produktlösung

[PRODUKTLÖSUNG]
Wat e r s Oa s i s µ E l u t i o n S P l aT t e N
■
Niedrige Elutionsvolumina von bis zu 25 µl
■
Ohne Einengen und Wiederaufnahme
■
Optimal für kleine Probenvolumina geeignet
■
Bis zu 15-faches Aufkonzentrieren
Pat ent iert e InNovat ion
Jetzt haben Sie die Möglichkeit, bei Festphasenextraktionen
Plattenformat liefert konzentrierte Extrakte, die direkt, ohne einen
verlässliche Aufreinigungen und Anreicherungen von Analyten
zeitraubenden Einengungsschritt, in Ihre LC/MS/MS injiziert werden
in sehr kleinen Probenvolumina (10-25 µl) bis zu einem
können.
Maximalvolumen von 375 µl durchzuführen. Die
Oasis®-µElutionsplatte von Waters bietet ein patentiertes*
Plattendesign, bewährte Oasis-Packungsmaterialien** und
unkomplizierte Protokolle, die hohe Wiederfindungsraten und
Extrakte mit hohem Reinheitsgrad liefern, in extrem niedrigen
Elutionsvolumina von bis zu 25 µl. Mit den Oasis-µElutionsplatten
erreichen Sie hervorragende Ergebnisse in kürzerer Zeit. Das
Eine Elution mit 25 µl ohne Einengen führt zu einer bis zu 15-fachen
Aufkonzentrierung der Analyten. Dies ermöglicht empfindliche,
robuste und reproduzierbare SPE-Ergebnisse. Wissenschaftler in den
Bereichen pharmazeutische Wirkstoffsuche und Wirkstoffentwicklung
können sauberste Extrakte aus ihren biologischen Proben herstellen
und so die Empfindlichkeit ihrer LC/MS/MS-Analysen erhöhen.
*US-Patent 6.723.236
** US-Patente 5.882.521 (1996), 5.976.376 (1998), 6.106.721 (1999), 6.254.780 (2001), 6.322.695 (2001), 6.468.422 (2002), 6.726.842 (2004),
6.773.583 (2004), 6.723.236 (2004), weitere Patente angemeldet.
Schnelle UND empfindliche Methode zur
Bestimmung von Ropinirol in Humanplasma
Ropinirol ist ein wirksames Medikament, das in den USA unter
dem Namen Requip® und in Europa als Adartrel® verkauft wird.
Es wird beim Restless-Legs-Syndrom und der Parkinson-Krankheit
verschrieben. Zur Bestimmung wurde eine bioanalytische Methode
entwickelt und validiert unter Verwendung von
Oasis-MCX-µElutionsplatten zur Probenvorbereitung und
Aufkonzentrierung sowie eines ACQUITY UPLC®/MS/MS-Systems
zur hochempfindlichen Detektion. Die erforderliche untere
Bestimmungsgrenze (LLOQ) von 0,005 ng/ml (5 pg/ml) für Ropinirol
in Humanplasma wurde sicher erreicht. Das Signal bei 0,005 ng/
ml ist mehr als 10-fach höher als das Signal in der Leerprobe;
die Vorgaben der FDA zur Festlegung der Bestimmungsgrenze in
bioanalytischen Methoden werden damit übererfüllt.
Bedingungen ACQUIT Y U PLC
Säule:
Column part number: Mobile Phase A:
Mobile Phase B:
Flussrate:
Gradient:
Injektionsvolumen:
Säulentemperatur: Probentemperatur: Probendiluent: Starke Nadelwaschlsg.: Schwache Nadelwaschlsg.:
Bestellnummer
96-Well-Sammelplatte: ACQUITY UPLC BEH C18,
2,1 x 50 mm, 1,7 µm
186002350
10 mM NH4COOH, pH 9
CH3OH
0,5 mL/min
Zeit Profil Kurve
(min) A (%)
B (%)
0,0
95 5
2,0 2
98 2,5 2
98 2,6
95 5
3,0 95 5
8 μL
45 °C
15 °C
CH3OH + 5% NH4OH
60:40 CH3CN:IPA + 0.5%
HCOOH (1200 μL)
95:5 H2O:CH3OH (500 μL)
6
6
6
6
6
186002481
Dieses Beispiel verdeutlicht zum einen die hohe Extraktionsleistung
und Kapazität des Mixed-Mode Kationenaustausch-Sorbens Oasis MCX
im µElutionsplattenformat und zum anderen die hohe Empfindlichkeit,
Geschwindigkeit und Spezifität, die durch eine Kombination der
ACQUITY-UPLC- und Quattro-Premier™-XE-MS-Systeme von Waters
Aus der UPLC®/MS/MS-Messung extrahiertes
Ionenchromatogramm für Ropinirol in einer Humanplasmaprobe
bei der Bestimmungsgrenze von 0,005 ng/ml
Ropinirol 0,005 ng/ml
Signal-Rauschverh. = 125
> 10-fache der Leerprobe
100
erreicht werden können.
