25-OH Vitamin D

25-OH Vitamin D
Ein Enzymimmunassay für die Quantifizierung von Gesamt-25-OH Vitamin D in Humanserum
Zusammenfassung des Assays
MicroVue™ 25-OH Vitamin D
Vorbereitung von Reagenzien, Standardlösungen und Kontrollen
q Konzentrierten Waschpuffer im Verhältnis 1:200 mit
entionisiertem Wasser verdünnen.
q Standardlösungen, Kontrollen mit entionisiertem oder
destilliertem Wasser rekonstituieren
Testverfahren
Je 50 μL Standardlösungen, Kontrollen und Proben in die
Testvertiefungen pipettieren.
Je 150 μL des Assay-Puffers in die Testvertiefungen pipettieren.
Bei 18–28 °C für 2 Stunden unter Schütteln (300–700 U/min)
inkubieren.
q Innerhalb von 15 Minuten nach Beginn der Probeninkubation
das 25-OH Vitamin D-Konjugat 1:100 und das konzentrierte
Streptavidin-HRP 1:200 mit Rekonstitutionspuffer verdünnen.
Mit Waschlösung dreimal waschen.
Je 200 μL aktives HRP-Konjugat pipettieren
Bei 18–28 °C für 30 Minuten unter Schütteln (300–700 U/min)
inkubieren.
Mit Waschlösung dreimal waschen.
Je 100 μL Substratlösung pipettieren
Bei 18–28 °C für 15 Minuten unter Schütteln (300–700 U/min)
im Dunkeln inkubieren.
Je 100 μL Stopplösung pipettieren
(Ergebnisse innerhalb von 1 Stunde ablesen)
Optische Dichte bei 450 nm mit Referenzfilter bei 650 nm
ablesen. Testergebnisse mittels 4-Parameter-Kurvenanpassung
oder B/B0% analysieren
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VORGESEHENER VERWENDUNGSZWECK
Der Enzymimmunassay MicroVue 25-OH Vitamin D misst
die Menge an Gesamt-25-OH Vitamin D in Humanserum.
ZUSAMMENFASSUNG UND ERLÄUTERUNGEN
Vitamin D ist eine Gruppe fettlöslicher Secosteroide, die in
der Haut von Wirbeltieren nach der Einwirkung von UVLicht der Sonne gebildet werden, aus künstlichen Quellen
stammen können oder auf natürliche Weise in einigen
wenigen Lebensmitteln vorkommen. In manchen Ländern
werden haltbare Lebensmittel wie Milch, Mehl und
Margarine künstlich mit Vitamin D angereichert, es ist
außerdem als Nahrungsergänzungsmittel in Tablettenform
erhältlich. Lebensmittelquellen wie fettiger Fisch, Eier und
Fleisch sind reich an Vitamin D und werden häufig
Personen mit Vitamin D-Mangel empfohlen.
Im Blutkreislauf gibt es drei verschiedene Arten von Vitamin D,
doch 25-OH Vitamin D ist der empfohlene Marker zur
Feststellung des Vitamin-D-Status. Gesamt-25-OH Vitamin D ist
eine kombinierte Messung von zwei wesentlichen Formen,
Vitamin D2 (Ergocalciferol) und Vitamin D3 (Cholecalciferol),
gemeinhin als Calciferol bekannt. Vitamin D wird im Blut zur
Leber transportiert, wo es in das Prohormon Calcidiol
umgewandelt wird. Im Blutkreislauf befindliches Calcidiol kann
dann in den Nieren oder durch Monozyten-Makrophagen im
Immunsystem zu Calcitriol, der biologisch aktiven Form von
Vitamin D, umgewandelt werden. Wenn es durch MonozytenMakrophagen synthetisiert wird, fungiert Calcitriol lokal als
Zytokin und schützt den Körper vor mikrobiellen
Eindringlingen.
Wenn es in den Nieren synthetisiert wird, zirkuliert Calcitriol
als Hormon; unter anderem reguliert es die Kalzium- und
Phosphatkonzentration im Blut und unterstützt die
gesunde Mineralisierung, das Wachstum und den
Knochenumbau. Ein Vitamin-D-Mangel kann zu dünnen,
brüchigen oder missgebildeten Knochen, Rachitis bei
Kindern und Osteomalazie bei Erwachsenen führen.
