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LABORWELT
Nr. 4 / 2007 - Vol. 8
Mehrschalige
Nanocarrier für die
RNA-Transfektion
Das
-Themenheft
siRNA
Mit RNAs gegen
die ChemotherapieResistenz
RNA-Technologien
RISC
Hemmung von PERV
in primären porcinen
Zellen
Marktübersicht:
High Content- & High
Throughput-Screening
Interview:
Dr. Sven Klußmann,
NOXXON Pharma AG
RNA-Wirkstoffe gegen
die Polo-like Kinase 1
Analytik und Qualitätskontrolle von siRNAs
BIOCOM AG
guide-Strang
mRNA
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References
1. Lau NC, LP Lim, EG Wienstein, and DP Bartel 2001 An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science 294: 858-862.
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Zum Thema
N
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INHALT

Neue Sicht auf RNA
Ein Pilotprojekt hat es Mitte Juni zutage gebracht. Nicht nur die Gene
werden in mRNA übersetzt, sondern fast das gesamte Humangenom
wird permanent transkribiert. Neben völlig unbekannten regulatorischen
Sequenzen spürten die 180 Wissenschaftler des ENCODE-Konsortiums
– die sich der Mission verschrieben haben, jedes Funktionselement des
menschlichen Genoms aufzuspüren und zu erklären – dabei auch speziesspezifische nicht codierende RNAs (ncRNAs) auf, die Auswirkungen
auf den Kondensationsgrad des Chromatins haben. Bestätigen sich die
vorläufigen Ergebnisse an den noch ausstehenden 99% zu analysierender
Human-DNA, wird dies das Ende einer naiven Sicht auf das Genom
sein, die DNA lediglich als Informationsspeicher für Proteine und Arzneimittelangriffspunkte begreift. Vielleicht muss sogar neu definiert
werden, was ein Gen ist (vgl. Seite 4).
Welche Rolle deutschen Forschern bei der Entschlüsselung der
Regulationsebene der ncRNAs zukommen wird, das entscheidet sich
dieser Tage im Zuge der Evaluation der Berliner RNA-Netzwerkes, das
schon bald unter prominenter Führung und mit einem angemessenem
Budget ein bundesweites werden könnte. Pläne dazu werden derzeit
rege diskutiert. Bei den Bewerbungsrunden auf den Platz des in den
Ruhestand tretenden Berliner RNA-Netzwerk-Pioniers Volker Erdmann
war jedenfalls Tom Tuschl zugegen, der bei entsprechender Ausstattung
Bitte nutzen Sie unseren Kennziffer-Service: online unter
www.biocom.de oder auf unserer Fax-Seite (S. 52). Wenn
Sie ein Produkt interessiert, einfach Nummer ankreuzen,
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erhalten umgehend Informationen unserer Inserenten.
STATEMENT
 Zukunft der RNA-Technologien in Deutschland
Prof. Dr. Volker Erdmann, Freie Universität Berlin
REPORT
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 Nukleinsäure-basierte Wirkstoffe zur
Targetvalidierung und Krebstherapie
Prof. Dr. Klaus Strebhardt et al. Klinikum Universität Frankfurt
BLITZLICHT
 siRNA-Analytik: Qualität, Stabilität und
pharmakokinetische Eigenschaften
10
Dr. Ingo Röhl et. al, Roche Kulmbach GmbH
BLITZLICHT
 Funktionelle Überprüfung der intrinsischen
Hautalterung mittels siRNA
14
Prof. Dr. Christos Zouboulis et al, Städtisches Klinikum Dessau
BLITZLICHT
 Mehrschalige Calciumphosphat-Nanopartikel
als biokompatible Träger für Nukleinsäuren
17
Prof. Dr. Matthias Epple, Universität Duisburg-Essen
BLITZLICHT
 Überwindung der Chemotherapie-Resistenz
humaner Tumoren
22
Prof. Dr. Dr. Hermann Lage, Charité Berlin
BLITZLICHT
25
und im Falle eines Rufes erwägt, den USA und der Rockefeller-Universität den Rücken zu kehren.
Obgleich das Problem der Zielsteuerung siRNA-basierter Wirkstoffe
immer noch nicht gelöst ist (vgl. Seite 17), häufen sich die klinischen Versuche und die präklinische Evidenz, dass die unmodifiziert instabilen
Moleküle Targets hochwirksam ausschalten könnten – egal ob es dabei
um Krebs (vgl. Seite 6), die Chemotherapie-Resistenz von Tumoren (vgl.
Seite 22), die Hautalterung (vgl. Seite 14) oder die Expression endogener
porciner Retroviren bei der Xenotransplantation (vgl. Seite 33) geht.
Dass auch große Pharmaunternehmen in die Entwicklung entsprechender Arzneien investieren, zeigen die Übernahmen von Alnylam
Europe durch Roche (vgl. Seite 10) und der jüngste Lizenzdeal von
Silence Therapeutics mit AstraZeneca. Entsprechend der noch offenen
Lage bei den siRNA-Patenten gibt es bereits erste Verteilungskämpfe
(vgl. Seite 27).
Wegen der Schwierigkeiten beim Drug Delivery von siRNA-Arzneien
entwickelt sich derzeit ein neuer Hype: das Ausschalten von durch
körpereigene microRNAs regulierten Signalwegen mit LNAs (locked
nucleic acids). Auch Antisense-, Ribozym- und Aptamer/SpiegelmerAnsätze (vgl. Seite 36) erleben derzeit eine Renaissance.
 Validierung infektionsrelevanter Schlüsselgene
mit RNA-Interferenz
Thomas Gabrielczyk
 Systeme für HCS und HTS
40
 Stellenmarkt
46
 Verbände
51
 Fax-Seite
52
 Produktwelt
53
 Termine/Impressum
54
Dr. Volker Patzel et al., MPI für Infektionsbiologie, Berlin
BLITZLICHT
 RNAi-Patente und RNAi-Lizenzen
Dr. Joachim Wachenfeld, Vossius & Partner, München
BLITZLICHT
 Zuverlässige Kontrollen für RNAi-Experimente
Dr. Bettina Hädrich et al., Qiagen GmbH, Hilden
WISSENSCHAFT
 Hemmung von PERV in primären porcinen Zellen
Britta Dieckhoff, Dr. Joachim Denner, Robert-Koch-Institut
INTERVIEW
 Ziel: Klinische Prüfung in 2008
Dr. Sven Klußmann, CEO/CSO, NOXXON Pharma AG, Berlin
MARKTÜBERSICHT
Schema des siRNA-Mechanismus. Nachdem der RNA
induced silencing complex (RISC) an den guide-Strang
der siRNA gebunden und den passenger-Strang verdrängt hat, wird komplementäre mRNA abgebaut.
Grafik: Heiko Fritz
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Kennziffer 11 LW 04
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8. Jahrgang | Nr. 4/2007 | 3
L E S E R F O R U M
Statement

Zukunft der RNA-Technologien
in Deutschland
Prof. Dr. Volker A. Erdmann,
FU Berlin und Vorstandsvorsitzender des Berliner Netzwerkes für RNA-Technologien
Im Jahr 2006 ging der Nobelpreis für Chemie an Roger Kornberg für seine Strukturcharakterisierungen der eukaryotischen RNAPolymerase und der Nobelpreis für Medizin
an Andrew Z. Fire und Craig C. Mello für ihre
grundlegenden Entdeckungen auf dem Gebiet
der RNA-Interferenz. Seit dieser Zeit haben
sich die RNA-Technologien noch rasanter
entwickelt. Es wundert daher nicht, dass nicht
nur die Fach- sondern auch die Tagespresse
sich diesem Thema immer mehr annehmen.
So veröffentlichte zum Beispiel der ECONOMIST
(14. Juni 2007) unter dem Titel „The RNA
Revolution“ einige Beiträge zu RNA-Themen
und stellte fest: „What physics was to the 20th
century, biology will be to the 21st – and RNA
will be a vital part of it“.
In einem 2006 an dieser Stelle veröffentlichten Statement hatte ich bereits angesprochen,
dass eine japanische Delegation das Berliner
RiNA-Netzwerk besucht hatte, um sich über
dessen Struktur und Organisation zu informieren. Die Delegation, die ein Konsortium von 92
Firmen vertrat, interessierte sich ausschließlich
für die Gründung eines Netzwerkes für noncoding RNAs (ncRNAs). Was sie aus Berlin an
Know-how mitnehmen konnten, setzten sie in
der Zwischenzeit in Japan bei der Gründung
ihres ncRNA-Netzwerkes erfolgreich um. Beachtlich ist, dass dieses japanische Netzwerk in
der gleichen Größenordnung unterstützt wird
wie das gesamte Berliner Netzwerk für RNATechnologien. Dass die japanische Industrie
sich wieder einmal durch einen hervorragenden Spürsinn auszeichnet, lässt sich an den
folgenden neuesten Entwicklungen auf dem
RNA-Gebiet feststellen.
Wurde die Anzahl der ncRNA-Gene des
Menschen im vergangenen Jahr noch auf
40.000 bis 65.000 geschätzt – also die zwei- bis
dreifache Anzahl an proteincodierenden Genen, so musste diese Zahl vor kurzem deutlich
nach oben korrigiert werden. Die ersten Ergebnisse, die gerade durch das „Project Consortium“ des ENCODE-Projektes (ENCyclopedia
Of DNA Elements) in NATURE (14. Juni 2007,
Vol. 447, 799-016) veröffentlicht wurden, lassen
nicht nur die Schlussfolgerung zu, dass die
ncRNAs uns in Zukunft noch so manch eine
Überraschung bescheren werden, sondern dass
wir unsere Anstrengungen um ein Vielfaches
intensivieren müssen, um mit der internatio4 | 8. Jahrgang | Nr. 4/2007
nalen Konkurrenz Schritt halten zu können. In
diesem Konsortium haben in der Pilotphase
(!) zunächst 35 Arbeitsgruppen (mit sicherlich
einigen hundert Mitarbeitern) im Wesentlichen
mit Hilfe der Bioinformatik 29.998 Kilobasen
(kb), also etwa 1% der Sequenz des gesamten
Humangenoms untersucht. Obgleich dieses
Konsortium nicht als RNA-Netzwerk ausgewiesen wird, kann es als solches gelten, denn
es gleicht in seinem Ansatz dem japanischen
Netzwerk für ncRNAs.
Trifft die Definition des Gens noch zu?
Die ersten Schlussfolgerungen des ENCODEProjektes von grundlegender Bedeutung sind
die Folgenden:
– Das ganze Genom wird praktisch vollständig transkribiert, so dass die Hauptzahl
der Basen mit wenigstens einem primären
Transkript assoziiert ist.
– Viele einzigartige ncRNAs konnten erstmalig identifiziert werden.
– Ein großer Teil dieser Sequenzen zeigt
Überlappungen mit proteincodierenden
Bereichen.
– Dagegen konnte der Ursprung von anderen
ncRNAs auf DNA-Regionen zurückgeführt
werden, die bisher als nicht transkribiert
eingestuft wurden.
Die neuesten Erkenntnisse aus dem ENCODE-Projekt werfen die ersten Fragen auf,
ob die uns bisher vertraute Definition des
klassischen Gens überhaupt noch zu halten
ist, und nicht wie von Gerstein et al. (GENOME
RES. 2007, 17: 669-681) vorgeschlagen, neue
Definitionen gefunden werden müssen. Es
ist klar, dass auch bei diesen Überlegungen
immer stärker die Rolle der RNA-Moleküle
miteinbezogen werden muss. Dies wird
weiter in einem Übersichtsartikel von Mehler
und Mattick (PHYSIOL. REV. 87, 799-823, 2007)
verdeutlicht, die den Einfluss von ncRNAs
bei der Entwicklung des Gehirns, dessen
funktioneller Vielfalt und bei neurologischen
Erkrankungen untersucht haben. An die ersten
Hinweise, dass das Engagement von größeren
ncRNAs, wie etwa die HARIF-RNA, in der
Entwicklung des Gehirns des Menschen von
entscheidender Bedeutung war, so dass er
sich letztendlich vom Schimpansen absetzen
konnte, müssen wir uns sicherlich erst noch
Prof. Dr. Volker A. Erdmann (65) ist Inhaber
des Lehrstuhls für Biochemie und Molekularbiologie der Freien Universität Berlin
und Initiator und Vorstandsvorsitzender des
Berliner Netzwerkes für RNA-Technologien.
Durch seine Expertise auf dem Gebiet der
RNA-Biochemie und Genexpression (mehr
als 420 Publikationen, zahlreiche Patente)
gehört er zu den Vorreitern bei der Etablierung der RNA-Technologien in Deutschland.
Prof. Erdmann studierte bis zum M.Sc.
an der University of New Hampshire und
promovierte 1968 am Max-Planck-Institut
für experimentelle Medizin in Göttingen
und der Technischen Universität in Braunschweig. Nach einer Postdoktorandenzeit
an der University of Wisconsin in Madison
(1969-71) und als Arbeitsgruppenleiter am
Max-Planck-Institut für molekulare Genetik
in Berlin (1971-80) folgte Prof. Erdmann dem
Ruf auf den Lehrstuhl an der FU Berlin.
gewöhnen (Pollard et al. NATURE 443, 167-172).
Es erscheint aber höchst ratsam, dass wir gerade aufgrund dieser neuesten Entdeckungen
keine Zeit verlieren, sondern die Struktur und
Funktion der ncRNAs mit höchstem Einsatz
erforschen. Dies hat sich für Cai und Cullen
(RNA 13,313-316, 2007) bereits gelohnt, die
sich jüngst nochmals mit der überhaupt ersten
entdeckten, geprägten (imprinted) und nicht
codierenden H19-RNA befasst haben. Die
Funktion dieser konservierten und in embryonalem und tumorspezifischem Gewebe
auftretenden ncRNA ist weiterhin unbekannt.
Da diese ncRNA 3.500 Nukleotide lang ist
und inzwischen einige Proteine identifiziert
wurden, die spezifisch an diese RNA binden,
wurde die Schlussfolgerung gezogen, dass die
Funktion eine regulatorische Funktion beinhaltet, bei der die Proteine die RNA binden
müssen. Umso überraschender erscheint nun
die neueste Feststellung von Cai und Cullen,
dass die noncoding H19-RNA eine Vorstufe für
eine microRNA (miRNA) darstellt.
Ich glaube, dass die meisten Leser mit
mir darin übereinstimmen werden, dass die
siRNAs, microRNAs und ncRNAs nicht mehr
aus den Laboratorien der Molekularbiologen,
Mediziner und Pharma-Industrie wegzudenken sind und dass diese RNA-Molekül-KlasLABORWELT
L E S E R F O R U M
Genevac_JetRotors_Laborwelt_0907:Genevac_JetRotors_Laborwel
sen uns gemeinsam mit dem gesamten Bereich der RNA-Technologien
in den nächsten 15 bis 20 Jahre intensiv beschäftigen werden. Die zu
erwartende Ernte dieser Bemühungen erscheint lohnend: internationale
Konkurrenzfähigkeit in der Medizin und Biotechnologie.
Bei den anstehenden Analysen der Funktion tausender ncRNAs
dürfen wir die Strukturanalysen der RNA-Moleküle auf keinen Fall
vergessen, denn nur wer die atomare Struktur dieser Moleküle begreift,
kann ihre Funktion verstehen und diese Informationen nutzen um neue
RNA-Moleküle mit Methoden des Computerdesigns zu entwickeln.
Und auch hier liegt noch einiges weltweit mit der RNA-Forschung im
Argen, wie uns folgende Zahlen verdeutlichen: Im März 2007 waren
in den Strukturdatenbanken die Koordinaten für 38.633 Protein-Moleküle, 1.137 DNA-Moleküle, aber nur 582 RNA-Moleküle hinterlegt
– bei den RNA-Strukturuntersuchungen gibt es also einen riesigen
Nachholbedarf. Durch atomar aufgelöste Proteinstrukturen haben wir
bereits vieles über die Proteinfunktion und deren Vorhersage gelernt.
Berücksichtigt man die neuesten hochaufgelösten RNA-Strukturergebnisse, die zeigen, dass neben Watson-Crick-Basenpaarungen auch
vielseitige non-Watson-Crick-, Tripel-Basenpaarungen und hochspezifische Wasser- und Kationen-Wechselwirkungen die RNA-Strukturen
und Funktionen beeinflussen, so müssen künftig sicher vergleichbare
Mengen an RNA-Strukturen ermittelt werden.
Zukunft der RNA-Technologien in Deutschland
Kennziffer 12 LW 04 · Informationen ordern? · www.biocom.de
LABORWELT

Abschließend noch einige Anmerkungen zur Zukunft der RNATechnologien in Deutschland und was aus dem Netzwerk für RNATechnologien werden soll. Zur Erinnerung: das RiNA-Netzwerk für
RNA-Technologien wurde im Oktober 1998 für 10 Jahre in Berlin vom
BMBF, dem Land Berlin und der Industrie gegründet. Das Fördervolumen betrug 120 Millionen DM, also 60 Millionen Euro. Um allerdings
über die Zukunft der RNA-Technologien in Deutschland entscheiden
zu können, wurde von den Geldgebern, nach einer Ausschreibung, das
Fraunhofer-Institut für System- und Innovationsforschung (ISI) mit der
Evaluierung des RNA-Netzwerkes beauftragt.
Die gründliche Evaluierung wurde von vornherein für einen Zeitraum
von neun Monaten angesetzt, so dass das Ergebnis in diesem Monat zu
erwarten ist. Mit der Evaluierung sollen letztendlich folgende Fragen
beantwortet werden: 1. Hat sich das modellhafte Konzept des Berliner
Netzwerkes für RNA-Technologien bewährt? 2. Hat das Netzwerk von
seiner wissenschaftlichen und wirtschaftlichen Seite die Erwartungen
der Geldgeber erfüllt? 3. Haben die RNA-Technologien, die ursprünglich
in sie gesetzten Erwartungen erfüllt? 4. Sollen die RNA-Technologien
in Zukunft weiter – und wenn ja –, auch bundesweit gefördert werden?
5. Im Fall einer Weiterförderung stellt sich die Frage nach der Struktur
und Organisation und dem Ort der Weiterförderung. Sicher ist aufgrund
der weltweiten Entwicklung der RNA-Technologien eine künftige Förderung in einem erheblichen Maße, die das derzeitige Fördervolumen
um einiges übersteigt, unumgänglich. Dies sehen wir zum Beispiel
allein an dem Beispiel des japanischen ncRNA-Netzwerkes und des
internationalen ENCODE-Projektes, mit denen beide Länder massiv
in die RNA-Technologien investieren. Um in Deutschland mit diesen
Entwicklungen Schritt halten zu können, bedarf es einer nationalen
Anstrengung unter Einbeziehung aller RNA-Experten und Ressourcen
der Republik. Es ist also absolut notwendig, dass die Nation – also etwa
das BMBF, die DFG, die Bundesländer, die Universitäten, die außeruniversitären Einrichtungen, aber auch die Industrie – alle Möglichkeiten
ausschöpfen, damit ein international konkurrenzfähiges Netzwerk oder
Konsortium für RNA-Technologien eingerichtet werden kann. Die mit
dem weltweit einzigartigen Berliner Netzwerk für RNA-Technologien
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nächste Zukunft weltweit entscheidende Vorteile zu verschaffen.
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8. Jahrgang | Nr. 4/2007 | 5
Krebs
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Nukleinsäurebasierte
Wirkstoffe zur Targetvalidierung
und Krebstherapie
Dr. Birgit Spänkuch und Prof. Dr. Klaus Strebhardt, Klinikum der Universität Frankfurt
Die Polo-Like Kinasen (Plk) zählen zur Familie der von der Hefe bis zum Menschen hochkonservierten Serin/Threonin-Kinasen, Es gibt vier Vertreter beim Menschen, Plk1 bis 4. Plk1 wird in
malignen Geweben gegenüber benignem Gewebe überexprimiert, und diese Überexpression dient
als negativer prognostischer Marker. Plk1 hat multiple Funktionen in der Zellzyklusregulation, vom
Eintritt in die Mitose über die Ausbildung eines intakten Spindelfaserapparates bis hin zum Austritt
aus der Mitose, was die Bedeutung von Plk1 für die Zellproliferation und die Zellzykluskontrolle
unterstreicht. Daher kann Plk1 als ein vielversprechendes Target für die Krebstherapie genutzt
werden. Denn bei dieser geht es darum, gezielt die Proliferation maligner Zellen zu hemmen,
dabei aber die benignen Zellen oder Gewebe nicht in ihrer Funktion zu beeinträchtigen.
Unter den verschiedenen Krebsarten nimmt
etwa Brustkrebs eine sehr bedeutende Rolle
ein. So werden für 2007 180.000 Neuerkrankungen in den USA vorhergesagt, 15% der
krebsbedingten Todesfälle sind eine Folge von
Brustkrebs. Diese Zahlen verdeutlichen die
Notwendigkeit neuer Entwicklungen in der
Krebstherapie. Mögliche Strategien reichen von
der Hemmung der Plk1-Expression mit Hilfe
Nukleinsäure-basierter Ansätze, wie der Antisense-Technologie oder der RNA-Interferenz,
über das Einbringen von Hemmstoffen für die
Polo-Box und damit für die Bindung von Plk1
an seine Substrate, bis hin zu ATP-kompetitiven Hemmstoffen, die die katalytische Aktivität von Plk1 hemmen. All diese Ansätze führen
zu einem G2/M-Arrest, zu apoptotischem
Zelltod in verschiedenen Tumorentitäten und
zu verringerter Zellproliferation in vitro und
in vivo. Die Antisense-Technologie und die
RNA-Interferenz führen darüber hinaus zu
verringerter Plk1-mRNA- und -Protein-Expression, da sie auf der Ebene der Translation
ansetzen und damit die Bildung des Plk1-

