Bestimmung von Spurenelementgehalten im Blut und im Ejakulat

Transcription

Tierärztliche Hochschule Hannover
Bestimmung von Spurenelementgehalten
im Blut und im Ejakulat und deren Beziehungen
zur Spermaqualität und Fertilität
bei Zuchthengsten
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
-Doktor medicinae veterinariae(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Sophie Luise Keppler
Los Alamos
Hannover 2009
Wissenschaftliche Betreuung:
Prof. Dr. H. Sieme
Klinik für Pferde
Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken
1. Gutachter: Prof. Dr. H. Sieme
2. Gutachter: Prof. Dr. J. Kamphues
Tag der mündlichen Prüfung: 13. November 2009
Für Rainer
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung........................................................................................................... 11
2
Literaturübersicht............................................................................................... 12
2.1
2.1.1
Proteine im Seminalplasma ................................................................ 14
2.1.2
Enzyme im Seminalplasma ................................................................. 15
2.1.3
Makroelemente im Seminalplasma ..................................................... 16
2.1.4
Spurenelemente im Seminalplasma.................................................... 16
2.2
Spurenelemente ......................................................................................... 17
2.2.1
Selen................................................................................................... 18
2.2.2
Zink ..................................................................................................... 21
2.2.3
Eisen ................................................................................................... 23
2.2.4
Kupfer ................................................................................................. 24
2.2.5
Molybdän ............................................................................................ 25
2.2.6
Mangan ............................................................................................... 26
2.3
Vitamine ..................................................................................................... 26
2.3.1
Vitamin A............................................................................................. 27
2.3.2
Vitamin E............................................................................................. 29
2.4
Reactive oxygen species (ROS) ................................................................ 30
2.4.1
Physiologische ROS-Wirkung auf Spermien ....................................... 32
2.4.2
Pathologische ROS-Wirkung auf Spermien ........................................ 33
2.5
3
Seminalplasma........................................................................................... 12
Antioxidantien............................................................................................. 34
2.5.1
Enzymatische Antioxidantien .............................................................. 35
2.5.2
Nichtenzymatische Antioxidantien....................................................... 38
Material und Methoden...................................................................................... 41
3.1
Versuchsgruppen ....................................................................................... 41
3.2
Probenentnahme........................................................................................ 42
3.3
Probenaufbereitung.................................................................................... 43
3.4
Untersuchungen ......................................................................................... 44
3.4.1
Spermatologische Untersuchungen .................................................... 44
Inhaltsverzeichnis
4
3.4.2
Blutuntersuchungen ............................................................................ 47
3.4.3
Spermauntersuchungen...................................................................... 50
3.5
Fertilitätsparameter .................................................................................... 55
3.6
Statistische Auswertungen ......................................................................... 55
Ergebnisse ........................................................................................................ 57
4.1
Spurenelementgehalte im Blut, in den Ejakulaten, im Seminalplasma und in
den Spermien........................................................................................................ 57
4.1.1
Mittelwerte allgemein und differenziert nach Alters- und
Trächtigkeitsgruppen ......................................................................................... 57
4.1.2
Hengst- und ejakulatbedingte Variationen der Spurenelement- und
Vitamingehalte im Blut und Ejakulat .................................................................. 64
4.2
Korrelationen der Spurenelementgehalte im Blut zu denen in den
Ejakulatfraktionen ................................................................................................. 67
4.3
Korrelationen zwischen den Vitamin- und Spurenelementgehalten zur
Spermaqualität und Fruchtbarkeit ......................................................................... 67
5
Diskussion ......................................................................................................... 78
5.1
Spurenelementgehalte im Blut, in den Ejakulaten, im Seminalplasma und in
den Spermien........................................................................................................ 78
5.2
Mittelwerte differenziert nach Alters- und Trächtigkeitsgruppen................. 81
5.3
Hengst- und ejakulatbedingte Variationen der Spurenelement- und
Vitamingehalte im Blut und Ejakulat...................................................................... 83
5.4
Korrelationen der Spurenelementgehalte im Blut zu denen in den
Ejakulatfraktionen ................................................................................................. 84
5.5
Korrelationen zwischen den Vitamin- und Spurenelementgehalten zur
Spermaqualität und Fruchtbarkeit ......................................................................... 84
5.6
Schlussbetrachtung.................................................................................... 87
6
Zusammenfassung............................................................................................ 88
7
Summary ........................................................................................................... 90
8
Literaturverzeichnis ........................................................................................... 92
9
Anhang ............................................................................................................ 110
9.1
Zusammensetzung verwendeter Medien ................................................. 110
Inhaltsverzeichnis
9.2
Verwendete Chemikalien und Fluorochrome ........................................... 111
9.3
Mittelwerte mit Standardabweichung differenziert nach Alters- und
Trächtigkeitsgruppen .......................................................................................... 113
9.4
Korrelationen zwischen den Vitamin- und Spurenelementgehalten im Blut
und Ejakulat zu den Spermaqualitäts- und den Fruchtbarkeitsparametern......... 117
9.5
Abbildungsverzeichnis.............................................................................. 121
9.6
Tabellenverzeichnis.................................................................................. 123
Abkürzungsverzeichnis
Abb.
Abbildung
ACE
Angiotensin converting enzyme
alpha-t
Anteil der Rotfluoreszenz der Gesamtpopulation
AO
Akridinorange
AP
Alkalische Phosphatase
AST
Aspartat-Aminotransferase
ATP
Adenosintriphosphat
bzw.
beziehungsweise
C
Celsius
ca.
circa
Ca-Ionophor
Kalzium-Ionophor
cGPx
zytosolische Glutathionperoxidase
d
Tage
DFI
DNS-Fragmentationsindex
DNS
Desoxyribonukleinsäure
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
et al.
und andere
Fa.
Firma
FITC
Fluoreszein-Isothiocyanat
FL 1-3
Fluoreszenzkanäle 1 bis 3
g
Erdbeschleunigung
GGT
Gamma-Glutamyltransferase
GI-GPx
gastrointestinale Glutathionperoxidase
GPx
Glutathionperoxidase
h
Stunde
HPLC
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
ICP-OES
Inductively-coupled plasma optical emission spectrometry
IE
Internationale Einheit
INRA 82
Magermilchverdünner
K
Kelvin
kDa
Kilodalton
keV
Kiloelektronenvolt
KM
Körpermasse
LDH
Laktat-Dehydrogenase
Li-Heparin
Lithium-Heparin
mbar
Millibar
min.
Minuten
Mio.
Millionen
mmol
Millimol
mOsm
Milliosmol
Mrd.
Milliarden
mW
Milliwatt
µmol
Mikromol
NAA
Neutronenaktivierungsanalyse
NADPH
Nicotinamidadenindinukleotidphosphat
nm
Nanometer
nmol
Nanomol
p
Signifikanz
PAS
Spermien mit positiv akrosomalem Status
pGPx
Plasma Glutathionperoxidase
PHGPx
Phospholipid hydroperoxide Glutathionperoxidase
PI
Propidiumjodid
PMI
Plasmamembranintakte Spermien
PMS
Progressiv motile Spermien
PNA
Peanut Agglutinin
r
Korrelationskoeffizient
ROS
Reaktive Sauerstoffspezies (reactive oxygen species)
s.
siehe
SCSA
Sperm chromatin structure assay
±SD
Standardabweichung
snGPx
Sperm nuclei Glutathionperoxidase
SOD
Superoxiddismutase
Tab.
Tabelle
TRR
Trächtigkeitsrate pro Rosse
TS
Trockensubstanz
U
Einheiten (Units)
Vit. A
Vitamin A
Vit. E
Vitamin E
v/v
Volumenprozent
X¯
arithmetischer Mittelwert
°
Grad
%
Prozent
Einleitung
1 Einleitung
Die Spermaqualität und die Befruchtungsleistung eines Deckhengstes sind
bedeutende wirtschaftliche Aspekte für die Pferdezucht. Daher ist es wichtig, bei
einem genetisch wertvollen Vatertier die Gründe für seine eventuell schlechten
Reproduktionsleistungen zu ermitteln. Ein wichtiger Gesichtspunkt ist hierbei die
Spurenelementversorgung. Die Vermutung liegt nahe, dass der Spurenelementstatus
Auswirkungen auf die Samenqualität und die Fertilität hat.
Über den Einfluss von Spurenelementen auf die Fruchtbarkeit existiert bereits eine
Vielzahl
an
Forschungsarbeiten.
Vor
allem
in
der
Humanmedizin
gelten
Spurenelemente zum Teil schon als wichtige Parameter für die Fertilitätsprognose
(BLEAU et al. 1984, HENKEL et al. 1999, CHIA et al. 2000, HUANG et al. 2000).
Weiterhin sind im Vorfeld Studien über Spurenelementgehalte im Seminalplasma
(BARRIER-BATTUT et al. 2002, PESCH 2005) bei Hengsten entstanden. Bei Ratten
gilt Selen beispielsweise schon lange als bedeutend für die Reproduktion (BEHNE et
al. 1982).
Diese Studien umfassen jedoch stets nur einen Teilbereich, wie zum Beispiel das
Seminalplasma oder die Motilität der Spermien, oder beziehen sich auf eine andere
Spezies, wie beispielsweise Mensch (CHIA et al. 2000) oder Ratte (BEHNE et al.
1996).
Ziel dieser Studie ist es, aufbauend auf vorangegangenen Arbeiten (BERTELSMANN
et al. 2005), einen Gesamteindruck über mögliche Zusammenhänge zwischen den
Spurenelementgehalten
im
Blut
und
Ejakulat
und
der
Fruchtbarkeit
bei
Zuchthengsten zu bekommen. Dazu wurden Blutproben und Ejakulate untersucht.
Die Spurenelementgehalte wurden sowohl im vollständigen Ejakulat, als auch nach
Trennung der Ejakulatbestandteile durch Zentrifugation im Seminalplasma und den
Spermien bestimmt. Für die Spurenelementgehalte aus diesen Proben wurde
geprüft, ob eine Beziehung zu den Spermaqualitäts- und Fertilitätsparametern
besteht.
11
Literaturübersicht
2 Literaturübersicht
2.1 Seminalplasma
Bei der flüssigen Komponente des Ejakulates handelt es sich um das
Seminalplasma. Es macht 75-85 % des Ejakulatvolumens aus und wird beim Hengst
fraktioniert abgegeben. Gebildet wird es hauptsächlich durch die Sekrete der
akzessorischen Geschlechtsdrüsen. Zu einem kleinen Teil beinhaltet es auch
Sekrete aus dem Hoden, dem Nebenhoden, dem Samenleiter und den kleinen
Harnröhrendrüsen. Die Zusammensetzung zeigt tierartlich und individuell erhebliche
Unterschiede. Die Abweichungen der Zusammensetzung zwischen den Fraktionen
beim Hengst kommen dadurch zustande, dass sie von den unterschiedlichen Drüsen
gebildet werden. Die erste Fraktion wird von der Bulbourethraldrüse gebildet. Das
Seminalplasma
der
spermienreichen
Fraktionen
wird
hauptsächlich
durch
Samenleiterampulle und Nebenhoden produziert. Die letzten Fraktionen werden von
den Sekreten der Samenblasendrüse bestimmt (MAGISTRINI et al. 2000). Generell
handelt es sich beim Seminalplasma um eine isotone, klare Flüssigkeit mit einem
pH-Wert von 7,0-7,2, die zu ca. 75 % aus Wasser besteht. Es beinhaltet Hormone
(Steroide, Prostaglandine), Proteine, Enzyme, Fruktose, Zitronensäure, Inositol,
Ergothionine, Glycerolphosphorylcholin, Mengen- und Spurenelemente (PESCH
2005). Die Mengen der Inhaltsstoffe des Seminalplasmas bei Mensch, Bulle,
Schafbock und Hengst sind in Tabelle 1 angegeben.
Aufgaben des Seminalplasmas sind:
•
Transport der Spermien im männlichen und später im weiblichen Genitaltrakt
•
Stimulation des Spermientransportes über den Volumeneffekt und durch
spezifische Komponenten, wie Prostaglandine und Östrogene im weiblichen
Genitale
•
Abdichtung der Zervix gegen einen Rückfluss des Spermas bei Hengst und
Eber
12
Literaturübersicht
•
Schutz der Spermien vor schädigenden Stoffwechselprodukten unter
anderem durch Dekapazitationsfaktoren und Proteinaseinhibitoren, somit
fungiert es als neutralisierender Puffer
•
Ernährung der Spermien im weiblichen Genitaltrakt
(BUSCH und WABERSKI 2007)
•
Epithelschutz im Reproduktionstrakt
•
Bedeutung bei der Immunsuppression während der Befruchtung und bei der
Kapazitation
(PESCH 2005).
Tabelle 1: Angaben über Inhaltsstoffe im Seminalplasma (alle Angaben in
mg/100 ml, modifiziert nach MANN und LUTWACK-MANN 1981).
Mensch
Bulle
Schafbock
Hengst
Gesamtstickstoff
400-1000
440-1170
900
150-300
Natrium
100-200
150-370
180
257
Kalium
55-110
50-380
90
103
Kalzium
20-28
24-60
9
26
Magnesium
3-12
8
6
9
Chlorid
100-200
150-390
180
80-400
Fructose
40-600
300-1000
150-660
<1
Sorbitol
10
10-136
26-120
20-60
Inositol
54-63
24-46
10-15
19-47
Spuren
Spuren
Spuren
4-16
54-90
110-500
1600-2000
38-113
100-1400
350-1000
300-800
10-50
20-50
20-50
35
9-25
Brenztraubensäure
30
5
10
3
Ascorbinsäure
10
6
5
5
Kreatin
20
12
15
5
Bikarbonat
18
16
16
25
Ergothionine
Glycerylphosphorylcholin
Zitronensäure
Milchsäure
13
Literaturübersicht
Der Einfluss des Seminalplasmas auf die Motilität der Spermien bei der Lagerung
und auf die Fertilität wird kontrovers diskutiert. LOVE et al. (2005) konnten bei
Proben mit komplett entferntem Seminalplasma höhere Motilitäten und höhere
Prozentsätze chromatinstabiler Spermien feststellen als bei Proben mit höheren
Seminalplasmaanteilen. KARESKOSKI und KATILA (2008) konnten bei der
Flüssigkonservierung
von
Sperma
eine
Verschlechterung
der
Spermienchromatinqualität erkennen, wenn Seminalplasma in den Proben enthalten
war. Dabei war unerheblich, um welche Ejakulatfraktion es sich handelte. Bei den
Proben ohne Seminalplasma konnte Unterschiede im DFI (DFI= DNA Fragmentation
Index) zwischen den Fraktionen ermittelt werden. Dabei hatten die spermienreichen
Fraktionen niedrigere DFI-Werte, als die späteren spermienarmen Fraktionen. MANN
und LUTWACK-MANN (1981) beschreiben höhere Prozentsätze der motilen
Spermien durch Seminalplasma bei einigen Tierarten. Sie benennen ein so
genanntes forward-motility-protein (FMP) im Seminalplasma vom Bullen, welches bei
unreifen, nicht beweglichen Spermien aus dem Nebenhodenkopf progressive
Bewegung hervorruft. BALL (2008) sieht den Gehalt an antioxidativen Stoffen
verantwortlich für den von ihm beobachteten positiven Effekt des Seminalplasmas.
Die Antioxidantien wirken dem oxidativen Stress entgegen und vermindern somit
dessen negative Auswirkungen, wie Chromatin-, Membran- und Proteinschäden (s.
auch Kapitel 2.4.2)
2.1.1 Proteine im Seminalplasma
Schon AMANN et al. (1987) konnten 27 verschiedene Proteine mit einem
Molekulargewicht zwischen 13 und 122 kDa im Seminalplasma beim Hengst
nachweisen.
Die
Proteine
stammen
aus
dem
Nebenhoden
und
den
akzessorischen
Geschlechtsdrüsen. Sie sind an der Spermienreifung, d.h. an der Erwerbung der
Befruchtungsfähigkeit beteiligt. Zudem spielen sie eine Rolle bei wichtigen
Teilprozessen der Befruchtung, wie Kapazitation und Gameteninteraktion. Die drei
Hauptgruppen der Proteine im equinen Seminalplasma sind fibronektinhaltige
Proteine (Fn-2-Typ Proteine), cysteinreiche Proteine (cysteine-rich secretory proteins
14
Literaturübersicht
-CRISP) und Spermadhesine. Die Fn-2-Typ Proteine sind beteiligt an der
Kapazitation und die CRISP an der Fusion zwischen Spermien und Oozyten. Die
Spermadhesine kommen nur bei Einhufern vor und ihnen wird eine Rolle bei der
Gametenerkennung zugeschrieben (TÖPFER-PETERSEN et al. 2005).
Bis jetzt konnten acht Proteine (HSP-1 bis HSP-8) im Seminalplasma des Hengstes
identifiziert werden. Sie haben alle eine geringe molekulare Masse (14-30 kDa) und
sind - bis auf HSP-4 - alle zum Zeitpunkt der Ejakulation peripher an die
Spermienoberfläche gebunden. Den Hauptanteil der Proteine machen mit 70-80 %
HSP-1 und HSP-2 aus. Die totale Proteinkonzentration ist im Vorsekret am
geringsten und in der ersten Fraktion des Ejakulates am höchsten (KARESKOSKI
und KATILA 2008).
2.1.2 Enzyme im Seminalplasma
Die Aspartat-Aminotransferase (AST) ist in den Spermien im Mittelstück lokalisiert.
Bei Membranschäden in diesem Bereich kommt es zum Austritt des Enzyms ins
Seminalplasma und zu einer Hemmung der ATP-Produktion. Somit wird die Motilität
der Spermien herabgesetzt (COLENBRANDER et al. 1992). Die Beziehung zwischen
der AST-Freisetzung ins Seminalplasma und der verminderten Motilität, der
Farbstoffabsorption und dem Anteil der morphologischen Abweichungen konnten
bereits HILLMANN und TREU (1974) feststellen. PESCH et al. (2006) erhielten in
ihrer Studie einen Medianwert von 80 IE AST pro Liter Seminalplasma.
Die
Funktion
der
Alkalischen
Phosphatase
(AP)
ist
die
Hydrolyse
von
Phosphorsäureestern. TURNER und SERTICH (2001) stellten einen Zusammenhang
zwischen dem AP-Gehalt und dem Auftreten von Oligo- und Azoospermien fest. Sie
erkannten in der AP eine spermienunabhängige Nachweismöglichkeit für eine
Ejakulation, da der Hauptanteil des Enzyms aus dem Hoden und dem Nebenhoden
stammt. Die AP-Konzentration kann somit benutzt werden, um Ejakulationsstörungen
von testikulären Azoospermien abzugrenzen. Als Grenzwerte ermittelten sie >1000
IE/l nach vollständiger Ejakulation und <100 IE/l bei einer Ejakulationsstörung. Werte
dazwischen sehen sie als Hinweis auf eine partielle Ejakulation oder partielle
Blockade an. PESCH et al. (2006) ermittelten einen Medianwert von 30200 IE AP pro
Liter Seminalplasma. Zusätzlich konnten sie zwischen den Gehalten von Aspartat-
15
Literaturübersicht
Aminotransferase (AST), alkalischer Phosphatase (AP), Gamma-Glutamyltransferase
(GGT, Median 7500 IE/l), saurer Phosphatase (Median 20 IE/l) und LaktatDehydrogenase (LDH, Median 81 IE/l) zu den Volumina signifikant negative und zu
den Dichten signifikant positive Korrelationen feststellen. Sie schließen daraus, dass
diese Enzyme primär testikulärer und epididymaler Herkunft sind. Zudem erkannten
sie signifikante Korrelationen zwischen dem GGT-Gehalt und der Motilität der
Spermien, sowie zwischen dem LDH-Gehalt und der Gesamtmotilität, der
progressiven Motilität, der lebend:tot-Rate und der Pathomorphologie der Spermien.
2.1.3 Makroelemente im Seminalplasma
Die Konzentration von Natrium ist im Seminalplasma generell höher als die von
Kalium. Die Gehalte von Natrium sind zudem in der Zelle geringer, als im
Seminalplasma.
Daraus
lässt
sich
schließen,
dass
ein
aktiver
Transportmechanismus besteht (PESCH 2005). PESCH et al. (2006) ermittelten
Medianwerte von 110,5 mmol/l für Natrium und 22,1 mmol/l für Kalium.
Kalzium und Magnesium sind im Ejakulat in hohen Konzentrationen vorhanden, was
einen aktiven Transport aus dem Blut vermuten lässt. PESCH et al. (2006) erhielten
Medianwerte von 2,9 mmol/l für den totalen Kalziumgehalt, 1,7 mmol/l für den
Kalziumionengehalt und 3,1 mmol/l für den Magnesiumgehalt. Zudem konnten sie
Medianwerte von 1,1 mmol/l für Phosphat und 114,5 mmol/l für Chlorid messen.
Zwischen dem Kalziumgehalt (total und ionisiert) und dem Ejakulatvolumen konnte
eine positive Korrelation festgestellt werden, was vermuten lässt, dass dieses
Element
hauptsächlich
über
die
akzessorischen
Geschlechtsdrüsen
ins
Seminalplasma gelangt. Die Konzentrationen von Kalzium, anorganischem Phosphor
und
Magnesium
sind
in
den
spermienreichen
Fraktionen
am
höchsten
(KARESKOSKI und KATILA, 2008).
2.1.4 Spurenelemente im Seminalplasma
Selen ist Bestandteil vieler Enzyme. Das wichtigste Selenoenzym ist die
Glutathionperoxidase (s. auch Kapitel 2.2.1).
16
Literaturübersicht
Zink ist im Sperma an der Bildung von Enzymkomplexen beteiligt und somit wichtig
für die antibakterielle Aktivität des Seminalplasmas (PESCH 2005, s. auch Kapitel
2.2.2).
Eisen ist im Seminalplasma in freier Form und gebunden an Transferrin und Ferritin
vorhanden (s. auch Kapitel 2.2.3).
Kupfer liegt im Seminalplasma frei, gebunden an Enzyme (SOD, GPx) oder an das
Transportprotein Ceruloplasmin vor (s. auch Kapitel 2.2.4).
2.2 Spurenelemente
Als Spurenelemente werden jene chemischen Elemente bezeichnet, die weniger als
0,01% der Gesamtkörpermasse ausmachen. Spurenelemente, die im Organismus
eine
wichtige
spezifische
Aufgabe
bei
bestimmten
Stoffwechselvorgängen
übernehmen, werden essentielle Spurenelemente genannt. Sie müssen mit der
Nahrung aufgenommen werden. Geschieht dies nicht, kommt es zu Störungen
während des Wachstums oder bei der Fortpflanzung. Bei zu hoher Zufuhr können
jedoch auch Vergiftungserscheinungen auftreten. Essentielle Spurenelemente sind
Mangan (Mn), Eisen (Fe), Kobalt (Co), Kupfer (Cu), Zink (Zn), Selen (Se), Molybdän
(Mo) und Jod (I). Bedeutsam sind metallische Spurenelemente vor allem deswegen,
da sie oft als Aktivatoren bzw. als wichtige Bestandteile von Enzymen bei
Stoffwechselvorgängen dienen. Die katalytische Funktion der Enzyme geht also
ohne
die
Spurenelemente
verloren
(WOLFFRAM
2004).
Der
Bedarf
an
Spurenelementen im Futter beim Pferd ist in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2: Bedarf an Spurenelementen im Futter beim Pferd (KAMPHUES et al.
2009)
Fe
Cu
Mn
Zn
Co
I
Se
80-100
10
40
50
0,05-0,1
0,1-0,3
0,2
mg/kg
TS
Futter
17
Literaturübersicht
2.2.1 Selen
Von den Enzymsystemen, die Selen beinhalten, ist die Glutathionperoxidase (GPx)
das wichtigste. Es sind bereits fünf verschiedene Formen der GPx mit verschiedenen
Wirkorten entdeckt worden (s. Kapitel 2.5.1.3). Weitere Selenoenzyme sind die im
Stoffwechsel der Schilddrüsenhormone involvierten Deiodasen, die ThioredoxinReductasen, das Selenoprotein P aus dem Blutplasma und das Selenoprotein W aus
der Muskulatur (WOLFFRAM 2004).
Resorbiert
wird
Selen
im
Dünndarm.
Gut
aufzunehmende
Formen
sind
Selenoaminosäuren, wie Selenomethionin und Selenocystein, sowie anorganische
Formen, wie Selenit und Selenat. Stabile Metallselenide und elementares Selen sind
schlecht wasserlöslich und folglich kaum resorbierbar. Im Körper transportiert wird
Selen an Plasmaproteine gebunden. Auf diese Weise gelangt es in alle Gewebe,
einschließlich Knochen, Haare, Erythro- und Leukozyten. Im Hoden, in der Hypound Epiphyse sowie in der Nierenrinde, der Leber und im Pankreas ist Selen in
besonders hohen Konzentrationen vorhanden. Die Ausscheidung erfolgt fast
ausschließlich renal.
