur die Ergebnisse der Materialien, die
am lebenden Tier untersucht werden können (Milch und periphere Blutleukozyten),
ergibt dies eine Sensitivität von 92,2%. Die Spezifität liegt bei 100%.
Da die Virusmenge nach der Serokonversion geringer wird, ist die PCR nur vor der
Immunantwort sensitiver als der ELISA. Aus diesem Grund wird empfohlen, immer
beide Tests durchzuführen, um möglichst viele positive Tiere zu erkennen (ELTAHIR
et al. 2006). Problematisch hierbei ist die hohe Rekombinationsrate im Genom des
MVV und die molekularbiologischen Unterschiede der verschiedenen Stämme.
30
Literaturübersicht
Geeignete Materialien für den Nachweis mittels PCR sind Blut, Kolostrum, Milch und,
im Falle von Arthritiden, Gelenkflüssigkeit.
Sanierungsmöglichkeiten
Weltweit haben sich verschiedene Methoden für die Eradikation des MVV aus den
Herden als nützlich erwiesen. Island konnte sich innerhalb weniger Jahre sanieren,
indem die gesamten Herden nach Auftreten von klinischer Maedi getötet und durch
Tiere aus Maedi freien Teilen der Insel ersetzt wurden. Nach Etablierung
serologischer Tests setzten sich die „test-and-cull“-Methode (alle Schafe über einem
Jahr werden getestet und im positiven Fall sofort aus der Herde eliminiert) und die
„isolate-and-test“-Methode (die Lämmer von positiven Müttern werden sofort nach
der Geburt isoliert und mit Milchaustauscher aufgezogen) durch. Eine weitere
Methode ist die Separation der serologisch positiven Tiere von den serologisch
negativen Tieren und somit die Bildung zweier Herden. Häufig kommt es zu
Kombinationen dieser Methoden (PEPIN et al. 1998).
Freiwillige Sanierungsmaßnahmen mithilfe dieser Methoden haben sich in den
Niederlanden, Belgien, Großbritannien und Deutschland bereits recht erfolgreich
etabliert.
Da diese Methoden eine hohe Verlustrate und einen erheblichen Zeitaufwand
beinhalten, sind sie gerade für Länder mit einer großen Schafpopulation und einer
hohen MVV-Prävalenz unwirtschaftlich und kaum praktikabel. Aus diesen Gründen
wurde an alternativen Kontrollstrategien, wie z. B. einer Impfung geforscht
(BLACKLAWS et al. 1994), aber derzeit nicht weiter verfolgt (HARKIS 2009,
persönliche Mitteilung).
Eine Impfung über die Schleimhaut mit einem attenuierten nichtpathogenen Virus
konnte die Infektion mit dem gleichen nicht attenuierten hochpathogenen Virus nicht
verhindern. Es zeigte sich jedoch, dass die Infektion wesentlich milder ausfiel und
eine geringere Virusmenge aus den Tieren isoliert werden konnte (PÉTURSSON et
al. 2005).
Bis jetzt ist kein Impfstoff auf dem Markt erhältlich, obwohl Versuche mit
verschiedenen Impfstoffformen gelaufen sind (PEPIN et al. 1998). In weiteren
31
Literaturübersicht
Versuchen wurde auch mit antiviralen Medikamenten geforscht wie 9-(2Phosphonylmethoxyethyl)-adenin (PMEA). Diese Substanz ist ein hochpotenter
Inhibitor der lentiviralen Reversen Tanscriptase und der Virusreplikation in vitro. Die
Tiere wurden intracerebral mit einem hoch neurovirulenten Klon des MVV inokuliert.
Wenn die Gabe (subcutan, 3 mal pro Woche über 6 Wochen) von PMEA gleichzeitig
mit der Inokulation stattgefunden hatte, zeigte sich in den ersten sechs Wochen post
infect. ein merklicher inhibitorischer Effekt auf die Infektion, mit einer geringeren
Virusisolation aus den Blutzellen und weniger entzündlichen Veränderungen im
Gehirn.
Wurde PMEA erst 4 Wochen nach der intracerebellären Infektion verabreicht, zeigte
sich nur noch ein geringer Effekt hinsichtlich der Veränderungen im ZNS (THORMAR
et al.1995, 1998).
32
Material und Methoden
3
3.1
Tiere
Texelschafe
Für die Untersuchungen wurden insgesamt 41 Texelschafe aus 4 Beständen
angekauft.
Die Tierzahl und der Maedistatus der jeweiligen Bestände sind aus Tabelle 1 zu
ersehen.
Tabelle 1: Anzahl und Maedistatus der Tiere je Bestand
Texelschafe
gesamt
mit klinischer Maedi
sanierter Bestand,
kontrolliert Maedi
unverdächtig
Anzahl
40
32
Bestände
A
23
23
B
15
7
C
1
1
D
1
1
8
0
8
0
0
Bei Bestand B handelt es sich um einen Bestand in der Sanierung, so dass
serologisch Maedi positive Schafe vor der Sanierung und mutterlos aufgezogene
Schafe nach der Sanierung untersucht werden konnten.
Schwarzköpfige Fleischschafe (SKF)
Für die Studie wurden 21 SKF aufgekauft. Die Tierzahl und der Maedistatus der
jeweiligen Bestände sind in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2: Anzahl und Maedistatus der Tiere je Bestand
SKF-Schafe
gesamt
mit klinischer Maedi
sanierter Bestand,
kontrolliert Maedi
unverdächtig
Anzahl
Bestände
E
F
G
21
13
8
0
10
10
3
3
8
8
0
0
Die 10 Maedi positiven Tiere aus Bestand F sind genetisch mit den 8 Maedi
negativen Tieren aus Bestand E verwandt. Sie stammen aus einer SKF-Herde mit
33
klinischer Maedi. Dort wurden im Jahr 2000 alle serologisch positiven Muttertiere aus
der Herde durch Verkauf eliminiert und die Lämmer mutterlos aufgezogen.
Diese 10 Maedi positiven Tiere gehörten zu diesen eliminierten Muttern und ihren
Nachkommen, die negativen Schafe sind die ältesten Tiere der sanierten Teilherde.
Die 3 weiteren serologisch oder molekularbiologisch Maedi positiven Tiere stammen
aus dem Bestand der Tierärztlichen Hochschule und sind nicht mit den erwähnten
18 SKF-Schafen genetisch verwandt.
3.2. Auswahlkriterien
Die Auswahl der einzelnen Tiere innerhalb der bekanntermaßen Maedi positiven
Herden erfolgte anhand klinischer Symptome wie Abmagerung, einer im Vergleich zu
den anderen Herdenmitgliedern erhöhten Atemfrequenz, Dyspnoe und einem
auskultatorisch mittel- bis hochgradigen fauchenden Atemgeräusch.
In der Klinik erfolgte dann eine weitere Selektion anhand der Ergebnisse einer
serologischen Untersuchung auf Maedi-Antikörper mittels ELISA und einer
molekularbiologischen Untersuchung zum Nachweis der proviralen DNS des MaediVisna-Virus
im
Vollblut,
der
BALF,
Lungengewebe
oder
Gewebe
der
Lungenlymphknoten mittels PCR. War das serologische oder molekularbiologische
Ergebnis positiv, wurde das Tier als Maedi positiv eingestuft. Tiere mit fraglichen
Ergebnissen wurden zu einem späteren Zeitpunkt erneut getestet. War das Ergebnis
positiv, wurde das Tier in die Maedi positive Gruppe eingeteilt, bei negativem
Ergebnis schied es von der Studie aus.
Weiterhin wurden alle Tiere mittels PCR nach der Methode von VOIGT (2004) auf
Lungenadenomatose untersucht. War das PCR-Ergebnis Lungenadenomatose
positiv, wurden die Tiere von der Studie ausgeschlossen. Dies war in der Gruppe
Texelk zweimal und in der Gruppe Skk einmal der Fall.
3.2
Nach Ankunft der Tiere in der Klinik für kleine Klauentiere der Stiftung Tierärztliche
Hochschule erfolgte eine klinische Untersuchung.
34
In
der
weiterführenden
Atmungsapparates
wurde
speziellen
das
klinischen
Vorhandensein,
Farbe
Untersuchung
des
und
von
Konsistenz
Nasenausfluß kontrolliert, Atemtyp (costoabdominal, vermehrt abdominal, vermehrt
costal) und Atemrhythmus wurden erhoben und der Husten, ob spontan oder
auslösbar, wurde beurteilt.
Anschließend erfolgte die beidseitige Auskultation des Respirationstraktes an
mindestens 5 Lokalisationen (Trachea, Region der Bifurkation und beiderseits zwei
dorsale Lungenbereiche) und die Dokumentation der Befunde unter Benennung der
Lokalisation (tracheal, tracheobronchial, bronchobronchulär, alveolär), des Grades
(geringgradig,
mittelgradig,
hochgradig)
und
des
Charakters
(kontinuierlich/diskontinuierlich) auftretender Atemgeräusche.
Um andere Gründe außer Maedi für den meist schlechten Ernährungszustand der
serologisch Maedi positiven Tiere auszuschließen, wurden die Zähne kontrolliert,
Füllungszustand und Motorik des Pansens beurteilt, und es wurde eine Kotprobe für
eine parasitologische Untersuchung entnommen.
3.3
Röntgenologische Untersuchung des Thorax
Je nach Gewicht und Verhalten der Tiere wurden sie in wachem oder
anaesthesiertem (Ketaminhydrochlorid (Ursotamin®, Serumwerk Bernburg AG,
Bernburg) 10mg/kg Körpergewicht (KGW)) Zustand sowohl bei laterolateralem, wie
auch bei dorsoventralem Strahlengang in Hartstrahltechnik bei 125kV geröntgt
(Röntgengenerator
Röntgentisch
Typ
Belichtungsautomat
CONVIX
360,
3203,
Picker
PRECIMAT,
Picker
International
GmbH,
Picker
GmbH,
Film-Fokus-Abstand
International
GmbH,
München;
1,50
m;
Espelkamp;
Verstärkerfolien 3M, Trimax T8, Format 30 x 40 cm, Röntgenfilm Valmex® VA 990
G-T).
Es wurde versucht, die Belichtung immer in maximaler Inspiration manuell
auszulösen.
Um die Befunde besser bewerten zu können, wurden beide Ebenen, wie in
Abbildung 2 und 3 zu sehen, in jeweils 4 Segmente unterteilt (nach GANTER 1996).
35
Abb. 2: Einteilung der Beurteilungsfelder in der seitlichen Röntgenaufnahme
Die jeweils beurteilten Quadranten sind mit Zahlen versehen: 1 und 2 dorsale
Lungenfelder, 3 und 4 ventrale Lungenfelder
Abb. 3: Einteilung
der
Beurteilungsfelder
Röntgenaufnahme
36
in
der
dorso-ventralen
Bei
der
Bewertung
des
Lungengewebes
wurde
ein
semiquantitatives
Bewertungssystem nach GANTER (1996) verwendet. Jedes Feld erhielt eine
Scorenote mit folgenden Werten:
1 = unverändertes Lungengewebe,
2 = geringe bis mittelgradige Verdichtungen oder multiple kleine Verschattungen,
3 = hochgradige Verdichtungen oder großflächige Verschattungen.
Bei der Bewertung des Herz- und Zwerchfellschattens wurde in der seitlichen
Aufnahme jeweils ein Score zugeordnet und in der dorso-ventralen (d.-v.) Aufnahme
erhielt jede Hälfte einen Scorewert mit folgender Bedeutung:
1 = scharf abgegrenzte Schatten,
2 = verschwommene, aber noch deutlich sichtbare Schatten,
3 = kaum oder nicht mehr sichtbarer Organschatten.
Um den Grad der sichtbaren Bronchographie festzulegen, wurde für beide Ebenen je
ein Score wie folgt vergeben:
1 = nur Trachea und Stammbronchien sichtbar,
2 = Verlauf einzelner Segmentbronchien dargestellt
3 = mehrere Segmentbronchien sind stark verdichtet oder werden durch vollständige
Verschattung des umgebenden Gewebes als Aufhellung scharf dargestellt.
Durch Addition der Scores konnte das Ausmaß der Lungenveränderungen von
16 = „unveränderte Lunge“ bis 48 = „in allen beurteilten Parametern hochgradig
veränderte Lunge“ quantifiziert werden (GANTER 1996).
3.4
Hämatologische Untersuchung
Um hämatologische Veränderungen bei allen Tieren ausschließen zu können,
erfolgte eine Blutentnahme aus der Vena jugularis. Es wurden je 9 ml Lithiumheparinisiertes Blut (Vacuette®, Greiner bio-one, Essen) und 18 ml Kalium- EDTABlut (Monovette®, Sarstedt AG und Co., Nümbrecht) entnommen.
37
Aus dem entnommenen Blut wurde sowohl ein weißes, wie auch ein rotes Blutbild
nach Standartmethoden (STAMM 1979) erstellt. Der Hämoglobingehalt und die
Leukozytenzahl wurde mit dem Blutanalysegerät (Hematology Analyser Modell MEK6108G, Nihon Kohden, Bad Homburg) bestimmt.
3.5
Blutgasanalyse
Aus dem Ramus auricularis medialis der Arteria auricularis wurde mit einer 21G
Kanüle (Microlance® 3, Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA) und
einer heparinisierten 250µl Kapillare Blut entnommen und mit dem Blutgasgerät
(Osmetec OPTI™ CCA, Fa. Osmetech, Roswell, USA) folgende Parameter
untersucht:
pH-Wert, pCO² (mmHg), pO² (mmHg), BE (mmol/l), HCO³ (mmol/l), Hämoglobin
(g/dl). Das Gerät gibt jeweils die Werte für eine Standardkörpertemperatur von 37°C
und für die aktuell gemessene Körpertemperatur an. Für die weiteren Berechnungen
wurden diese individuellen Werte verwendet. Zur späteren Berechnung des
alveoloarteriellen Sauerstoffpartialdruckes wurde der Barometerdruck zur Zeit der
Blutentnahme notiert.
Der Zeitabstand zwischen Entnahme und Analyse des Blutes betrug maximal 15
Minuten. In dieser Zeit wurden die Kapillaren auf Eis gekühlt.
3.6
Bronchoalveoläre Lavage (BAL)
Spülmethode
Nachdem
die
Tiere
mit
Hilfe
eines
Halfters
fixiert
waren,
wurde
die
Nasenschleimhaut mit 5 ml 4%igem Isocainhydrochlorid (Isocain ad us. vet.,
Selectavet, Weyan- Holzollingen) anästhesiert und ein flexibles Endoskop (Olympus
GIF-XP 20, Olympus optical Co. GmbH, Hamburg) in den ventralen Nasengang
eingeführt. Durch den Instrumentierkanal des Endoskopes wurden weiterhin der
Larynx- / Pharynxbereich und nach weiterem Vorschieben auch die Bifurkation der
Lunge mit insgesamt maximal 10ml Isocainhydrochlorid 4% anästhesiert. Nach
Wirkung des Anästhetikums wurde das Endoskop in den rechten dorsalen
38
Zwerchfelllappen vorgeschoben, bis die Spitze des Endoskopes das Bronchiallumen
abdichtete
(sog.
„wedge“-Position).
In
dieser
Position
wurde
über
den
Instrumentierkanal ein Polyäthylenkatheter (Portex® Fine Bore Polythene Tubing,
30m, Firma Smith, Außendurchmesser 1,52 mm) bis zur Spitze des Endoskopes und
darüber hinaus weiter caudal vorgeschoben, bis er in einem kleinen Bronchus zu
liegen kam und ein weiteres Vorschieben nicht möglich war.
Über diesen Katheter erfolgte die Spülung der ersten Fraktion (die für die kulturelle
mikrobiologische
Untersuchung
verwendet
wurde).
Zunächst
wurde
mit
Einwegspritzen 5 ml warme 0,9 %ige NaCl-Lösung (B. Braun Melsungen AG,
Melsungen) instilliert und über das Endoskop sofort wieder aspiriert. Diese Fraktion
wurde in einem sterilen Tupferröhrchen ohne Nährmedium aufgefangen und zur
kulturellen bakteriologischen Untersuchung in das Institut für Mikrobiologie der
Stiftung Tierärztliche Hochschule weitergeleitet. Anschließend wurde der Katheter
entfernt und über den Instrumentierkanal 5 x 20 ml 0,9%ige NaCl-Lösung in den
bronchoalveolären Raum eingebracht und die Flüssigkeit nach jeder Fraktion sofort
wieder vorsichtig mit leichtem Unterdruck durch eine Saugpumpe (Endoaspirator,
System Endoparts, Fa. Georg Pauldrach, Hannover) aspiriert. Diese 5 Fraktionen
wurden in einer autoklavierten und mit konzentriertem Heparin ausgespülten
Gaswaschflasche
nach
Drechsel
(Gebrüder
Rettberg
GmbH,
Göttingen)
aufgefangen.