Gemeinsam mit Kalzium schützt es ältere Menschen vor
Osteoporose. Vitamin D moduliert außerdem die
neuromuskuläre Funktion, verringert Entzündungen und
beeinflusst die Wirkung vieler Gene, die die Proliferation,
Differenzierung und Apoptose von Zellen regulieren.
Von den meisten Experten wird ein Vitamin-D-Mangel als
ein 25-OH Vitamin-D-Spiegel von weniger als 20 ng pro
Milliliter (50 nmol pro Liter) definiert. Schätzungsweise
1 Milliarde Menschen weltweit leiden unter Vitamin-DMangel oder -Insuffizienz (21–29 ng/ml). Laut verschiedener
Studien leiden 40 % bis 100 % der älteren Frauen und
Männern in den USA und Europa unter einem Mangel oder
einer Insuffizienz an Vitamin D. Die Mayo Clinic glaubt, dass
Vitamin D eine wichtige neue Rolle in psychiatrischen,
kardiovaskulären, infektiösen, Kreislauf-, Krebs-, Lungenund Knochen-/Muskel-Erkrankungen spielt.1-9
FUNKTIONSPRINZIP
Der Enzymimmunassay MicroVue 25-OH Vitamin D für die
Quantifizierung von Gesamt-25-OH Vitamin D in
Humanserum ist ein dreischrittiges Verfahren, das (1) eine
Mikroassay-Platte, beschichtet mit einem monoklonalem
Maus-Antikörper, der gezielt humanes 25-OH Vitamin D2
und D3 bindet, (2) biotinyliertes 25-OH Vitamin D,
(3) Streptavidin-Meerettich-Peroxidase (HRP) und (4) ein
chromogenes Substrat verwendet.
In Schritt 1 werden Standardlösungen, Kontrollen und
Proben in die Mikroassay-Vertiefungen gegeben, die mit
einem primären monoklonalen Antikörper gegen
humanes 25-OH Vitamin D2 und D3 beschichtet sind. Das
Gesamt-25-OH Vitamin D (D2 und D3) in den
Standardlösungen, Kontrollen und Proben wird von den
bindenden Proteinen im Serum getrennt und bindet sich
an den monoklonalen Antikörper.
In Schritt 2, nach dem ersten Waschzyklus, konkurriert eine
festgelegte Menge von biotinyliertem 25-OH Vitamin D, in
Gegenwart von Streptavidin-Meerettich-Peroxidase (HRP)
mit dem ungekennzeichneten 25-OH Vitamin D2 und 25-OH
Vitamin D3, die an den monoklonalen Antikörper gebunden
sind. Am Ende der Inkubation des Tests wird durch einen
Waschzyklus die kompetitive Reaktion beendet.
In Schritt 3 wird in jede Mikroassay-Vertiefung ein
chromogenes Enzymsubstrat gegeben. Das gebundene
HRP-Konjugat reagiert mit dem Substrat und bildet dabei
eine blaue Farbe. Nach einer Inkubationszeit wird die
Enzymreaktion chemisch gestoppt, was zu einer
Farbänderung von blau zu gelb führt. Die Farbintensität
wird spektrophotometrisch bei 450 nm gemessen. Die
Farbintensität der Reaktionsmischung verhält sich
proportional zu der Konzentration von Gesamt-25-OH
Vitamin D in den Testproben, Standardlösungen und
Kontrollen.
MITGELIEFERTE REAGENZIEN UND
MATERIALIEN
Der Enzymimmunassay MicroVue 25-OH Vitamin D
enthält Folgendes:
A 25-OH Vitamin-D-Standardlösungen
Artikelnr. KAL. A–KAL. F
Je 1 x 2 ml (KAL. A)
Je 1 x 1 ml (KAL. B–F)
F Lyophilisiert. Enthält jeweils gereinigtes humanes Gesamt-
L
25-OH Vitamin-D-Kontrolle
Artikelnr. 4219716
Je 1 x 1 ml
Lyophilisiert. Nach der Rekonstituierung enthält jedes humanes
Serum mit Proclin®.
H
25-OH Vitamin-D-Kontrolle
Artikelnr. 4219717
Je 1 x 1 ml
Lyophilisiert Nach der Rekonstituierung enthält jedes humanes
Serum mit Proclin®.
