Les exopolysaccharides des bactéries lactiques

Transcription

‫الجمهورية الجزائرية الديمقراطية الشعبية‬
République Algérienne Démocratique et Populaire
Ministère de l’enseignement Supérieure et de la Recherche Scientifique
Faculté des sciences de la nature et de la vie
Département de Biologie
Mémoire de fin d’études
En vue d’obtention du diplôme de magister
Option : Microbiologie fondamentale et appliquée
Intitulé:
Les exopolysaccharides des bactéries lactiques :
Optimisation et cinétique de production.
Présenté par : Mme. ZIDANI Hadjer
Membres du jury: Soutenue le 29 Juin 2015
Président : Mr. Kihel Mebrouk (Professeur à l’université d’Oran Es-Sénia).
Examinateur: Mr .Heddadji Miloud ( Professeur à l’université d’Oran Es-Sénia)
Examinatrice : Mme. Belahcene Kheira (Professeur à l’université d’Oran Es-Sénia)
Promoteur: Mr.Guessas Bettache (Professeur à l’université d’Oran Es-Sénia).
2015/2016
Table de matière :
Revue bibliographique :
Introduction
1
Chapitre I:
1.Vue générale sur les bactéries lactiques :
3
1.1. Caractéristiques principales du groupe :
3
1.2. Classification des bactéries lactiques :
3
1.3. Habitat :
4
1.4 .Le genre Lactobacillus :
7
1.5 .Différentes activités de bactéries lactiques
8
1.5.1. Activité acidifiante :
8
1.5.2. Activité protéolytique :
9
1.5.3. Activité lipolytique :
10
1.5.4. Activité antimicrobienne :
10
1.6. Applications technologiques des Lactobacilles :
15
Chapitre II:
2.Définition des polysaccharides :
16
3.Structure et composition générale des polysaccharides :
17
4.Classification des polysaccharides microbiens :
18
5.Les exopolysaccharides bactériens :
18
6.Les exopolysaccharides des bactéries lactiques :
19
7.Composition chimique des EPS produits par les bactéries lactiques :
21
8.Structure des exopolysaccharides des bactéries lactiques :
22
9.Classification des exopolysaccharides des bactéries lactiques :
23
10 .Organisation des gènes codant pour les EPS :
25
11.Régulation des gènes des EPS et biosynthèse :
26
La biosynthèse des sucres précurseurs :
28
L’assemblage des unités répétitives :
28
12. Fonctions et intérêts des exopolysaccharides bactériens :
29
13.Les facteurs essentiels affectant la biosynthèse des exopolysaccharides :
33
13.1 .Les conditions de production :
33
a. L’instabilité du phénotype :
33
b.Les plasmides :
34
c. Rendement de la production :
35
13.2 .Les conditions de culture :
35
a.
La source de carbone :
35
b.
Source d’azote
37
c.
Certaines vitamines :
37
d.
Stade de croissance bactérienne :
38
e.
La température d’incubation :
38
f.
Le pH:
38
g.
Les enzymes dégradantes :
39
h.
Les procédés de fermentation :
39
14.Méthodes culturelles d’optimisation de la production des EPS :
40
15.Détection des EPS :
41
15.1. Examen visuel :
41
15.2. Les colorations :
43
15.3 .Microscope électronique:
43
15.4 .Détection des EPS par mesure de la viscosité du milieu fermenté :
45
15.5. Méthodes de purification des EPS :
46
16.Quantification des EPS :
46
17.L’analyse des polysaccharides :
47
18.Utilisations des EPS des bactéries lactiques :
49
19.Les effets non souhaitables des EPS :
52
Matériel et méthodes:
1.Origine des échantillons :
53
2.Milieux et solutions biologiques utilisés :
53
3.Isolement et purification des souches de Lactobacillus :
53
4. Pré-identification des souches de Lactobacillus :
54
4.1. Le type fermentaire :
54
4.1. Croissance à différentes températures :
55
4.2. Test de l’arginine dihydrolase (ADH) :
55
4.3. Profils fermentaires des isolats :
55
4.4. La pré-identification sur API 50 CH et API 20 Strep :
55
5. Etude de quelques aptitudes technologiques des Lactobacilles isolés:
56
5.1. Etude de la thermorésistance :
56
5.2. Test de croissance à différentes concentrations en NaCl et à différends pH :
56
5.3. Pouvoir protéolytique :
56
5.4. Pouvoir lipolytique :
56
5.5. Production de composés aromatiques :
57
5.6. Utilisation de citrate en présence de sucre fermentescible :
57
5.7. Etude du pouvoir acidifiant :
57
5.8. Etude des interactions bactériennes :
58
5.9. Pouvoir texturant :
59
6. La cinétique de croissance des souches Lb. plantarum (Lbl26), Lb.plantarum (Lbl57) et Lb.
acidophilus (Lbl61) :
62
7. Optimisation des conditions de la production des EPS chez Lb.plantarum (Lbl26):
63
8. Etude de la cinétique de production des EPS en fonction de la croissance bactérienne chez
Lb.plantarum (Lbl26) :
64
9. Etude de quelques aptitudes probiotiques :
64
9.1. Résistance aux antibiotiques :
64
9.2. Tolérance à l’acidité :
64
9.3. Résistance aux sels biliaires :
65
Résultats et méthodes:
1. Isolement et purification des Lactobacilles :
66
2. Pré-identification des isolats de Lactobacilles :
67
3. Etude de quelques aptitudes technologiques des Lactobacilles isolés :
73
3.8. Etude des interactions bactériennes (antibiose) :
79
3.9. Etude du pouvoir texturant :
84
3.9.1. Recherche de la production des EPS :
84
3.9.2. Quantification des EPS purifiés:
93
4. Etude de la cinétique de croissance des souches Lb. plantarum (Lbl26), Lb.plantarum (Lbl57)et
Lb.acidophilus(Lbl61) :
94
5. Etude de la cinétique de production des EPS en fonction de la croissance bactérienne chez
Lb.plantarum (Lbl26):
94
6. Optimisation des conditions de la production des EPS chez Lb.plantarum (Lbl26) :
95
7. Etude de quelques aptitides probiotiques :
96
7.1. La résistance aux antibiotiques :
96
97
98
Discussion générale
100
Conclusion
104
Références bibliographiques
106
Liste des abréviations :
ATC : acide trichloroacétique
ATF: acide trifluoroacétique
EPS : exopolysaccharides
E. Escherichia
En. Enterococcus
Fru: fructose
Gal: galactose
Glu: glucose
HePS :heteropolysaccharides
HoPS : homopolysaccharides
Lac : Lactose
L. Lactococcus
Lb. Lactobacillus
Lis. listeria
Lnc. Leuconostoc
N : Normalité
PM : poids moléculaire
Rha :rhamnose
S. Staphylococcus
Str.Streptococcus
SEM : Scanning electron microscopy : Microscopie électronique de balayage
Liste des figures :
Figure 1: Arbre phylogénique des bactéries lactiques : a : comparé avec les genres Aerococcus,
Listeria, Staphylococcus et Bacillus et b : avec d’autres gram positif (basée sur ARNr 16s). L'arbre
(non-raciné) est produit suivant la méthode de neighbor-joining.
4
Figure 2: voies métaboliques des bactéries lactiques.
8
Figure 3 : Mode d’action sur les pathogènes des acides organiques produits par les lactobacilles. 11
Figure 4 : schéma de la structure chimique proposée du kefiran, le polysaccharide hydrosoluble
des grains de kéfir.
20
Figure 5 : structure du Kéfiran.
20
Figure 6 : Structure de l’homopolymère : dextrane.
23
Figure 7 : classification des homopolysaccharides produits par Lactobacillus sp.
24
Figure 8 : schéma de comparaison fonctionnelle des gènes d’EPS des bactéries
lactiques. 1,
Streptococcus thermophilus NCFB 2393 ; 2, Lactobacillus lactis NIZO B40 ; 3, Streptococcus thermophilus
Sfi6 ; 4, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Lif5.
25
Figure 9 : clivage du sucrose et synthèse de l’homopolysaccharide dextrane par la dextransucrase
chez certaines bactéries lactiques.
27
Figure 10 : représentation de la synthèse extracellulaire des Glucanes et des Fructanes.
27
Figure 11 : schéma représentatif des voies impliquées dans le catabolisme lactose/glucose
29
Figure 12 : localisation cellulaire des polysaccharides produits par les gram positif
(CPS =
Capsular polysaccharides (capsule), EPS = exopolysaccharides (couche fine).
30
Figure 13 : les rôles biologiques des polysaccharides anti-adhésion.
31
Figure 14 : Colonies mucoïdes de Rhizobium alamii produites sur un milieu riche en glucose après 4
jours à 30°C et à l’obscurité.
42
Figure 15 : Culture en boite de Pétri de souches mucoïdes de bactéries hydrothermales
productrices d’EPS.
42
Figure16 : apparence macroscopique du filament visqueux formé par la masse cellulaire d’une
souche de bactéries lactiques commerciale productrice d’EPS en croissance sur le milieu gélosé de
Man Rogosa et Sharpe.
42
Figure 17 : distribution d’exopolysaccharides (en vert) dans la structure du lait fermenté.
44
Figure 18 : le lait fermenté par l’espèce Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus RR après agitation.45
Figure 19 : micrographes de microstructure et de morphologie de surface des KF5 EPS observées
par SEM.
45
Figure 20 : modèle de gomme arabique avant et après traitement avec la pronase.
46
Figure 21 : structure d’EPS de Lb.johnsonii 151.
49
Figure 22 : les applications potentielles du polysaccharide anti-adhésion : A.adjuvants,
51
Figure 23 : aspect macroscopique des colonies de bactéries lactiques : 1.dilution 10-4 ; 2.dilution 10-5
et 3.dilution 10-6 du MRS au CaCO3.
66
Figure 24 : pureté des souches sur milieu solide.
66
Figure 25 : aspects microscopiques après coloration de Gram des souches Lbl60 et Lbl23 (Gr X
1250).
67
Figure 26 : a et b, le type fermentaire des souches lactiques.
67
Figure 27 : test de l’ADH sur milieu M16 BCP des souches Lbl21 et dégradation de l’esculine.
68
Figure 28 : sucres témoins (à gauche) du profil fermentaire de la souche Lbl26 (à droite).
70
Figure 29 : test de fermentation des hydrates de carbone sur Api 50CH des souches Lbl26 et Lbl 60.73
Figure 30 : profil fermentaire de la souche Lbl63 sur API20 STREP.
73
Figures 31 : a. b. c. d. e. f : études des aptitudes technologiques des souches.
76
Figure 32 : A. cinétique d’acidification (en degré Dornic °D) et B. évolution du pH en fonction du
temps, des souches de Lb. plantarum (Lbl26, Lbl22, Lbl23, Lbl25, et Lbl26).
78
temps, des souches de Lb. cellobiosus (Lbl27 et Lbl28).
78
Figure 34: A. cinétique d’acidification (en degré Dornic °D) et B. évolution du pH en fonction du
temps, des souches de Lb. casei (Lbl56 et Lbl60).
78
temps, des souches de Lb. acidophilus (Lbl61 et Lbl62).
79
temps, des souches de Lb. curvatus (Lbl63 et Lbl64).
79
temps, des souches de Lb. helveticus (Lbl59).
79
Figure 38 : activité inhibitrice des souches isolées sur les souches indicatrices pathogènes :
80
1 –Listeria monocytogenes 33090, 2 –Staphylococcus aureus 25923, 3- Enterococcus faecalis 2035, 4Escherichia coli 25922, successivement.
80
Figure 39 : activité inhibitrice des surnageants natifs des souches isolées sur les souches
indicatrices pathogènes : 1-Listeria monocytogenes 33090, 2 –Staphylococcus aureus 25923, 3Enterococcus faecalis 2035, 4- Escherichia coli 25922, successivement.
82
Figure 40: activité inhibitrice des surnageants neutralisés des souches isolées sur les souches
83
Figure 41 : interaction entre bactéries lactiques.
83
Figures 42 : a, b, c, d, e : recherche qualitative de souches productrices d’EPS.
87
Figure 43 f et g : recherche qualitative de souches productrices d’EPS sur milieu Chalmers.
88
Figure 44 : résultat du test estimatif de production des EPS.
89
Figure 45 : aspect du gel formé sur lait écrémé par les souches Lbl23, Lbl26 et Lbl 27.
91
Figure 46 : précipitation des EPS à l’éthanol.
93
Figure 47 : résultats du séchage des differents EPS après précipitation à l’éthanol.
93
Figure 48 A et B: cinétique de croissance et d’acidification sur MRS des souches : Lb. plantarum
(Lbl26), Lb. plantarum (Lbl57) et Lb. acidophilus (Lbl61).
94
Figure 49 : cinétique de la production des EPS en fonction de la croissance de la souche Lb.
plantarum (Lbl26) sur MRSs.
95
Figure 50 : étude de l’optimisation des conditions de la production des EPS chez Lb. plantarum
(Lbl26).
96
Figure 51: antibiogramme de la souche Lb. casei (Lbl60).
97
Figure 52 : résistance à l’acidité après 2h par la souche Lb. acidophilus (Lbl61).
98
Figure 53: viabilité de la souche : Lb. plantarum (Lbl23) sur MRS aux sels biliaires après 2h.
99
Figure 54 : viabilité des souches aux conditions extrêmes.