Selen besitzt eine verhältnismäßig geringe therapeutische Breite, so dass der
Bereich zwischen Bedarf und Toxizität relativ eng ist. Eine Vergiftung mit Selen zeigt
auf Grund der verschiedenen Verbindungen und Aufnahmewege ein uneinheitliches
Bild. Häufig können Veränderungen an Haar und Horn, periphere Neuropathien,
Müdigkeit und gastrointestinale Symptome auftreten. Außerdem geht oft ein
knoblauchartiger Geruch der Expirationsluft mit der Selenvergiftung einher. Dies liegt
am hohen Gehalt an Dimethylselenit, welches bei einer Intoxikation vermehrt über
die Atmung ausgeschieden wird (WOLFFRAM 2004).
Durch Selenmangel kommt es in Folge der fehlenden Deiodasen zu einer
beeinträchtigten Bildung von Trijodthyronin und den daraus resultierenden Folgen.
Durch die synergistische Beziehung zwischen Vitamin E und Selen, muss bei einer
Überprüfung der Versorgung immer auf beide Substanzen geachtet werden. Ein
Selenmangel kann bis zu einem gewissen Grad durch eine gute Vitamin EVersorgung
aufgefangen
werden.
Außerdem
kann
eine
ausreichende
Selenaufnahme auch einen geringen Vitamin-E-Mangel ausgleichen. Dabei können
18
Literaturübersicht
die Mangelerkrankungen in drei Gruppen eingeteilt werden (KIRCHGESSNER 2004).
Die erste Gruppe sind Erkrankungen, die sich durch Vitamin E-Gaben, aber nicht
durch Selen heilen lassen, wie beispielsweise die Resorptionssterilität der Ratten
und die Enzephalomalazie bei Küken. Die zweite Gruppe sind die Krankheiten, die
sowohl durch Vitamin E, als auch durch Selen verhindert werden können, wie
Lebernekrosen
beim
Schwein,
exsudative
Diathese
beim
Küken
und
die
ernährungsbedingte Muskeldystrophie vieler Tierarten. Letztlich gibt es noch die
Erkrankungen, die sich hauptsächlich durch ausreichende Selenzufuhr vermeiden
lassen, wie Wachstumsstörungen vieler Tierarten, Pankreasdegenerationen bei
Küken und mangelnde Fruchtbarkeit beim Wiederkäuer.
Ein Selenmangel wird oft mit reproduktiven Störungen in Zusammenhang gebracht.
Stuten mit Problemen, wie eitrigen Gebärmutterentzündungen, wiederholtem
Umrossen, embryonalem Frühtod und Abort, wiesen einen geringen Selengehalt im
Blut auf (MAYLIN et al. 1980). Zusätzlich werden Agalaktie, verlängerte Tragezeit
und perinatale Sterblichkeit durch Selenmangel unterstellt (PULS 1994). LAVOIE
(2000) beschrieb die Zusammenhänge zwischen Abort und neonataler Sterblichkeit
mit der Selenmangelversorgung von Fohlen und tragenden Stuten. Dabei beschrieb
er die Symptome bei Fohlen und Mutterstuten, die in selenarmen Gebieten gehalten
wurden. Die Fohlen litten vermehrt an Muskeldegenerationen. Bei manchen
Jungtieren war der Herzmuskel und die Schlundmuskulatur mit betroffen, was zur
erhöhten neonatalen Sterblichkeit führte. Bei den Stuten vermutet LAVOIE einen
Zusammenhang zwischen der Selenmangelversorgung mit vermehrten Spätborten
und Nachgeburtsverhaltungen. Im Anschluss empfiehlt er eine Selenzufütterung von
1 mg pro Pferd täglich. Bei den so behandelten Pferden eines Betriebes stieg der
Selenblutspiegel und die Abort- und neonatalen Sterblichkeitsraten nahmen ab.
Selenoprotein P ist an der Entwicklung von Mausspermien beteiligt. Bei männlichen
Mäusen, denen dieses Protein fehlt (Sepp1-/-), entwickeln sich spezifische
Strukturdefekte im Spermienschwanz während der Spermiogenese. Diese Mäuse
sind unfruchtbar. Die Fertilität kann durch Selensupplementation nicht wieder
hergestellt
werden.
Die
Veränderungen
gleichen
jenen,
die
bei
19
Literaturübersicht
selenmangelernährten, normalen Mäusen (Sepp1+/+) auftreten. Hier können die
Defekte durch Selenzufuhr verringert werden (OLSEN et al. 2005).
Mit Hilfe eines Fütterungsversuchs bei Ratten wurde herausgefunden, dass die
Konzentration von Selen im Blut und anderen Geweben, bei einer Mangelversorgung
mit diesem Element, stark abnahm. Dagegen wich die Selenkonzentration im Hoden
nicht von den Werten der Kontrolltiere ab. Hieraus lässt sich schließen, dass die
Versorgung des Hodens mit Selen Vorrang vor der Versorgung der anderen Gewebe
hat (BEHNE et al. 1982).
Ein weiterer Versuch ergab, dass Selen einen wichtigen Einfluss auf die normale
Entwicklung der Hoden, auf die Testosteronsynthese und auf die Spermiogenese
hat. Heranwachsende Ratten, die eine Selenmangeldiät in der vierten Generation
bekamen, hatten stark reduzierte Hodengewichte von über 50 % und produzierten
keine ausdifferenzierten Spermien mehr. Durch eine im Folgenden ausreichende
Selenversorgung waren die Defizite reversibel (BEHNE et al. 1996).
Bei Menschen wurde festgestellt, dass sich sowohl eine zu hohe, als auch eine zu
niedrige Selenkonzentration im Sperma negativ auf die Motilität und die Morphologie
auswirkt. Bei sehr hohen Gehalten wurde ein Zusammenhang mit einer erhöhten
Abortrate und einer ovariellen Dysfunktion der Partnerinnen gesehen. Hier wurde
unterstellt,
dass
diese
die
gleichen
Voraussetzungen
bezüglich
der
Spurenelementversorgung hatten (BLEAU et al. 1984).
BERTELSMANN et al. (2005) untersuchten die Selengehalte im Sperma, im
Seminalplasma und in den Spermien von Hengsten. Sie erhielten folgende mittlere
Werte für die Trockenmassen: 2,90 ± 0,97 µg/g Sperma, 0,66 ± 0,18 µg/g
Seminalplasma und 12,3 ± 1,7 µg/g Spermien. Es konnte eine signifikant negative
Korrelation zwischen dem Selengehalt der Spermien und den Werten für die gestörte
Chromatinkondensation festgestellt werden. Dies bedeutet, dass ein geringerer
Selengehalt zu einer stärker gestörten Chromatinkondensation und somit zu einer
schlechteren Spermaqualität führt. Die Werte für Selen in den Spermien korrelierten
dahingegen positiv mit den Abfohlraten der Stuten, die von den untersuchten
Hengsten besamt worden waren.
20
Literaturübersicht
2.2.2 Zink
In über 300 Enzymen ist Zink an der Funktion beteiligt. Metalloenzyme mit Zinkanteil
sind Oxidoreductasen, Transferasen, Hydrolasen, Lyasen, Isomerasen und Ligasen.
Sie sind im Stoffwechsel von Proteinen, Kohlenhydraten, Fetten und Nukleinsäuren
integriert. Zudem ist das Element als Stabilisator von biologischen Membranen
wichtig. Zink spielt außerdem eine vielfältige Rolle bei der Produktion, Speicherung
und Sekretion verschiedener Hormone. Verhältnismäßig hohe Zinkgehalte kommen
in Augen, Leber, Inselzellen des Pankreas, Knochen, Haaren bzw. Federn und
Hoden vor. Die Gehalte in Prostata, Seminalplasma und reifen Spermien sind höher
als in anderen Organen.
Die Resorption von Zink findet hauptsächlich im Jejunum statt. Phytinsäure, welches
die Speicherform für Phosphor in Pflanzen ist, kann die Aufnahme von Zink hemmen.
Es bilden sich dabei Zink-Phytat-Komplexe, die schlecht löslich sind. Dieser Effekt
wird durch eine hohe Calciumzufuhr noch verstärkt. Zink wird meist an Albumin
gebunden transportiert. Im Organismus wird es nicht in großen Mengen gespeichert,
was zu einem raschen Mangel nach Verringerung der Zufuhr führt. Ausgeschieden
wird das Element überwiegend über den Faeces, wobei der Hauptteil aus dem
Pankreassaft kommt (LÖFFLER und PETRIDES 1998).
Chronischer
Zinküberschuss
führt
zu
Anämien,
Hämorrhagien
und
Gelenkschwellungen. Bei akuter Überversorgung kann es zu Magen-DarmGeschwüren, Brechdurchfällen und Kreislaufversagen kommen (BUDDECKE 1994).
Jungtiere zeigen bei Zinkmangel ein verzögertes Wachstum und Inappetenz. Durch
Störungen in der Keratinisierung kommt es typischerweise zu parakeratotischen
Hautveränderungen, Haarausfall bzw. schlechter Befiederung und verzögerter
Wundheilung (KIRCHGESSNER 2004). Bei männlichen Tieren kommt es zu
verzögerter Entwicklung und geringerem Wachstum der Hoden, Atrophie der
Samenkanälchen und einer gestörten Spermatogenese. Zudem kommt es zu Oligo-,
Astheno- und Teratozoospermie.
Der Androgengehalt
im Hoden und der
Testosterongehalt im Blut sinken (LEONARD-MAREK 2001).
Zink ist durch eine Isoform des zinkabhängigen ACE (Angiotensin converting
enzyme) an der Spermienreifung beteiligt. Dieses Enzym kommt nur bei bestimmten
21
Literaturübersicht
Spermiogeneseschritten in den Spermien vor. Physiologische Zinkgehalte im
Seminalplasma blockieren den Einstrom von ionisiertem Calcium und verhindern so
die frühzeitige Induktion der Akrosomreaktion. Zudem ist das Element verantwortlich
für die Verbindung zwischen Kopf und Schwanz der Spermien. Nach der Penetration
der Oozyte sinkt der Zinkgehalt, wodurch die Schwanzablösung veranlasst wird
(LEONADR-MAREK 2001).
BEHNE
et
al.
(1988)
Ejakulatfraktionen.
untersuchten
Sie
die
konnten
Gehalte
keine
von
Zink
Korrelationen
in
humanen
zu
den
Spermaqualitätsparametern wie Motilität, Vitalität, Geschwindigkeit und Morphologie
herstellen. HENKEL et al. (1999) konnten hingegen bei ihren Untersuchungen zu
Zinkgehalten in humanem Ejakulat und Seminalplasma eine negative Korrelation zur
Motilität und zur Geschwindigkeit der Spermien feststellen. Zudem stellte sich eine
positive Korrelation zu dem Prozentsatz der abnormal geformten Spermien und dem
Alter
der
Probanden
heraus.
Hieraus
ergab
sich
die
Notwendigkeit
der
Zinkelimination während der epididymialen Spermienreifung.
CHIA et al. (2000) erforschten die Gehalte von Zink in Blut und Seminalplasma und
verglichen
die
Werte
von
fruchtbaren
und
unfruchtbaren
Männern.
Die
Zinkkonzentrationen im Blut unterschieden sich zwischen den Gruppen nicht. Die
Seminalplasmagehalte waren jedoch bei den unfruchtbaren Probanden deutlich
niedriger. Außerdem konnte eine positive Korrelation zwischen den Werten im
Seminalplasma zu der Dichte, der Motilität und der Vitalität der Spermien
nachgewiesen werden.
PESCH et al. (2006) konnten in ihren Untersuchungen feststellen, dass die
Zinkgehalte im Seminalplasma von Hengsten negativ mit den Volumina und positiv
mit den Dichten der Ejakulate korrelieren. Sie schlossen daraus, dass die primäre
Herkunft des Zinks Hoden und Nebenhoden sind. BARRIER-BATTUT et al. (2002)
untersuchten unter anderem die Gehalte von Zink im Seminalplasma von fertilen
Hengsten und den Zusammenhang mit der Einfriertauglichkeit der Ejakulate. Sie
ermittelten einen Mittelwert von 26,5 ±10,7 nmol Zink pro ml Seminalplasma, konnten
aber keine Korrelation zwischen den Motilitäten nach dem Auftauen und dem
22
Literaturübersicht
Zinkgehalt feststellen. PESCH (2005) stellte dahingegen je nach Jahreszeit mittlere
Konzentrationen von 88,8 bis 128,0 nmol/ml fest.
2.2.3 Eisen
Etwa die Hälfte des Gesamteisengehaltes des Körpers ist an Hämoglobin gebunden.
Es übernimmt die Funktion der Sauerstoffbindung im Blut. Im Muskel übt es diese
Funktion in Zusammenhang mit Myoglobin aus. Zusätzlich hat Eisen, als Bestandteil
verschiedener Enzymsysteme, noch weitere Aufgaben. Beispiele sind hier die
Cytochrome in der Atmungskette, die Katalase als antioxidatives System und
Enzyme im Energiewechsel (KIRCHGESSNER 2004).
Eisen liegt in der Nahrung meist dreiwertig in Form von Eisenhyroxid oder in
organischen Verbindungen vor. Diese Moleküle werden gespalten und das Eisen in
die zweiwertige Form überführt. So ist es löslich und damit besser resorbierbar. Im
Duodenum wird es aufgenommen und zum Transport an Transferrin gebunden. Das
nicht benötigte Eisen wird in Form von Ferritin und Hämosiderin gespeichert. Dies
geschieht in der Leber, im Knochenmark, in der Milz aber auch in den
Darmepithelzellen.
Ausgeschieden
wird
Eisen
über
die
Galle,
die
Niere,
abgeschilferte Haut- und Darmepithelzellen und den Schweiß (LÖFFLER und
PETRIDES 1998).
Bei
einer
übermäßigen
Eisenzufuhr,
beispielsweise
bei
wiederholten
Erythrozytentransfusionen, kommt es zu einer Hämosiderose, also einer vermehrten
Speicherung ohne Gewebeschäden. Bei der Hämochromatose handelt es sich
hingegen um eine angeborene Erkrankung, bei der vermehrt Eisen resorbiert und
dann in Leber, Pankreas, Myokard, endokrinen Drüsen und Hoden eingelagert wird.
Folgen sind Hautpigmentierungen, Lebervergrößerung und Diabetes mellitus
(LÖFFLER und PETRIDES 1998).
Eisenmangel führt zu Anämien. Einhergehend damit sind vor allem bei Jungtieren
verminderte
Immunabwehr,
Appetitverlust
und
verzögertes
Wachstum
(KIRCHGESSNER 2004). Verursacht wird die Unterversorgung durch mangelnde
Zufuhr, erhöhten Verlust (Blutungen), erhöhten Bedarf (Trächtigkeit, Wachstum) und
Kupfermangel (s. Kapitel 2.2.4).
23
Literaturübersicht
Einerseits fungiert Eisen als Bestandteil der Katalase als Antioxidans, andererseits
ist es durch die Fenton-Reaktion (s. Kapitel 2.4) an der ROS-Produktion beteiligt und
wirkt somit auch gegenteilig. BERTELSMANN et al. (2008) untersuchten den
Eisengehalt im Ejakulat (11,4 nmol/ml), im Seminalplasma (3,2 nmol/ml) und in den
Spermien (27 nmol/109) von Hengsten. Ziel der Arbeit war herauszufinden, ob der
Eisengehalt eine Auswirkung auf die Chromatinkondensation in Spermien hat. Sie
konnten jedoch keine signifikanten Korrelationen zwischen den Eisengehalten und
dem DFI feststellen. PESCH et al. (2006) untersuchten den Gehalt von Eisen im
Seminalplasma von Hengsten und ermittelten dabei eine mittlere Konzentration von
1,9 nmol/ml. Hierbei konnte eine positive Korrelation zur Dichte und eine negative
Korrelation zum Volumen der Ejakulate hergestellt werden. Daraus konnte auf eine
hauptsächlich testikuläre und epididymiale Herkunft des Eisens im Seminalplasma
geschlossen werden.
2.2.4 Kupfer
Kupfer ist in vielen Proteinen enthalten. Vier Enzymsysteme sind dabei besonders
wichtig. Das erste ist das Ceruloplasmin, welches beim Eisenstoffwechsel das Eisen
oxidiert, damit es an das Transferrin gebunden und somit im Blut transportiert
werden kann. Weiterhin gibt es die Monoaminooxidasen zur Pigmentierung und zur
Kontrolle von Neurotransmittern und –peptiden. Im Bindegewebestoffwechsel findet
sich die Lysyloxidase, die das dritte Enzymsystem darstellt. Der vierte Bereich sind
die Metalloenzyme Cytochrom-c-Oxidoreductase im oxidativen Stoffwechsel und die
Superoxiddismutase bei der Beseitigung der Superoxidanionen (s. Kapitel 2.5.1.1)
(WOLFFRAM 2004).
Kupfer wird im Magen und im Duodenum resorbiert. Es wird im Blut zum Transport in
die Leber an Albumin oder Transcuprein gebunden. Dort wird es entweder
gespeichert oder direkt in Enzyme wie Ceruloplasmin eingebaut. Im Blut liegen bis zu
95 % des Kupfers an Ceruloplasmin gebunden vor. Ausgeschieden wird Kupfer in
geringen Mengen über den Urin. Der Hauptteil wird über die Faeces -teils nicht
resorbiertes Kupfer und teils in die Galle sezerniertes Kupfer- eliminiert (LÖFFLER
und PETRIDES 1998).
24
Literaturübersicht
Für Kupfer gibt es starke Toleranzunterschiede zwischen den verschiedenen
Tierarten. Besonders anfällig sind Schafe, bei denen es nach einer längeren
übermäßigen
Versorgung mit
Kupfer und
anschließender Stressphase
zur
Ausschüttung des Kupfers aus der Leber kommen kann. Es folgt eine hämolytische
Krise, bei der es zu Dyspnoe, Tachykardie, Ikterus und Hämoglobinurie kommen
kann (BICKHARDT 2001). Durch einen Kupfermangel kommt es zu einem Mangel an
Ceruloplasmin. Das hat zur Folge, dass das Eisen, welches in der Darmmukosa an
Ferritin gebunden ist, nicht in das Blut abgegeben werden kann. Daher kommt es im
Kupfermangel sekundär zu einem Eisenmangel und den damit verbundenen
Symptomen, auch wenn die Versorgung mit diesem Element ausreichend ist
(WOLFFRAM 2004). Zusätzlich entstehen im Kupfermangel Störungen in der
Pigmentierung und der Struktur des Fells, bei der Ausbildung von Nervensystem
(neonatale Ataxie) und Skelett (Verformung und erhöhte Brüchigkeit). Diese
Erscheinungen sind ebenfalls auf die Defekte in den kupferhaltigen Enzymsystemen
zurückzuführen (KIRCHGESSNER 2004). Kupfermangel geht auch mit einer
verminderten Hodenentwicklung einher. Die Hodenkanälchen sind unterentwickelt
und die Spermiogenese ist gestört. Die Ejakulate haben ein geringeres Volumen,
eine geringere Spermiendichte, eine verringerte Motilität und einen höheren Anteil an
Spermien mit veränderter Morphologie (LEONARD-MAREK 2001).
Bei den Untersuchungen von PESCH et al. (2006) wurde eine positive Korrelation
zwischen der Kupferkonzentration im Seminalplasma und dem Ejakulatvolumen bei
Hengsten ermittelt. Hieraus lässt sich schließen, dass dieses Kupfer seinen Ursprung
in den akzessorischen Geschlechtsdrüsen hat. Es wurden mittlere Gehalte von 17,8
nmol Kupfer pro ml Seminalplasma ermittelt. BARRIER-BATTUT et al. (2002)
konnten ähnliche Konzentrationen feststellen (20,9±18,9 nmol/ml).
2.2.5 Molybdän
Molybdän ist im Organismus in Leber, Milz, Nieren und in den höchsten
Konzentrationen im Skelett vorhanden. Es kommt in unterschiedlichen Enzymen vor.
Beispiele sind die Xanthinoxidase, die Aldehydoxidase und die Sulfitoxidase. Die
Xanthinoxidase wirkt katalytisch bei der Umwandlung von Hypoxanthin und Xanthin
zu Harnsäure. Molybdän beeinflusst auch die Kupferspeicherung. Bei zu hohen
25
Literaturübersicht
Molybdängehalten im Futter kann es in Anwesenheit von Sulfat, trotz ausreichender
Zufuhr von Kupfer, zu einem Kupfermangel kommen (KIRCHGESSNER 2004).
Bei
Molybdänmangel
Spermatogenese
und
im
Wachstum
einem
kommt
verringerten
es
zu
Gewicht
einer
der
verminderten
Hoden.
Ein
Versorgungsüberschuss führt zu Hodendegenerationen, reduzierter Spermiogenese
und verminderter Libido sexualis (LEONARD-MAREK 2001).
2.2.6 Mangan
Mangangehalte sind in Skelett, Leber, Niere und Pankreas vergleichsweise hoch.
Das Element ist Bestandteil verschiedener Enzyme. Durch Pyruvatcarboxylase
nimmt es an der Gluconeogenese und durch Arginase an der Harnstoffsynthese teil.
In Zusammenhang mit der Superoxiddismutase ist es auch für dessen antioxidative
Wirkung mitverantwortlich (s. Kapitel 2.5.1.1).
Nach der Resorption wird Mangan an ein beta-Globulin gebunden und anschließend
meist in den Mitochondrien gespeichert. Die Ausscheidung erfolgt hauptsächlich über
die Galle, aber auch über den Pankreassaft (LÖFFLER und PETRIDES 1998).
Manganmangel
führt
zu
Wachstumsdepressionen,
Skelettfehlentwicklungen,
Fruchtbarkeitsproblemen und neurologischen Störungen (KIRCHGESSNER 2004).
Durch Mangel während des Wachstums kommt es zu einer gestörten Entwicklung
der Hodenkanälchen. Die Motilität und die Morphologie von Spermien können
negativ beeinflusst werden (LEONARD-MAREK 2001). Bei Stuten kann es zu
verspätetem Östrus, verringerter Fertilität und spontanen Aborten kommen (PULS
1994).
Bei einer Manganüberversorgung kommt es zu einer verringerten Spermatogenese
und einer geringeren Spermiendichte in den Hodenkanälchen (LEONARD-MAREK
2001).
2.3 Vitamine
Vitamine sind Verbindungen, die als essentielle Bestandteile mit der Nahrung
aufgenommen werden müssen. Sie werden in zwei Gruppen geteilt, in die fett- und
die wasserlöslichen Vitamine. Im Körper übernehmen sie regulatorische oder
katalytische Funktionen. Daher kommt es bei einer Unterversorgung zu mehr oder
26
Literaturübersicht
weniger spezifischen Krankheitssymptomen. Die empfohlene Zufuhr ausgewählter
Vitamine ist in den Tabellen 3 und 4 dargestellt.
2.3.1 Vitamin A
Über die Nahrung wird beta-Karotin und Vitamin A (Retinol) aufgenommen. Das auch
als Provitamin A bezeichnete beta-Karotin wird im Organismus zu Vitamin A
umgewandelt und so der Bedarf gedeckt. Katzen sind zu diesem Schritt nicht fähig,
sie müssen ihren gesamten Bedarf über aufgenommenes Retinol decken (SENGER
2004). Vitamin A ist ein fettlösliches Vitamin, dessen Hauptaufgaben im Sehvorgang,
im Wachstum, in der Reproduktion, in der Differenzierung von Epithelien (MC
DOWELL 2000) und in der Unterstützung des Immunsystems (SENGER 2004) zu
finden sind.
Tabelle 3: Vitaminbedarf beim Pferd pro kg Trockenmasse Futter (MC DOWELL
2000)
Vitamin A
Vitamin D
Vitamin E
Vitamin B1
Vitamin B2
[IE]
[IE]
[IE]
[mg]
[mg]
Wachstum
2000
800
80
3
2
Erhaltung
2000
300
50
3
2
Arbeit
2000
300
80
5
2
Trächtigkeit
3000
600
80
3
2
Laktation
3000
600
80
3
2
Tabelle 4: Vitaminbedarf beim Pferd bezogen auf das Körpergewicht
(KAMPHUES et al. 2004)
Pro kg
KM/Tag
Vitamin A [IE]
Vitamin D [IE]
50-150
10-20
Vitamin E
[mg]
0,1-1
Karotin [mg]
~1
27
Literaturübersicht
Eine bedarfsüberschreitende Vitamin A-Versorgung wirkt sich negativ auf den
Vitamin E-Gehalt im Organismus aus. Die Tocopherolkonzentration sinkt, was an der
eventuellen Hemmung der Vitamin E-Aufnahme durch Retinol liegen kann (SENGER
2004).
Vitamin A wird im Dünndarm über die Fettresorption in den Körper aufgenommen.
Dabei entsteht Retinal aus beta-Karotin, welches anschließend über Chylomikronen
in die Leber transportiert wird. Dort und im Fettgewebe wird das Vitamin als
Retinylpalmitat gespeichert und kann bei Bedarf wieder freigesetzt werden
(LÖFFLER und PETRIDES 1998). An spezielle Transportproteine gebunden, gelangt
es dann an seinen Bestimmungsort. Die Ausscheidung von Vitamin A erfolgt zu
gleichen Teilen über Kot und Urin.