1.76
261,2 > 113,8
1,29e4
0.55
%
Methode mit Oasis-MCX-96-Well-µElutionsplatten
0.25
0.44
0.33
0
Konditionieren:
200 µL CH3OH
0.83
0,40
0.97
0,80
1.27 1.36 1.48
1.12
1,20
1.97
1.64
1,60
2.12 2.23
2,00
2.41
100
2.77 2.87
2.57
2,40
2,80
261,2 > 113,8
1,29e4
Äquilibrieren:
Plasma-Leerprobe
200 µL H2O
%
Beladen:
600 µl verdünntes Humanplasma (300 µl
Plasma 1:1 verdünnt mit 4 % H3PO4 in H2O)
0.55
0.25
0
Waschen 1:
0.84
0.44
0,40
0,80
0.98
1.08
1.23 1.35
1,20
1.54
1.78
1.85
1,60
2.02
2.15
2,00
2.42
2,40
2,80
200 µL 2% CHOOH in H2O
Residuum
Eluieren:
1 x 25 µL 5% NH4OH in CH3OH
Standardkurve und Linearitätsdaten für Ropinirol
0,0
-5,0
0,0
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
10,0 ng/mL
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
10,0 ng/mL
20,0
Signalstärke
Waschen 2:
200 µL CH3OH
10,0
0,0
0,0
Geradenanpassung der Ropinirol-Standardkurve mit Gewic htung von 1/x2
von 0,005 ng/ml bis 10 ng/ml über 3,5 Größenordnungen
Korrelationskoeffizient: r = 0,999054, r2 = 0,998108
Gleichung der Kalibrierkurve: y = 2,20969 * x + 0,00746661
[PRODUKTLÖSUNG]
Einfac he Met hodik
Probenanreicherung:
bis zu 15-fache Aufkonzent rierung
Die Oasis-2x4-Methode ist ein einfacher, logischer Ansatz zur
0,5 ng/ml Risperidon
375 µl Probe, verdünnt mit 375 µl 4%iger H3PO4,
auf Oasis-MCX-Platten
%
0
Elution mit 25 µl
Wiederfindung = 98 %
11-fach erhöhtes Signal-Rauschverh.
17-fach erhöhte Peakfläche
0,20
0,40
0,60
411,2 > 191,2
2,17e6
Oasis-MCX-µElutionsplatte
15-fach aufkonzentriert
0,80
1,00
1,20
1,40
411,2 > 191,2
2,17e6
100
Elution mit 375 µl
Zwei Protokolle und vier Sorbentien bieten die Flexibilität zur
Extraktion von sauren, basischen und neutralen Verbindungen
mit hohen Wiederfindungsraten, bei gleichzeitiger Entfernung von
0,83
100
Auswahl des SPE-Sorbens und des SPE-Methodenprotokolls.
Matrixkomponenten, die bei der Analyse Störeffekte verursachen
können.