R
Proteins verhindern. Damit bietet sich Plk1 als
Zielgen für eine spezifische Krebstherapie mit
biodegradierbaren Wirkstoffen an, bei der die
Wahrscheinlichkeit für das Auftreten schwerer
Nebenwirkungen möglichst gering ist.
Entdeckt und kloniert wurde Plk1 bereits im
Jahr 19941. Namensgebend war eine zuerst in
Drosophila entdeckte Kinase, die Polo genannt
wurde. Alle weiteren verwandten Kinasen
wurden in Anlehnung an die Namensgeberin polo-like, also „polo-ähnlich“ getauft. In
Säugetierzellen gibt es vier Mitglieder der PlkFamilie: Plk1, SNK/Plk2 und FNK/Plk3 und
Plk4. Plk1 ist ein 68 kDa-großes Protein mit
multiplen Funktionen im Zellzyklus2. Allen
Plks sind zwei hochkonservierte Aminosäuresequenzen gemeinsam: Eine C-terminale
Domäne, die als polo-Box-Domäne bezeichnet
wird, und eine zweite konservierte Sequenz
in der aminoterminalen Hälfte, die KinaseDomäne3. Die polo-Box-Domäne besteht bei
Plk1-3 aus je zwei polo-Boxen und bei Plk4
aus einer polo-Box, wobei jede polo-Box 60
bis 70 Aminosäuren lang ist (Abb. 1).
Die Plk1-Expression ist abhängig von der
Zellzyklusphase: Sie ist zu Beginn der G1Phase gering, nimmt während des Zellzyklus
zu und erreicht während der G2/M-Phase ihr
Maximum, parallel zur Expression von Cyclin
B12. Nicht nur die Expression und Aktivität von
Plk1 hängen von den jeweiligen Zellzyklusphasen ab, sondern auch die Lokalisation in
der Zelle. In der Pro-Metaphase ist Plk1 an den
Centrosomen oder Kinetochoren lokalisiert, in
der frühen und späten Anaphase findet sich
Plk1 in der Region, die sich zwischen den sich
neu bildenden Tochterzellen befindet („MidBody“), um dann in der Telophase beziehungsweise während der Cytokinese an der letzten
Verbindungsstelle zwischen den neu gebildeten
Tochterzellen („Mid-Zone“) zu lokalisieren4 .
Plk1 ist in verschiedenen Phasen des
Zellzyklus an ganz unterschiedlichen Funktionen beteiligt 2 . Plk1 wird in verschiedenen Krebsarten überexprimiert, und
diese Überexpression von Plk1 geht mit
einer schlechten Prognose der jeweiligen
Patienten einher5. Außerdem führt eine erhöhe Aktivität/Expression von Plk1 dazu,
den „DNA-damage-checkpoint“ zu überwinden6 . Damit könnte die Überexpression
von Plk1 in Tumoren zur Entstehung und
zur Manifestation von Krebs beitragen,
aber auch einen geeigneten Angriffspunkt
für ein therapeutisches Eingreifen darstellen.
Hemmung der Plk-Funktion
Abb. 1: Polo-like Kinasen in humanen Zellen. Schematische Darstellung der vier identifizierten
Plks in humanen Zellen (Plk1-4). Die Länge der Open-Reading-Frames ist angegeben (aa). Zudem sind die Positionen der Kinasedomäne (rot) und der Polo-Boxen (blau) dargestellt (aus: [3]).
6 | 8. Jahrgang | Nr. 4/2007
Wichtige Hinweise auf die Funktion von
Genen werden durch ein Ausschalten der
entsprechenden Gen-/Proteinfunktion erzielt.
Die Hemmung von Plk in verschiedenen
eukaryotischen Spezies hatte unterschiedLABORWELT
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Abb. 2: Hemmung der Plk1-mRNA- und Protein-Expression in MCF-7-Zellen. (a) RT-PCRAnalyse zum Nachweis der Plk1- und der GAPDH-cDNA zur Standardisierung. Gezeigt ist die
GAPDH-standardisierte Plk1-Expression relativ zu unbehandelten Zellen nach Transfektion mit
siRNA4 und siRNA4S (0,056 nM, 0,56 nM, 5,6 nM). (b) Western-Blot-Analyse zum Nachweis der
Plk1-Protein-Expression. Zur Standardisierung dient die Proteinexpression von β-Aktin. Es sind
jeweils siRNA4-Konzentrationen von 0,056 bis 5,6 nM aufgetragen. Als Negativkontrolle dient die
Scrambled-Sequenz zu siRNA4, siRNA4S. aus: [16].
liche Auswirkungen, die von mitotischen
Anomalien bis zum Absterben der Larven
in Drosophila melanogaster7 über kondensierte
Chromosomen und monopolare Spindeln
in Schizosaccharomyces pombe8 bis hin zur
Hemmung der Zellteilung, abnormaler
Chromatin-Verteilung, monoastralen Mikrotubuli, kleineren Centrosomen, apoptotischen
Veränderungen (‚mitotische Katastrophe’) in
humanen Zellen reichen9-13. Aufgrund der bei
humanen Zellen auftretenden Unterschiede
zwischen Tumorzellen und normalen Zellen
konnte der Begriff einer „Tumor-selektiven
Apoptose“ geprägt werden, die durch Hemmung der Plk1-Funktion auftritt.
Inhibition von Plk1 als
therapeutische Intervention
Die Tatsache, dass Plk1 einerseits in malignen Geweben im Vergleich zu normalem
gesunden Gewebe überexprimiert wird und
andererseits an wichtigen Kontrollpunkten
im Laufe des Zellzyklus wichtige Funktionen
übernimmt, macht Plk1 zu einem interessanten Target für eine mögliche neue, spezifische
MCF-7
SK-BR-3
Krebstherapie, die auf molekularbiologischen
Technologien beruht. Hierbei geht es darum,
gezielt die Funktion eines bestimmten Gens
auszuschalten, während die Expression anderer Gene unbeeinflusst bleibt, um mögliche
Nebenwirkungen so gering wie möglich zu
halten. Eine Methode hierfür ist die Antisense-Technologie, wobei synthetische, zu einer
spezifischen mRNA komplementäre DNAFragmente in Zellen eingebracht werden, die
so die Funktion zum Beispiel von Tumorgenen
unterdrücken. Aufgrund vielversprechender
Resultate wurde deren therapeutisches Potential bei verschiedenen malignen Erkrankungen
analysiert. Das zugrundeliegende Prinzip ist
das folgende: Es werden kurze, meist etwa
20 Basen lange einzelsträngige AntisenseOligonukleotide (ASOs), die komplementär
zur mRNA des zu hemmenden Gens sind, in
die Zellen eingebracht. Wenn das ASO durch
Hybridisierung an die komplementäre mRNA
bindet, entsteht eine illegitime Heteroduplex,
ein mRNA/DNA-Hybrid. Dieses wird von der
Zelle als unphysiologisch erkannt, so dass die
zelleigene RNase H induziert wird, die ihrerseits die mRNA an der Stelle der Heteroduplex
MDA-MB-435
BT-474
HMEC
Kontrolle
siRNA4S
siRNA4
Abb. 3: Apoptoseinduktion durch Transfektion mit siRNA im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen und zur scrambled-Kontrolle (siRNA4S). DAPI-Färbung zur Darstellung der DNA in verschiedenen Brustkrebszelllinien (MCF-7, SK-BR-3, MDA-MB-435, BT-474) und primären humanen
Mammaepithelzellen (HMECs). aus: [16]
8 | 8. Jahrgang | Nr. 4/2007
schneidet und sie damit abbaut14. Dadurch
wird die Translation zum Protein verhindert
und damit auch die sich normalerweise
anschließende Signalkaskade. Eine weitere
Strategie zur Unterdrückung unerwünschter
Protein-Expression ist die RNA-Interferenz.
Darunter versteht man die Sequenz-spezifische Hemmung der Proteinexpression durch
doppelsträngige RNA. Elbashir et al. konnten
zeigen, dass die Transfektion 21 Nukleotidlanger siRNAs zur selektiven Inhibition endogener Gene führt15. Auf dieser Basis konnte
gezeigt werden, dass die Transfektion mit
siRNA gegen Plk1 – einem zentralen Regulator der Mitose – in Tumorzellen Apoptose
verursacht. Die Hemmung der Gen- bzw.
Proteinexpression mit siRNAs ist spezifischer
als die Antisense-Technologie, und bereits sehr
niedrige Konzentrationen (im picomolaren
Maßstab) führen zu einer signifikanten Reduktion der Plk1-Expression (Abb. 2).
Mit beiden Technologien ist es möglich, in
Krebszelllinien und Tumoren im humanen Xenograft-Experiment die Apoptose zu induzieren. Beim Vergleich der Wirkung von siRNAs,
die gegen Plk1 gerichtet sind, auf Krebszellen
und normale Zellen zeigt sich ein differentieller
Effekt, der für eine eventuelle Therapie sehr
wichtig ist. Hierbei lässt sich festhalten, dass
primäre Zellen wesentlich weniger empfindlich
auf die Hemmung der Plk1-Expression reagieren. Es werden höhere siRNA-Konzentrationen
benötigt, um die gleiche Transfektionseffizienz
zu erzielen, aber auch mit diesen hohen Konzentrationen wird weder die Proliferation der
gesunden Zellen beeinträchtigt, noch wird
Apoptose induziert oder ein G2/M-Arrest
ausgelöst, wie dies bei Krebszellen doch sehr
deutlich der Fall ist12,16 (Abb. 3).
Ein weiterer Ansatz zur Hemmung der
Plk1-Aktivität und damit der Zellproliferation
von Krebszelllinien ist die Entwicklung von
niedermolekularen Hemmstoffen17-19. Hierbei
werden in silico chemische Formeln für niedermolekulare Wirkstoffe ermittelt, mit denen
entweder eine ATP-kompetitive Hemmung
der Kinaseaktivität erreicht werden kann,
oder es werden Hemmstoffe für die Polo-Box
entwickelt, die eine Bindung von Plk1 an seine
Substrate verhindert. Weiterhin ist es möglich,
mit Peptiden, die über einen Carrier, beispielsweise Antennapedia, in die Zellen eingebracht
werden, die Funktion der Polo-Box zu hemmen
und damit die Proliferation von Krebszellen
spezifisch zu hemmen13.
Vor allem bei den Nukleinsäure-basierten
Technologien, aber auch bei anderen Strategien, besteht jedoch nach wie vor das Problem,
die Wirkstoffe intakt über die Blutbahn des
Menschen an den Ort des Geschehens, also in
den Tumor zu bringen. Bei den Antisense-Oligonukleotiden wurde dieses Problem mit verschiedenen chemischen Modifikationen (Phosphorothioate, 2’-O-Methyl-Modifikationen etc.)
gelöst, bei siRNAs gibt es Versuche, die siRNAs
beispielsweise über Cholesterol zu verestern.
LABORWELT
R
E
P
O
R
T
Porvair rose ad Laborwelt DE:Layout 1
25/5/07
12:52
Dennoch sind diese chemischen Modifikationen nicht unproblematisch
bezüglich der Induktion unspezifischer Antworten, insbesondere durch
das Immunsystem. Eine Strategie, um diese aufwendigen chemischen
Modifikationen zu umgehen, ist der Einsatz von Protein-basierten Nanopartikeln, wie zum Beispiel HSA (humanes Serumalbumin). Damit
werden der Wirkstoff stabilisiert und die Zirkulationsdauer signifikant erhöht. Wenn diese Nanopartikel darüber hinaus an Antikörper
gekoppelt werden, ist ein Tumor-spezifisches Targeting möglich, mit
dem Nebenwirkungen minimiert werden könnten. Eine Möglichkeit
bieten hier beispielsweise Trastuzumab-konjugierte Nanopartikel, mit
denen zum Beispiel Antisense-Oligonukleotide gegen Plk1 transportiert
werden könnten. So könnte eine gute Anreicherung der Wirkstoffe im
Zielgewebe, dem Tumor, verbunden mit einer geringen Anreicherung der
Wirkstoffe in gesundem Gewebe erzielt werden, wodurch die Belastung
der gesunden Organe durch die Wirkstoffe deutlich reduziert werden
kann. Die Kombination der Wirkstoffe mit einem Antikörper stellt eine
gute Möglichkeit dar, die Spezifität der Technologie weiter zu erhöhen
und damit den therapeutischen Effekt zu steigern. Gleichzeitig wird
die Stabilität der Nukleinsäure-basierten Wirkstoffe erhöht, so dass eine
biodegradierbare neue Wirksubstanz (ASO, siRNA) ohne weitere Zugabe
chemisch synthetisierter Stoffe zum Einsatz kommen könnte.
Fazit
Plk1 ist aufgrund der Tatsache, dass es in malignen Geweben gegenüber benignem Gewebe überexprimiert wird und einen negativen
prognostischen Marker darstellt, ein vielversprechendes Targetgen für
den ‚Knock-Down’ mit Nukleinsäure-basierten Wirkstoffen, die ein
spezifisches Silencing ermöglichen. Damit war es in der Vergangenheit
bereits möglich, in vitro und in vivo reduziertes Tumorwachstum durch
Apoptose zu erzielen. Weitere Studien müssen nun einerseits die Targetvalidierung mit Hilfe der niedermolekularen Wirkstoffe in ersten klinischen Studien erbringen, der Nanopartikel-basierte Ansatz sollte – vor
allem in Hinblick auf bereits zugelassene Arzneimittelformulierungen
mit HSA-Nanopartikeln – weiter in präklinischen Studien evaluiert
werden. Andererseits muss nach neuen Applikationswegen für siRNAs
oder ASOs gesucht werden, um diese spezifischen Wirkmechanismen
anschließend in klinischen Studien einsetzen zu können.
Literatur
[1]
[2]
[3]
[4]
[5]
[6]
[7]
[8]
[9]
[10]
[11]
[12]
[13]
[14]
[15]
[16]
[17]
[18]
[19]
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Yuan J et al. Oncogene 21 (2002) 8282.
Takai N et al. Oncogene 24 (2005) 287.
Smits VA et al. Nat Cell Biol 2 (2000) 672.
Llamazares S et al. Genes Dev 5 (1991) 2153.
Ohkura H et al. Genes Dev 9 (1995) 1059.
Lane HA et al. J Cell Biol 135 (1996) 1701.
Cogswell JP et al. Cell Growth Differ 11 (2000) 615.
Spankuch-Schmitt B et al. Oncogene 21 (2002) 3162.
Spankuch-Schmitt B et al. J Natl Cancer Inst 94 (2002) 1863.
Yuan J et al. Cancer Res 62 (2002) 4186.
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Elbashir SM et al. Nature 411 (2001) 494.
Spankuch B et al. Oncogene (2007)
Steegmaier M et al. Curr Biol 17 (2007) 316.
Gumireddy K et al. Cancer Cell 7 (2005) 275.
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8. Jahrgang | Nr. 4/2007 | 9
Page
B L I T Z L I C H T
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siRNA-Analytik: Qualität,
Stabilität, pharmakokinetische
Eigenschaften
Ingo Röhl und Stephan Seiffert, Roche Kulmbach GmbH
Die chemisch-instrumentelle Analytik sowohl von einzel- wie auch doppelsträngiger, synthetisch
hergestellter RNA ist ein integraler Bestandteil der Forschungstätigkeit von Alnylam Europe
(jetzt Roche Kulmbach), einem Unternehmen, das auf die Entwicklung neuartiger Medikamente
auf der Basis von small interfering RNAs (siRNA) fokussiert ist. Die Entwicklung robuster und
nachweisstarker analytischer Methoden zur Charakterisierung der siRNA unter GLP-Bedingungen in der präklinischen und klinischen Forschung stellt eine große Herausforderung für den
Analytiker dar. Im Gegensatz zu den „small molecule drugs“ tritt bei der Herstellung von siRNA
eine Vielzahl unbekannter, teilweise schwierig zu analysierender Verunreinigungen auf.
Bereits in einer sehr viel früheren Phase der
Entwicklung eines Medikaments auf siRNABasis sollte nicht auf eine ausreichende Qualitätskontrolle verzichtet werden. Vor allem die
hohe Probenzahl für das in vitro-Screening, in
dessen Rahmen aktive siRNA-Moleküle identifiziert werden, erfordert einen hohen zeitlichen und instrumentellen Aufwand. Dieser
Aufwand ist jedoch insofern gerechtfertigt, als
dass gezeigt wurde, dass zwei völlig identisch
erscheinende siRNAs zweier verschiedener
kommerzieller Anbieter zu variierenden
Ergebnissen im in vitro-Testsystem führen
können. Eine nachträgliche Analyse dieser
siRNAs ergab voneinander abweichende
molekulare Massen und Reinheiten1.
Aus diesem Grund werden bei der Roche
Kulmbach GmbH alle in das in vitro-Screening
eingebrachten siRNAs nach Synthese und Auf-
reinigung hinsichtlich ihrer Qualität überprüft.
Diese Vorgehensweise gewährleistet zum
einen die Vergleichbarkeit der verschiedenen
siRNAs in einem Testsystem. Zum anderen
können unerwünschte „non-siRNA“-Nebenwirkungen reduziert werden. Das Ziel, hierbei
einen hohen Probendurchsatz zu garantieren,
erfordert den Einsatz robuster, universell einsetzbarer analytischer Methoden. Bei Roche
Kulmbach ist daher die Qualitätskontrolle
einer siRNA in zwei voneinander getrennte
Arbeitsschritte unterteilt. Zunächst erfolgt
die Überprüfung der RNA-Einzelstränge
nach der Synthese und Aufreinigung mittels
denaturierender Anionenaustausch-HPLC
und MALDI-TOF-Massenspektrometrie auf
Reinheit und Identität.
Denaturierende Bedingungen werden
durch Chromatographie bei 75 °C und den
Abb. 1: Stabilität verschieden modifizierter siRNAs in humanem Serum (*FLP: full length product)
10 | 8. Jahrgang | Nr. 4/2007
Einsatz chaothropher Eluentensalze wie
etwa NaClO4 oder durch einen erhöhten pHWert der Eluenten von 11 erreicht. Vor allem
über den pH-Wert der Eluenten kann die
Selektivität der Chromatographie gesteuert
werden. Dies ermöglicht besonders bei der
denaturierenden siRNA-Duplex-Analyse
eine gute Trennung der beiden gleich langen
Einzelstränge. Die im Vergleich zu neutralen
Eluenten verbesserte Trennung der Einzelstränge beruht vor allem auf der negativen
Ionisierung der tautomeren Sauerstoffatome
in den Basen rG, rU und dT. Bei diesen pHBedingungen erweist sich etwa die DNA-Pac
PA200 (Dionex) als sehr robuste Trennsäule
mit guter Lebensdauer2.
Die native Analyse der siRNA-Duplexe
wird mittels paralleler Kapillargelelektrophorese durchgeführt. Dabei wird der Annealing-Prozess im Hinblick auf den Einsatz
der richtigen Einzelstränge in äquimolaren
Konzentrationen überprüft. Als Ergebnis
erhält man das Einzelstrang- zu Duplexverhältnis. Mit Hilfe dieses Gesamtprozesses
werden Fehler frühzeitig erkannt und damit
falsch-positive oder -negative Treffer im
Screening reduziert.
Analyse von Verunreinigungen
Zusätzlich zu diesen Standardmethoden wird
das Verunreinigungsprofil von RNA-Einzelsträngen für in vivo-Anwendungen mittels
Ionenpaar-RP-HPLC mit ESI-MS-Kopplung
charakterisiert. Als optimales IonenpaarReagenz für die ESI-MS-Kopplung werden Gemische aus Hexafluoroisopropanol
(100-400mM) und Triethylamin (8-16mM)
in wässrigen Eluenten auf XBridge C18 RPSäulen (Waters) eingesetzt. Die Elution der
RNA erfolgt mit Hilfe eines Methanol- oder
Acetonitril-Gradienten3.
Um eine hohe Auflösung unter denaturierenden Bedingungen zu erreichen, wird
bei einer Temperatur von 50° C bis 60° C
chromatographiert. Auf diese Weise können
vor allem die sogenannten (n+x)-Verunreinigungen identifiziert werden, die mit Hilfe
der Anionenaustausch-HPLC nur schlecht
vom Hauptprodukt getrennt werden können.
So werden schon in einem frühen Entwicklungsstadium Erkenntnisse über kritische
Verunreinigungen gesammelt, die später in
den GLP- und GMP-Entwicklungsprozess
einfließen können.
Die Anionenaustauscher-Chromatographie stellt zudem ein ideales Instrument zur
Untersuchung von siRNA direkt aus Plasma
dar. Störende Plasmabestandteile eluieren im
Totvolumen der Säule, während die siRNA
mit hoher Kapazität gebunden wird. Das
Lower Limit of Quantitation (LLOQ) der Anionenaustauscher-HPLC mit UV-Detektion
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siRNA-Wirkstoffentwicklung
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Ursprungs-Sequenz
siRNA-A
siRNA-B
siRNA-C
siRNA-D
siRNA-E
Jejunum
[ng/g]
Serum
[ng/g]
Modifikation
siRNA-A1-Chol
exo + endo
siRNA-A2-Chol
exo
siRNA-B1-Chol
siRNA-B2-Chol
siRNA-C1-Chol
siRNA-C2-Chol
siRNA-D1-Chol
exo + endo
8
17
22
siRNA-D2-Chol
exo
BQL
BQL
BQL
siRNA-E1-Chol
exo + endo
> 900
60
40
siRNA-E2-Chol
exo
70
7
BQL
2
6
6
BQL
BQL
BQL
exo + endo
35
7
18
exo
7
4
2
exo + endo
130
28
25
exo
72
10
7
bei 260nm liegt im Bereich von etwa 1 pmol
siRNA, und die erhaltenen Kalibrierungsgeraden sind über drei Größenordnungen linear. Die verwendeten DNA Pac-PA200-Säulen
können problemlos mit bis zu 50 µL Plasma
in einer Injektion beladen werden, ohne dass
eine signifikante Peakverbreiterung auftritt.
Damit ergibt sich, bezogen auf die siRNAKonzentration im Plasma, ein LLOQ von ca.
300ng/mL. Diese Nachweisgrenze reicht für
viele in vivo-Anwendungen, speziell PlasmaPharmakokinetik-Studien, aus.
in vitro-Stabilität und Pharmakokinetik
Eine weitere wichtige Anwendung der Anionenaustauscher-HPLC und der MALDITOF-MS ist die in vitro-Stabilitätsanalyse, die
zur Verbesserung der pharmakokinetischen
(PK) Eigenschaften von siRNA-Molekülen
genutzt wird. Die Stabilität der siRNA spielt
– im Gegensatz zu Untersuchungen in in
vitro-Testsystemen – in vivo eine entscheidende Rolle. Es gibt eine Vielzahl von exo- und
endo-Ribonukleasen, die RNA in biologischen
Flüssigkeiten in wenigen Minuten vollständig
degradieren können. Eine intravenös verabreichte, chemisch unmodifizierte siRNA
würde im Blutplasma sehr schnell abgebaut
und über die Niere in den Urin ausgeschieden
werden. Daher ist die Stabilisierung gegen
Ribonukleasen einer der Schlüsselschritte, um
eine siRNA mit den gewünschten pharmakokinetischen und -dynamischen Eigenschaften
auszustatten.
Um die Stabilität verschiedener siRNAs zu
vergleichen, werden diese in Plasma bei 37° C
unterschiedlich lang inkubiert und anschließend ohne weiteren RNA-Aufarbeitungsschritt, wie zum Beispiel eine Trizol-Extraktion, direkt mit der Anionenaustauscher-HPLC
analysiert. Die erhaltenen HPLC-Chromatogramme sind quantitativ auswertbar, und es
kann die Halbwertszeit für beide Einzelstränge
berechnet werden. Durch die hohe Auflösung
des HPLC-Systems können beide Einzelstränge sowie deren Degradationsprodukte als gut
12 | 8. Jahrgang | Nr. 4/2007
Leber
[ng/g]
modifizierte siRNA
voneinander separierte Peaks detektiert werden. Die Fraktionierung dieser Metaboliten
mit nachfolgender MALDI-TOF-MS-Analyse
erlaubt deren Identifizierung und nachfolgend
eine Stabilisierung der siRNA durch gezielten
Einbau chemischer Modifikationen4.
So schützt der Austausch einer Phosphorodiestergruppe durch eine Phosphorothioatgruppe (PTO) gegen den Abbau durch
Exonukleasen, während der Austausch von
2’-Hydroxygruppen gegen 2’-Methoxygruppen (2’-OMe) die Degradierung durch
Endoribonukleasen unterbindet. Abbildung
1 zeigt den Einfluss der 2’-OMe-Modifikationen auf die Stabilität einer bereits durch PTO
gegen Exonukleasen geschützten siRNA in
humanem Serum. Dieser Assay wird in vielen
verschiedenen biologischen Flüssigkeiten angewendet und liefert wichtige Informationen
über die Eigenschaften der siRNA im jeweiligen Zielgewebe, etwa nach einer lokalen Gabe
in die Lunge.
Eine weitere Möglichkeit, die PK einer
siRNA zu beeinflussen, besteht in der Konjugation mit einer lipophilen Gruppe wie
beispielsweise Cholesterin. Es konnte gezeigt
werden, dass eine am sense-Strang mit Cholesterin konjugierte siRNA gegen ApoB sehr
viel länger in der systemischen Zirkulation
verbleibt als die entsprechende unkonjugierte Sequenz. Als Hauptursache der längeren
Plasmahalbwertszeit einer mit Cholesterin
konjugierten siRNA wird die erhöhte Plasmaproteinbindung und die dadurch reduzierte Ausscheidung über die Niere angesehen.
ApoB 100 ist als Bestandteil der VLDL- und
LDL-Partikel verantwortlich für den Transport, die Verteilung und den Stoffwechsel von
Cholesterin im Organismus. 48 Stunden nach
intravenöser Administration der Cholesterinkonjugierten ApoB-siRNA in die Maus wurde
eine mRNA-Reduktion um 57% in der Leber
und um 42% im Jejunum gemessen. Entsprechend wurde auch eine deutliche Senkung des
Cholesterinspiegels im Blut gefunden5.
Die Analyse der Plasma-PK dieser intravenös verabreichten Cholesterin-modifizierten
siRNA erfolgte wiederum mit Anionenaustauscher-HPLC auf einer DNA-Pac PA200-Säule.
Die Auswertung erfolgte, wie schon in der
Stabilitätsanalyse, für beide Einzelstränge
separat. Die Plasmahalbwertszeit der siRNA
wurde von wenigen Minuten für den unkonjugierten Duplex auf ca. zwei Stunden durch
den Einbau des Cholesterins verlängert. Im
Lebergewebe wurde 48 Stunden nach der
Applikation eine siRNA-Konzentration von
60ng/g gefunden. Im Vergleich dazu konnten
für die entsprechende unkonjugierte Sequenz
weder signifikante siRNA-Konzentrationen
noch ein Absinken der ApoB 100-mRNA in
der Leber detektiert werden.
Die Kombination der Cholesterin-Konjugation mit der gezielten Stabilisierung durch
chemische Modifikationen führt zu einer weiteren Erhöhung der siRNA-Konzentrationen
im Gewebe. Abbildung 2 zeigt einen Vergleich
nach intravenöser Injektion von jeweils
50mg/kg siRNA. Es wird jeweils eine nur
gegen Exonukleasen mit einer gegen Exo- und
Endoribonukleasen geschützten siRNA identischer Sequenz verglichen. In allen Beispielen
wurden deutlich höhere Anteile der stärker
stabilisierten siRNA in Leber und Jejunum
detektiert. Beispielsweise wurden von der
siRNa-E1-Chol mehr als 900 ng/g in der Leber
nachgewiesen. Dieser Wert entspricht mehr als
der 13-fachen Menge der sequenzidentischen,
aber weniger stabilisierten siRNA-E2-Chol.
Die gezeigten Beispiele belegen eindrucksvoll, dass der Einsatz von Methoden der
instrumentellen Analytik einen großen Beitrag
zur Optimierung von siRNA-Molekülen für
die therapeutische Anwendung liefert. Vor
allem die HPLC und die Massenspektrometrie
sind unverzichtbare Hilfsmittel im Entwicklungsprozess eines auf siRNA basierenden
Medikamentes. Im Screening-Prozess wird
durch die systematische Qualitätskontrolle die
Vergleichbarkeit der Ergebnisse garantiert. Die
hierfür angewendeten analytischen Methoden
stellen die Basis der in vitro-Stabilitätsstudien
dar, die zum gezielten Einbau chemischer Modifikationen führen. Letztlich ist das Ergebnis
dieser Experimente eine siRNA mit verbesserten PK- und PD-Eigenschaften.
Literatur
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J. Soutschek et al. Nature, 2004, 432, 173-178.
Korrespondenzadresse
Dr. Ingo Röhl, Stephan Seiffert
Analytical Chemistry, Roche Kulmbach GmbH
Fritz-Hornschuch-Straße 9
95326 Kulmbach
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Abb. 2: Gewebekonzentrationen unterschiedlich modifizierter, Cholesterin-konjugierter siRNAs
(BQL: below quantitation level)
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Klinische Forschung
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
Funktionelle Überprüfung
der intrinsischen Hautalterung
mittels siRNA
Dr. Sabine Fimmel1, Dr. Evgenia Makrantonaki2, Prof. Dr. Christos C. Zouboulis1,2;
1
Campus Benjamin Franklin, Berlin, 2Städtisches Klinikum Dessau
Während der durch Umwelteinflüsse verursachte exogene Hautalterungsprozess intensiv
erforscht wird, ist der molekulare Mechanismus der endogenen Hautalterung weit weniger
geklärt. Dabei bietet sich die Haut als peripheres endokrines Organ an, den Einfluss der Hormone alters- und geschlechtsspezifisch zu studieren. Es wurde mit humanen Talgdrüsenzellen
(SZ95-Sebozyten) ein in-vitro-Modell der intrinsischen Hautalterung entwickelt, das auf alle
anderen Hautzelltypen übertragen werden kann. Mittels der Methode der RNA-Interferenz
wurde die funktionelle Bedeutung von CXCL1 untersucht, eines Chemokins, dessen Expression
im Alter zunimmt und welches an zahlreichen Entzündungskaskaden beteiligt ist.
Key Words: intrinsische Hautalterung, in-vitro-Alterungsmodell, RNA-Interferenz, CXCL1
In unserem, innerhalb des Berliner RNANetzwerkes geförderten Projekt wurde das
Potential von small interfering RNA (siRNA)
zur Entwicklung neuer Strategien zur Untersuchung der intrinsischen Hautalterung
genutzt. Es sollte geklärt werden, inwieweit
es möglich ist, mittels synthetischer siRNAMoleküle in humanen Hautzellen Gene zu
hemmen, die in den endokrinen Alterungsprozess der Haut involviert sind. Während
der exogene Alterungsprozess organspezifisch ist und von Umwelteinflüssen, wie der
UV-Strahlung, Luftverschmutzung und von
Lebensgewohnheiten (falsche Ernährung,
Rauchen) abhängig ist, wird die intrinsische
Alterung durch eine individuelle genetische
Prädisposition und durch den Hormonstatus
beeinflusst. Die Haut – Ziel von zahlreichen
Hormonen – ist selbst ein aktives peripheres
endokrines Organ, das Hormone synthetisiert