Bei einer Hypovitaminose kommt es durch die Speicherung des Vitamins erst nach
Erschöpfung der Reserven zu Mangelsymptomen. Hierbei können verschiedene
spezifische
und
unspezifische
Symptome
auftreten.
Allgemein
entstehen
Appetitmangel, schlechtes äußeres Erscheinungsbild, reduzierte Fruchtbarkeit und
Gewichtsverlust. Die Epithelien des gesamten Organismus verhornen, was je nach
Lokalisation zu entsprechenden Folgen führt. Beim Pferd kommt es bei einer
Hypovitaminose zu Nachtblindheit, Lakrimation, Keratinisierung von Kornea und
Atmungstrakt, Reproduktionsstörungen, vermindertem Appetit, voranschreitender
Schwäche und Tod. In Bezug auf die Fruchtbarkeit hat ein Vitamin A-Mangel bei den
meisten Tieren negative Auswirkungen. Beim weiblichen Tier äußert sich dies meist
in Resorptionen der Frucht, Aborten, Totgeburten (MC DOWELL 2000) oder
lebensschwachen und missgebildeten Nachkommen (SENGER 2004). Männliche
Tiere mit einem Retinolmangel haben meist eine verringerte sexuelle Aktivität,
Spermiogenesestörungen und degenerierte Hoden. Nach einer umfangreichen
Literaturstudie kommt SENGER (2004) zu der Schlussfolgerung, dass Vitamin A
unerlässlich für die Fruchtbarkeit bei Ratten ist. Männliche Tiere benötigen das
Vitamin für eine geregelte Spermiogenese; bei weiblichen Individuen ist es
notwendig für einen normalen Zyklus und für die Aufrechterhaltung der Gravidität.
Zudem ist es für eine ungestörte Embryonal- und Fetalphase erforderlich. Die
Literatur zu einem Vitamin A-Mangel bei Pferden (GUILBERT et al. 1940, HOWELL
28
Literaturübersicht
et al. 1941) beurteilt SENGER (2004) als Hinweis darauf, dass das Vitamin eine
ähnliche Funktion bei der Reproduktion dieser Tierart ausübt wie bei Ratten.
Eine Überversorgung entsteht erst bei einer hundertfachen Überdosierung der
empfohlenen Tagesdosis und ist somit meist iatrogen verursacht. Charakteristische
Symptome sind Skelettdeformationen, spontane Frakturen und innere Blutungen.
Unspezifische
Anzeichen
sind
Appetitverlust,
verzögertes
Wachstum,
Gewichtsverlust, unterdrückte Verhornung, verlängerte Blutgerinnungszeit, Anämie,
Enteritis, Konjunktivitis (MC DOWELL 2000) und kongenitale Veränderungen wie
Gaumenspalten (SENGER 2004).
2.3.2 Vitamin E
Auch Vitamin E (alpha-Tocopherol) ist ein fettlösliches Vitamin, welches über die
Nahrung aufgenommen werden muss. Die wichtigste Funktion des Vitamins ist seine
Wirkung als Antioxidans. Es reagiert mit Radikalen und unterbricht so Radikalketten,
wie bei der Lipidperoxidation. Damit schützt es den Organismus vor oxidativem
Stress. Dies spielt unter anderem in Spermien eine wichtige Rolle (s. Kapitel 2.4.2).
Zudem
hat
alpha-Tocopherol
eine
Bedeutung
bei
der
Funktion
von
Reproduktionstrakt, Muskeln, Kreislauf-, Nerven- und Immunsystem (MC DOWELL
2000).
Eine wichtige Beziehung besteht zwischen den Funktionen von Vitamin E und Selen.
Bei Selenmangel kann Vitamin E den Symptomen vorbeugen oder sie verzögern.
Umgekehrt übt Selen einen Vitamin-E-einsparenden Effekt aus und kann auch die
Symptome bei einem Mangel aufschieben (MC DOWELL 2000). Selen ist als
Bestandteil der Glutathionperoxidase (GPx) auch eine wichtige Komponente der
antioxidativen Kapazität im Organismus. Unter anderem ist die GPx auch für die
Regeneration von Vitamin E zuständig und hilft so, die antioxidative Wirkung
auszuüben (s. Kapitel 2.5.2.1).
Die Resorption findet hauptsächlich im Dünndarm statt. Durch die Fettlöslichkeit wird
das Vitamin zusammen mit dem Fett in den Körper aufgenommen. Über die Lymphe
gelangt es dann in den Kreislauf. Gebunden an Lipoproteine gelangt Vitamin E in die
Speicherorgane. Diese sind hauptsächlich die Leber, aber auch Fettgewebe und die
Muskulatur (MC DOWELL 2000). In diesen Geweben ist es dann vor allem in den
29
Literaturübersicht
Zellmembranen
angereichert
(SENGER
2004).
Alpha-Tocopherol
ist
nicht
plazentagängig, im Kolostrum ist es jedoch in hoher Konzentration vorhanden. Auch
aus diesem Grund ist eine gute Biestmilchversorgung zu gewährleisten. Der
Hauptteil des Vitamin E gelangt über die Galle zur Ausscheidung. Weniger als ein
Prozent wird über die Niere ausgeschieden.
Symptome bei einer Unterversorgung mit Vitamin E sind sehr vielfältig und zeigen
inter-
und
intraspeziesspezifische
Unterschiede.
Allgemein
kommt
es
zur
Muskeldegeneration, zentralnervösen Symptomen, Verfärbungen des Körperfettes
und Reproduktionsstörungen (SENGER 2004). Ein Symptom, das alle Tierarten
gemein haben, ist die Muskeldystrophie, bei welcher die Skelett- und Herzmuskulatur
gleichermaßen betroffen sind. Es besteht hier ein Zusammenhang zwischen dem
Mangel an Vitamin E und Selen („Weißmuskelkrankheit“). In Bezug auf die
Reproduktion führt nach SENGER (2004) ein Vitamin E-Mangel bei weiblichen
Ratten zur Fruchtresorption und bei männlichen zur Hodendegeneration. Bei den
anderen Tierarten kann eine solche Aussage nicht belegt werden. HOFFMANN et al.
(1999) konnten eine Erhöhung des IgG-Spiegels bei laktierenden Stuten und ihren
Fohlen feststellen, nachdem sie den Vitamin E-Gehalt peripartal im Futter der
Mutterstuten erhöht hatten.
Alpha-Tocopherol ist kaum toxisch. Eine Überdosierung ist somit erst bei sehr hohen
Dosen und nur iatrogen zu erreichen. Bei Hühnern konnten dabei eine
Wachstumsdepression, ein verringerter Hämatokritwert und eine verlängerte
Prothrombinzeit festgestellt werden (MC DOWELL 2000). Kombiniert mit einem
Vitamin K-Mangel konnte eine Vitamin E-Überdosierung zur Gerinnungshemmung
bei Ratten beitragen (SENGER 2004). Bei Menschen kommt es bei einer täglichen
Dosis von bis zu 1000 IE Vitamin E zu Kopfschmerzen, Müdigkeit, Übelkeit und
Muskelschwäche (MC DOWELL 2000).
2.4 Reactive oxygen species (ROS)
Unter bestimmten Voraussetzungen können durch Sauerstoff im Körper besonders
reaktionsfähigen Radikale, die so genannten reactive oxygen species (ROS),
entstehen. Diese reagieren leicht mit organischen Verbindungen und verändern ihren
30
Literaturübersicht
Reaktionspartner entweder durch Oxidation oder Reduktion. Dabei wird eine
Kettenreaktion gestartet, die zu einer Veränderung von biologischen Strukturen führt.
Besonders anfällig für eine Reaktion mit ROS sind mehrfach ungesättigte Fettsäuren,
wie sie in Biomembranen vorkommen (GRIVEAU und LE LANNOU 1997). In Tabelle
5 sind alle bekannten ROS-Typen aufgeführt.
Sauerstoffradikale entstehen oft durch Ein-Elektronenreduktionen (LÖFFLER und
PETRIDES
1998).
Diese
führen
zum
Superoxidradikal
(O2-°),
welches
Hydrogenperoxid (H2O2) bildet. Das H2O2-Radikal scheint der Hauptgrund für den
zytotoxischen Effekt auf Spermien zu sein (BAUMBER et al. 2000). Als letztes
entsteht aus dem Wasserstoffperoxid das Hydroxylradikal (OH°). Dieser letzte Schritt
ist meist metallkatalysiert und läuft nach der Fenton-Reaktion (FENTON 1984) ab.
H2O2 + Fe2+ Fe3+ + OH- + OH°
Das Hydroxylradikal ist sehr reaktiv und in vielen Fällen der Beginn der
Kettenreaktion bei der Lipidperoxidation. Oft ist Eisen als metallischer Katalysator in
dieser Reaktion vertreten. Im Körper kommt es aber meistens als Fe3+ im Komplex
mit beispielsweise Ferritin oder Lactoferritin vor und kann somit die Reaktion nicht
fördern. Einerseits wird vermutet, dass Eisen und Kupfer im Seminalplasma in freier
Form vorkommen (KWENANG et al. 1987). Andererseits könnte das Superoxidanion
die Lösung des Eisens aus dem intrazellulären Ferritin und seine Umwandlung zu
Fe2+ ermöglichen (BIEMOND et al. 1984).
Fe3+ + O2-° Fe2+ + O2
Diese beiden Gleichungen können in der Haber-Weiss-Reaktion zusammengefasst
werden:
H2O2 + O2-° O2 + OH° + OH-
31
Literaturübersicht
Im Körper können ROS von vielen verschiedenen Zellen produziert werden. Im
Sperma kommen zweierlei Typen in Betracht. Zum einen sind das Leukozyten, die
durch Kontamination ins Ejakulat gelangen (AITKEN und WEST 1990) und zum
anderen die Spermien selbst (ALVAREZ et al. 1987). Hierbei werden zwei mögliche
Entstehungsmechanismen diskutiert. Einerseits eine NADPH-Oxidase, die sich in der
Plasmamembran der Spermien befindet (AITKEN et al. 1992) und andererseits eine
Spermiendiaphorase
(eine
NAD(P)H-abhängige
Oxireduktase),
die
sich
im
Mittelstück befindet und an der mitochondrialen Atmungskette beteiligt ist (GAVELLA
und LIPOVAC 1992).
Bei den ROS-Wirkungen auf Spermien muss man zwischen physiologischen und
pathologischen Prozessen unterscheiden.
Tabelle 5: Typen von ROS
Radikal
Name
O2-°
Superoxidanion
H2O2
Hydrogenperoxid
ROO°
Peroxylradikal
OH°
Hydroxylradikal
2.4.1 Physiologische ROS-Wirkung auf Spermien
Allgemein üben ROS im Körper verschiedene physiologische Funktionen aus. Sie
helfen bei Regulationsprozessen, Elektronentransferreaktionen und sind durch ihre
bakterizide Wirkung an der unspezifischen Bakterienabwehr beteiligt (AITKEN und
FISHER 1994). Speziell bei den Spermien sind sie in niedrigen Konzentrationen
wichtig für verschiedene Prozesse. AITKEN et al. (1989) fanden heraus, dass eine
moderate Lipidperoxidation die Bindungsfähigkeit humaner Spermien zur Zona
pellucida verbesserte. BIZE et al. (1991) entdeckten den Zusammenhang zwischen
dem Vorhandensein von Hydrogenperoxid und der Induktion der Kapazitation bei
Spermien von Hamstern. Die Stimulation der Kapazitation durch Hydrogenperoxid
äußert sich in einem frühen Auftreten der Hyperaktivität, in der Fähigkeit zur
32
Literaturübersicht
kalziuminduzierten Akrosomreaktion (GRIVEAU et al. 1994) und in einer erhöhten
Fusionsrate zwischen Spermien und Oozyten (AITKEN et al. 1995). Weiterhin
können auch Superoxidanionen die Kapazitation und Akrosomreaktion fördern und
die Hyperaktivität stimulieren (DE LAMIRANDE und GAGNON 1993a, b). BLONIN et
al. (1997) beschrieben die Notwendigkeit einer niedrigen ROS-Konzentration, damit
Spermium und Oozyte beim Rind fusionieren können.
2.4.2 Pathologische ROS-Wirkung auf Spermien
Die negativen Wirkungen der reaktiven Sauerstoffradikale werden allgemein als
oxidativer Stress zusammengefasst.
Die Plasmamembran von Spermien hat einen hohen Anteil von ungesättigten
Fettsäuren. Diese gewährleisten ihnen Beweglichkeit, aber auch Integrität. Bei der
Lipidperoxidation binden die Sauerstoffradikale ein Wasserstoffatom aus einer
ungesättigten Fettsäure und wandelt diese wiederum zu einem Radikal. Dieses
Radikal bildet mit Sauerstoff ein Peroxidradikal, welches wiederum andere
ungesättigte Fettsäuren angreift. Dies führt zu einer Kettenreaktion. Das Ergebnis
der Lipidperoxidation sind strukturelle und funktionelle Schäden an der Membran,
was unter anderem zu einer erhöhten Permeabilität führt. Somit kommt es zum
Verlust intrazellulärer Bestandteile (Enzyme, Koenzyme, Elektrolyte), die für die
Kontrolle der Spermienbewegung wichtig sind (BAUMBER et al. 2000). Außerdem
agglutinieren Spermien mit einer defekten Plasmamembran leichter miteinander
(SIEGEL et al. 1986). Die Fluidität der Membran wird herabgesetzt, was die
Fusionseigenschaften des Spermiums mit der Oozyte negativ beeinflusst (BALL
2008).
Nicht nur die Plasmamembran der Spermien ist ein Angriffspunkt der ROS, auch die
Mitochondrienmembranen sind gefährdet. Bei Versuchen mit humanen Spermien
wurde das mitochondrienreiche Mittelstück als einer der Hauptangriffspunkte der
ROS charakterisiert (SIKKA 2001). Durch die Schäden an den Mitochondrien kommt
es zu einem intrazellulären ATP-Abfall und somit zu Motilitätseinbußen.
Obwohl das Superoxidanion das erste Produkt der ROS-Produktion ist, scheint das
membranpermeable Wasserstoffperoxid das gefährlichste Radikal für Spermien zu
33
Literaturübersicht
sein. Bei einer Studie wurden Hengstspermien exogen produzierten ROS
ausgesetzt. Dabei stieg die Hydrogenperoxidproduktion, und die Motilität der
Spermien nahm ab (BAUMBER et al. 2000). Hierbei wurden noch keine
Veränderungen
an
Vitalität,
Akrosomintegrität
oder
mitochondrialem
Membranpotential erkannt. BALL (2008) schließt daraus, dass die Motilität als erster
sensibler Indikator für oxidativen Stress gewertet werden kann.
Die ROS sind auch Ursache für DNS-Schäden. Bei einer Studie mit Hengstsperma
wurde eine positive Korrelation zwischen der zugeführten ROS-Konzentration und
dem Ausmaß der Chromatinschäden nachgewiesen (BAUMBER et al. 2003).
Eine deutlich erhöhte ROS-Produktion findet in morphologisch und funktionell
abnormalen Spermien statt, vor allem in solchen die noch Residualzytoplasma
beinhalten. Dies führt dazu, dass die restlichen vitalen Spermien einem erhöhten
oxidativen Stress ausgesetzt sind. Die Menge der von defekten menschlichen
Spermien produzierten ROS reicht aber nicht aus, um die Motilität der intakten
Spermien zu stören. Dies verhält sich anders bei ROS, die von Leukozyten
produziert werden. Hier können durchaus so hohe Konzentrationen entstehen, dass
die Motilität menschlicher Spermien negativ beeinflusst wird (PLANTE et al. 1994).
Beim Hengst kann dieser Effekt nur durch eine Genitalinfektion und eine somit stark
erhöhte Leukozytenzahl im Sperma hervorgerufen werden, da die Motilität der
Pferdespermien erst bei einer viel höheren Konzentration an ROS gestört wird
(BAUMBER et al. 2002).
SHARMA et al. (1999) entwickelten eine Berechnungsmethode, bei der sie die ROSKonzentration und die totale antioxidative Kapazität (TAC) von Spermaproben in
Relation setzten. Dieses Verhältnis empfehlen sie als Maß für den oxidativen Stress
und somit als Methode, um Unfruchtbarkeit bei Männern vorauszusagen.
2.5 Antioxidantien
Damit die Produktion der ROS und somit der oxidative Stress im Körper nicht über
das physiologische Maß hinausgehen, gibt es Systeme, die Radikale abfangen und
binden können. Auf diese Weise entsteht ein Gleichgewicht zwischen ROS-Bildung
und ROS-Eliminierung. Diese so genannten Antioxidantien lassen sich in eine
34
Literaturübersicht
enzymatische und eine nichtenzymatische Gruppe teilen. Die enzymatischen
Antioxidantien bilden meist einen Komplex mit einem Spurenelement; die wichtigsten
nichtenzymatischen Antioxidantien gehören zu den Vitaminen. Daher ist eine
ausreichende Versorgung mit diesen Stoffen für die Bekämpfung des oxidativen
Stresses unbedingt notwendig. Die Spermien selbst scheinen nur über eine
begrenzte Menge an antioxidativen Stoffen zu verfügen. Dagegen scheint das
Seminalplasma eine höhere antioxidative Kapazität zu besitzen. Daher wird die
Entfernung
des
Seminalplasmas
bei
der
Samenaufbereitung
für
die
Gefrierkonservierung kontrovers diskutiert (BALL 2008).
2.5.1 Enzymatische Antioxidantien
In den Spermien kommen intrazellulär drei wichtige Enzymsysteme vor, die am
Abbau von ROS beteiligt sind. Dies sind die Superoxiddismutase (SOD), die
Katalase
und
die
(GPx).
Sie
bilden
zusammen
ein
Schutzsystem gegen die Sauerstoffradikale.
2.5.1.1
Superoxiddismutase
Die Superoxiddismutase (SOD) ist ein Metalloenzym. Das bedeutet, dass sie in
ihrem aktiven Zentrum Metallionen enthält. Beim Menschen bildet das Enzym im
Hoden mit verschiedenen Metallen Komplexe. Im Zytosol ist die SOD mit Kupfer und
Zink, in den Mitochondrien mit Mangan und extrazellulär mit Kupfer verbunden. Bei
Untersuchungen an Sperma von unterschiedlichen Tieren war die Enzymaktivität von
SOD bei Eseln und gleich danach bei Pferden am höchsten. Dann folgten Kaninchen
mit einem hohen Gehalt im Seminalplasma, aber einer geringen Konzentration in den
Spermien selbst. Beim Eber verhielt es sich genau umgekehrt: hier war der Gehalt im
Seminalplasma geringer und in den Spermien vergleichsweise hoch. Tiere mit den
geringsten Gehalten waren Rinder, Schafe und Hähne (MENELLA und JONES
1980). Beim Eber näher untersuchte intrazelluläre SOD enthielt Kupfer und Zink.
Meist befindet sich die SOD intrazellulär. Bei Equiden ist der Gehalt auch
extrazellulär, d.h. im Seminalplasma sehr hoch, was mit der Sekretion über die
akzessorischen Geschlechtsdrüsen erklärt wird (MANN 1964). Vermutet wird ein
35
Literaturübersicht
Zusammenhang mit der Samenleiterampulle, die bei Eseln und Pferden besonders
ausgeprägt entwickelt ist (MENELLA und JONES 1980).
Die Funktion der Superoxiddismutasen ist die Katalyse der Oxidation der
Superoxidanionen (O2-°) zurück zu Sauerstoff (O2) und zu Wasserstoffperoxid H2O2
(SIKKA 2001).
2 O2-° + 2 H+ H2O2 +O2
Auf diese Weise wird die Kettenreaktion der Lipidperoxidation unterbrochen und die
Spermien werden vor den negativen Auswirkungen geschützt. CASSANI et al. (2005)
konnten in ihrer Studie eine negative Korrelation zwischen der SOD-Aktivität und der
Konzentration der Lipidperoxide im Sperma von Rüden nachweisen. Das Maß für die
Lipidperoxidation wurde hierbei in nmol TBARS pro 108 Spermien angegeben
(TBARS= Thiobarbituric reactive substance). Die TBARS-Konzentration wird nach
einer Untersuchungsmethode von Aitken et al. (1993) über Fluoreszenzspektrometrie
ermittelt. CASSANI et al. schließen aus ihren Ergebnissen auf einen Schutzeffekt
des Enzyms SOD gegen oxidativen Stress.
Bei einem Kälteschock, beispielsweise bei Tiefgefrierkonservierung von Sperma,
steigt die Lipidperoxidation rapide an, da die SOD fast vollständig inaktiviert wird
(MENELLA und JONES 1980). Die physiologische Funktion der Superoxidanionen
bei der Hyperaktivierung und der Kapazitation wird durch Zugabe von SOD
verhindert (DE LAMIRANDE et al. 1993).
2.5.1.2
Katalase
Die Peroxidase Katalase ist entscheidend für die Eliminierung des Hydrogenperoxids
(H2O2). Es katalysiert die Umwandlung dieser sehr aggressiven Moleküle zu Wasser
und Sauerstoff. Damit beendet es den Schritt der Entgiftung, der durch die SOD
begonnen wurde.
2 H2O2 2 H2O + O2
36
Literaturübersicht
Die Katalase besitzt als funktionelle Gruppe das Hämin, welches im Zentrum ein
dreiwertiges Eisenatom trägt. Es ermöglicht dem Enzym die Übertragung von
Elektronen (BUDDECKE 1994). GRIVEAU et al. (1995) behandelten humane
Spermien
mit
einer
Sauerstoffradikale
zu
Kombination
von
Xanthin
produzieren.
Dabei
und
fanden
sie
Xanthinoxidase,
heraus,
dass
um
die
Enzymaktivitäten von hinzu gegebener SOD und GPx gehemmt wurden. Katalase
konnte diese Hemmung verhindern.
BALL et al. (2000) konnten in Pferdesperma eine hohe Katalaseaktivität nachweisen,
die ihren Ursprung in den Prostatasekreten hat. Die Aktivität war jedoch in den
separierten Samenzellen höher als im Seminalplasma. Daher wurde angenommen,
dass sich das Enzym bevorzugt an die Spermien anlagert.
Katalase kann die durch ROS induzierten Chromatinschäden blockieren (BAUMBER
et al. 2003). In anderen Studien (BALL et al 2001, AURICH et al. 1997) konnte kein
positiver Effekt der Katalase auf die Motilität, die Membranintegrität oder die
Akrosomintegrität von Hengstspermien bei flüssig konserviertem Sperma festgestellt
werden. AURICH et al. (1997) wiesen in höheren Konzentrationen (1,8 x 106 U/l)
sogar eine Hemmung der Motilität durch Katalase nach.
2.5.1.3
Die Glutathionperoxidase (GPx) ist ein Enzym, welches Selen enthält. Wie alle
anderen Proteine, die Selen enthalten, enthält es das Element als kovalent
gebundenes Selenocystein. Wie die Katalase katalysiert die GPx die Reduktion von
Hydrogenperoxid und außerdem von organischen Hydroperoxiden. Es greift somit
direkt in die Lipidperoxidation ein und verhindert die oxidativen Schäden an den
Zellen. Insgesamt sind bis jetzt fünf Glutathionperoxidasen benannt worden, welche
in Tabelle 6 aufgeführt sind (BEHNE und KYRIAKOPOULOS 2001).
Für die antioxidative Wirkung in Spermien sind die PHGPx und die snGPx wichtig.
Die PHGPx kommt im Zytosol oder membranassoziiert vor und spielt eine wichtige
Rolle in der Spermatogenese. STRADAIOLI et al. (2006) fanden keinen
Zusammenhang
zwischen
Ejakulatparametern
wie
Volumen,
Dichte,
Vorwärtsmotilität und der Aktivität von PHGPx im Sperma von Hengsten. Bei Bullen
konnten solche Beziehungen nachgewiesen werden (STRADAIOLI et al. 2004).
37
Literaturübersicht
URSINI et al. (1999) erkannten in PHGPx zusätzlich ein Stukturprotein, welches in
den ausgereiften Spermien im Mittelstück für Stabilität sorgt.
Die snGPx tritt in den Kernen der späten Spermatiden auf. Die kondensierte Struktur
des Chromatins am Ende der Spermienreifung wird durch Querverbindungen der
Thiolgruppen der Protamine stabilisiert. Für die Bildung dieser Disulfidbrücken wird
die snGPx verantwortlich gemacht. Das Enzym ist somit wichtig für die
Spermienreifung und die männliche Fruchtbarkeit (BEHNE und KYRIAKOPOULOS
2001, BERTELSMANN 2007).