Zytologische Untersuchung der bronchoalveolären Spülflüssigkeit (BALF)
Die zurückgewonnene BALF wurde direkt nach der Entnahme in das klinikeigene
Labor verbracht, durch Schwenken resuspendiert, volumenmäßig erfasst und dann
bei 200 x g für zehn Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Vom Sediment wurde
soviel in 0,9 % NaCl-Lösung gegeben, bis diese eine optisch sichtbare Trübung
ergab. Dieser Anteil wurde anschließend mittels Zentrifugation (Multifuge 4 KR,
Thermo Elekton Corporation, Osterode) für 10 Minuten bei 200 x g mittels
Zytospotverfahren auf Objektträger verbracht (GANTER 1996). Jeweils ein Zytospot
wurde nach Pappenheim gefärbt und 200 Zellen wurden auf ihre Integrität untersucht
und differenziert.
39
Bakteriologische Untersuchung der BALF
Für die mikrobiologische Untersuchung wurde die erste Spülfraktion verwendet.
Durch die Verwendung eines Katheters ließen sich bakterielle Kontaminationen
während der Passage durch die oberen Atemwege so weit wie möglich vermeiden.
Da sich durch die Verwendung des Katheters wiederholt Blutungen des
Lungengewebes einstellten, wurde dessen Verwendung ab der 15. BAL eingestellt.
Die weiteren mikrobiologischen Untersuchungen erfolgten aus 3 ml einer
dekantierten Fraktion der aspirierten Spülflüssigkeit.
Im
Institut
für
Mikrobiologie
wurden
die
Proben
unter
Verwendung
von
Standardmethoden auf aerobe und anaerobe Krankheitserreger untersucht.
Untersuchungen der Lymphozytensubsets
BALF mit Erythrozytenbeimengungen oder mit weniger als 33 lymphoiden Zellen
wurden von der Analyse ausgeschlossen.
Indirekte Membranimmunfluoreszenz (MIF)
Bei dieser Methode bindet ein monoklonaler Primärantikörper an eine native
Oberflächenstruktur, welche auf der Zelle exprimiert wird. An diesen Primärantikörper
bindet
ein
zweiter,
fluorochrommarkierter
Sekundärantikörper.
Der
Anteil
fluorochrommarkierter Zellen wird anschließend durchflußzytometrisch erfasst.
Durchführung der indirekten Membranimmunfluoreszenz (MIF)
Für die MIF wurden 2-3 x 105 Zellen pro Vertiefung einer Rundbogenmikrotiterplatte
(Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen) eingesetzt, zentrifugiert (4 Min., 220 x g,
10°C) (Megafuge 1.0 R, Thermo Scientific, Osterode) , der Überstand dekantiert und
die Platte mit dem Zellsediment auf dem Mikrotiterplattenrüttler (AM 69 Microshaker,
Dynatech AG, Zug) für 5 Sekunden bei Raumtemperatur resuspendiert. Die Zellen
wurden durch Zugabe von 150 µl MIF-Puffer (siehe Anhang) in die einzelnen
Vertiefungen einmal gewaschen (bei 10°C für 4 Min. bei 200 x g abzentrifugiert,
Dekantieren des Überstandes, Platte aufrütteln) und mit 25µl Primärantikörperlösung
40
(monoklonal, Mouse anti bovine CD8, Produktnummer MCA 837 G, Mouse anti ovine
CD4, Produktnummer MCA 2213, ABD Serotec, Düsseldorf) für 30 Min. bei 4°C
inkubiert.
Nach dieser ersten Inkubation erfolgte ein zweimaliges Waschen in jeweils 150 µl
MIF-Puffer, wobei das Zellpellet zwischen den Waschschritten für 4 Minuten bei 220
x g und 10 °C zentrifugiert, dann der Überstand dek antiert und das Zellpellet durch
Rütteln resuspendiert wurde. Der nächste Schritt bestand in der Inkubation der
resuspendierten Zellpellets mit 25 µl Fluoresceinisothiocyanat (FITC) - konjugiertem
Sekundärantikörper (Ziege-anti-Maus - FITC, Nr.115-015-068, Dianova, Hamburg).
Die eingesetzte Verdünnung des FITC- konjugierten Ziege-anti-Maus-Antikörpers
betrug
1:100
in
MIF-Puffer.
Um
die
unspezifischen
Bindungen
des
Sekundärantikörpers auf den Zellen einschätzen zu können, wurde zum Vergleich
anstelle des Primärantikörpers 25µl MIF-Puffer eingesetzt.
Nach erneutem resuspendieren wurden die Zellen unter Lichtabschluß für 30
Minuten auf Eis inkubiert und zweimal mit MIF-Puffer gewaschen. Die Zellpellets
wurden dann in 100 µl kaltem MIF-Puffer resuspendiert und in ein Röhrchen mit
100µl eines Sheath fluid (siehe Anhang) für die Durchflußzytometrie überführt.
Durchflußzytometrische Messung und Auswertung der Membranimmunfluoreszenz
Nach Resuspendierung der Zellen in den Röhrchen wurden im Durchflußzytometer
10.000 Ereignisse („events“) gemessen. Ein „event“ entspricht einem Partikel,
darunter Zellen und auch Zelltrümmer.
Mit Hilfe des Analyseprogrammes WinMDI© (TROTTER 1999) erfolgte die
Bewertung Propidiumjodid-negativer (Zellmembran-intakter) Zellen der jeweils zu
untersuchenden
Leukozytenpopulation.
Die
durch
den
konjugierten
Sekundärantikörper entstehende Fluoreszenzintensität wurde in einem „dotplot“
dargestellt.
Tote Zellen, die anhand ihrer positiven Rotfluoreszenz (propidiumjodid-positiv, FL3positiv) zu identifizieren waren, wurden durch das Setzen eines Fensters von der
Auswertung
ausgeschlossen.
Bestimmt
wurde
der
prozentuale
fluoreszenzpositiver Zellen an der jeweils untersuchten Zellpopulation.
41
Anteil
3.7
Serologische Untersuchung
Serumproben wurden zum Anfang der Studie mittels ELISA nach dem Protokoll des
Herstellers (CHEKIT CAEV/MVV Sreening oder CHEKIT CAEV/MVV Confirmation,
Dr. Bommeli AG, Bern, Schweiz) später mittels VMRD-ELISA (Caprine ArthritisEncephalitis Virus Antibody Test Kit, cELISA, VMRD Incorporated, Washington,
USA) auf Antikörper gegen Maedi-Visna-Virus-Antigen untersucht.
3.8
Virusnachweis
Zellpräparation
Buffy-Coat-Präparation
Das durch Li-Heparin gerinnungsgehemmte Vollblut wurde bei 3300 x g bei
Raumtemperatur für 10 Minuten zentrifugiert (Multifuge 4 KR, Thermo Elekton
Corporation, Osterode). Der zwischen Erythrozyten und Plasma deutlich sichtbare,
weißliche Buffy-Coat wurde abgesaugt (Liquipette™, Roth, Karlsruhe) und in ein
steriles, unten spitz zulaufendes Zentrifugenröhrchen (Greiner CellStar®, Greiner
Bio-One GmbH, Frickenhausen) gegeben. Das Röhrchen wurde mit 10-15 ml Trisgepufferter 0,16 molarer Ammoniumlösung (s. Anhang) aufgefüllt, geschwenkt und
bei Raumtemperatur inkubiert, bis die enthaltenen Erythrozyten lysiert waren. Durch
die Zentrifugation bei 3300 x g für 10 Minuten sammelten sich die Leukozyten am
Grund des Zentrifugenröhrchens.
Der Überstand wurde abpipettiert, das Pellet in 1ml PBS (s. Anhang) resuspendiert,
in ein steriles 1,5 ml Mikroreaktionsgefäß (Reaktionsgefäß, Carl Roth GmbH&Co,
Karlsruhe) überführt und bei Raumtemperatur bei 16.000 x g zentrifugiert. Der
Überstand wurde erneut abgenommen und das Pellet wiederholt in 1 ml PBS
resuspendiert. Diese Suspension wurde danach auf 2 Mikroreaktionsgefäße verteilt,
zentrifugiert und nach erneutem Abpipettieren des Überstandes bei -80°C
eingefroren.
42
Gesamt-DNS-Isolierung aus Buffy-Coat-Zellen
Die Isolierung der DNS aus den Leukozytenpellets erfolgte nach dem Protokoll des
Herstellers für Zellkulturzellen des DNeasy® Tissue Kit (DNeasy® Tissue Kit,
Qiagen, Hilden).
Gesamt-DNS-Isolierung aus Gewebeproben
Aus den tiefgefrorenen Gewebeproben von Lunge und Lungenlymphknoten wurden
mithilfe
steriler
Bestecke
Gewebestücke
mit
einem
Gewicht
von
25
mg
herausgetrennt und in ein steriles 1,5 ml Mikroreaktionsgefäß verbracht. Aus dem
DNeasy® Tissue Kit wurden Puffer ATL und Proteinase K dazugegeben, geschwenkt
und bei 55°C für mehrere Stunden in einem Schüttelw asserbad (Typ 1083,
Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel) bis zur vollständigen Auflösung des
Gewebes inkubiert. Nach vollständiger Lyse wurde Puffer AL (DNeasy® Tissue Kit,
Qiagen, Hilden) dazugegeben, gemischt und bei 70°C für 10 Minuten im Wasserbad
inkubiert. Nach Zugabe von 200 µl 99,8%igem Ethanol wurden die Proben nach dem
Protokoll des Herstellers wie die Buffy-Coat-Zellen weiter bearbeitet.
Gesamt-DNS-Isolierung aus BALF-Zellen
Nach Zentrifugation der Lungenspülflüssigkeit und dem Abgießen des Überstandes
erfolgte die Isolierung der DNS aus den Zellen der BALF nach dem Protokoll für
Zellkulturzellen des DNeasy® Tissue Kit der Firma Qiagen, Hilden.
Konzentrations- und Reinheitsbestimmung der DNS
Das bei der DNS-Isolierung gewonnene Eluat wurde in einem sterilen DNS- und
RNS- freien Mikrotitergefäß im Verhältnis 1:20 (30µl des Eluates und 570µl DNSfreies Wasser) verdünnt.
Die Messung der optischen Dichte (OD) erfolgte mit einem Volumen von 500µl in
einer Quarzküvette bei Wellenlängen von 260 und 280 nm.
Die Bestimmung der Reinheit erfolgte über die Formel OD260 / OD 280. Als Leerwert
diente eine Mischung aus 30µl Puffer AE und 570µl Wasser.
43
Die Berechnung der DNS-Konzentration in der Ausgangslösung erfolgte nach
folgender Gleichung:
cDNS Ausgangslösung = (OD260*50) * 20
Nachweis von Maedi-Visna-Virusgenom mittels Polymerasekettenreaktion (PCR)
Es erfolgte eine strikte räumliche Trennung zwischen den Arbeitsschritten
1. Probenbearbeitung und DNS-Isolierung
2. Herstellen des Mastermix
3. Probenzugabe und Amplifikation und
4. Elektrophorese
Die PCR erfolgte nach einer modifizierten Methode nach EXTRAMIANA et al. (2002).
Dabei handelt es sich um die Amplifikation eines 291 Basenpaar-DNS-Fragmentes in
der long-terminal-repeat (LTR) Region des Maedi-Visna-Provirus. Die bereits von
EXTRAMIANA et al. (2002) verwendete Primersequenz wurde von der Firma
Biometra®
(Göttingen)
synthetisiert
und
für
diese
PCR
eingesetzt.
Als
Amplifikatvorlage wurden statt 500 ng (EXTRAMIANA et al. (2002)) 200 ng GesamtDNS in einem Reaktionsvolumen von 50 µl eingesetzt. Da jeweils 25 µl Mastermix
(Biometra, Göttingen) verwendet wurde, betrug das maximale Probenvolumen 25 µl.
Geringere Probenvolumina wurden durch Vorlage von Wasser in das entsprechende
Reaktionsgefäß ausgeglichen.
Die Zusammensetzung des Mastermix entsprach der von VOIGT (2004)(Tab. 3).
Nach Vorlage von 25 µl Mastermix und der errechneten Menge Wasser in ein
Reaktiongefäß unter der Sterilbank wurde dieses verschlossen. Die Zugabe der
Proben einschließlich der Positiv- und Negativkontrolle erfolgte dann in einem
zweiten Raum, in dem auch die Amplifikation stattfand.
Das modifizierte Zeit-Temperaturprogramm des Cycler ist in Tabelle 4 dargestellt.
44
Tabelle 3:
Zusammensetzung des Mastermix
Eingesetzte Konzentration
Eingesetztes Volumen /
Probe
10x
5 µl
MgCl2
25 mmol/l
2 µl
Primer R1
10 mmol/l
1 µl
Primer M1
10 mmol/l
1 µl
10 mmol/l je dNTP
1 µl
5 Einheiten/µl
0,25µl
Reagenzien
10 x PCR-Puffer
dNTP-Stammlösung
HotStarTaq™ Polymerase
Aqua bidest.
Tabelle 4:
ad 25 µl
Zeit-Temperaturprogramm für die PCR
Programmschritt
Temperatur
Dauer
Zyklenanzahl
95 °C
15 min.
1
Denaturierung
94 °C
30 sec.
34
Anlagerung und
Verlängerung
70 °C
90 sec.
1
Finale Verlängerung
72 °C
10 min.
1
Warten bis zur Entnahme
4 °C
mind. 1 Minute
Initiale Denaturierung und
Enzymaktivierung
Beginn des Zyklus
Ende Zyklus
45
Heminested PCR
Alle Proben, die im ersten Durchlauf der PCR ein negatives oder fragliches Ergebnis
zeigten,
wurden
mittels
heminested
PCR
(EXTRAMIANA
et
al.
2002)
nachuntersucht.
Als Template wurden hierfür 25 µl des Amplifikates der einfachen PCR (s. 3.8.4.2.)
verwendet. Das Mastermixvolumen betrug konstant 25 µl. Die Arbeitsschritte, die
verwendeten
Reagenzien
und
Primer
und
das
Zeit-Temperaturprogramm
entsprachen denen der einfachen PCR. Das zu erwartende Amplifikat hatte auch in
dieser hn PCR eine Größe von 291 bp.
Das Amplifikat der im ersten Durchlauf bereits deutlich positiven Proben wurde in der
hn PCR nicht nachuntersucht, da sich bei diversen Vorversuchen herausstellte, dass
dann keine oder mehrere unspezifische Banden auftraten.
Sichtbarmachung der PCR-Produkte im Agarosegel mit Hilfe der Gelelektrophorese
Um ein 2 %iges Gel zu erhalten, wurden die entsprechenden Mengen Agarosepulver
(Biozym CE Agarose, Biozym Scientific GmbH, Hess. Oldendorf) und TBE-Puffer
(siehe Anhang) in einen Erlenmeyerkolben gegeben und in der Mikrowelle (R-202,
Firma Sharp, Hamburg) bei 800 Watt bis zur vollständigen Auflösung des
Agarosepulvers (SeaKem® LE Agarose, Biozym, Hess. Oldendorf) erhitzt. Nach
Abkühlung auf 55-65°C wurde die Lösung mit 5 µl Nuk leinsäurefarbstoff (GelStar®
Nucleic Acid Gel Stain, Lanza, Rockland USA) pro 50 ml Agaroselösung versetzt, gut
durchmischt und blasenfrei in eine vorbereitete Gelelektrophoresekammer (ComPhor
Midi Gelelektrophoresesystem, Biozym, Hess. Oldendorf) gegossen. Als Laufpuffer
wurde 1 x TBE verwendet.
Die PCR-Produkte wurden mit Farbstoffpuffer (GelStar® Nukleinsäurefarbstoff,
Biozym, Hess. Oldendorf) versetzt, durch mehrmaliges Aspirieren gründlich gemischt
und dann wurden jeweils 20 µl vorsichtig in eine Geltasche pipettiert. Als
Größenmarker wurden 0,25 µg eines 100bp-Marker (Carl Roth GmbH&Co,
Karlsruhe) pro Gel verwendet. Die Gelprodukte wurden je nach Größe des Gels bei
ca. 60 bzw. 100 Volt für eine Stunde im Agarosegel elektrophoretisch (Standard
46
Power Pack P25, Biometra® biomedizinische Analytik GmbH, Göttingen) der Größe
nach aufgetrennt.
Die entstandenen Banden wurden mithilfe eines Blaulichttransilluminators (Flu-O-Blu,
Biozym, Hess. Oldendorf) bei 460-480 nm durchleuchtet, mit einem digitalen
Aufnahmesystem photographiert und gespeichert.