B L I T Z L I C H T
(Abb. 1)1. Die endogene Hautalterung reflektiert dieselben degenerativen Prozesse wie sie
auch in anderen Organen beobachtet werden. Die alters- und geschlechtsabhängigen
hormonellen Veränderungen verursachen
ein vermindertes Proliferationsvermögen,
eine reduzierte Synthese der Matrixproteine
und einen erhöhten Widerstand gegenüber
apoptotischen Signalen, was zur Ausbildung
eines spezifischen Phänotyps führt, wie trokkener und dünner Haut, wodurch diese ihre
Elastizität einbüßt2.
Endokrines in-vitro-Alterungsmodell
Um die Rolle der Hormone bei der endogenen
Hautalterung besser zu verstehen, haben wir
ein in-vitro-Hautmodell entwickelt, das auf
definierte Hormonbedingungen reagiert: Das
Kulturmedium der humanen Talgdrüsenzelllinie SZ95 wurde mit 17β-Östradiol, Progesteron, Testosteron, DHEA, Wachstumshormon
(GH) und IGF-I so substituiert, dass es der
normalen Serumkonzentration einer 20beziehungsweise 60-jährigen Frau (f20/f60)
oder einem 20- beziehungsweise 60-jährigen
Mann (m20/m60) entsprach (Abb. 2). Eine
cDNA-Microarray-Expressionsanalyse in
Kooperation mit dem Max-Planck-Institut
für molekulare Genetik (Dr. James Adjaye,
Dr. Ralf Herwig, Prof. Dr. Hans Lehrach)
ergab, dass von 15.529 bekannten und neuen
Genen 8.163 Gene in den jeweils Hormon-behandelten Sebozyten exprimiert wurden. 899
Gene wiesen eine differentielle Expression in
der f20- und f60-Gruppe auf und wurden als
potentielle Marker für die hormoninduzierte
Hautalterung eingestuft. 399 Gene wurden
bei Bedingungen hochreguliert, die die weibliche Serumhormonkonzentration simulierten; bei Bedingungen, welche die männliche
Serumhormonkonzentration nachstellten,
waren es 298 Gene3.
CXCL-1 – ein potentielles Targetgen
für RNA-Interferenz
Abb. 1: Hormonsynthese in humaner Haut. ACTH = Adrenocortikotropes Hormon; -MSH = -Melanozyten stimulierendes Hormon; CRH = Corticotropin releasing Hormon; Vit. D = Vitamin D; atRA
= All-trans Retinsäure; IGF-I = Insulin-like growth factor I; IGFBP-3 = Insulin-like growth factor
Bindungsprotein-31.
14 | 8. Jahrgang | Nr. 4/2007
Zu unseren potentiellen Zielgenen, deren
Expression in Korrelation zum Alter hochreguliert war, gehören unter anderem Gene,
welche in inflammatorische Signalkaskaden
involviert sind. Ein Gen, das bei der hormoninduzierten Alterung besonders stark hochreguliert wird – und zwar nicht nur in der Haut,
sondern auch in anderen Organen wie etwa
Niere, Milz, Plazenta und im Rückenmark
von alten Menschen –, ist das CXCL1-Gen.
CXCL1 (GRO-α) ist ein Chemokin, das eine
wesentliche Rolle bei der Entzündung, der
Tumorentstehung und der Angiogenese
spielt und wurde daher von uns als Kandidat
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Abb. 2: In-vitro-Hautmodell unter definierten Hormonbedingungen: Die Konzentrationen entsprechen den Serum-Normalwerten von 20- und 60-jährigen Männern (m20/m60) bzw. Frauen (f20/f60).
Bei der transienten Transfektion der humanen
SZ95-Sebozyten mit synthetischen siRNAMolekülen konnten wir auf Erkenntnisse
zurückgreifen, die wir bei der Etablierung
von Transfektionsmethoden mit AntisenseMolekülen in diesem Zellsystem gewonnen
hatten4-5. Bei den uns von Silence Therapeutics (vormals Atugen bzw. SR Pharma,
Berlin, London) zur Verfügung gestellten
Transfektionsreagenzien handelt es sich um
eine “Delivery“-Technologie, mit der die
siRNA-Moleküle effektiver in das Zielgewebe (Zelle) transportiert werden, was ihre
Funktionalität fördert. Die sogenannten AtuPLEX®-Formulierungen, basierend auf proprietären kationischen Lipiden und neutralen
Helferlipiden, wurden für eine systemische
Applikation in vivo etabliert. Durch die Bildung eines siRNA-Lipoplexes, bestehend
aus positiv geladenen Liposomen und der
negativ geladenen siRNA, wird eine effektive
siRNA-Aufnahme in die Zellen erreicht. Bei
den siRNA-Molekülen (AtuRNAi®) handelt
es sich um doppelsträngige RNA-Oligonukleotide mit stumpfen Enden, stabilisiert mit
2’-O-Methyl-Modifikationen wechselseitig an
beiden RNA-Strängen6,7.
Die effiziente Aufnahme der CXCL1-siRNA
in die humanen Talgdrüsenzellen wurde
mittels einer Cy3-markierten siRNA fluoreszenzmikroskopisch gezeigt (Abb. 3). Durch
die Auswahl geeigneter AtuPLEX®-Formulierungen wurde nach einer Endozytose/
endosomal-vermittelten Inkorporation eine
effiziente zelluläre Aufnahme der siRNAs in
das Zytoplasma der Zellen erreicht, dem Ort
des siRNA-vermittelten mRNA-Abbaus.
Im Zuge von RNA-Interferenz-Experimenten sind verschiedene Kontrollen nötig, um
den Einfluss des Transfektionsvehikels aus-
zuschließen und um die sequenzspezifische
Inhibierung durch die siRNA-Sequenzen
nachzuweisen. Daher wurde die stabile
Expression von zwei Haushaltsgenen in den
transient transfizierten Zellen mittels quantitativer real-time-PCR nachgewiesen. Für die
relative Quantifizierung des „knock-downs“
auf RNA-Ebene wurden Glucose-6-PhosphatDehydrogenase (G6PDH)-“house-keeping“
Standards gegen CXCL1-Verdünnungsserien ins Verhältnis gesetzt. Nach einer
Transfektionszeit von 12 Stunden und einer
Erholungsphase von sieben Stunden war die
CXCL1-Expression um 75,0±3,0% reduziert.
Die Hautzellen sezenieren mehr als 90% des
Chemokins in ihren Kulturüberstand, daher
wurde der Proteingehalt mittels ELISA ermittelt. Die effektivste siRNA-Sequenz erzielte
eine Hemmung von 70,0±2,8% (verglichen
mit negativen Kontrollen, scrambled siRNAMoleküle, native und nur mit AtuPLEX behandelte SZ95-Sebozyten) auf Proteinebene,
während die weniger wirksamen Sequenzen
eine Reduktion von immerhin 30% bis 40%
erreichten. Diese Hemmung ist von vorübergehender Natur. Das heißt, nach 16 bis 20
Stunden verliert die transiente Transfektion
der Sebozyten ihre Wirkung, und eine erneute
siRNA-Behandlung wird erforderlich.
Wir konnten zeigen, dass transiente Transfektionen von epithelialen Hautzellen (Sebozyten und Keratinozyten) mit siRNA-Molekülen erfolgreich und biologisch relevant
sind. Es ließen sich Korrelationen zwischen
einer gehemmten CXCL1-Expression und
einem verminderten Niveau des Angiogenesemarkers VEGF sowie den mit Entzündungsprozessen in Verbindung stehenden
Interleukinen IL6 sowie IL8 nachweisen.
Literatur
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Santel, A., Aleku, M., Keil, O., Endruschat, J., Esche, V., Fisch, G., Dames,
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Gene Ther. 16 (2006), 1222-1234.
Korrespondenzadresse
Abb. 3: Effizienzüberprüfung durch Fluoreszenzmikroskopie. AtuPLEX®-vermittelte Aufnahme
von Cy3-markierter siRNA in das Zytoplasma der SZ95-Sebozyten
16 | 8. Jahrgang | Nr. 4/2007
Dr. Sabine Fimmel
Laboratorium für Biogerontologie,
Dermato-Pharmakologie
und Dermato-Endokrinologie
Institut für Klinische Pharmakologie und
Toxikologie – Campus Benjamin Franklin
Charité-Universitätsmedizin Berlin
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Transfektion
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Mehrschalige CalciumphosphatNanopartikel als biokompatible
Träger für Nukleinsäuren
Anna Kovtun1, Viktoriya Sokolova1, Rolf Heumann2, und Matthias Epple1,
1
Institut für Anorganische Chemie, Universität Duisburg-Essen, Essen
2
Molekulare Neurobiochemie, Ruhr-Universität Bochum, Bochum
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Less Heat.
No DNA Damage.
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Calciumphosphat-Nanopartikel können durch Umhüllung mit Nukleinsäuren (DNA, siRNA,
Oligonukleotide) in kolloidaler Form stabilisiert werden und zur Transfektion von Zellen
eingesetzt werden. Durch den Einschluss der Nukleinsäuren in die Nanopartikel können
diese vor dem intrazellulären Abbau geschützt werden, wodurch die Transfektionseffizienz
erheblich gesteigert werden kann. Die Transfektionslösungen sind lagerfähig und verlieren
ihre Fähigkeit zur Transfektion nicht. Der besondere Vorteil der Methode liegt in der hohen
Biokompatibilität des Calciumphosphats.
Das Einbringen von Nukleinsäuren in lebende
Zellen wird sowohl zur Induktion der Produktion von Proteinen als auch zur Abschaltung der Produktion von Proteinen eingesetzt.
Im ersten Fall wird DNA eingesetzt, die nach
dem Einschleusen in den Zellkern die Produktion der entsprechenden Proteine codiert. Im
zweiten Fall führt das Einbringen von small
interfering RNA (siRNA) in das Zytoplasma
zur selektiven, postranskriptionalen Inhibition der Proteinexpression. Ein möglicher
klinischer Einsatz wird in der Gentherapie
gesehen, das heißt der Behandlung genetisch
bedingter Krankheiten1. Da Nukleinsäuren allein kaum zum Eindringen in Zellen befähigt
sind und durch Nukleasen schnell abgebaut
werden, bedarf es geeigneter Träger, um eine
effiziente Transfektion zu erreichen. Dafür
stehen insbesondere modifizierte Viren (virale Transfektion=Transduktion), kationische
und liposomale Transfektionsagenzien und
anorganische Nanopartikel zur Verfügung.
Aufgrund erheblicher Bedenken bei der
viralen Transfektion hinsichtlich der möglichen Rekombination, der Immunogenität
und Carcinogenität 2 sowie aufgrund der
toxischen Eigenschaften kationischer und
liposomaler Transfektionsagenzien3-5 gewinnen anorganische Nanopartikel zunehmend
an Bedeutung, auch wenn ihre Effizienz im
Allgemeinen geringer ist als die viraler Transfektionsagenzien.
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Abb. 1: Verfahren zur Herstellung von Calciumphosphat-Nanopartikeln, die mit Nukleinsäuren
umhüllt werden. Lösungen von Calcium- und Phosphatsalzen werden in ein gerührtes Gefäß
gepumpt, wodurch ein Niederschlag von nanopartikulärem Calciumphosphat entsteht. Nach wenigen Sekunden wird die entstandene Dispersion der Calciumphosphat-Nanopartikel mit einer
Pipette entnommen und in einem zweiten Gefäß schnell mit einer Lösung von Nukleinsäuren
gemischt. Es entsteht eine stabile kolloidale Dispersion von Nukleinsäure-umhüllten Calciumphosphat-Nanopartikeln.
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8. Jahrgang | Nr. 4/2007 | 17
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Abb. 2: Rasterelektronenmikroskopische Darstellung von Nukleinsäure-CalciumphosphatNanopartikeln. Durch den Trocknungsvorgang
sind die einzelnen Partikel aggregiert. Der
Durchmesser der einzelnen Partikel beträgt
rund 100 nm.
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18 | 8. Jahrgang | Nr. 4/2007
Calciumphosphat ist als anorganischer
Bestandteil von menschlichem Hartgewebe
(wie etwa der Knochen und Zähne) von
grundsätzlich hoher Biokompatibilität 6 .
Die gute Wechselwirkung der Calciumphosphat-Oberfläche mit Nukleinsäuren
– vermutlich vermittelt über die PhosphatGruppen der Nukleinsäuren – wurde 1973
in der klassischen Calciumphosphat-Transfektionsmethode nach Graham und van
der Eb umgesetzt7. Diese ist zwar einfach,
führt aber nur zu geringen Transfektionseffizienzen. Weiterhin sind die hergestellten
Transfektionsdispersionen nicht lagerfähig,
da die in-situ gefällten CalciumphosphatDNA-Aggregate einer zeitlichen Veränderung unterliegen. Besser geeignet sind
gezielt hergestellte Calciumphosphat-DNAAggregate, deren Struktur und Eigenschaften besser definiert sind8.
Durch ein geeignetes Fällungsverfahren
gelang uns die Umhüllung von Calciumphosphat-Nanopartikeln mit Nukleinsäuren
und die Herstellung stabiler kolloidaler
Dispersionen (Abb. 1). Diese sind für die
Transfektion einsetzbar und behalten ihre
Transfektionseffizienz auch nach mehrwöchiger Lagerung9. Dies konnte sowohl für
DNA9 als auch für siRNA10 gezeigt werden.
Es entstehen annähernd kugelförmige Partikel mit einem Durchmesser von etwa 100
nm (Abb. 2).
Nachteilig für die Transfektion mit derartigen Partikeln, die aus einem Kern aus Calciumphosphat und einer Hülle aus Nukleinsäuren bestehen, welche die Aggregation der
Nanopartikel durch die negative Ladung der
Nukleinsäure-Hülle verhindert, ist die gute
Zugänglichkeit der Nukleinsäuren durch
RNA- beziehungsweise DNA-abbauende
Enzyme in der Zelle. Dadurch erreicht nur
ein kleiner Teil der Nukleinsäuren in intakter
Form seinen Wirkungsort in der Zelle, zum
Beispiel den Zellkern11.
Eine erhebliche Erhöhung der Transfektionseffizienz gelang uns durch den Einschluss
der Nukleinsäuren in die anorganischen
Nanopartikel. Dazu wurde eine weitere
Hülle aus Calciumphosphat aufgebracht,
auf die eine dritte Schale von Nukleinsäuren
zur kolloidalen Stabilisierung aufgebracht
wurde9,10 (Abb. 3). Sowohl die Transfektion
mit cEGFP-DNA an T-HUVEC-Zellen als
auch das Gene Silencing mit siRNA an EGFPproduzierenden HeLa-Zellen zeigten die
Vorteile dieses Konzeptes (Abb. 4, 5).
Die hier vorgestellten mehrschaligen Nanopartikel aus Calciumphosphat und Nukleinsäuren zeichnen sich insbesondere durch eine
hohe Biokompatibilität aus. Vitalitätstests
an den verwendeten Zellsystemen ergaben
keine adversen Reaktionen; gleichwohl ist
ein Anstieg der intrazellulären Konzentration
an Calcium zu vermeiden, da dies zu Schädigungen der Zellen führen kann. Aus der
Abwesenheit einer negativen Wirkung der
Calciumphosphat-Nanopartikel schließen
wir, dass das eingebrachte Calcium entweder
in partikulärer oder in gelöster Form effektiv
und schnell aus der Zelle entfernt wird.
Abb. 3: Schematische Darstellung mehrschaliger Calciumphosphat-Nanopartikel, in denen
die Nukleinsäuren vor dem Abbau durch Nukleasen geschützt werden9.
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Abb. 4: Effizienz der Abschaltung der Bildung von Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) in
HeLa-Zellen (gene silencing). Mehrschalige Calciumphosphat-Nanopartikel sind hier besonders
wirksam10. Die obere Kante des grünen Balkens entspricht der gemessenen Effizienz, der blaue
Balken gibt die dazugehörige Standardabweichung in positiver Richtung wieder.
In dem hier vorgestellten Konzept wurden die
gleichen Nukleinsäuren für die Transfektion
(im Innern des Nanopartikels) und für die
kolloidale Stabilisierung (auf der Oberfläche
des Nanopartikels) verwendet. Grundsätzlich
sollte es hier möglich sein, unterschiedliche
Nukleinsäuren einzusetzen, das heißt an der
Oberfläche des Partikels stabilisierende und
möglicherweise auch dirigierende Agenzien,
und im Innern des Partikels die in die Zelle
einzuschleusenden Nukleinsäuren. Eine
kolloidale Stabilisierung ist dabei auch mit
geeigneten Polymeren möglich12.
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Graham, F. L., van der Eb, A. J., Virology 52 (1973), 456-467.
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Sokolova, V. V., Radtke, I., Heumann, R., Epple, M., Biomaterials 27 (2006),
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Sokolova, V., Kovtun, A., Prymak, O., Meyer-Zaika, W., Kubareva, E. A.,
Romanova, E. A., Oretskaya, T. S., Heumann, R., Epple, M., J. Mater. Chem.
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Orrantia, E., Chang, P. L., Exp. Cell. Res. 190 (1990), 170-174.
Urch, H., Franzka, S., Dahlhaus, D., Hartmann, N., Hasselbrink, E., Epple,
M., J. Mater. Chem. 16 (2006), 1798-1802.
Korrespondenzadresse
Prof. Dr. Matthias Epple
Institut für Anorganische Chemie
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Abb. 5: HeLa-Zellen, die durch vorhergehende genetische Manipulation permanent das Enhanced Green Fluorescent Protein synthetisieren und dadurch fast alle grün fluoreszieren, vor
(links) und nach (rechts) der Transfektion mit dreischaligen Calciumphosphat-siRNA-Nanopartikeln. Das Einbringen von siRNA führt zum selektiven Abschalten der grünen Fluoreszenz.
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8. Jahrgang | Nr. 4/2007 | 21
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Überwindung der
Chemotherapie-Resistenz
humaner Tumoren
Prof. Dr. Dr. Hermann Lage,
Charité Universitätsmedizin Berlin, Campus Mitte, Institut für Pathologie
Obwohl in den letzten Jahren die RNA-Interferenz (RNAi)-Technologie Einzug in viele biomedizinische Laboratorien gehalten hat, ist die Strategie der gezielten Inhibition der Expression eines
bestimmten Gens mit Hilfe von RNA-Molekülen nicht neu. So wurden in der „Prä-RNAi-Ära“ auf
RNA-Molekülen basierende Antisense-Konstrukte, Ribozyme oder Aptamere vielfältig entwickelt
und detailliert untersucht. Ähnlich wie bei der RNAi-Technik zielt auch die Nutzung dieser RNATechnologien auf die zellbasierte Funktionsanalyse und die Entwicklung neuer therapeutischer
Applikationen ab. Ein wichtiges klinisches Problem, bei dessen Bearbeitung RNA-Technologien
eingesetzt wurden, stellt die Resistenz von Tumoren gegenüber Chemotherapeutika dar. Derartige Resistenzen sind ein wesentlicher Hinderungsgrund für eine erfolgreiche Behandlung von
Tumorpatienten. Auf RNA-Technologien basierende Ansätze helfen dabei, sowohl Chemoresistenz-assoziierte zelluläre Faktoren zu inhibieren und damit eine Chemotherapie-Resistenz zu
durchbrechen als auch die Funktion potentieller neuer Resistenzfaktoren zu charakterisieren.
Bei rund der Hälfte aller malignen Erkrankungen sprechen die Tumoren aufgrund einer
intrinsischen Resistenz nicht auf eine zytotoxische Chemotherapie an. Bei den Tumoren,
die sich chemotherapeutisch behandeln lassen,
entwickelt ein gutes Drittel im Therapieverlauf
eine sekundäre Resistenz, die oft gleichzeitig
gegen mehrere Substanzklassen mit unterschiedlicher chemischer Struktur und Wirkungsweise gerichtet ist – ein Phänomen, das
als Multidrug-Resistenz (MDR) bezeichnet
wird1. Der heute am besten untersuchte MDRPhänotyp wurde bereits Ende der 1960er Jahre
beschrieben und lässt sich auf die Aktivität des
plasmamembranständigen ABC-Transporters
MDR1/P-Glykoprotein (MDR1/P-gp) zurückführen. Die Tumorzelle kann sich mittels
dieses ATP- abhängigen Pumpproteins – oder
auch anderer ABC-Transporter – durch den
gezielten Auswärtstransport von Zytostatika
der sie schädigenden Substanzen entledigen.
RNA-basierte Anti-MDR-Strategien
Um Chemoresistenzen zu überwinden, ist eine
Vielzahl niedermolekularer pharmakologisch
aktiver Inhibitoren von ABC-Transportern
entwickelt worden, die aus unterschiedlichsten
Gründen in der Klinik bisher keine Verbesserung der Therapie bewirken konnten. Neben
diesem „klassischen“ Ansatz wurden auch
auf RNA-Technologien basierende Strategien
verfolgt, um ABC-Transporter in ihrer Aktivität
zu beeinflussen und damit Tumorzellen einer
zytostatischen Therapie zugänglich zu machen.
So wurden bereits seit Beginn der 1990er Jahre
22 | 8. Jahrgang | Nr. 4/2007
in einer Vielzahl von Studien auf RNA-Molekülen basierende Ribozyme (Abb. 1A) erfolgreich in verschiedenen in-vitro-Modellen zur
Inhibition von MDR1/P-gp eingesetzt. Studien
mit auf RNA basierenden Antisense-Oligonukleotiden oder Aptameren liegen nicht vor.
Entsprechend dem zentralen Problem aller auf
Gentherapie basierender Strategien – also dem
Problem der Applikation („Delivery“) – gibt es
nur eine Studie, in der ein RNA-Konstrukt, das
heißt ein von einem Adenovirus synthetisiertes
Ribozym, zur MDR1/P-Gp-Inhibition in einem
in-vivo-Modell erfolgreich eingesetzt wurde2.
Eine Weiterentwicklung dieser „klassischen“ Ribozym-Strategie ist die Entwicklung
von „Multitarget-Multiribozymen“ (MTMR)3
(Abb. 1E). Bei diesem Ansatz werden mehrere bereits vorher detailliert charakterisierte
Ribozyme miteinander kombiniert, die gegen die Transkripte unterschiedlicher ABCTransporter gerichtet sind. Diese einzelnen, in
trans schneidenden Ribozyme sind mit einer
bekannten „Linker“-Sequenz miteinander
verbunden. Über ebenfalls in dem Konstrukt
vorhandene in cis schneidende Ribozyme, die
gegen die „Linker“-Sequenzen gerichtet sind,
können die „therapeutischen“, in trans schneidenden Ribozyme in einem autokatalytischen
Prozess freigesetzt werden.
Seit Einführung der RNA-Interferenz (RNAi)Technologie in die biomedizinische Forschung
am Anfang des Jahrzehnts ist diese ebenfalls in
einer Vielzahl unterschiedlicher Studien zur
Überwindung von MDR eingesetzt worden4.
Erste in vitro-Untersuchungen mit siRNAs
und shRNA-kodierender Plasmid-DNA (Abb.
1B-1D) konnten überzeugend die Inhibition
der Expression unterschiedlicher, ABC-Transporter-spezifischer mRNAs in verschiedenen Tumorzellmodellen zeigen5-8. „Multitarget“-Strategien unter Einsatz verschiedener
RNAi vermittelnder RNA-Konstrukte – auch in
der Kombination mit „klassischen“ Ribozymen
– befinden sich in der Entwicklung (Abb. 1F).
Die entscheidende Hürde für einen erfolgreichen in-vivo-Einsatz der RNAi-Strategie stellt
wiederum das ungelöste Problem der Applikation dar. Bisher konnte lediglich in einer einzigen Untersuchung überzeugend eine Strategie
zur in-vivo-Applikation von anti-ABC-Transporter shRNA kodierender DNA aufgezeigt
werden9 . In dieser Studie wurde shRNA
kodierende Plasmid-DNA mittels Luftdruck
direkt in den chemoresistenten Tumor injiziert
(„Jet Injection“). Das shRNA-vermittelte RNAiPhänomen bewirkte im Vergleich zu chemosensiblen Vergleichstumoren eine vollständige
Sensitivierung des chemoresistenten Tumors
gegenüber einer Behandlung mit Chemotherapeutika. Der Nachteil dieser hocheffektiven Technik liegt darin, dass sie sich ausschließlich zur Behandlung solider und „chirurgisch“
zugänglicher Tumore eignet. Zur systemischen
Behandlung disseminierter chemoresistenter
Tumoren müssen daher alternative Strategien
verfolgt werden. Zum einen wird daher die
Applikation systemisch einsetzbarer, chemisch stabilisierter siRNAs untersucht; zum
anderen werden virale Vektoren, zum Beispiel
Adenoviren, entwickelt, die shRNAs gegen
ABC-Transporter exprimieren10.
RNA-basierte Funktionsuntersuchungen
Durch Einsatz unterschiedlicher „-omics“Technologien, zum Beispiel von „whole
genome“-Genexpressionsanalysen mittels
DNA-Chips, wurden in den letzten Jahren
verschiedene neue potentielle Resistenzfaktoren identifiziert. Da oft keine spezifischen
niedermolekularen Inhibitoren für diese neu
identifizierten Faktoren vorliegen, bieten sich
unterschiedliche, auf RNA-Technologie basierende Strategien an, diese Faktoren gezielt
zu inhibieren und damit deren Beteiligung
an einem Resistenzphänotyp nachzuweisen.
Sowohl der Einsatz von Ribozymen11,12 als
auch die Nutzung RNAi-basierter Methoden13
konnten dabei die biologische Bedeutung
neuer Faktoren für einen definierten Resistenzphänotyp näher charakterisieren.
Schlussfolgerung und Ausblick
Unterschiedliche, auf RNA-Technologie basierte Strategien konnten in den letzten Jahren
eindrucksvoll ihr Potential zur Überwindung
eines MDR-Phänotyps von Tumoren unter Beweis stellen. Zentrale Herausforderung für zu-
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RNA-Technologien
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Abb. 1: Schematische Darstellung unterschiedlicher RNA-Konstrukte zur Inhibition der Expression von ABC-Transporter-spezifischen mRNAs.
A. Ribozym: ein kleines RNA-Molekül, das neben einer konservierten katalytischen Sequenz jeweils zwei variable, flankierende Sequenzen aufweist,
die homolog zu einer definierten Ribozymschnittstelle auf einem spezifischen RNA-Molekül sind. B. siRNA: „small interfering“ RNA, die den intrazellulären RNA-Interferenz (RNAi)-Signalweg aktiviert. C. shRNA-Expressionsvektor: hinter einem RNA-Polymerase III-abhängigen Promoter (P) sind
die über eine „Loop“-Struktur miteinander verknüpften Sequenzen eines Sense- (blau) und eines Antisense-Stranges (rot) lokalisiert. Am 3’-Ende des
Antisense-Stranges befindet sich ein RNA-Polymerase III-spezifisches Terminationssignal (T5), welches aus fünf aufeinanderfolgenden Thymidinresten besteht. Die RNA-Polymerase III-abhängig synthetisierte shRNA (short hairpin RNA) wird intrazellulär über den Dicer-Komplex durch Entfernung
der „Loop“-Struktur in die entsprechende siRNA prozessiert. D. ssRNA Expressionsvektor: jeweils ein Sense- (blau) und ein Antisense-Strang (rot),
die einer siRNA entsprechen, werden unabhängig voneinander über jeweils einen separaten RNA-Polymerase III-abhängigen Promoter (P) synthetisiert. Der Transkriptionsstopp erfolgt an jeweils einem Terminationssignal (T5). Sense- (blau) und Antisense-Strang (rot) hybridisieren intrazellulär
zu der entsprechenden siRNA. E. Multitarget-Multiribozym (MTMR): in diesem Konstrukt sind mehrere, gegen unterschiedliche ABC-Transporter (hier
gegen MDR1/P-gp, BCRP, MRP2) gerichtete Ribozyme (rot) über MDR1/P-gp-spezifische „Linker“-Sequenzen (grün) miteinander verbunden, die die
spezifische Ribozymschnittstelle aufweisen. Eine autokatalytische Spaltung in cis setzt die einzelnen Ribozyme intrazellulär frei. Die Ribozyme können
daraufhin ihre spezifische „Target“ mRNA (schwarz) in trans spalten. F. Multitarget-Multi-siRNA/ Ribozym (MTMsiR): dieses Konstrukt besteht aus
abwechselnd aufeinander folgenden Ribozymen (schwarz) und mehreren siRNA-spezifischen Sense- (blau) und Antisense-Strängen (rot), die jeweils
über „Linker“-Sequenzen (grün) mit der entsprechenden Ribozymschnittstelle, miteinander verbunden sind. Eine autokatalytische Spaltung in cis setzt
die einzelnen siRNA Einzelstränge frei, die intrazellulär zu der entsprechenden siRNA hybridisieren können.
künftige Entwicklungen stellt dabei die Art der
Applikation dar. Eine besonders interessante
Strategie zur Applikation therapeutischer
RNAs ist die mögliche Nutzung neuartiger
„onkolytischer“ Adenoviren – das heißt Viren,
die spezifisch in Tumorzellen replizieren und
diese dadurch lysieren. So wurde ein „onkolytisches“ Adenovirus beschrieben, das ausschließlich in chemoresistenten Tumorzellen
repliziert14,15. Ein derartiges „onkolytisches“
Virus, das shRNAs gegen unterschiedliche
ABC-Transporter exprimiert, sollte in Verbindung mit einer konventionellen zytotoxischen
Chemotherapie eine scharfe Waffe gegenüber
einem chemoresistenten Tumor darstellen.
24 | 8. Jahrgang | Nr. 4/2007
Literatur
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Mantwill K, Ladhoff A, Wichert A, Mymryk JS, Ritter T, Dietel. M, Gänsbacher
B, Royer HD., Cancer Res. 64 (2004), 322-328.
Mantwill K, Köhler-Vargas N, Bernshausen A, Bieler A, Lage H, Kaszubiak A,
Surowiak P, Dravits T, Treiber U, Hartung R, Gänsbacher B, Holm PS., Cancer
Res. 66 (2006), 7195-7202.
Korrespondenzadresse
Prof. Dr. Dr. Hermann Lage
Charité – Universitätsmedizin Berlin
Campus Mitte - Institut für Pathologie
Charitéplatz 1, 10117 Berlin
Tel./Fax: +49-30-45053-5045/45053-6900
eMail: [email protected]
LABORWELT
siRNA-Screening

Validierung infektionsrelevanter
Schlüsselgene mit RNAi
Dr. Volker Patzel, MBA, und Prof. Dr. Stefan H.E. Kaufmann;
Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie, Abteilung für Immunologie, Berlin
Zahlreiche angeborene und erworbene Krankheiten – so auch virale und bakterielle Infektionen
– sind kausal auf die Expression defekter oder unerwünschter, krankmachender Gene zurückzuführen. Die Sequenzierung des Humangenoms sowie des Erbgutes zahlreicher Pathogene
haben Wissenschaftlern den Zugriff auf tausende Gene unbekannter Funktion eröffnet, unter
denen zahlreiche infektionsrelevante Gene vermutet werden. Zur Funktionsbestimmung (Funktionsvalidierung) können unbekannte Gene durch Mutation inaktiviert werden, um anschließend
aus den Folgen des Funktionsverlustes und den resultierenden Phänotypen Rückschlüsse auf die
ursprüngliche Genfunktion zu ziehen. Alternativ zu dieser aufwendigen Knockout-Technik können
Gene auch temporär, dafür aber schnell und parallelisierbar, mit Hilfe kleiner interferierender
RNAs (engl.: small interfering RNAs; siRNAs) gehemmt werden. Dieser als RNA-Interferenz
bezeichnete Mechanismus existiert nur in eukaryotischen Zellen und kann daher ausschließlich
zur Validierung von Wirtsgenen eingesetzt werden. Um auch die Validierung bakterieller Gene
effizienter zu gestalten, haben wir eine zum Patent angemeldete Methode entwickelt, mit Hilfe
von siRNAs auch prokaryotische Gene abzuschalten. Derzeit etablieren wir eine siRNA-basierte
Plattform zur Funktionsvalidierung eukaryotischer und prokaryotischer Gene, die bei bakteriellen
Infektionen eine Schlüsselrolle spielen. Diese repräsentieren vielversprechende Zielstrukturen
(Targets) für neue diagnostische und therapeutische Ansätze in der Infektionsforschung.
werden bei mikrobiellen Infektionen Genprodukte sowohl des infektiösen Pathogens
als auch des infizierten Wirts exprimiert.
Die Genome des Menschen und zahlreicher
humanpathogener Erreger sind seit einigen
Jahren sequenziert, und in der Identifizierung
neuer infektionsrelevanter Gene liegt ein wesentlicher Schlüssel zu neuen therapeutischen
Ansätzen und Wirkstoffen.
Makroorganismen einschließlich des Menschen haben mit ihren Immunsystemen
komplexe molekulare und zelluläre Systeme
entwickelt, um sich gegen die permanenten
Angriffe unterschiedlichster Mikroorganismen zu behaupten. Im Gegenzug haben
Mikroorganismen wie zum Beispiel Bakterien
oder Viren trickreiche Strategien hervorgebracht, um der Wirtsabwehr zu entkommen
oder entgegenzutreten und so den eigenen
Fortbestand unter Missbrauch des infizierten
Makroorganismus zu sichern. Entsprechend
Abb. 1: Elektronenmikroskopische Aufnahme
von Mycobacterium tuberculosis (blau coloriert) während der Infektion eines humanen
Makrophagen (gelb coloriert)
LABORWELT
Bei der Analyse infektionsrelevanter Genfunktionen spielen die Techniken der reversen
Genetik, also die Ermittlung der Genfunktion
auf Basis der Kenntnis der Gensequenz, eine
entscheidende Rolle. Bei der Mutagenese
werden die zu untersuchenden Gene im Wirt
(Zellkultur- oder Tiermodell) oder Pathogen
ganz oder teilweise eliminiert. Der resultierende Funktionsverlust gibt anschließend
Aufschluss über die Rolle des mutierten Gens
bei der Infektion und während des Infektionsverlaufs.
Als Alternative zu diesen zeit- und kostenaufwendigen Gen-Knockout-Studien lassen
sich Gene im Hochdurchsatzverfahren partiell auch mit inhibitorischen Nukleinsäuren
abschalten (Knock-down). Bei diesen inhibitorischen RNAs handelt es sich um Antisense-Nukleinsäuren oder siRNAs, welche die
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8. Jahrgang
| Nr. 2/2007
| 25
N
E
T
Z
W
E
R
K
Translation durch Bindung an die Boten-RNA
transient inhibieren. Während Antisense-Nukleinsäuren die Translation durch Anlagerung
an die mRNA stöchiometrisch blockieren,
nutzen siRNAs einen noch effektiveren zellulären Mechanismus, welcher zur katalytischen
Zerstörung mehrerer mRNA-Moleküle durch
ein einziges siRNA-Molekül führt. Dieser als
RNA-Interferenz bezeichnete Mechanismus
existiert nur in eukaryotischen Zellen.
Den Tuberkulose-Erreger im Visier
In der Abteilung für Immunologie des Berliner
Max-Planck-Instituts für Infektionsbiologie
wird die RNA-Interferenztechnologie zur
Validierung infektionsrelevanter Gene eingesetzt. Insbesondere Infektionen, die durch
schwer zugängliche intrazelluläre Erreger wie
Mycobacterium tuberculosis (MTB) verursacht
werden, stehen im Fokus des Interesses (Abb.
1). Weltweit ist ein Drittel der Gesamtbevölkerung mit diesem Erreger infiziert und für
annähernd 10% dieser Menschen besteht das
Risiko, im Verlauf ihres Lebens an Tuberkulose
zu erkranken. Eine besondere Problematik
besteht, nicht zuletzt auch im Zuge der Globalisierung, in der zunehmenden Ausbreitung schwer oder gar nicht therapierbarer
multiresistenter Erreger des MTB-Komplexes.
Diese Erreger werden auch als hypervirulente
Stämme bezeichnet.
In aufwendigen Transkriptom- und Proteomanalysen wurden globale Expressionsmuster
infizierter und naiver Mäuse sowie humaner
Zellen als auch Patientenmaterial verglichen.
Dabei wurden sowohl auf Seiten des Wirtsorganismus als auch auf Seiten des Erregers
zahlreiche Gene identifiziert, welchen potentiell eine Schlüsselrolle im Zusammenhang mit
Infektion und Infektabwehr zuzuschreiben ist.
Innerhalb des vom Berliner RNA-Netzwerk
(unterstützt durch BMBF, Berliner Senat,
ERDF, RiNA GmbH und Novartis AG) sowie
dem BMBF (PathoGenoMik-Plus-Netzwerk)
geförderten Projektes werden auf der Wirtsseite murine und humane Kandidatengene
mittels RNAi in vitro und in vivo unterdrückt
und die Folgen der Unterdrückung der Genfunktionen auf verschiedene infektionsrelevante Parameter analysiert.
siRNAs auch zur Validierung
prokaryotischer Genfunktionen
Da nur eukaryotische Zellen über den Mechanismus der RNA-Interferenz verfügen,
war das Einsatzspektrum dieser Technologie
bisher auf die Zellen und Gene der Wirtsorganismen beschränkt. In Bakterien fehlt der
Mechanismus der RNA-Interferenz oder zumindest wesentliche Komponenten, obgleich
Analoge zu den eukaryotischen ArgonautProteinen – einer wesentlichen Komponente
des RNA-induzierten Hemmkomplexes (engl.:
RNA-induced silencing complex; RISC) sowie
26 | 8. Jahrgang | Nr. 4/2007
Abb. 2: Schema der siRNA-basierten Plattform zur Mitteldurchsatz-Validierung eukaryotischer
und prokaryotischer Genfunktionen.
RISC-verwandter Komplexe1-6 – für sie beschrieben sind7. Da gerade in Mykobakterien
und insbesondere bei MTB konventionelle
Knockout-Strategien extrem zeitaufwendig
sind, haben wir nach Alternativen gesucht,
diesen Flaschenhals bei der Genvalidierung
zu überwinden. Nach Komplementierung des
prokaryotischen Repertoires mit eukaryotischen Funktionen des RNAi-Mechanismus ist
es uns gelungen, siRNAs zur spezifischen und
effizienten Abschaltung prokaryotischer Gene
einzusetzen. Die bisherigen Versuche haben
gezeigt, dass diese Technik in Gram-positiven,
Gram-negativen und in Mykobakterien funktioniert. Das Spektrum der in den Bakterien
beobachteten Gensuppression erstreckt sich
dabei vom transienten Knockdown- bis hin zu
dauerhaften stabilen Knockout-Phänotypen.
Damit eröffnen sich vielversprechende Perspektiven bezüglich der Funktionsvalidierung
prokaryotischer Gene. Gen-Knockdown/
out-Bakterien können ex vivo und in vivo für
Infektionsversuche eingesetzt werden, um auf
einfache Art und Weise infektionsrelevante
bakterielle Gene zu identifizieren. Besonders
attraktiv erscheint der Gedanke, inhibitorische
Ribonukleinsäuren als Anti-Infektiva einzusetzen oder resistente Erreger wieder für Antibiotika suszeptibel zu machen. Dieses Ziel konnte
zumindest in vitro am Beispiel multiresistenter
humanpathogener Salmonella-Spezies erreicht
werden. Damit in der Zukunft eventuell auch
in vivo antibiotisch aktive Nukleinsäuren
zum Einsatz kommen können, muss jedoch
das große Problem der Einschleusung in die
Bakterienzellen, bei intrazellulären Erregern
zusätzlich in die entsprechenden Kompartimente der Wirtszellen, gelöst werden.
sowie von Genen des Erregers, welche mit
Infektiösität, Toxizität, Replikation oder Hypervirulenz assoziiert sind (Abb. 2). Für diese
Studien verwenden wir auf der Basis selbstentwickelter Computerprogramme selektierte
siRNAs8,9, welche in vitro mit Hilfe elektrischer
Pulse (Elektroporation) in die eukaryotischen
und prokaryotischen Zielzellen eingeschleust
werden.
Abschließend ist die Erstellung eines globalen Genmusters mit definierten Funktionen
bei der Infektabwehr gegen bakterielle Krankheitserreger eines der Hauptziele. Derartige
Genmuster können die Basis bilden für:
1. den Aufbau eines Diagnosewerkzeugs zur
Früherkennung von Individuen mit erhöhter Empfänglichkeit gegenüber Infektionskrankheiten und
2. die Identifizierung von Genprodukten, die
für die Kontrolle bakterieller Infektionserreger von Bedeutung sind und damit Targets
für neue Impfstoffe, insbesondere auch
therapeutische Impfstoffe, sowie Wirkstoffe
gegen diese Erreger darstellen.
Das Erreichen dieser Ziele, die bis vor wenigen
Jahren noch in weiter Ferne zu liegen schienen,
rückt mit der Entwicklung der RNA-Interferenztechnologie nun in greifbare Nähe.
Etablierung einer siRNA-basierten
Genvalidierungsplattform
Korrespondenzadresse
Im Hinblick auf MTB-Infektionen (Erreger der
Tuberkulose) etablieren wir gegenwärtig eine
Technologieplattform zur siRNA-basierten
Mitteldurchsatz-Validierung von Wirtsgenen,
die in Zusammenhang mit der Erreger-Suszeptibilität, -Abwehr oder -Resistenz stehen
Literatur
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Patzel, V. et al., Nat. Biotechnol. 2005, 23, 1440-1444.
Köberle, C., Kaufmann, S.H.E. and Patzel, V., Nat. Protocols 1, 1832-1839.
Dr. Volker Patzel, MBA
Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie
Abteilung für Immunologie
Charitéplatz 1, D-10117 Berlin
Tel.: +49-(0)30-284 605 20
Fax: +49-(0)30-284 605 05
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B L I T Z L I C H T
DGHM 2007

RNAi-Patente und
RNAi-Lizenzen – eine kurze
Bestandsaufnahme
59. Jahrestagung der
Deutschen Gesellschaft für
Hygiene und Mikrobiologie
mit FEMS Satellitensymposium
„Life Inside Cells“
Dr. Joachim Wachenfeld, Vossius & Partner
Patent- und Rechtsanwaltspartnerschaftsgesellschaft, München
Nachdem der US-amerikanische Pharmariese Merck & Co. im vergangenen Jahr mit der
kalifornischen Firma Sirna einen der Key Player im Bereich der RNA-Interferenz (RNAi)
akquiriert hat, sind in diesem Sommer mit den Big-Pharma-Unternehmen Roche und
AstraZeneca weitere Global Player nachgezogen. Wie unlängst bekannt wurde, hat Roche
mit der von Nobelpreisträger Phil Sharp mitgegründeten Alnylam Pharmaceuticals Inc.
einen weitreichenden Lizenz- und Kooperationsvertrag geschlossen, der ein Gesamtvolumen von rund 730 Millionen Euro aufweist. Gegenstand dieses Vertrages ist unter
anderem, dass Roche das in Kulmbach beheimatete Forschungszentrum von Alnylam
übernimmt und nicht-exklusive Lizenzen am geistigen Eigentum von Alnylam erhält.
AstraZeneca hat jüngst bekannt gegeben, dass die Firma einen Vertrag im Umfang von
zunächst etwa 300 Millionen Euro mit der britischen Firma Silence Therapeutics plc unterschrieben hat, in der auch die Berliner Atugen AG aufgegangen ist. Der Vertrag sieht
vor, dass beide Firmen innerhalb der nächsten drei Jahre mit den Silence Therapeutics
eigenen Technologien neue Behandlungsverfahren gegen bis zu fünf Targets entwickeln,
die von AstraZeneca bereitgestellt werden.
LABORWELT
Der Kampf um Markanteile spiegelt sich
auch in den zunehmenden Streitigkeiten
in Patentangelegenheiten wider. Während
insbesondere die Max-Planck-Gesellschaft
(mit weitreichenden Rechten an den TuschlPatentanmeldungen/Patenten, vgl. Tab. 1,
S. 28-29), das Carnegie Institute of Washington, Alnylam, ISIS, Benitec, Silence
und Merck/Sirna Anmeldungen für Basistechnologien halten, für die zum Teil bereits
Patente erteilt wurden, sind nicht für all
diese Schutzrechte Lizenzen erhältlich.
Tagungspräsident
Prof. Dr. med. Ingo B. Autenrieth
(Tübingen)
Kongressthema
Medizinische Mikrobiologie, Hygiene
und Infektionsepidemiologie:
Wissenschaftliche Grundlagen und
Klinische Perspektiven
Schwerpunkte
Grundlagen- und Klinische Forschung
in den Bereichen Mikrobiologie,
Hygiene und Infektiologie
• Prävention und Epidemiologie
• Molekulare Schnelldiagnostik,
Neue diagnostische Methoden
• Anaerobier und Kommensale
• Nosokomiale Infektionen
• Management multiresistenter Erreger
• Neue Antibiotika
Zwischenzeitlich sind Einspruchsverfahren gegen die von Alnylam gehaltene
Patentfamilie (die sogenannten „Kreutzer/
Limmer“-Patente) vor dem Europäischen
Patentamt anhängig gemacht worden. Das
erstinstanzliche Einspruchsverfahren gegen
das Stammpatent wurde bereits beendet und
das Patent in beschränktem Umfang aufrechterhalten. Das Patent schützt nun unter
anderem in vitro-Verfahren und Medikamente
zur Hemmung der Expression von Genen in
Säugerzellen, wobei doppelsträngige RNAs
(dsRNAs) eingesetzt werden, die aus 15 bis
21 bp bestehen und durch eine chemische
Kennziffer 21 LW 04 · www.biocom.de
Göttingen
• Pneumonie und Mukoviszidose
Wichtige Schutzrechte im Bereich
der RNA-Technologien