99
Liste des tableaux :
Tableau 1 : exemples d'utilisation des bactéries lactiques en industrie alimentaire
6
Tableau 2 : composition des exopolysaccharides de différentes bactéries lactiques
21
Tableau 3 : les méthodes analytiques majeures des carbohydrates
48
Tableau 4 : Profil physiologique et biochimique des souches isolées.
68
Tableau 5 : le profil fermentaire des differentes souches de Lactobacillus.
70
Tableau 6 : résultat des profils fermentaires sur API 50 CH
72
Tableau 7: résultats sur API 20 STREP.
73
Tableau 8 : activités protéolytique et lipolytique des Lactobacilles.
76
Tableau 9 : activité antagoniste des surnageants natifs des souches de Lactobacillus.
81
Tableau 10 : activité antagoniste des surnageants neutralisés :
82
Tableau 11 : interactions entre bactéries lactiques.
84
Tableau 12 : résultats de la recherche qualitative de production des EPS.
86
Tableau 13 : formation d’EPS sur milieu Chalmers agar modifié.
89
Tableau 14 : les résultats du test de Lingani et al., (2010).
90
Tableau 16 : caractères visqueux des EPS dans le lait fermenté par les Lactobacilles.
92
Tableau 15 : rendement en production des EPS en mg de masse sèche/ml.
93
Tableau17 : taux de production des EPS quantifiés selon Dubois (1956) (en g/l).
94
Tableau 18 : cinétique de la production des EPS en fonction de la croissance.
95
Tableau 19: résultats de la résistance et la sensibilité aux antibiotiques.
97
Tableau 20: survie des souches à pH 2.
98
Tableau 21: viabilité des souches sur milieu à 5% de sels biliaires.
99
‫امللخّص‬
‫نلبين‬
‫يف جمال ضناػة مش خلات احلليب ٌسؼى املسدمثرون جاهدون الس خغالل خطائص امبكذرياي انلبنية اخلامطة ‪ .‬ثفرز امبكذرياي ا ة‬
‫ظبيؼ ّيا مذؼدد سكرايت خاريج ذو أمهية حكنوموجية ابمغة ملدرثه ػىل اسدبلاء املاء وضامن مزوجة املنخجات اخمل ّمرة‪.‬ركّزت دراسدنا‬
‫ػىل غزل ػدّة سالالت بكذرياي مبنيّة من أهظمة بيئية خمخلفة‪ :‬احلليب (منب خمرث و لكيةل)‪ ،‬هوامش امزًخون اخمل ّمرة ومخرية اخلزب‪،‬‬
‫و امؼمل ػىل الاهخلاء و امخؼرًف بأكرثها كدرة ػىل اهخاج و افراز مذؼدد امسكرايت اخلاريج‪ّ .‬مت امخحطل ػىل أربؼني سالةل من‬
‫امبكذرياي انلبنية ثنمتي أساسا اىل زالث أهواع‪( Enterococcus :‬سالمخان)‪ ( Lactobacillus ،‬مثاهية و غرشون سالةل(‬
‫امسكرايت اخلاريج‬
‫و ‪( Leuconostoc‬غرش سالالت)‪ 67 .‬ابملائة من امسالالت املؼزوةل أظهرت كدرة جيدة ػىل افراز مذؼدد‬
‫ّ‬
‫مويج‬
‫وخاضة هوع ‪،Lactobacillus :‬حير اخذريت جسع غرشة سالةل مت اس خغالمها ّندلراسة فذؼرًفها و ثليمي خطائطها امخّكنو ة‬
‫حتومها‪ ،‬اضافة اىل بؼظ اخلطائص امربوبيوثيكيّة ‪ّ .‬مت ثؼرًف ػدّة اكئنات ابمخلرًب اسدنادا اىل‬
‫ابمخّحدًد املدرة امخّكوًنية نلمواد ّامّت ّ‬
‫حطلت‪:‬مثان سالالت‪، Lb. plantarum :‬سالمخا ‪:‬‬
‫خطائطها امظاهرًة و ابمخايل ّ‬
‫‪, Lb. curvatus‬سالمخا‪Lb. acidophilus :‬‬
‫سالمت ‪ ،Lb. cellobiosus‬أربع سالالت‪ Lb. casei :‬وسالةل‪ .Lb. helveticus :‬أظهرت امسالالت ػدة ّمتّيات خطائطية‬
‫ا‪:‬‬
‫حكنوموجية و بروبيوثيكية زايدة ػىل اهخاهجا ملخؼدد امسكرايت اخلاريج‪ .‬س يق امبحر غن خاضية االفراز ػىل ظرًلذني‪ :‬ظرًلة‬
‫هوغ ّية ػىل ّ‬
‫لك من ‪ MRS، MRS ،MSE‬مؼدّل ّامّتكيبة ‪،‬يف احلليب وػىل وسط زراغي حيخوي ػىل أمحر ّامروثينيوم‪ .‬أ ّما احفص‬
‫ظاهراي‪ ،‬اىل أن أظهر امفحص‬
‫امسالالت ظهرت مزجة ػىل الوساط املمّية‬
‫ّ‬
‫المكّي فس يق يف وسط مائع مؼدل ّامّتكيبة‪ .‬أغلبيّة ّ‬
‫بخفوق اماكئنات‪،Lb. plantarum (Lbl (25 26 ,27) :‬‬
‫اممكّي ثفاوات بني ّ‬
‫امسالالت من حير املدرة االهخاجيّة‪ّ ،‬‬
‫)‪ .Lb. curvatus (Lbl63),Lb. acidophilus (Lbl61‬مع هخاجئ كياس ّية ثؼدت مكية‪1 :‬غ‪/‬انلّّت‪.‬حرث ّب غن حتسني رشوط اهخاج‬
‫مذؼدّد ّسكرايت خاريج أفضل مردود( ‪12,14‬غ‪/‬مّت) حتت امخوافق‪( :‬درجة حرارة‪ - °23‬حركّيامسكروز‪10‬غ‪/‬مّت‪ -‬ػامل‬
‫امحلوضة‪ )5.4 :‬دلى امسالةل‪.Lb.plantarum (Lbl26):‬‬
‫املكامت املفذاحًّة‪ :‬بكذرياي مبنية ‪ ،‬مذؼدد سكرايت خاريج ‪ ،‬حركية االهخاج‬
‫بروبيوثييك‪.‬‬
‫‪،‬حتسني االهخاج‪Lactobacillus plantarum،‬‬
Résumé
Les investisseurs de l’industrie laitière, désirent bénéficier des effets irremplaçables des
bactéries lactiques à caractères technologiques privilégiés. Les exopolysaccharides (EPS)
produits naturellement par certaines bactéries lactiques suscitent un intérêt technologique
du à leur capacité de rétention d’eau et celles de moduler la viscosité des produits
fermentés.
Notre étude a pour but l’isolement
de souches lactiques de différents
écosystèmes : lait (Raib et Klila), margines d’olive fermentées et du levain de panification ;
ainsi, la sélection et l’identification de celles productrices d’EPS. Quarante souches de
bactéries lactiques obtenues; appartenaient essentiellement à trois genres : Enterococcus
(dix souches), Leuconostoc (deux souches) et en grande partie à Lactobacillus (vingt huit
souches). Environ 67% des souches isolées ont exhibé une production d’EPS ; spécialement,
les souches de Lactobacilles. Cependant, dix neuves souches ont été retenues à identifier et
à évaluer leurs aptitudes technologiques, notamment, le pouvoir texturant. En plus, de
quelques aptitudes probiotiques. Différentes espèces ont été pré-identifiées selon leurs
caractères phénotypiques : 8 souches de Lb. plantarum, 4 souches de: Lb. casei, 2 souches
de: Lb .acidophilus et 2 souches de Lb. cellobiosus. Elles ont montré plusieurs performances
d’après l’étude des caractères technologiques et probiotiques ; mise à part leur production
d’EPS. La recherche de la production d’EPS a reposé sur deux types de tests :
1. Tests
qualitatifs (sur gélose MRS modifiée, milieu MSE, milieu au rouge de Rhuténium, milieu
Chalmers modifié), lait écrémé, et 2. Tests quantitatifs (bouillon MRS modifié). La quasi
totalité des souches ont montré un aspect très visqueux sur les milieux utilisés pour la
recherche de la production des EPS. Une sélection préliminaire était effectuée grâce au test
de Lingani. Néanmoins, la quantification a révélé une certaine inégalité en production
entre ces souches. Les souches les plus performantes sont Lb. plantarum (Lbl25, Lbl26 et
Lbl57), Lb. acidophilus (Lbl61) et Lb. curvatus (Lbl63) avec des taux de production trop
élevés, qui dépassent les 1 g/l. L’optimisation des conditions de la production des EPS
chez la souche Lb. plantarum (Lbl26), a donné le meilleur rendement avec la combinaison
(T°=23°C _ pH 5.4 _ MRS modifié à 10% de sucrose) : 12.14 g/l.
Mots clés : bactéries lactiques, exopolysaccharides, Lactobacillus plantarum, optimisation
de la production, cinétique de production, probiotiques.
12
Abstract
In the milk industry, the investors wish to profit from the non replaceable effects of lactic
acid bacteria thanks to their privileged technological characters. The naturally produced
exopolysaccharides (EPS) by certain lactic acid bacteria arouse a technological interest due
to their water holding capacity and to modulate the viscosity of the fermented products.
Our study was based on the isolation of lactic acid bacteria of various ecosystems: milk
(Raib and Klila), fermented margins of olive and sourdough; and so the selection and the
identification of those producing EPS. Forty strains of lactic bacteria obtained belonged
primarily to three genera: Enterococcus (ten strains), Leuconostoc (two strains) and mainly
Lactobacillus (twenty eight strains). About 67% of the strains produced EPS; especially
Lactobacillus strains. Whereas, ninety strains have been retained to be identified and to
evaluate their technological properties in particular texturing capacity. Furthermore to
some probiotic properties. Different species have been pre-identified based on their
phenotypic characteristics: 8 strains of:Lactobacillus plantarum, four strains of: Lb. casei,
two of: Lb .acidophilus, two of: Lb.curvatus, two of :Lb. cellobiosus and a species of Lb.
helvticus. They have shown many technological performances beside of probiotic ones;
instead of EPS production. The screening of EPS production rested on: qualitative (on
modified MRS agar, MSE medium, medium with the red of Rhutenium, modified Chalmers
agar), skimmed milk and on quantitative tests (modified MRS broth). Most strains
exhibited a ropy character on screening mediums for EPS production. A preliminary
selection was carried out thanks to the test of Lingani and others. Nevertheless, the
quantification revealed an inequality in production between strains. The most preferment
strains were: Lb. plantarum (Lbl25, Lbl26 and Lbl57), Lb. acidophilus (Lbl61) and Lb.
curvatus (Lbl63). With too high production rates, which exceed the: 1g/l. The optimization
of EPS production conditions at: Lb .plantarum (Lbl26), gave the best output with
combination (T°=23°C _ pH 5.4 _ MRS modified with 10% of sucrose): 12.14 g/l.
Key words: lactic acid bacteria, Lactobacillus plantarum, optimization of production
conditions, kinetic of production, probiotic.
13
Introduction
Traditionnellement, l'industrie alimentaire (comme la fermentation des produits laitiers)
cherche à améliorer la structure et la texture des aliments, pour optimiser la qualité du
produit à fabriquer; comme par exemple les yaourts. En faisant varier un ou plusieurs
facteurs à savoir la composition du mélange de départ, traitement par chauffage du
mélange avant la fermentation, modification de la composition des ferments et des
conditions d'incubation, manipulation du produit fini et ajout de stabilisants.
L'ajout de substances qui stabilisent les produits fermentés devient de plus en plus
réglementé et même interdit dans certains pays. Les consommateurs recherchent
davantage des produits naturels ou «biologiques» exempts d’additifs. De plus, les
substances stabilisantes peuvent affecter le goût et l'arôme du produit.
Des micro-organismes sont employés pour la production des métabolites spécifiques tels
que des acides, des alcools, des enzymes, des antibiotiques et des carbohydrates. Depuis
que l’on a interdit l’addition de stabilisateurs d’origine animale ou végétale dans le yaourt
naturel (Hutkins, 2006), nous avons pensé à exploiter les capacités des bactéries
considérées comme
food-grade à produire un matériel polysaccharidique à sécrétion
naturelle en raison de leurs excellentes propriétés stabilisatrices et rhéologiques. La
stabilité de la production et la régularité de la structure des polymères produits par des
bactéries leurs en font des bioingrédients de choix dans différents domaines alimentaires.
Les bactéries lactiques sont à la base de la plupart de l’industrie des produits laitiers
(différents types de fromages, laits fermentés, yaourts), les légumes et la fermentation de
levain. Elles appartiennent principalement aux Lactobacilles et aux Pediocoques. Elles font
partie des cultures starter employées dans la fermentation de viande pour produire des
acides et des composés aromatiques souhaitables ; grâce à leurs nombreuses propriétés
métaboliques permettant de rendre une simple denrée alimentaire un produit fini à
caractères organoleptiques désirés. Ce qui, leur confère une omniprésence en leur faisant
intervenir pour ces applications. Notamment, les souches de S. thermophilus et Lb.
delbrueckii subsp. bulgaricus aptes à produire et secréter naturellement les EPS lors de la
fermentation du lait dans la production des yaourts. Mise à part, leurs effets bénéfiques
« probiotiques » améliorant l’état de santé personnelle après leur ingestion.