 Mikroassay-Platte
Artikelnr. 4219708
12 x 8 Vertiefungen
Streifen mit jeweils acht Vertiefungen, beschichtet mit
monoklonalem Maus-Antikörper 25-OH Vitamin D2 und D3 in
einem wiederverschließbaren Folienbeutel.
 Stopplösung
Artikelnr. SS04
Enthält 1,5 N (3,65 %) Salzsäure (HCl).
 200X Waschkonzentrat
Artikelnr. 4219711
12 ml
10 ml
Enthält TRIS-HCl.
 TMB-Substrat
Artikelnr. SB04
12 ml
Gebrauchsfertig. Enthält 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidin (TMB).
 Biotinyliertes 25-OH Vitamin D
Artikelnr. 4119703
Enthält Biotin-konjugiertes 25-OH Vitamin D.
0,4 ml
 200X Konzentriertes Streptavidin-HRP
Artikelnr. 4119713
0,2 ml
Enthält zu Streptavidin konjugierte Meerettich-Peroxidase.
 Rekonstitutionslösung
Artikelnr. 4119705
Enthält Kasein und Proclin®.
 Assaypuffer
Artikelnr. 4219713
Enthält Kasein und Proclin®.
30 ml
20 ml
Proclin® ist eine eingetragene Marke der Rohm and Haas Company.
BENÖTIGTE MATERIALIEN (NICHT IM LIEFERUMFANG
ENTHALTEN)
• Stoppuhr (über einen Bereich von 60 Minuten)
• Saubere, unbenutzte Mikroassay-Platten,
Verdünnungsplatte mit 96 Vertiefungen bzw.
Proberöhrchen und Ständer
• Kunststoffbehälter für die Verdünnung des
Waschpuffers
• Waschflasche oder anderes validiertes, für Immunassays
geeignetes Waschsystem
• Mikropipetten und Pipettenspitzen
• Einstellbare Mehrkanalpipette (8 oder 12 Kanäle) oder
Mehrfachmikropipetten
• Saubere Pipetten, 1 ml, 5 ml und 10 ml
• Reagenzienbehälter zum Hinzufügen von
Antikörpern, Substrat- und Stopplösung auf der Platte
(für jedes Reagenz saubere, noch nicht verwendete
Behälter verwenden)
• Plattenlesegerät, das A450- und A650-Messungen
vornehmen kann (biochromatische Messung)
• Entionisiertes oder destilliertes Wasser
• Orbitalschüttler/Rotator (300–700 U/min)
25-OH Vitamin D mit einer zugewiesenen Proteinkonzentration (ng/ml)
in Pferdeserum mit Gentamyzin und Proclin®. Nullstandard ist die
biologische Matrix mit Gentamyzin und Proclin®.
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2
WARNHINWEISE UND
VORSICHTSMASSNAHMEN
1. Zur In-vitro-Diagnostik
2. Die in diesem Kit enthaltenen Humanblut-
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
Komponenten wurden mithilfe von in Europa
und/oder durch die FDA zugelassenen Methoden
getestet und wurden als negativ für HBsAg, Anti-HCV,
Anti-HIV-1 und 2 bewertet. Keine bekannte Methode
kann eine komplette Gewähr dafür liefern, dass
humane Blutderivate nicht Hepatitis, AIDS oder andere
Infektionen übertragen. Proben daher als potenziell
gefährliches biologisches Material behandeln. Bei der
Arbeit mit diesem Kit und den Patientenproben die
allgemein gültigen Vorsichtsmaßnahmen befolgen.10, 11
Alle tierischen Produkte und Derivate wurden von
gesunden Tieren entnommen. Komponenten vom
Rind stammen aus Ländern, in denen es keine BSEFälle gab. Trotzdem sollten Komponenten mit
tierischen Substanzen als potenziell infektiös
behandelt werden.10
Bei der Handhabung der Kitkomponenten geeignete
Schutzkleidung, Schutzhandschuhe und Schutzbrille
bzw. Gesichtsschutz tragen.
Die mitgelieferten Reagenzien als eine
zusammengehörende Einheit vor dem auf der
Verpackung angegebenen Verfallsdatum verwenden.
Reagenzien aus verschiedenen Chargen dürfen nicht
untereinander vertauscht werden.
Die Testreagenzien wie angegeben lagern.