Die Entwicklungen belegen, welcher Stellenwert der RNAi-Technologie mittlerweile
beigemessen wird. Es steht zu erwarten,
dass weitere Akquisitionen getätigt oder
weitreichende Lizenzvereinbarungen getroffen werden, in deren Zuge insbesondere
größere Arzneimittelhersteller versuchen
werden, sich ihren Anteil an dieser zukunftsweisenden Technologie zu sichern.
Gestützt werden derartige Erwartungen
unter anderem etwa dadurch, dass die
RNA-Interferenz-Technologie das Feld der
reinen Grundlagenforschung inzwischen
verlassen hat und einige Produkte in klinischen Studien erprobt werden. So testet
Alnylam einen siRNA-Wirkstoffkandidaten
(ALN-RSV01, der die Bildung des viralen
Nucleocapsid-Proteins verhindert) gegen
Infektionen mit dem Respiratory-Syncytial-Virus (RSV) in der klinischen Phase
I, Sirna/Merck testen – ebenfalls in der
klinischen Phase I – ein Medikament (Sirna027, ein chemisch modifizierter siRNAWirkstoff gegen das Angiogeneseprotein
VEGF) zur Behandlung der Altersabhängigen Makula-Degeneration (AMD) und
die frühere Acuity Pharmaceuticals (jetzt
Opko Health Inc.) rekrutiert seit Mitte Juli
Patienten für eine Phase III-Studie ihres
siRNA-basierten Medikamentenkandidaten
Bevasiranib sodium (früher Cand 5, der die
Proteinproduktion von VEGF inhibiert) zur
Behandlung von AMD.
30. September bis 4. Oktober 2007
Einladung
Recht
• Bakterielle Zellhülle
• Zelluläre Mikrobiologie
• Infektionsimmunologie
• DFG-Schwerpunktprogramm
„Infektionen des Endothels“
• FEMS-Symposium und DFG-Schwerpunktprogramm „Life Inside Cells“:
– Endosymbionts and organelles
– Intracellular parasitism
– Invasion and transport
– Life within the cytosol and vacuoles
Anmeldung und Programm unter
www.dghm2007.de
8. Jahrgang | Nr. 4/2007 | 27
B L I T Z L I C H T
Verknüpfung stabilisiert sind. Gegen die
erstinstanzliche Entscheidung hatten Sirna
und Atugen Beschwerde eingelegt. Die
Entscheidung der Beschwerdekammer
wird nach dem Kenntnisstand des Autors
die erste zu einem Grundlagenpatent der
RNAi-Technologie sein und ist frühestens
im nächsten Jahr zu erwarten.
Tabelle 1 gibt eine Übersicht über wichtige
Patentanmeldungen/Patente im Bereich
RNA-Interferenz, deren Eigner und eine
Zusammenfassung des durch das jeweilige
Schutzrecht beanspruchten Gegenstandes1.
Tab. 1: Status ausgewählter siRNA-Patente
Erfinder
Inhaber/Anmelder
Fire et al.
Carnegie Inst. of Washington
Carnegie Inst. of Washington;
Univ. of Massachusetts
28 | 8. Jahrgang | Nr. 4/2007
Status
US 6,506,559
US2003051263 A1
US2003055020 A1
US2003056235 A1
EP1042462 A1
erteilt, Januar 2004
noch nicht erteilt
noch nicht erteilt
noch nicht erteilt
noch nicht erteilt
Tuschl (I)
Univ. of Massachusetts Medical
School; MIT; Whitehead Inst.;
Max-Planck-Ges.
US20020086356 A1
EP1309726 A2
noch nicht erteilt
noch nicht erteilt
Tuschl (II)
Max-Planck-Ges.
US 7,056,704
US 7,078,196
EP1407044 A1
erteilt, Juni 2006
erteilt, Juli 2006
kurz vor Erteilung
Crooke, Stanley T.
Isis Pharmaceuticals, Inc.
US 5,898,031
EP0928290 B1
erteilt, April 1999
erteilt, März 2005
Crooke, Stanley T.
Isis Pharmaceuticals, Inc.
US 6,107,094
erteilt, August 2000
Graham, Michael
Wayne
Benitec Australia, Ltd.
US 6,573,099
EP1555317 A1
EP1624060 A2
erteilt, Juni 2003
noch nicht erteilt
noch nicht erteilt
Kreutzer/Limmer
Alnylam Europe AG
EP1144623 B9
erteilt, August 2002,
Einspruchsbeschwerdeverfahren anhängig
EP1550719 A1
(Teilanmeldung)
EP1798285 A1
(Teilanmeldung)
noch nicht erteilt
Ist Forschung mit patentgeschützen
siRNAs nach dem Forschungsprivileg
freigestellt?
In Deutschland ansässige und mit RNAi
befasste Forschergruppen, die sich die Frage
stellen, ob sie sich um eine Lizenz an diesen
Schutzrechten bemühen sollten, sollten folgendes beachten: Versuche, die sich auf den
patentierten Gegenstand beziehen, beispielsweise eine Weiterentwicklung der RNAiTechnologie zum Ziel haben, unterliegen
gemäß §11 Absatz 2 des Patentgesetzes nicht
dem Patentschutz und zwar auch dann nicht,
wenn hinter diesen Versuchen letztendlich
gewerbliche Interessen stehen. Dies trifft auch
auf Versuche zu, mit denen herausgefunden
werden soll, ob die patentierte Lehre überhaupt wie beschrieben funktioniert.
Dagegen ist der Einsatz eines gebrauchsfertigen RNAi-Tools, beispielsweise zur
Entwicklung von Arzneimitteln, nicht
freigestellt. Mit anderen Worten sind sogenannte research tools patentgeschützt, und
deren nicht autorisierte Verwendung im
Labor kann eine Patentverletzung darstellen. Dies gilt insbesondere dann, wenn die
im Patent beschriebene und beanspruchte
Lehre als gegeben hingenommen oder vorausgesetzt wird. In solchen Fällen beziehen
sich die Versuche nämlich nicht auf den
beanspruchten Gegenstand, sondern mit
der patentgeschützten Lehre wird versucht,
anderweitige Erkenntnisse zur erlangen.
Ob ein Experiment dem Versuchsprivileg
unterliegt oder eine Patentverletzung darstellt, ist manchmal schwierig einzuschätzen
und muss daher anhand des Einzelfalles
entschieden werden2.
Wenn ein research tool allerdings von
einem Laboranbieter gekauft wird, der über
die notwendigen Lizenzen verfügt, so darf
der Forscher das Produkt auch bestimmungsgemäß verwenden. Das Patentrecht ist dann
insoweit erschöpft, beziehungsweise der
Erwerber hat ein implizites Nutzungsrecht
bezüglich der vom Berechtigten erworbenen
Substanzen gekauft. Selbst herstellen darf der
Forscher die siRNA dann allerdings nicht. Geachtet werden sollte auch darauf, ob gemäß
dem Beipackzettel bestimmte Verwendungen
der siRNAs nicht unter die Lizenz fallen
Veröffentlichungsnummer
noch nicht erteilt
Kreutzer/Limmer
Alnylam Europe AG
EP1214945 B1
(hervorgegangen
aus einer Teilanmeldung)
erteilt, Juni 2005,
Einspruchsverfahren
anhängig
Plaetinck et al.
Devgen NV
EP1197567 A2
EP1093526 A2
noch nicht erteilt
gilt als zurückgenommen
Beach et al.
Cold Spring Harbour Lab.; Genetica, Inc.
US20040086884 A1
noch nicht erteilt
Caldwell et al.
IRM, LLC
US20030170642 A1
noch nicht erteilt
Giese et al.
Atugen AG/Silence Therapeutics
EP1527176 B1
erteilt, Januar 2007
McSwiggen et al.
Sirna Therapeutics, Inc./
Merck&Co, Inc.
EP1458741 A2
noch nicht erteilt
und damit eine Patentverletzung darstellen
würden.
Sowohl das Europäische Patentamt (EPA)
wie auch sein US-Pendant, das USPTO,
haben noch in der jüngeren Vergangenheit
breitere Patente im Bereich der RNAi-Technologie erteilt (z.B. EP-B1 1 482 975, US B1
6,506,559). Während dies für bahnbrechende
Weiterentwicklungen auch in Zukunft der
Fall sein dürfte, werden für das Gros der
LABORWELT
B L I T Z L I C H T
Schutzbereich
Das erteilte US-Patent bezieht sich auf Verfahren zur Inhibierung der Expression eines Zielgens
durch komplementäre dsRNA, wobei das Verfahren entweder in vitro durchgeführt oder in einem
Invertebraten eingesetzt wird.
Diese Anmeldungen beziehen sich auf RNA mit 21 bis 23 bp Länge, die RNA-Interferenz vermittelt,
Verfahren zu deren Herstellung sowie Verfahren zum Vermitteln von RNA-Interferenz.
Die erteilten US-Patente beziehen sich auf Verfahren zur Herstellung von dsRNA-Molekülen, die die
Spaltung einer mRNA (in einer Säugerzelle) vermitteln, wobei die beiden Stränge eine Länge von 19
bis 25 Nukleotiden aufweisen. Es muss mindestens einer der Stränge einen 3’-Überhang von 1 bis 5
Nukleotiden aufweisen. Die Anmeldung beim EPA steht kurz vor der Erteilung und beansprucht dsRNAMoleküle, wobei die Stränge eine Länge von 19 bis 23 Nukleotiden und mindestens einen 3’-Überhang
von 1 bis 3 Nukleotiden aufweist.
Die erteilten Patente beziehen sich auf zu Zielgenen komplementäre RNA-Derivate mit optimierter
Bindungsaffinität zum RNA-Target. Die chemischen Bindungen zwischen den Nukleosid-Untereinheiten weisen erhöhte Stabilität im Vergleich zu Phosphodiesterbindungen auf.
Das Patent bezieht sich auf Phosphorothioat-modifizierte RNAi-Konstrukte.
Das erteilte US-Patent bezieht sich auf genetische Konstrukte unter der Kontrolle eines Promoters. Expression der Konstrukte reduziert die Expression eines Zielgens in Tierzellen. Ebenfalls
beansprucht sind damit transfizierte Zellen sowie Verfahren zur Reduktion der Expression eines
Zielgens.
Das in eingeschränkter Form aufrechterhaltende europäische Patent bezieht sich auf in vitro-Verfahren und Medikamente zur Hemmung der Expression von Genen in Säugerzellen, wobei dsRNAs eingesetzt werden, die aus 15 bis 21 bp bestehen und durch chemische Verknüpfungen stabilisiert sind.
In vitro-Verfahren zur Hemmung der Expression eines Zielgens durch 15 bis 49 bp lange dsRNA-Moleküle in Säugetierzellen, weiterhin Medikamente diese dsRNA enthaltend, sowie Verwendungen der
dsRNA zur Herstellung eine Medikamentes
Die europäische Patentanmeldung bezieht sich auf ein reverse-genetics-Verfahren zur Identifizierung
von DNA-Sequenzen, die verantwortlich für einen spezifischen Phänotyp sind. Diese DNA-Sequenzen
exprimieren dsRNAs. Ebenfalls beansprucht sind Verfahren zur Herstellung transgener Tiere und Verfahren zur Verringerung des Befalls von Pflanzen durch Krankheiten.
Die US-Anmeldung bezieht sich auf ein Verfahren zur Verringerung der Expression eines Zielgens
durch dsRNA, die an untranslatierte Bereiche des Zielgens hybridisiert, Zusammensetzungen derselben Wirkung, Verfahren zur Herstellung von siRNAs, transgene Tiere und shRNAs.
Die US-Anmeldung bezieht sich auf ein Verfahren zur Identifizierung der Funktion von endogenen Genen, wobei bevorzugt RNAi-vermittelnde Moleküle eingesetzt werden.
Das erteilte europäische Patent bezieht sich auf zu Target-DNA-Molekülen komplementäre dsRNAMoleküle, welche sowohl 2’-modifizierte als auch nicht- oder anders modifizierte Nukleotide enthalten. Ebenfalls beansprucht werden Medikamente, Zellen, Organismen und Zusammensetzungen
diese dsRNA enthaltend, sowie Verwendungen der dsRNA zur Herstellung eines Medikamentes als
auch eine in vitro-Methode zur Inhibierung der Zielgenexpression durch dsRNA-Moleküle.
Die europäische Patentanmeldung bezieht sich auf 18 bis 24 bp lange dsRNA-Moleküle, welche
2’-Modifikationen und Phosphorothioat-Bindungen aufweisen und damit eine verbesserte RNAInterferenz vermitteln sollen.
Anmelder folgende Richtlinien zu beachten
sein: Das EPA wird die Patentfähigkeit für
siRNAs anhand von Richtlinien prüfen, die
für die antisense-Technologie entwickelt
wurden: Falls die Target-Nukleinsäure an
LABORWELT
sich neu und erfinderisch ist, wird wohl auch
ein generischer Anspruch auf siRNAs erteilt
werden. Voraussetzung ist, dass das Target im
Anspruch hinreichend durch einen SequenzIdentifier gekennzeichnet ist.
Falls das Target bereits bekannt ist, werden
generische Ansprüche auf siRNAs nicht erfinderisch sein. Bestand jedoch ein Vorurteil
dahingehend, dass funktionelle siRNAs gegen die Target-Sequenz oder eine Teilsequenz
davon nicht herstellbar waren, wird davon
ausgegangen, dass es hierfür strukturelle
Ursachen gibt. Ursächliche Merkmale zur
Überwindung des Vorurteils sind in den
Ansprüchen dann anzugeben.
Beschreibt der Stand der Technik bereits generische siRNAs gegen ein bekanntes Target,
werden allenfalls spezifische und durch eine
konkrete Sequenz gekennzeichnete siRNAs
patentfähig sein – und auch nur dann, wenn
ihnen ein überraschender technischer Effekt
innewohnt. Das USPTO verlangt in aller
Regel experimentelle Daten in der Anmeldung, gewährt dann aber Patente, sofern
konkrete Sequenzen im Anspruch genannt
sind. Voraussetzung ist auch hier, dass Neuheit und erfinderische Tätigkeit belegt sind,
was für konkret beanspruchte Sequenzen
aber in der Regel einfacher ist als beim EPA.
Bedeckt zeigt sich das USPTO zur Zeit, wenn
Behandlungsverfahren oder Arzneimittel
beansprucht sind und die Anmeldung keine
Belege in Form von in vivo-Daten enthält.
Der Grund hierfür ist, dass die verfügbaren
Verabreichungssysteme (delivery tools) nach
Ansicht des USPTO unzureichend sind, um
einen Behandlungserfolg zu gewährleisten.
Diese Haltung des USPTO ist auch einer
der Ursachen, warum auf die Anmeldung
Tuschl I (s. Tabelle) bislang noch kein Patent
erteilt wurde. Hier ist davon auszugehen,
dass Weiterentwicklungen im Bereich der
Verabreichungssysteme Fortschritte erbringen werden.3
Danksagung
Mein Dank gilt Dr. Andreas Robinson für seine Unterstützung bei der Zusammenstellung
der Tabelle sowie Dr. Johann Wirsing für die
Bereitstellung von Informationen
Referenzen
[1]
[2]
[3]
sh. auch Schmidt, “Negotiating the RNAi patent thicket”, Nature Biotechnology 25(3) 2007, 273-275
Holzapfel, “Die patentrechtliche Zulässigkeit der Benutzung von
Forschungwerkzeugen” GRUR 2006, 10-17
weiterführende Literatur: Hemmings, “Patenting RNA Interference
under European and US Patent Law: Considerations for an Emerging
Biotechnology” MAS-IP Diplomarbeit, ETH Zürich 2007
Korrespondenzadresse
Dr. Joachim Wachenfeld
Vossius & Partner
Patent- und RechtsanwaltspartnerschaftsGesellschaft
Siebertstraße 4, 81675 München
Tel.: +49-(0)89-413 04-0
Fax: +49-(0)89-413 04-111
eMail: [email protected]
8. Jahrgang | Nr. 4/2007 | 29
B L I T Z L I C H T
siRNA
Test, um den interessierenden Phänotyp
nachzuweisen.

Zuverlässige Kontrollen für
erfolgreiche RNAi-Experimente
Eric Lader, Elizabeth Scanlan, QIAGEN Sciences, Germantown (MD, USA);
Bettina Hädrich, QIAGEN GmbH, Hilden
Die RNA-Interferenz (RNAi) ist ein biologischer Prozess, bei dem die Expression eines Zielgens
spezifisch abgeschaltet wird. RNAi wird über kurze interferierende RNAs (sog. siRNAs) –
doppelsträngige RNA-Moleküle mit einer Länge von 19 Nukleotiden und überhängenden Enden
aus zwei Nukleotiden – vermittelt. Synthetische siRNAs lassen sich durch Transfektion in Zellen
einbringen, wo sie in einen Multiprotein-Komplex, den RNA-induzierten Silencing-Komplex
(RISC) inkorporiert werden. Einer der siRNA-Stränge bleibt an RISC gebunden und bindet komplementäre mRNA, die anschließend abgebaut wird, so dass die Expression des zugehörigen
Gens posttranslational gehemmt wird.
Die RNAi-Methode ist zu einem weitverbreiteten experimentellen Hilfsmittel geworden. Das Ausschalten (Knock-down) eines
einzelnen Gens oder kleiner Gruppen von
Genen erleichtert die Funktionsanalyse von
Genen und die Analyse zellulärer Signal- und
Stoffwechselwege erheblich. Darüber hinaus
können mit Hilfe von Hochdurchsatz-RNAi-
Experimenten komplette Genome mit unterschiedlichsten Zielsetzungen gescreent werden, so etwa um Arzneimittel-Zielmoleküle
(Targets) zu identifizieren. Typischerweise
besteht ein RNAi-Experiment aus dem Knockdown eines Zielgens durch Transfektion der
Zellen mit komplementärer synthetischer
siRNA und dem anschließenden Screening-
Tab.: Überblick über die möglichen RNAi-Kontrollexperimente
Art der Kontrolle
Merkmal
Positivkontrolle
validierte siRNAs , die spezifisch für konstitutive Gene (auch
„Haushaltsgene“ genannt) sind,
z.B. MAPK1, oder für Gene, deren
Knock-down den zu untersuchenden Phänotyp bewirkt
Überprüfung der optimalen
experimentellen Bedingungen
Negativkontrolle
nicht interferierende siRNAs ohne
Homologie zu einem Gen des
untersuchten Organismus;
siRNA-Moleküle, die nur minimale unspezifische Auswirkungen
auf Expression und Phänotyp
haben
Test auf sequenzunabhängige,
unspezifische Effekte und Messung von Expression/Phänotyp bei
Abwesenheit von genspezifischer
siRNA
Transfektionseffizienz
fluoreszenzmarkierte siRNA /
Validierte siRNAs
Messung der Transfektionseffizienz durch Zählung der fluoreszierenden Zellen. Quantitative
Analysen mit Hilfe von validierten
siRNAs und Analyse der Knockdown-Rate über qRT-PCR
Nicht transfizierte Zellen
Zellen, bei denen keine Transfektion durchgeführt wird
Messung der basalen Expressionsrate/Phänotypausprägung
Scheintransfizierte Zellen
(Mock-transfection)
Zellen, die die Transfektionsprozedur ohne zugegebene siRNA
durchlaufen
Test auf unspezifische Effekte, die
durch den Transfektionsprozess
verursacht werden
Redundanzexperiment
Bestätigung positiver Hits durch
die Transfektion mit mehreren
siRNAs, die gegen verschiedene
Abschnitte derselben mRNA gerichtet sind
Ausschluss sequenzspezifischer
Off-Target-Effekte aufgrund von
Bindung an Nicht-Zielsequenzen
30 | 8. Jahrgang | Nr. 4/2007
Zweck
1
Die Notwendigkeit der Kontrollen
Ohne adäquate Kontrollen ist die richtige
Interpretation der Analyseergebnisse unmöglich. Sie sind insbesondere bei Hochdurchsatz-Experimenten, bei denen große
Datenmengen anfallen und zu beurteilen
sind, von kritischer Bedeutung. Das Mitführen von Kontrollen dient mehreren Zwekken: dem Bestimmen und Sicherstellen des
optimalen Versuchsansatzes, Überwachen
der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse und
Ausschließen von Effekten aufgrund von
unspezifischer Bindung oder Bindung an
Nicht-Zielsequenzen. Schließlich stellen die
Kontrollen auch sicher, dass positive und
negative Ergebnisse korrekt identifiziert
werden. Dieser Artikel gibt einen Überblick
über die möglichen Typen von RNAi-Kontrollexperimenten (Tabelle).
Positivkontrollen
Eine Positivkontroll-siRNA führt zu einer
hohen Knock-down-Rate des betreffenden
Zielgens und sollte bei jedem Experiment
mittransfiziert werden. Eine deutlich geringere
als die zu erwartende Knock-down-Rate deutet auf ein Problem beim Versuchansatz hin.
Als Positivkontrollen werden häufig siRNAs
verwendet, die spezifisch für ubiquitäre,
mit hoher Rate exprimierte Gene zellulärer
Grundfunktionen („Haushaltsgene“) sind, wie
zum Beispiel MAPK1. Alternativ kann eine
siRNA, die ein Zielgen abschaltet, das für den
untersuchten Phänotyp codiert, als Kontrolle
Versuchsansatz und Transfektionsprotokoll
dienen. Als Ausgangspunkt für die Auswahl
der geeigneten Positivkontrolle dient eine
Vielzahl Funktions-validierter siRNAs, deren
Knock-down-Effizienz bereits über quantitative
Real-Time PCR verifiziert ist1.
Negativkontrollen
Als Negativkontrollen werden nicht interferierende siRNAs verwendet, die keine Homologie
zu einem der Gene des untersuchten Organismus aufweisen. Auch ein Transfektionsansatz
mit Negativkontroll-siRNA sollte in jedem Experiment mitgeführt werden. Ein Vergleich der
Ergebnisse der Negativkontrollen mit denen,
die bei der Transfektion der Zellen mit genspezifischer siRNA erhalten wurden, erleichtert
die Identifizierung positiver Ergebnisse (auch
„Hits“ genannt). Ein Vergleich mit den Versuchsergebnissen mit nicht transfizierten Zellen
gibt zudem Hinweise darauf, ob durch den
Versuchsablauf allein unspezifische Veränderungen der Genexpression oder des Phänotyps
verursacht werden. Dabei muss auch ausgeschlossen werden, dass die nicht interferierende
siRNA selbst einen solch unspezifischen Effekt
LABORWELT
B L I T Z L I C H T
12,5
Anteil regulierter Gene (%)
10,0
7,5
5,0
2,5
0
Ko
n
Ko tro
n lle
Ko tro 1
n lle
Ko tro 2
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10
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8
lS
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Ko ars
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ro
lle
10
auslöst. Die Negativkontroll-siRNA sollte daher
validiert sein, um sicherzustellen, dass sie den
Basislevel der Genexpression und des zellulären Phänotyps widerspiegelt.
Zur Lösung des Problems, eine möglichst
„saubere“, nicht interferierende KontrollsiRNA auszuwählen, hat Qiagen umfangreiche Testreihen mit zahlreichen nicht
interferierenden siRNAs durchgeführt. Dabei
wurde eine siRNA gefunden – die AllStars
Negative Control siRNA–, die nur minimale
unspezifische Effekte zeigt. Zu den durchgeführten Experimenten gehörten u.a. die
Erstellung genomweiter Expressionsprofile,
Phänotyp-Analysen und die RISC-Inkorporationsanalyse.
Bei der Erstellung genomweiter Expressionsprofile mithilfe von Affymetrix® GeneChip® Arrays wurde das Ausmaß unspezifischer Effekte auf die Genexpression in
verschiedenen Zelltypen nach Transfektion
mit zahlreichen Negativkontroll-siRNAs
unterschiedlicher Herkunft untersucht.
Dabei wurde mit AllStars Negative Control
siRNA stets die geringste Anzahl unspezifisch
regulierter Gene erhalten, während andere
Negativkontroll-siRNAs zu einer unspezifischen Regulierung vieler Gene führten, die
eine wichtige Rolle bei zellulären Signal- oder
Stoffwechselwegen spielen.
Interferon-Signalweg
Zellzyklus-Gene
Apoptose-Signalweg
JAK-Stat-Signalweg
Abb. 1: Mehrere Negativkontroll-siRNAs (Kontrolle 1 bis Kontrolle 10) wurden in MCF-7-Zellen
transfiziert (3 Ansätze pro Kontrolle). Die genomweite Expressionsanalyse wurde mit Hilfe von
Affymetrix GeneChip Arrays (Human Genome U133 Set) durchgeführt. AllStars Negative ControlsiRNA führte jeweils zur geringsten Anzahl regulierter Gene (siehe Pfeile).
Die Phänotyp-Analyse umfasste Untersuchungen der Größe des Zellkerns, Proliferationsrate, DNA-Syntheserate, Verteilung der
Zellzyklusstadien und zytotoxischer Effekte
(Daten siehe: www.qiagen.com/AllStars). Bei
all diesen Experimenten wurden mit AllStars
Negative Control siRNA ähnliche Ergebnisse
erhalten wie bei nicht transfizierten Zellen.
Die RISC-Inkorporationsanalyse ergab,
dass AllStars Negative Control siRNA in
RISC eingebaut wird, das heißt, sie durchläuft denselben biologischen Prozess wie
die genspezifische siRNA. Das bedeutet: Die
mit der genspezifischen siRNA erhaltenen
Daten können mit denen der Negativkontroll-siRNA-Experimente verglichen werden.
Dadurch sind zuverlässige Aussagen über
Effekte möglich, die tatsächlich auf einen
Knock-down des Zielgens zurückzuführen
sind, und Artefakte und unspezifische Effekte
können ausgeschlossen werden.
Für die RISC-Inkorporationsanalyse wurde
ein Konstrukt aus einem Reportergen und einer synthetischen siRNA-Zielsequenz erzeugt,
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LABORWELT
8. Jahrgang | Nr. 4/2007 | 31
B L I T Z L I C H T
A
können eingesetzt werden, um zu testen, ob
allein durch die Transfektionsprozedur ungewünschte zytotoxische oder unspezifische
Effekte ausgelöst werden.
Bestätigung positiver Ergebnisse
Für den Erfolg von RNAi-Experimenten ist es
von kritischer Bedeutung, dass falsch-positive
Ergebnisse aufgrund von Effekten, die durch
Bindung an Nicht-Zielsequenzen ausgelöst
werden, ausgeschlossen werden können.
Nicht-zielspezifische Effekte sind nachweisbare Effekte, die aus unbeabsichtigten Wechselwirkungen der siRNA resultieren oder allein
durch den siRNA-Transfektionsprozess verursacht werden. Sie haben ihre Ursache darin,
dass die siRNA eine mRNA erkennt, die eine
hohe Homologie zur Ziel-mRNA-Sequenz
aufweist, oder dass siRNA-Moleküle die
Funktion von microRNA übernehmen. Nach
Feststellen eines Phänotyps sollten Redundanzexperimente durchgeführt werden, um derartige nicht-zielspezifische Effekte auszuschließen2,3. Bei Redundanzexperimenten werden
mehrere siRNAs eingesetzt, die spezifisch
für unterschiedliche Ziel-mRNA-Sequenzen
sind. Die Wahrscheinlichkeit, dass mehrere
verschiedene siRNAs, die unterschiedliche
Sequenzabschnitte desselben Gens erkennen,
denselben Phänotyp ergeben, ist sehr niedrig.
Redundanzexperimente sind daher ein einfacher und überzeugender Nachweis für die
Spezifität der siRNA.
B
Zusammenfassung
Abb. 2: A. Das Reportergen-Konstrukt besteht aus einer synthetischen Zielsequenz, die komplementär zu AllStars Negative Control siRNA ist und die mit einem Reportergen für ein fluoreszierendes Protein mit His-Markierung fusioniert ist. B. HeLa- und MCF-7-Zellen wurden mit dem Reportergen-Konstrukt und entweder einer nicht komplementären siRNA oder der AllStars Negative
Control siRNA ko-transfiziert. Nach 24 Stunden wurde die Expression des Fluoreszenz-Reportergens durch FACS®-Analyse gemessen. Nach Ko-Transfektion mit AllStars Negative Control-siRNA
war die Fluoreszenz signifikant niedriger – ein Zeichen für das Abschalten des Reportergens.
die komplementär zur AllStars Negative
Control siRNA ist (Abb. 2A). Wurde dieses
Konstrukt zusammen mit AllStars Negative
Control siRNA kotransfiziert, wurde durch
die siRNA die Expression ihrer komplementären Sequenz abgeschaltet, was zum Abbau
des gesamten mRNA-Transkripts führte.
Das heißt, damit es zum Knock-down – gemessen als Abnahme der Fluoreszenz (siehe
Abbildung 2B) und Ausbleiben des von der
His-Markierung erzeugten Signals – kommt,
muss die AllStars Negative Control siRNA
in RISC eingebaut worden sein (Daten siehe:
www.qiagen.com/AllStars).
Transfektionskontrollen
Bei der Etablierung der RNAi oder bei Verwendung einer neuen Zelllinie ist es notwendig,
zahlreiche Transfektionen unter verschiedenen
32 | 8. Jahrgang | Nr. 4/2007
Bedingungen durchzuführen, um die optimalen Reaktionsbedingungen für eine maximale
Transfektionseffizienz zu erhalten. Der erste
Schritt dieser Optimierungsexperimente kann
beispielsweise mit fluoreszenzmarkierten
siRNAs durchgeführt werden. Die Transfektionsbedingungen, die zu den höchsten
Prozentsätzen fluoreszierender Zellen führen,
sollten in den nachfolgenden Experimenten
beibehalten werden. Allerdings wird empfohlen, bei weiteren Schritten in der Optimierung, eine validierte siRNA zu transfizieren,
die gegen ein einfach zu analysierendes Gen
gerichtet ist, und Analysemethoden wie die
qRT-PCR einzusetzen, die eine quantitative
Auswertung der Ergebnisse ermöglichen.
Es sollten auch nicht transfizierte Zellen analysiert werden, um die Basis-Genexpression
und den normalen Phänotyp zu bestimmen.
Scheintransfizierte Zellen (mock transfections)
Die RNA-Interferenz (RNAi) ist ein leistungsstarker experimenteller Ansatz für die
Forschung. Um zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse sicherzustellen, müssen die
Experimente sorgfältig etabliert und die Versuchsansätze mit entsprechenden Kontrollen
überprüft werden. Wir haben einige wichtige
Kontrollexperimente beschrieben, die dabei in
Erwägung gezogen werden sollten.
Gerade bei RNAi-Screening-Experimenten
sind die Auswahl und der Einsatz der richtigen Kontrollen von entscheidender Bedeutung. Weitere Informationen zum Thema
sind über das High-Throughput RNAi User
Forum erhältlich, das von Qiagen koordiniert
und von einem Expertengremium betreut
wird. Diese Informationsquelle steht unter
www.qiagen.com/HTRNAi zur Verfügung.
Literatur
[1]
[2]
[3]
Krueger, U. et al. (2007) Insights into effective RNAi gained from large scale
siRNA validation screening. Oligonucleotides 17: 237.
Echeverri, C.J. et al. (2006) Minimizing the risk of reporting false positives in
large-scale RNAi screens. Nat. Methods. 3, 777.
Echeverri, C.J. and Perrimon, N. (2006) High-throughput RNAi screening in
cultured cells: a user’s guide. Nature Reviews Genetics 7, 373.
Kontakt
eMail: [email protected]
LABORWELT
W I S S E N S C H A F T
Xenotransplantation