1
Introduction
Notre étude s’inscrit dans la thématique de recherche de notre laboratoire de microbiologie
fondamentale et appliquée, dont l’objectif est : la sélection, l’élaboration de souches de
bactéries lactiques issues de margines, lait caillé, Klila et levain de panification d’origines
locales, qui sont aptes à produire des exopolysaccharides et de comparer les différentes
conditions de leur production.
2
Revue bibliographique
I. Les bactéries lactiques
1.Vue générale sur les bactéries lactiques :
Ce groupe de bactéries assez hétérogènes sur les plans physiologique et morphologique,
réunie plusieurs genres de bactéries dont le nom lui-même est évocateur de leur
caractéristique métabolique principale qui est la production d’importantes quantités
d’acide lactique à partir de l’hydrolyse du lactose et de la fermentation du glucose et/ou
du galactose ; autrement dit, c’est la conversion du pyruvate en acide lactique pour
régénérer le NAD+ utilisé au cours de la glycolyse. Ainsi, l’appellation « bactérie lactique »
est, cependant, souvent étendue à d'autres bactéries qui leur sont apparentées:
Bifidobacterium,
Micrococcus,
différence ; leur
tolérance
Brevibacterium
à
l’oxygène :
et
Propionibacterium
anaérobies
strictes
avec
la
seule
(Bifidobacterium,
Propionibacterium) ou aérobies (Micrococcus, Brevibacterium).
Ce groupe comprend des bactéries en forme : de coques appartenant aux genres :
Streptococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Vagococcus, Enterococcus, Pediococcus, Aerococcus,
Tetragenococcus, Leuconostoc, Atopobium, Weissella et Oenococcus et en forme de bacilles
appartenant aux genres : Lactobacillus, Carnobacterium et Bifidobacterium (Romain. H, 2011).
1.1. Caractéristiques principales du groupe :
Il assemble des cellules procaryotes à Gram-positif, ayant la forme : de coque, de bacille ou
de coccobacille, immobiles, asporulées, anaérobies,
ne possèdent pas de catalase ni
cytochrome oxydase mais elles peuvent survivre en présence d’oxygène, hétérotrophes et
chimio-organotrophes, requièrent des molécules organiques complexes comme source
énergétique (acides aminés, peptides, sels, acides gras et glucides). Elles ne possèdent pas
de nitrate réductase. Ces microorganismes fermentent principalement les monosaccharides
« glucose » des disaccharides « lactose » et rarement un polysaccharide « amidon » (Rogers
et al., 2006 ; Prescott et al., 2010).
1.2. Classification des bactéries lactiques :
La classification de ce groupe D’après Ludwig et al., (2008), le phylum Firmicutes
comprend trois classes : Bacilles, Clostridium et Erysipelotrichi. Les bactéries lactiques
appartenant à la classe Bacilli, sont divisées en trois familles :
3

Famille des Lactobacillaceae comportant les Lactobacillus, Paralactobacillus et
Pediococcus.

Famille des Leuconostocaceae contenant les Leuconostoc, Oenococcus et Weissella.

Famille des Streptococcaceae comprenant les Streptococcus, Lactococcus et Lactovum.
Les révisions taxonomiques récentes présentes dans le manuel de Bergey Trust (2008) des
bactéries lactiques, montrent que ces dernières peuvent comprendre environ une
quarantaine de genres, les plus principaux sont ceux associées aux aliments dont on cite:
Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus,
Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus et Weissella (Figure1 : a et b)
Le genre Bifidobacterium y appartient au fait de son similarité physiologique, biochimique,
sa présence dans le même habitat écologique (tube gastro-intestinal), son utilisation dans
les aliments et son effet probiotique sur l‘organisme (Vandamme et al., 1996 ; Gevers, 2001 ;
Patrignani et al., 2006).
Fig.a
Fig.b
Figure 1: Arbre phylogénique des bactéries lactiques : a : comparé avec les genres Aerococcus,
Listeria, Staphylococcus et Bacillus (Axelsson L.2004) et b : avec d’autres gram positif (basée sur
ARNr 16s). L'arbre (non-raciné) est produit suivant la méthode de neighbor-joining (Hutkins.RW,
2006)
1.3. Habitat :
La possibilité de présence des bactéries lactiques dans divers habitats dépond directement
de la température et du substrat nutritionnel.
4
Elles sont associées aux plantes (chou, maïs, orge, mâche, chou frisé), aux ensilages, aux
produits carnés (saucissons, jambons..etc) (James et al., 2005 ; Talon et al., 2007) ; aux
poissons (Kanmani et al., 2011), le Kéfir (Farnworth, 2005) et aux produits laitiers : les
différents types de fromages (tels : L. lactis, Lc. mesenteroides et Lb. Plantarum) (Cocolin et
Ercolini, 2008) et les yaourts (Zourari et al.,1992) ,
L’utilisation des bactéries lactiques pour une application industrielle donnée (tableau 1)
est déterminée par leurs propriétés fonctionnelles et technologiques qui recouvrent ces
propriétés :
— Activité acidifiante.
— Production de métabolites d’intérêt.
— Propriétés enzymatiques : les activités protéolytiques et peptidasiques sont
importantes car elles déterminent la capacité des bactéries lactiques à utiliser la
fraction azotée du milieu.
— L’activité lipolytique présente, de plus, un intérêt pour les applications fromagères.
— Propriétés probiotiques.
— Critères de performance: résistance aux bactériophages, aux traitements
mécaniques, à la congélation ou à la lyophilisation et au stockage. Ainsi que la
tolérance aux inhibiteurs de la croissance (acidité, éthanol, chlorure de sodium).
5
Tableau 1 : exemples d'utilisation des bactéries lactiques en industrie alimentaire (d’après Romain,
2011).
Genre
Substrat
Exemples de produits
Bifidobacterium
Lait
Laits fermentés
Lactobacillus
Lait, Viande,
Yaourts, lait s fermentés, kéfirs, fromages Saucissons secs,
Végétaux,
jambons secs Choucroute, olives, « yaourts » au lait de soja
Céréales
Pain au levain, bières
Lactococcus
Lait
Fromages, kéfirs
Leuconostoc
Végétaux, Lait
Choucroute, olives, vin Fromages, kéfirs
Pediococcus
Végétaux,
Choucroute Saucisses semi-séchées
Viande
Oenococcus
Végétaux
Vin
Streptococcus
Lait
Yaourts, lait s fermentés, fromages
6
1.4 .Le genre Lactobacillus :
Ce genre représente le groupe des Lactobacillaceae. Il a été créé en 1901 par le
microbiologiste hollandais Beijerinck, pour regrouper des bactéries à gram positif isolées
de produits laitiers et à métabolisme fermentaire. Des bâtonnets, non sporulés, parfois, de
0.5 _1.2 µM et 1.0_10 µM de dimensions, généralement immobiles. Leur morphologie
microscopique varie d’une espèce à l’autre de coccobacilles aux bacilles fins et allongés,
incurvés ou même ovoïdes, groupés en paires avec une formation de chaînes de cellules
qui est courante. La morphologie des colonies varie en fonction du milieu de culture utilisé.
Sur un milieu sélectif les colonies sont très petites, souvent sous forme « Smooth » ou
« Rough ».
Les Lactobacillus sont catalase (-) (certains ont une pseudo-catalase), micro-aérophiles ou
anaérobies. La plupart se multiplie dans une gamme de températures comprise entre 15 °C
et 42 °C. Tandis que, certaines souches de lactobacilles dites thermophiles restent viables à
55 °C. Ils ont un métabolisme fermentaire produisant de l’acide lactique (Prescott et al.,
2010). Le taxon est un groupe très hétérogène comprenant des espèces de large élasticité
phénotypique ; là où des variabilités dans les propriétés physiologiques peuvent être
adaptées dans une espèce. On cite plus de 60 espèces et sous espèces (Nigatu et al.,
2000).On les rencontre dans divers habitats : environnement (sur les surfaces de plantes),
Homme (au niveau de la cavité buccale, du tractus digestif et du tractus uro-génital,
notamment dans le vagin), dans les produits fermentés (viande et ses dérivés, laits et
produits latiers).
Certaines espèces sont homolactiques, utilisant la voie de la glycolyse ; les pentoses et le
gluconate ne sont pas fermentés (les espèces de: Lb. delbrueckii), d’autres hétérolactiques
produisant des acides volatils, de l’éthanol et du CO2 en plus de l’acide lactique. Parmi les
hétérofermentaires, certains sont facultatifs (par exemple les Lb. casei)
ils utilisent la
glycolyse ou le cycle des pentoses. Les hétérofermentaires stricts (Lb. brevis) n’utilisent que
le cycle des pentoses (Rogers et al., 2006).
7
1.5 .Différentes activités de bactéries lactiques :
Différentes sont les activités des bactéries lactiques (figure 2) qui leur confèrent une
importance vu leur intérêt technologique très demandé. Or , les Lactobacillus sont bien
connus pour leur aptitude à produire différents composés : composés antimicrobiens :
H2O2,
acides organiques, les antibiotiques (reutericycline) (Messens et De, 2002), les
bactériocines (Franz et al., 1998), les substances antifongiques (Belal et al., 2011, Laref et al.,
2013), les protéinases, aminopeptidases (Magboul et Mc Sweeney, 1999 ; Udomsil et al.,
2010 ; Roudj, 2010) et les exopolysaccharides (Cerning et al., 1994 ; Gorska et al., 2013 ;
Fguiri et al., 2015).
Figure 2: voies métaboliques des bactéries lactiques (D’après Danone ; 2009)
1.5.1. Activité acidifiante :
En industrie laitière, on cherche le plus souvent des souches rapidement acidifiantes ; alors,
trois critères sont à prendre en compte en l’occurrence : la quantité de lactate produite, la
nature de l’acide produit (D, L ou DL) et la vitesse d’acidification qui est un critère
important en technologie (le pH peut atteindre 4 à 4.5) (Luquet ,1994, ).
8
Le lactose est le sucre fermentescible majeur rencontré dans le lait à des taux de 40 à50 g/l.
la partie glucose est métabolisée rapidement sue la partie galactose du lactose par les
Lactocoques. Vers la fin de phase de croissance, moins de 0.5% du lactose est ainsi utilisée
et la fermentation produit da l’acide lactique L(+) (Annika, 2004).
Sur un autre substrat, comme exemple: dans la fabrication des produits carnés fermentés,
la chute du pH due à la production d’acide lactique résulte de l’utilisation des hydrates de
carbone par les bactéries lactiques provenant des matières premières ou de
l’environnement (Papamanoli et al., 2003). Cette acidification provoque la coagulation des
protéines musculaires et induit ainsi à la fermeté, à la cohésion et au découpage facilité de
la viande. En outre, l’accumulation des acides organiques produits inhibe la croissance des
bactéries pathogènes et celle de la flore d’altération de la viande
1.5.2. Activité protéolytique :
Toutes les protéines du lait y compris le lactosérum sont hydrolysables par les souches
starter. On prévoie la présence de protéines plus accessibles dans les micelles de caséine.
Lb. helveticus est montrée pour pouvoir attaquer la caséine αs et partiellement la caséine β,
Lb. bulgaricus dégrade la majorité des caséines notamment la caséine β. Les Lactocoques
hydrolysent les caséines K et β avant la caséine αs. Le pouvoir protéolytique des Str.
thermophilus est plus faible que celui des Lactocoques et n’affecte pas l’hydrolyse de la
caséine dans les fromages (Annika, 2004).
Sur des substrats autres que le lait on cite l’exemple de la viande : Les protéines du muscle
sont divisées en 3 groupes: protéines sarcoplasmiques (enzymes de glycolyse, pigments,
protéines des organelles), protéines myofibrillaires (actine, myosine) et protéines du tissu
conjonctif (collagène, élastine). Leur catabolisme consiste en ; la protéolyse (leur
dégradation en peptides puis dégradation des peptides en acides aminés) et le catabolisme
des acides aminés (Ammor, 2004). En général, les bactéries lactiques ont une faible
propriété protéolytique sur les protéines myofibrillaires (Molly et al., 1997). Toutefois,
certaines souches de Lb. casei, Lb. plantarum, Lb. curvatus et Lb. sakei participent à
l’hydrolyse des protéines sarcoplasmiques et par conséquent, contribuent à la
décomposition des peptides en acides aminés. Des peptidases issues de ces bactéries
9
lactiques hydrolysent des oligopeptides et de ce fait, produisent les substances
responsables de la flaveur et de la texture des produits fermentés (Ho Thi Nguyet, 2008).
1.5.3. Activité lipolytique :
Le genre Lactobacillus est faiblement lipolytique (Papamanoli et al., 2003). C’est à travers des
publications scientifiques, que les connaissances des activités estérasiques et lipolytiques
des bactéries lactiques restent encore fragmentaires. L’activité estéarique des lactocoques
est plus importante que celle des lactobacilles. Cependant on trouve que dans le groupe
des lactobacilles thermophiles, les activités lipolytiques de Lb. delbrueckii ssp. lactis et Lb.
acidophilus sont supérieures à celles de Lb. Delbrueckii ssp. bulgaricus et Lb. helveticus. et dans
le groupe des lactobacilles hétérofermentaires facultatifs : Lb. casei et Lb. plantarum,
possèdent un système estérasique plus actif que les hétérofermentaires strictes : Lb. brevis et
Lb. fermentum (Talon et al., 2006).