Die beschichteten Teststreifen nicht verwenden, wenn
der Beutel beschädigt ist.
Die Stopplösung ist ätzend und kann Reizungen
verursachen. Nicht einnehmen. Kontakt mit Augen,
Haut und Kleidung vermeiden. Bei Kontakt den
betroffenen Bereich sofort mit Wasser spülen. Im Fall
der Einnahme einen Arzt aufsuchen.
Proclin wird als Konservierungsmittel verwendet. Der
unbeabsichtigte Kontakt mit Pufferlösungen oder
Reagenzien, die Proclin enthalten, bzw. deren
Einnahme kann zu Reizungen der Haut, der Augen
oder des Mundes führen. Die Anforderungen der
guten Laborpraxis beachten, um die Exposition
möglichst gering zu halten. Beim Auftreten erster
Symptome einen Arzt aufsuchen. Für ein zügiges und
effizientes Dosieren der Reagenzien wird der Gebrauch
von Mehrkanal- oder Mehrfachpipetten empfohlen.
Um genaue Messungen zu gewährleisten, bei der
Zugabe der Proben und Standardlösungen genau
arbeiten. Beim Pipettieren vorsichtig vorgehen und
nur kalibrierte Geräte verwenden.
Für den Erhalt genauer Ergebnisse müssen die Proben
fachgerecht entnommen und aufbewahrt werden
(siehe ENTNAHME UND LAGERUNG DER PROBEN).
Eine mikrobielle Kontamination oder Kreuzkontamination
von Proben und Reagenzien ist zu vermeiden.
Jede Probe als Doppelbestimmung messen.
Jede Mikroassay-Vertiefung jeweils nur für einen Test
verwenden.
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16. Wenn die Inkubationszeiten und -temperaturen bei
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
der Testdurchführung von den Vorgaben im Abschnitt
„Testverfahren“ abweichen, können falsche Ergebnisse
auftreten.
Das TMB-Substrat muss während der Lagerung und
Inkubation vor Licht und Kontakt mit Metall oder
Gummi geschützt werden. Kontakt mit Augen, Haut
und Kleidung vermeiden. Bei Kontakt den betroffenen
Bereich sofort mit Wasser spülen.
Die Mikroassay-Vertiefungen nach dem Start des Tests
nicht austrocknen lassen.
Beim Entfernen von Flüssigkeiten aus den MikroassayVertiefungen den Boden der Vertiefungen nicht
ankratzen oder berühren.
Um beim Waschen die Bildung von Aerosolen zu
vermeiden, eine Vorrichtung verwenden, mit der die
Waschflüssigkeit in eine Flasche mit haushaltsüblichem
Bleichmittel gesaugt wird.
Zum Waschen der Platte eine Waschflasche oder
ein automatisiertes Dosiergerät verwenden
(TESTVERFAHREN, Schritt 5). Für optimale Ergebnisse
keine Mehrkanalpipette zum Waschen der MikroassayPlatte verwenden.
Behälter und ungenutzte Inhaltsstoffe gemäß den
Anforderungen bundesweit, landesweit oder örtlich
geltender Richtlinien entsorgen.
Um Abweichungen zu vermeiden, darf die Zeit
zwischen dem Pipettieren der ersten Standardlösung
und der letzten Probe höchstens 20 Minuten betragen,
beginnend mit der Pipettierung der Standardlösung in
die beschichteten Vertiefungen.
Weitere Informationen finden Sie auf dem
Sicherheitsdatenblatt auf quidel.com.
LAGERUNG
Assaypuffer, TMB-Substrat und Stopplösung sind
gebrauchsfertig. Vor Öffnen oder Rekonstitution alle KitKomponenten bei 2–8 °C lagern.
VORBEREITEN DER REAGENZIEN
Alle Reagenzien und Materialien vor der Verwendung
auf Raumtemperatur bringen.
Nach der Entnahme der benötigten Reagenzien und
Materialien die nicht benötigten Komponenten wieder
auf die entsprechende Lagertemperatur bringen
(siehe LAGERUNG).