Hemmung porciner
endogener Retroviren in
primären porcinen Zellen
Dipl.-Biol. Britta Dieckhoff, Dr. Joachim Denner, Robert Koch-Institut, Berlin
Die Transplantation porciner Organe in den Menschen ist mit dem Risiko der Übertragung
porciner endogener Retroviren (PERV) verbunden, die sich nicht durch Zucht unter spezifisch Pathogen-freien (specific pathogen free, SPF) Bedingungen eliminieren lassen, da sie
ein integrierter Bestandteil des porcinen Genoms sind. Eine vielversprechende Strategie
zur Gewinnung virussicherer Xenotransplantate stellt die RNA-Interferenz (RNAi) dar. So
konnte mit Hilfe der RNAi die PERV-Expression in primären porcinen Fibroblasten um bis
zu 95% gehemmt werden.
Key Words: RNAi, lentivirale Vektoren, PERV, Xenotransplantation
Die Übertragung von lebens- und funktionsfähigen Zellen, Geweben und Organen
zwischen verschiedenen Spezies (Xenotransplantation) eröffnet eine Möglichkeit, dem
zunehmenden Mangel an humanen Spenderorganen zu begegnen. Als Spendertier für
die Xenotransplantation wird momentan aus
zahlreichen Gründen das Schwein (Sus scrofa
f. domestica) favorisiert. Dazu zählen anatomische und physiologische Ähnlichkeiten,
die einfache Zucht sowie die Möglichkeit
der Haltung unter SPF-Bedingungen. Bis
dieser Ansatz jedoch eine klinische Anwendung finden kann, gilt es, noch zahlreiche
Hürden zu überwinden. Hierbei ist neben
immunologischen Problemen (wie die hyperakute Abstoßung des Transplantates)
und physiologischen Problemen (etwa die
Hormoninkompatibilität) die potentielle
Übertragung porciner Pathogene – insbe-
sondere der porcinen endogenen Retroviren
(PERV) – von zentraler Bedeutung.
PERV sind mit jeweils bis zu 100 Kopien in
das Genom aller Schweine integriert1,2 und
werden von Schweinezellen als infektiöse Partikel freigesetzt3,4. Sie werden der Familie der
γ-Retroviren zugeordnet. Zahlreiche Vertreter dieser Familie sind in der Lage, Tumore
und Immundefizienzen zu induzieren. Es
sind drei PERV-Subtypen bekannt (PERVA, -B und -C), von denen PERV-A und -B
humane Zellen in vitro infizieren können5-7.
Zwar konnte bisher weder in Transplantations- und Infektionsstudien mit Kleintieren
sowie nicht-humanen Primaten noch in
ersten klinischen Xenotransplantationen
eine Übertragung porciner endogener Retroviren beobachtet werden. In Anbetracht
der besonderen Situation bei einer Xenotransplatation – Exposition der porcinen
Organe im humanen Rezipienten bei starker
Immunsuppression über mehrere Jahre – ist
das Risiko einer PERV-Übertragung jedoch
nicht auszuschließen.
Daher gilt es, Strategien zur Minimierung
des PERV-Übertragungsrisikos zu entwikkeln. Einen vielversprechenden Ansatz
stellt hierbei die Hemmung der PERV-Expression durch RNA-Interferenz (RNAi)
dar – die post-transkriptionelle Hemmung
von Genen, basierend auf einer durch kurze
doppelsträngige RNA-Moleküle induzierten
Sequenz-spezifischen Degradierung von
mRNA. Dieses Phänomen, das vermutlich
einen der ältesten Abwehrmechanismen gegen virale Infektionen darstellt, wurde unter
dem Namen RNAi erstmals beim Nematoden Caenorrhabditis elegans beschrieben8.
Es ist jedoch, wie andere Arbeiten zeigten,
hochkonserviert in Pflanzen, Fliegen, Würmern und Säugetieren9.
Hemmung der PERV-Expression
in vitro
In einer früheren Publikation der Arbeitsgruppe10 wurden bereits zahlreiche synthetische, PERV-spezifische siRNAs hinsichtlich
ihrer Fähigkeit untersucht, die PERV-Expression in humanen PERV-infizierten Zellen zu
hemmen. Die effizienteste siRNA entsprach
einer hochkonservierten Sequenz im viralen
pol-Gen (pol2), das die viralen Enzyme Polymerase, Reverse Transkriptase und Integrase
kodiert. Da die Unterscheidung der PERVSubtypen ausschließlich auf Unterschieden
des viralen, die Hüllproteine kodierenden
env-Gens beruht, ist die Ziel-RNA-Sequenz
in allen funktionellen PERV-Subtypen identisch und die siRNA somit in der Lage, die
Expression aller drei Subtypen zu hemmen.
Zur stabilen Inhibition der PERV-Expression
erfolgte die Expression der effizienten pol2Sequenz als short hairpin-RNA (shRNA)
unter Verwendung eines Polymerase IIIVektorsystems (pSuper)10.
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�����
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���
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��
���
����
Abb. 1: Schematische Darstellung des lentiviralen Vektors pLVTHM.
LTR: long terminal repeat, H1: Polymerase III H1-RNA Genpromotor. shRNA: short hairpin RNA, SIN: self-inactivating element, cPPT: zentraler
Polypurintrakt, GFP: green fluorescent protein, WPRE: post-transkriptionales Element des Woodchuck Hepatitis-Virus, EF 1α: Elongationsfaktor-1α Promotor, tetO: Tetracyclin-Operator, loxP: Rekombinationsstelle der Cre-Rekombinase für den Bakteriophagen P1
LABORWELT
8. Jahrgang | Nr. 4/2007 | 33
W I S S E N S C H A F T
relative PERV-Expression [%]
140
120
100
80
60
40
20
Fibroblasten
Leervektor
pLVTHM-pol2
pLVTHM-pol2
nicht transduziert
171 Tage
116 Tage
29 Tage
5 Tage
Leervektor
nicht transduziert
0
PK-15
Abb. 2: Hemmung der PERV-Expression in primären porcinen Fibroblasten und der porcinen
Nierenzelllinie PK-15 nach Transduktion mit dem lentiviralen Vektor pLVTHM-pol2 im Vergleich
zur Expression in Leervektor-transduzierten Zellen sowie nicht transduzierten Zellen
Das Ziel, shRNA-transgene Schweine mit
stark verminderter PERV-Expression nach
der Methode des Nukleustransfers zu erzeugen, erfordert zunächst die Hemmung
der PERV-Expression in primären porcinen
Zellen. Primäre Zellen lassen sich mit konventionellen Expressionsvektoren jedoch nur
schwer und mit schlechter Effizienz transfizieren. Abhilfe können hierbei lentivirale Vektoren schaffen (z.B. pLVTHM, Abb. 1). Durch
Co-Transfektion einer Verpackungszelllinie
werden lentivirale Partikel gebildet, die auf
ihrer Oberfläche das Glykoprotein des Vesicular Stomatitis-Virus tragen. Durch dieses
Glykoprotein erschließt sich ein sehr breites
Wirtsspektrum, was den Vorteil bietet, dass
Zellen zahlreicher Spezies durch diese lentiviralen Partikel transduziert werden können.
Der als double copy-Vektor konzipierte lentivirale VektorpLVTHM11 (Abb. 1) ermöglicht
die Expression einer der pol2-siRNA entsprechenden pol2-shRNA. Nach der Transduktion
integriert der Teil des Vektors, in dem sich
die shRNA-Expressionskassette sowie ein
Reportergen (green fluorescent protein, gfp)
befinden, in das Genom der Wirtszelle,
wodurch es zu einem stabilen Einbau des
Transgens und zudem zur Duplikation der
34 | 8. Jahrgang | Nr. 4/2007
shRNA-Expressionskassette kommt. Die
shRNA-Expressionskassette wird, wie die
zellulären Gene auch, durch eine zelleigene Polymerase abgelesen. Aufgrund der
Expression des Reportergens gfp besteht
die Möglichkeit, nach der Transduktion der
Zellen, die Transduktionseffizienz, das heißt
den Anteil „grüner“ und somit transduzierter Zellen, fluoreszenzmikroskopisch oder
durchflusszytometrisch zu bestimmen. Bei
Transduktionseffizienzen von weniger als
95% ist eine Anreicherung der Zellen durch
FACS (fluorescence activated cell sorting)
unerlässlich, da eine Bestimmung des inhibierenden Effekts der shRNA sonst nicht
möglich ist.
Zur Hemmung der PERV-Expression
wurden porcine fötale Fibroblasten sowie
eine stark PERV produzierende, porcine Nierenzelllinie (PK-15) mit lentiviralen Partikeln
(pLVTHM-pol2), welche die beschriebene
PERV-spezifische shRNA pol2 enthalten, sowie mit einem Leervektor (pLVTHM) transduziert12. Nach der Anreicherung der transduzierten Fibroblasten durch FACS erfolgte
der quantitative Nachweis der Hemmung der
PERV-Expression mit Hilfe eines one-stepRT-real-time-PCR-Assays, der die Detektion
der viralen Volllängen-RNA ermöglicht. Die
PERV-Expression der mit den lentiviralen
Partikeln pLVTHM-pol2 transduzierten
Zellen wurde mit der PERV-Expression der
nicht-transduzierten Kontrollzellen (normiert
auf 100%) sowie mit der mit dem Leervektor
(pLVTHM) transduzierten Kontrollzellen
verglichen. In den primären Zellen zeigte
sich eine pol2-shRNA-vermittelte Hemmung
der PERV-Volllängen-RNA-Expression von
bis zu 94,8%, die über Monate (mind. 171
Tage) stabil blieb (Abb. 2). In der stark PERV
exprimierenden Zelllinie PK-15 konnte eine
Hemmung der PERV-Expression von 73,5%
erreicht werden (Abb. 2).
Nachdem gezeigt werden konnte, dass der
lentivirale Vektor pLVTHM-pol2 in der Lage
ist, die Expression der PERV-Vollängen-RNA
in unterschiedlichen Zelltypen zu hemmen,
wurde untersucht, ob die Hemmung der
viralen mRNA auch zu einer reduzierten
Expression viraler Proteine führt. ProteinPräparationen der fötalen Fibroblasten und
der PK-15-Zellen wurden mit Hilfe der
Western-Blot-Analyse hinsichtlich der Expression des p27-Gag-Proteins untersucht,
das von der PERV-Volllängen-RNA gebildet
wird. Abbildung 3 zeigt eine reduzierte p27Gag-Proteinexpression der pLVTHM-pol2transduzierten PK-15-Zellen im Vergleich
zu den nicht transduzierten sowie den Leervektor-transduzierten Zellen. Die Beladung
äquivalenter Proteinmengen wurde mit Antikörpern gegen β-Actin verifiziert. Die Proteinexpression in den porcinen Fibroblasten
ist sehr gering, wodurch ein Nachweis ihrer
Hemmung in diesen Zellen mittels WesternBlot-Analyse nicht möglich war.
Bei den transduzierten PK-15-Zellen
führten die reduzierte mRNA- und Proteinexpression auch zu einer verminderten
Virusfreisetzung. Die Bestimmung der Virusfreisetzung erfolgte über die Quantifizierung
der Aktivität der Reversen Transkriptase,
dem charakteristischen Enzym der Retroviren, welches das retrovirale RNA-Genom
während der Replikation in provirale DNA
umschreibt. Das Nachweissystem (C-Type RT
Abb. 3: Hemmung der viralen p27Gag-Proteinexpression in pLVTHM-pol2-transduzierten
PK-15-Zellen im Vergleich zu den Leervektortransduzierten sowie den nicht transduzierten
Zellen
LABORWELT
W I S S E N S C H A F T
RT-Aktivität [mU/ml]
25
25
2
20
1
15
1
10
5
pLVTHM-pol2
Leervektor
nicht transduziert
0
Abb. 4: Reduzierte RT-Aktivität im Überstand
der pLVTHM-pol2-transduzierten PK-15 im
Vergleich zu den Leervektor-transduzierten
sowie den nicht transduzierten Zellen
Activity Kit, Cavidi) basiert auf der Kopplung
von Poly-rA (ein Substrat der RT) und einem
Oligo-dT-Primer an eine Mikrotiterplatte.
Je nach Konzentration der zugegebenen
Reversen Transkriptase erfolgt eine Verlänamx_01674_HTAnz_TotalFlexibility_rz
gerung des Oligo-dT-Primers mit Bromodesoxyuridin, welches seinerseits mit Hilfe eines
spezifischen, mit Alkalischer Phosphatase
konjugierten Antikörpers und einer Substratlösung photometrisch gemessen und
quantifiziert werden kann. Somit wurde
in den Überständen der mit pLVTHM-pol2
transduzierten PK-15-Zellen eine signifikant
reduzierte RT-Aktivität (4,74 mU/ml) im
Vergleich zu den Leervektor-transduzierten
(22,5 mU/ml) und den unbehandelten PK15-Zellen (21,21 mU/ml) bestimmt (Abb. 4).
In den Überständen der Fibroblasten konnte
aufgrund der geringen PERV-Expression
keine RT-Aktivität detektiert werden.
In dieser Studie12 konnte erstmals eine
signifikante Hemmung porciner endogener
Retroviren durch lentiviral vermittelte RNAInterferenz in primären porcinen Zellen
gezeigt werden. Durch die Verwendung
lentiviraler Vektoren erfolgt eine Integration der shRNA-Expressionskassette in das
Wirtsgenom. Damit besteht die Möglichkeit,
shRNA-transgene Schweine zu erzeugen,
indem die lentiviralen Partikel in den Perivitellinraum der porcinen Zygote injiziert
oder Schweine unter Verwendung der hier
beschriebenen transduzierten primären Zellen mittels Nukleustransfer geklont werden.
Bisher noch nicht publizierte Ergebnisse
06.08.2007
12:54 Uhr
deuten die Realisierbarkeit dieses Konzeptes an. Solche shRNA-transgenen Schweine
mit stark verminderter PERV-Expression
könnten in Zukunft zu virologisch sichereren
Xenotransplantaten führen.
Literatur
[1]
[2]
[3]
[4]
[5]
[6]
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[8]
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Wiznerowicz, M., Trono, D., J Virol. 77 (2003), 8957-8961.
Dieckhoff, B., Karlas, A., Hofmann, A., Kues, W., Petersen, B., Pfeifer, A.,
Niemann, H., Kurth, R., Denner, J., Arch Virol. 152 (2007), 629-634.
Korrespondenzadresse
Dipl.-Biol. Britta Dieckhoff
Robert Koch-Institut
Nordufer 20, 13353 Berlin
Tel.: +49-(0)30-18754 2827
Fax: +49-(0)30-18754 2801
eMail: [email protected]
Seite 1
Kennziffer 23 LW 04 · Informationen ordern? · www.biocom.de
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LABORWELT
High-Throughput RNAi with Total Flexibility
8. Jahrgang | Nr. 4/2007 | 35
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Interview
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Ziel: Klinische Prüfung in 2008
Dr. Sven Klußmann, CEO und CSO, NOXXON Pharma AG, Berlin
Rund 37 Mio. Euro hat die im Oktober 1997 gegründete NOXXON Pharma AG aus Berlin im
Juni in einer Serie-C-Finanzierungsrunde eingestrichen, Mit dem frischen Kapital will das
Unternehmen die zwei Wirkstoffkandiaten NOX-E36 und NOX-A12 Ende 2008 beziehungsweise Anfang 2009 nach ermutigenden Ergebnissen im Tierversuch in die klinische Prüfung
einbringen. Bereits zuvor hatte das Unternehmen einen signifikanten Deal mit dem Pharmariesen Pfizer, der den Ghrelin-Inhibitor NOX-B11 und bis zu drei Spiegelmere der Berliner pro
Jahr gegen vorgegebene Targets einlizenzierte, einstreichen können. LABORWELT sprach
mit Firmengründer Dr. Sven Klußmann über den Weg der von ihm mitentwickelten L-RNAAptamere (Spiegelmere) in die Klinik.
Laborwelt:
Herr Dr. Klußmann, 1996 haben Sie in Ihrer
Doktorarbeit erstmals umfassend L-RNAAptamere – sogenannte Spiegelmere – als
vielversprechende neue Wirkstoffklasse beschrieben, 1997 erfolgte die Gründung der
NOXXON Pharma AG. Was waren für Sie die
Meilensteine und größten Herausforderungen
bei der Entwicklung von damals bis heute?
Klußmann:
Ein wesentlicher Meilenstein war sicherlich
die Optimierung und Automatisierung des
SELEX-Herstellungsprozesses, die im Jahre
2002 abgeschlossen werden konnten. Das hat
uns in die Lage versetzt, die Hauptlast, die bis
dato von Wissenschaftlern getragen wurde,
die den Herstellungsprozess der L-RNAAptamere manuell durchgeführt haben, auf
robotergestützte Systeme zu übertragen. Das
brachte eine wesentlich größere Reproduzierbarkeit und hat uns in die Lage versetzt, die
in-vitro-Selektion, sprich SELEX, hochparallel
durchzuführen. Ein Jahr zuvor hatten wir das
SELEX-Portfolio für Spiegelmer-Anwendungen einlizenziert. Bis dahin waren die Patente
der Firma Gilead quasi nicht zugänglich.
Ein dritter Meilenstein war sicher, dass wir
in den Jahren 2001 bis 2004 gemeinsam mit
Partnerfirmen Produktionsprozesse für die
L-Nukleotide etabliert haben, und zwar in
einem Bereich von 20 bis 50 Kilogramm, um
überhaupt Spiegelmere herstellen zu können.
Dies alles wäre aber ohne den entsprechenden
finanziellen Rückhalt nicht möglich gewesen,
wie die 21 Mio. Euro-Finanzierungsrunde
Ende 2000 unter Federführung von Merlin und
die ungefähr 21 Mio. Euro, auf die sich verschiedene Zwischenfinanzierungen summieren. Dazu kommt natürlich die Finanzrunde
von 37 Mio. Euro, die wir in diesem Jahr mit
einem ausgezeichneten Investorenkonsortium
abschließen konnten. An Business-Meilensteinen wären die sehr frühen Kooperationen mit
z.B. Schering, Grünenthal und Fresenius zu
nennen, die uns entsprechende Einnahmen
36 | 8. Jahrgang | Nr. 4/2007
gebracht haben. Dann hatten wir längere Zeit
keine neuen Partnerschaften. Ein sicherlich
entscheidender Meilenstein im letzten Jahr
war die Kollaboration, die wir mit Pfizer
eingegangen sind.
Laborwelt:
… mit dem sich der US-Konzern die weltweiten Exklusivrechte an NOXXONs Ghrelin-Inhibitor NOX-B11 gegen Obesitas sicherte?
Klußmann:
Dazu kommt noch ein Screening- und ein
Plattformdeal und im Gegenzug die Beteiligung Pfizers am Grundkapital von NOXXON.
Für uns ist das ein „validierender Deal“
– validierend für unsere Technologieplattform.
Diese Meilensteine konnten nur durch die
Zusammenarbeit eines hervorragenden Wissenschaftlerteams erreicht werden, das im Kern
schon seit Anfang 2000 zusammenarbeitet und
gemeinsam auch Durststrecken und die damit
verbundene Begrenzung der Möglichkeiten
überstanden hat.
Laborwelt:
Waren denn nur finanzielle Durchstrecken
zu überwinden, oder sahen Sie sich auch
mit technologischen Herausforderungen
konfrontiert, wie etwa der Entfernung von
PCR-Primern, die beim SELEX-Verfahren
anfallen, oder bei der Spiegelmer-Synthese
oder -Aufreinigung?
Klußmann:
Ja, absolut. In den ersten Jahren war es außerordentlich schwierig, das 1996 Publizierte
und an Musterbeispielen Gezeigte wirklich
zu einem industriellen Prozess zu formen.
Das hat mehrere Jahre gedauert. Im Jahr 2002
hatten wir den SELEX-Prozess soweit optimiert
und automatisiert, dass wir mit Fug und Recht
sagen konnten, jetzt können wir Moleküle
mit ähnlichen ‚drug-like properties‘ wie etwa
Antikörperwirkstoffe identifizieren. Diese
Meilensteine fielen aber in eine Zeit, in denen
Dr. Sven Klußmann ist Mitgründer der
NOXXON Pharma AG, seit Mai 2006 leitet er
die Firma als Alleinvorstand (CEO & CSO).
Er hat nach einem Biochemiestudium in
seiner Doktorarbeit , die er in der Abteilung
von Prof. Volker Erdmann am Institut für
Biochemie der FU Berlin angefertigt hat, das
Konzept, spiegelbildliche Oligonukleotide
als neuartige Wirkstoffe zu identifizieren,
gezeigt. Ende 1997 folgte die Firmengründung und schon kurze Zeit später wurden
erste Industriekooperationen eingegangen.
Im März 2006 wurde eine strategische
Partnerschaft mit Pfizer unterschrieben. Dr.
Klußmann hat in den ersten Jahren die junge
Technologie in einen robusten industriellen
Prozess überführt. Seit Mai 2006 zeichnet
er dafür verantwortlich, den Übergang von
einer eher technologisch ausgerichteten
Firma in ein Unternehmen mit klinischem
Entwicklungsprofil zu begleiten. Auf diesem
Weg wurde zunächst im Mai 2007 eine Finanzierungsrunde im Volumen von 37 Mio.
Euro abgeschlossen, die die notwendige
Voraussetzung für die weitere (prä)klinische
Profilierung der Spiegelmere NOX-E36 und
NOX-A12 schafft.
die finanzielle Lage bei sehr vielen Biotechnologie-Unternehmen sehr angespannt war.
Auch wir haben von 2003 an bis letztlich zum
Pfizer-Deal mit einem extrem engen Budget
gearbeitet, eigentlich primär überlebt, und das
bereits 2002 Entwickelte quasi hinübergerettet
in eine bessere Zeit. Wir waren 2003 nur 17
Leute. Mit einer so dünnen Personaldecke eine
so komplexe Technologieplattform, inklusive
Produktion, Analytik, Zellkultur etc. aufzubauen, war eigentlich kaum zu stemmen, und
war allein getrieben von der gemeinsamen
Vision, ein Spiegelmer-Molekül in die klinische
Entwicklung zu bringen. Deswegen bin ich so
stolz auf das Team.
Laborwelt:
Von außen betrachtet, hat sich der eine oder
andere sicher gefragt, weshalb stecken die
Wirkstoffe nach zehn Jahren noch immer in
der Präklinik?
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Klußmann:
Klußmann:
Laborwelt:
So wird das halt gesehen. Wir mussten bei
der Entwicklung der Spiegelmere länger
Pionierarbeit leisten als ursprünglich gedacht. Wir haben zwar sehr gut angefangen,
hätten aber mehr Finanzmittel benötigt, um
die Entwicklung noch schneller vorantreiben zu können. Es hat bis zum Merlin-Deal
gedauert, bis ein angemessener finanzieller
Rahmen zur Verfügung stand, mit dessen
Hilfe wir die Selektions- und Produktionsprozesse etabliert haben. Zusätzlich
mussten wir sehr viel Geld für IP ausgegeben – also den SELEX-Prozess – und sind
danach in die finanzielle Krise gerutscht.
Wir hatten die Technologie zwar etabliert,
waren aber dann finanziell nicht mehr in
der Lage, danach die richtigen Prozesse
aufzusetzen.
Wir haben CD-spektroskopische Untersuchungen durchgeführt und konnten im
polarisierten Licht klar erkennen, dass es sich
um spiegelbildliche Konformationen handelt.
Von einem funktionellen Spiegelmer liegen
bisher leider noch keine Kristallstrukturen
vor; es ist nicht ganz einfach, RNA-Moleküle
zu kristallisieren.
Mit Blick auf die angepeilte klinische
Entwicklung der Spiegelmere: Ist eine
cGMP-konforme Herstellung bereits aktuell
etabliert?
Laborwelt:
Können sie kurz umreißen, was Spiegelmere
sind, welche Eigenschaften sie haben und
wie sie produziert werden?
Klußmann:
Spiegelmere sind spiegelbildlich aufgebaute Oligonukleotide, also DNA- oder RNAWirkstoffe, die durch ihre dreidimensionale
Struktur in der Lage sind, an Targets zu
binden. Durch die Spiegelbildlichkeit,
also die Verwendung in der Natur nicht
vorkommender L-Nukleotid-Bausteine, besitzen die Spiegelmere eine extreme Biostabilität. Jede andere Oligonukleotidsubstanz
muss chemisch stabilisiert werden, was
mit Wirksamkeitseinbußen einhergehen
kann, um nicht dem Abbau durch zelluläre
Nukleasen anheim zu fallen. Spiegelmere
werden dagegen durch diese Nukleasen
nicht angegriffen und sind auch bei Körpertemperatur stabil.
Laborwelt:
Was heißt das für die biologische Halbwertszeit und die Zeit, bis Spiegelmere wieder
vollständig ausgeschieden sind?
Klußmann:
Sie werden nach den bisher durchgeführten
Untersuchungen sowohl über die Niere
als auch die Leber als Volllängenmoleküle
ausgeschieden. Das passiert in Nagern vergleichsweise schnell, nach subkutaner Administration in Primaten gehen wir davon
aus – und das zeigen auch Experimente zur
Pharmakokinetik – dass eine wöchentliche
Verabreichung ausreichend ist.
Laborwelt:
Wurde die theoretische Überlegung, dass
aus D- oder L-Oligonukleotiden aufgebaute Oligomere spiegelsymmetrische
Strukturen ergeben, bereits experimentell
belegt – zum Beispiel durch Analysen der
Röntgenstruktur?
LABORWELT
Laborwelt:
Inwieweit unterscheiden sich Spiegelmere
von konventionellen Aptamer-Wirkstoffen,
zum Beispiel in puncto herstellungsbedingte
Verunreinigungen, Kosten etc.?
Klußmann:
Die Herstellungskosten der Spiegelmere
werden ein wenig höher als die von normalen Aptamere liegen, wobei die Kosten der
Aptamerherstellung von der Art der eingesetzten Modifikationen abhängen. Bei Macugen,
dem bereits zugelassen Aptamer-Wirkstoff
zur Behandlung der Alters-abhängigen Macula-Degeneration (AMD) etwa, werden die
Herstellungskosten durch die 2'-Fluoro-modifizierten Bausteine nicht günstig ausfallen.
Allerdings machen die Herstellungskosten
der Bausteine den kleineren Teil der Aptamerherstellung aus, die Oligomer-Synthese den
größeren Teil. Insgesamt werden wir aber bei
den Produktionskosten wesentlich besser dastehen als die wirklichen Konkurrenzprodukte
der Spiegelmere, die monoklonalen Antikörper
(mAbs). Auch Immunogenität haben wir bei
Spiegelmeren – ganz im Gegensatz zu mAbs
– bisher nicht beobachtet. Verunreinigungen
bei der Herstellung von Oligonukleotiden gibt
es sicher immer durch Abbruchprodukte bei
der Festphasensynthese (z.B. n-1). Allerdings
wirken sich diese nach unserem Dafürhalten
nicht auf die Funktion der Spiegelmere aus und
führen auch nicht zu Nebenwirkungen. Wir
haben aus Tiermodellen bisher keinen Hinweis
auf Toxizitäten. Es kam nie zu Reizungen an
der Injektionsstelle, wir haben in Zellkulturen
noch nie Zellen sterben sehen und erwarten
nun die Überprüfung im Menschen.
Laborwelt:
Wie lang muss – oder besser –, wie lang darf
denn ein Spiegelmer sein, damit es spezifisch
wirkt, die Herstellungskosten aber trotzdem
in einem vertretbaren Rahmen bleiben?
Klußmann:
Das ist eine wichtige Frage, die wir uns natürlich auch gestellt haben. Wir gehen davon
aus, dass bei 40 ± 3 Nukleotiden die Wahrheit
liegt. Jenseits der 50 Nukleotide handelt es
sich aufgrund der hohen Produktionskosten
nicht mehr um ein markttaugliches Produkt.
Kritisch ist hierbei, dass trotz hoher Kopplungseffizienzen von zum Teil mehr als 99%
je RNA-Syntheseschritt am Ende genügend
Produkt erhalten werden muss.
Klußmann:
Wir sind kurz davor, uns für einen Produzenten zu entscheiden und werden Ende
dieses oder Anfang nächsten Jahres einen
entsprechenden Prozess auf Basis der etablierten Phosphoamidit-Chemie für unser
erstes Projekt, NOX-E36, aufsetzen.
Laborwelt:
Auf Ihrer Homepage werden derzeit sechs
Entwicklungskandidaten in verschiedensten Indikationen präsentiert, in der wissenschaftlichen Literatur sind noch mehr
beschrieben. Welches ist den neben dem
bereits auslizenzierten NOX-B11 der derzeit
aussichtsreichste Kandidat für einen weiteren Lizenzdeal?
Klußmann:
Wir sind primär für die Entwicklung von
NOX-E36 zur Nephritisbehandlung und
NOX-A12 zur Therapie der diabetischen
Retinopathie finanziert worden. Diese
beiden Kandidaten, von denen NOX-E36
etwas weiter in der Entwicklung ist, bringen
wir jetzt mit Hochdruck in die klinische
Entwicklung, mit dem Ziel, diese bis zum
Wirksamkeitsnachweis in Phase 2 zu entwickeln. Dann werden wir entscheiden, ob
wir einen oder alle beide weiterführen und
in das Co-Development mit einem Pharmapartner einbringen. Das hängt einfach von
den Ergebnissen ab. Daneben haben wir
weitere Kandidaten in der Pipeline, die aus
früheren Projekten stammen, die wir aber
selbst nicht weiterführen können, weil wir
nach heutigem Stand denken, dass dies keine für ein Biotech-Unternehmen geeignete
Indikationen sind. Gleichwohl bieten wir
diese in noch früher Entwicklung befindlichen Spiegelmere interessierten Pharmapartnern an. Dieses Vorgehen ist Bestandteil
unserer Strategie, sowohl die Technologieplattform als auch präklinische Produkte
auszulizenzieren und für Projekte, für die
der Wirksamkeitskeitsnachweis erbracht
wurde, Entwicklungspartnerschaften aufzubauen. Nach dem Pfizer-Deal im letzten
Jahr und der Finanzierungsrunde in diesem
Jahr hoffen wir in der zweiten Jahreshälfte
einen weiteren Pharma-Deal abschließen
zu können. Ende nächsten Jahres wollen
wir das erste Spiegelmer in die klinische
Entwicklung einbringen, und in den Jahren
2009 und 2010 erwarten wir die ersten Wirksamkeitsdaten beim Menschen.
Laborwelt:
Herr Dr. Klußmann, vielen Dank für das
Gespräch.
8. Jahrgang | Nr. 4/2007 | 39
40 | 8. Jahrgang | Nr. 4/2007
None
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The system is controlled by the 96-well Shuttle Software. This graphic
user interface is used to setup, control and save the results of a 96-well
nucleofection experiment. Each result file stores information about date
and time, user, used devices, well parameters etc.. It can be exported as
an Excel-compatible csv-file.
Europe and Rest of World: Phone: +49-221-99199-400 (Mo-Fr, 9am-6pm
CET) • Fax: +49-221-99199-499 • Email: scientifi[email protected] |
USA: Phone: 888-632-9110 (toll-free) (Mo-Fr, 9am-7pm EST) • Fax: 888632-9112 (toll-free) • Email: scientifi[email protected]
6. Optische Komponenten
7. Bild-Akquisition
8. Datenerfassung/-auswertung/
-speicherung/- transfer
9. Technischer Service
Pipettierarm mit einem Kanal. erlaubt Bildanalyse während Zugabe der Reagenzien,
garantiert eine sofortige Aufnahme der
zellulären Response, Verwendung von
Einwegspitzen erlaubt Einhaltung von einwandfreien Arbeitsbedingungen,
Pipettieren mit 2 - 100 µl pro Pipettiervorgang geeicht, beinhaltet schnelles Ansaugen,
um das Durchmischen der Reagenzien mit
den Zellen zu ermöglichen.
Laser-freies, konfokales High Content
Screening-Gerät zur automatischen Analyse
von zellulären Assays mit hohem Durchsatz,
durch integrierte CO2-Kammer auch für
kinetische Analysen einsetzbar
Drei Servicetechniker und Hotline; Applikationsunterstützung beim Anwender
und/oder zentral durch Imaging-erfahrene Applikationsmitarbeiter; Demo-Labor mit umfangreichen Probenvorbereitungs- und Messoptionen
Datenauswertung und -erfassung mit integrierter Software mit Assaymodulen
sowie der Option, flexible, kundenspezifische Assay-Protokolle zu definieren;
Daten werden als txt-Dateien gespeichert.
Hochauflösende, gekühlte CCD-Kamera, Bilder werden als 12 Bit-TIFF auf 1344
x 1024 Pixel gespeichert, zur Bildaufnahme wird das Objektiv (nicht die Probe)
bewegt, um schwach adhärente Zellen nicht zu stören (einzigartiges Konzept).
Konfokal oder Epifluoreszenz, wählbar für jede Wellenlänge, Spinning Disk für
Konfokalaufnahmen kann beliebig in den Lichtweg ein- und ausgefahren werden.
keine
Laser-freies, konfokales High
Content Screening-Gerät zur
automatischen Analyse von
zellulären Assays mit hohem
Durchsatz
308.000,– C
195.000,– C
The Nucleofector 96-well Shuttle System allows automatic processing
of a 96-well plate in 3-4 min and fulfills prerequisites for liquid handling
integration. We recently successfully combined the superior automation
features of Tecan’s cell transfection workstations based on the Freedom
EVO platform with amaxa’s Nucleofector Technology. This allows for
fully automated, high throughput transfection of primary cells, including
Neurons and T-cells, as well as hard-to-transfect cell lines. The development is ideal for large-scale studies that involve high throughput transfection stages, such as RNAi based screening for target identification and
-validation.
5. Liquid Handling-Komponenten
Device: price on request • Kits: 480,– C (96 rcts.)
System for the highly efficient transfection of primary cells and difficultto-transfect cell lines in 96-well format. The Nucleofector 96-well Shuttle
System consists of three components, the 96-well Shuttle, the Nucleofector
II Device and a laptop. Driven by the Nucleofector II, the 96-well Shuttle can
deliver DNA directly into the nucleus, allowing even non-dividing primary
cells (such as resting T cells or neurons) to be efficiently transfected. siRNA
delivery into the cytoplasm, on the other hand, also occurs with up to 99%
efficiency. Optimal nucleofection conditions depend upon the individual
cell type, not on the substrate being transfected. This means that identical
conditions are used for the nucleofection of DNA, siRNA or shRNA vectors.
So it is a simple matter to switch back and forth between substrates or to
perform co-transfections with DNA and RNA together. • High Efficiencies:
Up to 90% transfection efficiency with DNA combined with viabilities > 95%
Features: • Up to 99% siRNA duplex transfer even in suspension cells • High
reproducibility: Small intra- and inter-plate standard deviations • No edge
effects and no lot-to-lot variance • Access to difficult-to-transfect cell types:
Neurons, T cells and other difficult-to-transfect cell types can be transfected
• Ease of use: Optimized 96-well Nucleofector Kits and protocols for many
primary cells and cell lines • Substrate flexibility: Identical transfection conditions for DNA, siRNA, shRNA, miRNA ... • Transfection flexibility: Modular
2 x 8 Nucleocuvette plate for scalable throughput • Up to 96 independent
programs can be run per plate • Variable cell numbers - from 104 - 106 cells
per reaction • Rapid optimization: Optimization of any difficult-to-transfect
cell line in just one plate • Safety: Disposable plates minimize the risk of
cross contamination • Innovative conductive polymer - no metal ion release
4. Produktbeschreibung
RNA-Screening, Krebsforschung, ZNS, Diabetesforschung, Immunologie, Medikamentenforschung
BD Pathway 855 Bioimager
11. Preis für Basisgerät
High-throughput transfection system for screening of siRNA, shRNA,
miRNA or cDNA libraries in difficult-to-transfect cell lines and primary
cells
3. Anwendungsbereiche des
Systems
BD Pathway 435 Bioimager
Becton Dickinson GmbH
BD Biosciences/ Bioimaging
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Dr. Khuong Truong
Automatisierung mit Hilfe eines Roboterarms
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2. Produktname
Becton Dickinson GmbH
BD Biosciences/ Bioimaging
Tullastr 8-12, 69126 Heidelberg
Dr. Khuong Truong
10. Extras
amaxa AG
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Tel.: +49-(0)221-99199-0, Fax: +49-(0)221-99199-199
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Paradigm Platform about 25,000,– C • Cartridge
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Detection Platform is a unique, modular system
that allows quick and easy configuration by the
user. The platform features a selection of cartridges that can be interchanged in less than five
minutes to meet different assay needs, making
this the first user-upgradable and -configurable
multimode reader. It is ideal for labs with multiple users and applications.
Eight different cartridges will be available,
though future cartridges, including models specifically designed for the new BioRAPTR FRDTM
micro fluidic workstation, are in development.
Beckman Coulter will also provide custom-labeled cartridges for these read modes, to meet
unique user needs.
Beckman Coulter expects to begin shipping the
PARADIGM Detection Platform at the end of the
first quarter of this year.
High Performance Multimode Platform allows
to configure the systems to your needs and
expand at the time it’s necessary by adding
Detection cartridges – plug and detect
Paradigm High Performance Multimode Reader
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Systems
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Tel.: +43-(0)662-857 220
DI Rainer Mühlbacher
M A R K T Ü B E R S I C H T
Marktübersicht: HCS- und HTS-Systeme
Zellen statt in vitro-Nachweise biochemischer Reaktionen zum Aufspüren neuer Wirkstoffe und ihrer Optimierung zu nutzen, erscheint derzeit als vielversprechende Strategie in der Wirkstoffentwicklung. Anders als beim High-Throughput-Screening (HTS) werden die durch einen
Fluoreszenz-Tag markierten Zielmoleküle beim High-Content-Screening (HCS) durch Epifluoreszenz- oder Konfokalmikroskopie und mit CCDKameras erfasst und die Bilder ausgewertet. So verstanden, bedeutet HCS eine in vivo-Erweiterung des HTS. Einen Überblick über aktuelle
Verfahrenslösungen der Firmen, die sich der LABORWELT-Befragung zu HCS und HTS beteiligt haben, bietet die folgende Martkübersicht.
LABORWELT
LABORWELT
Zellkulturen, ELISA, mikrobiologische
Prüfungen, Nukleinsäure- und ProteinAssays, Membran-Assays
Schneller Mikroplatten-Washer, speziell
für höchsten Probendurchsatz konstruiert
Ultraschall-Reinigungsfunktion, Vakuumpumpe, Abfallflasche, Flüssigkeitssensoren
3. Anwendungsbereiche des Systems
4. Produktbeschreibung
5. Liquid Handling-Komponenten
Pipettierkopf 96/25 µl, Volumenbereich 200
nl-25 µl, Auflösung Volumenschritte 0,01 µl,
Polypropylen-Einwegspitzen für 10 µl oder
25 µl in den Qualitäten Standard, Steril und
PCR-zertifiziert, mögliche Plattenformate
96, 384, 1536, Mikroplatten-Transportsystem mit 4 oder 5 Plätzen • im Wechsel:
384/25 µl (Parameter s.o.) • Spitzenwaschstation: Kontamination < 0,006 % (Fluoreszenzmessung), keine Kreuzkontamination
mit siRNA-Transfektions-Experiment nachweisbar (qPCR, high content screening)
Multikanalpipettierer CyBi®-Well vario mit
auswechselbaren Pipettierköpfen • 96 und
384 Pipettierkanäle • Zubehör: 2 Stacker,
hocheffiziente aktive Spitzenwaschstation •
Barcode Reader
RNA interference-Screening • Setup von
Transfektionsprotokollen, Reformatierung
von siRNA-Banken
CyBi®-Well vario Workstation für automatisierte siRNA-Transfektion
Manifold wäscht 96- und 384-Well-Platten
ohne Wechsel, Crosswise Aspiration, fein
regulierbare Kolbenpumpe mit Pufferzugabe
ab 16.000 ,– C
9. Technischer Service
10. Extras
11. Preis für Basisgerät
ab 16.380,– C (je nach Konfiguration)
Hohe Pipettirgeschwindigkeit, geringe
Stellfläche, Schnelldispensiermodus, hohe
Genauigkeit und Reproduzierbarkeit auch
bei kleinen Volumina
ab 47.000,– C, je nach Konfiguration
einfache Softwareeinstellungen von
komplexen Pipettierprotokollen durch
Webbrowser-ähnliche Benutzeroberfläche
• Liquid Handling-Parameter ermöglichen
schonendes Pipettieren von empfindlichen
Zellkulturen/nicht adhärenten Zellen •
Höchste Präzision über gesamten Volumenbereich von 25 nL-250 µL
Netz von Servicetechnikern in ganz Europa
• individuelle Wartungsverträge
Gesetzliche Bestimmung zur Verjährung
der Gewährleistung, Vorort-Service,
Deutschlandweites Servicenetz, individuelle Service- und Wartungsverträge •Product Validation Package zur regelmäßigen
GLP-gerechten Überprüfung, IQ-, OQ-,
OQ-Routinen werden unterstützt.
8. Datenerfassung/-auswertung/
-speicherung/- transfer
Gesetzl. Bestimmung zur Verjährung der
Gewährleistung, Vorort-Service Deutschlandweites Servicenetz, individuelle Service- und Wartungsverträge
keine
keine
umfangreiche, eingebaute Software,
Kopierfunktion, Programmierpaket zur
Ansteuerung in Roboteranlagen, Wartungsprogramme
7. Bild-Akquisition
Steuerung/Programmierung entweder
durch Precision Power-Software mit PC
oder durch Onboard-Keypad.• Simulationsmodus für Pipettierprogramme erleichtert
das Erstellen fehlerfreier Programme
und vermeidet Verschwendung teurer
Reagenzien.
Autoklavierbarer Dispenser, 4 verschiedene
Modi Flüssigkeiten zu verteilen, Grafisches
Simulationsprogramm zum leichten Erstellen von Pipettier-Abläufen, Optionaler
Stacker zum Wechseln von Platten, Einkanal-Modus mit Liquid Level Sensing
Platzsparender Liquid Handler • Plattform
frei konfigurierbar für 6 Stationen • Kompatibel mit verschiedenen Plattenformaten
(96 / 384), Pipettenspitzen, Reagenzgefäßen
und Reservoirs
EIAs/ELISAs, Hit-Picking, Zell-Assays,
Übertragung von Mutter- zu Tochterplatten, Replikation von Mikroplatten, Serielle
Verdünnungen (Proteinassays), Reagenzzugabe
Precision
CyBio AG
Dr. H. Hermann
Göschwitzer Str. 40, 07745 Jena,
Tel.: +49-(0)3641-351 430
[email protected]
www.cybio-ag.com
keine
Washer Elx405HTS
2. Produktname
BioTek Instruments GmbH
Dr. Marina Bruß
Kocherwaldstr. 34, 74177 Bad Friedrichshall
Tel.: +49-(0)7136-968 202
Fax: +49-(0)7136-968 111
[email protected], www.biotek.de
6. Optische Komponenten
BioTek Instruments GmbH
Dr. Marina Bruß
Kocherwaldstr. 34, 74177 Bad Friedrichshall
Tel.: +49-(0)7136-968 202
Fax: +49-(0)7136-968 111
[email protected], www.biotek.de
1. Firmendaten, Ansprechpartner
ab 250.000,– C, je nach Konfiguration
einfache Softwareeinstellungen von komplexen
Pipettierprotokollen durch Webbrowser-ähnliche Benutzeroberfläche • Liquid Handling-Parameter ermöglichen schonendes Pipettieren
von empfindlichen Zellkulturen/nicht adhärenten Zellen • Höchste Präzision über gesamten
Volumenbereich von 25 nL-250 µl • vollautomatischer Wechsel der Pipettierspitzen im Prozess
Netz von Servicetechnikern in ganz Europa •
individuelle Wartungsverträge
keine
keine
keine
Pipettierkopf 96/25 µl, Volumenbereich 200
nl – 25 µl, Auflösung Volumenschritte 0,01 µl,
Polypropylen-Einwegspitzen für 10 µl oder 25 µl
in den Qualitäten Standard, Steril und PCR-zertifiziert, mögliche Plattenformate 96, 384, 1536,
• Pipettierkopf 384/25 µl (Parameter s.o.) •
Mikroplatten-Transportsystem mit 4 oder 5
Plätzen • Geschwindigkeit: 20.000 Transfektionen in 3 Stunden • kontaktfreies, schonendes
Dispensieren von Zellen • Zugabe von Transfektionslösung durch Multikanal-Pipettierköpfe
mit anschl. Spitzenwechsel
2 Mehrkanalpipettierer CyBi®-Well vario mit
auswechselbaren Pipettierköpfen • 96 und
384 Pipettierkanäle pro Kopf • 4 Stacker • 2
TipChanger • kontaktfreier Dispenser CyBi®Drop 3D mit Zell-Zirkulation • Verbindung der
linearen Transportsysteme über Dreharm •
Barcode Reader
RNA interference-Screening • High Throughput
inclusive Setup von Transfektionsprotokollen •
Zell-Aussaat • Reformatieren von siRNA-Banken • Duplikation von Assay-Mikroplatten
CyBi®-Well vario Workstation für automatisiertes RNAi-Screening
CyBio AG
Dr. H. Hermann
Göschwitzer Str. 40, 07745 Jena,
Tel.: +49-(0)3641-351 430
[email protected]
www.cybio-ag.com
Die epMotion ist eine universelle automatische
Pipettierstation, die auch für weitere Liquid Handlingaufgaben wie „Proben-Normalisierung“ oder
„Hit-Picking“ eingesetzt werden kann.
Eppendorf epMotion Performance-Pläne: klar
definierte Pläne ohne versteckte Kosten – einfache
Auswahl und Budgetierung • Premium-Pläne inklusive 1 Jahr Garantierverlängerung • professionelle
Betreuung durch engagierte und gut ausgebildeteServicetechniker • Kalibrierung der Dosierwerkzeuge nach ISO 8655 möglich
keine
keine
keine optische Analysetechnik
Automatisierung der Eppendorf-Pipettiertechnologie
• Pipettierbereich von 1µl -1000µl. Ein- und achtKanal-Pipettierwerkzeuge • ausschließlich kontaktfreies Dispensieren zur maximalen Reduktion von
Kontaminationen • autoklavierbare Pipettierwerkzeuge • kompatibel mit Einzelgefäßen oder PCR-,
Mikroplatten bis 384 wells
Automatisches Pipettiersystem mit höchster Pipettierpräzision • einfachste Bedienführung durch das
einzigartige Control Panel oder integriertem PC •
flexibel einzusetzen für nahezu alle Liquid HandlingAnwendungen
Ansatz von Real-time PCR-Assays im Hochdurchsatz-Maßstab
epMotion 5075 LH
Eppendorf Vertrieb Deutschland GmbH
Axel Kettler
Peter-Henlein-Straße 2, 50389 Wesseling-Berzdorf
Tel.: 01803-255911
[email protected]
HCS&HTS-SYSTEME
8. Jahrgang | Nr. 4/2007 | 41
42 | 8. Jahrgang | Nr. 4/2007
Das System besteht aus dem Opera High Content Imaging
Reader, der automatisierten Workstation, je nach Ausstattung sind Liquid handling-Komponenten wie die JANUS
cellular workstation, der FlexDrop, ein Cell-Washer sowie
Inkubatoren und weiteres in diesem System integriert.
Das optische Herz des Systems ist der Opera High content
Imaging Reader
Das Opera-System ist ein Hochdurchsatz-Imaging-System.
Zusammen mit den Automatiserungskomponenten können
mit dem System 50.000-100.000 Tests in 24h ausgelesen
werden.
Hochflexible Bildanalyse-Software „AcapellaTM“ bereits enthalten inklusive umfangreicher Bibliothek mit Algorithmen
gängiger Bildanalyse-Prozeduren für die Assayentwickung
sowie der Fähigkeit zur on-the-fly-Bildprozessierung •
Hochdurchsatz-Bildverarbeitungssystem mit parallelisierter Bildprozessierung, skalierbar: Basissystem mit
zwei PCs, je ein Dual-Core Prozessor, je 2 GB RAM und 2 x
250 GB Speicher. Jederzeit Aufrüstung mit weiteren PCs •
Zusätzliche Server zur Datenspeicherung
Weltweiter Support durch ein wachsendes Team von Serviceingenieuren, Applikationsspezialisten, Software-Datenanalyse-Spezialisten und weiteren Supportmitarbeitern
Das System kann auch auf S2-Laborbedingungen angepasst werden
5. Liquid Handling-Komponenten
6. Optische Komponenten
7. Bild-Akquisition
8. Datenerfassung/-auswertung/
-speicherung/- transfer
9. Technischer Service
10. Extras
11. Preis für Basisgerät
Automatisiertes High Content Screening-System • Vereinigt High Content-Imaging mit robuster Automatisierung
• Das System ist modular aufgebaut und kann je nach
Anwendung zusammengestellt werden.
4. Produktbeschreibung
Fluoreszenzbasierte zelluläre Assays in der präklinischen Wirkstoffforschung • Primärscreening, Sekundärscreening, Lead-Optimierung • ADME / Tox-Assays • Target-Validierung • Systembiologie • RNAi-Screening
3. Anwendungsbereiche des Systems
Klimakontrolle (Temperatur, CO2, Feuchtigkeit) • Weitere
Office-Lizenzen für die Bildanalyse-Software • Plattenhandling: plate::
handlerTM II, Transfer zu Stackern, Inkubator, Liquid Handling-Modulen • Aufrüstung zur cell::explorerTM HCS Screening-Plattform (incl.
Plattenhandling, Pipettieren, Waschen, Plattenlagerung, Inkubation) •
Integration in bestehende Screening-Anlagen
Weltweiter Support durch ein wachsendes Team von Serviceingenieuren, Applikationsspezialisten, Software-Datenanalyse-Spezialisten
und weiteren Supportmitarbeitern • Applikationsentwicklung durch
unser Team: Machbarkeitsstudien, Assayentwicklung, Bildanalyse-Algorithmenentwicklung, sowohl in-house als auch beim Kunden
Hochflexible Bildanalyse-Software „AcapellaTM“ bereits enthalten
inklusive umfangreicher Bibliothek mit Algorithmen gängiger Bildanalyse-Prozeduren für die Assayentwickung sowie der Fähigkeit zur
on-the-fly-Bildprozessierung • Hochdurchsatz-Bildverarbeitungssystem mit parallelisierterBildprozessierung, skalierbar: Basissystem
mit zwei PCs, jeein Dual-Core Prozessor, je 2 GB RAM und 2 x 250 GB
Speicher. Jederzeit Aufrüstung mit weiteren PCs • Zusätzliche Server
zur Datenspeicherung
Parallele Dreifarben-Bildaufnahme über drei Peltier-gekühlte CCDKameras, 1376x1040 Pixel • bis zu 13 Bandpassfilter • Optional eine
weitere Kamera für den UV-Bereich • frei konfigurierbares Layout für
Sublayouts in einem Well und z-Stacks
Punktscan-konfokales Imaging-Prinzip mit Nipkow-Scheibe für
schnelle konfokale Bildaufnahme bei minimalem Photobleaching,
besonders geeignet für lebende Zellen • Festkörper-Laser zur Fluoreszenzanregung, Intensität regelbar • Zusätzlich nichtkonfokale
Epifluoreszenzoption mit Xenon-Lampe für den UV-Bereich • Laserbasierter Autofokus für ultraschnelle Definition der Bildebene
Optional on-line Dispenser und Kimakontrolle für Kurzzeit-Mehrfarben-Kinetikmessungen: Kontaktfreies Dispensieren von 0,2-15
µl mit schneller Durchmischung, HTS-Modus für Verschachteln von
Dispensieren und Messung • Optional FlexDropTM Liquid-Handling
Modul außerhalb des Opera für parallelisierte Zugabe von Substanzen: Achtkanal-Dispensieren von 200 nl-2 ml, bis zu vier Reagenzien
• Weitere Möglichkeiten mit Ausbau zu „cell::explorerTM“ ScreeningPlattform (Pipettierer, Washer)
Vollautomatisierter konfokaler Hochdurchsatz-Imaging Reader für
alle gebräuchlichen Mikrotiterplatten (96- bis 3456-Format) • Hohe
Geschwindigkeit für das Screening großer Substanzbibiotheken bei
gleichzeitig hoher konfokaler Auflösung • Vier Laser (405 nm, 488 nm,
561 nm oder 532 nm, 640 nm), optional Xenon-Lichtquelle zur Anregung im UV-Bereich für maximale Flexibilität bei der Auswahl der zu
verwendenden Fluorophore • Drei Peltier-gekühlte CCD-Kameras für
parallele Vielfarben-Bildaufnahme, optional eine weitere Kamera für
den UV-Bereich • Wasserimmersionsobjektive für exzellentes SignalRauschverhältnis, Luftobjektive für Platten mit dicken Plastikblöden,
Vergrößerung 10x bis 60x
OperaTM High Content Screening-System
cell::explorer - High Content Screening platform
2. Produktname
Evotec Technologies GmbH, A PerkinElmer Company
Dr. Gabriele Gradl (Global Product Manager High Content Screening)
Schnackenburgallee 114, 22525 Hamburg
Tel.: +49-(0)40-560 81-574, Fax: +49-(0)40-560 81-222
Evotec Technologies GmbH, A PerkinElmer Company
Andreas Niewöhner (Product Manager Automated Systems)
Schnackenburgallee 114, 22525 Hamburg
Tel.: +49-(0)40-560 81-338, Fax: +49-(0)40-560 81-488
1. Firmendaten, Ansprechpartner
ab 60.755,- C
5 Personen im Service in Europa, 2 in UK und je
eine in Deutschland, Frankreich, Skandinavien
Modulare Akquisitions-und Auswertesoftware
Cytosoft auf Laptop, im Vergleich zum Imaging
sehr kleine Ergebnisdateien von < 100 KB
Keine, sondern flowzytometrische Erfassung von
bis zu 6 Parametern simultan für jede Zelle
Kapillare Flowzytometrie mit bis zu 6 simultan
erfassten Detektoren
Integrierter 96-Well-Probenroboter, der auch
Proben aus Mikrozentrifugenröhrchen nehmen
kann • GuavaLink-Schnittstelle zu Liquidhandling-Roboter oder Plateloader
Kapillares Flowzytometer mit integriertem Probenroboter fuer 96-Wellplatten und Mikrozentrifugenröhrchen • Detektion von Fluoreszenz mit 2
bis 4 Farben, Forward- und Sidescatter (optional)
• Dank patentierter Kapillartechnik: absolute
Zellzählung und robuste, einfache Anwendung
und kompaktes Format
Cell Based Assays z.B.: Zellzählung/Viabilität •
Verschiedene Apoptose-Assays • Cell Cyclus
• Celltoxicity • Cell Tracking • Detektion von
Oberflächenmarkern • GFP-Detektion etc • Bead
Based Assays z.B.: IgG-Quantifizierung
Guava PCA-96
Guava EasyCyte Plus
Guava Technologies, Inc.
25801 Industrial Blvd., Hayward, CA 94545, USA
Dr. Michael Liebler
Tel.: +49-(0)171-7282932
[email protected]
Zugabe von Zellen, Aspiration von bis zu 4 Positionen
(3x fix) möglich • Plate-Mixing-Funktion (Minimierung
von Pipettierartefakten, z.B. durch DMSO), auch für
Ratiometrische Methoden, Barcode Reader • FRET-Option • Multiplexing • hoher Durchsatz (z.B. Flash-Lumineszenz 30 Platten/h) • höchste Zuverlässigkeit
Der technische Service erfolgt von Herrsching aus.
Real-Time-Anzeige der Messdaten, pos./neg. Kontrolle
• Hit-Detektion • Datentransfer (z.B. Excel)
separate Detektoren, optimiert für Lumineszenz bzw.
Fluoreszenzmessungen • Lumineszenz: hochempfindliche Photon Counting-Kamera • Fluoreszenz: gekühlte
Digitalkamera mit hoher Empfindlichkeit über einen
weiten Spektralbereich (350 nm bis 800 nm)
Fluoreszenz: leicht zugänglich außerhalb des Hauptgeräts plaziert sind lichtstarke Xenonlampen, gekoppelt
mit einem Anregungs-Filterrad; über einen QuartzLichtleiter und eine Epifluoreszenz-Optik erfolgt die
Anregung der ganzen MTP, über Emissionsfilter wird
das Signal auf den Detektor abgebildet • Lumineszenz:
fiberoptische Kopplung zwischen MTP und Kamera
1-3 Pipettierköpfe (96 oder 384 Kanäle) oder 1536er
Pin-Tool • Tip-Washer • Multi-Wasch-Funktion •
Wiping-Tool, externer Vorratstank
sehr flexibler MTP-Reader mit integriertem Liquid
Handling, für Stand-alone Betrieb (Stacker) oder integriert in Robotersysteme, Lumineszenzassays (Flashund Glow-Lumineszenz) können ebenso gemessen
werden wie alle handelsüblichen Fluoreszenzfarbstoffe
(1 Ex.-1 Em., 2 Ex.-1 Em., 1 Ex.-2 Em.), durch Messung
des ganzen Wells wird nicht nur eine hohe Empfindlichkeit erzielt, es können sowohl adhärente Zellen als
auch Zellsuspensionen eingesetzt werden.
Lumineszenz- und/oder Fluoreszenz-Messungen an
Mikrotiterplatten (96 und/oder 384 Well-Format), geeignet für Primary und Secondary Screening sowie zur
Assayentwicklung
FDSS 6000
Hamamatsu Photonics Germany GmbH
Arzberger Str. 10 , 82211 Herrsching
Tel.: +49-(0)8152-375 203, Fax: +49-(0)8152-375 222
Dr. Walter Graewe
Tel.: +49-(0)2831-94 506 , [email protected]
M A R K T Ü B E R S I C H T
LABORWELT
LABORWELT
Real-Time-Anzeige der Messdaten, Datentransfer (z.B. Excel)
Der technische Service erfolgt von Herrsching aus.
Temperaturkontrolle, Barcode Reader, automatische Entfernung des MTP-Deckels
8. Datenerfassung/-auswertung/
-speicherung/- transfer
9. Technischer Service
10. Extras
11. Preis für Basisgerät
hochempfindliche Bildverstärker-Kamera,
gegenüber herkömmlichen Lumineszenzsensoren mit stark erhöhter Empfindlichkeit im NIR-Bereich (z.B. 20x bei 700 nm)
7. Bild-Akquisition
Zusammen mit einem System der Microlab
STAR-Line erhalten Anwender eine Komplettlösung für das automatisierte Proben-Management
u. Liquid-Handling. Die Integration der beiden
Systeme stellt Prozess- und Probensicherheit für
das komplette Highthroughput Screening sicher.
Servicetechniker und Applikationsspezialisten
im gesamten Bundesgebiet.
Anwenderfreundliche Software, die alle nötigen Probenhandling-Schritte mit grafischer
Benutzerführung ermöglicht. Bearbeitung von
Arbeitslisten oder Anbindung an LIMS-Systeme
für maximale Probensicherheit. Ausgestattet
mit verschiedenen, redundanten Sicherungssystemen.
2D- und 3D-Barcodescanner integriert
Hochflexibles Lagersystem für Compound-Management in Mikrotitierplatten und Röhrchen
Lumineszenz: fiberoptische Kopplung
zwischen MTP und Kamera
hochempfindlicher Lumineszenz-Reader, f. Stand-alone-Betrieb (Stacker) o.
integriert in Robotersysteme, für Lumineszenzassays u. alle handelsüblichen
Fluoreszenzfarbstoffe (1 Ex.-1 Em., 2 Ex.-1
Em., 1 Ex.-2 Em.), durch Messung des
ganzen Wells wird eine hohe Empfindlichkeit erzielt, es können adhärente Zellen u.
Zellsuspensionen eingesetzt werden
4. Produktbeschreibung
Proben- und Compound-Management für Biotech, Pharma, akademische Forschung u.a.
6. Optische Komponenten
Bio- u. Chemolumineszenz-Messungen
an MTP (96, 384 und 1536 Well-Format) f.
Endpunkt-Bestimmungen, Kinetiken u.
Time-Lapse-Anwendungen, zeitgleiche
Aufnahme der Daten von allen Wells einer
MTP durch Imaging-Technik
3. Anwendungsbereiche des Systems
Active Sample Manager
Enorme Vorteile hins. Flexibilität, Durchsatz,
Bedienungsfreundlichkeit u. Sicherheit d. Proben:
Versch. Nutzer können simultan Hitpicking, Einu. Auslagerungsanfragen f. sofortige o. spätere
Ausführung bearbeiten, während die integrierten
in- und output-Systeme gleichzeitig mehrere
Platten ein- u. auslagern. Alle Proben verbleiben
bis zum endgültigen Verlassen d. Systems in
kontrollierten, inerten Bedingungen, um ihre
maximale Haltbarkeit sicherzustellen. Das System lässt sich zu jedem Zeitpunkt mit weiteren
Lagerungseinheiten erweitern, die bez. der Lagerungsbedingungen u. Probengefäße unabhängig
voneinander konfiguriert werden können.
RayCatcher
2. Produktname
Entwicklung maßgeschneiderter Integrationslösungen
nach Kunden-Bedürfnissen. Eine große Auswahl an
Zubehör steht für verschiedene Applikationen zur
Verfügung (Magnetic-Bead- und Vakuum-Technologie,
Inkubation, Analyse etc.).
Servicetechniker und Applikationsspezialisten im gesamten Bundesgebiet.
Steuerung durch Windows-basierte Software, die
einfache Integration und Ansteuerung von weiteren
Instrumenten (z.B. Readern, Inkubatoren etc.) erlaubt.
Daten-Tracking mit optionalem Barcode-Leser. Integration in LIMS-Systeme ist möglich über File-Handling (z.B.
Excel-, Access-, Text-Dateien).
Hohe Reproduzierbarkeit und Prozess-Sicherheit durch
„Air-Displacement“-Pipettier-Technologie. Bei Verwendung
von Einweg-Tips wird das Risiko von Kontamination praktisch ausgeschlossen. “Monitored Air Displacement” (MAD)
ermöglicht zudem die Überwachung einzelner PipettierSchritte mittels Drucksensoren. • Verschiedene Deckgrößen mit Nachrüst-Möglichkeit. 1-16 unabhängig positionierbare Pipettierkanäle und/oder optionaler 96er, 384er,
Nanodispenser-Pipettierkopf auf einem oder zwei parallel
arbeitenden Armen. Gleichzeitiger Einsatz von Tips und
Stahlnadeln. Plate-Handling mittels zweier verschiedener
interner oder einem externen Greif-Arm. Große Auswahl
an Zubehör für verschiedene Applikationen (MagneticBead und Vakuum-Technologie, Inkubation etc.).
Modulare Liquid Handling-Workstations mit frei konfigurierbaren Pipettier- und Plattentransport-Modulen.
Mikro- und Nanoliterpipettierung auf ein- und demselben
Gerät möglich.
Vielfältige Anwendungsmöglichkeiten in Genomics,
Proteomics und Drug Discovery, z.B: PAMPA, ADME und
Cytotoxicity Assays, Cell based Assays, Nukleinsäure/
Protein-Aufreinigung, Probenvorbereitung für Expressionsanalysen, DNA-Klonierung (Gateway®, Invitrogen),
PCR-Set-up (Real Time), Normalisierung, Proteinkristallisation für Labore in den Bereichen Biotech, Pharma,
akademische Forschung, Veterinär, Forensics u.a.
MICROLAB STAR Line (STARlet, STAR, STARplus)
HAMILTON Robotics GmbH
Dr. Jörg Katzenberger
Fraunhoferstr. 17, 82152 Martinsried
Tel.: +49-(0)89-55 26 49-0, Fax: +49-(0)89 55 26 49-10
[email protected], www.hamiltonrobotics.com
5. Liquid Handling-Komponenten
Hamamatsu Photonics Germany GmbH
Arzberger Str. 10 , 82211 Herrsching
Tel.: +49-(0)8152-375 203, Fax: -375 222
Dr. Walter Graewe, Tel.: +49-(0)2831-94 506
[email protected]
1. Firmendaten, Ansprechpartner
150.000,- C
Erweiterungsmodul für
Präparation der Biosensoren, Entgasung der
Messlösungen
8 Applikationsspezialisten und 2 Servicetechniker • Assay development
als Dienstleistung
Automatische Erfassung
von Peak Current-Amplitude oder Integral. Speicherung der Rohdaten
in binären Files. Export
als ASCI.
keine Image Acquisiton,
elektrische Messung
keine optischen Komponenten, elektrische
Messung
Automatischer Einkanalpipettierer (xyz-Antrieb)
mit firmeneigener Liquid-Handling-Einheit
für schnellen Lösungswechsel (IonJet-Injektionskopf)
Markierungsfreie und
zellfreie BiosensorTechnologie. Drastisch
erhöhter Durchsatz und
Empfindlichkeit gegenüber konventionellen
Methoden. Bis zu 500
Messungen pro Tag im
96-well-Format.
Direkte funktionelle
Messung der Aktivität von
Transportproteinen für
Screeninganwendungen.
Markierungsfreie Messung, keine Verwendung
von Fluoreszenzfarbstoffen oder radioaktiv markierten Substanzen
SURFE2R Workstation
IonGate Biosciences GmbH
Industriepark Hoechst
Geb. D528
65926 Frankfurt
Wolfgang Lerch, CEO
Flexible Pipettier- und Roboterplattform an individuelle
Assays, Durchsätze und Arbeitsvolumina anpassbar
und aufrüstbar. Roboterarme zur Beladung von Modulen
rechts, links, hinter und unter dem Gerät. Unterschiedlichste optische Komponenten auch von Drittfirmen integrierbar. Software ist FDA 21 CFR Part 11-kompatibel.
Tecan bietet 12 Monate Garantie, optionaler Servicevertrag möglich. Ein flächendeckendes Servicenetz mit 9
Servicetechnikern ist in Deutschland vorhanden.
EVOware-Software verfügt über Arbeitslisten, Dokumentation und Schnittstellen für Treiber von externen Geräten.
Die Steuersoftware schreibt für alle Abläufe ausführliche
Log-Files. Datenimport und -Export in verschiedenen Dateiformaten möglich. Bei integrierten Detektionsmodulen
übernimmt die Magellan-Software die Datenreduktion für
alle Detektionsmodi und Formaten bis zu 1536 Well.
Image-Akquisition auf Detektorebene, Datenaustausch
mit Liquid Handling-Software.
Optische Komponenten je nach Kundenwunsch (Scanner, Mikroskope, Plattenreader). Mechanische und Software-Integration mit Pipettierplattform. Auch mehrere
Detektionsgeräte auf einem System möglich.
1 oder 2 Liquid Handling-Arme mit jeweils 2, 4 oder 8
Einweg- oder waschbaren Stahlnadeln in beliebiger
Kombination. Mehrkanal-Pipettierung mit 96 (Einweg- oder waschbaren Stahlnadeln) oder 384 Nadeln
in Kombination mit Liquid Handling-Arm möglich.
Volumenbereich 10nl bis 5 ml (abhängig von der Art der
verwendeten Spitze).
Offene, flexible Liquid Handling- und Robotik-Plattform in
4 versch. Größen zur flexiblen Konfiguration v. Automationslösungen unterschiedlichster Anwendungen. Robotikfunktionen bewegen Verbrauchsmaterialien (Platten,
Röhrchen, Tips,…) innerhalb, neben, hinter und unter die
Arbeitsfläche. Beliebige Funktionen f. Detektion, Identifikation, Waschen, Schütteln, Temperieren, Extrahieren
(Magnet o. Vakuum), Inkubieren, Zentrifugieren, Cyclen u.
Lagern optional u. individuell konfigurierbar.
Breiter Bereich von Automationslösungen für das High
Throughput Screening und das High Content Screening,
Anwendungen um Bereich Zellkultur, zelluläre Assays,
Probenvorbereitung für Analysen und automatische
Analysen.
Freedom EVO® Serie
Tecan Deutschland GmbH
Dr. Jürgen Fetzer (Marketing)
Theodor-Storm-Str. 17, 74564 Crailsheim
Tel.: +49-(0)7951-94170, Fax: -5038
[email protected], www.tecan.de
HCS&HTS-SYSTEME
8. Jahrgang | Nr. 4/2007 | 43
44 | 8. Jahrgang | Nr. 4/2007
ImageXpressULTRA™
Confocal imaging of live cells or fixed samples on multi-well plates or slides • High
throughput, high content and research modes
Fully-integrated, true point-scanning confocal imaging system for automated acquisition
and analysis of images for high throughput cell-based screening • Optically-encoded linear motors, for superior precision and accuracy in X, Y, and Z positioning, with better than
100 nm resolution in all three axes • High-speed firmware-controlled auto-focus with a
dedicated laser, to minimize sample bleaching • Custom self-aligning optics, to ensure
optimal sensitivity and resolution of images • Software-configurable detection pinhole
diameter • Up to four internally-installed, solid state lasers (405, 488, 532 or 561, 635 nm),
for simultaneous or sequential scanning • Software-controlled linear objective changer
which protects unselected objectives from contact with the stage (up to 4 objectives) • Optional integration with an automated plate-loading robot • MetaXpressTM software, which
controls both acquisition and analysis, and is built on the backbone of our market-leading
MetaMorph imaging software • The MDCStoreTM enterprise-level database, for data management and image storage, automatically linking analysis results to original images,
segmentation overlays and annotations, compatible with Microsoft SQL Server and Oracle
platforms • Seamless integration with the AcuityXpressTM cellular informatics software
(optional), an advanced package for data mining, analysis, statistics, and visualization.
2. Produktname
3. Anwendungsbereiche des Systems
4. Produktbeschreibung
• Up to four internally-installed, solid state lasers (405, 488, 532 or 561, 635 nm), for simultaneous or sequential scanning •4 PMTs, enabling simultaneous acquisition of up to 4 colours
• The MetaXpress software, which controls both image acquisition and analysis, is built
on the backbone of MetaMorph imaging software. In addition to all the features of MetaMorph, MetaXpress is equipped with application modules to easily automate common
analysis tasks. Application modules feature intuitive dialog boxes for set-up of image
analysis, improved segmentation through adaptation to local content, image and cell-bycell data logging. Typical applications include: • Endothelial tube formation • Promotion
or inhibition of blood vessel formation • Cell viability • Cell cycle Analysis • Membrane
potential • Cytotoxicity and apoptosis • Cell proliferation • Cell migration • Cell counting
• Kinase activation • Fatty acid uptake • Mitosis • Adipogenesis • Examining transfection
efficiencies • Studying intracellular structures • Receptor internalization • Punctate
staining • Clustering target molecules • Process extension • Neurodegenerative or
neurodegenerative disease research • Cell differentiation (Stem cell research) • Protein
movement, translocation and co-localization • Cell pathway analysis • Protein phosphorylation • Mitochondrial localization • Detect monopolar spindles • Angiogenesis tube
formation • The MDCStore enterprise-level database, for data management and image
storage, automatically linking analysis results to original images, segmentation overlays
and annotations, compatible with Microsoft SQL Server and Oracle platforms. Writing to
and reading from the database is enabled through the database API and various export
and import functions in both AcuityXpress and MetaXpress • Seamless integration with
the AcuityXpress cellular informatics software, an advanced package for data mining,
analysis, statistics, and visualization. AcuityXpress features MDCEarth, a unique tool to
explore and analyze per-cell data and link data points to images.
7. Bild-Akquisition
8. Datenerfassung/-auswertung/
-speicherung/- transfer
Up to 4 objectives (4x-100x supported) • Filter cubes configured for specific dye excitation
and emission •Automated plate loading • MetaXpress offline analysis packages • Analysis application modules for MetaXpress • AcuityXpress cellular informatics software
POA
10. Extras
11. Preis für Basisgerät
9. Technischer Service
• A fully-integrated, true point-scanning confocal imaging system • High-speed firmware-controlled auto-focus with a dedicated laser, to minimize sample bleaching •
Custom self-aligning optics, to ensure optimal sensitivity and resolution of images •
Software-configurable detection pinhole diameter • Up to four internally-installed, solid
state lasers (405, 488, 532 or 561, 635 nm), for simultaneous or sequential scanning •
Software-controlled linear objective changer which protects unselected objectives from
contact with the stage (up to 4 objective).
6. Optische Komponenten
5. Liquid Handling-Komponenten
Molecular Devices (part of MDS Analytical Technologies)
660-665 Eskdale Road, Winnersh triangle
Wokingham, Berkshire RG41 5TS, UK
Technical support: +44-(0)118-9448000
1. Firmendaten, Ansprechpartner
Auf Anfrage, verschiedene Basismodelle
Heizen und Kühlen auf Deck optional möglich • Optional
Deckbelegung zur Bevorratung, Tipchange etc.
Weltweiter Support durch ein großes Team von
Serviceingenieuren und Applikationsspezialisten •
Applikationsunterstützung durch unser Team: Assayentwicklung • PerkinElmer eigenen Assaytechnologien
(inkl. EuroScreen)
einfach zu bedienende Windows-Software für die Erstellung und Nutzung von Protokollen, einfache AssayOptimierungen möglich • Softwareebene für den Poweruser erlaubt detailliertes Eingreifen in die Protokolle •
Auswertesoftware AssayPro
gekühlte CCD-Kamera
Kontakt Imaging-Technologie mit einer ultragekühlten
CCD-Kamera (LumiLux) • Epi-Fluoreszenz-Imaging mit
gekühlter CCD-Kamera (CellLux) • Reagenzzugabe in
der kompletten Platte zeitgleich zum Imaging
96, 384 und 1536-well-Pipettierkopf • Waschstation
u. wechselbare Spitzen • Bevorratung von bis zu 150
Platten („stand alone“) • Rührstation f. Lösungen • Fließband f. stabilen Transport der Platten o. Spitzenboxen •
integrierter Greifer f. Platten o. Boxen, daher hohe „walk
away“-Zeit • flexible Deckbelegung, damit auch f. andere
Liquid Handling-Aufgaben nutzbar • Barcode Reader
Vollautomatisierte Zellular-Imaging-Plattform für alle
gebräuchlichen Mikrotiterplatten (96- bis 3456-Format)
mit einer fortschrittlichen Liquid-Handling-Komponente
• Hohe Geschwindigkeit für das Screening großer
Substanz-Bibliotheken • „Stand-alone“-Modus mit
eingebauter Bevorratung (Stackern) für kleine Durchsätze und integrierbar in eine Screening-Anlage mit
großer Bevorratung
Flash- und Glo-Lumineszenz-Zell-Assays •Aequorin
Assays (suspensions- und adherente Zellen) • Calcium
Assays • Ion Chanels • Arbeitet mit Fluoreszenz Compounds • Primärscreening, Sekundärscreening, LeadOptimierung • Target-Research
LumiLux Cellular Screening Platform
CellLux Cellular Screening Platform
PerkinElmer LAS (Germany) GmbH
Ferdinand-Porsche-Ring 17, 63110 Rodgau
Tel.: (D): 0800-181-0032 • (CH): 0800-000-015 • (A): 0800-111-933
[email protected]
verschiedene Basismodelle
Integration in bestehende Screening-Anlagen
Weltweiter Support durch ein großes Team von
Serviceingenieuren und Applikationsspezialisten
• Applikationsunterstützung durch unser Team:
Assayentwicklung • PerkinElmer eigenen Assaytechnologien
einfach zu bedienende Windows-Software für die
Erstellung und Nutzung von Protokollen, einfache
Assay-Optimierungen möglich • Softwareebene
für den Poweruser erlaubt detailliertes Eingreifen
in die Protokolle
gekühlte CCD-Kamera • Optische Module nachrüstbar • frei konfigurierbares Layout in einem Well
große Linse, um komplette Platten auswerten
zu können
Optional FlexDropTM Liquid-Handling-Modul außerhalb des Viewlux für parallelisierte Zugabe von
Substanzen: Achtkanal-Dispensieren von 200 nl
– 2 ml, bis zu vier Reagenzien
Vollautomatisierter Platten-Imaging-Reader für
alle gebräuchlichen Mikrotiterplatten (96- bis
3456-Format) und Gele, TLC Plates und Membranen • Hohe Geschwindigkeit für das Screening
großer Substanz-Bibliotheken mit biochemischen
Assays • Stand-alone-Option mit eingebauter
Bevorratung (Stackern) für kleinere Durchsätze
und integrierbar in eine Screening-Anlage mit
großer Bevorratung
• TRF, FP, Fluoreszenz, Lumineszenz, Absorptions- und radioaktive Assays • Primärscreening,
Sekundärscreening, Lead-Optimierung • ADME /
Tox-Assays • Target-Research
Viewlux HTS microplate Imager
from 62.500,- C
customized solutions on request
application development on request •
service contracts
on request • depending on application
on request • depending on application
CCD microscope camera
non contact piezo dispenser • up to 8
dispensing channels • drop volumes
from 100 – 500 picoliter
XYZ robot sytems with integrated
picoliter dispensing unit and control
software
production of cell transfection arrays
• dispensing of living cells in ultra low
volumes (pico-to-nanoliter range) •
general low volume liquid handling
applications
sciFLEXARRAYER product line
Scienion AG
Dr. Rita Böttge
Tel.: +49-(0)30-63921700
[email protected], www.scienion.com
M A R K T Ü B E R S I C H T
LABORWELT
LABORWELT
Tisch (120x200 oder 200x200) mit Assist-Roboter und
Steuerung. Einhausung mit Sicherheitstüren, Liquid
Handling mit VPrep oder Bravo mit variablen Köpfen
und Volumen; Integration weiterer Geräte wie Washer
oder Dispenser nach Wahl; Thermo- oder LiconicInkubatoren, auch unter Deck; Deckelstation; Reader
nach Wahl. Komplette Anlage mit höchster Prozessgeschwindigkeit. Sehr variable und robuste Software.
Bestes Error Handling. Flexibel für Umbau und Anpassung auf sich ändernde Anforderungen. Beliebig mit
weiteren Modulen erweiterbar
VPrep-Pipettierer ist der kompakteste Pipettierer auf dem Markt mit austauschbaren Pipettierköpfen für verschiedene Volumina in 96er oder 384er Format. Wechselspitzen oder Nadeln, Volumenbereich von 100nl bis 200µl. Höchste Präzision und Genauigkeit.
Bravo-Pipettierer ist der variable Pipettierer mit Greifarm der ebenfalls variable austauschbare Köpfe für verschiedene Volumina in Nadeln oder Wechselspitzen hat. Kann Platten auf dem Deck stapeln. Deckelhandling auf dem
Pipettierer. Integration von Schüttlern, Wägestation, Vacuumstation uvm. Gleiche Volumenbereiche, Präzision und
Genauigkeit wie VPrep.
Analytische Module können nach Wahl integriert
werden.
Je nach Analysegerät
Daten können in der Analyse-Software des Readers
gespeichert werden oder über eine Schnittstelle in
lokale Datenbanken transferiert werden.
Technischer Support ist jederzeit kurzfristig verfügbar;
online-Einwahl und Hilfe möglich.
zusätzliche Applikationsunterstützung möglich
4. Produktbeschreibung
5. Liquid Handling-Komponenten
6. Optische Komponenten
7. Bild-Akquisition
8. Datenerfassung/-auswertung/
-speicherung/- transfer
9. Technischer Service
10. Extras
11. Preis für Basisgerät
Screening im mittleren oder hohen Durchsatz
3. Anwendungsbereiche des Systems
zusätzliche Applikationsunterstützung möglich
Technischer Support ist jederzeit kurzfristig verfügbar;
online Einwahl und Hilfe möglich.
Daten können in der Analyse-Software des Readers
gespeichert werden oder über eine Schnittstelle in lokale
Datenbanken transferiert werden.
Je nach Analysegerät
Analytische Module können nach Wahl integriert werden.
Tisch (122x122) mit Roboter und Steuerung. Liquid
Handling mit VPrep oder Bravo mit variablen Köpfen und
Volumen; Integration weiterer Geräte wie Washer oder
Dispenser nach Wahl; Thermo- oder Liconic-Inkubatoren; Deckelstation; Reader nach Wahl. Sehr kompakte
Anlage mit sehr hoher Prozessgeschwindigkeit. Sehr
variable und robuste Software. Bestes Error-Handling.
Flexibel für Umbau und Anpassung auf sich ändernde
Anforderungen
Screening im niedrigen oder mittleren Durchsatz
The Element
BioCel
2. Produktname
Velocity11 International
Dr. Anthony Zerlin
Melbourn Science Park
Melbourn, Hertfordshire SG8 6HB, Großbritannien
Tel.: 0151-1555-9934
[email protected]
Velocity11 International
Dr. Anthony Zerlin
Melbourn Science Park
Melbourn, Hertfordshire SG8 6HB, Großbritannien
Tel.: 0151-1555-9934
[email protected]
1. Firmendaten, Ansprechpartner
194.000,– C
MOSS 2002 kann auf individuelle Kundenanforderungen
angepasst werden. Dazu stehen eine Vielzahl an Modulen zur
Verfügung, z.B.: Integrierte Kamera zur Dokumentation und
Auswertung des Auflösezustands • Ultraschall • Spezielle
Pipettiernadeln wie Sprühnadeln zum Abwaschen der Reagenzien von den Innenwänden der Probengefäße oder Wechselspitzen sind optional erhältlich • Auflösen und Pipettieren
unter Argonschutzschild möglich • Rückstandsfreier Transfer der gelösten Proben mit kippbaren Racks
Kompetente Servicetechniker weltweit, kundenspezifische
Schulungen
Software in vorhandene Datenbankstrukturen angepasst
werden
Die Bilder werden in einer Datenbank gespeichert und
können während des Laufs analysiert werden, um z.B. nicht
gelöste Proben mit einem anderen Lösemittel oder mit
Ultraschall zu behandeln
Integrierte Kamera zur Dokumentation und Auswertung des
Auflösezustands
1 Arm mit um 270° rotierendem Greifer zum Transport von
Platten und Aufnehmen von Werkzeugen • 2D Barcodereader
• 1 Arm mit 8 Edelstahl 1-Kanal-Pipettiernadeln mit variablem Abstand zwischen den Pipettiernadeln für jeden Nadeltyp individuell einstellbar • Niveaudetektion an jeder Pipettiernadel • 8 Präzisions-Spritzenpumpen • Aktive Waschstation • „HeavyDuty“-Vortexer mit automatischer Arretierung
für ein Primärrack • Auflösegestell für 96 Kunden-Probenröhrchen • Decktrays für je 4 MTP • Spezielle Pipettiernadeln
wie Sprühnadeln zum Abwaschen der Reagenzien von den
Innenwänden der Probengefäße oder Wechselspitzen sind
optional erhältlich • Rückstandsfreier Transfer der gelösten
Proben mit kippbaren Racks möglich
Automatisches System zur Herstellung von Testplatten
für Bibliothekskomponenten mit computerunterstütztem
manuellem Wiegen der Proben in vorbeschriftete Barcodefläschchen, softwareüberwachtes Verdünnen zu einer vorgegebenen Konzentration und Probenverteilung in vorbeschrifteten Barcodetestplatten oder Mutterplatten • Auflösen und
Pipettieren unter Argonschutzschild möglich • Integrierte
Kamera zur Analyse des Auflösezustands optional erhältlich
• Ultraschall kann in als in Form eines Ultraschallbad oder
als Sonde integriert werden.
High Throughput Screening • Compound Management
Compound Libraries • Assay & Testplate Preparation
MOSS 2002
ZINSSER ANALYTIC GmbH
Eschborner Landstraße 135
60489 Frankfurt
155.000,– C
CRISSY ist ein maßgeschneidertes System und kann auf
individuelle Kundenwünsche angepasst werden. Wie
beispielsweise um Module für Löslichkeitsscreens oder
zum Testen und Optimieren von Formulierungen erweitert
werden. Z.B.: Integrierte Kamera zur Dokumentation und
Auswertung der Kristallbildung • Temperaturkontrollierte
Magnetrührer
Verteilung viskoser Medien • Aufreinigung der Proben für
die Analytik
Kompetente Servicetechniker weltweit, kundenspezifische
Schulungen
Software in vorhandene Datenbankstrukturen angepasst
werden
Die Bilder werden in einer Datenbank gespeichert und
können während des Laufs analysiert werden, um z.B.
nicht kristallisierte Proben mit einem anderen Reagenz
behandeln
Integrierte Kamera zur Dokumentation und Auswertung der
Kristallbildung
CRISSY-Workbenchsystem für polymorphes Kristallisations- und Salz-Screening • X,Y,Z-Plattform mit integriertem
Greifarm • Liquid Handling, Wäge- und Vortexer-Module •
4-stellige Wägezelle, integriert in Arbeitsfläche • PräzisionsSpritzenpumpen (für 500 µl, 1 ml, 2,5 ml, oder 5 ml Spritzen)
• Patentierte 1-Kanal-Filternadeln mit 10um Filter; variabler
Abstand (8 bis 38 mm) zwischen den Pipettiernadeln für
jeden Nadeltyp individuell einstellbar •Niveaudetektion an
jeder Pipettiernadel • Hochdurchfluss-6-Wegeventil mit
integriertem Verteiler zum Wechsel zwischen 6 externen
Flüssigkeiten • Wasch- und Vakuum-Trockenstation für
Filtrationsnadeln • Hochgeschwindigkeitsschüttler mit integrierter Heizplatte (+150°C) •Hochgeschwindigkeitsschüttler
für Zirkulationsbad zum Kühlen (-40°C) • Stickstoff-Manifold
für Reaktorblöcke •Pulververteilung • Rack für 24 Lösemittel, mit Niederhalter • CRISSY-Standard-Reaktorblöcke •
Platte zum Einsetzen der Kolbenköpfe für CRISSY-Block
Automatisiert den gesamten Workflow (Einwaage der APIs,
Zugabe der Reagenzien, Heizen & Kühlen, Probenentnahme
für die HPLC oder LC/MS, Trocknen der Kristalle) und liefert
trockene Kristalle, die direkt ausgewertet werden können •
Flexibler & modularer Aufbau des Systems
Drug Discovery,Polymorphism & Salt Screening
CRISSY
ZINSSER ANALYTIC GmbH
Eschborner Landstraße 135
60489 Frankfurt
HCS&HTS-SYSTEME
8. Jahrgang | Nr. 4/2007 | 45
S T E L L E N M A R K T
Akademischer Stellenmarkt
Veröffentlichen Sie Ihre Stellenanzeigen zielgruppengerecht in unserem akademischen Stellenmarkt, der allen nicht-kommerziellen Instituten für ihre
Stellenausschreibungen kostenlos zur Verfügung steht. Bitte senden Sie dazu Ihre Anzeige (1/4 Seite 90 mm breit x 122,5 mm hoch, Logo – jpg oder tiff,
300 dpi Auflösung) an [email protected]. Annahmeschluß für die nächste LABORWELT-Ausgabe 5/07 (Erscheinungstermin 26.09.2007) ist der 14. September.
Invitation to apply for the permanent post of a university professorship in the
“Polymer Sciences (Physical Chemistry of Polymers)” pursuant to §98 of the
2002 University Act in the Technical-Natural Sciences Faculty of the Johannes
Kepler University of Linz
Invitation to apply for the permanent post of a university professorship in the
“Chemical Technology of Organic Materials with a special focus on Polymers”
pursuant to §98 of the 2002 University Act in the Technical-Natural Sciences
Faculty of the Johannes Kepler University of Linz
From July 1, 2008, the permanent post of a
From July 1, 2008, the permanent post of a
Professor of “Polymer Sciences
(Physical Chemistry of Polymers)”
Professor of “Chemical Technology
of Organic Materials with a special focus on
Polymers”
is to be filled at the Technical-Natural Sciences Faculty of the Johannes Kepler University of Linz.
It will be the task of the successful applicant to represent and further develop this specialist field in both the teaching and research areas. The detailed requirements
are contained in a job description, which can be accessed on the Internet under the address http://www.jku.at/professuren.
A prerequisite for an application is a post-doctoral lecturing or equivalent qualification in the advertised subject.
The Johannes Kepler University is seeking to increase the quota of women among its scientific personnel and therefore would expressly request qualified women to
apply for the post. In the case of identical qualifications, preference will be given to a female applicant.
Taking into account the criteria stipulated in the job description, interested parties are requested to submit their applications and the related form, electronically by
midnight on September 3, 2007 to the rector of the Johannes Kepler University of Linz ([email protected]). Should the communication of the documents in electronic
form not be possible, these are to be sent in quintuple form in such a way that, at the latest, they are received by the rector within a period of grace of one week after
the end of the application period.
Rector Prof. Dr. Rudolf Ardelt, Johannes Kepler University, Altenbergerstraße 69, A-4040 Linz, Austria.
In der Klinik für Innere Medizin I (Ärztlicher Direktor: Professor Dr. G. Adler) ist im
Forschungslabor AG Reimann/Schirmbeck zum 01.10.2007 eine Stelle als
Naturwissenschaftliche(r) Doktorand(in)
im Rahmen eines DFG-geförderten Forschungsprojektes zu besetzen.
Die Arbeitsgruppe beschäftigt sich mit der Expression von rekombinanten Antigenen und deren Einsatz in verschiedenen Impfstoffstrategien. Hauptinteresse ist die
Induktion von CD8-T-Zellen in verschiedenen (therapeutischen und prophylaktischen) murinen Modellsystemen.
Das Tätigkeitsgebiet umfasst sowohl moderne Methoden der Molekularbiologie und Proteinbiochemie und Immunisierungsstudien. Der/die Bewerber/in sollte motiviert
und engagiert sein, Interesse an immunologischen Fragestellungen haben und über ein abgeschlossenes Hochschulstudium der Biologie oder Biochemie verfügen.
Ihre Bewerbungen werden bis 31.08.2007 erbeten an: Prof. Dr. Reinhold Schirmbeck,
Universitätsklinikum Ulm, Klinik für innere Medizin I, Robert Koch-Str. 8, 89081 Ulm
E-mail: [email protected]
46 | 8. Jahrgang | Nr. 4/2007
LABORWELT
S T E L L E N M A R K T
Das Chemotherapeutische Forschungsinstitut Georg-Speyer-Haus, ein Institut mit
großer Tradition in der deutschen biomedizinischen Forschung, und die Johann
Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt sind durch eine Kooperationsvereinbarung
auf den Gebieten der molekularen Infektions- und Tumorbiologie miteinander
verbunden. Im Rahmen eines gemeinsamen von der Deutschen Forschungsgemeinschaft geförderten Projekts zum Thema „Experimentelle Therapie von Gliomen: Interferenz mit der Expression und der Funktion des Transkriptionsfaktors
Stat3“ sind ab sofort folgende Positionen für zunächst zwei Jahre zu besetzen:
Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg-Speyer-Haus,
Frankfurt am Main, Arbeitsgruppe Prof. Dr. Bernd Groner (Direktor)
1 Doktorand/in (BAT IIa/2)
Das Labor Groner arbeitet seit vielen Jahren an der Stat-vermittelten Signaltransduktion. Es wurden Peptid-Aptamere isoliert, die in der Lage sind, mit
funktionellen Domänen von Stat3 zu interagieren und essentielle Funktionen
von Stat3 in Tumorzellen inhibieren. Diese sollen zur Behandlung von Gliomen
in Tiermodellen weiterentwickelt werden.
Voraussetzungen: Diplom in Biologie oder einer verwandten Fachrichtung, sehr
gute Kenntnisse in Zell- und Molekularbiologie, Interesse an experimenteller
Tumortherapie und translatorischer Forschung.
Kontakt und Bewerbung: Prof. Dr. Bernd Groner, Chemotherapeutisches
Forschungsinstitut Georg-Speyer-Haus, Paul-Ehrlich-Straße 42-44,
60596 Frankfurt, Tel. 069-63395-180, e-mail: [email protected].
Für weitere Informationen: www.georg-speyer-haus.de
Zentrum für Neurologie und Neurochirurgie des Klinikums der
Johann Wolfgang Goethe-Universität, Frankfurt am Main (Direktor:
Prof. Dr. V. Seifert), Abteilung Experimentelle Neurochirurgie (Leiter:
PD Dr. D. Kögel).
1 Doktorand/in (BAT IIa/2)
Das Labor Kögel/Weissenberger arbeitet an den molekularen Veränderungen
in Glioblastomzellen und hat transgene Mausmodelle für Gliome etabliert. An
diesen soll die Therapietauglichkeit von Stat3 mittels RNAi und Peptid-Aptameren
untersucht und evaluiert werden.
Voraussetzungen: Diplom in Biologie oder verwandter Fachrichtung, sehr gute
Kenntnisse in Zell- und Molekularbiologie. Interesse an anwendungsorientierter
Forschung und Neuroonkolgie.
1 technische/r Assistent/in (BAT Vc/2)
Aufgaben: Betreuung transgener Tiere, Kultivierung von Primärzellen, molekularbiologische Methoden, Immunhistochemie und Western blotting.
Voraussetzungen: Abgeschlossene Ausbildung als BTA oder MTA, Erfahrung in
Molekularbiologie, Bereitschaft zu tierexperimentellen Arbeiten.
Schwerbehinderte Bewerberinnen/Bewerber werden bei gleicher persönlicher
und fachlicher Eignung bevorzugt berücksichtigt.
Das Universitätsklinikum tritt für die Gleichberechtigung von Frauen und Männern
ein und fordert daher Frauen nachdrücklich zur Bewerbung auf.
Kontakt und Bewerbung: Dr. Jakob Weissenberger, Neuro Science Center,
Exp. Neurochirurgie, Heinrich-Hoffmann-Str. 7, 60528 Frankfurt am Main,
Tel. 069 6301 84051, e-mail: [email protected]
LABORWELT
At the Johannes Kepler University Linz (Austria), Institute of Biophysics a three
year
PhD Position in Biophysics
is available to study the molecular mechanism of ion and water transport across
potassium channels (see PNAS (2004) 101, 4805-4809). Studies involve protein
reconstitution into planar bilayers and electrophysiological characterisation. The
successful applicant will exploit electrochemical microscopy and fluorescent
correlation spectroscopy.
Your environment: A young, lively, international and interdisciplinary research
team in an excellently equipped research laboratory is waiting for you to
join and give you training in cutting edge technologies in a strongly growing
research field.
Your profile: You have an excellent master’s degree or diploma in Biophysics, Biochemistry or Biology. Preference will be given to individuals younger than 28.
Applications including cover letter, full c.v., and copies of graduation certificates should be sent as soon as possible. The position is open until filled.
Please send your application to Univ.-Prof. Peter Pohl, Johannes Kepler
University Linz, Institute of Biophysics, Altenberger Straße 69, A-4040 Linz,
Austria or per e-mail: [email protected]. You can also contact Prof. Pohl at
telephone no.: +43/(732)2468-9269.
8. Jahrgang | Nr. 4/2007 | 47
S T E L L E N M A R K T
GSF-Forschungszentrum
für Umwelt und Gesundheit, GmbH
Ingolstädter Landstraße 1, 85764 Neuherberg
Die GSF als Trägerin des Bayerischen Frauenförderpreises 2004 sowie des Total
E-Quality-Zertifikates strebt generell eine Erhöhung des Frauenanteils an und
fordert deshalb qualifizierte Interessentinnen ausdrücklich auf, sich zu bewerben.
Schwerbehinderte werden bei gleicher Eignung bevorzugt.
Das Institut für Toxikologie (TOX) sucht zur Mitarbeit in einem durch die Deutsche
Krebshilfe finanzierten Projekt in der „AG Signalprozesse im Immunsystem“
ab sofort eine/n
Am Institut für Allgemeine Physiologie des Fachbereichs Medizin der Universität
Ulm in der AG Molekulare Neurophysiologie (Prof. Birgit Liss) ist eine Position
als
Wissenschaftliche
Mitarbeiterin / Mitarbeiter (Doktorand/in)
Wissenschaftliche/n Mitarbeiter/in (82/07)
Die Arbeitsgruppe befasst sich mit Mechanismen der Aktivierung von Lymphozyten.
Das Projekt beinhaltet die Analyse von Fehlfunktionen in den Signalkaskaden
in malignen Lymphomen. Mittels biochemischer und molekularbiologischer
Methoden sollen kritische Mediatoren und Modifikationen in Lymphomazellen
charakterisiert werden. Weiterhin sollen molekulare Marker für unterschiedliche Lymphoma-Entitäten bestimmt werden. Neben einem abgeschlossenen
Hochschulstudium und einer Promotion in den Bereichen Biologie, Biochemie
oder Medizin werden Erfahrungen mit biochemischer und molekularbiologischer
Methodik erwartet.
Erwünscht sind Kenntnisse auf dem Gebiet der Protein-Chromatographie, sowie
der interzellulären Signaltransduktion und der Onkologie.
Wir bieten eine Vergütung nach TVöD. Das Arbeitsverhältnis ist auf drei Jahre
befristet.
Ihre schriftliche Bewerbung richten Sie bitte an: Herrn Dr. Daniel Krappmann,
GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit, Institut für Toxikologie
(TOXI), Ingolstädter Landstraße 1, D-85764 Neuherberg
Rückfragen richten Sie bitte an: Daniel Krappmann, [email protected]
zu besetzen.
Die Vergütung erfolgt nach Verg.-Gr. BAT IIa (1/2). Der Besetzungszeitpunkt ist
flexibel. Die Stelle ist für zunächst 24 Monate befristet (eine Verlängerung ist
möglich).
Aufgabengebiet:
Wissenschaftliche Arbeiten im Rahmen eines von der Gemeinnützigen Hertiestiftung und vom BMBF geförderten Drittmittelprojekts „Funktionelle Einzelzell-Genomik dopaminerger Neurone beim Morbus Parkinson und dessen
Mausmodellen“.
Durch Kombination von molekularbiologischer Einzelzell-Genexpressionsanalyse
mit Laser-Mikrodissektionstechniken und patch-clamp-Hirnschnitt-Elektrophysiologie untersuchen wir die differentielle Funktion und Genexpression dopaminerger Neuronenpopulationen vor dem Hintergrund Ihrer Pathophysiologie
im Morbus Parkinson (und auch anderer Krankheitsbilder des dopaminergen
Systems, wie Schizophrenie und Drogensucht). Literatur siehe z.B. Liss&Roeper,
2004 TINS; Liss et al, 2005 Nature Neuroscience; Ramirez et al, 2006 Nature
Genetics. Weitere Informationen zur Arbeitsgruppe unter: http://www.uni-ulm.
de/med/med-allgphys.html
Voraussetzungen:
Die Abteilung Genexpression (AGE) der GSF sucht ab sofort eine/n
Postdoc (4/07)
für systembiologische Analysen funktioneller genregulatorischer Systeme. Wir
untersuchen die Mechanismen der Genkontrolle und Genprogrammierung in
gesunden und leukämischen hämatopoietischen Zellen. Bisherige Schwerpunkte
der Abteilung lagen auf der Erforschung regulatorischer Netzwerke und den
Mechanismen der Transkription.
In BMBF-geförderten Projekten suchen wir eine/n talentierte/n Kollegen/in
für die Charakterisierung von Proteinkomplexen und die systembiologische
Analyse funktioneller krankheitsrelevanter Systeme. Die Projekte sind integraler Teil des deutschen Nationalen Genomforschungsverbundes und schließen
die Zusammenarbeit mit Massenspektrometrieexperten, Mathematikern und
Biotech-Firmen ein (Systembiologieprogramm QuantPro des BMBF). Wir bieten
ein modernes Labor in einem hervorragend ausgestatteten Institut der GSF am
Campus Großhadern/Martinsried.
Wir setzen eine abgeschlossene Promotion im Fachbereich Biologie/Biochemie
oder Chemie voraus.
Wir bieten eine Vergütung nach TVÖD. Das Arbeitsverhältnis ist bis 31.12.2009
befristet.
Ihre schriftliche Bewerbung richten Sie bitte an: Prof. Dr. Michael Meisterernst,
GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit, Institut für Molekulare
Immunologie, Abteilung Genexpression (AGE), Marchioninistr. 25, 81377
München
Rückfragen richten Sie bitte an: Angela Hoffmann, [email protected]
Das Institut für Medizinische Informatik (IMEI) sucht ab sofort eine/n
48 | 8. Jahrgang | Nr. 4/2007
Bewerben sollten sich hochmotivierte Naturwissenschaftler oder Mediziner, die
in einem jungen Team mit internationalen Kooperationen arbeiten möchten.
Erfolgreiche Bewerber sollten ein besonderes Interesse an neurobiologischen
Fragestellungen mitbringen sowie idealerweise Kenntnisse in der Analyse von
Ionenkanal- und Rezeptorfunktion aufweisen. Vorerfahrungen in elektrophysiologischen, molekularbiologischen und/oder immunzytochemischen Techniken
sollten ebenfalls vorhanden sein.
Rückfragen und Bewerbungen (in Deutsch oder Englisch) mit den üblichen
Unterlagen sind zu richten an: Prof. Dr. Birgit Liss, Institut für Allgemeine
Physiologie, AG Molekulare Neurophysiologie, Albert Einstein-Allee 11,
89081 Ulm. E-mail: [email protected].
Wir bitten, nur Kopien vorzulegen, da die Unterlagen nicht zurückgesandt werden;
diese werden nach Abschluss des Auswahlverfahrens vernichtet. Vorstellungskosten können nicht erstattet werden.
Bemerkungen: Das Labor zieht gerade von der Universität Marburg an die
Universität Ulm.
Neben naturwissenschaftlichen Doktoranden werden auch Diplomanden /
medizinische Doktoranden und Postdocs gesucht.
Die Universität Ulm bietet Stipendien für Medizinstudierende an, die Aufgrund
einer experimentellen Doktorarbeit mit dem Studium temporär aussetzen.
Auch für Diplomanden bzw. Masterarbeiten sind bei entsprechender Eignung
Stipendien möglich!
Interesse? Ansprechpartner: Prof. Dr. Birgit Liss, Telefon: 0731 500 23115
E-mail: [email protected]
Internet: http://www.uni-ulm.de/med/med-allgphys.html
LABORWELT
S T E L L E N M A R K T
Paul-Ehrlich-Institut
Paul-Ehrlich-Straße 51 - 59,
63225 Langen, Telefon (06103) 77-11 00
Im Institut für Pharmakologie und Toxikologie des Universitätsklinikums Aachen ist ab dem frühestmöglichen Zeitpunkt für zunächst
2 Jahre befristet die Stelle eines/einer
wiss. Angestellten
mit der tariflich vereinbarten Arbeitszeit (zurzeit 38,50 Std./Wo.) neu
zu besetzen.
Das Arbeitsgebiet beinhaltet die Strukturaufklärung von Ligandengesteuerten Ionenkanälen (P2X-Rezeptoren) durch molekularbiologische, biochemische und biophysikalische Methoden (vorhanden:
heterologe Expression in Xenopus laevis-Oocyten, Säugerzellen
und Pichia pastoris, Membranprotein-Biochemie mit Spezialität BNPage. TVEC- und Patch-Clamp-Elektrophysiologie).
Erwartet werden eine qualifizierte Promotion in Proteinchemie oder
Molecular Modeling oder verwandtem Gebiet. Der ideale Kandidat
ist Naturwissenschaftler oder Humanmediziner, strebt eine Karriere
in biochemischer Pharmakologie an und hat ein starkes Interesse
für Proteinstrukturen.
Die Vergütung richtet sich nach den Bestimmungen des TV-L mit
den im öffentlichen Dienst üblichen sozialen Leistungen.
Die RWTH Aachen ist für ihre Bemühungen um die Gleichstellung
von Mann und Frau mit dem “Total-E-Quality-Award“ ausgezeichnet
worden. Bewerbungen von Frauen sind ausdrücklich erwünscht.
Bei gleicher Eignung, Befähigung und fachlicher Leistung werden
Frauen bevorzugt berücksichtigt, sofern nicht in der Person eines
Mitbewerbers liegende Gründe überwiegen. Auf § 8 Abs. 6
Landesgleichstellungsgesetz NW (LGG) wird verwiesen.
Die RWTH Aachen ist für ihre Bemühungen um die Ausbildung und
Beschäftigung schwerbehinderter Menschen mit dem “Prädikat
behindertenfreundlich“ ausgezeichnet worden. Bewerbungen geeigneter schwerbehinderter Menschen sind ausdrücklich erwünscht.
Dies gilt auch für Gleichgestellte im Sinne von § 2 SGB IX.
Nähere Informationen per e-mail unter: [email protected]
oder unter der folgenden Rufnummer: 0241/80-89130.
Schriftliche Bewerbungen mit den üblichen Unterlagen werden
innerhalb von 14 Tagen nach Erscheinungsdatum dieser Anzeige erbeten an Herrn Univ.-Prof. Dr. Schmalzing, Institut für
Pharmakologie und Toxikologie, Universitätsklinikum Aachen,
Wendlingweg 2, 52074 Aachen.
MAX-PLANCK-INSTITUT
FÜR ENTWICKLUNGSBIOLOGIE
We are in search of a
Diploma or Ph. D. Student
for a project aiming at deciphering the ontogeny of the highly variable color
pigment pattern of male guppies (Poecilia reticulata).
The project comprizes cloning of candidate genes known to be involved in
regulation of pigment patterns of other vertebrates, identification of neural crest
cells in embryogenesis by means of in situ hybridization, genetic and molecular
analysis of genes involved in pigmentation. Our ongoing genome mapping project
of the guppy will aid identification of loci relevant for male ornamentation.
We offer working in a highly interactive international team involved in research
on various aspects of natural variation and evolution.
Max-Planck-Institut für Entwicklungsbiologie, Prof. Dr. Christine Dreyer,
Abt. VI für Molekularbiologie, 72011 Tübingen, Postfach 2109
Tel.: (07071) 601 1415, Fax: (07071) 601 1412
e-mail: [email protected]
http://www.eb.tuebingen.mpg.de/dept6/dreyer/home.html
http://www.weigelworld.org/research/projects/guppyvariation/
LABORWELT
Das Paul-Ehrlich-Institut ist eine wissenschaftliche Einrichtung des Bundes, die
als Bundesoberbehörde für die Zulassung und Chargenprüfung immunbiologischer Arzneimittel zuständig ist und auf den damit verbundenen Gebieten der
Lebenswissenschaften (z.B. Virologie, Bakteriologie, Allergologie, Immunologie,
Medizinische Biotechnologie, Hämatologie) Forschung betreibt.
In der Forschungsgruppe der Abteilung Virologie ist zum nächstmöglichen
Zeitpunkt nachstehende Position zu besetzen:
Wissenschaftliche(r) Mitarbeiter/-in
(Doktorand/-in)
Stellenbewertung: E 13/2 TVöD
Bewerbungskennziffer: 25/07
Aufgabenprofil:
In dem Teilprojekt 7 „Host susceptibility to H1 and H9 influenza subtypes in
mammalian species” des FLURESEARCHNET sollen in Kooperation mit dem
Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung (HZI) in Braunschweig Influenzavirus
H9N2-Subtypen und -Reassortanten in vitro und in vivo analysiert werden.
Das Ziel des vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) geförderten Influenza-Forschungsnetzwerkes „FLURESEARCHNET – Molecular
signatures determining pathogenicity and species transmission of influenza
A viruses“ ist die Integration der gesamten nationalen Expertise (Grundlagenforschung, klinische Virologie und Veterinärmedizin) zur Untersuchung des
zoonotischen Potenzials von Influenza-A-Viren.
Aufgabe der Promotionsarbeit ist die Charakterisierung verschiedener H9N2
Virusisolate in etablierter Zellkultur, in primären Hühnerfibroblasten und
embryonierten Hühnereiern. Mittels der reversen Genetik sollen im Anschluss
Influenzavirus-Reassortanten hergestellt werden, um Virulenzfaktoren replikationskompetenter Subtypen zu analysieren.
Anforderungsprofil
– Abgeschlossenes Studium der Biologie, Biochemie, Humanbiologie, Molekulare Medizin oder verwandtem Studiengang.
– Kenntnisse in allen gängigen gentechnologischen bzw. biochemischen
Methoden der modernen molekularbiologischen Charakterisierung und der
zielgerichteten Herstellung genetischer Konstrukte (Klonierungsverfahren)
sind wünschenswert.
– Praktische Erfahrung im Umgang mit Influenzaviren oder anderen RNA-Viren
sind wünschenswert.
– Interesse an virologischen Fragestellungen
– Team- und Organisationsfähigkeit, Leistungsbereitschaft
Das Beschäftigungsverhältnis ist vorerst auf drei Jahre befristet. Die wöchentliche Arbeitszeit beträgt 39 Stunden.
Die Eingruppierung erfolgt nach den tariflichen Bestimmungen des TVöD. Auswärtigen Bewerbern ist das Paul-Ehrlich-Institut bei der Wohnraumbeschaffung
behilflich. Trennungsgeld und Umzugskosten werden nach den gesetzlichen
Vorschriften gewährt.
Schwerbehinderte werden bei gleicher Eignung bevorzugt berücksichtigt.
Das Paul-Ehrlich-Institut fördert die Gleichstellung von Frauen und Männern
und ist daher an Bewerbungen von Frauen interessiert.
Bitte richten Sie Ihre vollständigen Bewerbungsunterlagen bis zum
03.08.2007 an das Personalreferat des Paul-Ehrlich-Instituts.
8. Jahrgang | Nr. 4/2007 | 49
S T E L L E N M A R K T
GSF-National Research Center of Environment and Health
Ingolstädter Landstraße 1, 85764 Neuherberg
The GSF contributes to the foundation of Future Medicine and Health Care as well as Ecosystems, which are of critical importance for health. Our focus is on chronic
degenerative diseases like lung diseases, allergies, cancer, and cardiovascular diseases that are influenced to a large extent by environmental conditions, personal risk
factors, and life style. Therefore, in order to generatea knowledge base, we analyse interactions between genetic disposition, biological systems, and environmental
factors. This will lead to the development of new personalised approaches in prevention, diagnostics, and causal therapy – the future direction of medicine. Our
strategy is based on translational approaches that bridge basic research with clinical application to provide an immediate benefit to the patient. The GSF is a member
of the Helmholtz Association of German Research Centers.
The GSF as holder of the Bavarian Advancement of Women Prize 2004 and of the Total E-Quality Certificate is striving to increase the overall proportion of women on
its staff and thus expressly urges qualified women to apply.
The Institute of Molecular Virology (IMV) studies chronic virus infections and
their contributions to diseases in humans. We are seeking a
The group of Dr. Andrea Huber Brösamle “Neuronal Circuit Formation” at the
Institute of Developmental Genetics (IDG) is seeking to employ a
PhD student (d.7/07)
PhD Student (d.11/07)
interested in studying molecular mechanisms of the persistence of human
retroviruses (HIV, endogenous retroviruses).
Applicants should have a Masters or equivalent degree (i.e. „Diplom“) in an area
of life sciences and a strong interest in molecular virology. Experience in basic
laboratory techniques of molecular and cellular biology is essential. A background
in neurobiology would be helpful but is not a requirement.
We pay standard German salary EG 13/2 TVöD.
The position is limited to three years.
Please send your Curriculum Vitae, the names and addresses of two references, a summary of your research experience and a short statement
outlining your interest in this position to: Prof. Dr. Ruth Brack-Werner,
GSF-National Research Center for Environment and Health Institute of Molecular Virology (IMV), Ingolstädter Landstrasse 1, D-85764 Neuherberg
For questions please refer to: Prof. Dr. Ruth Brack-Werner, [email protected]
Futher info: www.gsf.de/imv/
The Institute of Biochemical Plant Pathology (BIOP) is seeking a
PhD Student (d.8/07)
for Electrophoresis (2D-PAGE) of protein extracts originating from plant tissues, monitoring of differential protein expression in response to biotic and
a-biotic stress, characterisation of proteins by means of mass spectrometry
(MS/MS) including sequencing de novo in co-operation with the GSF-National
Research Centre for Environment and Health, and the University of Bordeaux.
Applicants should have a Masters or equivalent degree (i.e. „Diplom“) in biology or biochemistry.
We pay standard German salary EG 13/2 TVöD.
The position is limited to three years.
developmental wiring defects using behavioral paradigms, cell culture assays as
well as in vivo imaging techniques.
We are interested in the molecular mechanisms of establishment and maintenance
of neuronal connections during development and in the adult nervous system. We
are studying the consequences of developmental wiring defects using behavioral
paradigms, cell culture assays as well as in vivo imaging techniques.
We are a well-equipped laboratory with excellent core facilities and state of the
art equipment in a young, dynamic, and very interacitve environment.
We pay standard German salary EG 13/2 TVöD. The position is limited to three
years.
Please send your curriculum vitae to: Dr. Andrea Huber Brösamle, GSF-National
Research Center for Environment and Health Institute of Developmental Genetics (IDG), Ingolstädter Landstraße 1, D-85764 Neuherberg
For questions please refer to: Dr. Andrea Huber Brösamle, [email protected]
Futher info: www.gsf.de/idg/groups/neuronal_circuit_formation/start.html
The group of Dr. Esther Mahabir-Brenner „Reproductive Biology and Microbiology“
at the Department of Comparative Medicine (AVM) is seeking a
PhD Student (d.12/07)
as soon as possible for a project which has the goal of investigating the risk of
transmission of pathogens via assisted reproductive techniques (ARTs) in the
mouse. The candidate will be involved in all aspects of the relevant ARTs including
cryopreservation of spermatozoa and embryos, superovulation, in vitro fertilization,
flushing and collection of embryos and embryo transfer. Biological samples will be
collected for analysis using molecular biological and cell culture techniques.
Applicants should have completed their studies in Veterinary Medicine. Willingness
to work in a team, computer literacy, English proficiency, and the ability to meet
deadlines are necessary. Successful candidates have the possibility of doing their
Specialization in Laboratory Animal Science.
We pay standard German salary EG 13/2 TVöD. The position is limited to three
years.
Interested candidates should send their CV and a letter describing research
interests and experience to: Dr. Dietrich Ernst, GSF-National Research Center
for Environment and Health Institute of Biochemical Plant Pathology (BIOP),
Ingolstädter Landstraße 1, D-85764 Neuherberg
Please send your curriculum vitae to: Dr. Esther Mahabir-Brenner, GSF-National
Research Center for Environment and Health Department of Comparative
Medicine (AVM), Ingolstädter Landstraße 1, D-85764 Neuherberg
For questions please refer to: Dr. Dietrich Ernst, [email protected]
Futher info: http://www0.gsf.de/biop/
For questions please refer to: Dr. E. Mahabir-Brenner, [email protected]
Futher info: www.gsf.de/avm/
50 | 8. Jahrgang | Nr. 4/2007
LABORWELT
S T E L L E N M A R K T
EuroFerm GmbH | IZMP Erlangen
1 Technische Assistenten (TA) Stelle
Für den Neubezug unseres Zellkulturlabors Labors im IZMP in Erlangen ist zum nächstmöglichen Termin eine Stelle einer/eines biol./med. oder
pharm. techn. Assistentin/en für die Zeitdauer von zunächst 2 Jahren zu besetzen.
Anforderungen I Aufgaben
Voraussetzung
•
Abgeschlossene Berufsausbildung als technische/r
Assistentin/Assistent
•
Kenntnisse in der Insektenzellkultur sind wünschenswert
•
Grundlagen im Umgang mit Computer werden vorausgesetzt
•
•
•
Betreuung der Stammhaltung
Vorbereitung und Durchführung von
Fermentationsprozessen im Kleinstmaßstab
allgemeine Labororganisation
Falls Sie sich tatkräftig in unser junges Unternehmen einbringen möchten freuen wir uns auf ihre Bewerbung.
Ihre schriftliche Bewerbung richten Sie bitte an:
EuroFerm GmbH, Dr. Ing. Peter Fischer
Henkestraße 91, 91052 Erlangen
Für Rückfragen wenden Sie sich bitte an:
Dr. Ing. Peter Fischer,
Telefon: 09131-977949-0, e-mail: peter.fi[email protected]
Weitere Informationen finden Sie auf unserer Homepage: www.Euroferm.de
Kontakt zu Verbänden
Im Jahr 2007 erscheint LABORWELT zweimonatlich, IVW geprüft. Alle Abonnenten des Branchen-Magazins |transkript sowie die
Mitglieder der nachfolgenden Gesellschaften erhalten LABORWELT regelmäßig mit freundlicher Empfehlung ihrer Organisationen.
Wer sich darüber hinaus für einen Beitritt interessiert, erreicht die Gesellschaften unter folgenden Kontaktdaten:
bts (Biotechnologische Studenteninitiative e.V.)
DECHEMA
Fachsektion Biotechnologie
Theodor-Heuss-Allee 25
60486 Frankfurt/Main
Tel.: +49-(0)-69-7564-289
Fax: +49-(0)-69-7564-272
www.dechema.de
Deutsche Gesell. für Proteomforschung
c/o MPI für Biochemie
Am Klopferspitz 18a
82152 Martinsried
Tel.: +49-(0)-89-8578-3964
Fax: +49-(0)-89-8578-2802
[email protected]
www.dgpf.org
Österreichische Gesell. für Biotechnologie
c/o Boehringer Ingelheim
Austria GmbH
Dr. Boehringer-Gasse 5-11
A-1121 Wien
Tel.: +43-(0)-1-80105-2311
Fax: +43-(0)-1-80105-9311
www.boku.ac.at/oegbt/
Deutsche Gesellschaft für Genetik
c/o Genetisches Institut
der Universität Gießen
Heinrich-Buff-Ring 58-62
35392 Gießen
Tel.: +49-(0)-641-99-35463
Fax: +49-(0)-641-99-35469
www.gfgenetik.de
Gesellschaft für Signaltransduktion
c/o Prof. Dr. Ralf Hass
Med. Hochschule Hannover
AG Biochemie u. Tumorbiol.
30625 Hannover
Tel.: +49-(0)-511-532-6070
Fax: +49-(0)-511-532-6071
www.sigtrans.de
Gesellschaft für Pharmakologie u.Toxikologie e.V.
DGHM
c/o Gesellschaft für
Hygiene & Mikrobiologie
Josef-Schneider-Str. 2
97080 Würzburg
Tel.: +49-(0)-931-201-46936
Fax: +49-(0)-931-201-46445
www.dghm.de
LABORWELT
c/o BIOCOMMUNICATIONS.
net GmbH
Brunnenstr. 128,13355 Berlin
Tel.: +49-(0)-2649-21-21
Fax: +49-(0)-2649-21-11
www.bts-ev.de
Geschäftsstelle der DGPT
Achenbachstr. 43
40237 Düsseldorf
Tel.: +49-(0)-211-600-692-77
Fax: +49-(0)-211-600-692-78
[email protected]
www.dgpt-online.de
Nationales Genomforschungsnetz
c/o DLR – Koblenzerstr. 112
53177 Bonn-Bad Godesberg
Tel.: +49-(0)-228-3821-331
Fax: +49-(0)-228-3821-332
[email protected]
www.ngfn.de
Deutsche Gesellschaft für Neurogenetik
c/o Institut für Humangenetik
Uni Gießen/Schlangenzahl 14
35392 Gießen
Tel.: +49-(0)-641-99-41600
Fax: +49-(0)-641-99-41609
www.med.uni-giessen.de
/genetik/dgng.html
Netzwerk Nutrigenomforschung
Arthur-Scheunert-Allee 114
14558 Bergholz-Rehbrücke
Tel.: +49-(0)-33200 88 385
Fax: +49-(0)-33200 88 398
[email protected]
www.nutrigenomik.de
Netzwerk RNA-Technologien
c/o Prof. Dr. Volker A. Erdmann
Freie Universität Berlin
Thielallee 63, 14195 Berlin
Tel.: +49-(0)-30-8385 6002
Fax: +49-(0)-30-8385 6413
[email protected]
www.rna-network.com
8. Jahrgang | Nr. 4/2007 | 51
P R O D U K T W E L T
Kennziffer 26 LW 04 · Informationen ordern? · www.biocom.de