1.5.4. Activité antimicrobienne :
Ce sont essentiellement les bactéries lactiques (Lactobacillus , Leuconostoc ,Pediococcus et
Lactococcus) et des Bifidobactéries qui sont connus pour posséder de telles activités grâce à
leur capacité à produire lors de leur croissance des composés actifs ; à savoir, les acides
organiques qui acidifient le milieu (lactate ,acétate ..), des dérivés du métabolisme de
l’oxygène (H2O2), et des substances naturelles de nature protéique; douées d’une activité
antagoniste à l’encontre d’un grand nombre de germes d’altération, leur permettant de se
développer préférentiellement dans divers écosystèmes (Vandervoorde et al., 1991; Annika
et Marc, 2004 ; Herreros et al., 2005; Belal et al ., 2011).
Plusieurs études ont été réalisées dans ce contexte. On cite une étude faite mesurant
l’activité antagoniste des bactéries lactiques (Lb. bulgaricus, Bifidobacterium
bifidum et
Streptococcus thermophilus) vis à vis aux trois souches Helicobacter pylori responsables des
maladies gastroduodénales, isolées à partir des biopsies gastriques des malades. Qui nous
ont démontré le pouvoir inhibiteur de ces bactéries lactiques contre les bactéries
pathogènes ; un but qui compte un pat de développement dans le domaine thérapeutique
(Tabak, 2007).
10
a. Les acides organiques :
Parmi lesquels l’acide lactique et l’acide acétique et tous ceux causant la diminution du pH
qui induit à une acidification du cytoplasme cellulaire (figure ci-dessous) ; en conséquence
les flores acido-sensibles (exemple: Pseudomonas) sont inhibées. Cependant, un grand
nombre de Lactobacillus produisent ces acides organiques (Annika.M.M et Marc.B, 2004).
On a observé que le mécanisme inclus dans l’invasion de cellules Caco-2 par Salmonella
enterica serovar Typhimurium sans modification de la viabilité des pathogènes, s’est arrêté
après neutralisation des cultures de Lb. casei rhamnosus GG a pH7. La croissance de
E.coliO157 :H7 était réduite sous l’effet de l’acide lactique et la diminution de pH causées
par Lb. lactis, Lb. casei Shirota ou Lb. acidophilus YIT0070. Comme on a découvert l’inhibition
de H. pylori in-vitro, effet apparemment du a la production de l’acide lactique et l’acide
acétique et l’acide hydrochlorique par les souches L. acidophilus, L. casei subsp. rhamnosus, L.
bulgaricus et
B. bifidus (Alain, 2004) et l’inhibition de l’espèce S. aureus ATCC 25923,
Escherichia coli ATCC 25921 et Bacillus sp , par des souches de : Lb. plantarum (Mami. A et al.,
2011) .
Figure 3 : Mode d’action sur les pathogènes des acides organiques produits par les lactobacilles.
b. Le diacétyl et d’autres produits
Le diacétyl (C4H6O2) un des composants aromatiques essentiels du beurre synthétisé par
différents genres de bactéries lactiques comme Lactococcus, Leuconostoc, Lactobacillus et
Pediococcus ; est produit suite à la dégradation du citrate, un composé inhibiteur à pH 5
plus actif contre les bactéries à Gram négatif, les levures et les champignons (200 mg/mL)
11
que contre les bactéries à Gram positif non lactiques (300 mg/mL) pour les non lactiques
(Jay, 1982; Smaoui, 2010) .Cependant, A pH 7 ce produit est très inefficace. Pseudomonas
présente la plus grande sensibilité à ce produit. Outre, il est à noter que les quantités
produites sont en général trop faibles pour être inhibitrices (Annika.M.M et Marc.B, 2004).
c. Le dioxyde de carbone
Le dioxyde de carbone est produit par des bactéries lactiques hétéro-fermentaires. Le
véritable mécanisme de son action antibactérienne reste indéterminé. Cependant, il peut
jouer un rôle dans la création d’un environnement anaérobique qui inhibe la
décarboxylation enzymatique, alors que son accumulation dans la bicouche lipidique de la
membrane peut causer un disfonctionnement de la perméabilité de celle-ci (Smaoui,
2010).il
peut effectivement inhiber la croissance de nombreux germes d’altération et
essentiellement les germes psychrotrophes à Gram négatif.
d. Le peroxyde d’hydrogène
Il est depuis longtemps, reconnu comme un agent majeur de l'activité antimicrobienne des
bactéries lactiques en particulier celle des Lactobacilles qui
peuvent le générer par
plusieurs mécanismes. Vu qu’elles soient catalase négatif et certaines souches peuvent
accumuler du peroxyde d’hydrogène lorsqu’elles sont cultivées en aérobiose ou en
microaérobiose ce qui induit l’oxydation des lipides membranaires et la destruction des
structures des protéines des cellules des différents microorganismes parmi en on cite
Staphylococcus aureus et Pseudomonas. spp. Sa production peut avoir lieu selon plusieurs
modes mettant enjeu des NADH peroxydases ou des flavoproteines oxydases (Ammor,
2004, Annika.M.M et Marc.B, 2004; Smaoui, 2010 ; Boumehira.Z, 2010).
e. La production d’antibiotiques
Il existe aussi les antibactériens non peptidiques, parmi lesquels la reuterine produite par
Lactobacillus reuteri : un antibiotique à large spectre, actif vis-à-vis des bactéries Grampositives et Gram-négatives, des levures, des moisissures et des protozoaires. Il s'agit d'un
12
dérivé du glycérol, le 3-hydroxypropionaldéhyde produit lors de la fermentation anaérobie
de ce dernier (Piard and Desmazeaud, 1991).
f. La production des bactériocines
Les bactériocines : un groupe hétérogène de molécules de nature protéique produites par
synthèse ribosomique dotées d'un site actif et qui ont un pouvoir antimicrobien ;elles
présentent une activité bactéricide ou bactériostatique contre les souches bactériennes
phylogénétiquement proches à la souche productrice (Piard et Desmazeaud, 1991; Muriane
et Klaenhammer, 1991; Tomomi et al., 2009): Lactococcus, Streptococcus, Staphylococcus,
Listeria et Mycobacterium (Alain,2004) ; avec un large spectre d’activité contre les germes
pathogènes gram positif et gram négatif( Paulraj et al ., 2011).
Il est établi que le point d’entrée de plusieurs bactériocines est les pores formés dans la
membrane cytoplasmique des bactéries sensibles relatif à l’efflux des ions et des composes
accumulés à cause de la dissipation du potentiel membranaire résultat de la déplétion en
ATP (selon la figure ci-dessous) (Alain, 2004). D’autres bactériocines ne forment pas de
pores mais interfèrent avec l’activité de certains enzymes des bactéries suspects.
Contrairement à la théorie qui dise que les bactériocines des Lactobacillus sont inactives sur
les organismes gram négatif, on a rapporté l’efficacité contre H.pylori des lacticins A164 et
BH5 (Alain, 2004)
Plusieurs genres de bactéries lactiques y compris Lactobacillus (klaenhammer, 1998)
Enterococcus, Streptococcus, Pediococcus, Lactococcus, Leuconostoc et
Carnobacterium
produisent ces molécules. On a même caractérisé les bactériocines de plusieurs espèces
comme : Lb. fermentum, Lb. helveticus, Lb. acidophilus, et Lb. plantarum.
Klaenhammer a défini trois classes majoritaires de bactériocines. Récemment on en a ajouté
une quatrième classe (Alain ,2004 ; Paulraj et al., 2011, Stoyanova et al., 2012).
1.5.5. Activité antifongique :
On a pu isoler de différents environnements: levains, MaÏs (Doguiet et
Denis, 2010),
fromages, laits, fruits , ensilages et de plusieurs produits fermentés (Belal et al., 2011) ; des
13
bactéries lactiques surtout du genre Lactobacillus qui avaient une activité antifongique
efficace en produisant des substances comme l'acide phényllactique (en quantités
inférieures à 7.5 mg/ml et l'acide 4-hydroxy-phényllactique isolés des souches de Lb.
plantarum 21B. Ces substances ont montré une activité inhibitrice contre :Aspergillus niger,
Aspergillus flavus , Penicillium cprylophilium , Penicillium requeforti , Penicillium expansum,
Fusarium graminearum (Doguiet et
Denis,2010). On a même noté l’effet des mêmes
substances produite cette fois par la souche Lb. plantarum 20B contre Aspergillus, Penicillium
et Monilia (Kouakou et Philippe, 2011).
Par ailleurs, une gamme d'acides organiques tels que les acides: acétique, formique,
caproïque, propionique, butyrique et valérique libérées par Lb. sanfranciscensis CB1 et Lb.
plantarum, possèdent le même effet contre Aspergillus, Fusarium, Penicillium et Monilia. Ces
acides agissent d'une manière synergique (Kouakou et Philippe, 2011). D’autre part, des
souches de Lb. fermentum 007, Lb. paracasei D5, Lb. pentosus G004, Pediococcus pentosus Te010
ont été caractérisées pour posséder la capacité de produire des substances antifongiques
efficaces de nature protéique vis-à-vis Aspergillus niger, Aspergillus orizea (Belal et al., 2011)
Meanwhile et Schnurer (2001) ont attribué la production d’une bactériocine (la reuterine) à
spectre d’activité antimicrobienne limité à Lb. coryniformis , l’étude a été renforcé par la
publication de Adebayo et Aderiye, (2010) sur les bactériocines produite surtout par Lb.
plantarum EK1, Lb. plantarum EK4 et Lb. fermentum SG10, inhibant les champignons
d’altération Penicillium citrinum EK1, Aspergillus niger FF2 et Aspergillus flavus EB3 isolés de
produits alimentaires Nigériens fermentées (Adebayo et Aderiye, 2010) .
Comme on a prouvé l’effet antifongique de la bactériocine Nizine Z produite
par Lactococcus lactis ssp. lactis biovar. Diacetylactis UL719envers certaines souches de
Candida (dont parmi Candida albicans) responsables des infections buccales qui occupent
une place importante en pathologie ORL (Oto-RhinoLaryngologie) (Lay ,2009).
Vanne et al.,(2000) a démontré que la croissance de champignons toxinogenes était limitée
in vitro
par des bactéries lactiques par l‘effet combine entre l’acide lactique et des
bactériocines(Adebayo et Aderiye, 2010). Sur le même contexte, on a prouvé l’inhibition
d’organismes gram négatif Pantoea agglomerans VTT-E-90396 et de Fusarium avenaceum
14
VTT-D-8014par des composés a potentiel antimicrobien secrétés par L. plantarum VTT-E78076,dont :l’acide benzoïque , 5-methyle -2, 4-imidazolidinedione, tetrahydro-4-hydroxy4-methyl-2H-pyran-2-one et 3- (2-methylpropyl)-2,5-piperazinedione ;avec une activité de
ces derniers marquée optimale a la présence de l’acide lactique ce qui s’est avéré conscient
avec l’observation disant que le lactate rend la membrane des organismes gram négatif
perméable aux contenus extracellulaires permettant la pénétration et augmentant la
fonction de ces composés antimicrobiens produits par l’hôte (Alain, 2004).
Récemment, Laref et Guessas, (2013), ont prouvé l’effet antifongique des espèces de Lb.
plantarum et Lb. fraciminis vis-à-vis Aspergillus spp., Fusarium roseum, Trichoderma spp.,
Penicillium spp. and Stemphylium spp.
1.6. Applications technologiques des Lactobacilles :
Plusieurs applications de lactobacilles sont mises en évidence parmi lesquelles : l’affinage
des fromages et la fabrication du yaourt en contribution avec l’acidification, l’aromatisation
et l’amélioration de la Texture (Saxer et al., 2013).
Le yaourt a une texture qui est déterminée par le traitement thermique sur la matrice du
lait de base et par les cultures starter. La texture d’un yaourt est la résultante d’une
interaction complexe entre les protéines du lait, qui sont acidifiées et entre les
polysaccharides exocellulaires produites par les cultures starter (Hassan et al., 1995). Les
propriétés les plus recherchées sont la finesse, la douceur et la viscosité. Les cultures starter
peuvent influencer chacune de ces propriétés par la production d’exopolysaccharides, ces
dernières sont produites soit sous forme de fibres soit sous, forme de capsules (Gentes et
al., 2011).
15
II. Les exopolysaccharides des bactéries lactiques :
Il est connu que pour améliorer la qualité du produit laitier fermenté ; quelques
approches technologiques parmi lesquelles l’augmentation
des substrats solides
du lait comme les lipides, protéines ou les sucres (sucrose, fructose,) l’addition de
stabilisateurs
agréés
par
la
législation
nationale
(pectine,
amidon,
alginate,
gélatine) sont considérés comme nécessaires (Duboc et Mollet, 2001).