Mikroassay-Teststreifen
Die für den Test erforderliche Anzahl von Teststreifen
bestimmen. Quidel empfiehlt, Blindvertiefungen,
Standardlösungen und Kontrollen in Doppelbestimmung
zu testen. Die nicht benötigten Teststreifen entfernen und
in einen Aufbewahrungsbeutel legen. Den Beutel
verschließen, Trockenmittel hinzufügen und ihn wieder
auf 2–8 °C bringen. Die im Test verwendeten Teststreifen
im Testplattenrahmen befestigen.
3
Standardlösungen und Kontrollen
Waschlösung
Für den Nullstandard (KAL. A) mit 2,0 ml destilliertem oder
entionisiertem Wasser rekonstituieren und mischen. Jedes
Fläschchen der Standardlösungen (KAL. B bis F) und
Kit-Kontrollen 1 und 2 mit 1,0 ml destilliertem oder
entionisiertem Wasser rekonstituieren und mischen. Durch
vorsichtiges Umkehren gründlich mischen, um die
vollständige Rekonstitution zu gewährleisten.
Nach Rekonstitution sind Standardlösungen und
Kontrollen bei 2–8 °C eine Woche lang stabil. Bei längeren
Lagerungszeiträumen sollten Teilmengen hergestellt und
bei -20 °C maximal 3 Monate lang gelagert werden.
Aufeinanderfolgende Einfrier-/Auftauzyklen vermeiden.
Die 200-fach konzentrierte Waschlösung durch
mehrfaches Umdrehen der Flasche mischen. Wenn die
200-fach konzentrierte Waschlösung bei 2-8 °C gelagert
wurde, haben sich u. U. Kristalle gebildet. Zum Auflösen
dieser Kristalle die Flasche in einem 37 °C warmen
Wasserbad erwärmen, bis sich alle Kristalle aufgelöst
haben, und anschließend sorgfältig mischen. Ein
angemessenes Volumen von Waschlösung durch Auflösen
von 1 Teil 200-fachem Waschlösungs-Konzentrat in
199 Teilen destilliertem oder entionisiertem Wasser
vorbereiten. Gründlich mischen. Die aktive Waschlösung
sollte nur am Tag der Vorbereitung benutzt und nicht
gelagert werden.
HRP-Konjugatlösung
HINWEIS: Die aktive HRP-Konjugatlösung ist innerhalb
von 15 Minuten nach Beginn des ersten zweistündigen
Inkubationsschrittes vorzubereiten (TESTVERFAHREN,
Schritt 4).
Je nach Anzahl der verwendeten Streifen ein geeignetes
Volumen an gebrauchsfertiger HRP-Konjugatlösung durch
Mischen des konzentrierten 25-OH Vitamin-D-Konjugats,
konzentrierten HRP und Rekonsitutionspuffers vorbereiten
(Volumen siehe Tabelle 1). Gründlich durch Verwirbelung
der Lösung mischen. Das gebrauchsfertige HRP-Konjugat
bis zur Anwendung bei Zimmertemperatur lagern und
direktes Sonnenlicht vermeiden (zur Vorbereitung kann
ein braunes Glasfläschchen genutzt werden). Das
gebrauchsfertige HRP-Konjugat ist instabil und muss
entsorgt werden, wenn es nicht genutzt wird.
Tabelle 1. Vorbereitung der gebrauchsfertigen HRPKonjugatlösung
Anz. an
Streifen
Volumen
konzentriertes
Konjugat (µL)
Volumen
konzentriertes
HRP (µL)
Volumen
Rekonstitutionsp
uffer (mL)
1
30
15
3
2
50
25
5
3
60
30
6
4
80
40
8
5
90
45
9
6
100
50
10
7
120
60
12
8
140
70
14
9
160
80
16
10
180
90
18
11
200
100
20
12
220
110
22
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ENTNAHME UND LAGERUNG DER PROBEN
Bei der Handhabung und der Entsorgung aller Proben die
allgemein üblichen Vorsichtsmaßnahmen beachten.
Probenentnahme
ACHTUNG: Alle Proben sind als potenziell infektiös zu
behandeln. Allgemein übliche Vorsichtsmaßnahmen
beachten. Kontaminierte oder falsch gelagerte Proben
dürfen nicht verwendet werden.
Serum
Die Ermittlung des Gesamt-25-OH Vitamin D sollte mit
Serum durchgeführt werden.