Die in diesem Flussdiagramm gezeigten einfachen Schritte führen zu
hohen Ausbeuten und Extrakten mit einem hohen Reinheitsgrad:
• Charakterisieren Sie den Analyten [neutral, sauer oder basisch; pKa]
Oasis-MCX-10-mg-Platte
• Wählen Sie eines der vier Oasis-Sorbentien aus
nicht aufkonzentriert
• Wenden Sie das entsprechende Protokoll an [1 oder 2]
1,00
• Bestimmen Sie die SPE-Ausbeuten per LC-Analyse
%
0,83
0
0,20
0,40
0,60
0,80
1,20
1,40
Oasis 2x4 optimierte Methodik für µ Elutionsplatten
Protokoll für Oasis-MCX-µElutionsplatte
Konditionieren:
Äquilibrieren:
Äquilibrieren:
Beladen:
Waschen 1:
200 µL 2% CHOOH in H2O
Waschen 2:
200 µL CH3OH
Eluieren:
Protokoll 2
anwenden
Probe vorbereiten
Probe vorbereiten
Konditionieren/Äquilibrieren
Probe laden
Konditionieren/Äquilibrieren
Probe laden
Waschen:
2% HCOOH
Waschen:
5% NH4OH
500 µL H2O
Beladen:
750 µl verdünntes Plasma
(375 µl Plasma 1:1 verdünnt
mit 4% H3PO4 in H2O)
Waschen 1:
Eluieren 1:
100% CH3OH
Waschen 2:
Eluieren 2: 5% NH4OH in
60:40 CH3CN:CH3OH
500 µL 2% CHOOH in H2O
500 µL CH3OH
Eluieren 1:
100% CH3OH
Neutralstoffe
Eluieren 2: 2% HCOOH in
60:40 CH3CN:CH3OH
Eluieren:
25 µL 5% NH4OH in
60:40 CH3CN:CH3OH
375 µL (125 µL x 3) 5% NH4OH
in 60:40 CH3CN:CH3OH
Injizieren:
Injizieren:
5 µL
Protokoll 1
anwenden
Konditionieren:
500 µL CH3OH
750 µl verdünntes Plasma
(375 µl Plasma 1:1 verdünnt
mit 4% H3PO4 in H2O)
Für Säuren
Für starke Basen
pKa 2-8:
pKa >10:
Oasis MAX verwenden Oasis WCX verwenden
Protokoll für Oasis-MCX-10-mg- Platte
200 µL CH3OH
200 µL H2O
Für Basen
Für starke Säuren
pKa 2-10:
pKa <1:
Oasis MCX verwenden Oasis WAX verwenden
5 µL
Base
Starke Säure
Säure
Starke Base
Wer schon einmal die Oasis-2x4-Methode mit Kartuschen angewandt
hat, wird feststellen, dass die eluotrope Stärke des letzten
Elutionsmittels in den oben beschriebenen Protokollen erhöht worden
ist. Hierdurch soll die Ausbeute bei kleinsten Elutionsvolumina
erhöht werden. Wir empfehlen für den Anfang eine 60:40-Mischung
von Acetonitril und Methanol anstatt 100 % Methanol. Diese
Mischung bietet die optimale Elutionsstärke, Viskosität und
Löslichkeitseigenschaften für hohe Ausbeuten bei verschiedensten
Analyten in nur 25 µl Elutionsvolumen.
Oasis-2x4-Met hode – Bestät igung des Konze pt s
Untersuc hung von Matrixeffekten
Wiederfindungstest
Bei Matrixeffekten* handelt es sich um eine Veränderung des
Um den logischen Ansatz, die Einfachheit und Effektivität der
Oasis-2x4-Methode nachzuweisen, wurden fünf Rattenplasmaproben
vorbereitet, die mit jeweils einem der zuvor charakterisierten, unten
aufgelisteten Testanalyten dotiert waren:
O
N
O
O
H
Imipramin (B)
pKa = 9,4, 2 ng/ml
O F
HO
F F F F
Nonafluorpentansäure
(st. S.) pKa < 0,5, 200 ng/ml
und können zu falschen Ergebnissen führen.
damit zusammenhängenden Matrixeffekte deutlich.
Quantitative A bsc hätzung von Matrixeffekten:
OH
F
F
Analysemethode, erhöhen die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen
Oasis-µElutionsplatten verringert die Plasmainterferenzen und die
Prednison (N)
10 µg/ml
F
Plasmaproben sind Phospholipide und Lysophospholipide als
Eine SPE-Aufarbeitung mit der Oasis-2x4-Methode in
H
O
Valethamat (q. A.)