Depuis que, l’addition de stabilisateurs d’origine animale ou végétale dans le yaourt
naturel est interdite en France et en Netherlands (Les Pays Bas/Hollande) et puisqu’il en
existe une croissance dans la popularité des produits alimentaires exempts d’additions, on
s’est dirigé vers d’autres substituant biosynthétiques, secrétés naturellement dans les
produits fermentés ; dans le but de remplacer les additifs interdits , tout en réservant la
même fonctionnalité de ces derniers .De ce fait, l’utilisation des bactéries lactiques
productrices d’EPS a attiré la plus grande popularité (Grobben et al., 1998) grâce aux
caractères stabilisant et rhéologiques qu’elles offrent. Plusieurs études ont fait l’isolement
et l’analyse des souches de bactéries lactiques notamment : Leuconostoc, Lactobacilles,
Lactococcus ayant la capacité de produire les exopolysaccharides, la quête de leur
recherche (Grobben et al., 1998 ; Duboc. et Mollet, 2001 ; Zajsek et al., 2013)
Les souches productrices S. thermophilus ; L. delbrueckii subsp. bulgaricus et même
Lactococcus lactis sont maintenant largement employées en culture starter pour la
fabrication du yaourt (Grobben et al., 1997 ; Hassan et al., 2002 ; Vaningelgem et al., 2004 ;
Aslim et al., 2005; Hutkins., 2006 ; Urshev et al., 2008 ; Mende et al., 2012) soient seules ou
bien mélangées à d’autres souches. L’intérêt s’est depuis peu tourné vers les souches de
Lactobacillus et de bifidobactéries. Ces souches sont considérées comme probiotiques : ce
qui est une qualité de plus en plus recherchée par les consommateurs. .
2.Définition des polysaccharides :
Les polysaccharides font partie de la classe des fibres alimentaires et peuvent aussi servir
de substituts aux gras dans la préparation de certains aliments à faible teneur en calories.
Plusieurs types de polysaccharides provenant de sources diverses peuvent être employés
selon le produit visé et l’effet recherché. Ils peuvent être d’origine végétale : plantes
(cellulose, pectine, amidon), algale (agar-agar, alginate, carraghénine) ou bactérienne
(gomme gellan, gomme xanthane, alginate).
16
La majorité des polysaccharides employés dans l’industrie alimentaire sont d’origine
végétale (amidons et dérivés, celluloses et pectines, naturellement dérivés) ou produits par
des algues (agars, carraghénanes et alginates). L’amidon et ses dérivés : les gommes, y
compris, l’haricot de sauterelle, les gommes de guar, fécule de maïs, tapioca, ainsi que la
cellulose ;
sont les polymères les plus utilisés par l’industrie alimentaire. Ils sont
disponibles en grande quantité et aucun traitement n’est nécessaire avant leur utilisation.
Le
principal
intérêt
des
polymères
dérivés
d’algues
est
dans
leur
caractère
thermoréversible qui permet une foule d’applications dans les produits alimentaires.
Parfois, on ajoute même de la gélatine (Duboc et Mollet, 2001; Hutkins, 2006 ; Badel et al.,
2011).
3.Structure et composition générale des polysaccharides :
Un polysaccharide est un polymère de résidus monosaccharidiques reliés entre eux par des
liens glycosidiques. Ces liens se forment par l’élimination d’une molécule d’eau entre le
groupe hémiacétal hydroxyle de l’extrémité de l’un et le groupe hydroxyle primaire ou
secondaire du résidu suivant. Le groupement hydroxyle peut être dérivé par estérification
et peut être présent sous forme d’acétate, de sulfate ou de phosphate. Les groupements
hydroxyles peuvent aussi être substitués par des pyruvates ketals. Des résidus d’acides
uraniques
(ex. :
acide
D-galacturonique)
peuvent
être
présents
dans
certains
polysaccharides (certaines unités sont méthyl-estérifiées alors que d’autres sont associées à
des cations mono ou divalents).
Les polysaccharides peuvent être linéaires, avec embranchements ou, dans certains cas,
cycliques. Le degré de ramification du polymère a une incidence sur les propriétés
physiques telles que la solubilité dans l’eau, la viscosité et les comportements gélifiants des
solutions de polysaccharides.
Le nombre de résidus contenus dans un polysaccharide peut être de quelques-uns à
plusieurs milliers et la composition d’un polysaccharide peut être homogène (un seul type
de monosaccharide) ou hétérogène (plusieurs types de monosaccharides) (Hames et al.,
2006 ; Gorska et al .,2013).
17
4.Classification des polysaccharides microbiens :
Les polysaccharides microbiens sont généralement divisés en trois catégories :
1. polysaccharides des parois cellulaires.
2. polysaccharides intracellulaires
3. polysaccharides exocellulaires
Les premiers sont généralement difficiles à extraire ainsi à faible intérêt industriel à part la
chitine et le yeast glucan.
Les polysaccharides intracellulaires sont aussi difficiles à extraire, de ce fait, tous les efforts
ont été consacrés à commercialiser les exopolysaccharides.
Les polysaccharides exocellulaires peuvent être rencontrés sous forme de capsules ou sous
forme de boue extracellulaire détachée de la surface bactérienne.
5.Les exopolysaccharides bactériens :
Ils se présentent soit sous forme d’une capsule enrobant la cellule soit secrétés dans le
milieu environnant. Dans certains cas, les deux formes sont produites par le microorganisme sauf que dans la pratique, la distinction entre les deux est floue.
Ces polymères ont été nommés polysaccharides capsulaires (« capsular polysaccharides » :
CPS), microcapsulaires, ou encore « slime » dans la littérature anglo-saxonne. Le terme
général de polysaccharide exocellulaire ou exopolysaccharide (EPS) est le plus approprié
pour désigner ces différentes formes de polysaccharides.
II est aussi possible de produire des polysaccharides par fermentation microbienne en plus
de ceux végétaux et des algues ; en offrant les mêmes propriétés physicochimiques, une
meilleure qualité et encore à un niveau plus élevé de pureté. Exemple de la cellulose
bactérienne employée comme stabilisant ou émulsion dans l’industrie des cosmétiques,
comme peau artificielle aux applications médicale. Qui est d’une résistance à la traction
plus haute que le polymère végétal. Les EPS sont produits par de nombreuses espèces de
bactéries provenant de diverses niches écologiques (Roger, 2011, Badel et al., 2011)
Définissent les EPS comme des polymères localisés dans le milieu extracellulaire sans
liaisons covalentes avec la membrane bactérienne, produits par les Archaebactéries et les
18
Eubactéries (par les Gram positif aussi bien que par les Gram négatif) (Kranenburg et al.,
1991 ; Badel et al., 2011) alors que Ruas-Madiedo et al., (2005) ajoutent que les EPS forment
aussi de fines couches lâchement jointes à la surface cellulaire.
Chez les Gram négatif : le xanthane produit par Xanthomonas campestfi et le gellan produit
par Pseudomonas elodea (selon Bresin, 2008) ou par Sphingomonas paucimovilis (selon RuasMadiedo et de los Reyes-Gavilan, 2005) ; ainsi que le curdlan trois types de polysaccharides
bactériens largement utilisés dans I‘industrie alimentaire comme agent stabilisant et
texturant (Badel et al., 2011). On cite aussi l’acétane produit par Acetobacter xylinum.
On a aussi, les bactéries lactiques et les bactéries propioniques (Cerning, 1995) entre autre,
des glucanes formés par Streptococcus mutans ; des homopolymères de glucose tandis que
des Streptococcus salivarus produit des levanes qui sont des homopolymères de fructose.
La stabilité de la production et la régularité de la structure des polymères produits par des
bactéries leur en font des bioingrédients de choix (Bresin et al., 2008),
Bresin et al., (2008), ont réalisé une recherche dénuant des souches de la rhizosphère d’un
certain nombre de plantes (blé dur, blé tendre, tournesol, colza, Arabidopsis thaliana), mises
en culture dans des sols de régions tempérées, semi-désertiques ou désertiques qui ont été
recherchées de façon systématique. Les espèces révélées appartenaient surtout à la famille
des Rhizobiacées (Rhizobium, Sinorhizobium, Agrobacterium) et plus spécifiquement ;il ont
étudié la capacité de l’espèce Rhizobium alamii YAS34, en fonction de la connaissance de la
structure et les propriétés originales de son EPS ; afin de, définir et développer une gamme
d’applications. Apres, il ont procède a l’optimisation de cette production d’EPS en
intégrant la souche dans un procédé industriel de fabrication (fermentation).
6.Les exopolysaccharides des bactéries lactiques :
Mentionnée par plusieurs auteurs et même approuvée ; la capacité des bactéries lactiques à
générer ces polymères lors de leur croissance (Grobben et al., 1997 ; De Vuyst et Degeest,
1999 ; Degeest et al., 2001 ; Ruas-Madiedo et de los Reyes-Gavilan, 2005 ; Badel et al., 2011 ;
Mende et al., 2012). Les genres les plus couramment rencontrés producteurs d’EPS sont :
Streptococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus et les plus fréquents sont Lactobacillus ;
19
approximativement 30 espèces l’en sont (Ruas-Madiedo et de los Reyes-Gavilan, 2005 ;
Badel et al., 2011) parfois même des Bifidobacterium.
Ruas-Madiedo et al., 2007 ont pu isoler des espèces de Lactobacillus et des Bifidobacterium du
microbiote intestinal de l’Homme (hébergeant 10 fois plus de bactéries que le corps), à
partir des échantillons fécaux et de la muqueuse de sujets adultes sains ; qui produisaient
des EPS.
Le kéfir :
C’est un lait fermenté fait à base de grains de kéfir contenant les bactéries lactiques et les
levures responsables de la fermentation. Un polysaccharide appelé kéfiran est produit par
une souche de Lactobacillus kéfiran au cours de la fermentation. Il contient des quantités
équimolaires en D-glucose et le D-galactose (figure4 et 5) seulement d’un rapport de 1 :1
(Farnworth, 2005).
Figure 4 : schéma de la structure chimique proposée du kefiran, le polysaccharide hydrosoluble des
grains de kéfir (d’après Farnworth, 2005)
Figure 5 : structure du Kéfiran (d’après Badel et al., 2011)
Les souches laitières productrices d’exopolysaccharides concernent plusieurs espèces qui
peuvent figurer parmi le consortium microbien de grains de kéfir : Leuconostoc
mesenteroides, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactobacillus
20
acidophilus, Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, Lb. helveticus, Lb. paracasei et Lb. rhamnosus (De
Vuyst et al., 2001).
7.Composition chimique des EPS produits par les bactéries lactiques :
De grandes controversions se sont imposées ; dans les premiers travaux de recherche dès
1958, sur la nature du matériel extracellulaire produit par les bactéries lactiques, donnant
au lait fermenté un aspect visqueux.
Puis les consensus se sont convergés vers la théorie qui dit que : ces exopolymères
consistent en divers polysaccharides formés d’unités (ramifiée) répétées, contenant des
liaisons α et β (Cerning, 1994).
Selon De Vuyst et Degeest, 1999 ; Degeest et al., 2001 ; on a défini une grande variété de ce
type de composés chez les bactéries lactiques (tableau 2).
Tableau 2 : composition des exopolysaccharides de différentes bactéries lactiques (Hutkins, 2006).
Souches de bactéries
Composition d’exoploysaccharides
Rapports en sucres
Heptasaccharide de glucose, galactose, rhamnose
Gal :Glu :Rha 5 :1 :1
Rr
Gal :Glu :Rha 5 :1 :1
Lfi5
Gal:Glu:Rha 5:1:1
Lactobacillus
delbrueckii
subsp. Bulgaricus
LY03
291
Pentasaccharide de glucose, galactose
Lactobacillus
subsp. Cremoris
B39
lactis
H415
Pentasaccharide de galactose
SBT 0495 ,
Pentasaccharide
phosphate
Lactobacillus
TY1-
Glu:Gal: 3:2
glucose,
helveticus 2
Heptasaccharide
galactopyranosyl,
2glucopyranosyl
Gal:Glu:Rha 3:2:2
—
galactose,
rhamnose, Gal:Glu:Rha:Pho
2.1:1.8:1.3:1
o
glucopyranosyl, GluP:GalP:AgluP:
acetamido-2-deoxy-D- 3.0:2.8:0.9
Lactobacillus rhamnosus Heptasaccharide de glucose, galactose, rhamnose, Glu :Gal :Rha :Pyr
RW-9595M
pyruvate,
2 :1 :4 :1
21
Lactobacillus sakei 0-1
Pentasaccharide de glucose, rhamnose,
Glu :Rha :G3P 3 :2 :1
Lactobacillus
sanfranciscensis
LTH2590
Trisaccharide de glucose et fructose
Glu :Fru 1 :2
Hexasaccharide de galactose et rhamnose
Gal:Rha 2:1
Sy89
Tetrasaccharide de glucose et galactose
Gal:Glu 1:1
Sy102
Gal:Glu 1:1
Sfi6
Tetrasaccharide de
acetylgalactosamine
Sfi12
Hexasaccharide de galactose, rhamnose, glucose
Gal:Rha:Glu 3:2:1
Sfi39
Gal:Glu 1:1
IMDO1
Tetrasaccharide de glucose et galactose *
Gal:Glu 3:1
IMDO2
Tetrasaccharide de glucose and galactose*
Gal:Glu 3:1
IMDO3
Tetrasaccharide de glucose and galactose *
Gal:Glu 3:1
NCFB
859 Tetrasaccharide de glucose and galactose *
Gal:Glu 3:1
CNCMl
Tetrasaccharide de glucose and galactose *
Gal:Glu 3:1
MR-Lc
Octasaccharide de galactose, rhamnose, fucose
Gal:Rha:Fuc 5:2:1
EU20
Glu:Gal:Rha 2:3:2
OR 901
Hepatsaccharide
rhamnopyranose
Streptococcus
thermophilus
S3
glucose,
de
et
galactose,
N- Gal:Glu:GalNAc 2:1:1
galactopyranose, GalP:RhaP 5:2
(La suite du tableau 2) : *Un résidu apparait en N-acetygalactosamine
8.Structure des exopolysaccharides des bactéries lactiques :
Diverses sont les structures de ces macromolécules produites par les espèces de bactéries
lactiques que l’on a décrites (Badel et al., 2011). Les polysaccharides sont constituées en
unités de sucres ou de leurs dérivés embranchées, les chaines sont répétitives ;
généralement des résidus de glucose, galactose et rhamnose sous différents rapports
(Welman et Maddox, 2003) parfois même on cite le mannose, le fructose, l’arabinose, et le
xylose (Liu et al., 2011). On prend come exemple : la structure du Dextrane (figure 6).