3.9
Parasitologische Kotuntersuchung
Bei Ankunft wurde aus dem Rektum der Tiere eine Kotprobe entnommen. Diese
wurde im Labor der Klinik für kleine Klauentiere mittels eines kombinierten
Sedimentations-Flotationsverfahren untersucht (TEGTMEYER, 2006). Es folgte eine
Differenzierung der einzelnen Gattungen aufgrund der spezifischen Merkmale von
Eiern und Larven.
3.10 Postmortale Untersuchungen
44 Schafe wurden am Ende der Untersuchungen an der Klinik für kleine Klauentiere
durch intravenöse Injektion einer Überdosis Pentobarbital (Eutha® 77, Essex
Tierarznei) euthanasiert, 8 Tiere verendeten während des Untersuchungszeitraumes.
Alle 52 Tiere wurden im Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule
Hannover seziert.
Tabelle 5:
Übersicht der euthanasierten und verendeten Tiere
Anzahl insgesamt
euthanasiert
verendet
SKF
20
19
1
Texelschafe
32
25
7
Nach Feststellung des Gewichtes des Tierkörpers und dessen Eröffnung wurde bei
einem Teil der Tiere unmittelbar nach der Exenteration das Zwerchfell im Bereich
des rechten dorsalen Zwerchfelllappens eröffnet und es wurde mit sterilem
Instrumentarium ein 3 cm x 3 cm großes Stück des Zwerchfelllappens entnommen
und in einem Probengefäß verwahrt, bis es der bakteriologischen Untersuchung
47
zugeführt wurde. Anschließend wurde der Brustkorb eröffnet und die Lunge
entnommen.
Lungengewicht
Vor der Entnahme der Proben wurde die Lunge gewogen. Zur Ermittlung des
Organgewichtes wurden Herz, Zwerchfell, Aorta und Trachea (cranial des Abganges
des Bronchus trachealis) abgesetzt.
Probenentnahme aus der Lunge
Die Lunge wurde eingehend makroskopisch und palpatorisch beurteilt und je 2
Gewebeproben von vier definierten Lokalisationen (Pars cranialis des rechten
Spitzenlappens, caudaler Bereich der beiden Hauptlappen und eine Probe der Lnn.
mediastinales) entnommen.
Je eine Probe wurde für max. 24 h in 4%igem gepuffertem Formalin (pH 7,2) fixiert
und max. 24 h später erfolgte durch Mitarbeiter des Institutes für Pathologie der
Stiftung Tierärztliche Hochschule eine Einbettung in Paraffin und die anschließende
pathohistologische Untersuchung.
Die zweite Gewebeprobe wurde auf 2 Blöcke mit je 1x1x1 cm Länge x Breite x Höhe
zurecht geschnitten. Diese Gewebeproben wurden in Aluminiumfolie unter
Verwendung des Gefrierschutzmediums O.C.T. (Tissue Tek® O.C.T.-Compound, Fa.
Vogel GmbH & Co.KG, Gießen) in mit flüssigem Stickstoff gekühltem Isopentan
schockgefroren. Die weitere Lagerung erfolgte bei -80°C.
Die Zeitverzögerung zwischen dem Tod des Tieres und dem Einfrieren der Proben
betrug maximal 3 Stunden.
Histologische Untersuchungen der Lunge
Die in Paraffin eingebetteten Lungenproben wurden von Mitarbeitern des Institutes
für Pathologie der Stiftung tierärztliche Hochschule mikroskopisch untersucht.
Die graduelle Einteilung der Befunde „BALT-Hyperplasie“ und „Interstitielle
Pneumonie“ wurde von der Doktorandin selbst durchgeführt.
48
3.11 Statistik
Die statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe des Programmes SAS® (SAS Institute
Inc., Cary, NC, USA). Im Rahmen dieses Programmes wurden die Werte mit dem
Shapiro-Wilk und dem Kolmogorov-Smirnov-Test auf Normalverteilung überprüft. Die
Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mit dem Wilcoxon-test auf Signifikanz
überprüft.
Korrelationen
wurden
über
die
Berechnung
der
Spearman`s
Rangkorrelationskoeffizienten ermittelt. Regressionen wurden mit Microsoft Excel ®
berechnet.
49
Ergebnisse
4
4.1
Ergebnisse
Auswahlkriterien
Die Einteilung in die Gruppen Schwarzkopf gesund (Skg), Schwarzkopf krank (Skk),
Texel krank (Texelk) und Texel gesund (Texelg) erfolgte aufgrund des Maedistatus
im
Herkunftsbetrieb
und
den
Ergebnissen
der
serologischen
und
molekularbiologischen Tests.
Es wurden insgesamt 21 Schwarzköpfige Fleischschafe (SKF) für die Versuche
aufgekauft. 8 Tiere stammten aus einer kontrolliert Maedi unverdächtigen Herde,
hatten serologisch negative Ergebnisse im Maedi-ELISA, in der Maedi-PCR der
BALF-Zellen und in der Adematose-PCR der BALF-Zellen. Sie wurden daraufhin der
Gruppe Schwarzkopf gesund (Skg) zugeordnet. Die Lungen zeigten sich
makroskopisch und histologisch unaufällig.
Die 13 weiteren SKF stammten aus Herden mit klinischer Maedi, zeigten im MaediELISA 11 positive Ergebnisse, 1 negatives und 1 fragliches Ergebnis. Die MaediPCR ergab 6 positive Ergebnisse (darunter das fragliche Tier aus dem ELISA) und 6
negative Ergebnisse. Ein Tier wurde nicht mittels Maedi-PCR untersucht, da das
Adenomatose-PCR-Ergebniss positiv war. Ein weiteres Tier zeigte weder ein
positives Ergebnis im Maedi-ELISA noch in der PCR. Beide Tiere schieden aus der
Studie aus. Bei 9 Tieren wurde postmortal eine interstitielle Pneumonie (IP)
diagnostiziert, bei 2 serologisch Maedi positiven Tieren wurde keine IP festgestellt.
Diese Gruppe bestand aus 11 Tieren und wurde als Schwarzkopf krank (Skk)
bezeichnet.
Für die Versuche wurden 40 Texelschafe aufgekauft.
32 Texelschafe stammten aus Herden mit klinischer Maedi, das Maedi-ELISAErgebnis war bei 24 Tieren positiv, bei 2 negativ und bei 6 fraglich. Die Maedi-PCR
der BALF-Zellen teilte sich auf in 18 positive (darunter die 6 serologisch fraglichen
und ein serologisch negatives Tier) und 13 negative Ergebnisse. Ein Tier wurde nicht
mittels PCR untersucht, da es vor der BAL verstarb. Bei 31 Tieren verlief die
Untersuchung auf Lungenadenomatose mittels PCR negativ. Bei einem Tiere wurde
mittels PCR Lungenadenomatose nachgewiesen. Dieses Tiere wurde von der
50
Ergebnisse
Auswertung ausgeschlossen. Ein weiteres Tier zeigte weder ein serologisch
positives Ergebnis im ELISA, noch konnte mittels PCR MVV-Antigen nachgewiesen
werden, so dass auch dieses Tier nicht in die Auswertung aufgenommen werden
konnte. Drei Tiere starben vor der BAL und gingen nicht in die Auswertung ein.
Alle 32 Tiere wurden postmortal einer Sektion unterzogen. Bei 27 Tieren wurde eine
interstitielle Pneumonie diagnostiziert, vier Tiere zeigten keine histologischen
Anzeichen einer interstitiellen Pneumonie. Ein Tier verstarb 48 Stunden vor der
Sektion, die Lunge war autolytisch und konnte nicht beurteilt werden. Es gingen 27
Tiere in die Auswertung ein und wurden als Texel krank (Texelk) bezeichnet.
8 weitere Texelschafe stammten aus einer Maedi sanierten Herde, waren kontrolliert
Maedi unverdächtigt, hatten negative Maedi-ELISA-Ergebnisse, negative MaediPCR-Ergebnisse in den BAL-Zellen und auch die Lungenadenomatose-PCR war
negativ. Diese Gruppe wurde als Texel gesund (Texelg) bezeichnet. Die Tiere gingen
nach den klinischen Untersuchungen und der BAL lebend in den Herkunftsbetrieb
zurück.
Tabelle 6: Anzahl
und
biologischen
Verteilung
der
Ergebnisse
serologischen
bei
den
und
Schafen,
molekulardie
Selektionskriterien erfüllten.
Rasse
Gruppe
N
Maedi-ELISA
positiv
SKF
Texel
Maedi-PCR
negativ
fraglich
positiv
negativ
Skg
8
(100%)
0
8
(100%)
0
0
8
(100%)
Skk
11
(100%)
10
(90,9%)
0
(0%)
1
(9,09%)
7
(63,63%)
4
(36,36)
Texelg
8
(100%)
0
8
(100%)
0
0
8
(100%)
Texelk
27
(100%)
23
(85,2%)
1
(3,7)
3
(11,11%)
16
(59,25%)
11
(40,74%)
51
die
Ergebnisse
4.2
Klinische Befunde
Die Tiere der Gruppen Skg, Skk und Texelk hatten ein Zahnalter von 4 – 8 Jahren,
die Tiere der Gruppe Texelg befanden sich im Zahnwechsel der Inzisivi und waren 1
bis 2 Jahre alt.
Das Gewicht der Tiere unterschied sich signifikant zwischen den Gruppen Skg –Skk
(p<0,05) und Skg-Texelk (p<0,0001), Skg-Texelg (P<0,0001) und Skk-Texelg
(p<0,05). Zwischen Texelg und Texelk konnte kein signifikanter Gewichtsunterschied
festgestellt werden.
130
120
110
Körpergewicht [kg]
100
90
80
70
60
50
40
Skg
Skk
Texelk
Texelg
n=8
n=11
n=27
ober. Quart.
104
82
65
n=8
58
Max.
110
120
77
66
75
52,2
43,7
46
unt. Quart.
94,5
57,6
51,65
49,5
Median
97,5
61,3
56,6
52,5
Min.
Abb. 4: Körpergewicht der Tiere nach Gruppen unterteilt. Innerhalb der Boxen sind
die Werte zwischen dem oberen 75%-Quartil und dem unteren 25 %-Quartil dargestellt.
Der graue Balken markiert den Medianwert. Die Enden der Striche ober- und unterhalb der
Boxen markieren die Maximal- und Minimalwerte.
52
Ergebnisse
Hinsichtlich der weiteren klinischen Parameter Atemfrequenz, Dyspnoe, Husten,
Nasenausfluß und Auskultation konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen
den vier Gruppen festgestellt werden.
4.3
Röntgenologische Befunde
Von allen untersuchten Tieren wurden Röntgenbilder des Thorax in zwei Ebenen
angefertigt. Da die Tiere nur bei zu starken Abwehrbewegungen sediert wurden,
konnte eine Aufnahme bei maximaler Inspiration nicht sicher gewährleistet werden.
Tiere mit einer Wolllänge von über 3 cm wurden geschoren, um Artefakte zu
vermeiden.
Bei den gesunden Kontrolltieren der Gruppe Skg zeigte sich im Bereich des
Lungengewebes
eine
nahezu
vollständige
Schwärzung
und
innerhalb
des
Lungenfeldes stellten sich nur die Trachea und die beiden Stammbronchien dar. Im
Bereich der Schulter- und Rückenmuskulatur zeigte sich je nach Ausprägung der
Muskulatur eine gering- bis mittelgradige Aufhellung. In der laterolateralen Aufnahme
waren die Aorta abdominalis, die Vena cava cranialis, die Vena cava caudalis und
zum Teil auch die Lungengefäße sichtbar. Bei adipösen Tieren waren der Herz- und
Zwerchfellschatten verschwommen bis nicht mehr sichtbar und das Herz war deutlich
nach dorsal abgehoben.
Bei den Tieren der Gruppen Skk, Texelk und Texelg zeigten sich im Bereich des
Lungengewebes geringe bis mittelgradige Verdichtungen oder multiple granuläre
Verschattungen. Die deutlichsten Veränderungen zeigten sich immer im caudodorsalen Quadranten. Hinsichtlich der Bronchographie waren die Tiere der Gruppe
Skg unauffällig. Bei den Gruppen Skk und Texelg waren die Segmentbronchien sehr
deutlich zu sehen und bei der Gruppe Texelk waren mehrere Segmentbronchien
stark verdichtet und wurden zum Teil durch vollständige Verschattung des
umliegenden Gewebes scharf als Aufhellung dargestellt.
Wie in Kapitel 3.4. beschrieben, wurden die Veränderungen mit Bewertungszahlen
(Scores) versehen und summiert.
53
Ergebnisse
Signifikante Unterschiede der Scoresumme (p<0,01) ergaben sich zwischen den
Gruppen Skk - Texelk und zwischen den Gruppen Skk-Texelg (p<0,05).
40
Röntgenscoresum m e
35
30
25
20
15
Skg
Skk
Texelk
Texelg
n=8
n=11
n=24
29,5
23
33
28
M ax.
31
33
38
30
M in.
17
18
19
24
unt. Quart.
21
19
24
26
22,5
21
29
26,5
ober. Quart.
M edian
n=8
Abb. 5: Röntgenscoresumme der Diagnosegruppen. Innerhalb der Boxen sind die
Werte zwischen dem oberen 75%-Quartil und dem unteren 25%-Quartil dargestellt. Der
graue Balken markiert den Medianwert. Die Enden der Striche ober- und unterhalb der
54
Ergebnisse
4.4
Hämatologische Befunde
Von allen untersuchten Tieren wurde ein Differentialblutbild erstellt.
Bezüglich der Gesamtleukozytenzahl ergaben sich signifikante Unterschiede
zwischen den Gruppen Skk-Texelk (p<0,05) und den Gruppen Skg-Texelk (p<0,01).
Hinsichtlich der Monozyten, der eosinophilen und segmentkernigen Granulozyten
wurden signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen Skg-Skk und Skg-Texelk
deutlich.
Hinsichtlich der Lymphozyten zeigten sich im Blut keine signifikanten Unterschiede
zwischen den vier Gruppen.
10
9
8
Leucozyten
7
Lymphozyten
Zellzahl [G/l]
6
Segmentk.
5
Basiphophile
4
Eosinophile
3
Monozyten
2
1
0
Skg n=8
Skk n=11
Texelk n=27
Texelg n=8
Leucozyten
4,85
6,3
8,2
9,2
Lymphozyten
3,02
3,07325
3,706
4,63975
Segmentk.
1,13675
2,99125
2,86125
3,399
Basiphophile
0,02575
0,0305
0,03275
0,07125
Eosinophile
0,4435
0,1605
0,123
0,84875
Monozyten
0,0115
0,05625
0,0525
0,081
Abb. 6: Differentialblutbild der Diagnosegruppen .
55
Ergebnisse
4.5
Blutgase
Von allen Versuchstieren wurde vor der BAL (t0), 3 Tage danach (t1) und 8 Tage (t2)
nach der BAL Blut aus der Ohrarterie entnommen. Es wurden die Parameter pHWert, pCO2 (mmHg), pO2 (mmHg), BE (mmol/l), Hb (g/dl) und der aktuelle
Barometerdruck bestimmt. Die Daten wurden auf die aktuelle Rektaltemperatur der
Schafe zum Entnahmezeitpunk korrigiert.
Zum Zeitpunkt t0 bestand bezüglich des pH-Wertes ein signifikanter Unterschied
(p<0,01) zwischen Skg- Skk und Skg-Texelg.
7,65
7,6
7,55
7,5
pH
7,45
7,4
7,35
7,25
t1
t0
7,3
Skg
Skk
Texelk
Texelg
Skg
Skk
t2
Texelk
Skg
Skk
Texelk
n=8
n=11
n=27
n=8
n=7
n=2
n=19
n=8
n=11
n=22
ober. Quart.
7,4615
7,542
7,515
7,505
7,4795
7,49
7,49
7,4895
7,46
7,4945
Max.
7,4865
7,613
7,57
7,52
7,502
7,49
7,535
7,5025
7,4735
7,545
Min.
7,415
7,44
7,392
7,45
7,41
7,42
7,383
7,438
7,38
7,283
unt. Quart.
7,42
7,47
7,45
7,48
7,421
7,42
7,415
7,4605
7,41
7,445
7,4465
7,5085
7,485
7,48
7,436
7,455
7,455
7,47125
7,44
7,4675
Median
Abb. 7: Arterielle Blut-pH-Werte der Diagnosegruppen. Innerhalb der Boxen sind die
Werte zwischen dem oberen 75%-Quartil und dem unteren 25 %-Quartil dargestellt. Der
graue Balken markiert den Medianwert. Die Enden der Striche ober- und unterhalb der
56
Ergebnisse
Vor der BAL (t0) ist der pO² signifikant verschieden zwischen den Gruppen SkgTexelk (p<0,001) und Skk-Texelk (p<0,013), Skg-Texelg (p<0,0001) und Skk-Texelg
(p<0,001).