Tabelle 6: Die verschiedenen Glutathionperoxidase-Typen
Zytosolische oder klassische GPx
Gastrointestinale GPx
Plasma GPx
Abkürzung
cGPx
GI-GPx
pGPx
Phospholipid hydroperoxide GPx
PHGPx
Sperm nuclei GPx
snGPx
2.5.2 Nichtenzymatische Antioxidantien
Zu den nichtenzymatischen Antioxidantien gehören Vitamine, wie Vitamin E und
Vitamin C, sowie die Vorstufe von Vitamin A, das beta-Karotin. Auch anderen Stoffen
werden antioxidative Wirkungen zugeschrieben.
2.5.2.1
Vitamin E
Vitamin E fungiert als inter- und intrazellulärer Radikalfänger und macht so die ROS
unschädlich, die sonst die ungesättigten Fettsäuren der Membranen angreifen
würden. Es führt so dazu, dass die Kettenreaktion unterbrochen wird. Dabei wird
Vitamin E selbst oxidiert (MC DOWELL 2000); anschließend wird das entstandene
Radikal durch Reaktion mit beispielsweise Ascorbinsäure oder Glutathionperoxidase
wieder reduziert (SENGER 2004).
38
Literaturübersicht
In verschiedenen Studien wurde die Wirkung von Vitamin E und seinem
synthetischen Analog Trolox auf die Spermaqualität untersucht. BREININGER et al
(2004) konnten einen schützenden Effekt von Vitamin E gegen oxidativen Stress bei
gefrierkonservierten Spermien von Ebern feststellen. Zu ähnlichen Ergebnissen
kamen PENA et al. (2003), welche die Wirkung von Trolox beim Einfrieren
verschiedener Ejakulatfraktionen von Ebern prüften. BALL et al. (2001) konnten
hingegen keine Wirkung von Vitamin E auf die Motilität von flüssigkonservierten
Hengstspermien feststellen. Bei Pferdespermien wurde eine Verringerung der durch
Abkühlung und Lipidperoxidation entstandenen Schäden mittels einer Zugabe von
Vitamin E beobachtet. Als Ursache wird eine erhöhte Zellatmung vermutet (AGUERO
et al. 1994).
2.5.2.2
Vitamin C
Vitamin C (Ascorbinsäure) ist das wichtigste extrazelluläre Antioxidans. Es schützt
die Biomembranen vor Lipidperoxidation, indem es die Peroxylradikale neutralisiert,
bevor diese die Kettenreaktion starten können (MC DOWELL 2000). Weiterhin
reduziert es oxidiertes Vitamin E wieder (LÖFFLER und PETRIDES 1998) und
schützt die Aktivität der Superoxiddismutase (BECONI et al. 1993). Somit ist es in
doppelter Hinsicht an der Verhinderung von oxidativem Stress beteiligt: Zum einen
durch direkten Eingriff in die Lipidperoxidation und zum anderen durch Unterstützung
anderer antioxidativen Systeme.
Im Seminalplasma ist das Vitamin in einer zehnfachen Konzentration, verglichen mit
dem Blutserum, vorhanden. Verringerte Werte haben eine Agglutination der
Spermien zur Folge. MC DOWELL (2000) folgert daraus einen speziellen
Spermienschutz vor oxidativem Stress durch Vitamin C. AEHNELT (1950) konnte
eine
positive
Korrelation
zwischen
den
natürlichen
Konzentrationen
von
Ascorbinsäure im Pferdesperma und den Motilitäts- und Vitalitätswerten belegen. In
Untersuchungen zur Auswirkung von hinzu gegebenem Vitamin C auf Merkmale der
Spermaqualität von flüssig konserviertem Hengstsperma konnten AURICH et al.
(1997) einen positiven Effekt auf die Membranintegrität feststellen. BALL et al. (2001)
konnten nach der Zugabe von Vitamin C, allein oder in Kombination mit anderen
antioxidativ wirkenden Substanzen, keine Verbesserung der Motilität nachweisen.
39
Literaturübersicht
2.5.2.3
Weitere Antioxidantien
Beta-Karotin
kann
ebenfalls
antioxidativ
wirken,
indem
es
die
reaktiven
Sauerstoffradikale deaktiviert und so die Lipidperoxidation verhindert. Reagiert das
Provitamin mit den ROS, oxidiert es die Radikale zu Polyencarbonylen und geht
dabei selbst in einen Triplettzustand über. Durch Wärmeabgabe kann es wieder in
den Ausgangszustand zurückkehren (BUDDECKE 1994). In einer Studie mit
Besamungsebern
wurde
festgestellt,
dass
die
antioxidative
Kapazität
des
Stoffwechsels durch beta-Karotin zwar gesteigert werden kann, unter Stress konnte
es die ungesättigten Fettsäuren der Samenzellen jedoch nicht vor Oxidation
schützen (WEMHEUER et al. 1996).
HECZKO (2004) untersuchte den Einfluss der Fütterung von Astaxanthin, einem
antioxidativ wirkenden Karotinoid, auf die Spermaqualität und Fruchtbarkeit bei
Warmbluthengsten. Dabei konnte sie einen Einfluss der Zufütterung auf die
Vorwärtsmotilität der Spermien beim Frischsamen und auf die Peroxidkonzentration
der tiefgefrorenen Spermien feststellen. Zudem war eine Verbesserung der
Abfohlraten pro Rosse durch die Astaxanthinfütterung zu beobachten.
Bei Xanthurensäure wird ein Schutz vor der Lipidperoxidation bei Spermien vermutet,
der Mechanismus ist aber bislang unbekannt (DENNISTON et al. 2000).
BAUMBER et al. (2003) konnten einen schützenden Effekt von reduziertem
Glutathion auf das Chromatin in Hengstspermien gegen ROS feststellen.
FUNAHASHI und SANO (2005) untersuchten die Effekte bei der Zugabe von
Glutathion, Cystein und Hypotaurin zum Verdünner bei gekühlt gelagertem
Ebersperma. Es konnte eine positive Wirkung von Glutathion und Cystein auf die
Vitalität der Spermien festgestellt werden.
40
Material und Methoden
3 Material und Methoden
3.1 Versuchsgruppen
Als
Versuchstiere
dienten
39
Hannoveraner
Warmbluthengste
und
zwei
Vollbluthengste des Landgestüts Celle im Alter von 4 bis 26 Jahren.
Im Zeitraum der Probenentnahme wurden die Hengste unter einheitlichen
Bedingungen gehalten und gefüttert. Sie waren auf Stroh in Einzelboxen aufgestallt.
Die Fütterung erfolgte zweimal täglich mit 3 kg Heu und dreimal täglich mit 2 kg
Hafer.
Zusätzlich
wurde
noch
insgesamt
1
kg
eines
pelletierten
Ergänzungsfuttermittels (Derby® Vital, Fa. Derby, Münster) gefüttert. Die Vitaminund Spurenelementmengen in diesem Zusatzfutter sind in Tabelle 7 aufgeführt.
Tabelle 7: Vitamin- und Spurenelementgehalte im verwendeten
Ergänzungsfuttermittel laut Deklaration
Gehalt pro
kg Futter
Vitamin A
80000 IE
Vitamin E
500 mg
Kupfer
75 mg
Zink
300 mg
Selen
1,30 mg
Eisen
225 mg
Mangan
200 mg
Jod
2,65 mg
Geht man davon aus, dass die Futtermittel (Heu und Hafer) Spurenelementgehalte
entsprechend MEYER und COENEN (2002) (s. Tabelle 8) enthielten, so ist es
möglich für die Fütterung der Hengste Spurenelementgehalte der Tagesration pro
Hengst entsprechend Tabelle 9 zu ermitteln.
41
Diesen
Berechnungen
zufolge
kann
von
einer
Bedarfsdeckung
in
der
Spurenelementversorgung, entsprechend den Empfehlungen von Kamphues et al.
(2009) (s. Tabelle 2, S. 17), bei den in der vorliegenden Arbeit untersuchten Hengste
ausgegangen werden.
Tabelle 8: Spurenelementgehalte in Heu und Hafer (Angaben in mg/kg TS, nach
MEYER und COENEN 2002)
Kupfer
Zink
Selen
Eisen
Mangan
Jod
Heu
4-6
30
0,10
200
110
0,27
Hafer
5
35
0,08
65
50
0,11
Tabelle 9: Errechnete Spurenelementgehalte der Fütterung (Angaben in mg/kg
TS Futter)
mg/kg
Kupfer
Zink
Selen
Eisen
Mangan
Jod
11,12
55,91
0,20
139,88
90,17
0,40
Alle Tiere wurden von den Mitarbeitern des Landgestüts täglich gepflegt und
gearbeitet.
Die Versuchshengste sind in drei Altersgruppen zu je mindestens 12 Tieren eingeteilt
worden. Die Hengste der ersten Altersgruppe waren zur Zeit der Versuche vier- bis
siebenjährig (Gruppe 1, n=14), die der zweiten acht- bis fünfzehnjährig (Gruppe 2,
n=15) und die der dritten Gruppe über fünfzehn Jahre alt (Gruppe 3, n=12). Zudem
ist innerhalb der Gruppen darauf geachtet worden, dass möglichst dieselbe Anzahl
Hengste mit guten und schlechten Befruchtungsergebnissen ausgewählt wurden.
3.2 Probenentnahme
Die Versuche wurden von Mitte Juli bis Anfang August bei den im Deckeinsatz
stehenden Hengsten durchgeführt. Die sexuelle Belastung der Hengste vor den
Versuchen variierte von 3 (Montag, Mittwoch, Freitag) bis zu 6 (Montag bis Samstag,
1x täglich) Samenentnahmen pro Woche. Entnommen wurden Ejakulate und
Blutproben.
42
Die Entnahmen der Proben erfolgten dreimal bei jedem Versuchstier, jeweils in
zweitägigem Abstand immer vormittags innerhalb des normalen Deckbetriebes in der
Sprunghalle der Zentralen Besamungsstation Celle oder der Besamungsstation
Adelheidsdorf.
Die Ejakulate wurden mit Hilfe einer künstlichen Scheide (Modell „Hannover“)
gewonnen. Vor jeder Entnahme wurde in die künstliche Scheide eine sterile
Einmalschlauchfolie eingezogen, an welchem direkt das sterile Auffangglas befestigt
war.
Zum
Abtrennen
von
Schmutzpartikeln
und
eventuell
vorhandenen
Schleimanteilen wurde ein Gazefilter im Innern des Halses des Auffangglases
befestigt. Als Sprungpartner diente ein Phantom (Modell „Celle“ Fa. Minitüb,
Landshut), vor welchem eine rossige Stute fixiert wurde.
Unmittelbar danach wurden die Blutproben durch Punktion der Jugularvene
entnommen. Dabei wurden Einmalkanülen (0,9x38 mm) und Vakuumröhrchen des
Vacutainer®-Systems (Fa. Becton Dickinson GmbH, Heidelberg.) verwendet. Die
Kanüle wird auf einen Adapter geschraubt und die Vene mit dem Daumen gestaut.
Nach dem Einstich in die Vene wird das Vakuumröhrchen von hinten in den Adapter
geschoben. Dabei wird von dem hinteren Ende der Kanüle der Gummideckel des
Röhrchens durchstochen, und das Blut kann durch das anliegende Vakuum in das
Probengefäß fließen. Die Proben bestanden aus je einem Röhrchen Serum (ohne
Gerinnungshemmer)
und
zwei
Röhrchen
Vollblut
(eines
mit
EDTA
als
Gerinnungshemmer und eines mit Lithium-Heparin als Gerinnungshemmer).
3.3 Probenaufbereitung
Nach der Untersuchung auf die spermatologischen Eigenschaften (s. Kapitel 3.4.1)
wurden die Ejakulate wie in Abbildung 2 dargestellt, aufgeteilt.
Ein Aliquot wurde mit standardisiertem Verdünner (INRA 82) auf 25 Millionen
Samenzellen pro ml verdünnt. Mit diesen Proben wurden später mit Hilfe einer FITC
PNA/PI-Färbung sowohl die Integrität der Akrosommembran als auch die der
Zellmembran per Durchflusszytometrie bestimmt.
Ein nativer Teil der Ejakulate wurde zur späteren Bestimmung der Chromatinstabilität
mittels SCSA-Färbung und Durchflusszytometer unmittelbar in Pailletten abgefüllt.
43
Die Abfüllung erfolgte automatisch (Typ MRS 1, Fa. IMV Technologies, L’Aigle
Cedex, Frankreich). Die Pailletten wurden dann auf Racks verbracht, die in einem mit
flüssigem Stickstoff befüllten Styroporgefäß standen. Die Menge des Stickstoffs
wurde dabei so bemessen, dass der Flüssigkeitsspiegel einen Abstand von drei
Zentimetern zu den Pailletten hatte und die Proben so im Stickstoffdampf
herabkühlen konnten. Nach zwanzigminütiger Gefrierdauer wurden die Pailletten in
flüssigem Stickstoff eingetaucht. Ebenso wurde mit einem Nativanteil verfahren, der
später zur Bestimmung der Spurenelemente im Ejakulat, im Seminalplasma und in
den Spermien verwendet wurde. Der Aufbau des Kühlvorganges ist in Abbildung 1
zu erkennen.
Zur morphologischen Untersuchung der Spermien wurden 100 µl des Ejakulates
verwendet (s. Kapitel 3.4.1).
3.4 Untersuchungen
3.4.1 Spermatologische Untersuchungen
Die Ejakulate wurden unmittelbar nach der Gewinnung auf ihre spermatologischen
Eigenschaften untersucht. Nach der Beurteilung der Farbe (weiß, grau, gelb) und der
Konsistenz (wässrig, molkig, milchig, rahmig) erfolgte die Bestimmung des Volumens
durch Ablesen auf der Skala des Auffangglases.
Die Dichte (Samenzellkonzentration = Anzahl der Zellen pro Milliliter Ejakulat) wurde
mit Hilfe eines Photometers (SpermacueTM, Fa. Minitüb, Landshut) ermittelt. Durch
Multiplikation des Volumens mit der Dichte wurde die Gesamtspermienzahl der
Ejakulate errechnet.
Anschließend wurde mit Hilfe eines Phasenkontrastmikroskops (BX 60, Fa. Olympus,
Hamburg) und eines bei 38°C vorgewärmten Objekttisc hes (HAT 400, Fa. Minitüb,
Landshut) die Motilität der verdünnten Spermaprobe mikroskopisch geschätzt. Dabei
wurden jeweils drei Gesichtsfelder bei 200-facher Vergrößerung untersucht. Es
erfolgte eine Einteilung in vorwärts-, orts- und unbewegliche Spermien, welche
jeweils in Prozent angegeben wurden.
Zur
Bestimmung
des
Prozentsatzes
der
Spermien
mit
morphologischen
Abweichungen wurden 100 µl Sperma von jedem Ejakulat mit 300 µl Negrosin-Eosin
44
in einem Eppendorfgefäß gemischt. Nach 30 Sekunden Inkubation wurde ein
Tropfen dieser Mischung auf einem Objektträger ausgestrichen. Nach der Trocknung
wurden auf jedem Ausstrich 200 Spermien mit Hilfe eines Phasenkontrastmikroskops
(Axioskop, Fa. Zeiss, Hamburg) mit eingelegtem Grünfilter und Ölimmersion bei
1000-facher Vergrößerung ausgezählt. Die Spermien wurden hinsichtlich ihrer
morphologischen Veränderungen nach dem in Tabelle 10 dargestellten Schema
beurteilt.
Pailletten
Styroporkammer
Rack
3cm
flüssiger Stickstoff
Abbildung 1: Anordnung der Pailletten zur Gefrierung im Styroporgefäß
45
Ejakulat
verdünnt mit
INRA 82 auf
50 Mio./ml
Membranintaktheit
Akrosomintaktheit
nativ in
Pailletten abgefüllt
und tiefgefroren
nativ in
Pailletten abgefüllt
und tiefgefroren
Chromatinintegrität
SpurenelementAnalyse
durch NAA
Abbildung 2: Aufbereitung und anschließende Verwendung der Ejakulate
Tabelle 10: Morphologische Veränderungen bei Spermien
Veränderungen
Differenzierung
Kappenveränderungen
abgelöste Kappen, Kappen in Ablösung,
deformierte Kappen
Kopfveränderungen
deformierte Köpfe
Halsveränderungen
Halsbrüche, Plasmatropfen,
paraxialer/retroaxialer Schwanzansatz
Verbindungsstückveränderungen
Gebrochenes/fibrilläres/deformiertes
Verbindungsstück, Plasmatropfen
Haupt- und Endstückveränderungen
Schleifenform, aufgerollt, um den Kopf
aufgerollt, abgeknickt, rudimentär,
Plasmatropfen
Missbildungen
Normale Spermien
46
Doppelköpfe, Zwillingsschwänze, andere
3.4.2 Blutuntersuchungen
Die Blutproben wurden unmittelbar nach der Gewinnung vorsichtig geschwenkt und
anschließend zur Auswertung in das Labor der Klinik für Rinder der Tierärztlichen
Hochschule gebracht.
In diesen Proben wurden die Konzentrationen der Spurenelemente Selen, Zink,
Kupfer, Eisen, Mangan und Molybdän bestimmt. Zusätzlich wurden noch die Gehalte
an Vitamin A und Vitamin E gemessen. Welche Werte aus welchen Proben
gemessen wurden, stellt Abbildung 3 dar. Referenzbereiche für Spurenelemente
beim Pferd sind in Tabelle 11 aufgelistet.
Blut
Serum
Vollblut
mit
Li-Heparin
Vollblut
mit
EDTA
Bestimmung
von
Cu, Fe, Zn, Mo, Mn
Bestimmung von
Selen
Bestimmung von
Vitaminen
E und A
Abbildung 3: Verwendung der Blutproben
Tabelle 11: Referenzwerte für Spurenelementgehalte im Blutserum beim Pferd
Referenzbereich (DROMMER
Referenzbereich
und SCHÄFER 2006)
(PULS 1994)
Selen [µg/l]
28-133
170-250*
Zink [µmol/l]
11-15
7,19-26,01
Kupfer [µmol/l]
19-21
10,23-31,5
Eisen [µmol/l]
13-25
15,04-46,03
*Dieser Wert ist eine Angabe für Vollblut
47
Bei der Messung von Selen im Blut wird der Gehalt indirekt über Aktivität der
selenabhängigen GPx in den Erythrozyten bestimmt (PAGLIA und VALENTINE
1967). Hierzu werden neben, mit Lithium-Heparinat ungerinnbar gemachtes Vollblut,
Drabkins Reagenz und eine Reaktionslösung benötigt.
Die Bestimmung erfolgt nach der von JACHENS (1993) beschriebenen Methode. Am
Ende jeder Messung wird ein Extinktionsmittelwert ermittelt. Die Selenkonzentration
wird nun mit Hilfe dieses Extinktionsmittelwertes und über den Hämoglobinwert
errechnet (JACHENS 1993).
Extinktionsmittelwert x 100
µg Selen/l Blut = ---------------------------------------- x 0,475
Hämoglobinwert
Die Gehalte der Spurenelemente Eisen, Kupfer, Zink, Mangan und Molybdän wurden
über die optische Emmissionsspektrometrie mit Hilfe eines induktiv gekoppelten
Plasmas (ICP-OES = inductively-coupled plasma optical emission spectrometry)
bestimmt. Bei dieser Methode wird ein Argon-Plasma verwendet, um die optische
Emission der zu analysierenden Elemente anzuregen. Ein Plasma ist ein ionisiertes
Gas, welches sehr heiß ist (ca.10000 K). Argon ist hier auf Grund der großen
Ionisierungsenergie, seiner chemischen Inertheit und der fehlenden Bandenspektren
gut geeignet. Die notwendige Energie, um das Plasma aufrecht zu erhalten, wird
elektromagnetisch durch eine Induktionsspule übertragen. Die Probe wird in
Aerosolform in das Plasma gebracht. Durch die große Hitze lösen sich alle
chemischen Verbindungen, so dass die Analyse unabhängig von der chemischen
Zusammensetzung der Probe durchgeführt werden kann. Die entstandenen Atome
und Ionen werden durch die hohe vorherrschende Energie angeregt und emittieren
dann Licht einer bestimmten Wellenlänge. Die Emissionslinien der verschiedenen
Stoffe können getrennt voneinander und somit gleichzeitig registriert werden. Die
Intensität der Emissionen korreliert zu den Konzentrationen der zu analysierenden
Elemente. Diese können somit über das Spektrometer ermittelt werden (NÖLTE
2003).
48
Die
wichtigsten
Teile
des
ICP-Spektrometers
sind
der
Hochfrequenzgenerator,
die
Plasmaquelle,
der
Probenzerstäuber
und
das
eigentliche Spektrometer (SKOOG und LEARY 1996).
Das verwendete Spektrometer ist das Modell Vista-Pro der Firma Varian. Die
Wellenlängen der Emissionen sind in Tabelle 12 dargestellt.
Tabelle 12:Gemessene Wellenlängen der Emissionen
Wellenlänge
[nm]
Zink
Eisen
Kupfer
Molybdän
Mangan
213,857
234,350
327,395
202,032
257,610
Die Vitamin A - und E -Gehalte wurden fluoreszenzphotometrisch nach der Methode
von Rammell (RAMMELL et al.1983) gemessen.
Zunächst wird die Probe verseift und anschließend der unverseifbare Anteil mit
organischen
Lösungsmitteln
extrahiert.
Danach
wird
das
Vitamin
durch
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) separiert und schließlich durch
fluoreszenzphotometrische Detektion bestimmt.
Dazu wurden
- 1 ml heparinisiertes Plasma
- 1 ml Ascorbinsäure, Fa. Merck, No. 500074
- 1 ml Methanol, Fa. Fisons, No. XM 4056
- 2 ml Ethanol, Chromatographie Handel Müller GmbH, No. E/0665/17
- 1ml Kaliumhydroxid, Fa. Merck, No. 5033
gut gemischt und für 10 Minuten bei 60°C erhitzt. N ach wiederholtem Mischen wurde
die Lösung weitere 20 Minuten bei 60°C verseift. An schließend wurde die Probe 10
Minuten in Eiswasser gekühlt und dann mit 5 ml Hexan (Fa. Fisons, No. XM/0406/17)
vermischt. Diese Mischung wurde bei 1000 g für 5 Minuten zentrifugiert. Die
Hexanphase wurde dann in kleine Kolben abgefüllt. Dieser Vorgang zur
Hexanextraktion wurde noch zweimal wiederholt. Anschließend wurden die auf diese
Weise gewonnenen Hexanphasen zusammen im Rotationsdampfer (FA. HeidolphElektro GmbH + Co KG, Kehlheim) bei einer Temperatur von 35°C und einem Druck
49
von 150 mbar eingedampft. Das entstandene Extrakt wurde in 1 ml Methanol gelöst
und über einen Autoinjektor mittels HPLC analysiert.
Die hierzu verwendeten Geräte und Materialien waren:
- HPLC Anlage: HPLC-Pumpe 2150 (Fa. Pharmacia LKB, Freiburg)
- Säule: 250 x 4,6 Nucleosil C18 (Fa. Grom, Herrenburg)
- Vorsäule: 10 x 4,6 Nucleosil C18 (Fa. Grom, Herrenburg)
- Autoinjektor: SIL-9A (Fa. Shimadzu Europa GmbH, Duisburg)
Das Fließmittel bestand aus 4 Teilen Aqua bidestillata zu 96 Teilen Methanol (v/v),
bei einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min. Bei der Detektion wurde der
Spektrofluorometer RF-551 (Fa. Shimadzu Europa GmbH, Duisburg) und der
Integrator C-R5A (Fa. Shimadzu Europa GmbH, Duisburg) verwendet.
3.4.3 Spermauntersuchungen
3.4.3.1
Bei
Sperm chromatin structure assay (SCSA)
dieser
Methode
werden
Spermien
mit
intakter
und
nicht
intakter
Chromatinstruktur unterschieden. Dabei wird auf das Prinzip zurückgegriffen, dass
vorgeschädigtes Chromatin leichter durch eine physikalische Noxe denaturierbar ist.
Die Zugabe einer Säure in die Spermiensuspension bewirkt, dass sich die
Doppelhelix der DNS in ihre Einzelstränge aufteilt. Anschließend wird eine Färbung
mit Akridinorange (AO) durchgeführt, wobei sich der Farbstoff an die DNS anlagert.
Die Fluoreszenz der Doppelstränge ist grün, die der Einzelstränge rot. Die Detektion
des emittierten Lichts kann mit Hilfe eines Durchflusszytometers durchgeführt
werden. Die Messung erfolgte nach dem von EVENSON und JOST (2000)
beschriebenen Verfahren.
Bei den Messungen wurde das Durchflusszytometer FACScanTM (Fa. Becton
Dickinson, Heidelberg) verwendet. Das Gerät arbeitet mit einem luftgekühlten
Argonlaser mit einer Wellenlänge von 488 nm und einer Leistung von 15 mW. Zur
Auswertung standen drei Filter zur Auswahl: FL-1 (530/30 nm) für die grüne
Fluoreszenz, FL-2 (585/42 nm) für die orange Fluoreszenz und FL-3 (650 LP nm) für
die rote Fluoreszenz. Es wurden FL-1 und FL-3 verwendet. Die Analyse der Daten
50
fand mit Hilfe der Cellquest
TM
Software auf einem Power Mac G4-Computer (Apple
Computer Inc.) statt.