Serumproben sollten unter aseptischen Bedingungen und
unter Anwendung von Standardverfahren entnommen
werden.11 Nach der Blutgerinnung sollte das Serum,
vorzugsweise in einer Kühlzentrifuge, sofort getrennt
werden. Serumproben müssen bei 2–8 °C gelagert
werden. Wird der Test nicht innerhalb von 24 Stunden
durchgeführt, wird eine Lagerung bei -20 °C oder darunter
empfohlen. Aufeinanderfolgende Einfrier-/Auftauzyklen
vermeiden. Keine mit Natriumazid vorbereiteten Proben
verwenden. Stark hämolysierte oder stark lipämische
Proben vermeiden.
TESTVERFAHREN
Vor der Durchführung des Tests die gesamte
Packungsbeilage lesen.
Siehe WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN
und VORBEREITUNG DER REAGENZIEN.
1. Eine für alle sechs (6) 25-OH Vitamin-DStandardlösungen [A – F, genaue Konzentrationsangabe auf Flaschenetikett], Kit-Kontrollen und
Patientenproben ausreichende Anzahl mit Anti-25-OH
Vitamin D2 und D3 beschichteter Streifen in die
Halterung einsetzen.
2. Je 50 μL Standardlösung, Kontrollen oder Proben in die
dafür vorgesehene bzw. gekennzeichnete Vertiefung
pipettieren. Die übrigen Standardlösungen und
Kontrollen sind nach der Verwendung so schnell wie
möglich einzufrieren (-20 °C). Innerhalb von 20 Minuten
nach Hinzufügen der ersten Standardlösung alle
Proben zu den beschichteten Streifen geben.
3. 150 µL des Assaypuffers in jede Vertiefung, die bereits
Standardlösungen, Kontrollen oder Proben enthält,
pipettieren bzw. dispensieren.
4
4. Platte 2 Stunden bei Raumtemperatur (18–28 °C) auf
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
einem Plattenschüttler oder Rotator bei 300–700 U/min
inkubieren.
Mikroassay-Vertiefungen nach einer der folgenden
Vorgehensweisen waschen:
a. Den Inhalt aus jeder Vertiefung abgießen oder
absaugen.
b. Mit einer Waschflasche oder einem automatisierten
Plattenwaschgerät ca. 400 μL Waschlösung in jede
Vertiefung geben.
c. Den Inhalt aus jeder Vertiefung absaugen.
d. Schritte a–c noch zweimal (2) wiederholen bzw.
insgesamt drei (3) Waschgänge durchführen.
200 µL des gebrauchsfertigen HRP-Konjugats in jede
Vertiefung, die bereits Standardlösungen, Kontrollen
oder Proben enthält, pipettieren bzw. dispensieren.
Platte 30 Minuten bei Raumtemperatur (18–28 °C) auf
einem Plattenschüttler bei 300–700 U/min inkubieren.
Mikroassay-Vertiefungen nach einer der folgenden
Vorgehensweisen waschen:
a. Den Inhalt aus jeder Vertiefung abgießen oder
absaugen.
b. Mit einer Waschflasche oder einem automatisierten
Plattenwaschgerät ca. 400 μL Waschlösung in jede
Vertiefung geben.
c. Den Inhalt aus jeder Vertiefung absaugen.
d. Schritte a–c noch zweimal (2) wiederholen bzw.
insgesamt drei (3) Waschgänge durchführen.
Innerhalb von 15 Minuten nach dem letzten
Waschgang 100 µL des TMB-Substrats in jede
gewaschene Test-Vertiefung pipettieren bzw.
dispensieren.
Mikrotiterplatte(n) mit einer entsprechenden
Abdeckung zur Vermeidung von Lichteinstrahlung
15 Minuten bei Raumtemperatur (18–28 °C) auf einem
Plattenschüttler oder Rotator bei 300–700 U/min
inkubieren.
In jede Vertiefung 100 µL Stopplösung pipettieren
oder dispensieren, um die enzymatische Reaktion zu
stoppen.
Die Platte vorsichtig oben antippen, damit sich die
Farbentwicklung gleichmäßig und vollständig verteilt.
Innerhalb von 1 Stunde nach der Zugabe der
Stopplösung (Schritt 11) die Extinktion für jede
Testvertiefung bei 450 nm bestimmen (Referenzfilter
630 nm oder 650 nm verwenden) und je nach
verwendetem Spektrophotometer eine
Blindwertkorrektur vornehmen.