140
130
120
pO 2 [mmHg]
110
100
90
80
t0
70
60
Skg
Skk
n=8
ober. Quart.
M ax.
M in.
unt. Quart.
M edian
t1
Texelk
n=11
Texelg
n=27
n=8
Skg
Skk
n=7
t2
Texelk
n=2
Skg
Skk
Texelk
n=19
n=8
n=11
n=22
120,075
113
106
98,5
111,1
111
112,25
118,325
118,15
109,4
122,9
118,95
127,75
105
119,3
111
122,75
122,55
123,5
127,6
75,5
104,4
101,45
65,5
83,66
106,3
106,5
80,25
107,5
103,45
109,325
102,75
89,575
92,33
107,3
106,5
94,5
109,75
104,6
88
115,9
110,85
97
95,75
108,9
108,75
106,5
114,4
110,1
103,4
Abb. 8: Arterieller Sauerstoffpartialdruck (pO²) der Diagnosegruppen. Innerhalb
der Boxen sind die Werte zwischen dem oberen 75%-Quartil und dem unteren 25 %Quartil dargestellt. Der graue Balken markiert den Medianwert. Die Enden der Striche
ober- und unterhalb der Boxen markieren die Maximal- und Minimalwerte.
57
Ergebnisse
Es besteht ein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen Skg-Skk (p<0,01)
und Skk-Texelk (p<0,001) zum Zeitpunkt t1 hinsichtlich des pCO2. Zu t2 ist der
Unterschied zwischen Skg-Texelk signifikant (p<0,01).
55
pCO 2 [mmHg]
50
45
40
35
t0
30
Skg
Skk
n=8
t1
Texelk
Texelg
n=11
n=27
n=8
Skg
Skk
n=7
t2
Texelk
Skg
Skk
Texelk
n=2
n=19
n=8
n=11
n=22
42,425
42,25
44,9
40,25
42
34
42,5
38,7
40,05
43,95
M ax.
46,6
42,85
50,5
40,5
45,4
34
47
41
42,7
53,6
M in.
39,1
34
33,5
35
36,4
33,5
31
34,3
32
33
40,075
35,3
36,5
36,66
37,1
33,5
36
35
34,4
37
41,15
39,8
39,5
39,16
39,1
33,75
38
37,375
37,3
42,325
ober. Quart.
unt. Quart.
M edian
Abb. 9: Arterieller Kohlendioxidpartialdruck (pCO²) der Diagnosegruppen.
Innerhalb der Boxen sind die Werte zwischen dem oberen 75%-Quartil und dem unteren
25 %-Quartil dargestellt. Der graue Balken markiert den Medianwert. Die Enden der
Striche ober- und unterhalb der Boxen markieren die Maximal- und Minimalwerte.
58
Ergebnisse
Zu t0 ist der Unterschied der Baseexzesse zwischen den Gruppen Skg und Skk
signifikant (p<0,05). Zu t2 besteht ein signifikanter Unterschied zwischen Skg-Skk
(p<0,05) und Skk-Texelk (p<0,01).
14
12
10
8
BE
6
4
2
0
-2
-4
-6
t1
t0
Skg
Skk
n=8
Texelk
n=11
Texelg
n=27
n=8
Skg
Skk
t2
Texelk
n=6
n=2
Skg
Skk
n=19
n=8
Texelk
n=11
n=22
ober. Quart.
4,75
9,5
9,9
7,175
5
2,15
7,55
4,325
4,5
6,9
Max.
8,9
14,2
15,7
9
8,3
2,15
13,05
4,9
6,25
13,6
Min.
0,3
0,1
-1,2
2,7
-0,1
-2,1
-5,6
1,55
-4
-2,1
unt. Quart.
0,8
5,2
1,6
2,85
0,5
-2,1
0,35
2,25
-2,3
3,2
Median
2,35
6,8
6
4,075
2,9
0,025
1,95
3,525
-0,7
4,675
Abb. 10: Arterielle Basenexzesse (BE) der Diagnosegruppen. Innerhalb der Boxen
sind die Werte zwischen dem oberen 75%-Quartil und dem unteren 25 %-Quartil
dargestellt. Der graue Balken markiert den Medianwert. Die Enden der Striche ober- und
unterhalb der Boxen markieren die Maximal- und Minimalwerte.
59
Ergebnisse
Die durchschnittliche alveoloarterielle Sauerstoffdruckdifferenz wurde aus den
arteriellen
Sauerstoff-
und
Kohlendioxidpartialdrücken
und
dem
zum
Entnahmezeitpunkt herrschenden Barometerdruck errechnet.
Zum Zeitpunkt t0 besteht ein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen SkgSkk (p<0,05), Skk-Texelk (p<0,05), Skg-Texelk (p<0,001), Skg-Texelg (p<0,0001)
und Skk-Texelg (p<0,001).
Zum Zeitpunkt t1 bestehen keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen.
Zum Zeitpunkt t2 besteht ein signifikanter Unterschied (p<0,05) zwischen den
Gruppen Skg-Texelk.
∆A-aO2 [mmHg]
50
40
30
20
10
0
-10
-20
ober. Quart.
t0
Skg
Skk
t1
Texelk
Texelg
Skg
Skk
t2
Texelk
Skg
Skk
Texelk
n=8
n=11
n=27
n=8
n=7
n=2
n=19
n=8
n=11
n=22
0,9917
7,7121
18,53
19,43
5,959
7,6975
17,58
2,6844
7,0104
20,6975
Max.
4,3174
9,6121
42,98385
25,63
7,96375
7,6975
31,1668
6,3495
10,0604
31,245
Min.
-11,4164
-2,68595
-7,9228
3,85255
-7,9315
2,71845
-6,6717
-6,3329
-5,3379
-10,903
unt. Quart.
-8,04545
0,5797
5,066
13,934
-1,99435
2,71845
2,29
-2,1248
-3,01055
0,5096
Median
-4,0914
3,9107
9,967
15,59
3,73805
5,207975
7,25
-1,02367
3,504
8,8099
Abb. 11: Durchschnittliche alveoloarterielle Sauerstoffdifferenz (∆A-aO2) der
Diagnosegruppen. Innerhalb der Boxen sind die Werte zwischen dem oberen 75%Quartil und dem unteren 25 %-Quartil dargestellt. Der graue Balken markiert den
Medianwert. Die Enden der Striche ober- und unterhalb der Boxen markieren die Maximalund Minimalwerte.
60
Ergebnisse
4.6
Bronchoskopische Befunde
Bei 7 Tieren war die Schleimhaut der Trachea gerötet, bei 3 Tieren waren die
Trachealgefäße hochgradig injiziert und bei 4 Tieren war die Trachealschleimhaut
mittelgradig geschwollen. Die Befunde verteilten sich nahezu gleichmäßig über alle 4
Gruppen.
4.7
Zytologische Befunde der bronchoalveolären Lavage
Die Gesamtzellzahl in der BAL-Flüssigkeit (BALF) wurde durch Zählung in der
Zählkammer ermittelt. Signifikante Unterschiede ergaben sich zwischen den
Gruppen Skk-Texelk (p<0,05) und Skg-Texelk (p<0,05).
0,7
0,6
Zellzahl [G/l]
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
Skg
Skk
Texelk
Texelg
n=8
n=11
n=27
n=8
o ber. Quart.
0,08
0,12
0,19
0,13
M ax.
0,11
0,15
0,65
0,2
M in.
0,05
0,02
0,01
0,03
0,06
0,05
0,07
0,0375
0,065
0,07
0,1
0,085
unt. Quart.
M edian
Abb. 12: Gesamtzellzahlen in der BALF der Diagnosegruppen. Innerhalb der Boxen
sind die Werte zwischen dem oberen 75%-Quartil und dem unteren 25 %-Quartil
dargestellt. Der graue Balken markiert den Medianwert. Die Enden der Striche ober- und
unterhalb der Boxen markieren die Maximal- und Minimalwerte.
61
Ergebnisse
Die Lymphozytenfraktion und der Anteil der segmentkernigen Granulozyten nahmen
sowohl absolut, wie auch prozentual von den gesunden Tieren der Gruppe Skg zu
den kranken Tieren der Gruppe Texelk signifikant zu (p<0,05).
1
0,1
Zellzahl [G/l]
0,01
Makrophagen
Lymphozyten
0,001
Segmentk.
0,0001
0,00001
Makrophagen
Skg
Skk
Texelk
Texelg
0,06755
0,08793
0,0997
0,08231
0,00137
0,00325
0,0003
0,00318
0,0072
Lymphozyten
0,001
Segmentk.
Abb. 13: Differentialzellbilder der BALF der Diagnosegruppen in G/l.
100
90
80
Zellzahl [%]
70
60
Makrophagen
50
Lymphozyten
40
Segmentk.
30
20
10
0
Makrophagen
Skg
Skk
Texelg
n=5
n=6
n=19
n=8
97
95,35
92
98
1,1
1,5
0,3
2
2,85
6
Lymphozyten
Segmentk.
Texelk
Abb. 14: Differentialzellbilder der BALF der Diagnosegruppen in %.
62
Ergebnisse
4.8
Lymphozytensubsets
Bei allen Tieren wurden Blut und BALF hinsichtlich ihres Anteils an CD4+- und
CD8+-Lymphozytensubsets analysiert. Es wurden sowohl die prozentualen Anteile,
wie auch das Verhältnis zueinander berechnet (ratio CD4+/CD8+). BALF mit
Blutbeimengungen wurden von der Studie ausgeschlosssen, da nicht zwischen den
Lymphozytensubsets der BALF und des Blutes unterschieden werden konnte. Auch
Proben mit weniger als 33 gezählten events in der Durchflußzytometrie wurden
ausgeschlossen. Diese Selektion führte in der Gruppe Texelg zu einer geringen
Anzahl auswertbarer Proben (n=2).
Die Unterschiede der prozentualen Anteile der CD8+-subsets zwischen den Gruppen
sind nicht signifikant.
80
CD8+[%]
60
40
20
0
Skg
Skk
n=8
Texelk
n=9
Texelg
n=17
n=2
36,85
37,5
50,8
28,2
Max.
44,3
77,7
70,6
28,2
Min.
20,8
9,8
1,2
21,5
unt. Quart.
23,2
15,4
23,4
21,5
Median
27,1
26,5
37,6
ober. Quart.
Abb. 15: Prozentualer Anteil der CD8+ an den Lymphozytensubpopulationen in
der BALF der Diagnosegruppen. Innerhalb der Boxen sind die Werte zwischen
dem oberen 75%-Quartil und dem unteren 25 %-Quartil dargestellt. Der graue Balken
markiert den Medianwert. Die Enden der Striche ober- und unterhalb der Boxen markieren
die Maximal- und Minimalwerte.
63
Ergebnisse
Die Unterschiede der prozentualen Anteile der CD4+-subsets zwischen den Gruppen
sind nicht signifikant.
80
70
60
50
CD4+[%]
40
30
20
10
0
Skg
Skk
n=8
Texelk
n=9
Texelg
n=17
n=2
ober. Quart.
34,55
43,5
38,2
30,2
Max.
37,6
64,3
67,2
30,2
Min.
11,6
10,3
1,3
11,25
unt. Quart.
23,75
28,2
10,6
11,25
Median
28,85
40
17,7
Abb. 16: Prozentualer Anteil der CD4+ an den Lymphozytensubpopulationen in
der BALF der Diagnosegruppen. Innerhalb der Boxen sind die Werte zwischen
dem oberen 75%-Quartil und dem unteren 25 %-Quartil dargestellt. Der graue Balken
markiert den Medianwert. Die Enden der Striche ober- und unterhalb der Boxen markieren
die Maximal- und Minimalwerte.
64
Ergebnisse
Es bestehen keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen bezüglich der
ratio CD4+/CD8+ in der BALF.
4
3,5
3
ratio CD4+/CD8+
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Skg
Skk
n=8
Texelk
n=9
Texelg
n=17
n=2
ober. Quart.
1,11
2,6
1,37
2,51
Max.
1,33
6,53
3,79
2,51
Min.
0,49
0,26
0,13
1,41
unt. Quart.
0,645
0,83
0,21
1,41
Median
1,005
1,56
0,72
Abb. 17: Verhältnis der CD4+ zu den CD8+ in der BALF der Diagnosegruppen.
65
Ergebnisse
Ein signifikanter Unterschied bezüglich der CD8+ Lymphozytensubsets im Blut
besteht zwischen den Gruppen Skg-Texelk (p<0,05), Skg-Texelg (p<0,5), Skk-Texelg
(p<0,05) und Texelk-Texelg (p<0,001).
90
80
70
60
CD8+[%]
50
40
30
20
10
0
Skg
Skk
Texelk
Texelg
n=8
n=10
n=24
n=8
ober. Quart.
34,2
35
55,9
15,7
Max.
43,1
76,2
70,2
38,9
Min.
16,1
10,7
7,1
5,7
18
23
26,55
9,3
25,05
30,15
42,45
12,75
unt. Quart.
Median
Abb. 18: Prozentualer Anteil der CD8+ an den Lymphozytensubpopulationen im
Blut der Diagnosegruppen. Innerhalb der Boxen sind die Werte zwischen dem
oberen 75%-Quartil und dem unteren 25 %-Quartil dargestellt. Der graue Balken markiert
den Medianwert. Die Enden der Striche ober- und unterhalb der Boxen markieren die
Maximal- und Minimalwerte.
66
Ergebnisse
Signifikante Unterschiede bezüglich der CD4+-Lymphozytensubsets bestehen
zwischen Skk-Texelk (p<0,05), Skg-Texelk (p<0,01), Skg-Texelg (p<0,001), SkkTexelg (p<0,001), Texelk-Texelg (p<0,001).
80
70
60
50
CD4+[%]
40
30
20
10
0
Skg
Skk
Texelk
Texelg
n=8
n=10
n=24
n=8
48,45
39,2
32,1
12,8
Max.
51,5
51,6
70
21,2
Min.
23,6
13,8
10
6,7
unt. Quart.
31,5
34
14,3
8,6
36,55
37,25
17,55
10,15
ober. Quart.
Median
Abb. 19: Prozentualer Anteil der CD4+ an den Lymphozytensubpopulationen im
Blut der Diagnosegruppen. Innerhalb der Boxen sind die Werte zwischen dem
oberen 75%-Quartil und dem unteren 25 %-Quartil dargestellt. Der graue Balken markiert
den Medianwert. Die Enden der Striche ober- und unterhalb der Boxen markieren die
Maximal- und Minimalwerte.
67
Ergebnisse
Signifikant (p<0,05) ist der Unterschied bezüglich der ratio CD4+/CD8+ im Blut
zwischen den Gruppen Skg-Texelk.
4
3,5
3
ratio CD4+/CD8+
2,5
2
1,5
1
0,5
0
ober. Quart.
Max.
Skg
Skk
Texelk
Texelg
n=8
n=11
n=24
n=8
2,295
1,72
0,995
1,77
3,19
3,67
5,43
2,8
0,55
0,18
0,17
0,27
unt. Quart.
0,985
0,64
0,245
0,525
Median
1,705
1,19
0,37
0,675
Min.
Abb. 20: Verhältnis der CD4+ zu den CD8+ im Blut der Diagnosegruppen.
68
Ergebnisse
Korrelationen
Vergleicht man das prozentuale Verhältnis der CD4+ im Blut/in der BAL und der
CD8+ im Blut / in der BAL, so besteht nur in der Gruppe Skk eine signifikant positive
Korrelation bezüglich der CD4+ (p<0,01).
60
50
y = 0,8234x + 0,7802
CD4+ im Blut [%]
R2 = 0,836
40
30
20
10
0
0
10
20
30
40
50
60
70
CD4+ in der BALF[%]
Abb. 21: Korrelation zwischen den CD4+ im Blut und in der BALF der Gruppe
Skk.
69
Ergebnisse
4.9
Serologische und molekularbiologische Befunde
In der Gruppe Skg waren alle Tiere im Maedi-ELISA sowie in der PCR negativ.
In der Gruppe Skk zeigten 91% der Tiere ein positives Maedi-ELISA- und 64% ein
positives Maedi-PCR-Ergebnis. Kein Schaf war im Maedi-ELISA negativ, jedoch
36,4% in der Maedi-PCR. Neun Prozent der Tiere hatten ein fragliches Ergebnis im
ELISA. Alle Schafe dieser Gruppe hatten zumindest in einem der beiden
Testverfahren ein positives Ergebnis.
Alle Texelschafe der Gruppe Texelg waren negativ in der Maedi-PCR und im MaediELISA.
Die Schafe der Gruppe Texelk zeigten im Maedi-ELISA zu 85% ein positives
Ergebnis, bei 4% negativen und bei 11% fraglichen Ergebnissen. Die PCR war bei
59% der Tiere positiv, bei 41% negativ. Alle Tiere waren mindestens in einem der
Tests positiv.