pKa > 12, 2 ng/ml
F
OH
OH
H
N
einer Verstärkung des Signals (“Ionenverstärkung”) führen. In
Matrixeffekte verringern die Robustheit und Reproduzierbarkeit einer
Br–
N+
zu einer Abschwächung des Signals (“Ionensuppression”) oder
Hauptverursacher von Matrixeffekten identifiziert worden.**
Bestätigung des Konzepts: Rattenplasma dotiert mit Analyten
O
MS-Signals durch störende Komponenten in der Probe. Sie können
Matrixeffekte bei der Oasis-2x4-Methode – Bestätigung des Konzepts
O
Ibuprofen (S)
pKa = 5,2, 200 ng/ml
Leerwert-Matrix
(Keine Analyten)
Protokoll 1
Oasis
MCX
Standardlösung
(Analyt(en))
Protocol 2
Oasis
MAX
Oasis
WAX
Oasis
WCX
100
Matrixeffekte [%] = (
SPE-Ausbeute [%]
80
SignalDotierte Probe nach Extraktion
SignalStandardlösung
-1) x 100
60
� Die Zusammensetzung der Lösung
40
beider Proben sollte identisch sein
Matrixextrakt mit
Standards dotieren
20
� Rechnerische Matrixeffekte von <± 15 %
werden allgemein als akzeptabel angesehen
0
re
säu
B.)
tan
en
N)
or p
(st.
at
ham
let
N)
Va
n(
iso
dn
Pre
(S)
fen
pro
N)
Ibu
n(
iso
dn
Pre
flu
n(
iso
dn
na
No
Pre
(B)
in
am
i pr
N)
Im
n(
iso
dn
Pre
DOTIERT E Probe
nach Extraktion
.)
S
(st.
Elution: CH3OH
Jede Plasmaprobe wurde verdünnt (1:1, v/v) und mit Phosphorsäure
(4%ig in Wasser) angesäuert. Die entsprechenden Aliquots wurden mit
Oasis
WCX
30
20
10
0
let
Va
at
ham
fen
pro
re
-40
säu
-30
tan
en
-20
Ibu
-10
or p
wurden mit LC/MS/MS-Analyse bestimmt. Der neutrale Analyt wurde
Oasis
MAX
Oasis
WAX
flu
Mixed-Mode Ionenaustausch-Sorbens verarbeitet. Die SPE-Ausbeuten
Oasis
MCX
na
No
vorgeschlagenen Methodenprotokoll und dem vorgeschlagenen Oasis
40
in
am
i pr
Im
dem von der Oasis-2x4-Methode für den entsprechenden Probentyp
Ionensuppression Ionenverstärkung
Elution: 60:40 CH3CN:CH3OH + Modifier
Alle Matrixeffekte lagen unter dem von uns festgelegten
Akzeptanzkriterium von ± 15 %
mit allen vier Sorbentien verarbeitet.
* Neue und McDonald, Techn. Dokument v. Waters
** Chambers et al., J. Chromatogr. B, 2007, Jun 1;852 (1-2): 22-34
Beladba rk eit der μElut ions p lat t en
Die SPE-Beladbarkeit ist definiert als die Gesamtmasse an Analyten
und endogenen Probenbestandteilen, die vom Sorbensbett unter
SPE-Ausbeute für 200 ng/ml
Imipramin und 200 ng/ml
Atenolol mit Oasis-MCX-µElutionsplatte
Beispiel SPE-Ausbeute für polare
und unpolare Analyten in Plasma
Beladungsbedingungen zurückgehalten werden kann. Wenn die
Beladbarkeit des Sorbensbetts überschritten wird, findet ein
100
Durchbruch statt. Die physikochemischen Eigenschaften der
sogar wenn jede Kammer einer Oasis-µElutionsplatte nur 2 mg
Oasis-Sorbens enthält.
Zur Bestimmung der Kapazität der Oasis-µElutionsplatten wurden
80
Wiederfindung [%]
Oasis-Sorbentien sorgen für eine außergewöhnlich hohe Beladbarkeit,
60
40
20
0
Plasma- und Urinproben in steigenden Volumina (50 µl bis 350 µl
50
in 50-µl-Schritten) mit 200 ng/ml Imipramin (unpolare Base) und
200 ng/ml Atenolol (polare Base) dotiert. Die Plasmaproben wurden
350 µL
100
anschließend wurden die Proben auf die µElutionsplatte geladen. Die
80
Wiederfindung [%]
Wiederfindung wurde berechnet und für jedes Beladungsvolumen
SPE-Protokoll mit
200 250 300
Beispiel SPE-Ausbeute für polare
und unpolare Analyten in Urin
1:1 mit 4 % H3PO4 verdünnt und die Urinproben 1:1 mit H2O und
grafisch dargestellt.