22
Figure 6 : Structure de l’homopolymère : dextrane.
9.Classification des exopolysaccharides des bactéries lactiques :
En se basant sur la localisation des polysaccharides relative à la cellule productrice, on
définit des EPS d’encapsulation étroitement liés à la cellule et des EPS secrétés hors de la
cellule sous forme de boue lâche (Ruas-Madiedo et de los Reyes-Gavilan, 2005).
En se basant sur les chaînes de sucres répétitives dont ils sont composés ces polymères, on
distinguent deux groupes d’EPS produits (figure 7) :
1 .Homopolysaccharides (HoPS) : constitués d’un seul monosaccharide ; les deux positions
(alpha ou beta) du groupement hydroxyle sur l’hexose sont possibles (De Vuyst et al.,
2001) ; d’un poids moléculaire élevé entre : 4.0×104 et 6.0×106 Da ; souvent produits en
grandes quantités par rapport aux hétéropolysaccharides. Ils sont subdivisés en 4 sousgroupes (Sanchez et al., 2006).
a.
α-D glucanes : exemple :
 Dextrane : polymères de glucose liés 1-6, produits par : Leuconostoc mesenteroides ;
Mutane-1-3, le second Hops le plus décrit, produit par S. mutans ; linéaire, formé par des
résidus de D-glucose liés par plus de 50% du total avec des liaisons glucosidiques α-(1-3),
associé avec D-glu embranché en α-(1-6), insoluble dans l’eau, responsable de l’adhésion
de la bactérie productrice Lb. reuteri à la surface des dents , en plus sans aucune application
industrielle.
b. β-D glucanes : glucanes, polymères de 1-3 glucose, produits par : Pediococcus et
Lactobacillus,
23
c. Fructanes : polymères de D-fructose liés 2-6, produits par des souches de S.
salivarius, Lb. sanfranciscensis, et Lb. reuteri ; le type Inuline présente souvent des
liaisons β-(2-6) ou β-(2-1), si produit par L. reuteri 121.
d. Autres comme le polygalactane : galactose produit par des souches L. lactis (De
Vuyst et Degeest, 1999 ; Lapointe, 2009 ; Badel et al., 2011).
Figure 7 : classification des homopolysaccharides produits par Lactobacillus sp (Badel et al., 2011).
2 .Hétéropolysaccharides (HePS) : formés de plusieurs copies d’oligosaccharides construits
d’unités répétitives contenant deux ou plusieurs monosaccharides dont le nombre d’unités
varie entre tri et octasaccharides. Avec un enchainement de sous-unités, souvent
embranchés en C2, C3, C4, or C6 (De Vuyst et al., 2001 ; Welman et Maddox, 2003), élaborés
par différentes bactéries lactiques thermophiles et mésophiles. Ils sont d’un grand intérêt
rhéologique très recherché. Ils différent considérablement entre les souches dans la
composition, la structure et les propriétés physicochimiques. Le plus souvent formés de
combinaison : Glucose, Galactose, et Rhamnose, ainsi que le Fructose, sucres aminoacetylés, Ribose, acid glucuronique, et des constituants non carbohydrate : glycérol,
phosphate, pyruvyl, and groupements acétyles, en faibles taux (De Vuyst et Degeest, 1999 ;
Duboc et Mollet, 2001; Hutkins, 2006). Ils peuvent être encore classifiés selon la
composition des monosaccharides, les liaisons entre les unités, la présence des chaînes
latérales répétées, et surtout la longueur et la fréquence de l’embranchement qui affectent
24
fortement leur propriété rhéologique ; généralement produits à l’ordre de 10–1000 mg/L
avec une grande masse moléculaire entre 104 et 106 Da (Duboc et Mollet, 2001 ; Lapointe,
2009, Badel et al., 2011). Ils sont produits par des bactéries lactiques mésophiles (ex : L.
lactis, L. cremoris, Lb. casei) et thermophiles (ex : Lb. bulgaricus, S. thermophilus).
10 .Organisation des gènes codant pour les EPS :
Les gènes codant pour la production des EPS généralement, localisés dans les plasmides
des bactéries lactiques mésophiles ou sur le chromosome des thermophiles. Ils existent
sous forme de faisceaux avec de spécifiques fonctions structurelles, régulatrices et de
transport. Ils ont été séquencés des souches de yaourt aussi bien que des bactéries lactiques
mésophiles. Ces faisceaux indiquent une structure commune d’opéron, avec les gènes
placés dans un ordre particulier (figure 8) (Hutkins, 2006).
Au début du faisceau epsA une région suggérée potentiellement impliquée dans la
régulation des EPS. Pendant qu’au centre : les gènes epsE, epsF, epsG, epsH, et epsI, codant
pour les enzymes ; conçues pour la biosynthèse des unités répétitives des EPS.
Les
produits des epsC, epsD, epsJ, et epsK sont responsables sur la polymérisation et l’export des
EPS.
Figure 8 : schéma de comparaison fonctionnelle des gènes d’EPS des bactéries lactiques. 1,
Streptococcus thermophilus NCFB 2393 ; 2, Lactobacillus lactis NIZO B40 ; 3, Streptococcus thermophilus
Sfi6 ; 4, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Lif5 (d’après Hutkins, 2006).
25
11.Régulation des gènes des EPS et biosynthèse :
Ni la production ni le rendement en EPS, n’est un caractère stable (De Vuyst et Degeest,
1999). Les bactéries lactiques contrairement aux autres Gram positifs, produisent de faibles
taux en EPS (3 g /l) par rapport aux autres qui font de 10 à 15 g /l (Hutkins, 2006).
Le site de la synthèse des EPS et la nature des précurseurs permettent de distinguer deux
types principaux de biosynthèse par les bactéries lactiques : la synthèse en dehors de la
cellule (produisant des HoPS) ; ou celle à la membrane cellulaire (produisant des HePS).
Sachant que la biosynthèse et la sécrétion d’EPS s’effectue à différentes phases de
croissance (De Vuyst et al., 2001 ; Badel et al., 2011)
a. La biosynthèse des HoPS : Il existe au moins deux mécanismes de biosynthèse des
HoPS :
1 .Les polymères sont synthétisés en dehors de la cellule grâce à des enzymes excrétés par
la bactérie : comme les glycansucrases appartenant aux glycosyltransferases (GTF), classe
(E.C. 2.4.x.y), contrairement aux types glycosyltransferases classiques de Leloir. Elles
n’utilisent pas le sucre nucléotidique comme donneur sauf le sucrose. Elles catalysent le
transfère des monosaccharides des molécules activées à une molécule réceptrice pour la
création des liaisons glycosidiques (Badel et al., 2011).
En présence de sucrose et d’un sucre accepteur (le maltose,) les glycanesucrases effectuent
la synthèse des oligosaccharides de faible PM, au lieu de polymères à PM élevé.
Dans la production du dextrane par exemple, seulement une enzyme est utilisée : la
dextranesucrase (figure 9). Cet enzyme est spécifique pour le sucrose ; ainsi, l’énergie de
la polymérisation, vient de son hydrolyse. Le dextrane peut être produit à partir de
cultures cellulaires de Lnc. Mesenteroides, ou de préparations de l’enzyme sans cellules
vivantes, éventuellement immobilisée.
Il existe ainsi, d’autres enzymes extracellulaires ; qui sont produites par différentes souches
des espèces
Lnc.
mesenteroides
et
Lb.
reuteri :
levansucrases,
glucansucrases et
fructansucrases (figure10) (Cerning, 1990, Lapointe, 2009).
26
Figure 9 : clivage du sucrose et synthèse de l’homopolysaccharide dextrane par la dextransucrase
chez certaines bactéries lactiques (De Vyust et Degeest, 1999).
Figure 10 : représentation de la synthèse extracellulaire des Glucanes et des Fructanes (D’après
Badel et al., 2011).
2 . Un deuxième mécanisme de biosynthèse des glucanes survient : la glucane synthase
Dps chez certaines espèces de Pediococcus damnosus et Oenococcus oeni productrices d’EPS.
Grâce à un seul type d’enzyme la β-glucosyltransferase catalysant les liaisons successives
de sucres de type β(1-2) et β(1-3) ; qui effectue l’exportation du polysaccharide.
b. La biosynthèse des HePS :
Une enzyme très spécifique « glycosyltransferase » est impliquée dans la réaction de
polymérisation.
Dans ce deuxième type, la biosynthèse a lieu à la membrane cytoplasmique. Elle comprend
quatre grandes étapes : la synthèse des sucres nucléotidiques, l’assemblage des sous unités
répétitives, l’exportation et la polymérisation des sous unités à l’extérieur de la cellule.
27
La biosynthèse des sucres précurseurs :
La voie de production des HePS dépond de l’approvisionnement en glucose -1-phosphate
qui dérive de la conversion du glucose-6-phosphate grâce à l’enzyme clé : la
Phosphoglutcomutase (PGM) ; à partir duquel les sucres précurseurs qui consistent en
sucres nucléotidiques comme les UDP-glucose, Dtdp glucose, UDP-galactose et le Dtdprhamnose ayant un rôle important dans l’activation des sucres. Elles sont essentielles à la
polymérisation des monosaccharides aussi bien qu’aux interconversions (comme
l’épimérisation, la déshydrogénation, la décarboxylation… etc ). A ce moment elles n’ont
aucun rôle notable dans la composition des EPS produits. Elles sont synthétisés par
glycolyse au sein du cytoplasme (figure 11) ; mais, qui ne sont pas disponibles à la
production d’énergie. Ils peuvent provenir soit d’une synthèse de novo ou d’une voie de
récupération par le catabolisme de nucléotides préexistants. L’UDP glucose et le Dtdp
glucose sont formés grace aux enzymes UDP–glucose pyrophosphorylase (GalU)ou Dtdp–
glucose pyrophosphorylase ou glucose-1P thymydilyltransferase (RfbA ou RmiA).
La conversion du galactose en glucose-1-phosphate via galactose-1-phosphate (la voie de
Leloir) est possible en cas de présence du système dans la cellule (Degeest, et De Vuyst,
2000 ; De Vyust et Degeest, 1999 ; Lapointe, 2009).
L’assemblage des unités répétitives :
Plusieurs enzymes interviennent lors de la biosynthèse et la sécrétion des HePS (figure 11):
l’UDP glucose déshydrogénase, la glycosyltransférase et la galactosyltransférase. Toutefois,
ils sont impliquées dans d’autres activités métaboliques. L’unité répétitive est assemblée à
la membrane cytoplasmique par addition successive d’unités glucosyle au polysaccharide
naissant , qui est probablement ancré individuellement sur un transporteur lipidique qui
pourrait être l’undécaprenyl phosphate, nommé C55 (figure) par l’action séquentielle de
glycosyltransferases. Après complétion de l’unité répétitive, celle-ci est transportée au
travers de la membrane cellulaire probablement à l’aide d’une flippase. Elle est
polymérisée à l’extérieur de la cellule pour former l’hétéropolysaccharide, avec un poids
moléculaire finale élevé d’environ 1 .106 Da
(De Vyust et Degeest, 1999 ; Welman et
Maddox, 2003 ; Lapointe, 2009).
28
Figure 11 : schéma représentatif des voies impliquées dans le catabolisme lactose/glucose
et la biosynthèse des EPS par Lactococcus lactis Gal+ (via les systèmes phosphoénolpyruvate
PEP et phospho-transférase PTS) et par Lactobacilles delbrueckii ssp. Bulgaricus et
Streptococcus thermophilus Gal- (via l’antiport lactose/galactose) (De Vuyst et al., 2001 ;
Welman et Maddox, 2003).
12. Fonctions et intérêts des exopolysaccharides bactériens :
Plusieurs rôles biologiques, physiologiques ainsi que technologiques ont été dénués dans
les travaux de recherches vu leur grande importance. Les propriétés de cette couche
hydrophile secrétée autour des bactéries (figure12) semblent importantes pour leur survie
en milieu naturel (qu’il soit liquide ou solide). Ou, la majeure partie des bactéries
s’adsorbe, sélectivement ou non, à des surfaces inertes ou des organismes vivants.
Dès 1928, le rôle des polysaccharides capsulaires dans la virulence de la souche
Streptococcus pneumoniae était mis en évidence par Griffith ; notant que l’étude du rôle et de
la conséquence d’existence de ces polymères étaient au début visés par les travaux de
recherche médicaux (Dupont, 1999).
29
Figure 12 : localisation cellulaire des polysaccharides produits par les gram positif (CPS =
Capsular polysaccharides (capsule), EPS = exopolysaccharides (couche fine) (d’après RuasMadiedo et al., 2005).
Les EPS ne semblent pas constituer une source d’énergie puisque les bactéries productrices
ne catabolisent généralement pas le polymère qu’elles produisent (Looijesteijn, 2000).