Tabelle 7:
Übersicht der Maedi-PCR und ELISA- Ergebnisse
Maedi-ELISA
Rasse Gruppe
SKF
Texel
Maedi-PCR
N
positiv negativ fraglich
positiv
negativ
Skg
8
(100%)
0
8
(100%)
0
0
8
(100%)
Skk
11
(100%)
10
(90,9%)
0
(0%)
1
(9,09%)
7
(63,63%)
4
(36,36)
Texelg
8
(100%)
0
8
(100%)
0
0
8
(100%)
Texelk
27
(100%)
23
(85,2%)
1
(3,7)
3
16
(11,11%) (59,25%)
70
11
(40,74%)
Ergebnisse
4.10 Postmortale Befunde
Bei
allen
sezierten
Tieren
wurde
vor
Entnahme
der
Lungenproben
das
Lungengewicht ermittelt. Es zeigte sich ein signifikanter Unterschied zwischen den
Gruppen SKg-Texelk (p<0,001) und Skk-Texelk (p<0,05).
2500
2000
Lungengewicht [g]
1500
1000
500
0
Skg
Skk
Texelk
n=8
n=11
n=27
ober. Quart.
675
950
1800
Max.
720
1500
2120
Min.
500
450
500
unt. Quart.
605
500
850
Median
640
700
1250
Abb. 22: Lungengewicht der Diagnosegruppen. Innerhalb der Boxen sind die Werte
zwischen dem oberen 75%-Quartil und dem unteren 25 %-Quartil dargestellt. Der graue
Balken markiert den Medianwert. Die Enden der Striche ober- und unterhalb der Boxen
markieren die Maximal- und Minimalwerte.
Die Tiere der Gruppe Skg zeigten keine interstitielle Pneumonie (IP).
In der Gruppe Skk zeigten 18 % der Tiere keine IP, 64 % eine geringgradige (ggr.)
und 18 % eine geringgradige bis mittelgradige (mgr.) IP.
Die Tiere der Gruppe Texelk teilten sich auf in 11 % ohne IP, 19 % ggr. IP,
7 % ggr.-mgr. IP, 19 % mgr. IP, 4 % mittelgradig-hochgradige (hgr.). IP und 41 %
hgr. IP.
Ein signifikanter Unterschied in der Häufigkeit der Diagnosen und Diagnosegrade
besteht zwischen Skg-Skk (p<0,01), Skk-Texelk (p<0,01) und Skg-Texelk (p<0,01).
71
Ergebnisse
12
Anzahl der Tiere
10
keine IP
8
ggr.
ggr.-mgr.
6
mgr.
mgr.-hgr.
4
hgr.
2
0
Skg (n=8)
Skk (n=11)
Texelk (n=26)
Gruppe
Abb. 23: Anzahl der Tiere je Ausprägungsgrad der interstitiellen Pneumonie in
den Diagnosegruppen.
Prozentsatz d. Tiere [%]
120
100
80
60
40
20
0
Skg (n=8)
Skk (n=11)
Texelk (n=26)
100
18,18
11,5
ggr.
0
63,63
15,4
ggr.-mgr.
0
18,18
7,7
mgr.
0
0
19,2
mgr.-hgr.
0
0
3,8
hgr.
0
0
42,3
keine IP
Gruppe
Abb. 24: Prozentsatz
der
Tiere
je
Ausprägungsgrad
der
IP
in
den
Diagnosegruppen. In der Gesamtheit der Tiere besteht eine signifikante Korrelation
(p<0,001) zwischen dem Grad der IP und dem Lungengewicht. Betrachtet man die
Gruppen einzeln, zeigt sich nur innerhalb der Gruppe Texelk eine signifikante Korrelation
(p<0,05).
72
Ergebnisse
2500
Lungengewicht [g]
2000
1500
1000
500
y = 275,69x + 699,54
R2 = 0,3979
0
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
Grad der IP
Abb. 25: Verteilung der Lungengewichte aller untersuchten Tiere (n=48) aller
Gruppen in Bezug zum Grad der interstitiellen Pneumonie. Scorewert 0
bedeutet keine IP, 1 ggr. IP, 1,5 ggr.-mgr. IP, 2 mgr. IP, 2,5 mgr.-hgr. IP und 3 hgr. IP.
Berücksichtigt man nur Tiere ohne weitere Lungenerkrankungen besteht weiterhin eine
signifikante Korrelation (p<0,05).
73
Ergebnisse
2500
Lungengewicht [g]
2000
1500
1000
y = 191,81x + 717,48
2
R = 0,2325
500
0
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
Grad der IP
Abb. 26: Verteilung
der
Lungengewichte
der
Tiere
(n=34)
ohne
Sekundärerkrankungen der Lunge aller Gruppen in Bezug zum Grad
der interstitiellen Pneumonie. Scorewert 0 bedeutet keine IP, 1 ggr. IP, 1,5 ggr.mgr. IP, 2 mgr. IP, 2,5 mgr.-hgr. IP und 3 hgr. IP.
Sekundärbefunde
Ein Tier (12,5%) der Gruppe Skg hatte Verklebungen der Pleura.
In der Gruppe Skk zeigten 4 Tiere (36%) eine Hyperplasie des BALT, 2 Tiere (18%)
eine abszedierende Pneumonie und ein Tier (9%) eine Bronchpneumonie.
Tiere der Gruppe Texelk hatten in 18 Fällen (69%) eine BALT-Hyperplasie, in 4
Fällen (15%) eine Fibrose, in 11 Fällen (42%) eine eitrige Bronchopneumonie und 3
Tiere (11,5%) hatte Verklebungen mit der Pleura.
Die Tiere der Gruppe Texelg wurden nicht seziert.
74
Ergebnisse
4.11 Beziehungen
zwischen
den
Röngenscoresummen
und
den
Lungengewichten
Zwischen dem Röntgenscore und dem Lungengewicht zeigte sich über alle Rassen
gesehen eine signifikante (p<0,001) positive Korrelation (Abb 28).
Innerhalb der Gruppe Skg gibt es keine signifikante Korrelation (ohne Abb).
Für die Gruppen Skk (p<0,05) (siehe Abb.29) und Texelk (p=0,01) (siehe Abb. 30)
liegt eine signifikante Korrelation vor.
2500
y = 56,099x - 418,04
2
R = 0,4439
Lungengewicht [g]
2000
1500
1000
500
0
15
20
25
30
35
40
Röntgenscore
Abb. 27: Korrelation zwischen dem Lungengewicht und dem Röntgenscore
über alle Gruppen (n=43).
75
Ergebnisse
In der Gruppe Skk besteht eine signifikante Korrelation (p<0,05).
1600
y = 59,47x - 548,15
Lungengewicht [g]
1400
2
R = 0,7657
1200
1000
800
600
400
200
0
15
20
25
30
35
Röntgenscore
Abb. 28: Korrelation zwischen dem Lungengewicht und dem Röntgenscore in
der Gruppe Skk.
Deutliche Signifikanz in der Gruppe Texelk (p=0,01).
2500
y = 48,996x - 85,747
R2 = 0,3184
Lungengewicht [g]
2000
1500
1000
500
0
15
20
25
30
35
40
Röntgenscore
der Gruppe Texelk.
76
Diskussion
5
Diskussion
Maedi ist eine weltweit auftretende, durch das Maedi-Visna-Virus hervorgerufene
Lungenerkrankung des Schafes. Neben interstitiellen Pneumonien kann es zu
Enzephalomyelitiden, interstitiellen Mastitiden und in seltenen Fällen zu chronischnichteitrigen Arthritiden kommen.
Aufgrund der Abmagerung trotz guter Futteraufnahme (BULGIN 1990), den Aborten
und der verminderten Milchleistung (CHRISTODOULOPOULOS 2006) kommt es
unter einigen Rassen weltweit zu hohen wirtschaftlichen Verlusten. Dem gegenüber
stehen Untersuchungen an Assafschafen, bei denen keine wirtschaftlichen Verluste
festgestellt wurden (KENIGSWALD et al. 2009).
Verschiedene Studien zeigten eine deutliche Rasseempfindlichkeit hinsichtlich der
Ausprägung der klinischen Symptome und der Organveränderungen und weniger
gegenüber der Infektion (STRAUB 2004; ZINK Johnson 1994).
KENIGSWALD et al. (2009) verglichen die Milchproduktion und die Ablammrate von
serologisch Maedi positiven und serologisch Maedi negativen Schafen einer AssafMilchschafherde und konnten keine Unterschiede feststellen. Auch PERK et al.
(1996) beobachteten bei Awassischafen in einer 20-jährigen Studie keine klinischen
Symptome.
Im
Gegensatz
dazu
zeigte
in
der
von
DAWSON
(1987)
untersuchten
Milchschafherde mit klinischer Maedi über 60% der Muttern eine verringerte
Milchleistung aufgrund einer chronisch lymphoiden Mastitis.
Nach Island importierte MVV-positive Karakulschafe zeigten nie klinische Symptome,
man konnte jedoch beobachten, dass die Lungenveränderungen bei den
reinrassigen Islandschafen schneller voranschritten als bei den Kreuzungstieren aus
Islandschaf x Border Leicester (PALSSON 1976).
Aufgrund dieser deutlichen und teilweise offensichtlichen Rasseunterschiede in der
klinischen Ausprägung einer MVV-Infektion sollten in dieser Studie Unterschiede
zwischen den als unempfindlich geltenden Schwarzköpfigen Fleischschafen (SKF)
und den hochempfänglichen Texelschafen untersucht werden.
77
Diskussion
Ein Vergleich fand sowohl zwischen den Maedi positiven und den Maedi negativen
Tieren einer Rasse, als auch den beiden Rassen untereinander bezüglich der
Parameter
klinische
Symptome,
röntgenologisch
sichtbare
Veränderungen,
hämatologische, zytologische und immunologische Unterschiede, Blutgase und Grad
der pathologischen Lungenveränderungen statt.
Weiterhin wurde ein Protokoll zur PCR-Diagnostik des Maedi-Visna-Virus (MVV) an
der Klinik für kleine Klauentiere etabliert.
Aufgrund der Ergebnisse verschiedenster Forschungsgruppen war zu erwarten, dass
es zu einer stetigen Verstärkung der Veränderungen in der Reihenfolge der Gruppen
gesunde Schwarzköpfige Fleischschafe (Skg) / gesunde Texelschafe (Texelg) –
Maedi positive Schwarzköpfige Fleischschafe (Skk) – Maedi positive Texelschafe
(Texelk) kommen würde. Weiterhin war zu erwarten, dass die jeweiligen Parameter
bei den Maedi positiven Tieren einer Rasse gegenüber denen der gesunden Tiere
verschlechtert sind. Die Ergebnisse dieser Studie folgen den Erwartungen jedoch nur
bezüglich weniger Parameter.
Worin hier die Ursachen liegen und welche Schlussfolgerungen man daraus ziehen
kann, wird im Folgenden diskutiert.
5.1
Etablierung einer MVV-PCR
In dieser Studie wurde ein modifiziertes Protokoll einer PCR von EXTRAMIANA et al.
(2002) zum Nachweis von Maedi-Visna-Virusantigen verwendet. Die Primer blieben
unverändert. EXTRAMIANA et al. (2002) erzielten dabei eine Sensitivität von 97,7%
bezüglich der Ergebnisse von ELISA und AGIDT. Die Spezifität lag bei 100%.
In dieser Studie waren alle Tiere der Gruppen Skg und Texelg in der Maedi-PCR
negativ. In der Gruppe Skk wurde eine Sensitivität von 64% erreicht, in Gruppe
Texelk 59%. Sowohl bei EXTRAMIANA et al. (2002) als auch in dieser Studie galt ein
Tier als positiv, wenn eines der untersuchten Gewebe ein positives PCR-Ergebniss
aufwies. Nach dreimaligem negativen Ergebnis wurde das Tier in dieser Studie als
78
Diskussion
negativ in der PCR eingestuft. Die Anzahl der Untersuchungen bei EXTRAMIANA et
al. (2002) sind nicht bekannt.
Ein Grund für die Diskrepanz der Sensitivitäten könnten die unterschiedlichen
untersuchten Materialien sein. EXTRAMIANA et al. (2002) verwendeten Blut, Milch
und Lungengewebe aus den Zwerchfelllappen, periventrikuläre Bereiche des
Dienzephalon mit choroiden Plexuszellen, zentrales Eutergewebe, zentrales
Milzgewebe und Lymphknotengewebe. In dieser Studie wurden Blut, BALF,
Lungenlymphknoten und Lungengewebe verwendet. Da die Konzentration der VirusDNS mitentscheidend für das Gelingen der PCR ist, ist hierin wahrscheinlich die
Hauptursache für die geringe Sensitivität der PCR zu sehen.
5.2
Auswahl der Versuchstiere
Für diese Studie wurden die beiden Rassen Texelschaf und Schwarzköpfiges
Fleischschaf (SKF) gewählt. Texelschafe zeigen nach den Beobachtungen von
STRAUB (2004) und GANTER (persönliche Mitteilung) schon in einem frühen
Krankheitsstadium eine deutliche Maedisymptomatik. Das SKF hingegen zeigt laut
WENDT et al. (1987) und GANTER (persönliche Mittelung) erst nach einer sehr
langen Inkubationszeit klinische Symptome einer MVV-Infektion.
Die Versuchstiere der Gruppen Skg und Texelg stammten aus zertifiziert Maedi
unverdächtigen Beständen. Tiere der Gruppen Skk und Texelk stammten aus
Betrieben, in denen klinische Maedi aufgetreten war. Da es sich immer um eine
Feldinfektion handelte, war der Zeitpunkt der Infektion bei keinem der Tiere bekannt.
Laut PÉTURSSON et al. (1992), BLACKLAWS et al. (2004) und BRODIE et al.
(1994) ist jedoch die Wahrscheinlichkeit einer Infektion durch das Muttertier am
höchsten. Deshalb wurden nach Möglichkeit Tiere der Altersgruppe über 4 Jahre
aufgekauft. Dies konnte jedoch nicht immer gewährleistet werden. Die Tiere der
Gruppen Skg, Skk und Texelk waren anhand des Zahnalters über 4 Jahre alt,
während die gesunden Texelschafe der Gruppe Texelg ein Alter unter 2 Jahren
hatten. Sie stammten aus einem frisch über mutterlose Aufzucht sanierten Betrieb.
79
Diskussion
Alle Bestände werden durch den Gesundheitsdienst für Kleinwiederkäuer Hannover
betreut.
Hauptauswahlkriterien für die Gruppe Skg waren die entsprechende Altersgruppe
(> 4 Jahre) und die enge genetische Verwandschaft zu Tieren der Gruppe Skk. Die
Tiere der Gruppe Skg und ein Teil der Tiere aus Gruppe Skk stammten aus demselben Ursprungsbestand. Der Bestand wurde 2003 durch Eliminierung serologisch
Maedi-positiver Tiere (Skk) und durch mutterlose Aufzucht (Skg) saniert. Trotz
intensiver Bemühungen standen für die Gruppe Texelg nur junge Tiere unter 2
Jahren zur Verfügung. Dies schränkt aufgrund von Altersunterschieden die
Vergleichbarkeit einiger Parameter stark ein.
Auswahlkriterien der kranken Tiere waren innerhalb der Herden das Alter, sichtbare
Dyspnoe, insbesondere im Verhältnis zu den anderen Tieren der Herde,
Abmagerung ungeklärter Genese und auskultatorisch fauchende Atemgeräusche.
Ziel dieser Selektionskriterien war es, Tiere im fortgeschrittenen Stadium einer reinen
Maediinfektion ohne weitere Sekundär- oder Begleiterkrankungen der Lunge zu
selektieren.
Da
laut
DAWSON
et
al.
(2005)
bei
reiner
Maedi
ohne
Sekundärinfektionen nicht mit Nasenausfluß zu rechnen ist, wurden Tiere mit
hochgradig eitrigem Nasensekret und rasselnden Atemgeräuschen von der Studie
ausgeschlossen. Kritisch zu betrachten sind Tiere mit geringem Nasenausfluß und
solche, die erst in der Klinik für kleine Klauentiere Symptome einer bakteriellen
Sekundärinfektion
zeigten.
Da
alle
Tiere
lebenslang
einem
natürlichen
Infektionsdruck ausgesetzt waren, ist die Wahrscheinlichkeit einer früheren oder
momentan bestehenden bakteriellen Sekundärinfektionen gegeben.