Stabilisierung von ELISA-Platten: Liquid Plate Sealer
Langzeit-Stabilität – auch bei Stress-Temperaturen – gehört zu den kritischen Anforderungen für viele Immunoassays in
Forschung und Routine. Die Qualität von
Assay-Komponenten sollte also auch dann
gewährleistet bleiben, wenn die Lager- und
Versandbedingungen nicht immer optimal
kontrollierbar sind. Anderenfalls kann
es zu Fehlbestimmungen oder unklaren
Ergebnissen kommen, die vermeidbar
wären. Eine innovative Lösung für diese
Anforderung ist der Liquid Plate Sealer™
der Firma Candor Bioscience. Stress-Tests
haben eine deutlich bessere Stabilität bei
Verwendung von Liquid Plate Sealer™ im
Vergleich zu Produkten gezeigt, die bislang
routinemäßig von ELISA-Kit-Produzenten
eingesetzt werden.
Sowohl in Tests des Unternehmens als
auch von externen Laboren hat der Liquid
Plate Sealer™ seine Überlegenheit gegenüber anderen Stabilisierungs-Produkten
unter Beweis gestellt. Liquid Plate Sealer™
ersetzt als „ready-to-use-Lösung“ bisherige
Stabilisierungs-Reagenzien und verlängert
die Lagerstabilität sowohl bei feuchter als
auch bei trockener Lagerung der ELISAPlatten. Die Lösungen von CANDOR sind
in diversen Kits für ELISAs, Western Blots,
Protein Arrays oder Lateral Flow-Assays
kommerziell erhältlich.
Kennziffer 28 LW 04 · Informationen ordern? · www.biocom.de