100 150
Geladenes Plasmavolumen (unverdünnt)
60
40
20
0
Oasis MCX-96-Well-μElutionsplatte
50
100 150
200 250 300
350 µL
Geladenes Urinvolumen (unverdünnt)
Konditionieren:
200 µL CH3OH
Matrixeffekte für polare und
unpolare Analyten in Plasma
Äquilibrieren:
Beladen:
Verschiedene Volumina von:
- Plasma 1:1 verdünnt mit 4 % H3PO4 in H2O
- Urin 1:1 verdünnt mit H2O
Waschen 1:
200 µL 2% CHOOH in H2O
Waschen 2:
200 µL CH3OH
Eluieren:
2 x 25 µL 5% NH4OH in 60:40
CH3CN:CH3OH
Verdünnen:
Ionensuppression Ionenverstärkung
200 µL H2O
40
30
20
10
0
-10
-20
-30
-40
50
100 150 200 250 300
50 µL H2O
Atenolol (polar)
Injizieren:
Imipramine
(unpolar)
5 µL
350 µL
Geladenes Plasmavolumen (unverdünnt)
n=8
OASIS-96-W ELL-µELUTIONS PLATTEN (1/ Pac k.)
Beschreibung
Bestellnummer
Oasis HLB 30 µm
186001828BA
Oasis MCX 30 µm
186001830BA
Oasis MAX 30 µm
186001829
Oasis WCX 30 µm
186002499
Oasis WAX 30 µm
186002500
Oasis-Sorbensauswahlplatte, je 3 Reihen MCX, WAX, MAX und WCX
186004475
Oasis-µElutionsplatte
Vakuumstat ion fÜ r E x t rak t ions p lat t eN
Beschreibung
Menge
Bestellnummer
Vakuumstation für Oasis-96-Well-Platten
1/box
186001831
Vakuumstation-Kit A für Extraktionsplatten
(beinhaltet Vakuumstation, Auffangbehälter,
Verschlusskappe und 350-µl-Probensammelplatte)
WAT097944
Einweg-Auffangbehälter
25/Karton
WAT058942
Probensammelplatte, 350 µl
50/Karton
WAT058943
Verschlusskappe für 96-Well-Sammelplatte
50/Pack.
WAT058959
SPE-Vakuumpumpe, 115 V 60 Hz
725000417
SPE-Vakuumpumpe, 240 V 50 Hz
725000418
Kit mit Vakuumdichtungen, Kit beinhaltet: 2 Dichtungen
mit Schaumstoff, 2 orange O-Ringe
186003522
SPE-Vakuumpumpe
(mit zwei Manometern und Druckregelung)
Kit mit Vakuumdichtungen
Österreich und europäischer Export (Mittleres Südosteuropa, GUS und Mittlerer Osten) 43 1 877 18 07, Australien 61 2 9933 1777, Belgien 32 2 726 1000, Brasilien 55 11 5094 3788,
Kanada 1 800 252 4752 x2205, China 86 21 6879 5888, GUS/Russland +497 727 4490/290 9737, Tschechische Republik 420 2 617 1 1384, Dänemark 45 46 59 8080, Finnland 09 5659 6288,
Frankreich 33 1 30 48 72 00, Deutschland 49 6196 400600, Hongkong 852 29 64 1800, Ungarn 36 1 350 5086, Indien und indischer Subkontinent 91 80 2837 1900, Irland 353 1 448 1500,
Italien 39 02 265 0983, Japan 81 3 3471 7094, Republik Korea 82 2 6300 4800, Mexiko 52 55 5524 7636, Niederlande 31 76 508 7200, Norwegen 47 6 384 60 50, Polen 48 22 833 4400,
Puerto Rico 1 787 747 8445, Singapur 65 6273 7997, Spanien 34 93 600 9300, Schweden 46 8 555 11 500, Schweiz 41 56 676 70 00, Taiwan 886 2 2543 1898, Großbritannien 44 208 238 6100
Alle anderen Länder: Waters Corporation USA 1 508 478 2000 -1 800 252 4752
Waters, The Science of What’s Possible, Oasis, ACQUITY UPLC, UPLC
und Quattro Premier sind Marken der Waters Corporation. Alle anderen
Marken sind Eigentum der jeweiligen Inhaber.
©2008 Waters Corporation. Gedruckt in den USA
September 2008 720000467DE IH-DS
Waters Corporation
34 Maple Street
Milford, MA 01757 U.S.A.
T: 1 508 478 2000
F: 1 508 872 1990
www.waters.com