5.3
Statistisch ließ sich nur beim Körpergewicht ein signifikanter Unterschied zwischen
den Gruppen feststellen. Die Tiere der Gruppe Skk hatten ein signifikant (p<0,05)
niedrigeres Körpergewicht (KG) als Tiere der Gruppe Skg. Dies mag nicht allein auf
der MVV Infektion beruhen, sondern könnte auch daher rühren, dass die Skg aus
80
Diskussion
einer Koppelschafherde mit sehr gutem Management und Fütterung kamen, während
10 der 13 Skk aus einer Wanderschafherde stammten, bei der die Futtergrundlage
zeitweise knapp war. Zwischen den Gruppen Texelg und Texelk gab es keinen
signifikanten Unterschied bezüglich des Gewichtes. Die Tiere der Gruppe Texelg
waren leichter als die der Gruppe Texelk. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die
Tierzahl sehr unterschiedlich war (27 vs. 8) und dass die acht gesunden Texel noch
nicht voll ausgewachsen waren. Maedi unverdächtige Texelschafe der Altersgruppe
über 4 Jahre standen trotz intensiver Bemühungen nicht zur Verfügung. Ein
Vergleich zwischen den Rassen ist aufgrund der unterschiedlichen Genetik und der
unterschiedlichen Haltungs- und Fütterungsbedingungen nicht möglich. Hinsichtlich
der Befunde der Allgemeinuntersuchung bestätigten sich die Beobachtungen von
GANTER (1996). Auch in dieser Studie ließ sich anhand der Allgemeinuntersuchung
kein gesicherter Hinweis auf eine Lungenerkrankung finden. Tiere aller Gruppen
zeigten zeitweise spontanen Husten und Nasenausfluß. Atem- und Herzfrequenz
waren stark vom bisherigen Umgang mit Menschen und damit von der Erregung bei
der Untersuchung abhängig, und die Werte waren bis auf wenige Ausnahmen bei der
Abschlussuntersuchung zum Zeitpunkt der Euthanasie im Referenzbereich.
Laut GANTER (1996) stellt die Auskultation ein sehr sensibles Instrument dar, um
gesunde von kranken Schafen zu unterscheiden. Es sind jedoch für bestimmte
Lungenerkrankungen keine typischen Geräuschveränderungen feststellbar. CURTIS
et al. (1986) und PRINGLE (1992) beschreiben ein physiologisch auftretendes
inspiratorisch ggr. fauchendes Atemgeräusch im Bereich der Bronchialaufzweigung,
ihrer Umgebung und über den Zwerchfelllappen. Bei adipösen Tieren sind diese
bronchobronchulären Atemgeräusche über den Zwerchfelllappen nicht hörbar. Diese
Beobachtungen bestätigten sich in dieser Studie hinsichtlich der Einteilung des
Schweregrades der Atemgeräusche in Abhängigkeit vom Ernährungszustand des
Tieres. Gut genährte Tiere mit einer mgr. interstitiellen Pneumonie (IP) hatten
auskultatorisch geringere Atemgeräusche als magere Tiere mit einer ggr. interst.
Pneumonie. Sowohl bei den adipösen Tieren der Gruppen Skg, wie auch bei den
Texelk sind keine oder lediglich ggr. Atemgeräusche hörbar. Somit entstand der
81
Diskussion
Eindruck,
dass
der
Ernährungszustand
einen
größeren
Einfluß
auf
die
Auskultationsbefunde hat als der Grad der interstitiellen Pneumonie.
5.4
Blutgase
Bei der Messung der Blutgaswerte erwarteten wir ähnliche Werte bei den gesunden
Tieren der Gruppen Skg und Texelg. Tiere der Gruppe Skk zeigen selten Dyspnoe
als Folge einer MVV-Infektion und wir erwarteten schlechtere Werte wie bei den
gesunden Tieren, aber bessere Werte als bei der Gruppe Texelk. In der
Untersuchung selbst ergaben sich jedoch einige Faktoren, die das Ergebnis der
Blutgasanalysen unabhängig vom Maedi-Status maßgeblich beeinflussten. Die Tiere
der Gruppe Skg waren den Umgang mit den Menschen gewohnt, versuchten sich
aber massiv der direkten Fixation durch Flucht oder auch Angriff zu entziehen.
Dieses Verhalten verstärkte sich von Tag 0 zu Tag 8. Diese Tiere zeigten meist
Hyperventilation, welche zu niedrigeren pH-Werten und vergleichsweise hohen pO2 Werten führte. Die Tiere der Gruppe Texelg stammten aus einer mutterlos
aufgezogenen
Herde
und
zeigten
keinerlei
Stresssymptome
während
der
Blutentnahme. Da diese Gruppe nach der BAL zum Besitzer zurückging, erfolgte
keine Messung an den Tagen 3 und 8.
Die Gruppe Texelk bestand sowohl aus Tieren, die den Umgang mit dem Menschen
gewohnt waren, wie auch aus wenig gewöhnten Schafen, was die breite Variation
der Blutgaswerte erklärte.
Nach GANTER (1996) stellt die alveoloarterielle O2-Differenz den empfindlichsten
Indikator hinsichtlich einer Beeinträchtigung der Atmung dar. Bei seinen gesunden
Tieren lag der Median bei 12mmHg und bei den Maedi kranken Tieren bei 15mmHg.
Der Median der hier gemessenen alveoloarteriellen O2-Differenzen vor der Spülung
lag bei den Skg bei -4mmHg, Texelg bei 14,9mmHg, Skk bei 3,9mmHg und bei den
Texelk bei 9,77mmHg. Diese unerwartete Verteilung der Werte legt die Vermutung
nahe, dass die alveoloarterielle Druckdifferenz nur zu einem gewissen Prozentsatz
von den Veränderungen der Lunge beeinflusst wird. Vielmehr spielt die erhöhte
Atemfrequenz hervorgerufen durch die Aufregung bei Schafen, die den Umgang mit
82
Diskussion
dem Menschen nicht gewohnt sind, eine entscheidende Rolle. Dies zeigt sich
signifikant (p<0,0001) zwischen widersetzlichen Tieren der Gruppe Skg, welche stark
hyperventilierten und der ruhigen, durch die mutterlose Aufzucht an den Menschen
gewöhnten Tiere der Gruppe Texelg.
Für die Analyse der Blutgase wurde ein Gerät aus der Humanmedizin verwendet. Mit
Hilfe manueller Eingabe der Körpertemperatur, des Geschlechtes und des
Hämoglobingehaltes berechnet es die verwendeten Parameter auf Grundlage
humaner physiologischer Daten. Inwieweit sich die Berechnung unter Annahme
menschlichen Hämoglobines, weiblichen Geschlechtes und Erwachsenenalter auf
das Schaf übertragen läßt, wurde nicht näher untersucht. Es lassen sich jedoch nur
durch solch eine mangelnde Anpassung die negativen ∆A-aO2-Werte der Gruppe
SKg erkären. Die Einzelwerte der Tiere sind insofern sicherlich zu hinterfragen,
jedoch dürfte sich die mangelnde Anpassung an die Tierart nicht auf die
Gruppenvergleiche ausgewirkt haben.
Wie vermutet steigt die mittlere alveoloarterielle Druckdifferenz signifikant von den
Skg über die Skk zu den Texelk an. Anders als bei den einzelnen Parametern der
Blutgasanalyse bleibt die Reihenfolge der Diagnosegruppen von t0 bis t2 erhalten.
Allerdings hat dies wohl weniger mit der IP durch Maedi zu tun, da die beiden
gesunden Gruppen am weitesten auseinander liegen.
5.5
Röntgenuntersuchung Thorax
Laut SUTER (1984) sollten Röntgenaufnahmen in maximaler Inspiration ausgelöst
werden. Optimale Bedingungen ergeben sich nur bei narkotisierten und intubierten
Tieren.
Da sich die Tiere der Gruppe Texelk größtenteils in einem fortgeschrittenen Stadium
der Maedierkrankung befanden und nach dem Röntgen die BAL vorgenommen
wurde, wurde hier auf eine Sedation verzichtet. Lediglich wehrhafte Tiere der Gruppe
Skg wurden mit 10 mg Ketamin-HCl/kg KGW (Ursotamin®) anaesthesiert, um
stärkere Bewegungsartefarkte zu vermeiden. Insofern sind die Röntgenaufnahmen
83
Diskussion
der anderen Gruppen suboptimal. Um Streuungsartefakte zu vermeiden, wurden die
Tiere geschoren.
Laut
GEORGSSON
(1990)
sind
die
histologischen
Veränderungen
nur
stecknadelkopfgroß und lassen sich deshalb röntgenologisch nicht nachweisen. Wie
in den Untersuchungen von GANTER (1996) ließen sich bei den Tieren der Gruppe
Texelk und Skk im Bereich der Zwerchfelllappen ggr. bis hgr. verdichtete Bereiche
und eine deutliche Bronchographie darstellen. Nach GANTER (1996) lassen sich mit
Hilfe von Scoresummen, welche das Lungengewebe, den Organschatten des
Herzens und den Zwerchfellschatten berücksichtigen, signifikante Unterschiede
zwischen Maedi gesunden und Maedi kranken Tieren ermitteln. In dieser
Untersuchung war dies nicht der Fall, da bei adipösen Tieren der Organschatten des
Herzen nicht sichtbar war und sich bei diesen Tieren dadurch eine ähnliche
Scoresumme wie bei mageren Tieren mit Verdichtungen des Lungengewebes
und/oder verstärkter Bronchographie ergab. So hat die Gruppe Texelg eine
signifikant höhere Scoresumme als die Gruppe Skk. Hierbei ist auch zu
berücksichtigen, dass Texelschafe einen mehr tonnenförmigen Thorax haben,
während der Thorax von Schwarzköpfigen Fleischschafen eher hochoval ist. Somit
kann
ein
Vergleich
der
Scoresummen
nur
unter
Tieren
mit
ähnlichem
Ernährungszustand erfolgen oder sollte sich nur auf das Lungengewebe ohne Herzund Zwerchfellschatten beziehen.
Bemerkenswert ist auch die Tatsache, dass der Röntgenscore des Lungengewebes
signifikant (p<0,001) positiv mit dem Lungengewicht korreliert ist, welches ohne Herz,
Herzbeutel und Zwerchfell ermittelt wurde.
Vergleicht man das Lungengewicht mit dem Grad der postmortal ermittelten
interstitiellen Pneumonie (IP), so gibt es im Gewichtsbereich von 1000 g-1500 g
sowohl Tiere ohne IP, als auch mit einer hochgradigen IP. Der Grund liegt vermutlich
darin, dass nur an drei Lokalisationen der Lunge ein ca. 1cm³ großes Probenstück
für die histologische Untersuchung entnommen wurde. Damit besteht das Risiko
einer falschen Klassifizierung der interstitiellen Pneumonie, da diese nicht homogen
verteilt war. Es wird jedoch deutlich, dass die Mehrzahl der Tiere mit einem
Lungengewicht <1000 g keine oder lediglich eine ggr. IP und Tiere über 1000 g
84
Diskussion
Lungengewicht eine mgr.-hgr. IP aufweisen. Nebenbefunde wie Bronchopneumonien
und Abszesse wirken sich auch auf das Lungengewicht aus, es besteht jedoch keine
Korrelation zwischen dem Lungengewicht und Sekundärerkrankungen.
5.6
Hämatologische Untersuchungen
Laut GANTER (1996) lassen zytologische Befunde des Blutes keine spezifischen
Veränderungen für bestimmte Erkrankungen erkennen. Die Leukozytenzahl der
Gruppe Texelk ist signifikant höher, als die der Gruppe Skk. Da in diesem Bereich
auch signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen Skg und Texelg bestehen,
kann man das nicht als Hinweis auf eine unterschiedlich starke Immun- oder
Entzündungsreaktion gegenüber dem MVV werten, zumal es keine signifikanten
Unterschiede in der Lymphozytenzahl zwischen den Gruppen gibt. Bei den gesunden
Texelschafen sind alle Leukozytenfraktionen im Vergleich zu den anderen Gruppen
erhöht. Es kann vermutet werden, dass es sich hierbei um die Reaktion auf eine
akute Allgemeininfektion handelt, die kurz nach der Einstallung der Tiere in die Klinik
für kleine Klauentiere auftrat. Nach BICKHARDT (1999) liegt der Referenzbereich
der Leukozyten bei jungen Tieren bis 9 Monaten innerhalb des Referenzbereiches
adulter Schafe. Ein altersbedingter Effekt ist daher unwahrscheinlich.
5.7
Zytologische Untersuchung der BALF
Die Gesamtzellzahl in der zurückgewonnenen BALF lag bei den gesunden Tieren mit
0,03 bis 0,2 G/l unter der Menge, die bei den Untersuchungen von GANTER (1996)
gewonnen wurde (0,1 und 0,65 G/l). Es ergaben sich keine signifikanten
Unterschiede zwischen den gesunden und den kranken Tieren einer Rasse.
Rasseübergreifend betrachtet, nimmt die Gesamtzellzahl in der BALF von der
Gruppe Skg über Skk zu den Texelk signifikant (p<0,05) zu. Die Mediane der
Gruppen (Skg 0,065 G/l, Skk 0,07 G/l, Texelk 0,1 G/l, Texelg 0,085 G/l) liegen dicht
beieinander. Der Anstieg der Gesamtzellzahl beruht bei den SKF hauptsächlich auf
dem Einstrom von Lymphozyten, gefolgt vom Einstrom der segmentkernigen
Granulozyten und den Alveolarmakrophagen. Bei den Texelschafen dominiert der
85
Diskussion
Einstrom segmentkerniger Granulozyten mit einem Anstieg von 0% (Texelg) auf 6%
(Texelk), gefolgt von den Lymphozyten (0,3% auf 1,5%). Der dominante Einstrom
von Lymphozyten spricht für eine IP ohne relevante Sekundärerkrankungen der
Lunge. Nach DELBECK (1995) ist bei Schweinen ein primärer Anstieg neutrophiler
Granulozyten typisch für eine katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie.
Da 42% der Tiere von Gruppe Texelk eine katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie
aufwiesen, kann hierin die Ursache für das unerwartete Differentialzellbild der BALF
gesehen werden.
Bei den gesunden Tieren stimmt das Differentialzellbild der BALF mit dem aus den
Untersuchungen von GANTER (1996) überein und entspricht dem bei gesunden
Menschen
beobachteten
Zellbild
(COSTABEL
1994).
Es
dominierten
die
Alveolarmakrophagen mit 97% bei den Skg und 98% bei den Texelg, gefolgt von den
Lymphozyten (Skg 0%; Texelg 0,3%) und den segmentkernigen Granulozyten mit
(Skg 2%; Texelg 0%).
Bei den kranken Tieren sank der Anteil der Alveolarmakrophagen auf 95% bei den
Skk und 92% bei den Texelk. Der Lymphozytenanteil stieg auf 1,1% bei den Skk und
1,5% bei den Texelk. Der Anteil der segmentkernigen Granulozyten stieg bei den
Skk ggr. auf 2,85% an. Bei den kranken Texelschafen kam es aufgrund von
Sekundärinfektionen zu einem deutlichen Anstieg auf 6%. Allerdings sind diese
zellulären Veränderungen in der BALF insgesamt als sehr gering anzusehen, wenn
man sie mit den Zellveränderungen bei ausgeprägten katarrhalisch-eitrigen
Bronchopneumonien oder Lungenadenomatosen vergleicht, wie GANTER (1996) sie
beschreibt.
Übereinstimmend mit GANTER (1996) und LUJAN et al. (1993) erhöht sich die
Lymphozytenfraktion von den gesunden SKF über die Maedi positiven SKF zu den
kranken Texelschafen signifikant. Auch DAWSON et al. (2005) sehen diesen
geringgradigen,
aber
signifikanten
Anstieg
der
Lymphozytenfraktion
als
charakteristisch für eine Maediinfektion an. In der hier vorliegenden Untersuchung
sind jedoch weder das Lungengewicht noch der Grad der interstitiellen Pneumonie
signifikant mit dem prozentualen Anteil der Lymphozyten in der BAL korreliert.
86
Diskussion
5.8
Lymphozytensubsets
Alle mit Blut verunreinigten BALF und solche, die weniger als 30 events (gezählte
Zellen)
in
der
Durchflußzytometrie
aufwiesen,
wurden
von
der
Studie
ausgeschlossen. Aufgrund dieser Selektion ist die Anzahl der auswertbaren Tiere in
einigen Gruppen sehr gering. Bei den verbleibenden Tieren wurden Blut und BALF
hinsichtlich ihres Anteils an CD4+ und CD8+-Lymphozytensubsets analysiert. Der
CD4-Rezeptor (cluster of differentiation 4) ist ein Glycoprotein, welches an der
Oberfläche von T-Helferzellen, Monozyten und Makrophagen vorkommt. Es handelt
sich um einen Corezeptor welcher zusammen mit dem T-Zell-Rezeptor MHC-Klasse
II Moleküle erkennt.
Der CD8-Rezeptor ist ein Erkennungsmolekül, welches sich in der Zellmembran von
cytotoxischen T-Zellen befindet. Zusammen mit dem T-Zell-Rezeptor erkennt er den
MHC-I-Komplex auf körpereigenen Zellen.