Bei der Auswertung über Punktwolkendiagramme wurde für jedes Spermium der
Anteil der Rotfluoreszenz an der Gesamtfluoreszenz (rote und grüne Fluoreszenz
zusammen) berechnet. Dieser Wert wird als DFI-Wert (DNA Fragmentations Index)
bezeichnet. Der DFI-Wert wird aus einem Verteilungshistogramm erstellt, wobei zwei
Populationen unterschieden werden können: Die Hauptpopulation mit niedrigem DFIWert und eine kleinere Population mit hohem DFI-Wert (EVENSON et al. 2002).
Durch manuelles Einziehen einer Linie zwischen den erhöhten und niedrigen DFIWerten konnte der Computer den prozentualen Anteil der Spermien mit erhöhtem
DFI-Wert an der Gesamtpopulation errechnen. Dieser prozentuale Wert lässt eine
Aussage über den Gesamtzustand der Chromatinstruktur der Probe zu.
3.4.3.2
FITC PNA/PI-Färbung
Bei dieser durchflusszytometrischen Methode werden die Spermien mit zwei
verschiedenen Farbstoffen angefärbt. Der erste Farbstoff, Arachis hypogaea Lectin
(Peanut Agglutinin, kurz PNA), ist dabei an Fluoreszein-Isothiocyanat (FITC)
gebunden und detektiert den akrosomalen Status der Spermien. PNA geht eine
Verbindung mit Spermien ein, deren Akrosom reagiert hat (CHENG et al. 1996) und
emittiert nach Anregung durch den Laser grünes Licht. Der zweite Farbstoff,
Propidiumjodid (PI), bindet an die DNS, ist aber nicht membranpermeabel (GARNER
et al. 1994). Somit färbt dieser Farbstoff den Zellkern von Zellen an, deren Membran
geschädigt ist. Er fluoresziert dann rot. Dadurch kann nach dieser kombinierten
Färbung zwischen vier Populationen unterschieden werden:
- Spermien mit intakter Plasmamembran und intaktem Akrosom: fluoreszieren nicht
(SP1)
- Spermien mit geschädigter Plasmamembran und intaktem Akrosom: fluoreszieren
rot (SP2)
- Spermien mit geschädigter Plasmamembran und geschädigter Akrosommembran:
fluoreszieren rot mit grüner Kopfkappe (SP3)
- Spermien mit intakter Plasmamembran und geschädigter Akrosommembran:
fluoreszieren mit grüner Kopfkappe (SP4)
51
Dargestellt auf einem Punktwolkendiagramm können die vier Populationen
voneinander unterschieden werden. Die verschiedenen Anteile werden in Prozent
ausgedrückt. Die Summe von SP1 und SP4 gibt die gesamten membranintakten
Spermien, die Summe aus SP3 und SP4 die gesamten Spermien mit positiv
akrosomalen Status an. Um die Induzierbarkeit der Akrosomreaktion zu testen, wird
das Calcium-Ionophor A23187 verwendet.
Bei dem verwendeten Durchflusszytometer handelte es sich um ein Cell Lab
QuantaTM SC (Fa. Beckmann Coulter, Krefeld). Auch dieses arbeitet mit einem
Argonlaser bei einer Wellenlänge von 488 nm und es wurden auch die Filter Fl-1
(grüne Fluoreszenz) und FL-3 (rote Fluoreszenz) verwendet. Die Daten wurden über
das dazugehörige Software-Programm Cell Lab QuantaTM SC MLP bearbeitet und
ausgewertet.
Die
morgens
gewonnenen
Spermaproben
wurden
mit
Magermilchverdünner (INRA 82) auf eine Dichte von 50 Millionen Spermien pro
Milliliter verdünnt und nachmittags ausgewertet. Zunächst wurden 5 µl der Probe mit
485 µl HBS vermischt. Diese Suspension wurde erst mit 7,5 µl PNA, dann mit 2,5 µl
PI versetzt und 10 Minuten inkubiert, um anschließend gemessen zu werden. Bei der
Akrosominduktion werden vor der Farbstoffzugabe 3,5 µl des Ca-Ionophors A23187
hinzu gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 15 Minuten bei 37°C unter
Lichtausschluss wird dann verfahren, wie bei der normalen FITC PNA/PI-Färbung
und -Messung. Parallel wird noch eine Kontrollgruppe ohne Ca-Ionophor inkubiert
und gemessen. Nach 24 Stunden wurden Rückhalteproben erneut auf ihre
Membran- und Akrosomintaktheit gemessen, um den Alterungsprozess der
Membranen beurteilen zu können.
3.4.3.3
Bestimmung der Spurenelementgehalte
Die Bestimmung der Gehalte von Selen, Zink und Eisen im Ejakulat (in nmol/g und
nmol/ml), im Seminalplasma (in nmol/g und nmol/ml) und in den Spermien (in nmol/g
und nmol/Mrd. Samenzellen) erfolgte aus den in flüssigem Stickstoff konservierten
Nativproben. Diese wurden zur Auswertung in einem Container für Tiefgefriersperma
ins Helmholtz-Zentrum Berlin für Materialien und Energie GmbH versendet. Dort
erfolgte die weitere Aufbereitung und Auswertung der Proben.
52
Zur Bestimmung der Spurenelemente in den Ejakulaten und dem Seminalplasma
wurde die Neutronenaktivierungsanalyse (NAA) verwendet, die sich allgemein zur
Spurenelementanalyse bei biologischen Proben eignet. Die Spurenelementwerte in
den Spermien wurden dann aus den Werten für das Ejakulat und das Seminalplasma
errechnet, beispielsweise für Selen bezogen auf die Feuchtmasse:
Se in den Spermien [nmol/Mrd.]= ((Se im Ejakulat [nmol/ml] – Se im Seminalplasma
[nmol/ml]) / Spermienanzahl [Mio./ml]) x 1000
Hierbei werden durch Bestrahlung mit thermischen (langsamen) Neutronen die
stabilen Isotope der Spurenelemente in der Probe in radioaktive Isotope verwandelt.
Die Strahlung, die bei dem Zerfall dieser Isotope frei wird, kann gemessen werden.
Die Strahlungsintensität ist dabei proportional zur Konzentration des Elements in der
Probe. Der Neutronenfluss unterliegt hierbei Schwankungen, daher werden mit der
Probe zusammen entsprechend definierte und zertifizierte Standards als Referenz
bestrahlt und gemessen. Die Isotope, Halbwertszeiten und Emissionslinien hierzu
sind in Tabelle 13 angegeben.
Tabelle 13: Isotope, Halbwertszeiten und gemessene Emissionslinien der
untersuchten Elemente (BLAAVW 1996)
Gemessene
Ursprüngliches
Radioaktives
Halbwertszeit
Isotop
Isotop
[d]
Selen
Se74
Se75
119,6
Zink
Zn64
Zn65
244,1
1116
Eisen
Fe58
Fe59
44,5
1099
Rubidium
Rb85
Rb86
18,8
1077
Element
Emissionslinie(n)
[keV]
Mittel aus 136 und
265
Zur Vorbereitung wurde jede Probe zunächst halbiert und die eine Hälfte mit 16000 g
für 30 Minuten zentrifugiert, um das Seminalplasma von den Spermien zu trennen.
So entstanden drei Fraktionen: Sperma, Seminalplasma und Spermien. Diese
wurden jede für sich weiter verarbeitet.
53
Vor der weiteren Aufbereitung wurden die Proben zunächst gewogen, um ihre
Feuchtmasse zu bestimmen. Dazu wurde eine Waage verwendet (MC 210 P, Fa.
Satorius, Göttingen), welche sich automatisch selbst kalibriert. Der Fehler der
Einzelmessung
beträgt
laut
Hersteller
20
µg.
Anschließend
erfolgte
eine
Gefriertrocknung (Labonco FreeZone 6, Piatrowski Forschungsgeräte, München) für
drei Tage bei -20°C und eine weitere Wägung zur Bes timmung der Trockenmasse.
Nach diesem Schritt wurde jede Probe mit einem Achatmörser (Fa. Lembke GmbH,
Technische Steine- und Laborbedarf, Bruchweiler) homogenisiert. Achat eignet sich
hierbei besonders gut, da der Abrieb von diesem Material vernachlässigbar gering
ausfällt. Somit gelangt keine Verunreinigung in die Probe, die das Ergebnis
verfälschen könnte. Das entstandene Pulver wurde zu je 10-25 mg in spezielle
Quarzampullen gefüllt, welche durch Zuschweißen aus Quarzrohren (Heraeus,
Hanau) entstanden. Die dazu benötigte Wasserstoff/Sauerstoff Flamme wurde von
einem eigens zu diesem Zweck konstruierten Apparat (Fa. Toss GmbH, Potsdam)
erzeugt.
Die Ampullen mit den Proben wurden dann in die aus Aluminium bestehenden
Bestrahlungsbüchsen
gesteckt.
Zusätzlich
wurden
eine
Leerampulle
(Blindwertkontrolle), zwei Ampullen mit je einem Multielementstandard 10090c184a
und 10090c183a (Merck, Darmstadt) sowie eine Ampulle mit dem zertifizierten
Referenzmaterial Bovine Liver 1577b (National Institute of Standards and
Technology, Washington) in den Büchsen hinzugefügt. Diese Büchsen wurden im
Kern des Reaktors BER II des Helmholtz-Zentrums für drei Tage bestrahlt. Nach der
Bestrahlung mussten die Proben zunächst sechs Wochen abklingen.
Um das radioaktiv kontaminierte Beckenwasser des Reaktors zu beseitigen, war es
anschließend notwendig die Ampullen nacheinander dreimal in 15%ige Flusssäure
(Merck, Darmstadt) zu tauchen, dreimal mit bidestilliertem Wasser, einmal mit
98%igem Ethanol (Merck, Darmstadt) und einmal mit 100%igem Aceton (Merck,
Darmstadt) zu waschen.
Die Messung der frei werdenden Gamma-Stahlung erfolgte mit einem Detektor aus
Reinstgermanium mit planarer Geometrie (GC 6520, Canberra, Mainz). Jede Probe
wurde vier bis sechs Stunden gemessen. Die Auswertung der Peaks der
54
aufgenommen Gamma-Spektren erfolgte über ein spezielles Computerprogramm
(Genie System Spectroscopy Applications, Canberra, Mainz) (BERTELSMANN
2002).
Bei einigen Proben lag der Wert für Eisen im Seminalplasma unter der
Nachweisgrenze. Sie wurden deswegen weitere sieben Tage bestrahlt und nach
einer Abklingzeit von sechs Wochen jeweils fünf Stunden lang nochmals gemessen.
3.5 Fertilitätsparameter
Zur Ermittlung der Fertilitätsparameter stellte das Landgestüt Celle das Deckregister
der
Decksaison
2007
zur
Verfügung.
Daraus
wurden
die
saisonalen
Trächtigkeitsraten pro Rosse ermittelt. Die saisonale Trächtigkeitsrate pro Rosse
(TRR) gibt den prozentualen Anteil der Rossen an, die zur Besamung genutzt
wurden und bei welchen im Anschluss eine Trächtigkeit festgestellt werden konnte.
Zur
Bildung
der
Trächtigkeitsgruppen
wurden
Quartile
der
saisonalen
Trächtigkeitsrate pro Rosse gebildet. Dabei wurde das untere Quartil als Gruppe 1
(Trächtigkeitsrate
25,0-40,9%,
n=7),
das
obere
Quartil
als
Gruppe
3
(Trächtigkeitsrate >50,9-58,8%, n=8) und die mittleren beiden Quartile zusammen als
Gruppe 2 (Trächtigkeitsrate >40,9-50,9%, n=15) betrachtet. Somit sind die Hengste
in der Gruppe 1, die mit der niedrigsten und die in Gruppe 3, die mit der höchsten
Trächtigkeitsraten.
3.6 Statistische Auswertungen
Die statistischen Auswertungen wurden mit Hilfe des Instituts für Epidemiologie und
Biometrie der Tierärztlichen Hochschule Hannover erstellt. Die verwendeten
Statistikprogramme waren SAS, Version 9.1 („Statistical Analysis Software“, SAS
Institute, Iowa, Cary, NC/USA) und SPSS 15.0 (SPSS GmbH Software, München).
Zunächst wurden alle Daten nach der Methode von Shapiro-Wilk auf eine
Normalverteilung untersucht. Die Korrelationen der normal verteilten Werte wurden
nach der Methode Pearson erstellt. Bei den nicht normal verteilten Ergebnissen
wurde auf die Methode nach Spearman zurückgegriffen. Die korrelierenden Werte
wurden in Signifikanzstufen eingeteilt. Dabei wurden die Grenzen p<0,001, p<0,01
und p<0,05 gewählt.
55
Für die Betrachtung der Verteilung der Werte wurden zunächst Mittelwerte, Minimalund Maximalwert aller Daten ermittelt. Diese wurden dann noch gesondert nach
Alters-
und
Trächtigkeitsgruppe
betrachtet.
Varianzkomponentenschätzung vorgenommen.
56
Anschließend
wurde
eine
Ergebnisse
4 Ergebnisse
Ziel dieser Studie ist es, neue Erkenntnisse über die Spurenelementgehalte im Blut,
im Ejakulat, im Seminalplasma und in den Spermien von Zuchthengsten zu erhalten.
Zudem wurden die Zusammenhänge der genannten Werte zur Spermaqualität und
Fertilitätsleistung der Hengste untersucht.
4.1 Spurenelementgehalte im Blut, in den Ejakulaten, im
Seminalplasma und in den Spermien
4.1.1 Mittelwerte allgemein und differenziert nach Alters- und
Trächtigkeitsgruppen
Die Mittelwerte mit Standardabweichung der Gehalte an Spurenelementen und
Vitaminen im Blut und der Spurenelemente in den Ejakulatfraktionen sind in Tabelle
14 zusammengefasst. Zur Berechnung wurde jeweils der Mittelwert der drei Sprünge
jedes Hengstes herangezogen.
Tabelle 14: Mittelwerte ±SD, Minimal- und Maximalwerte der Vitamine und
Spurenelemente im Blut und den Ejakulatfraktionen von Zuchthengsten (n=41
Hengste, m=3 Ejakulate)
Parameter
X¯ ±SD
Minimalwert
Maximalwert
Selen
Se Blut [µg/l]
71,8±1,2
58
90,3
Se Ejakulat [nmol/g]
20,0±1,1
6,0
39,5
Se Ejakulat [nmol/ml]
0,8±0,1
0,2
1,8
Se SP [nmol/g]
5,3±0,2
3,7
10,3
Se SP [nmol/ml]
0,2±0,01
0,1
0,4
Se Spermien [nmol/g]
125±2,9
77
157
Se Spermien [nmol/Mrd.]
2,4±0,1
1,1
3,5
27,2
54,6
Eisen
Fe Blut [µmol/l]
37,5±0,9
57
Ergebnisse
Fe Ejakulat [nmol/g]
205±9,9
98
379
Fe Ejakulat [nmol/ml]
7,6±0,4
3,4
14,1
Fe SP [nmol/g]
63,8±4,2
29,1
146,9
Fe SP [nmol/ml]
2,0±0,1
0,7
4,1
Fe Spermien [nmol/g]
1313±49,5
699
1971
Fe Spermien [nmol/Mrd.]
24,8±0,8
13,4
34,0
Zink
Zn Blut [µmol/l]
11,4±0,2
8,7
14,4
Zn Ejakulat [nmol/g]
513±17,6
219
870
Zn Ejakulat [nmol/ml]
19,6±1,1
10,0
34,0
Zn SP [nmol/g]
364±12,0
190
601
Zn SP [nmol/ml]
12,3±0,7
6,8
28,8
Zn Spermien [nmol/g]
1594±55,3
821
2426
Zn Spermien [nmol/Mrd.]
30,4±1,1
13,3
51,9
Rubidium
Rb Ejakulat [nmol/g]
232±12,4
112
427
Rb Ejakulat [nmol/ml]
8,4±0,5
4,61
16,4
Rb SP [nmol/g]
266±14,8
150
537
Rb SP [nmol/ml]
8,4±0,5
4,7
15,3
Blut
Vit. E Blut [mg/l]
2,6±0,2
1,3
7,7
Vit. A Blut [mg/l]
0,3±0,01
0,2
0,6
Cu Blut [µmol/l]
16,2±0,5
11,0
25,0
Mo Blut [µg/l]
9,9±0,6
3,0
18,9
Mn Blut [µg/l]
3,3±0,1
2,5
6,9
Se= Selen, Cu= Kupfer, Fe= Eisen, Zn= Zink, Mo= Molybdän, Mn= Mangan, Rb= Rubidium,
SP= Seminalplasma
Sämtliche Werte der Betrachtungen zu den Alters-, bzw. Fertilitätsgruppen sind in
den Tabellen 18 und 19 (Anhang 9.3) dargestellt. Die signifikanten Unterschiede sind
in den Abbildungen 4-8 dargestellt.
58
Ergebnisse
Signifikante Unterschiede zwischen den Altersgruppen ergeben sich hinsichtlich:
•
Zink in den Spermien [nmol/g]: die mittlere Gruppe hat signifikant höhere
Werte als die älteste Gruppe (s. Abbildung 4A),
•
Zink in den Spermien [nmol/Mrd.]: die mittlere Altersgruppe hat signifikant
höhere Werte als die beiden anderen Gruppen (s. Abbildung 4B),
•
Zink im Ejakulat [nmol/g]: die Gruppe 3 hat signifikant niedrigere Werte als die
Gruppen 1 und 2 (s. Abbildung 5),
•
Eisen (s. Abbildung 6A) und Selen (s. Abbildung 6B) im Seminalplasma
[nmol/ml]: die älteste Gruppe hat signifikant höhere Werte als die beiden
jüngeren,
•
Zink im Blut: alle drei Altersgruppen unterscheiden sich signifikant
voneinander, wobei die jüngsten den höchsten und die ältesten den
niedrigsten Zinkgehalt haben (s. Abbildung 7A),
•
Kupfer im Blut: die Gruppe der jüngsten Hengste hat signifikant höhere Werte,
als die Gruppe der ältesten (s. Abbildung 7B).
Bei den Trächtigkeitsgruppen unterscheiden sich die Gruppen nur bei Selen in den
Spermien
[nmol/g].
Die
Hengste,
deren
Stuten
niedrige
und
mittlere
Trächtigkeitsraten aufweisen unterscheiden sich signifikant von der Gruppe der
Hengste, deren Stuten hohe Trächtigkeitsraten erreichten. Dies ist in Abbildung 8
dargestellt.
59
Ergebnisse
Zink in den
Spermien
a,b
Zink in den
Spermien
b
a
b
a
a
A
B
Abbildung 4: Zinkgehalte in den Spermien in [nmol/g] (Abb. 4A) und in
[nmol/Mrd. Spermien] (Abb. 4B) bei Zuchthengsten (n=41
Hengste, m=3 Ejakulate) unter Berücksichtigung des Alters der
Hengste
Altersgruppen: 1 = 4-7 Jahre, n=14; 2 = 8-15 Jahre, n=15; 3 = >16 Jahre,
n=12
a, b = Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich
signifikant (p<0,05)
° = Ausreißer
60
Ergebnisse
Zink im Ejakulat
b
b
a
Abbildung 5: Zinkgehalte im Ejakulat [nmol/g] bei Zuchthengsten (n=41
Hengste, m=3 Ejakulate) unter Berücksichtigung des Alters der
Hengste
n=12
° = Ausreißer
61
Ergebnisse
Eisen im
Seminalplasma
Selen im Seminalplasma
b
b
a
a
A
a
a
B
Abbildung 6: Eisengehalte (Abb. 6A) und Selengehalte (Abb. 6B) im
Seminalplasma [nmol/ml] bei Zuchthengsten (n=41 Hengste, m=3
Ejakulate) unter Berücksichtigung des Alters der Hengste
n=12
° = Ausreißer
* = Extremwert
62
Ergebnisse
Zink im Blut
Kupfer im Blut
a
b
c
a
a,b
b
A
B
Abbildung 7: Zinkgehalte (Abb. 7A) und Kupfergehalte (Abb. 7B) im Blutserum
[µmol/l] bei Zuchthengsten (n=41 Hengste, m=3 Blutproben)
unter Berücksichtigung des Alters der Hengste
n=12
a, b, c = Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich
° = Ausreißer
63
Ergebnisse
Selen in den Spermien
b
a
a
Abbildung 8: Selengehalte in den Spermien [nmol/g] bei Zuchthengsten (n=41
Hengste, m=3 Ejakulate) unter Berücksichtigung der
Fruchtbarkeitsleistung der Hengste
Trächtigkeitsgruppen:
1 = 25,0-40,9 % Trächtigkeitsrate pro Rosse (TRR), n=7 Hengste
2 = >40,9-50,9 % TRR, n=15 Hengste
3 = >50,9-58,8 % TRR, n=8 Hengste
4.1.2 Hengst- und ejakulatbedingte Variationen der Spurenelement- und
Vitamingehalte im Blut und Ejakulat
Die Variationsbreite der Ergebnisse ist zum einen von den unterschiedlichen
Hengsten und zum anderen von den verschiedenen Ejakulaten bzw. der
verschiedenen
Blutproben
der
Individuen
abhängig.
Die
Variabilitäten
der
Spurenelementwerte der Ejakulatteile sind bei Selen und Rubidium vorwiegend auf
den Faktor Hengst zurückzuführen. Dasselbe gilt für die Zinkwerte im Seminalplasma
und im Ejakulat sowie für die Eisenwerte im Seminalplasma. Zudem sind die
64
Ergebnisse
Blutwerte von Vitamin E und Kupfer maßgeblich vom Hengst abhängig. Der
Eisenwert für das Ejakulat bezogen auf die Feuchtmasse ist fast zu gleichen Teilen
vom Hengst und vom Ejakulat abhängig. Hauptsächlich von dem Faktor Ejakulat
bzw. Blutprobe sind die Zinkwerte in den Spermien, der Eisenwert für das Ejakulat
bezogen auf die Trockenmasse und die Blutwerte für Eisen, Zink, Vitamin A,
Molybdän
und
Mangan
abhängig.
Auffällig
sind
die
Varianzkomponenten-
schätzungen für die Eisenwerte in den Spermien und für den Selenblutwert. Diese
hängen vollständig vom Ejakulat bzw. der Blutprobe ab. Die genauen prozentualen
Anteile sind in Tabelle 15 und 16 aufgeführt.
Tabelle 15: Variabilität der Spurenelementgehalte in den Ejakulatfraktionen
bezogen auf die Einflussfaktoren Hengst und Ejakulat anhand der
Varianzkomponentenschätzung (n=41 Hengste, m=3 Ejakulate)
Varianzkomponente Schätzung in %
Parameter
Hengst
Ejakulat
nmol/g
83
17
nmol/ml
76
24
nmol/g
80
20
nmol/ml
68
32
nmol/g
56
44
nmol/Mrd.
63
37
nmol/g
33
67
nmol/ml
52
48
nmol/g
57
43
nmol/ml
62
38
nmol/g
0
100
nmol/Mrd.
0
100
Selen
Se Ejakulat
Se Seminalplasma
Se Spermien
Eisen
Fe Ejakulat
Fe Seminalplasma
Fe Spermien
Zink
65
Ergebnisse
Zn Ejakulat
Zn Seminalplasma
Zn Spermien
nmol/g
80
20
nmol/ml
68
32
nmol/g
81
19
nmol/ml
68
32
nmol/g
31
69
nmol/Mrd.
38
62
nmol/g
73
27
nmol/ml
86
14
nmol/g
64
36
nmol/ml
77
23
Rubidium
Rb Ejakulat
Rb Seminalplasma
Se= Selen, Fe= Eisen, Zn= Zink, Rb= Rubidium
Tabelle 16: Variabilität der Spurenelement- und Vitamingehalte in den
Blutproben bezogen auf die Einflussfaktoren Hengst und Blutprobe anhand der
Varianzkomponentenschätzung (n=41 Hengste, m=3 Blutproben)
Varianzkomponente Schätzung in %
Parameter
Hengst
Blutprobe
Se
µg/l
0
100
Fe
µmol/l
33
67
Zn
µmol/l
25
75
Cu
µmol/l
82
18
Mo
µg/l
42
58
Mn
µg/l
6
94
Vit. E
mg/l
76
24
Vit. A
mg/l
36
64
Se= Selen, Fe= Eisen, Zn= Zink, Cu= Kupfer, Mo= Molybdän, Mn= Mangan
66
Ergebnisse
4.2 Korrelationen der Spurenelementgehalte im Blut zu denen in
den Ejakulatfraktionen
Um eine Korrelation der Spurenelementwerte aus den Ejakulatanteilen zu dem
jeweiligen Blutwerten festzustellen, wurden Korrelationen nach Spearman gerechnet.