Die B/B0-%-Werte für jeden Kalibratorenpunkt als
Funktion der 25-OH-Konzentration für jeden Kalibrator
grafisch darstellen.
Durch Interpolation der Probe (B/B0-%-Werte) die
25-OH Vitamin-D-Konzentrationen der Probe mithilfe
der Standardkurve ermitteln.
Die übrigen verdünnten Proben, Substrate und die
verwendeten Mikroassay-Teststreifen entsorgen (siehe
WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN).
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QUALITÄTSKONTROLLE
Das diesem Kit beiliegende Analysezertifikat ist
chargenspezifisch und soll gewährleisten, dass die von Ihrem
Labor ermittelten Ergebnisse denen der Quidel Corporation
entsprechen. Die angegebenen Extinktionswerte sollen
lediglich als Richtwerte dienen. Die von Ihrem Labor
ermittelten Ergebnisse können davon abweichen.
Die zu verwendenden Qualitätskontrollbereiche sind
angegeben. Die Kontrollwerte dienen zur Verifizierung der
Gültigkeit der Kurven- und Probenergebnisse. Jedes Labor
sollte eigene Kriterien für akzeptable Testgrenzwerte
festlegen. Wenn die Kontrollwerte NICHT innerhalb des
Akzeptanzbereichs Ihres Labors liegen, sollten die
Testergebnisse infrage gestellt und die Proben erneut
getestet werden.
AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE
Verwendung der Standardkurve
Mit den in Schritt 13 des TESTVERFAHRENS erhaltenen
endgültigen Absorptionswerten eine Kalibrierungskurve
mit 4-Parameter-Logistik oder B/B0(%) konstruieren, um
die Konzentration des Gesamt-25-OH Vitamin D zu
quantifizieren. Die meisten Plattenanalyse-Softwares und Computer können diese Berechnungen durchführen.
Alternativ können die Daten manuell grafisch dargestellt
werden. Für die 450-nm-Messung eine Kalibrierungskurve
mit den angegebenen Standardlösungen, d. h.
Standardlösungen A–F, erstellen. Den Mittelwert der
beiden
Bestimmungen
berechnen.
Für
jede
Standardlösung, Kontrolle und Probe Folgendes
berechnen:
B/B0(%) = OD (Standardlösung B–F, Kontrolle oder Probe) X 100
OD (Standardlösung A)
Entweder linear-lineares oder semi-logarithmisches
Millimeterpapier benutzen, um die B/B0(%)-Werte für
jeden Standardpunkt als Funktion der 25-OH Vitamin-DKonzentration für jede Standardlösung zu zeichnen.
Offensichtliche Ausreißer verwerfen. Die Werte (ng/ml) der
Testproben können direkt von der Regressionsgeraden
der Kalibrierungskurve abgelesen werden. Ein Beispiel
einer typischen Eichkurve ist in Abbildung 1 dargestellt.
Abbildung 1. Typische Eichkurve
Konzentration von 25-OH Vitamin D (ng/ml)
5
Tabelle 2. Probendaten bei A450
Präparat
Kreuz-Reaktivität (%)
25-OH Vitamin D3
100
0
25-OH Vitamin D2
84
92,32
5,3
2,242
70,50
15
1,25-(OH)2 Vitamin D3
50
Standardlösung D
1,816
53,44
25,7
1,25-(OH)2 Vitamin D2
< 0,2
Standardlösung E
1,079
23,95
54,3
Vitamin D3
< 0,2
Standardlösung F
0,348
-5,28
133
Probe
A450
B/B0(%)
ng/ml
Standardlösung A
3,043
102,54
Standardlösung B
2,788
Standardlösung C
Hinweis: 1 ng/ml = 2,5 pmol/ml
GEMESSENE WERTE
Das Serum von 20 Spendern wurde im Enzym-Immunassay-Kit
MicroVue 25-OH Vitamin D getestet. Die Ergebnisse sind
nachfolgend aufgeführt.
Probe
n
Mittelwert
(ng/ml)
Bereich (ng/ml)
Serum
20
15,6
6,0 – 39,4
HINWEIS: Die mittlere Abweichung und die Standardabweichung (SA) der 25OH Vitamin-D-Konzentrationen, die in Serumproben gemessen werden,
können von Labor zu Labor variieren. Daher wird empfohlen, dass jedes Labor
eigene Durchschnittswerte für die 25-OH Vitamin-D-Konzentration und die
Standardabweichung für Proben festlegt.