Aus der Gruppe Texelg sind nur 2 Tiere (25%) in die Auswertung eingeflossen. In
dieser Gruppe war die geringe Zellzahl problematisch. Aufgrund dieser geringen
Tierzahl ist kein Vergleich mit den anderen Gruppen wissenschaftlich aussagekräftig.
Aus der Gruppe Texelk gingen nur 17 (62%) der 27 gespülten Tiere in die
Auswertung ein. In dieser Gruppe waren Blutbeimengungen das Hauptproblem.
In der Gruppe Skg konnten alle acht Tiere (100%) ausgewertet werden. Hier bewegt
sich der Prozentsatz der CD8+ in einem recht engen Rahmen von 20,8 bis 44,3 %
(Median 27,1%). Bei den Skk gingen sieben der 13 gespülten Tiere (54%) in die
Auswertung ein.
Bei den kranken Tieren streuen die Werte wesentlich stärker von 9,8% bis 77,7%
(Median 26,5%) bei den Skk und 1,2% bis 70,6 % (Median 37,6%) bei den Texelk.
Der prozentuale Anteil der CD4+ beträgt bei den Skg 28,9%, bei den Skk 40% und
den Texelk 17,7%.
LUJAN
et
al.
(1995)
verglichen
Maedi
positive
Schwarzkopfschafe mit Maedi negativen Oxfordschafen.
87
Texel
und
Schottische
Diskussion
Bei diesen Untersuchungen war der Prozentsatz an CD8+ bei den erkrankten Tieren
erhöht, der Prozentsatz an CD4+ signifikant verringert. Dies konnte in dieser Studie
nur zwischen den Gruppen Skk und Texelk beobachtet werden. In der Studie von
LUJAN et al. (1995) zeigte sich ein Absinken der CD4+/CD8+-ratio im Verlauf der
Maedi. Bei den eigenen Untersuchungen hingegen stieg bei den Maedi positiven
SKF die Ratio von CD4+/CD8+, infolge eines Anstiegs der CD4+ und einem Abfall
der CD8+, an. Im Vergleich zwischen Skk und Texelk folgt diese Studie den
Beobachtungen von LUJAN et al. (1995) und die Ratio sinkt. Auch bei den
Texelschafen sank die Ratio bei den kranken Tieren. Wie bereits erwähnt, kann
jedoch aufgrund der geringen Tierzahl (n=2) keine statistisch gesicherte Aussage
gemacht werden. Es scheint jedoch bei den SKF und den Texelschafen zu
gegenläufigen Reaktionen gegenüber einer Maedi-Infektion zu kommen.
Insofern können die Ergebnisse von LUJAN et al. (1995) hinsichtlich der BALFZusammensetzung nur für die Texelschafe bestätigt werden, nicht aber für die SKF.
Die Ergebnisse dieser Studie könnten somit ein Hinweis auf den Grund für die
erhöhte Toleranz der SKF gegenüber klinischer Maedi sein. Die CD8+ gelten als
wichtige Effektorzellen (BLACKLAWS et al. 1994) und haben laut WATT et al. (1992)
einen hohen Anteil an der Pathogenese der Lungenveränderungen. Bei Studien von
LUJAN et al. (1995) korreliert der Anstieg der CD8+ mit dem Grad der
Lungenveränderungen. In dieser Studie wurde gezeigt, dass bei den als tolerant
geltenden SKF die CD8+ Lymphozytensubsets bei den Maedi positiven Tieren
sinken und bei den empfänglichen Texelschafen ansteigen.
Diese gegenläufige Reaktion der CD8+ könnte ein Marker für die Toleranz
gegenüber den Lungenveränderungen bei diesen beiden Rassen sein.
Um diese Theorie zu bestätigen, müssen weitere Untersuchungen mit höheren
Tierzahlen durchgeführt werden.
Insbesondere sind entsprechende Untersuchungen bei einer größeren Zahl
gesunder Texelschafe notwendig.
Die CD4+ und CD8+ im Blut verhalten sich wie in vorangegangenen Studien von
LUJAN et al. (1995) bereits beobachtet. Der Anteil der CD4+ Subsets sinkt von den
88
Diskussion
gesunden SKF über die kranken SKF zu den kranken Texelschafen ab. Der Anteil
der CD8+ Subsets steigt in gleicher Reihenfolge an und das Verhältnis der CD4/CD8
vermindert sich somit. Die gesunden Texelschafe lassen sich nicht eindeutig in diese
Reihenfolge mit eingliedern. Möglicherweise spielen hier wieder subklinische
Entzündungsreaktionen eine größere Rolle.
5.9
Die
Pathologische Untersuchungen
pathologischen
Befunde
entsprachen
den
Beobachtungen
von
CHRISTODOULOPOLOUS (2006), ELLIS und DE MARTINI (1985) sowie WATT et
al. (1992). Die gesunden Tiere der Gruppe Skg hatten das geringste Lungengewicht
mit einem Median von 640 g bei einem Minimum von 500 g und einem Maximum von
720 g. Die Gruppe Skk hatte deutlich erhöhte Lungengewichte mit einem Median von
700 g (min. 450 g – max.1500 g). Signifikant (p<0,05) darüber lagen die Gewichte
der Texelk mit einem Median von 1250 g (min. 500 g – max. 2120 g). Da die Tiere
der Gruppe Texelg nicht euthanasiert wurden, liegen für diese Gruppe keine Daten
vor.
Vergleicht man jedoch die Minima der anderen Gruppen, so korreliert das
Lungengewicht nicht mit der Rasse oder dem Körpergewicht und man kann davon
ausgehen, dass das Normalgewicht der Lunge auch in der Gruppe Texelg bei 500 g 700 g liegt. Somit hat sich das Gewicht bei einem kranken SKF im Durchschnitt
verdreifacht,
bei
den
Texelk
mehr als
vervierfacht.
Dass
dies
nicht
zu
entscheidenden Veränderungen der Blutgaswerte bei den kranken Schafen führt,
zeigt welche Kompensationsmöglichkeiten hier vorliegen.
Laut WATT et al. (1992) beruht die Gewichtszunahme hauptsächlich auf der
Hypertrophie der Muskelfasern der Alveolargänge und auf der Verdichtung der
interalveolären Septen.
In dieser Studie zeigte sich in der Gesamtheit der Tiere eine signifikante (p<0,0001)
positive Korrelation zwischen dem Grad der interstitiellen Pneumonie (IP) und dem
Lungengewicht. Im Gegensatz dazu zeigte sich aber auch, dass das Lungengewicht
nicht nur vom Grad der IP abhängig ist. So hatte ein Tier ohne IP ein Lungengewicht
89
Diskussion
von 1100 g und Lungengewichte über 1500 g lassen sich sowohl bei ggr., mgr. und
hgr. IP finden. Grund hierfür könnte die punktuelle Probenentnahme, bei gleichzeitig
inhomogener Verteilung der IP in der Lunge sein. Außerdem wiesen einige Tiere
neben
der
IP
noch
andere
pathologische
Lungenveränderungen
wie
Lungenabszesse und Bronchopneumonien auf, die das Lungengewicht beeinflussen
können.
Wie
erwartet
bestehen
signifikante
Unterschiede
in
der
Verteilung
des
Schweregrades der IP zwischen den Gruppen. In der Gruppe Skg lag keine IP vor,
bei den Skk zeigten 1/6 der Tiere keine IP, 2/3 eine ggr. IP und das letzte 1/6 eine
ggr-mgr. IP. In der Gruppe Texelk sind alle Schweregrade vertreten, wobei eine hgr.
IP mit 42,3 % am Häufigsten auftritt.
90
Schlussfolgerungen und Bewertung der Methodik
6
Auch in dieser Studie zeigte sich, dass im Rahmen der klinischen Untersuchung nur
anhand eines fauchenden Atemgeräusches in der Auskultation der Verdacht einer
interstitiellen Pneumonie gestellt werden kann. Da dieser Befund auch durch
Verengungen der Atemwege anderer Genese hervorgerufen werden kann, handelt
es sich lediglich um eine Verdachtsdiagnose. Rektaltemperatur, Atemfrequenz,
Herzfrequenz, auslösbarer Husten und Nasenausfluß liefern keine charakteristischen
Befunde, die für oder gegen eine MVV-Infektion sprechen. Sie geben allenfalls einen
Hinweis auf Sekundärinfektionen.
Bei der Röntgenuntersuchung hat sich der laterolaterale und der dorsoventrale
Strahlengang bewährt, um fokale Verdichtungen lokalisieren zu können. Hierbei
zeigten sich bei Tieren mit postmortal festgestelltem erhöhtem Lungengewicht
deutliche Bronchographien und Verdichtungen vor allem in den Zwerchfelllappen.
Nebenbefunde wie Lungenabszesse und Verklebungen mit dem Herzbeutel oder
Zwerchfell zeigten sich als lokale Verdichtungen unterschiedlicher Größe und einem
verwaschenen Organschatten.
In dieser Verbindung hat sich ein Röntgenscore des Lungengewebes als
zuverlässiger Indikator für histologische Veränderungen des Lungengewebes und
damit einhergehende Gewichtszunahme herausgestellt.
Bei Erstellung eines Lungenscores ist von der Berücksichtigung von Herzschatten
und Zwerchfellschatten abzusehen. Bei adipösem Ernährungszustand kommt es am
Herzen und im Bereich des Zwerchfells zu hgr. Fetteinlagerungen, die zu einer
schlechten Abgrenzung führten und somit einen hohen Scorewert bedingten.
Weiterhin bewirkt die vermehrte Streustrahlung und der vergrößerte, in tonnenform
übergehende Thoraxumfang eine Unschärfe des Schattens und somit eine erhöhte
Scoresumme.
Die Blutgasanalyse hat sich als wenig aussagekräftig für die Quantifizierung der
Lungenveränderungen erwiesen. Die Werte werden zu stark von der Atemfrequenz
der Tiere beeinflusst, wobei die Atemfrequenz auch bei fortgeschrittener IP noch zu
91
sehr von der Erregung der Tiere beeinflusst wird. Bei Tieren mit ähnlicher
Atemfrequenz könnte die arterioarterielle Druckdifferenz aber Hinweise auf eine
Ventilations- bzw. Diffusionsstörung liefern.
Die bronchoalveoläre Lavage stellt am wachen Tier eine einfache Methode zur
Gewinnung
von
Epithelial
Lining
Fluid
dar.
Die
Gesamtzellzahl
und
die
Lymphozytenfraktionen nehmen in Abhängigkeit von der Schwere der Erkrankung
zu. Die Makrophagenfraktion nimmt dementsprechend im Zuge der Veränderungen
ab. Kritisch ist hierbei zu beurteilen, dass gerade bei den chronisch kranken Tieren
häufig eine Differenzierung aufgrund von apoptotischen Zellen erschwert wird.
Die Untersuchungen der Lymphozytensubsets wurden stark durch die Qualität der
BALF beeinflusst. Bei den gesunden Texelschafen konnten aufgrund einer zu
geringen Zellzahl nur 2 von 8 Spülproben durchflußzytometrisch analysiert werden.
Bei den kranken Texelschafen bestanden die Probleme in Blutbeimengungen in den
Spülproben und apoptotischen Zellen.
Die gesunden SKF (Skg) hatten ein Zahnalter von 4-8 Jahren und stammten aus
einem
Herdbuchzuchtbetrieb
mit
sehr
guten
Haltungsbedingungen.
Dieser
Zuchtbetrieb war wenige Jahre zuvor über mutterlose Aufzucht neu aufgebaut
worden. Inwieweit jemals Sekundärinfektionen des Atmungsapparates stattgefunden
hatten, ist unbekannt. Ein Teil der aus dem Betrieb eliminierten Maedi positiven
Muttern konnten für die Gruppe Skk aufgekauft werden und ist genetisch eng
verwandt mit der Gruppe Skg.
Die Maedi negativen Texel (Texelg) befanden sich im Zahnwechsel. Eine Infektion
mit Lungenerkrankungserregern im Jungtieralter konnte nicht ausgeschlossen
werden.
Eine solche Infektion in frühem Alter könnte jedoch die häufig unerwarteten
Untersuchungsergebnisse erklären. Außerdem könnten ein Teil der Abweichungen
physiologische
altersbedingte
Abweichungen
darstellen.
Die
Variation
der
Lymphozytensubsets ist stark altersabhängig (MACKAY und HEIN 1991) und wird
92
auch durch andere Infektionen außer Maedi stark beeinflußt (WOLDEHIWET und
SHARMA 1990).
Da es sich bei den Maedi positiven Tieren (Skk und insbesondere Texelk) um
Feldinfektionen aus verschiedenen Beständen handelte, sind diese Gruppen sehr
inhomogen. Das Zahnalter konnte auf 4-8 Jahre geschätzt werden. Der Zeitpunkt der
Infektion mit dem MVV ist nicht bekannt. Die Haltungs- und Fütterungsbedingungen
in
den
Herkunftsbeständen
waren
unterschiedlich,
vorangegangene
Sekundärinfektionen und der Zeitpunkt einer akuten Infektion waren unbekannt.
Einige Tiere befanden sich in einem weit forgeschrittenen Stadium der Infektion,
andere zeigten nur Dyspnoe bei Stresseinwirkung und standen am Anfang der
klinischen Phase.
Abschließend kann man sagen, dass sich das Ausmaß der Lungenveränderungen
bei Maedi kranken Schafen klinisch am deutlichsten anhand des Röntgenscores
nachvollziehen lässt. Dieser ist positiv mit dem Lungengewicht und mit dem Ausmaß
der interstitiellen Pneumonie korreliert.
Hinsichtlich der Lymphozytensubsets scheint es bei den SKF und den Texelschafen
zu gegenläufigen Reaktionen zu kommen. Hierin sollte der Ansatz zu weiteren
Untersuchungen in Bezug auf die Toleranz gegenüber einer MVV-Infektion liegen.
93
Zusammenfassung
7
Zusammenfassung
Untersuchungen zum Einfluß einer Maedi-Infektion auf die Funktion und die
Morphologie der Lungen verschiedener Schafrassen
(Claudia Scherf)
Das Maedi-Visna-Virus (MVV) verursacht bei einigen Schafrassen infolge von
interstitiellen Pneumonien mit daraus resultierender Dyspnoe, Kachexie und
verschlechterter Ablammrate weltweit jährlich hohe wirtschaftliche Verluste. Des
Weiteren kommt es bei einem Teil der infizierten Tiere zu Mastitiden, welche bei der
Milchgewinnung zu Verlusten führen und die tägliche Zuwachsrate der Lämmer
verringert.
In der vorliegenden Arbeit sollten rasseabhängige Unterschiede und deren Ursache
im Ausprägungsgrad der klinischen Symptome einer MVV-Infektion am Beispiel der
als MVV-tolerant geltenden Schwarzköpfigen Fleischschafe (SKF) und den wenig
MVV-toleranten Texelschafen untersucht und verglichen werden. In diesem
Zusammenhang
wurde
besonders
auf
eine
intravitale
Quantifizierung
der
Lungenveränderungen und die zytologische Zusammensetzung der bronchoalveolären Spülflüssigkeit eingegangen.
Untersucht wurden 8 Maedi negative SKF (Skg), 13 Maedi positive SKF (Skk), 8
Maedi negative Texelschafe (Texelg) und 32 Maedi positive Texelschafe (Texelk).
Bis auf die Maedi negativen Texelschafe waren alle Tiere über 4 Jahre alt. Die
Gruppe Skg war genetisch verwandt mit der Gruppe Skk. Die Maedi negativen
Texelschafe stammten aus einem Betrieb und hatten ein Alter von unter 2 Jahren.
Die Tiere der Maedi positiven Kontrollgruppe stammten aus 4 verschiedenen
Herkunftsbetrieben. Bei den Maedi positiven Tieren handelte es sich um natürliche
Feldinfektionen.
Die Zuordnung zu den Gruppen Maedi gesund und Maedi krank beruhte auf dem
Vorbericht (Herde mit klinischer Maedi bzw. zertifiziert Maedi unverdächtige Herde),
sowie auf den serologischen Befunden der Einzeltiere im Maedi-ELISA und auf der
94
Zusammenfassung
Untersuchung verschiedener Gewebe (Lunge, Lungenlymphknoten und Zellen aus
der bronchoalveolären Spülflüssigkeit (BALF)) auf provirale DNS des MVV mittels
Polymerasekettenreaktion
(PCR)
nach
einer
modifizierten
Methode
von
EXTRAMIANA et al. (2002).
Die
intravitalen
Untersuchungen
umfassten
die
Lungenauskultation,
Röntgenuntersuchung des Thorax in zwei Ebenen, bronchoalveoläre Lavage (BAL),
arterielle Blutgasmessungen vor und nach der BAL, sowie hämatologische und
immunzytologische Blutuntersuchungen. Post mortem wurde das Lungengewicht
ermittelt und das Lungengewebe wurde an 3 Lokalisationen histologisch untersucht.