Es zeigte sich jedoch, dass kein Wert der Elemente Selen, Zink und Eisen im
Ejakulat, im Seminalplasma und in den Spermien signifikant mit dem dazugehörigen
Spurenelementwert aus dem Blut korrelierte. Die Korrelationskoeffizienten und
Signifikanzen sind in Tabelle 17 angegeben.
Tabelle 17: Korrelationen nach Spearman. Angegeben ist der Korrelationswert
zwischen dem Blutwert und dem zugehörigen Wert des gleichen
Spurenelements der jeweiligen Ejakulatfraktion (n=41 Hengste, m=3 Ejakulate).
Se Blut
Fe Blut
Zn Blut
r
p
r
p
r
p
SE Ejakulat [nmol/g]
-0,11
0,50
0,13
0,43
0,05
0,74
SE Ejakulat [nmol/ml]
-0,11
0,49
0,15
0,36
-0,13
0,43
SE SP [nmol/g]
0,11
0,49
0,15
0,33
0,10
0,55
SE SP [nmol/ml]
-0,04
0,80
0,20
0,22
-0,14
0,38
SE Spermien [nmol/g]
-0,23
0,15
0,01
0,98
-0,01
0,95
SE Spermien [nmol/Mrd.]
-0,14
0,37
0,04
0,80
-0,06
0,71
SE= Spurenelement; SP Seminalplasma; Se= Selen; Fe= Eisen; Zn= Zink, r=
Korrelationskoeffizient nach Spearman, p= Signifikanz
4.3 Korrelationen zwischen den Vitamin- und
Spurenelementgehalten zur Spermaqualität und Fruchtbarkeit
Die
Abbildungen
9-21
zeigen
jeweils
die
Korrelation
zwischen
den
Spermaqualitätsparametern bzw. dem Alter zu einem der Spurenelemente im Blut
oder in einer Ejakulatfraktion. Für die Darstellungen der Korrelationen zu den
Volumina, den Dichten, der Anzahl der PMI- und PAS- Spermien zum Zeitpunkt 0h
sind jeweils zwei Beispiele zum Signifikanzbereich p<0,001 ausgewählt worden. Bei
den Abbildungen zu den Korrelationen zur Anzahl der progressiv motilen Spermien,
67
Ergebnisse
der Anzahl der PMI- und PAS- Spermien zum Zeitpunkt 24h und zum alpha-t-Wert
sind die Korrelationen mit der höchsten Signifikanz ausgewählt worden. Die
Korrelationskoeffizienten mit den dazugehörigen Signifikanzbereichen sind in den
Tabellen 20 und 21 (Anhang 9.4) komplett aufgeführt.
Signifikante Korrelationen ergaben sich zwischen dem Volumen und den Werten für:
•
Selen im Ejakulat (r=-0,62, p<0,001) (s. Abbildung 9) und im Seminalplasma
(r=-0,62, p<0,001) jeweils bezogen auf die Feuchtmasse,
•
Zink im Ejakulat (r=-0,64, p<0,001) und im Seminalplasma (r=-0,60, p<0,001)
jeweils bezogen auf die Feuchtmasse,
•
Eisen im Ejakulat bezogen auf die Feuchtmasse (r=-0,60, p<0,001) (s.
Abbildung 10),
•
Selen (r=-0,57, p<0,001) und Zink (r=-0,38, p=0,01) in den Spermien bezogen
auf die Anzahl der Spermien,
•
Selen im Seminalplasma bezogen auf die Trockenmasse (r=-0,62, p=0,02,
•
Eisen im Seminalplasma bezogen auf die Feuchtmasse (r=-0,45; p=0,003),
•
Vitamin A im Blut (r=-0,34, p=0,03),
•
Zink im Blut (r=0,32, p=0,04).
Die Dichte ist signifikant korreliert mit folgenden Werten:
•
Selen (r=0,76, p<0,001 bzw. r=0,92, p<0,001) (s. Abbildung 11), Zink (r=0,71,
p<0,001 bzw. r=0,80, p<0,001), Eisen (r=0,58, p<0,001 bzw. r=0,86, p<0,001)
(s. Abbildung 12) im Ejakulat bezogen auf Trocken- und Feuchtmasse,
•
Selen (r=0,50, p=0,001), Zink (r=0,50, p=0,001) und Eisen (r=0,45, p=0,003)
im Seminalplasma bezogen auf die Feuchtmasse,
•
Selen (r=0,45, p=0,003) und Zink (r=0,32, p=0,04) im Seminalplasma bezogen
auf die Trockenmasse,
•
Selen (r=0,73, p<0,001) und Zink (r=0,47, p=0,002) in den Spermien bezogen
auf die Anzahl der Spermien,
•
Selen (r=0,39, p=0,01) und Eisen (r=-0,35, p=0,03) in den Spermien bezogen
auf das Trockengewicht,
68
Ergebnisse
•
Rubidium im Ejakulat bezogen auf das Trockengewicht (r=-0,36, p=0,02).
Der Prozentsatz der vorwärtsbeweglichen Spermien ist signifikant mit folgenden
Werten korreliert:
•
Selen im Ejakulat (r=0,43, p=0,006) (s. Abbildung 13) und in den Spermien
(r=0,43, p=0,005) bezogen auf die Trockenmasse,
•
Selen in den Spermien bezogen auf die Anzahl (r=0,31, p=0,05),
•
Zink im Ejakulat bezogen auf die Trockenmasse (r=0,34, p=0,03),
•
Selen im Seminalplasma bezogen auf das Trockengewicht (r=0,32, p=0,05),
•
Vitamin A im Blut (r=0,39, p=0,01).
Zum Anteil der morphologisch abweichenden Spermien korrelieren folgende Werte:
•
Selen (r=-0,39, p=0,01) und Zink (r=-0,33, p=0,04) im Ejakulat bezogen auf
die Trockenmasse,
•
Eisen in den Spermien bezogen auf Masse (r=0,36, p=0,02) und Anzahl
(r=0,38, p=0,01).
Die Membranintaktheit nach 0h korreliert signifikant positiv mit:
•
Selen (r=0,53, p<0,001), Zink (r=0,50, p=0,001) (s. Abbildung 15) und Eisen
(r=0,38, p=0,02) im Ejakulat bezogen auf die Trockenmasse,
•
Selen im Ejakulat bezogen auf die Feuchtmasse (r=0,38, p=0,01),
•
Selen in den Spermien bezogen auf die Trockenmasse (r=0,53, p<0,001) (s.
Abbildung 14) und die Anzahl der Spermien (r=0,40, p=0,01),
•
Selen im Seminalplasma bezogen auf die Trockenmasse (r=0,38, p=0,02).
Die Membranintaktheit nach 24h korreliert signifikant mit den Werten für:
•
Selen im Ejakulat bezogen auf die Trocken- (r=0,39, p=0,01) und
Feuchtmasse (r=0,32, p=0,05),
•
Zink im Ejakulat bezogen auf die Trockenmasse (r=0,35, p=0,03),
•
Selen in den Spermien bezogen auf die Trockenmasse (r=0,48, p=0,002) (s.
Abbildung 16) und auf die Anzahl der Spermien (r=0,32, p=0,05).
69
Ergebnisse
Die Anzahl der Spermien mit positiv akrosomalem Status nach 0h ohne
Kalziuminduktion ist signifikant mit folgenden Werten korreliert:
•
Selen (r=-0,60, p<0,001) (s. Abbildung 17), Zink (r=-0,52, p<0,001) (s.
Abbildung 18) und Eisen (r=-0,40, p=0,009) im Ejakulat bezogen auf die
Trockenmasse,
•
Selen (r=-0,47, p=0,002), Zink (r=-0,35, p=0,03) und Eisen (r=-0,39, p=0,01)
im Ejakulat bezogen auf die Feuchtmasse,
•
Selen im Seminalplasma bezogen auf die Trockenmasse (r=-0,46, p=0,003),
•
Selen in den Spermien bezogen auf die Trockenmasse (r=-0,45, p=0,003) und
die Anzahl (r=-0,42, p=0,007).
Die Anzahl der Spermien mit positiv akrosomalem Status nach 24h korreliert
signifikant mit dem Werten für:
•
Zink im Ejakulat bezogen auf die Trockenmasse (r=-0,32, p=0,04),
•
Selen im Ejakulat bezogen auf die Trocken- (r=-0,36, p=0,02) und
Feuchtmasse (r=-0,37, p=0,02),
•
für Selen in den Spermien bezogen auf die Trockenmasse (s. Abbildung 19)
(r=-0,46, p=0,003),
•
Selen im Blut (r=0,36, p=0,02).
Weitere Korrelationen ergaben sich zwischen der Anzahl der Spermien mit positiv
akrosomalem Status nach Kalziuminduktion mit folgenden Werten:
•
Selen (r=-0,36, p=0,02) und Eisen (r=-0,37, p=0,02) im Ejakulat bezogen auf
die Trockenmasse,
•
Selen im Seminalplasma bezogen auf die Trockenmasse (r=-0,31, p=0,05),
•
Vitamin E im Blut (r=0,39, p=0,01),
•
Mangan im Blut (r=0,33, p=0,04).
Zum DFI korrelieren die Werte für Selen (r=-0,39, p=0,01) und Zink (r=-0,34, p=0,03)
im Ejakulat bezogen auf die Trockenmasse.
70
Ergebnisse
Der alpha-t-Wert korreliert signifikant negativ mit dem Zinkgehalt im Blut (r=-0,47,
p=0,002) (s. Abbildung 21).
Zudem korreliert das Alter signifikant mit den Werten für:
•
Selen im Seminalplasma bezogen auf die Feuchtmasse (r=0,37, p=0,02),
•
Rubidium im Ejakulat bezogen auf die Feuchtmasse (r=0,32, p=0,04),
•
Zink im Blut (r=-0,66, p<0,001) (s. Abbildung 20).
2
Selen im Ejakulat [nmol/ml]
1,8
1,6
y = -0,0123x + 1,3837
R2 = 0,3825
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
20
40
60
80
100
120
Volumen [ml]
Abbildung 9: Korrelation zwischen dem Selengehalt im Ejakulat [nmol/ml] und
dem Volumen der Ejakulate [ml] (r=-0,62, p<0,001) bei Zuchthengsten (n=41)
71
Ergebnisse
16
Eisen im Ejakulat [nmol/ml]
14
12
y = -0,0971x + 12,523
R2 = 0,3591
10
8
6
4
2
0
0
20
40
60
80
100
120
Volumen [ml]
Abbildung 10:Korrelation zwischen dem Eisengehalt im Ejakulat [nmol/ml] und
dem Volumen der Ejakulate [ml] (r=-0,60, p<0,001) bei Zuchthengsten (n=41)
2
Selen im Ejakulat [nmol/ml]
1,8
1,6
y = 0,0038x - 0,1184
R2 = 0,9056
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
Dichte [Spermien/ml]
Abbildung 11: Korrelation zwischen dem Selengehalt im Ejakulat [nmol/ml] und
der Dichte der Ejakulate [Spermien/ml] (r=0,92, p<0,001) bei Zuchthengsten
(n=41)
72
Ergebnisse
16
Eisen im Ejakulat [nmol/ml]
14
y = 0,0283x + 1,0865
R2 = 0,7441
12
10
8
6
4
2
0
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
Dichte [Spermien/ml]
Abbildung 12: Korrelation zwischen dem Eisengehalt im Ejakulat [nmol/ml] und
der Dichte der Ejakulate [Spermien/ml] (r=0,86, p<0,001) bei Zuchthengsten
(n=41)
45
Selen im Ejakulat [nmol/g]
40
35
y = 0,1592x + 9,6265
R2 = 0,1529
30
25
20
15
10
5
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
PMS [%]
Abbildung 13: Korrelation zwischen dem Selengehalt im Ejakulat [nmol/g] und
dem Anteil der progressiv motilen Spermien (PMS [%]) (r=0,43, p=0,006) bei
Zuchthengsten (n=41)
73
Ergebnisse
180
Selen in den Spermien [nmol/g]
160
y = 0,5397x + 89,255
R2 = 0,1708
140
120
100
80
60
40
20
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
PMI 0h [%]
Abbildung 14: Korrelation zwischen dem Selengehalt in den Spermien [nmol/g]
und dem Anteil plasmamembranintakter Spermien (PMI [%]) nach 0h (r=0,53,
p<0,001) bei Zuchthengsten (n=41)
40
Zink im Ejakulat [nmol/g]
35
30
y = 0,0677x + 15,112
R2 = 0,0191
25
20
15
10
5
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
PMI 0h [%]
Abbildung 15: Korrelation zwischen dem Zinkgehalt im Ejakulat [nmol/g] und
dem Anteil plasmamembranintakter Spermien (PMI [%]) nach 0h (r=0,50,
p=0,001) bei Zuchthengsten (n=41)
74
Ergebnisse
180
160
140
120
100
80
60
y = 0,4362x + 95,508
R2 = 0,1182
40
20
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
PMI 24h [%]
und dem Anteil plasmamembranintakter Spermien (PMI [%]) nach 24h (r=0,48,
45
Selen im Ejakulat [nmol/g]
40
35
30
y = -0,7051x + 27,705
R2 = 0,3228
25
20
15
10
5
0
0
5
10
15
20
25
30
35
PAS 0h [%]
Abbildung 17: Korrelation zwischen dem Selengehalt im Ejakulat [nmol/g] und
dem Anteil der Spermien mit positiv akrosomalem Status (PAS [%]) nach 0h
(r=-0,60, p<0,001) bei Zuchthengsten (n=41)
75
Ergebnisse
1000
900
Zink im Ejakulat [nmol/g]
800
y = -6,7749x + 586,21
R2 = 0,107
700
600
500
400
300
200
100
0
0
5
10
15
20
25
30
35
PAS 0h [%]
Abbildung 18: Korrelation zwischen dem Zinkgehalt im Ejakulat [nmol/g] und
dem Anteil der Spermien mit positiv akrosomalem Status (PAS [%]) nach 0h
180
160
140
120
100
80
60
y = -0,9406x + 136,2
R2 = 0,1397
40
20
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
PAS 24h [%]
und dem Anteil der Spermien mit positivem akrosomalem Status (PAS[%])
nach 24h (r=-0,46, p=0,003) bei Zuchthengsten (n=41)
76
Ergebnisse
16
14
Zink im Blut [µmol/l]
12
10
8
y = -0,1252x + 12,8
R2 = 0,4125
6
4
2
0
0
5
10
15
20
25
30
Alter [Jahre]
Abbildung 20: Korrelation zwischen dem Zinkgehalt im Blut [µmol/l] und dem
Alter [Jahre] (r=-0,66, p<0,001) bei Zuchthengsten (n=41)
15
Zink im Blut [µmol/l]
13
11
9
y = -0,0355x + 19,522
R2 = 0,229
7
5
150
0
175
200
225
250
275
300
325
alpha-t
Abbildung 21: Korrelation zwischen dem Zinkgehalt im Blut [µmol/l] und dem
alpha-t-Wert (r=-0,47, p=0,002) bei Zuchthengsten (n=41)
77
Diskussion
5 Diskussion
Über die Bedeutung von Spurenelementen im Zusammenhang mit der Fruchtbarkeit
ist schon viel geforscht worden. Ziel dieser Studie war es, einen Überblick darüber zu
bekommen, wie die Spurenelementgehalte im Blut und im Ejakulat bzw. dem
Seminalplasma und den Spermien bei Hengsten verteilt sind. Die Frage, in welchen
Teilen des Ejakulates die Elemente vorhanden sind und somit aus welchen Organen
sie stammen, sollte beantwortet werden. Weiterhin wurden die Korrelationen der
Blut- zu den Spermawerten untersucht. Die Bestimmung der Spurenelemente im
Ejakulat und in den Spermien ist sehr aufwendig. Durch eine Korrelation mit den
Blutwerten könnte dieser Aufwand durch die einfachere Untersuchung des Blutes
ersetzt werden. Zudem sollte herausgefunden werden, ob die Gehalte mit der
Spermaqualität und der Fruchtbarkeit zusammenhängen.
Zur Versuchsdurchführung wurden von 41 Hengsten des Landgestüts Celle je drei
Ejakulate und drei Blutproben im Abstand von je zwei Tagen gewonnen. Die Hengste
wurden gezielt aus unterschiedlichen Altersklassen und mit unterschiedlichen
Fertilitätsvermögen ausgesucht. In den Blutproben wurden die Spurenelement- und
Vitamingehalte bestimmt. In den Ejakulaten wurden zunächst die üblichen
Spermaqualitätsparameter wie Volumen, Dichte und progressive Motilität erfasst.
Sowohl im Sperma als auch in dem durch Zentrifugation von den Spermien
getrennten Seminalplasma wurden die Spurenelementgehalte gemessen. Zudem
wurden von jedem Hengst der morphologische Status eines Ejakulates und mit Hilfe
der Durchflusszytometrie die Chromatinintaktheit, die Membranintaktheit und die
Akrosomintaktheit der Spermien aller Ejakulate bestimmt.
5.1 Spurenelementgehalte im Blut, in den Ejakulaten, im
Seminalplasma und in den Spermien
Selen ist ein Element, welches schon vielfach mit der Fertilität in Zusammenhang
gebracht wurde (KIRCHGESSNER 2004, LAVOIE 2000, PULS 1994, MAYLIN 1980).
78
Diskussion
Im Blut ergaben sich in dieser Studie Selenwerte von 71,8±1,2 µg/l. DROMMER und
SCHÄFER (2006) geben einen Referenzbereich von 28-133 µg/l an. Allerdings gilt
dieser Wert für Blutserum. In dieser Studie wurden die Selenwerte im Vollblut
gemessen. STOWE und HERDT (1992) geben das Verhältnis der Selengehalte von
Vollblut zu Serum mit 1,5:1 an. Damit wäre der Gehalt innerhalb des
Referenzbereiches von DROMMER und SCHÄFER (2006).
Für Ejakulat, Seminalplasma und Spermien ergaben sich folgende Werte: 20,0±1,1
nmol/g bzw. 0,8±0,1nmol/ml, 5,3±0,2 nmol/g bzw. 0,2±0,0 nmol/ml und 125±2,9
nmol/g bzw. 2,4±0,1 nmol/Mrd. BERTELSMANN et al. (2005) geben Werte von
36,8±12,3 nmol/g für das Ejakulat, 8,4±2,3 nmol/g für das Seminalplasma und
156,2±21,6 nmol/g für die Spermien an (Angaben von 2,9±0,97 µg/g, 0,66±0,18 µg/g
und 12,3±1,7 µg/g zur Umrechnung mit Faktor 12,7 multipliziert). In der
vorangegangenen Studie sind also geringfügig höhere Werte gemessen worden.
In der Humanmedizin gilt Zink schon länger als wichtiges Element für die Fertilität
von Männern (CHIA et al. 2000). Aus diesem Grund wurde der Zinkgehalt auch in
der vorliegenden Arbeit berücksichtigt. Der Mittelwert für die Zinkgehalte im Blut war
11,4±0,2 µmol/l. DROMMER und SCHÄFER (2006) geben 11-15 µmol/l und PULS
(1994) 7,19-26,01 µmol/l als Referenzbereich an. Somit gehen die vorliegenden
Werte mit beiden Aussagen konform.
Für die Spermaanteile wurden folgende Werte gemessen: 513±17,6 nmol/g bzw.
19,6±1,1 nmol/ml für das Ejakulat; 364±12,0 nmol/g bzw. 12,3±0,7 nmol/ml für das
Seminalplasma und 1594±55,3 nmol/g bzw. 30,4±1,1 nmol/Mrd. für die Spermien.
BARRIER-BATTUT
et
al.
(2002)
erhielten
26,5±10,7
nmol
Zink
pro
ml
Seminalplasma und PESCH et al. (2006) 13,2 nmol Zink pro ml Seminalplasma.
Somit liegt der hier gemessene Wert von 12,3±0,7 nmol/l unter denen von BARRIERBATTUT et al., stimmt aber mit PESCH et al. überein. Dabei muss berücksichtigt
werden,
dass
bei
den
anderen
Studien
die
Flammenphotometrie
als
Bestimmungsmethode verwendet wurde. Obwohl diese Methode nur das freie Zink
im Seminalplasma misst, erhalten die Autoren höhere Werte, als bei der Methode,
79
Diskussion
die im Rahmen dieser Studie verwendet wurde, bei der der Gesamtzinkgehalt erfasst
wird. Eine Erklärung für diese Diskrepanz konnte nicht gefunden werden.
Die Rolle des Eisens bei der Fertilität muss kontrovers betrachtet werden. Einerseits
trägt es als Teil der Katalase zu deren antioxidativen Wirkung bei. Andererseits ist es
an der Bildung von ROS beteiligt und wirkt somit auch gegenteilig. Für die
Eisenwerte im Blut ergab sich ein Mittelwert 37,5±0,9 µmol/l. DROMMER und
SCHÄFER (2006) geben als Referenzbereich 13-25 µmol/l an. PULS (1994) gibt eine
größere Spanne von 15,04-46,03 µmol/l an. Somit liegen die gemessenen Werte
innerhalb des von PULS angegebenen Bereichs.
Die Ergebnisse der Spermaanteile ergaben sich wie folgt: 205±9,9 nmol/g bzw.
7,6±0,4 nmol/ml für die Ejakulate; 63,8±4,2 nmol/g bzw. 2,0±0,1 nmol/ml für das
Seminalplasma und 1313±49,5 nmol/g bzw. 24,8±0,8 nmol/Mrd. für die Spermien.
BERTELSMANN et al. (2008) erhielten in ihrer Studie Werte von 11,4 nmol/ml für
das Ejakulat, 3,2 nmol/ml für das Seminalplasma und 27 nmol/Mrd. für die Spermien.
Insgesamt sind die Ergebnisse von BERTELSMANN et al. also ein wenig höher.
PESCH et al. (2006) geben einen mittleren Wert von 1,9 nmol/ml und MASSÁNYI et
al. (2003) Werte von 227±163 nmol/ml für das Seminalplasma an. Dabei ist zu
beachten,
dass
für
die
Messungen
andere
Methoden
verwendet
wurden
(Flammenphotometrie bzw. Atomabsorptionsspektophotometrie). Bei PESCH et al.
(2006) ist weiterhin zu beachten, dass bei dieser Methode nur das freie Eisen
berücksichtigt wird, wohingegen bei den anderen Verfahren der Gesamteisengehalt,
also auch das gebundene Eisen, gemessen wird. Dies erklärt die enormen
Unterschiede zwischen den Studien.
Rubidium ist ein Element, welches bisher noch nicht mit der Fruchtbarkeit in
Zusammenhang gebracht wurde. Bei der Rubidiummessung ergaben sich folgende
Werte: 232±12,4 nmol/g bzw. 8,4±0,5 nmol/ml für das Ejakulat und 266±14,8 nmol/g
bzw. 8,4±0,5 nmol/ml für das Seminalplasma. Dies bedeutet, dass fast der gesamte
Rubidiumgehalt im Seminalplasma vorhanden ist (Mittelwert 94,8%) und in den
Spermien nur ein zu vernachlässigender Teil. Daher ist anzunehmen, dass das
80
Diskussion
Rubidium fast ausschließlich aus den akzessorischen Geschlechtsdrüsen stammt.
Bei der Entwicklung der Spermien im Hoden spielt dieses Element also keine Rolle.
Für die restlichen Blutwerte wurden folgende Ergebnisse gemessen: Vitamin E
2,6±0,2 mg/l, Vitamin A 0,3±0,0 mg/l, Kupfer 16,2±0,5 µmol/l, Molybdän 9,9±0,6 µg/l,
Mangan 3,3±0,1 µg/l. DROMMER und SCHÄFER (2006) geben für Kupfer einen
Referenzbereich von 19-21 µmol/l und PULS (1994) einen Bereich von 10,23-31,5
µmol/l an. Auch Kupfer wird eine Bedeutung im Zusammenhang mit der
Fruchtbarkeit zugeschrieben (UMEYAMA et al. 1986, HUANG et al. 2000). PESCH
(2005) konnte in ihrer Studie eine positive Korrelation zwischen Kupfergehalt im
Seminalplasma und dem Anteil der lebenden Spermien feststellen.
5.2 Mittelwerte differenziert nach Alters- und Trächtigkeitsgruppen
Werden die Mittelwertverteilungen der Spurenelemente differenziert nach den drei
Altersgruppen betrachtet, fallen bei einigen Gruppen signifikante Unterschiede auf.
Die Altersgruppen sind dabei wie folgt gewählt: Gruppe 1: 4-7 Jahre, Gruppe 2: 8-15
Jahre und Gruppe 3: 16-26 Jahre.
Bei den Blutwerten für Zink unterscheiden sich alle drei Gruppen signifikant
voneinander. Gruppe 1 hat dabei die höchsten Zinkwerte, Gruppe 3 im Vergleich
dazu die niedrigsten. Die Zinkwerte im Blut sind hochgradig signifikant negativ mit
dem Alter korreliert (r=-0,66, p<0,001; s. Kapitel 5.5). Bei dem Blutwert für Kupfer
unterscheidet sich Gruppe 1 (höchster Wert) signifikant von Gruppe 3 (niedrigster
Wert).