Cependant, ils peuvent stocker l’énergie lors de la formation des matrices extracellulaires
des biofilmes et même parfois, on rencontre une dégradation du polymère produit chez
les Lactocoques et les Lactobacilles. Comme dans le cas de
Lb. rhamnosus dans des
fermentations prolongées ; après lyse cellulaire des glycosylhydrolases intracellulaires
dégradent les EPS (Mozzi et al., 2009). Mais il n’est pas certain que l’organisme utilise le
polymère dégrad (Ruas Madiedo et al., 2002 ; Ruas-Madiedo. P et de los Reyes-Gavilan,
2005, Lapointe, 2009 ; Rendueles et al., 2013).
Ils peuvent servir d’agent adhésif des molécules regroupées « connues sous le nom de
glycocalyx » entre cellule-cellule ou bien cellule-surface. Ou, ils jouent le rôle important
dans la formation et la stabilisation des colonies. Majoritairement elles comprennent les
EPS acides, avec des lipoprotéines et des glycoprotéines (Ruas-Madiedo et al., 2005 ;
Flemming, 2010 ; Rendueles et al., 2013). Elles peuvent servir de substance d’agrégation
bactérienne dans les communautés de rhizosphère et d’avoir un rôle dans la dissimulation
de la surface bactérienne. Dans certaines interactions entre les cellules (dans la
communication : glycosaminoglycans) (Badel et al., 2011) plantes et les bactéries : comme
dans la formation de nodules par Rhizobium meliloti et Agrobactenum tumefaciens par
exemple, ; Ils peuvent aussi être utiles au captage des ions métalliques (Dupont, 1999).
Comme dans certaines revues, on attribué la formation de la matrice extracellulaire (MEC)
des biofilmes à plusieurs composés dont 90% est l’eau et 10% des polymères
30
extracellulaires, parmi lesquels on cite le plus majeur chez plusieurs bactéries : les EPS. On
a découvert plus qu’une trentaine de types d’EPS de MEC. Exemple : glucanes produits
par Streptococcus mutans, et l’alginate : Pel et Psl produits par Pseudomonas aeruginosa (Badel
et al., 2011 ; Rendueles.O et al., 2013) d’une part et d’autre part, on a marqué un effet de
certains EPS (qu’on a appelé r-EPS) isolés de biofilmes formés, par deux espèces Gram
positif de bactéries lactiques Lactobacillus acidophilus A4 antibiofilmes de beaucoup de
germes pathogènes tels E. coli, Salmonella sp., Yersinia enterocolitica, P. aeruginosa, L.
monocytogenes et B. cereus (Kim.Y et al., 2009) et cela par l’effet des conditions
environnementales. Parmi les effets de ces EPS antibiofilmes (figure13) on a décrit le
changement des propriétés des surfaces abiotiques.
Figure 13 : les rôles biologiques des polysaccharides anti-adhésion.
A. Compétition. Polysaccharides anti-adhésion inhibent la formation du biofilme ou augmente la
dispersion du biofilme. Ils sont trop impliqués dans la résistance de colonisation contre les
bactéries concurrentes ou envahissantes, par conséquent, ils fournissant un avantage écologique
aux bactéries productrices.
B. les polysaccharides anti-adhésion sont secrétés dans le milieu extracellulaire. Même chez les
bactéries productrices peuvent en être susceptible de leur propre polysaccharide antibiofilme et
donc peuvent autoréguler leur comportement d’adhérence.
C. les bactéries concurrentes peuvent détecter les polysaccharides anti-adhésion secrétés et même
réagir contre eux en changeant leur propre expression de gène, par exemple, en réglant l’expression
de leurs facteurs d’adhésion (d’après Rendueles et al., 2013).
31
La présence d’EPS peut être responsable de la résistance aux phages en masquant le site
récepteur des cellules bactériennes sensibles. Le transfert du caractère mucoïde d’une
souche résistante aux phages à une souche non mucoïde sensible aux phages provoque une
résistance aux phages des nouveaux transconjugants ; aux anticorps, et aux surfactants ;
comme on leur a attribué la protection dans l’environnement naturel contre l’attaque par
les phages, la phagocytose, les antibiotiques, aux prédations par les protozoaires ainsi
qu’au stress osmotique (Vdamuthu et Nevile, 1986 ; Badel et al., 2011 ; Liu et al., 2011).
On a découvert chez certains polysaccharides de bactéries hydrothermales la capacité a
chélater des métaux lourds tels le Zn2+, le Cd2+ et le Hg2+
grâce à leurs propriétés
rhéologiques ce qui confère une résistance a ces bactéries extremophiles (Roger, 2002).
Du à la présence de phosphate ; l’EPS chargé négativement à pH environ de 2 ; Lactococcus
lactis NZ4010 produit un EPS composé de glucose, galactose, rhamnose et phosphate.Cette
charge négative est probablement importante dans la fonction protective des EPS contre les
ions métaux toxiques et le lantibiotique nisine chargé positivement. Apparemment, le
mécanisme de détoxification des EPS dans ce cas consiste en l’élimination des molécules
chargées positivement (Looijesteijn, 2000).
On leur a même attribué un effet bénéfique sur la santé des consommateurs comme la
réduction du cholestérol, activité antitummorale (Vinderola et al., 2006 ; Sanchez et al.,
2006), anti-inflammatoire et l’immunomodulation (Liu .C-F et al., 2011) ; aussi prouvée par
Gorska et al., (2013) qui a détecté par le test ELISA leur immunoréactivité en employant des
anticorps de lapins issus d’une immunisation directe avec les bactéries Lb. Johnsonii 142, Lb.
johnsonii 151 , Lb. animalis murinus 148, Lb. reuteri 115, et Lb. casei 0912. EPS 151 structure
commune chez toutes les espèces de Lactobacillus réagit avec le sérum polyclonal antiLactobacillus contre les cellules de toutes les souches citées sauf le sérum control pris avant
immunisation (Vinderola et al., 2006).
Dans certains cas ils peuvent agir comme des prébiotiques en assurant un rôle protecteur
contre le cancer du colon rectal si dégradés par le microbiote bénéfique du colon par
exemple dans le cas de formation de courtes chaines d’acides gras. Alors que s’ils ne sont
32
pas dégradés, ils offrent une protection contre ce cancer en augmentant le volume de selles
ou par l’adsorption spécifique des carcinogènes (Mozzi et al., 2009).
Quand à leur effet physiologique leur présence ne garantie pas la survie mais au moins ils
assurent une adaptation métabolique aux microorganismes producteurs comme chez les
souches S. thermohilus CRL 1190 et Lb. casei CRL 87. Face aux conditions acides rudes
stressantes du système gastrique, que ce soit des EPS ou des polysaccharides capsulaires
(PSC). Ils confèrent ainsi, une protection partielle aux microorganismes probiotiques ; pour
exercer leurs effets bénéfiques dans l’hôte (Mozzi et al., 2009). Sans oublier que les
probiotiques doivent de plus résister aux concentrations élevées en sels biliaires dans le
duodénum et plus ou moins dans les intestins.
Zhang et al., (2013), ont réalisé dans ce contexte un des travaux montrant l’importance des
EPS de l’espèce Lb. plantarum C88 isolés du Tofu fermenté chinois traditionnel, dans la
capacité de résister face au peroxyde d’hydrogène et dans l’activité de capture des radicaux
(tel le radical hydroxyle et le radical 1,1-diphenyl-2-picrylhydraz (DPPH) libre), in vitro et
la capacité d’amélioration du statu antioxydant des souris soumises à une souche oxydante
induite par D-Gal, in vivo.
13.Les facteurs essentiels affectant la biosynthèse des exopolysaccharides :
La biosynthèse
normale des EPS reste toujours marquée par plusieurs facteurs
intrinsèques et/ou extrinsèques.
13.1 .Les conditions de production :
Rappelant que, ce phénomène dépond essentiellement
de la souche étudiée et
sélectionnée.
a. L’instabilité du phénotype :
certaines parmi les souches Gram positif peuvent produire des EPS, car du point de vue
génétique, ce caractère s’avère instable chez les souches visqueuses employées dans la
fermentation (Kojic et al., 1992 ; Lapointe, 2009) . Ainsi, le type et le taux de production des
souches de la même espèce varient sous différentes conditions de culture (De Vuyst et
33
Degeest, 1999). comme on peut attester la production polyvalente par une seule souche
(Grobben et al., 1997).
La culture répétée peut induire la perte du phénotype. Même ceci peut être découlé d’une
perte coïncidente à l’encontre d’un manque de fermenter le : a-méthyle-glucoside. Ce fait
est un trait normal chez certaines espèces comme Lb. casei CG11 (Kojic et al., 1992).
La mutation spontanée, peut générer des variant clonaux avec production faible, plus
élevée comme peuvent donner carrément de nouveaux composés d’EPS. Ainsi, la perte de
plasmide portant le gène codant pour la production d’EPS chez les bactéries lactiques
mésophiles, provoquera une perte du phénotype (Cerning, 1990, Lapointe, 2009)
b.Les plasmides :
Vedamuthu et Nevile (1986) ont prouvé la probabilité avouant la perte du trait de
production des EPS chez les mésophiles à cause de la perte du plasmide.
Peu de bactéries lactiques sont connues pour leur possession des plasmides, bien que
toutes les souches de L.lactis présentent de 2 à 14 plasmides différents allant de 30 à 130
Kb. Ainsi ; avec fréquence chez Leuconostoc et Lb.salivarus de 100 à 380 Kb, chez
Streptococcus cremoris MS (Vedamuthu et Nevile, 1986). Seul un quart de souches de
S.thermophilus possédant un plasmide de petite taille, avec une rareté relative chez
Lb.bulgaricus et les lactobacilles intestinaux (Leblond et Guedon, 2009).
L’instabilité peut être due chez plusieurs espèces telles L. cremoris et Lb. casei CGll, par le
fait que le plasmide est impliqué dans l’expression du caractère mucoïde (Muc+) (Kojic et
al., 1992).
Mais chez les thermophiles cette explication demeure inacceptable. L’instabilité génétique
est plutôt due aux éléments génétiques mobiles comme les séquences d’insertion (SI), ou
due à l’instabilité génomique généralisée. En incluant les délétions et les réarrangements
de l’ADN. Ainsi, les deux phénomènes ont été observés chez
Lb. delbrueckii subsp.
bulgaricus et S. thermophilus (De Vuyst et al., 2001).
34
c. Rendement de la production :
Le rendement final des EPS dépond de la composition du milieu (source de carbone,
source d’azote et autres nutriments) et des paramètres de croissance (température, pH,
oxygène, temps d’incubation..etc) (Badel et al., 2011).
13.2 .Les conditions de culture :
Les conditions de culture optimales : pH, température de croissance, temps d’incubation,
source de carbone, source d’azote ; ainsi que plusieurs d’autres additifs (comme la caséine,
le glycérol…etc) ont un impact clair sur la croissance des bactéries productrices d’EPS.
Plusieurs auteurs l’ont prouvé (Cerning et al., 1986 ; Grobben et al., 1998 ; Sanchez et al.,
2006) en testant la biosynthèse des polysaccharides sous différentes conditions de culture.
Aussi bien que, sur le type et le taux d’EPS (De Vuyst et al., 2001).
La plupart des espèces de Lactobacillus sont auxotrophes, car elles sont incapables de
produire des acides aminés et des vitamines. C’est pour cela les différents milieux de
culture ont été employés à l’étude de la production qualitative et quantitative des EPS et de
déterminer l’influence des nutriments sur la croissance des souches productrices, et sur la
biosynthèse et la génétique des EPS (Cerning et al. 1990, Laws et al. 2001, Welman et
Maddox, 2003).
Les bactéries lactiques mésophiles, la plupart de celles rencontrées dans le kéfir, produisent
des EPS en quantités maximales sous des conditions sub-optimales (Kojic et al., 1992). On
soutient que, le taux de production d’exopolysaccharide est indépendant de la croissance
bactérienne (De Vuyst et al., 2001). Toutefois, dans le cas de Lactobacillus kefiranofaciens
subsp. kefiranofaciens et de Lb. rhamnosus la production d’exopolysaccharide en milieu de
synthèse est corrélée à la croissance bactérienne de la souche étudiée. Tandis que chez les
thermophiles, elle est associée à la croissance bactérienne.
a. La source de carbone :
Malgré que, le lactose soie la source d’énergie majoritairement préférée chez les bactéries
lactiques. Elles sont capables de métaboliser encore d’autres mono et disaccharides grâce à
trois systèmes qui sont bien connus :
35
1 .système de transport primaire ou bien par un couplage direct de la translocation du
sucre avec l’hydrolyse d’ATP via une ATPase de transport spécifique.
2 . des systèmes de transport de sucre secondaire, ou par un couplage du transport du
sucre avec le transport des ions ou d’autres solutés. Chacun des systèmes de transport
symport et antiport
3. Des systèmes de groupes de translocation, ou un couplage de transport de sucre avec la
phosphorylation,
via
le
système
phosphotransferase
(PST)
dépendant
du
phosphoenolpyruvate (PEP) (De Vuyst et al., 2001).