Neues Verfahren zur Pflege und Instandhaltung
von Substanz-Banken
Die britische Genevac Ltd. hat einen neuen
Anwenderbericht vorgestellt, in dem die Rolle
der „high performance“-Zentrifugal-Evaporation bei der Herstellung von „Trockenfilmen“
diskutiert wird. Die relativ neue Methode
beschäftigt sich vor allem mit der Integrität
von Proben und den physikalischen Lagerungsproblemen bei der Pflege und Wartung
von Substanzbibliotheken.
Kleinere pharmazeutische Unternehmen
haben in der Regel nicht die Möglichkeit,
spezielle, automatisierte „Handling-Lösungen“ zu etablieren, um die Probleme zu
vermeiden, die bei der Lagerung der Proben
in dem Lösungsmittel DMSO auftreten
können.
LABORWELT
In dem Bericht wird ein neuer Hochdurchsatz-Prozess zur Herstellung von Substanzbibliotheken auf Trockenfilm-Basis vorgestellt,
die für eine Langzeit-Lagerung validiert
wurden. Neben der Beschreibung, wie die
Substanzen gelöst werden und wie von 96er
auf 384er-Mikrotiterplatten reformatiert
wird, enthält der Bericht auch Angaben zur
Methode, mit der Genevacs DD-4X-Zentrifugal-Evaporator die anschließende Trocknung
der Substanzen durchführt, die danach bei
Raumtemperatur gelagert werden können.
Genevac DD-4X ermöglicht ein schnelles und
sicheres Evaporieren von bis zu sechzehn Platten im 384er-Format – bis zur vollständigen
Trocknung werden bei 40° C nur 25 Minuten
benötigt, eine deutliche Reduktion der Zeit
zur Herstellung der Substanzen. Dabei
produziert das Verfahren genug Trockenfilm„Assay Sets“ für mindestens zehn Screens.
Auch schwierige oder empfindliche Proben sind kein Problem für DD-4X. Die Kombination einer „high performance“-Pumpe
mit Hochleistungs-IR-Lampen erlaubt die
schnelle Entfernung der meisten Lösungsmittel. Das System lässt sich aufgrund des
großen Spektrums an Halterungen für
Röhrchen, Vials, Mikroplattenstacks und
weiterem Zubehör flexibel einsetzen.
Kennziffer 27 LW 04 · www.biocom.de