Bei den Zinkwerten aus den Spermien gibt es signifikante Unterschiede und zwar
sowohl bei den Ergebnissen bezogen auf die Trockenmasse als auch bei den
Ergebnissen bezogen auf die Feuchtmasse. Hinsichtlich der Trockenmasse sind die
Zinkgehalte in der mittleren Altersgruppe signifikant höher als die Gehalte in der
Gruppe der ältesten Hengste. Bei der Feuchtmasse ist die mittlere Gruppe signifikant
höher als die beiden anderen. Werden die Zinkwerte für das Ejakulat betrachtet, so
ergibt sich für Gruppe 3 ein Wert, der signifikant niedriger ist, als der Wert der beiden
jüngeren Gruppen. Bisherige Veröffentlichungen aus der Humanmedizin bringen
81
Diskussion
geringe Zinkwerte im Seminalplasma mit Infertilität in Verbindung (HUANG et al.
2000, CHIA et al. 2000). Eine weitere Untersuchung ergab eine negative Korrelation
des Zinkgehaltes zur Motilität und eine positive zum Anteil der morphologisch
abweichenden Spermien beim Menschen (HENKEL et al. 1999).
Im Seminalplasma sind die Gehalte von Eisen und Selen in der ältesten Gruppe
signifikant höher, als bei den anderen beiden. Ein möglicher Grund hierfür könnte ein
Auswertungsfehler sein. Das Seminalplasma wurde erst durch Zentrifugation aus
den Ejakulaten gewonnen, nachdem die Proben eingefroren und verschickt worden
sind. Daher besteht die Möglichkeit, dass die Spemienmembranen geschädigt
wurden und somit Spurenelemente aus den Spermien in das Seminalplasma
austraten. Die Wahrscheinlichkeit, dass die Spermien der älteren Hengste am
anfälligsten für eine Schädigung durch Kälte sind, ist recht hoch. BERTELSMANN et
al. (2005) konnten in ihrer Studie zu den Selengehalten in Ejakulatfraktionen keine
solchen Unterschiede in den Altersgruppen feststellen, obwohl die Reihenfolge der
Probenbearbeitung dieselbe war. Die Gründe hierfür könnten darin liegen, dass
BERTELSMANN et al. (2005) die Untersuchungen im Januar durchführten,
wohingegen die Ejakulatentnahmen zu dieser Studie im Juli und August stattfanden.
Die Unterschiede zwischen den beiden Studien könnten somit möglicherweise auf
saisonalen Effekten beruhen.
Werden die Mittelwerte differenziert nach den verschiedenen Fertilitätsgruppen
betrachtet, gibt es nur bei den Werten für Selen in den Spermien signifikante
Unterschiede zwischen den Gruppen. Zur Einteilung in Fertilitätsgruppen ist die
individuelle saisonale Trächtigkeitsrate verwendet worden. Hierbei bildet das untere
Quartil (Trächtigkeitsrate 25,0-40,9 %) Gruppe 1, das obere Quartil (Trächtigkeitsrate
50,9-58,9
%)
Gruppe
3
und
die
beiden
mittleren
Quartile
zusammen
(Trächtigkeitsrate 40,9-50,9 %) Gruppe 2. In den Spermien ist der Gehalt des
Spurenelements Selen in Gruppe 3 - also der Gruppe der Hengste, deren Stuten
hohe Trächtigkeitsraten aufweisen - am höchsten. Dieses Ergebnis stimmt auch mit
dem Ergebnis von BERTELSMANN et al. 2005 überein, welche eine positive
Korrelation zwischen den Selengehalten der Spermien und den Abfohlraten der
Stuten, die von den entsprechenden Hengsten besamt wurden, ermitteln konnten.
82
Diskussion
Weiterhin korreliert der Selengehalt in den Spermien und im Ejakulat mit dem
Prozentsatz der vorwärtsbeweglichen Spermien (s. Kapitel 5.5). Dieser Wert
korreliert wiederum schwach signifikant positiv mit der Trächtigkeitsrate. Es kann
vermutet werden, dass höhere Selengehalte die Motilität begünstigen, was sich
außerdem günstig auf die Befruchtung auswirkt.
5.3 Hengst- und ejakulatbedingte Variationen der Spurenelementund Vitamingehalte im Blut und Ejakulat
Die Gewinnung der drei Ejakulate und der drei Blutproben erfolgt in zweitägigem
Abstand von Hengsten, die in regelmäßiger sexueller Beanspruchung standen.
Die Spermawerte für Selen, Rubidium, die Seminalplasmawerte Zink und Eisen, die
Ejakulatwerte für Zink und die im Blut der Hengste gemessenen Gehalte von Vitamin
E und Kupfer waren vornehmlich abhängig vom Hengst. Der Eisenwert im Ejakulat
bezogen auf die Feuchtmasse wird ungefähr zu gleichen Teilen von Hengst und
Ejakulat bedingt. Von dem Faktor Ejakulat bzw. Blutprobe hängen hauptsächlich die
Werte für Zink in den Spermien, die Eisenwerte im Ejakulat bezogen auf die
Trockenmasse und die Blutwerte von Eisen, Zink, Vitamin A, Molybdän und Mangan
ab. Die Eisenwerte der Spermien und die Selenblutwerte sind zu 100 % vom Ejakulat
bzw. der Blutprobe abhängig. PAGAN et al. (2007) erkannten Unterschiede in den
Blutplasmawerten für Selen, abhängig vom Zeitpunkt des Trainings. So waren die
Werte vor dem Training geringer als direkt danach. Unterschiede ergaben sich auch
durch die Fütterung von anorganischen bzw. organischen Selenverbindungen. Die
Pferde, denen die anorganischen Verbindungen gefüttert wurden, erreichten 24
Stunden nach dem Training wieder ihre Ausgangswerte im Blutspiegel. Bei jenen mit
der organischen Fütterung blieben die Werte auch nach 24 Stunden noch erhöht. Die
Varianz der Selenwerte im Blut aus dieser Studie könnten darauf zurückgeführt
werden, dass bei der Blutentnahme nicht darauf geachtet wurde, ob sie vor oder
nach der Arbeit mit den Tieren stattfand.
Da keiner der Werte ausschließlich, oder fast ausschließlich durch den Faktor
Hengst
bedingt
wird
(Varianzkomponente
<86
%)
sollte
bei
späteren
Untersuchungen stets mehrere Stichproben pro Hengst verwendet werden.
83
Diskussion
5.4 Korrelationen der Spurenelementgehalte im Blut zu denen in
den Ejakulatfraktionen
Die Bestimmung der Spurenelemente im Ejakulat, im Seminalplasma und in den
Spermien wurde in der vorliegenden Arbeit über die Neutronenaktivierungsanalyse
durchgeführt.
Bei
der
Spurenelementgehalt
Untersuchung
muss
das
von
biologischen
Probenmaterial
Proben
bei
den
auf
ihren
meisten
Untersuchungsverfahren zunächst aufgeschlossen werden, um die Spurenelemente
zu bestimmen. Bei der Selenbestimmung ergibt sich das Problem, dass dabei
flüchtige Selenverbindungen entstehen, die das Messergebnis verfälschen können.
Die Neutronenaktivierungsanalyse erfordert keinen vorherigen Aufschluss und somit
kann diese Fehlerquelle ausgeschlossen werden. Daher ist die Methode der NAA
eine Referenzmethode für die Selenbestimmung in festen Proben. Da die
Bestimmung der Spurenelemente über die Neutronenaktivierungsanalyse sehr zeitund arbeitsaufwendig ist, sollte in dieser Studie herausgefunden werden, ob eine
Korrelation zwischen den Ejakulat- und den Blutwerten besteht. Auf diese Weise
könnte der Aufwand über die wesentlich einfachere Blutanalyse minimiert werden.
Hengsten mit dem Verdacht auf einen geringen Spurenelementgehalt im Sperma,
könnte einfach eine Blutprobe entnommen werden.
Die Korrelationsrechnungen ergaben bei keinem der Spurenelemente eine
signifikante Korrelation (r= -0,23 - 0,20, p= 0,15 - 0,98). Somit ist es nicht möglich,
die Spurenelementanalyse im Ejakulat, im Seminalplasma und in den Spermien
durch die Blutanalyse zur ersetzen.
Spurenelementgehalten zur Spermaqualität und Fruchtbarkeit
Um einen Überblick über die Zusammenhänge zwischen Spurenelementgehalten
und
Fruchtbarkeit
zu
bekommen,
sind
die
Korrelationen
zwischen
den
Spurenelementwerten in Ejakulat, Seminalplasma, Spermien, Blut und den
Vitamingehalten im Blut mit den Parametern für Samenqualität und Fertilität
errechnet worden.
84
Diskussion
Dabei ergab sich eine signifikant negative Korrelation (p<0,001) des Volumens mit
den Werten für Selen und Zink im Ejakulat und im Seminalplasma, Eisen im Ejakulat
bezogen auf die Feuchtmasse und Selen in den Spermien bezogen auf die Anzahl
der Spermien. Zudem korreliert der Eisenwert für das Seminalplasma signifikant
(p<0,01) negativ mit dem Volumen. Aus dem Zusammenhang zwischen dem
Volumen und dem Spurenelementgehalt im Seminalplasma und im Ejakulat kann
geschlossen werden, dass diese Elemente vorzugsweise über den Hoden und
Nebenhoden in das Sperma gelangen.
Dahingegen korreliert die Dichte signifikant positiv (p<0,001) mit Selen, Zink und
Eisen im Ejakulat, Selen und Zink im Seminalplasma bezogen auf die Feuchtmasse
und wiederum Selen in den Spermien bezogen auf die Anzahl. Zusätzlich gab es
signifikante Korrelationen (p<0,01) der Dichte zu Zink in den Spermien und Eisen im
Seminalplasma. Dies belegt, dass die Elemente vorzugsweise über Hoden und
Nebenhoden in das Ejakulat gelangen. Diese Beobachtungen entsprechen auch
denen von PESCH (2005). Sie konnte auch eine negative Korrelation zum Volumen
und eine positive Korrelation zur Dichte der Elemente Zink und Eisen im
Seminalplasma feststellen. Für Zink entsprechen diese Ergebnisse auch denen von
CHIA et al. (2000).
Der Prozentsatz der vorwärtsbeweglichen Spermien korreliert signifikant (p<0,01)
positiv mit den Selengehalten im Ejakulat und in den Spermien. Somit könnte für
höhere Gehalte dieses Spurenelements ein positiver Einfluss auf die Motilität der
Spermien vermutet werden. BLEAU et al. (1984) stellten eine negative Wirkung von
zu hohen bzw. zu niedrigen Selenwerten im Sperma bei Männern auf die Motilität der
Spermien fest. Bei den Ergebnissen der Hengste konnte keine negative Auswirkung
der höheren Werte erkannt werden, was die Vermutung nahe legt, dass schädigend
hohe Bereiche bei Hengsten in vivo nicht vorkommen.
Bei den Werten, die mit Hilfe des Durchflusszytometers gewonnen wurden, hat der
Prozentsatz für die Membranintaktheit nach 0 h eine positive Korrelation (p<0,001)
sowohl zu dem Selengehalt im Ejakulat und in den Spermien, als auch zum
Zinkgehalt im Ejakulat [nmol/g]. Hierbei spielen die Enzymsysteme eine Rolle, in
welchen diese Spurenelemente zur antioxidativen Aktivität beitragen. Selen trägt
85
Diskussion
über die GPx und Zink über die SOD zur Unterbrechung der Kettenreaktion der
Lipidperoxidation bei. Außerdem ist der Selengehalt in den Spermien signifikant
(p<0,01) positiv mit dem Anteil der PMI-Spermien nach 24 h korreliert. Selen könnte
also auch der Spermienalterung entgegen wirken. BEHNE et al. (1988) konnten in
ihren Untersuchungen zum Zinkgehalt in verschiedenen Ejakulatfraktionen keine
Korrelation zur Vitalität der Spermien feststellen, wohingegen CHIA et al. (2000) eine
positive Korrelation zwischen dem Seminalplasmagehalt von Zink und der Vitalität
erkannten.
Die Anzahl der Spermien mit positiv akrosomalem Status nach 0 h ist signifikant
(p<0,001) negativ mit den Selen- und Zinkwerten im Ejakulat [nmol/g] korreliert. Nach
24 h ist der Anteil der PAS-Spermien signifikant (p<0,01) negativ mit dem
Selengehalt in den Spermien korreliert. Somit kann vermutet werden, dass Selen und
Zink eine frühzeitige Akrosomreaktion verhindern. Zudem besteht eine signifikante
Korrelation (p<0,01) der PAS-Spermien zum Selengehalt in den Spermien und
Selen- und Eisenwert im Seminalplasma. Den Hauptanteil an den Selenoenzymen in
equinen Spermien macht die PHGPx aus. Über 90 % des Selengehaltes in den
Keimzellen ist in diesem Enzym gebunden. PHGPx wurde von LIANG et al. (2009)
als Anti-Apoptose-Faktor beschrieben. So kann die Auswirkung des Selengehaltes
auf die Anzahl der PAS-Spermien erklärt werden.
Ferner besteht eine signifikante Korrelation (p<0,001) zwischen dem Alter und dem
Zinkgehalt im Blut (s. auch Kapitel 5.2), d.h. der Gehalt des Elementes im Blut nimmt
mit zunehmendem Alter ab. Diesen Zusammenhang konnten auch HAASE et al.
(2006) bereits für Menschen nachweisen. Der DFI korreliert in dieser Studie positiv
mit dem Alter (p<0,05) und der alpha-t-Wert (Anteil der Rotfluoreszenz, also der
Einzelstränge an der Gesamtpopulation beim SCSA-Assay) korreliert signifikant
(p<0,01) negativ mit dem Zinkgehalt im Blut. Mit dem Alter sinkt somit nicht nur der
Blutzinkgehalt, sondern auch die Chromatinschäden nehmen zu. Daraus kann
indirekt auf eine Rolle von Zink bei der Verhinderung von Chromatinschäden
geschlossen werden.
Zwischen den Selenwerten im Blut und der Spermaqualität konnten keine
Zusammenhänge erkannt werden. Ein Grund könnte sein, dass der Hoden beim
86
Diskussion
Pferd
vorzugsweise
mit
Selen
versorgt
wird,
auch
wenn
niedrigere
Blutkonzentrationen vorhanden sind. Diese Bedingungen konnten BEHNE et al.
(1982, 1986) für Ratten nachweisen. Somit würde sich eine vorübergehend geringere
Selenversorgung nicht sofort auf die Spermienqualität und Fruchtbarkeit auswirken.
Entgegen vorangegangener Studien korreliert der Selengehalt im Ejakulat nur
geringgradig negativ mit dem DFI. BERTELSMANN et al. (2005) konnten eine
signifikant negative Korrelation zwischen dem Selengehalt im Ejakulat und in den
Spermien zur gestörten Chromatinkondensation herstellen. Auch für den Anteil der
morphologisch abweichenden Spermien konnte nur eine geringgradig signifikante
Korrelation zu den Selengehalten bestätigt werden. BLEAU et al. (1984) beschrieben
eine negative Auswirkung auf die Morphologie von zu hohen bzw. zu niedrigen
Selengehalten im menschlichen Sperma.
5.6 Schlussbetrachtung
Abschließend kann formuliert werden, dass sowohl für Selen als auch für Zink eine
mögliche positive Wirkung auf die Fruchtbarkeit vermutet werden kann, da die
Gehalte von beiden Elementen positiv mit der Membran- und Akrosomintaktheit
korrelieren.
Höhere
Selengehalte
könnten
mit
einer
verbesserten
Motilität
zusammenhängen und Zink scheint indirekt an der Chromatinintaktheit beteiligt zu
sein.
Bei weiteren Untersuchungen zu diesem Thema müsste überprüft werden, ob die
Reihenfolge der Aufbereitung bei den Untersuchungen Folgen auf die Ergebnisse
hatte. So sollten Ejakulatproben zunächst in Seminalplasma und Spermien
aufgetrennt und erst danach für den Transport eingefroren werden.
Als
weiterführende
Spurenelementgehalte
Forschungen
im
Sperma,
könnten
durch
die
Veränderungen
vorangegangene
der
zusätzliche
Spurenelementgaben bei der Fütterung, in Betracht gezogen werden. Die Frage, ob
ein zusätzliches Angebot an Spurenelementen im Futter die Fruchtbarkeitsleistung
von schlecht befruchtenden Hengsten verbessern kann, wäre zu klären.
87
Zusammenfassung
6 Zusammenfassung
Sophie Luise Keppler (2009):
Bestimmung von Spurenelementgehalten im Blut und im Ejakulat und deren
Beziehungen zur Spermaqualität und Fertilität bei Zuchthengsten
Ziel der vorliegenden Studie ist es Spurenelementgehalte im Blut, im Ejakulat, im
Seminalplasma und in den Spermien von Zuchthengsten zu bestimmen. Diese
Spurenelementwerte werden mit Spermaqualitäts- und Fertilitätsparametern auf
bestehende Zusammenhänge überprüft. Weiterhin werden die Beziehungen der
Spurenelementgehalte im Sperma zu denen im Blut untersucht, um festzustellen, ob
diese möglicherweise bedeutsam korrelieren und um somit gegebenenfalls auf
aufwendige Spurenelementanalysen im Sperma verzichten zu können.
Dazu wurden je drei Blut- und Ejakulatproben von 41 Hengsten des Landgestüts
Celle entnommen und deren Spurenelementgehalte bestimmt. Die Selengehalte im
Blut wurden über die selenabhängige GPx-Aktivität in den Erythrozyten bestimmt
(PAGLIA und VALENTINE 1967), die anderen Spurenelemente im Blut über die ICPOES und die Spurenelementgehalte im Sperma über die NAA. Weiterhin wurden bei
den Ejakulaten die Spermaqualitätsparameter erfasst und Untersuchungen zur
Plasmamembranintaktheit, zum akrosomalen Status und zur Chromatinintaktheit
durchgeführt. Als Fertilitätsparameter wurden die Trächtigkeitsraten pro Rosse
verwendet.
Bei den Vergleichen zwischen den Blutwerten und den Werten in den
Ejakulatanteilen konnten keine signifikanten Korrelationen festgestellt werden. Dies
bedeutet,
dass
bei
den
untersuchten
Hengsten
die
alleinige
Spurenelementbestimmung aus den Blutproben keine Rückschlüsse auf die
Spurenelementgehalte in den Ejakulatfraktionen erlaubt.
Die
vergleichenden
Betrachtungen
der
Spurenelementwerte
und
der
spermatologischen Parameter ergeben, dass die Spurenelementgehalte negativ mit
den Volumina und positiv mit den Dichten der Ejakulate korrelieren. So kann auf eine
88
Zusammenfassung
hauptsächlich testikuläre und epididymale Herkunft der Elemente geschlossen
werden.
Die Selengehalte der Ejakulate und der Spermien korrelieren positiv mit der
Vorwärtsmotilität der Spermien.
Zudem korrelieren die Gehalte von Selen und Zink im Ejakulat und die Gehalte von
Selen in den Spermien positiv mit der Anzahl der Spermien mit intakter
Plasmamembran und negativ mit der Anzahl der Spermien mit positiv akrosomalem
Status.
Im Ergebnis fällt auf, dass die ältesten Hengste sowohl im Ejakulat, als auch in den
Spermien stets die niedrigsten Zinkwerte aufweisen.
Der Zinkwert im Blut korreliert negativ mit dem Alter und mit dem alpha-t-Wert
(Maßzahl für die Chromatinintegrität) der Spermien. Zudem konnten in den Spermien
älterer Hengste hohe DFI-Werte gemessen werden. Im Alter nimmt der Zinkgehalt in
den Spermien ab, was einen möglichen Grund für die höheren Chromatinschäden
bei älteren Hengsten darstellen könnte.
Die Differenzierung anhand der von den Hengsten erreichten Trächtigkeitsraten
ergibt signifikant höhere Gehalte für Selen in den Spermien der Hengste mit den
besten Trächtigkeitsergebnissen.
89
Summary
7 Summary
Sophie Luise Keppler (2009):
Determination of trace element concentrations in blood and in semen and their
relations to sperm quality and fertility of stallions
The purpose of this study is to determine the concentrations of trace elements in
blood, in ejaculate, in seminal plasma and in spermatozoa of stallions. This data of
the trace element concentrations has been compared to sperm quality and fertility
parameters to detect, whether there is coherence. Furthermore the relations between
the trace element concentrations in semen and blood have been reviewed to find out
whether they might correlate significantly and therefore the elaborate analysis in the
ejaculate fractions is dispensable.
In order to test their trace element status, three blood and semen samples each of 41
stallions of the State Stud of Lower Saxony were collected. The selenium
concentrations in blood were detected via the selenium-dependent GPx-activity in
red blood cells (PAGLIA und VALENTINE 1967), the concentrations of the other
trace elements in blood via ICP-OES and the trace elements in the semen via NAA.
Furthermore the sperm quality parameters of the semen samples were determined
and the assays for the plasma membrane integrity, acrosomal status and chromatin
integrity were carried out. The pregnancy rates per oestrus cycle have been used as
well.
There are no correlations between the trace element concentrations in semen and
blood. Therefore the elaborate analysis of the semen via NAA cannot be replaces by
the analysis of blood samples.
Comparing the trace element concentrations and the parameters of sperm quality it
can be concluded that the trace element values correlate positively with the volumes
und negatively with the densities of the ejaculates. It can be assumed, that these
elements have a testicular and epididymal origin.
The selenium values of the ejaculates and the spermatozoa correlate positively with
the forward motility of the spermatozoa.
90
Summary
Moreover the concentrations of selenium and zinc in the ejaculate and of selenium in
the spermatozoa correlate positively with the number of the spermatozoa with an
intact plasma membrane and negatively with the number of spermatozoa with a
positive acrosomal status.
In conclusion the oldest stallions have in semen and in the spermatozoa always the
lowest zinc concentrations.
The zinc value in the blood correlates negatively with the age and with the alpha-tvalue (measure for chromatin integrity) of the spermatozoa. Furthermore higher DFIvalues could be detected in the spermatozoa of the older stallions. In higher age the
zinc concentration decreases in the spermatozoa. This could be a possible reason
for the higher chromatin damage of older stallions.
The differentiation by means of the pregnancy rates of the stallions shows
significantly higher values for selenium in the spermatozoa of the stallions with the
best pregnancy results.
91
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109
Anhang
9 Anhang
9.1 Zusammensetzung verwendeter Medien
INRA 82-Magermilchverdünner
5 g Glukose
300 mg Laktose
300 mg Raffinose
60 mg Tri-Natrium-Citrat-Dihydrat
82 mg Kalium-Citrat
952 mg HEPES
10 IE/ml Penicillin
10 IE/ml Gentamicin
100 ml Aqua bidestillata
100 ml UHT-Magermilch
pH-Wert 7,4 und Osmolarität 320 mOsm
(Nach SIEME, 2005)
HBS-Medium
8,006 g NaCl
0,14 g KOH
4,766 g HEPES
1,982 g Glucose x H2O
1 l Aqua bidestillata
pH-Wert 7,4 und Osmolarität 320 mOsm
Tyrode-Medium
0,5844 g NaCl
0,0231 g KCl
0,0294 g CaCl2 x 2H2O
0,0081 g MgCl2 x 6H2O
0,0061 g NaH2PO4
110
Anhang
0,2421 g Na-Laktat
0,0110 g Na-Pyruvat
0,2383 g HEPES
0,0050 g Gentamicin
pH-Wert 7,4, Osmolarität 320 mOsm
TNE-Puffer
9,48 g 0,01M Tris-HCl (Trizma Base)
52,6 g 0,15M NaCl
2,23 g 1mM EDTA
pH-Wert 7,4 mit NaOH
Diese Lösung vor der Benutzung 1:10 mit Aqua bidestillata verdünnen.
9.2 Verwendete Chemikalien und Fluorochrome
Calcium-Ionophor A23187 (Fa. Sigma-Aldrich, München, C 7522)
0,715 mM
Säuredetergenz
4,39 g 0,15M NaCl (Fa. Sigma-Aldrich, München, X-100)
0,5 ml 0,1%Triton-X (Fa. Sigma-Aldrich, München, X-100)
20 ml 2,0N HCl
pH-Wert 1,2 mit 5N HCl einstellen
Akridinorange
(Lagerung bei 4°C)
0,1 M Citric acid-Puffer
- 21,01 g Citric acid monohydrate (Sigma-Aldrich, München, C 1909)
111
Anhang
- ad 1000 ml Aqua bidestillata
0,2 M Na2HPO4-Puffer
- 28,4 g Sodium phosphate dibasic (Sigma-Aldrich, München, S 7907)
- ad 1000 ml Aqua bidestillata
Färbepuffer
- 370 ml 0,1M Citric acid-Puffer
- 630 ml 0,2M Na2HPO4-Puffer
- 372 mg 1mM EDTA
- 8,77 g 0,15M NaCl
- pH-Wert 6 mit NaOH einstellen
Akridinorange (AO)-Stammlösung (1mg/ml)
- 10 mg AO (Polysciences, Eppelheim, 04539)
- 10 ml Aqua bidestillata
Akridinorange-Gebrauchslösung
- 100 ml Färbepuffer
- 600 µl AO-Stammlösung
FITC-PNA (Fa. Sigma-Aldrich, München, L 7381)
1 mg/10ml Aqua destillata
Propidiumiodid (PI) (Fa. Sigma-Aldrich, München,P 4170)
10 mg/5ml Aqua destillata
112
Anhang
9.3 Mittelwerte mit Standardabweichung differenziert nach Altersund Trächtigkeitsgruppen
Tabelle 18: Mittelwerte und Standardabweichungen differenziert nach
Altersgruppen.