Es zeigte sich, dass die klinischen Parameter stärker durch den Ernährungszustand
und
die
Erregung
der
Tiere
beinflußt
wurden
und
weniger
durch
die
Lungenveränderungen infolge einer MVV-Infektion.
Trotz dieser Einflüsse konnte hinsichtlich der Blutgaswerte eine signifikante
Zunahme der alveoloarteriellen Sauerstoffdruckdifferenz von den Maedi negativen
SKF über die Maedi positiven SKF zu den Maedi positiven Texelschafen
nachgewiesen werden.
Jedes Tier erhielt einen Röntgenscorewert für den Organschatten des Herzens, des
Zwerchfells
sowie
für
die
Bronchographie
und
für
Veränderungen
des
Lungengewebes. Dabei stellte sich heraus, dass bei adipösen Tieren die
Gesamtscoresumme durch einen hohen Scorewert im Organschatten deutlich nach
oben verschoben wird. Soll der Röntgenscore als Beurteilungskriterium für die
Lungenveränderungen herangezogen werden, können nur Tiere mit einem ähnlichen
Ernährungszustand verglichen werden oder es sollte auf die Beurteilung der
Organschatten verzichtet werden. Wird lediglich das Lungengewebe betrachtet, zeigt
sich ein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen und der Score steigt von
den gesunden zu den Maedi kranken Schafen an. Weiterhin zeigte sich, dass der
Röntgenscore des Lungengewebes signifikant positiv mit dem Lungengewicht
korreliert.
95
Zusammenfassung
Das Differentialzellbild der BALF zeigte innerhalb der Rassen bei den erkrankten
Tieren einen prozentualen Abfall der Alveolarmakrophagen und einen Anstieg der
Lymphozytenanteile. Es erhöhte sich die Lymphozytenfraktion von den gesunden
SKF über die Maedi positiven SKF zu den kranken Texelschafen signifikant.
Die Untersuchung der Lymphozytensubsets in der BALF stellte sich durch
Blutbeimengungen oder einer zu geringen Zellzahl als problematisch dar. Zum Teil
konnten nur bei 1/4 der Tiere einer Gruppe die Lymphozytensubsets bestimmt
werden.
In dieser Studie konnten keine signifikanten Veränderungen in der Ratio von
CD4+/CD8+-Lymphozyten festgestellt werden. Die Maedi positiven SKF wiesen eine
etwas höhere CD4+/CD8+ Ratio auf als die Maedi negativen SKF infolge eines
Anstieges der CD4+ und einem Abfall der CD8+ positiven T-Zellen. Maedi positive
Texel haben aufgrund des CD8+ Anstieges wiederum eine niedrigere Ratio als
Maedi positive SKF.
Dieses gegenläufige Verhalten der Lymphozytensubsets bei den beiden Rassen
sollte in weiteren Studien näher untersucht werden. In dieser unterschiedlichen
Reaktion könnte die Erklärung für die Toleranz bzw. Empfänglichkeit gegenüber
klinischer Maedi liegen.
Im Blut sinken die CD4+ Subsets von den gesunden SKF über die kranken SKF zu
den kranken Texelschafen ab, die CD8+ Subsets steigen an.
Geht man von einem physiologischen Lungengewicht von ca. 500 g aus, so kam es
bei den kranken SKF zu einer Verdreifachung und bei den erkrankten Texelschafen
zu einer Vervierfachung der Lungengewichte.
Es zeigte sich weiterhin eine positive Korrelation zwischen dem Grad der
interstitiellen Pneumonie und dem Lungengewicht.
96
Zusammenfassung
Abschließend ist festzustellen, dass kein einfach zu ermittelnder quantitativer
Parameter gefunden werden konnte, mit dem eine Toleranz gegenüber klinischer
Maedi identifiziert werden kann.
97
Summary
8
Summary
Examination on the influence of a Maedi-Infection of function and morphology
of lungs in various sheepbreed
(Claudia Scherf)
In some sheep breeds the Maedi Visna Virus (MVV) causes high economic losses
worldwide due to the interstitial pneumonia which results in dyspnoea, loss of weight
and a lower reproduction rate. Furthermore, some of the infected animals develop
interstitial mastitis which causes reduced milk production and a decrease in weight
gain of the lambs.
Therefore, the main aim of the present study was to investigate the breed dependent
differences in the level of clinical symptoms caused by MVV. We investigated
German Blackheaded Muttons (BHMs), which are regarded as low susceptible to
clinical Maedi and high susceptibleTexel sheep and compared them with each other.
We mainly focussed on the intravital quantification of the lung alterations and the
cytologic content of the bronchoalveolar lavage fluid (BALF).
In this study eight serological MVV-negative BHMs (Skg), 13 MVV-positive BHMs
(Skk), eight MVV-negative Texel sheep (Texelg) and 32 MVV-positive Texel sheep
(Texelk) were examined. All animals were older than 4 years except of the MVVnegative Texel sheep. Some sheep of the two BHM groups had the same genetic
background. The MVV-negative Texel derived from a single breeding flock, were
reared motherless and aged under 2 years. The MVV-positive Texel sheep derived
from four different flocks.
All MVV-positive animals were infected by coincidence at unknown points of time.
The classification of the MVV-positive and MVV-negative group was based first on
flock history (flock with clinical manifestation of MVV or certificated MVV- negative
flocks), second on serology by MVV-ELISA and third on the examination of different
tissues (lungs, lymph node and BALF-cells) for proviral DNA of the MVV tested by
98
Summary
polymerase chain reaction (PCR) with a protocol according to EXTRAMIANA et al.
(2002).
For intravital examinations we chose auscultation of the lungs, X-ray of the thorax in
two planes, bronchoalveolar lavage (BAL), arterial blood gas analysis before and
after the BAL and haematological and cytological blood tests.
Post mortem the weight of the lungs was determined and the lung tissue was
analysed histologically using 3 different localisations of the lungs.
The clinical parameters were more influenced by body condition and the excitement
during investigation than by the degree of lung tissue lesions.
However, we could show that the alveoloarterial oxygen pressure difference
(∆A-a O2) was significantly lower in Maedi negative BHMs compared to the MVVpositive animals and also compared to the MVV-positive Texel sheep.
Each animal got a radiograph score defined by the shadows in the radiograph around
the heart, due to the diaphragm, around the bronchia and the pathologic alterations
of the lung tissue. We saw that obese animals had a higher score because of the
higher amount of X-ray-shadows in its organs. The consequence was that only
animals with the same body condition should be compared with each other.
Otherwise this criterion cannot be taken into account. Using only the lung tissue for
scoring the X-ray we could show a significant increase of the Score from the group
Skg over group Skk to group Texelk. Furthermore, the radiograph score of the lung
tissue correlated significantly positive with the weight of the lungs post mortem.
Within the breeds MVV positive sheep showed an increase of the percentage of
lymphocytes and a decreased percentage of alveolar macrophages in the BALF. The
fraction of the lymphocytes is significantly higher in infected Texel sheep compared
to MVV-positive BHMs and is significantly lower in healthy BHMs. In numerous cases
the analysis of the lymphocyte subsets of the BALF was not possible because of the
contamination with blood and because of the low amount of BAL-cells. In part, only
99
Summary
one quarter of all animals within one group could be taken into account for the
analysis. In this study, we could not find any significant differences in the ratio of
CD4+/CD8+ lymphocytes between the groups. MVV-positive BHMs had a higher
CD4+/CD8+ ratio compared to the MVV-negative BHMs because of the
augmentation of the CD4+ cells and the decrease of the CD8+ cells. In comparison
between BHMs and Texel sheep the CD4+/CD8+ ratio decreases.
This phenomenon should be investigated further in following studies.
In the blood the CD4+ subsets of healthy BHMs decrease compared to the infected
BHMs and to the infected Texel sheep. The CD8+ subsets increase.
Taking an average of 500 g as the physiological weight of the lungs the MVV infected
BHMs had lungs three times heavier and the lungs of the MVV infected Texel sheep
were even four times heavier compared to the lungs of healthy sheep of this breed.
Further, we saw a significant positive correlation between the level of the interstitial
pneumonia and the weight of the lungs.
In conclusion we found no quantitative parameter which indicates tolerence or
susceptibility to clinical Maedi.
100
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116
Anhang
10 Anhang
Materialien
A Herstellung der Gebrauchslösungen
10x TBE
Tris (Molekulargewicht 121,1)
108g
Borsäure
55g
diNaEDTA
9,3g
demineralisiertes Wasser
ad 1000g
(pH sollte ca. 8,3 sein, nicht einstellen)
Für die Herstellung der Arbeitslösung 1 : 10 verdünnen
Aufbewahrung bei 4°C
1x TE
10 mmol/l Tris, 1 mmol/l EDTA (pH 8,0) in doppelt autoklaviertem Aqua dest., pH mit
1N HCl einstellen, anschließend sterilfiltrieren
Bei 4°C aufbewahren.
Für 0,5l
für 1l
Tris
605,7 mg
1,2114 g
EDTA
146,15 mg
292,3 g
2x autokl. Aqua bidest.
ad 500ml
ad 1000ml
Erythrozyten-Lysispuffer (Tris-gepufferte 0,16 mol/l NH4Cl-Lösung)
Lösung A: 0,16 mol/l NH4Cl ( Molekulargewicht 53,49)
NH4CL
8,56g
2 x autokl. Aqua bidest.
ad 1000ml
Lösung B: 0,17 mol/l Tris (Molekulargewicht 121,1)
Tris
20,6 g
117
Anhang
In 900ml doppelt autokl. Aqua bidest. auflösen, pH mit HCl auf
7,56
einstellen, dann mit doppelt autokl. Aqua bidest auf 1000ml auffüllen
Für die Herstellung der Arbeitslösung 450 ml der Lösung A mit 50 ml der Lösung B
mischen und sterilfiltrieren (Steritop Express™Plus, Millipore Corporation, Billerica,
Massachusetts, USA). Alle Lösungen (A, B und die Arbeitslösung) bei 4°C
aufbewahren.
PBS
NaCl
137 mmol/l
KCl
2,7 mmol/l
Na²PO4
8,1 mmol/l
KH2PO4
1,12 mmol/l
Sterilfiltrieren und bei 4°C aufbewahren.
Für 1 Liter:
NaCl
8,006 g
KCl
201,31 mg
Na²PO4
1,15g
KH2PO4
152,42 mg
Sheath fluid
Sterilfiltriertes (0,2µm) PBS mit 0,1 mg/ml NaN³ (Natriumazid)
MIF-Puffer
Bovines Serumalbumin
5,0g
NaN³
0,1g
PBS ad
1000ml
Lagerung bei 4°C
118
Anhang
60ml Agarosegel
Agarose
1,2g
Gelstar®
6µl
TBE
ad
60ml
B Zutaten für die Herstellung der Gebrauchslösungen
Borsäure
Roth, Karlsruhe
Demineralisiertes Wasser aus eigener reverse Osmose-Anlage
Di-Natrium-EDTA
Doppelt destilliertes Wasser
Roth, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
HCl 1N
Merck, Darmstadt
KCl > 99,5%
Roth, Karlsruhe
KH2PO4
Merck, Darmstadt
Na2HPO4
Merck, Darmstadt
NaCl
AppliChem GmbH, Darmstadt
NH4ClTris-Puffer
Pufferan®, Roth, Karlsruhe
119
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1:
Pathogenese der Schädigung des Lungengewebes nach THORMAR
(2005). ..................................................................................................... 17
Abb. 2:
Einteilung der Beurteilungsfelder in der seitlichen Röntgenaufnahme..... 36
Abb. 3:
Einteilung der Beurteilungsfelder in der dorso-ventralen
Röntgenaufnahme ................................................................................... 36
Abb. 4:
Körpergewicht der Tiere nach Gruppen unterteilt .................................... 52
Abb. 5:
Röntgenscoresumme der Diagnosegruppen ........................................... 54
Abb. 6:
Differentialblutbild der Diagnosegruppen ................................................ 55
Abb. 7:
Arterielle Blut-pH-Werte der Diagnosegruppen........................................ 56
Abb. 8:
Arterieller Sauerstoffpartialdruck (pO²) der Diagnosegruppen. ................ 57
Abb. 9:
Arterieller Kohlendioxidpartialdruck (pCO²) der Diagnosegruppen........... 58
Abb. 10: Arterielle Basenexzesse (BE) der Diagnosegruppen............................... 59
Abb. 11: Durchschnittliche alveoloarterielle Sauerstoffdifferenz (∆A-aO2) der
Diagnosegruppen.. .................................................................................. 60
Abb. 12: Gesamtzellzahlen in der BALF der Diagnosegruppen. ............................ 61
Abb. 13: Differentialzellbilder der BALF der Diagnosegruppen in G/l..................... 62
Abb. 14: Differentialzellbilder der BALF der Diagnosegruppen in % ...................... 62
Abb. 15: Prozentualer Anteil der CD8+ an den Lymphozytensubpopulationen
in der BALF der Diagnosegruppen. ......................................................... 63
in der BALF der Diagnosegruppen. ......................................................... 64
Abb. 17: Verhältnis der CD4+ zu den CD8+ in der BALF der
Diagnosegruppen. ................................................................................... 65
im Blut der Diagnosegruppen. ................................................................. 66
im Blut der Diagnosegruppen. ................................................................. 67
Abb. 20: Verhältnis der CD4+ zu den CD8+ im Blut der Diagnosegruppen. .......... 68
Abb. 21: Korrelation zwischen den CD4+ im Blut und in der BALF der Gruppe
Skk........................................................................................................... 69
120
Abb. 22: Lungengewicht der Diagnosegruppen. .................................................... 71
Abb. 23: Anzahl der Tiere je Ausprägungsgrad der Interstitiellen Pneumonie in
den Diagnosegruppen ............................................................................. 72
Abb. 24: Prozentsatz der Tiere je Ausprägungsgrad der IP in den
Diagnosegruppen.. .................................................................................. 72
Abb. 25: Verteilung der Lungengewichte aller untersuchten Tiere aller
Gruppen in Bezug zum Grad der interstitiellen Pneumonie. .................... 73
Abb. 26: Verteilung der Lungengewichte der Tiere ohne
Sekundärerkrankungen der Lunge aller Gruppen in Bezug zum Grad
der interstitiellen Pneumonie. .................................................................. 74
Abb. 27: Korrelation zwischen dem Lungengewicht und dem Röntgenscore
über alle Gruppen. ................................................................................... 75
der Gruppe Skk........................................................................................ 76
der Gruppe Texelk. .................................................................................. 76
121
Tabellenverzeichnis
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Anzahl und Maedistatus der Tiere je Bestand ......................................... 33
Tabelle 2: Anzahl und Maedistatus der Tiere je Bestand ......................................... 33
Tabelle 3: Zusammensetzung des Mastermix .......................................................... 45
Tabelle 4: Zeit-Temperaturprogramm für die PCR ................................................... 45
Tabelle 5: Übersicht der euthanasierten und verendeten Tiere................................ 47
Tabelle 6: Anzahl und Verteilung der serologischen und molekular-biologischen
Ergebnisse bei den Schafen, die die Selektionskriterien erfüllten. .......... 51
Tabelle 7: Übersicht der Maedi-PCR und ELISA- Ergebnisse.................................. 70
122
Danksagung
Herrn Prof. Dr. Ganter danke ich für die Überlassung des Themas, die fachliche
Beratung und Unterstützung.
Klaus, Thorsten, Tanja und den Lehrlingen für die Versorgung der Tiere und die
Hilfe, wenn sonst keiner Zeit hatte.
Elke für die geduldige Hilfe bei meinem Kampf mit dem Endoskop und der Technik.
Herrn Fiedler und Herrn Richter für unzählige Fahrten zu den Beständen und in die
Patho.
Babs, Viola, Thekla und dem Rest der Crew für die beständige Hilfe, die unendliche
Geduld und für die gute Laune am Anfang eines langen Tages.
Dank auch den Kollegen und Mitarbeitern der anderen Institute für die freundliche
Einweisung in ihr Fachgebiet, die Probenbearbeitung und die unzähligen Sektionen
im wissenschaftlichen Interesse.
Klaus und Nashen, die mich bei langen Gassitouren und Badeabenden auf andere
Gedanken gebracht haben.
Doris, Julia, Eva und Conny für die lustige Ablenkung, die Hilfe bei den Tücken mit
SAS, EXCEL, WORD und Co., für das Verständnis, wenn mich das Selbstmitleid
übermannt hat und für den Satz „Alles wird gut.“
Meiner Familie für die mentale und finanzielle Unterstützung.
Den Kollegen Dres. Hinrichs für die Möglichkeit einer halben Stelle und für die
Bestärkung, dass es sich lohnt zu kämpfen…

Dissertation Scherf - TiHo Bibliothek elib

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