Produktive
Probenaufbereitung
Porvair Sciences Ltd. (www.porvair-sciences.
com) bietet Systeme auf Mikroplattenbasis
an, die zu entscheidenden Produktivitätssteigerungen bei der Festphasenextraktion
(SPE) und der Kombinatorischen Chemie
beitragen können.
Microlute™ ist ein System im 96-wellFormat für die Probenbereitung mit hohem
Durchsatz, das sich in zahlreichen Anwendungsbereichen einsetzen lässt, wie etwa
bei LC/MS/MS-Bioanalyseuntersuchungen.
Für Arzneimittelentwicklungs-, Lebensmittel- und Umweltlabors, die zur Bearbeitung
großer Probenmengen SPE-Kartuschen
verwenden, bietet MaxiLute™ ein 48 wellMikroplattensystem zur Festphasenextraktion, mit dem bis zu 200 ml Probenmaterial
wiederholt und präzise in einem Durchlauf
bearbeitet werden können. MaxiLute ist vollständig mit automatisierten Liquid Handlingund Roboter-Systemen kompatibel.
Kennziffer 29 LW 04 · www.biocom.de

Neue Reportergen-Assays
PerkinElmer hat zwei seiner Luciferase-basierten Reportergen-Assays optimiert. Im
Gegensatz zu Reportergen-Assays, die die
Original-Firefly-Luciferase (aus Photinus
pyralis) einsetzen, die ein für den HTSBereich zu kurzlebiges Lichtsignal liefern,
erzielt Steadylite Plus eine Halbwertszeit des
Lumineszenzsignals von fünf Stunden und
eine Detektionsgrenze im Femtogramm-Bereich. Britelite Plus bietet eine Halbwertszeit
von etwa 30 Minuten, ist aber fünfmal sensitiver als Steadylite Plus. Die Detektionsgrenze
liegt im Sub-Femtobereich. Somit sind beide
Assays perfekt auch an hochauflösende
Plattenformate ( bis 1.536 Wells) angepasst.
Die beiden DTT-freien, geruchsneutralen
und nicht gesundheitsschädigenden Kits
sind homogene Assays, Waschschritte oder
Medienwechsel entfallen daher. Durch eine
optimierte Stabilisierung können sie bei 2-8°C
gelagert werden.
8. Jahrgang | Nr. 4/2007 | 53
S
LABORWELT (ISSN 1611-0854)
erscheint zweimonatlich im Verlag der
BIOCOM AG
Stralsunder Str. 58-59
D- 13355 Berlin
Tel./Fax: 030/264921-0 / 030/264921-11
eMail: [email protected]
Internet: www.biocom.de
Redaktion:
Dipl.-Biol. Thomas Gabrielczyk
Tel.: 030/264921-50
Anzeigenleitung:
Oliver Schnell
Tel.: 030/264921-45, eMail: [email protected]
Leserservice:
Angelika Werner
Tel. 030/264921-40
Bildtechnik und Layout:
Heiko Fritz
Graphik-Design:
Michaela Reblin
Druck
Mayer & Söhne, D- 86551 Aichach
Mitglieder der DECHEMA-Fachsektion
Biotechnologie, der Österreichischen
Gesellschaft für Biotechnologie ÖGBT, der
Gesellschaft für Genetik GfG, der Deutschen
Gesellschaft für Proteomforschung DGPF, der
biotechnologischen Studenteninitiative btS,
der Deutschen Gesellschaft für Neurogenetik
DGNG, der Deutschen Gesellschaft für
Pharmakologie und Toxikologie DGPT,
der Gesellschaft für Signaltransduktion
STS, des Vereins zur Förderung der
Nutrigenomforschung, der Deutschen
Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie
DGHM, des RiNA RNA-Netzwerkes sowie
die Wissenschaftler des Nationalen
Genomforschungsnetzes NGFN erhalten die
Zeitschrift im Rahmen ihrer Mitgliedschaft.
Für einen regelmäßigen Bezug von
LABORWELT ist eine kostenlose
Registrierung unter www.biocom.de oder per
Fax (siehe Seite 52) erforderlich.
Namentlich gekennzeichnete Beiträge
stehen in der inhaltlichen Verantwortung der
Autoren. Alle Beiträge sind urheberrechtlich
geschützt. Ohne schriftliche Genehmigung
der BIOCOM AG darf kein Teil in irgendeiner
Form reproduziert oder mit elektronischen
Systemen verarbeitet, vervielfältigt oder
verbreitet werden.
R
V
I
C
E
26.-29.08.07: Plants for Human Health in the Post
Genomic Era, Helsinki (FI)
Info: Annemari Kuokka-Ihalainen, Phytochemical Society of
Europe (E-Mail: annemari.kuokka@vtt.fi,
Web: www.phytochemicalsociety.org/helsinki)
29.-31.08.07: EPFL Life Science Symposium,
Neuroscience: Molecules, Systems and Diseases,
Lausanne (CH)
Info: (Web: http://lss07.epfl.ch/)
01.-04.09.07: ELSO 2007, Dresden
Info: (Web: www.elso.org)
03.-09.09.07: Biotech & Pharma Business
Summer School, Berlin
Info: Dr. Ulrich Scheller, Gläsernes Labor
(Tel.: +49-9489-2943, E-Mail: [email protected],
Web: www.glaesernes-labor.de)
05.09.07: FDA-Zulassungen von
Medizinprodukten, Hamburg
Info: TuTech Innovation GmbH
(Tel.: +49-40-76629-6346,
E-Mail: [email protected], Web: www.tutech.de)
09.-12.09.07: Proteomics Workshop 2007,
Würzburg
Info: Dr. Katrin Denker, Universität Würzburg
(Tel.: +49-931-201-48736, E-Mail: katrin.denker@virchow.
uni-wuerzburg.de, Web: www.proteomics-workshop.de)
11.-13.09.07: European BioPharm Scale-up 2007,
Genf (CH)
24.-25.09.07: 5th Fraunhofer-Symposium on Text
Mining, Bonn
Info: Fraunhofer-Institut SCAI (Web: www.scai.fraunhofer.de)
25.-26.09.07: Bioforum 2007 – Where Science
Meets Business, Milano (IT)
Info: Bioforum/ITER, Milano (Tel.: +39-02-283-1161,
E-Mail: [email protected], Web: www.bioforum.it/en)
30.09.-04.10.07: 59. Jahrestagung der Deutschen
Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie
(DGHM), Göttingen
Info: (Web: www.dghm2007.de)
02.-04.10.07: L.A.B. 2007, London (UK)
Info: Dietrich Meier, Messe Leipzig GmbH/SPECTARIS e.V.
(E-Mail: [email protected], Web: www.lab-uk.de)
02.-04.10.07: ICSE 2007 - International Contract
Services Expo, Milano (IT)
Info: (E-Mail: [email protected], Web: www.icsexpo.com)
04.-06.10.07: 3rd Annual Meeting of the
Oligonucleotide Therapeutics Society, Berlin
Info: Stefan Bauer, RiNA Netzwerk RNA-Technologien GmbH
(Tel.: +49-30-844-166-34, E-Mail: [email protected], Web: www.ots-symposium.org/index.html)
04.-06.10.07: 2. Kongress der Deutschen Gesellschaft für Stammzellforschung, Würzburg
Info: Meike Weber, Julius-Maximilians-Universität Würzburg
(Tel.: +49-931-803-1584, E-Mail: [email protected], Web: www.kmb-lentzsch.de/gsz2007)
Info: Bianca Geldenhuys, Terrapinn Ltd.
(Tel.: +44-207-092-1224, Fax: +44-207-092-2320,
E-Mail: [email protected],
Web: www.terrapinn.com/2007/biopharm/)
07.-10.10.07: ProkaGENOMICS 2007, Göttingen
12.-16.09.07: EMBO Conference on Protein
Synthesis and Translational Control– partnered
with Cold Spring Harbor Laboratories, Heidelberg
08.-09.10.07: 4th International Meeting Stem Cell
Network NRW, Düsseldorf
12.-13.09.07: Biomarkers in Drug Development,
London (UK)
09.-11.10.07: BIOTECHNICA, Hannover
Info: Bettina Schäfer, EMBL Heidelberg
(E-Mail: [email protected],
Web: www-db.embl.de/jss/EmblGroupsOrg/conf_54)
Info: Heike Geiling, DECHEMA e.V.
(Tel.: +49-69-7564-176, E-Mail: [email protected],
Web: www.dechema.de/prokagenomics2007)
Info: Ira Herrmann, Kompetenznetzwerk Stammzellforschung
NRW (Tel./Fax: +49-211-896-4042/-4050,
E-Mail: [email protected],
Web: www.kongress.stammzellen.nrw.de)
Info: ACI Communications Int. (Tel.: +44 20 7368 3360,
E-Mail: [email protected], Web: www.acius.net)
Info: Oliver Wedekind, Deutsche Messe AG
(Tel.: +49-511-89-321-28, E-Mail: [email protected],
Web: www.biotechnica.de)
16.-19.09.07: Molecular Life Sciences 2007,
Hamburg
09.-10.10.07: 3. BMBF-Symposium Nanobiotechnologie, Hannover
Info: Ulrich Hahn/Georg W. Mayr, GBM e.V.
(Tel./Fax: +49-69-660-567-0/-22,
E-Mail: [email protected],
Web: www.gbm-online.de/Tagungen/Herbsttagung/
2007Hamburg)
18.-19.09.07: User Meeting
Kapillarelektrophorese, Basel (CH)
Info: Beckman Coulter
(E-Mail: [email protected],
Web: www.beckmancoulter.com)
Info: (Web: www.nanobio.de/symposium2007)
10.10.07: How to realize drug manufacture,
Basel (CH)
Info: Ulrike Liebert, LSMW GmbH (Tel.: +49-711-8804-2835,
E-Mail: [email protected], Web: www.lsmw.com)
16.-18.10.07: GVC/DECHEMA-Jahrestagungen
2007, Aachen
Info: DECHEMA e.V., Frankfurt/M.
(Tel./Fax: +49-69-7564-152/-176, Web: www.dechema.de)
20.09.07: Qualitätsgerechte Probenahme in
Chemie und Umwelt, Berlin
23.-25.10.07: Focused Compound Libraries 2007,
Frankfurt am Main
21.-28.09.07: Nanobiotechnology and
Nano-Medicine, Münster
24.-25.10.07: Virtual Discovery, London (UK)
Die Druckauflage von 20.000
Exemplaren ist IVW-geprüft:
Info: Dr. Johann S. Ach, Zentrum für Bioethik, Universität
Münster (E-Mail: [email protected],
Web: www.uni-muenster.de/Bioethik)
© BIOCOM AG, Berlin
® BIOCOM ist eine geschützte Marke der
BIOCOM AG, Berlin
23.-26.09.07: Experimental Standard Conditions
of Enzyme Characterizations – 3rd international
Symposium, Rüdesheim
29.-30.10.07: PAT-Based Downstream Protein
Purification, Hoofddorp (NL)
BIOCOM® AG
54 | 8. Jahrgang | Nr. 4/2007
Info: Sule Ramzi, Haus der Technik e.V., Essen
(Tel./Fax: +49-201-1803-345/-346,
E-Mail: [email protected], Web: www.hdt-essen.de)
Info: Carsten Kettner, Beilstein-Institut
(Tel.: +49-69-7167-3221,
E-Mail: [email protected],
Web: www.strenda.org/escec3.html)
Info: Ulrike Potratz, IQPC Gesellschaft für Management
Konferenzen mbH (Tel.: +49-30-209-13406/-1340,
E-Mail: [email protected], Web: www.iqpc.de)
Info: Karen Saunders, Select Biosciences
(Tel.: +44-1787-315-110,
E-Mail: [email protected],
Web: www.selectbiosciences.com/conferences/rnaieurope07/)
Info: CFPA (Tel.: +31-20-638-28-06,
E-Mail: [email protected], Web: www.cfpa.com)
Kennziffer 24 LW 04· www.biocom.de

Impressum
E
LABORWELT
THE PRIME ELEMENT
THE PRIME ELEMENT
OUTSOURCING
OUTSOURCING
CLINICAL
CLINICAL
TRIALS
TRIALS
C ON T RAC T
CREONS ETARAC
RC HT
RE S E A RC H
B IOT E C H NO L O G Y
B IOT E C H NO L O G Y
F
FS
S
OF SUCCESSFUL
OF SUCCESSFUL
IS CHOICE
IS CHOICE
IT
IT
IND
IU NP DP
UPP
IT
LI YT
LY
C U S TO M
S TOT M
M A NCUUFAC
URING
M A N U FAC T U R I N G
IN
AI TN
AT
LARG
IL CASRE G
ICSE
M EDICAL
MDEVICES
EDICAL
DEVICES
E
E2 0 0 7
2007
For more information please contact
For more information please contact
The ICSE sales team at +31 346 559429
The ICSE sales team at +31 346 559429
or e-mail to [email protected]
or e-mail to [email protected]
October 2-4
OF i e cr a tMoi l abn oe, Mri l a n2, I-t a l4y
F i eWr aWM. i Il aC nSo ,E M
W
X iPl aOn ., CI tOa lMy
W W W. I C S E X P O . C O M
2007
OFFERING CHOICE IN PHARMACEUTICAL OUTSOURCING
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M0202S/L
�
M0202T/M
M2200S/L
For ligation of cohesive or blunt-end DNA
fragments in 5 minutes at room temperature.
See our website for more details.
r = Recombinant
*NEB ligase products are BSA-free
�
�
�
Quality – Highly pure enzyme with no lot-to-lot variation
Convenience – Choose original T4 DNA Ligase or the
Quick Ligation Kit to meet the demands of a variety of
reaction conditions
Flexibility – Active at room temperature or 16°C; reaction
times run from 5 minutes to overnight
Robustness – Active in a variety of reaction buffers
New England Biolabs, Inc. is an ISO 9001 certified company
I N T E R N E T- B E S T E L L U N G E N , N E U I G K E I T E N U N D T E C H N I S C H E I N F O R M AT I O N E N .
0
0.1
0.2
1.0
T4 DNA Ligase (µl)
Ligation of blunt-ended
HaeIII fragments of Lambda
DNA using various amounts
of T4 DNA Ligase (400,000
cohesive end units/ml) in
a 20 µl reaction volume.
Reactions were incubated
for 30 minutes at 16°C.
0
10
20 30
Time (min)
60
Ligation of HindIII fragments
(4-base overhang) of Lambda
DNA using 1 cohesive end
unit (1µl of 1:400 dilution) of
T4 DNA Ligase. Reactions
were incubated at 25°C.
www.neb-online.de
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� New England Biolabs GmbH
Frankfurt/Main Deutschland Tel. +49/(0)69/305-23140 Fax +49/(0)69/305-23149 email: [email protected]
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