Altersgruppen
4-7 Jahre
8-15 Jahre
16-26 Jahre
75,5±16,6
69,1±11,8
70,8±15,3
20,3±4,4
21,4±7,9
18,0±8,4
0,7±0,2
0,8±0,4
0,8±0,5
Se SP [nmol/g]
5,3±0,8
5,1±1,0
5,7±1,9
Se SP [nmol/ml]
0,16a±0,1
0,17a±0,1
0,22b±0,1
126,7±15,7
128,8±22,4
118,0±27,3
2,4±0,3
2,5±0,5
2,3±0,7
38,8±6,9
36,7±7,6
37,2±9,5
219,4±111,6
196,1±58,6
199,9±77,1
7,1±2,8
7,4±3,1
8,6±4,2
Fe SP [nmol/g]
68,2±39,0
55,6±26,4
69,0±22,5
Fe SP [nmol/ml]
1,9a±1,0
1,8a±0,9
2,5b±0,8
1211,9±398,4
1412,1±563,6
Selen
Se Blut [µg/l]
Se Spermien
[nmol/Mrd.]
X¯ ±SD
Eisen
Fe Blut [µmol/l]
1342,0±734,
5
113
Anhang
Fe Spermien
23,3±6,8
27,1±11,0
12,3a±1,5
11,3b±1,8
10,4c±1,4
525,8b±64,4
553,1b±147,2
446,9a±109,3
18,3±6,6
21,0±8,7
19,4±8,3
Zn SP [nmol/g]
372,5±62,8
377,0±100,2
336,7±69,7
Zn SP [nmol/ml]
11,7±5,9
12,3±5,2
12,8±4,9
[nmol/Mrd.]
24,5±11,3
Zink
Zn Blut [µmol/l]
Zn Spermien
[nmol/Mrd.]
1591,6a,b±40
2,2
29,7a±8,1
1764,4b±525,1 1382,1a±427,9
33,9b±9,2
26,9a±10,1
Rubidium
231,5±73,3
244,9±94,6
216,7±92,5
7,7±2,9
9,0±3,6
8,6±2,2
Rb SP [nmol/g]
272,2±96,3
279,0±98,6
241,1±129,5
Rb SP [nmol/ml]
7,9±3,2
8,9±3,4
8,6±2,8
Blut
Vit. E Blut [mg/l]
2,7±1,1
2,5±1,0
2,7±1,8
Vit. A Blut [mg/l]
0,3±0,1
0,3±0,7
0,3±0,1
Cu Blut [µmol/l]
17,0a±2,4
16,4a,b±3,8
15,2b±2,6
Mo Blut [µg/l]
9,1±4,1
9,4±4,0
11,5±5,2
Mn Blut [µg/l]
3,3±0,7
3,4±1,7
3,1±0,7
114
Anhang
Tabelle 19: Mittelwerte und Standardabweichung differenziert nach den
Trächtigkeitsgruppen.
TRR – Quartile
0-25%
25-75%
75-100%
25,0-40,9
40,9-50,9
50,9-58,8
71,2±16,4
69,9±12,3
73,2±14,0
18,0±9,82
19,2±6,6
23,4±7,4
0,8±0,5
0,8±0,3
0,9±0,5
Se SP [nmol/g]
5,8±2,1
5,0±1,0
5,5±1,3
Se SP [nmol/ml]
0,2±0,1
0,2±0,1
0,2±0,1
114,7a±27,8
123,2a±22,2
139,0b±18,5
2,3±0,7
2,4±0,5
2,6±0,4
Selen
Se Blut [µg/l]
Se Spermien [nmol/Mrd.]
X¯ ±SD
Eisen
Fe Blut [µmol/l]
37,8±10,7
36,7±8,0
39,6±5,9
166,2±50,5
206,0±76,5
200,6±47,4
6,9±3,1
8,0±3,6
7,6±3,5
Fe SP [nmol/g]
60,7±26,7
63,0±27,2
52,5±21,4
Fe SP [nmol/ml]
2,2±1,0
2,1±0,9
1,6±0,7
Fe Spermien [nmol/Mrd.]
1225,0±510,1 1328,4±475,4 1228,6±412,8
24,3±10,2
25,5±8,6
22,8±7,7
Zink
115
Anhang
Zn Blut [µmol/l]
11,3±2,0
10,9±1,5
11,1±1,9
503,7±132,8
502,9±150,9
531,3±87,4
20,6±8,0
20,2±9,1
20,1±8,1
Zn SP [nmol/g]
378,9±89,0
363,4±100,6
367,7±80,2
Zn SP [nmol/ml]
13,5±4,5
13,1±6,8
11,9±4,5
Zn Spermien [nmol/Mrd.]
1542,9±528,0 1536,5±502,0 1652,5±587,1
31,1±10,8
29,3±10,1
30,8±10,2
Rubidium
224,9±105,3
233,3±80,8
246,7±118,4
8,5±2,6
9,2±3,9
8,3±2,4
Rb SP [nmol/g]
259,6±152,1
258,9±88,8
296,5±137,9
Rb SP [nmol/ml]
8,7±3,3
9,0±3,8
8,7±2,9
Blut
Vit. E Blut [mg/l]
3,2±2,0
2,5±1,1
2,4±1,0
Vit. A Blut [mg/l]
0,4±0,2
0,3±0,1
0,3±0,1
Cu Blut [µmol/l]
15,4±3,3
16,6±3,5
15,1±2,5
Mo Blut [µg/l]
10,4±4,2
9,3±4,4
12,0±5,5
Mn Blut [µg/l]
3,7±2,1
3,2±0,8
3,0±0,6
Für Tabelle 18 und 19 gilt: a, b= Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich
signifikant
Se= Selen, Cu= Kupfer, Fe= Eisen, Zn= Zink, Mo= Molybdän, Mn= Mangan, Rb= Rubidium,
SP= Seminalplasma
116
Anhang
Spurenelementgehalten im Blut und Ejakulat zu den
Spermaqualitäts- und den Fruchtbarkeitsparametern.
Zur Berechnung wurde jeweils der Mittelwert der drei Sprünge eines jeden Hengstes
herangezogen, n=41.
Tabelle 20: Korrelationen zwischen den Spurenelementen und Vitaminen zu
den spermatologischen Parametern und den Fertilitätsdaten
Parameter
Alter
Volumen Dichte
V%
MAS
KK
TRR
NR33
Selen
Se Blut [µg/l]
-0,25
0,17
-0,17
-0,02
0,00
0,11
-0,13
-0,19
-0,23
-0,25
0,76***
0,43**
-0,39*
-0,19
0,30
0,31
0,09
-0,62***
0,92***
0,25
-0,16
-0,12
0,20
0,16
Se SP [/g]
0,02
-0,37*
0,45**
0,32*
0,02
-0,26
0,01
0,05
Se SP. [/ml]
0,37*
-0,62***
0,50***
-0,00
0,20
-0,07
-0,01
-0,03
-0,07
-0,23
0,39*
0,43**
-0,23
-0,30
0,35
0,38*
0,05
-0,57***
0,73***
0,31*
-0,22
-0,09
0,22
0,24
Se Sperma
[/g]
Se Sperma
[/ml]
Se Spermien
[/g]
Se Spermien
[/Mrd.]
Eisen
Fe Blut
-0,15
-0,07
0,10
0,29
-0,2
0,03
0,15
0,21
-0,24
-0,13
0,58***
0,28
-0,28
-0,08
0,10
0,13
0,13
-0,60***
0,86***
0,18
-0,06
-0,02
0,04
0,05
Fe SP [/g]
0,06
-0,13
0,20
0,22
-0,06
0,06
-0,08
0,05
Fe SP [/ml]
0,28
-0,45**
0,45**
0,13
0,09
0,17
-0,10
0,02
[µmol/l]
Fe Sperma
[/g]
Fe Sperma
[/ml]
117
Anhang
Fe Spermien
[/g]
Fe Spermien
[/Mrd.]
0,09
0,10
-0,35*
-0,27
0,36*
0,19
-0,24
-0,26
0,14
-0,15
-0,04
-0,31
0,38*
0,27
-0,30
-0,33
Zink
Zn Blut
-0,66***
0,32*
-0,12
-0,01
-0,24
-0,10
0,13
0,05
-0,25
-0,27
0,71***
0,34*
-0,33*
-0,18
0,11
0,18
0,13
-0,64***
0,80***
0,11
-0,06
-0,05
0,01
0,01
Zn SP [/g]
-0,08
-0,12
0,32*
0,06
-0,09
-0,04
-0,14
-0,11
Zn SP [/ml]
0,26
-0,59***
0,50***
-0,09
0,16
0,10
-0,19
-0,19
-0,21
-0,20
0,16
0,10
-0,06
-0,01
0,10
0,09
-0,09
-0,38*
0,47**
0,19
-0,24
-0,06
0,12
0,11
[µmol/l]
Zn Sperma
[/g]
Zn Sperma
[/ml]
Zn Spermien
[/g]
Zn Spermien
[/Mrd.]
Rubidium
Rb Sperma
-0,07
0,25
-0,36*
0,12
-0,24
0,05
0,03
0,17
0,32*
-0,19
-0,15
-0,01
0,16
0,09
-0,02
0,10
Rb SP [/g]
-0,15
0,27
-0,27
0,19
-0,09
0,00
0,06
0,19
Rb SP [/ml]
0,29
-0,18
0,00
0,00
0,16
0,08
-0,03
0,08
[/g]
Rb Sperma
[/ml]
Blut
Vit. E Blut
[mg/l]
Vit. A Blut
[mg/l]
Cu Blut
118
-0,07
-0,20
-0,09
0,12
0,04
0,09
0,12
0,30
0,14
-0,34*
0,06
0,39*
-0,12
0,15
-0,01
0,17
-0,12
0,14
-0,04
-0,15
0,07
-0,07
0,01
-0,02
Anhang
[µmol/l]
Mo Blut
[µg/l]
Mn Blut
[µg/l]
0,22
-0,16
0,13
-0,06
0,09
0,06
-0,17
-0,18
-0,23
0,29
-0,10
-0,05
-0,11
-0,06
0,01
-0,02
Tabelle 21: Korrelationen zwischen den Spurenelementen und den Vitaminen
zu den durchflusszytometrischen Ergebnissen
Parameter
PMI
PAS
Ca-
PMI
PAS
0h
0h
PAS
24h
24h
DFI
alpha-t
Selen
Se Blut [µg/l]
-0,11
0,30
0,04
-0,28
0,36*
0,04
-0,27
0,53***
-0,60***
-0,36*
0,39*
-0,36*
-0,39*
-0,15
0,38*
-0,47**
-0,18
0,32*
-0,37*
-0,23
-0,20
Se SP [/g]
0,38*
-0,46**
-0,31*
0,15
-0,23
-0,22
-0,05
Se SP. [/ml]
0,11
-0,25
-0,04
0,06
-0,21
0,09
0,01
0,53***
-0,45**
-0,17
0,48**
-0,46**
-0,27
-0,12
0,40*
-0,42**
-0,13
0,32*
-0,32
-0,22
-0,17
Se Sperma
[/g]
Se Sperma
[/ml]
Se Spermien
[/g]
Se Spermien
[/Mrd.]
Eisen
Fe Blut
[µmol/l]
Fe Sperma
[/g]
Fe Sperma
[/ml]
Fe SP [/g]
0,25
-0,16
0,09
0,20
-0,11
0,03
-0,24
0,38*
-0,40**
-0,37*
0,30
-0,20
-0,23
-0,13
0,25
-0,39*
-0,24
0,24
-0,30
-0,07
-0,09
0,23
-0,24
-0,08
0,03
0,02
-0,18
0,05
119
Anhang
Fe SP [/ml]
Fe Spermien
[/g]
Fe Spermien
[/Mrd.]
0,16
-0,25
0,01
0,04
-0,07
-0,06
0,06
-0,27
0,22
-0,13
0,00
-0,00
0,29
0,18
-0,24
0,17
-0,9
-0,04
0,06
0,26
0,09
Zink
Zn Blut
0,12
0,25
0,24
0,09
0,22
-0,24
-0,47**
0,50***
-0,52***
-0,9
0,35*
-0,32*
-0,34*
-0,30
0,23
-0,35*
0,02
0,17
-0,26
-0,09
-0,18
Zn SP [/g]
0,21
-0,18
0,04
0,06
0,03
-0,23
-0,31
Zn SP [/ml]
0,06
-0,15
0,16
-0,02
-0,05
0,06
-0,13
0,01
-0,02
0,12
0,06
-0,12
0,13
-0,08
0,13
-0,16
0,10
0,10
-0,14
0,04
-0,04
[µmol/l]
Zn Sperma
[/g]
Zn Sperma
[/ml]
Zn Spermien
[/g]
Zn Spermien
[/Mrd.]
Rubidium
Rb Sperma
0,05
-0,15
0,12
0,05
-0,08
0,00
0,19
-0,00
-0,21
0,22
0,04
-0,21
0,24
0,28
Rb SP [/g]
0,15
-0,23
0,75
0,15
-0,13
-0,12
0,12
Rb SP [/ml]
0,01
-0,23
0,23
0,02
-0,18
0,20
0,24
[/g]
Rb Sperma
[/ml]
Blut
Vit. E Blut
[mg/l]
Vit. A Blut
[mg/l]
120
0,07
0,10
0,39*
-0,10
0,05
0,23
0,07
0,05
-0,01
0,00
0,03
-0,15
0,18
0,05
Anhang
Cu Blut
[µmol/l]
Mo Blut
[µg/l]
Mn Blut
[µg/l]
-0,07
0,12
-0,05
0,05
0,01
0,27
-0,18
0,09
-0,10
-0,09
0,27
-0,28
-0,13
0,16
0,01
0,24
0,33*
-0,01
0,25
0,12
-0,28
Für Tabelle 20 und 21 gilt: *= Signifikanz p<0,05; **= Signifikanz p<0,01; ***= Signifikanz
p<0,001; Se= Selen; Cu= Kupfer; Fe= Eisen Zn= Zink; Mo= Molybdän; Mn= Mangan; Rb=
Rubidium; SP= Seminalplasma; V%= geschätzter prozentualer Anteil der
vorwärtsbeweglichen Spermien; MAS= Anteil der morphologisch abweichenden Spermien;
KK= Anteil der Kopfkappenveränderungen; PMI 0h/24h= Anteil der plasmamembranintakten
Spermien direkt nach der Ejakulatgewinnung und 24 Stunden danach; PAS 0h/24h= Anteil
der Spermien mit positiv akrosomalem Status direkt nach der Ejakulatgewinnung und 24
Stunden danach; Ca-PAS= Anteil der Spermien mit positiv akrosomalem Status nach Zusatz
des Ca-Ionophors A23187; DFI= DNA-Fragmentationsindex; alpha-t= Anteil der
Rotfluoreszenz der Gesamtpopulation; TRR= individuelle saisonale Trächtigkeitsrate; NR33=
Non-Return-Rate für Tag 33.
9.5 Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Anordnung der Pailletten zur Gefrierung im Styroporgefäß
Abb. 2: Aufbereitung und anschließende Verwendung der Ejakulate
Abb. 3: Verwendung der Blutproben
Abb. 4: Zinkgehalte in den Spermien in [nmol/g] (Abb. 4A) und in [nmol/Mrd.
Spermien] (Abb. 4B) bei Zuchthengsten (n=41 Hengste, m=3 Ejakulate)
unter Berücksichtigung des Alters der Hengste
Abb. 5: Zinkgehalte im Ejakulat [nmol/g] bei Zuchthengsten (n=41 Hengste, m=3
Ejakulate) unter Berücksichtigung des Alters der Hengste
Abb. 6: Eisengehalte (Abb. 6A) und Selengehalte (Abb. 6B) im Seminalplasma
[nmol/ml] bei Zuchthengsten (n=41 Hengste, m=3 Ejakulate) unter
Berücksichtigung des Alters der Hengste
121
Anhang
Abb. 7: Zinkgehalte (Abb. 7A) und Kupfergehalte (Abb. 7B) im Blutserum [µmol/l] bei
Zuchthengsten (n=41 Hengste, m=3 Blutproben) unter Berücksichtigung des
Alters der Hengste
Abb. 8: Selengehalte in den Spermien [nmol/g] bei Zuchthengsten (n=41 Hengste,
m=3 Ejakulate) unter Berücksichtigung der Fruchtbarkeitsleistung der
Hengste
Abb. 9: Korrelation zwischen dem Selengehalt im Ejakulat [nmol/ml] und dem
Volumen der Ejakulate [ml] (r=-0,62, p<0,001) bei Zuchthengsten (n=41)
Abb. 10:Korrelation zwischen dem Eisengehalt im Ejakulat [nmol/ml] und dem
Volumen der Ejakulate [ml] (r=-0,60, p<0,001) bei Zuchthengsten (n=41)
Abb. 11:Korrelation zwischen dem Selengehalt im Ejakulat [nmol/ml] und der Dichte
der Ejakulate [Spermien/ml] (r=0,92, p<0,001) bei Zuchthengsten (n=41)
Abb.12: Korrelation zwischen dem Eisengehalt im Ejakulat [nmol/ml] und der Dichte
der Ejakulate [Spermien/ml] (r=0,86, p<0,001) bei Zuchthengsten (n=41)
Abb. 13:Korrelation zwischen dem Selengehalt im Ejakulat [nmol/g] und dem Anteil
der progressiv motilen Spermien (PMS [%]) (r=0,43, p=0,006) bei
Abb. 14:Korrelation zwischen dem Selengehalt in den Spermien [nmol/g] und dem
Anteil plasmamembranintakter Spermien (PMI [%]) nach 0h (r=0,53,
Abb. 15:Korrelation zwischen dem Zinkgehalt im Ejakulat [nmol/g] und dem Anteil
plasmamembranintakter Spermien (PMI [%]) nach 0h (r=0,50, p=0,001) bei
Anteil plasmamembranintakter Spermien (PMI [%]) nach 24h (r=0,48,
Abb. 17:Korrelation zwischen dem Selengehalt im Ejakulat [nmol/g] und dem Anteil
der Spermien mit positivem akrosomalem Status (PAS[%]) nach 0h (r=-0,60,
122
Anhang
Abb. 18:Korrelation zwischen dem Zinkgehalt im Ejakulat [nmol/g] und dem Anteil der
Spermien mit positivem akrosomalem Status (PAS[%]) nach 0h (r=-0,52,
Anteil der Spermien mit positivem akrosomalem Status (PAS[%]) nach 24h
(r=-0,46, p=0,003) bei Zuchthengsten (n=41)
Abb. 20:Korrelation zwischen dem Zinkgehalt im Blut [µmol/l] und dem Alter [Jahre]
Abb. 21:Korrelation zwischen dem Zinkgehalt im Blut [µmol/l] und dem alpha-t-Wert
(r=-0,47, p=0,002) bei Zuchthengsten (n=41)
9.6 Tabellenverzeichnis
Tab. 1: Angaben über Inhaltsstoffe im Seminalplasma (alle Angaben in mg/100ml,
modifiziert nach MANN und LUTWACK-MANN 1981).
Tab. 2: Bedarf an Spurenelementen im Futter beim Pferd (KAMPHUES et al. 2009)
Tab. 3: Vitaminbedarf beim Pferd pro kg Trockenmasse Futter (MC DOWELL 2000)
Tab. 4: Vitaminbedarf beim Pferd bezogen auf das Körpergewicht (KAMPHUES et
al. 2004)
Tab. 5: Typen von ROS
Tab. 6: Die verschiedenen Glutathionperoxidase-Typen
Tab. 7: Vitamin- und Spurenelementgehalte im verwendeten Ergänzungsfuttermittel
laut Deklaration
Tab. 8: Spurenelementgehalte in Heu und Hafer (Angaben in mg/kg TS, nach
MEYER und COENEN 2002)
Tab. 9: Errechnete Spurenelementgehalte der Fütterung (Angaben in mg/kg TS
Futter)
Tab. 10: Morphologische Veränderungen bei Spermien
Tab. 11: Referenzwerte für Spurenelementgehalte im Blutserum beim Pferd
Tab. 12: Gemessene Wellenlängen der Emissionen
Tab. 13: Isotope, Halbwertszeiten und gemessene Emissionslinien der untersuchten
Elemente (BLAAVW 1996)
123
Anhang
Tab. 14: Mittelwerte
±SD,
Minimal-
und
Maximalwerte
der
Vitamine
und
Spurenelemente im Blut und den Ejakulatfraktionen von Zuchthengsten
(n=41 Hengste, m=3 Ejakulate)
Tab. 15: Variabilität der Spurenelementgehalte in den Ejakulatfraktionen bezogen auf
die
Einflussfaktoren
Hengst
und
Ejakulat
anhand
der
Varianzkomponentenschätzung (n=41 Hengste, m=3 Ejakulate)
Tab. 16: Variabilität der Spurenelement- und Vitamingehalte in den Blutproben
bezogen auf die Einflussfaktoren Hengst und Blutprobe anhand der
Varianzkomponentenschätzung (n=41 Hengste, m=3 Blutproben)
Tab. 17: Korrelationen nach Spearman. Angegeben ist der Korrelationswert zwischen
dem Blutwert und dem zugehörigen Wert des gleichen Spurenelements der
jeweiligen Ejakulatfraktion (n=41 Hengste, m=3 Ejakulate).
Tab. 18: Mittelwerte und Standardabweichungen differenziert nach Altersgruppen.
Tab. 19: Mittelwerte
und
Standardabweichung
differenziert
nach
den
Trächtigkeitsgruppen.
Tab. 20: Korrelationen zwischen den Spurenelementen und Vitaminen zu den
spermatologischen Parametern und den Fertilitätsdaten
Tab. 21: Korrelationen zwischen den Spurenelementen und den Vitaminen zu den
durchflusszytometrischen Ergebnissen
124
Danksagung
Herrn Prof. Dr. Harald Sieme danke ich für das Überlassen des Dissertationsthemas.
Seine ironisch anspornende Art und seine ständige Unterstützung bei allen Problemen
haben immer schnell aus einem Tiefpunkt geholfen.
Den Landstallmeistern Dr. Burkhard Bade und Dr. Axel Brockmann danke ich für die
anderthalb Jahre am Landgestüt und die Ermöglichung meiner Versuche.
Eine schöne Zeit habe ich auf den Deckstellen in Bargstedt und Oberndorf verbracht.
Maßgeblich dazu beigetragen haben Ramona-Mona, Manfred, Ralf, Henning (der
Gruselbär-Knispel), Daniel, Michel, Dirk, Fred, Jörgibär, Rolf, Nilson, Locke und
Albrecht. Danke an euch alle, es war lustig.
Vielen Dank auch an die Tierärzte, die mir in dieser Zeit beigebracht haben, was
Stutengyn bedeutet: Gunda Kropp, Martin Lübbeke, Klaus-Eckardt Schlichting und
Saskia Walter.
Herrn Dr. Bertelsmann vom Helmholtz-Zentrum in Berlin danke ich für die Analyse der
Spurenelemente in den Ejakulaten und für den regen fachlichen Austausch.
Den Mitarbeitern des Labors der Rinderklinik und Herrn Dr. Martin Höltershinken bin
ich für die Auswertung meiner Blutproben dankbar.
„Gelassenheit ist oft der Schlüssel zum Glück“ (zitiert nach: Glückskeks, Aral-Tanke,
Marienstraße, November 2007). Allen „celler“ Doktoranden vielen Dank für eine lustige
Gemeinschaft. Camila und Gesa danke für die Unterstützung bei der
Versuchsdurchführung.
Viel, viel Dank gebührt Jutta, Daphne und Gesche für die vielen großen und kleinen
theoretischen Tipps und praktischen Hilfen beim Flow, bei der Formatierung, bei der
Statistik und und und. Danke, dass ich von eurer Erfahrung profitieren durfte.
Der Familie Poll danke ich für eine schöne Saison 2009, die es mir ermöglichte, in Ruhe
zusammen zu schreiben und trotzdem zu leben.
Danke auch an meine Eltern und die Bruders, die nie daran gezweifelt haben, dass ich
mal „Frau Doktor“ werde.
Und das Beste zum Schluss: Rainer, ohne dich hätte ich das nicht geschafft. Nur deine
unermüdliche Motivation und dein Beistand haben dies alles möglich gemacht. Danke,
dass du für mich da bist.
125

Bestimmung von Spurenelementgehalten im Blut und im Ejakulat

Transcription

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