REFERENZWERTE
Ernährung, Nationalität, Jahreszeit und Alter können den
normalen Spiegel von 25-OH Vitamin D3 beeinflussen.
Jedes Labor sollte seine eigenen Bereiche auf Grundlage
der örtlichen Bevölkerung festlegen. In aktuellen
Veröffentlichungen wurden die folgenden Bereiche für die
Klassifizierung des Vitamin-D-Status empfohlen:5, 8
Bereich (ng/ml)
Mangel
0–10
Insuffizienz
10–30
Suffizienz
30–150
Toxizität
> 150
LEISTUNGSMERKMALE DES TESTS
Vitamin D2
< 0,2
24,25-(OH)2 Vitamin D3
> 100
25,26-(OH)2 Vitamin D3
> 100
3-epi-25-OH Vitamin D3
< 0,2
Die Assay-Leistung wird nicht von Hämolyse (5 g/l Hämoglobin getestet),
Bilirubinämie (0,5 g/l Bilirubin getestet), Triglyzeriden (5 g/l getestet),
Ascorbinsäure (Vitamin C, 1g/l getestet) und Bilirubinkonjugat (1g/l
getestet) beeinflusst.
Präzision
Die Intra-Assay-Präzision wurde mithilfe von 35 Replikaten
von zwei Proben bestimmt.
Mittelwert
(ng/ml)
N
Intra-Assay
C.V. (%)
Probe A
27,4
35
5,7
Probe B
43,0
35
2,7
Probe
Die Inter-Assay-Präzision wurde mithilfe von 2 Proben in
10 verschiedenen Tests bestimmt.
Mittelwert
(ng/ml)
N
Inter-Assay
C.V. (%)
Probe A
26,3
10
4,7
Probe B
42,1
10
4,3
Probe
Linearität
Linearität wurde durch Verdünnung von Serumproben
mit Standard A (Nullkalibrator) erzielt. Die Ergebnisse sind
nachfolgend aufgeführt:
Probe
Grenzen
Nachweisgrenze: Die Nachweisgrenze (LOD) für den
25-OH Vitamin-D-Assay liegt bei 1,5 ng/ml, definiert als die
sichtbare Konzentration von zwei Standardabweichungen
unter der durchschnittlichen OD bei Nullbindung.
A
RückBeobachtet
gewinnung
(ng/ml)
(%)
Verdünnungsfaktor
Erwartet
(ng/ml)
1:1
66,2
66,2
100
1:2
33,1
34,5
104
1:4
16,6
15,5
94
1:8
8,3
8,2
99
Spezifität
1:16
4,1
4,4
106
Der Prozentsatz der Kreuz-Reaktivität wurde im Vergleich
mit der Konzentration geschätzt, die eine 50%-ige
Hemmung ergab. Die Ergebnisse sind nachfolgend
aufgeführt:
1:32
2,1
2,2
106
1:1
62,0
62,0
100
1:2
31,0
38,3
123
1:4
15,5
15,8
102
1:8
7,8
7,5
97
1:16
3,9
4,0
103
1483DE01 (2013/04)
B
6
Rückgewinnung aufgestockter Proben
Die Rückgewinnung aufgestockter Proben wurde
durchgeführt, indem verschiedene Mengen von entweder
25-OH Vitamin D3 oder 25-OH Vitamin D2 zu den Proben
hinzugefügt und die Rückgewinnungs-Prozentsätze
errechnet wurden. Die Ergebnisse sind nachfolgend
aufgeführt:
Hinzugefügtes 25-OH
Vitamin D3 (ng/ml)
Rückgewinnung
(%)
0
100
25
96
50
92
Hinzugefügtes 25-OH
Vitamin D2 (ng/ml)
Rückgewinnung
(%)
0
100
25
105
50
95
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LITERATURVERWEISE
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settings. MMWR. 36(suppl. 2S):001.
GLOSSAR
Vorgesehener Verwendungszweck
8046 –
25-OH Vitamin-D-EIA-Kit
MDSS GmbH
Schiffgraben 41
30175 Hannover, Germany
1483DE01 (2013/04)
7