Ce paramètre affecte la production et le rapport en sucres des EPS. Le comportement des
souches vis-à-vis de cette source diffère d’une espèce à une autre (Sanchez et al., 2006). Le
glucose étant la source la plus efficace, puis vient le lactose par rapport au fructose pour
des densités égales en cellules. Le taux de production des EPS était très minime pour le
mannose comme source de crbohydrates ; pour les souches de Lactobacilles delbrueckii
subsp. bulgaricus NCFB 2772 (Grobben et al., 1998), dans un travail précédant Grabben et
al., 1997 ont découvert la production par des souches de L. delbrueckii subsp. Bulgaricus
NCFB 2772 de deux fractions d’EPS concurremment dans le Glucose avec des taux presque
identiques. L’une avec un PM élevé et l’autre avec un PM plus faible. Même avec différents
rapports en Glu, Gal et Rha. En changeant le glucose par le fructose il y a eu une
favorisation de production de l’EPS à faible PM.
Pendant que chez Lb .delbruecki ssp bulgaricus CNRZ 1187, le carbohydrate le plus dominant
parmi ceux approvisionnés lors de la fermentation : Ara, Man, Glu et Gal ; elle vient d’etre
notée chez ce dernier (Bouzar et al., 1996).
Cerning et al., (1994) ont étudié les effets de différentes sources de carbone (galactose,
glucose, lactose, sucrose, maltose, melibiose) à différentes concentrations sur la production
d’EPS chez Lactobacillus casei CG11.
Ainsi, la production extracellulaire de certains homopolysaccharides ; comme les
dextranes, mutanes, alternane et levanes, elle dépond d’un substrat spécifique : sucrose
(Kojic et al., 1992 ; Schutten
et al., 1998 ;Devyust et Degeest, 1999). Alors, la glycosyl
transférase achève la réaction de polymérisation grâce à l’énergie fournie par son
36
hydrolyse (Duboc et Mollet, 2001). Ce substrat est signalé nécessaire chez les Lactobacilles
(Badel et al., 2011).
Pendant que, la polymérisation des unités répétitives chez les hétéropolysaccharides
s’effectue par des précurseurs formés dans le cytoplasme. La biosynthèse et la sécrétion
dépondent de plusieurs enzymes et /ou protéines.
Le lactose s’est avéré la source de carbone idéale pour la production du Kéfiran par les
espèces des grains de Kéfir, en ajoutant des dissacharides de lactose et même chose pour le
sucrose contrairement pour les monosaccharides de glucose et de fructose induisant une
production minime après leur ajout (Zajsek et al., 2013)
Grobben et al., 1997 ; on conclu entre autre que Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
NCFB 2772 produit trios fois plus d’EPS avec le glucose qu’avec le fructose comme source
de sucre, et le type d’EPS ainsi produit est influencé par la source de sucre plus d’autre
conditions (Looijesteijn, 2000).
b. Source d’azote
L’omission d’un ou de plusieurs acides aminés ; dans le but d’étudier son effet sur la
production d’EPS. Celle-ci n’a influencé ni la biosynthèse, ni la composition en sucres.
Malgré qu’elle a affecté la croissance des cellules Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus en
diminuant la densité cellulaire. Sachant que cette dernière a été affectée par l’omission de
certains acides nucléiques comme l’Uracile et l’Adénine (Grobben et al., 1998).
Un environnement riche en carbone et pauvre en azote (ratio carbone : azote élevé) favorise
la production d’EPS. Par contre, un faible ratio carbone sur azote favorise la production
d’EPS à faible poids moléculaire (Gentès, 2011)
c. Certaines vitamines :
D’après Grobben et al., (1998) : en omettant plusieurs vitamines citées, (sauf : la riboflavine,
la pantothenate de calcium et l’acide nicotinique) parues essentielles au développement de
Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus. La croissance était minime bien qu’il s’est avéré une
élévation en production des EPS
37
Entre autre, une omission de multiples vitamines n’a touché la composition monomérique
des EPS parue dans le contenu en galactose ; contrairement à l’omission élémentaire.
d. Stade de croissance bactérienne :
Certaines bactéries synthétisent des EPS durant toutes les étapes de croissance. Tandis que,
d’autres ne les produisent qu’en fin de phase exponentielle ou au stade stationnaire (RuasMadiedo & de los Reyes-Gavilan, 2005)
e. La température d’incubation :
La température d’incubation a un impact sur la production d’EPS (Ruas-Madiedo & de los
Reyes-Gavilan, 2005). La perte du trait de production peut se produire sur la culture
secondaire répétée, ou après incubation prolongée, particulièrement, à températures
élevées (De Vyust et Degeest, 1999). On a remarqué une différence des températures
optimales de la production de biomasse ; c’est-à-dire : la température de croissance des
graines de Kéfir (37°C), température de la production du Kéfiran (23°C) et celle affectant le
rapport en sucres dans ces polymères (Zajsek et al., 2013). On a ainsi, noté une diminution
de la production du Kéfiran vis-à-vis l’augmentation de la température dans un intervalle
de [25; 37]°C, avec une fraction en galactose et glucose maximale à 28°C .
Des psychrotrophes synthétisent des niveaux élevés de polysaccharides :
Les exemples les plus connus de cet effet, incluent la production du lait visqueux et de la
pâte à pain visqueuse, favorisées par de basses températures. La production des dextranes
extracellulaires par des espèces de : Leuconostoc et de Pediococcus, est connue pour être
favorisée à des températures au-dessous des optimums de leur croissance. Sa plus grande
production à de plus basses températures est due apparemment du fait que la
dextransucrase est très rapidement inactivée aux températures au-dessus de 30°C. Un
système thermosensible de dextransucrase synthétisant a été également montré chez des
espèces de Lactobacillus (James et al., 2005).
f. Le pH:
Chez les bactéries lactiques, les changements du pH jouent un rôle important dans la
biosynthèse, la production et possiblement dans la dégradation des EPS. L’importance du
38
contrôle du pH durant la fermentation réside dans la stabilité du système. Un pH stable
élimine une variable à prendre en compte dans l’interprétation des résultats. Aussi, un pH
stable permet de prolonger la phase logarithmique et la phase stationnaire de la croissance
du microorganisme. Ce qui provoque une baisse de la synthèse des peptidoglycanes et des
acides teichoïques. En favorisant ainsi, la production de polymères exocellulaires et de
même le catabolisme de la source de carbone.
Peu de travaux ont porté sur l’effet du pH sur la production d’EPS, l’information reste
fragmentaire (Ricciardi & Clementi, 2000). Cependant, Pety et al., (2000) ont souligné l’effet
de pH et de la source de carbone sur les rapports relatifs de monosaccharide dans les EPS.
Aussi, chez Lb. rhamnosus R on a observé que le pH contrôlé a favorisé l’activité des
glucohydrolases, ce qui a réduit le poids moléculaire d’EPS durant la fermentation (Pham
et al., 2000). Alors que Dupont et al. (2000) ont observé qu’avec ou sans contrôle de pH, la
quantité d’EPS restait la même chez la souche Lb. rhamnosus RW9595M.
De façon générale, l’optimum de pH pour la production d’EPS est le pH pour lequel les
effets opposés de la production et de la dégradation seront équilibrés.
g. Les enzymes dégradantes :
Le
phénomène a été observé par plusieurs auteurs. L’hypothèse de la présence de
glycohydrolases, enzymes dégradantes capables d’hydrolyser les polysaccharides dans du
lait ou dans l’ultra filtrat de lait, rapportée pour la première fois par Cerning (1988) dans
une étude sur les EPS des bactéries lactiques mésophiles, en chauffant un échantillon d’EPS
à 90°C pendant 10 min avant l’extraction ; comparé à un autre échantillon natif, sa
concentration était 40% plus élevée.
h. Les procédés de fermentation :
Les EPS peuvent être produits soit dans des bioréacteurs, suivi par un traitement en aval
approprié pour leur emploie comme des additifs alimentaires ou bien in situ, durant le
processus de fermentation (Sanchez et al., 2006). Cependant, l’accumulation du lactate
provoque l’inhibition des bactéries lactiques. Dans ce cas, une culture « fed batch » à
écoulement discontinu, avec des cellules libres ou immobilisées est nécessaire pour
39
diminuer la concentration de tels métabolites et pour améliorer la production. ce résultat
s’est présenté dans un même type de fermentation répétée avec une biomasse élevée de
cellules immobilisées. Où, le taux d’EPS était plus élevé que dans le cas de cultures de
cellules libres de Lb. rhamnosus RW9595M (Lapointe, 2009).
14.Méthodes culturelles d’optimisation de la production des EPS :
Différents milieux ont été utilisés dans ce contexte. Cependant, le choix du milieu
convenable est un paramètre crucial pour un meilleur rendement. Etant donné que ,
l’analyse peut être affectée par l’un des ingrédients du milieu de production ; bien qu’ils
permettent une bonne croissance des bactéries lactiques et souvent même une bonne
production d’EPS (comme l’extrait de bœuf, la proteose-peptone et l’extrait de levure).
Mais, ils contiennent d’autres polymères carbohydrates (comme : les glucomannanes de
l’extrait de levure et la peptone), ce qui a été démontré dans certains essaies en signalant
que ces composés forment 94% du fond total dans le bouillon MRS (Vaningelgem et al.,
2004 ; Ruas-Madiedo et de los Reyes-Gavilan, 2005).
Au début des recherches sur la production des EPS par les bactéries lactiques, aucune
production n’a été observée dans des milieux semi-définis comme le MRS (à base de
glucose). Ainsi, plusieurs travaux ont été réalisés dans le lait écrémé (milieu à base de
lactose) et les dérivés du lait (milieu à base de lactosérum). Seulement récemment des
milieux semi-synthétiques et synthétiques ont été utilisés.
La définition de nouveaux milieux de culture adaptés pour augmenter et pour accélérer la
production des EPS par les souches bactériennes (Kojic et al., 1992). Qui ne contiennent pas
ces composés interférant avec la production. Ainsi, un milieu chimiquement défini est plus
approprié pour l’étude de la biosynthèse des EPS par les bactéries lactiques et des voies
métaboliques impliquées. La cause majeure consiste à l’absence de composants qui
interférent avec la quantification et avec l’analyse des EPS.
Une autre étude a été consacrée pour déterminer un nouveau milieu synthétique (à part le
milieu MRS) en dédiant l’influence de la composition du milieu sur le type
d’exopolysaccharide produit car l’utilisation de milieux chimiquement déterminés est
40
particulièrement
importante à l’étude quantitative et qualitative et la régulation de
synthèse des EPS produits par les bactéries lactiques (Grobben et al., 1998)
Un milieu développé du milieu semi-défini (SDM) par Mende et al., (2012), pour L.
delbrueckii ssp. bulgaricus DSM 20081, isolée du yaourt Bulgare). Après sélection des milieux
les plus prometteurs sur des cultures en flacon, des expériences de bioréacteur ont été
effectuées en lots pour réaliser le plus grand rendement d’EPS. Tandis qu’aux
fermentations continues, elles ont été effectuées pour obtenir l’information sur la cinétique
de la croissance et de la production d’EPS (Petry et al., 2000).
Van der Meulen et al., 2007, ont mené tout simplement à la filtration du milieu MRS ; dans
le but d’éliminer les glucomannes ; avec une ultrafiltration de l’extrait de levure et la
peptone bactériologique
15.Détection des EPS :
II existe plusieurs façons de détecter la présence de polysaccharides. Ils peuvent être
détectés qualitativement par un examen visuel, par coloration ou par microscopie
électronique, et quantitativement, par différentes méthodes impliquées.
15.1. Examen visuel :
Pour détecter la production d’EPS chez une souche consiste à examiner une colonie sur un
milieu gélosé. En se basant sur l’apparence de la colonie productrice ; plusieurs
phénotypes ont été attribués aux souches lactiques productrices d’EPS « visqueuse »,
« mucoïde » et « slime : gluante» ; alors que, les souches mucoïdes ou slime, productrices
de boue ne sont pas toutes visqueuses (Vedamuthu et Neville, 1986 ; Kojic et al., 1992 ; Ruas
et de los Reyes, 2005).
Les colonies mucoïdes ont un aspect scintillant et gluant sur les plats d’agar (figure14, 15)
mais ne produisent pas de filament quand on les prolonge avec une anse à
ensemencement, contrairement la chez celles «visqueuses» ou il y aura formation de longs
filaments visqueux en touchant la colonie à l’aide d’un cure-dent ou d’une anse
d’ensemencement (selon la figure16).
41
Cependant, certaines souches de bactéries lactiques ne produisent pas de polymères sur un
milieu gélosé mais en produisent en milieu liquide sous certaines conditions bien définies
(Dupont, 1998).
Figure 14 : Colonies mucoïdes de Rhizobium alamii produites sur un milieu riche en glucose après 4
jours à 30°C et à l’obscurité (Bresin et al., 2008).
Figure 15 : Culture en boite de Pétri de souches mucoïdes de bactéries hydrothermales productrices
d’EPS (Roger, 2002).
Figure16 : apparence macroscopique du filament visqueux formé par la masse cellulaire d’une
souche de bactéries lactiques commerciale productrice d’EPS en croissance sur le milieu gélosé de
Man Rogosa et Sharpe.
Dans l’évaluation sensorielle des laits fermentés les souches visqueuses confèrent une
consistance lisse avec une basse synérèse par rapport à celles non visqueuses.
42
15.2. Les colorations :
Certaines études se basent sur une astuce découverte par Gancel et al., en 1988 qui consiste
en l’ajout de colorants cationique additionnés au milieu de croissance ; possédant une
affinité aux composés organiques et inorganiques anioniques environnants, aussi bien
qu’aux polysaccharides neutres et anioniques ; non pas ceux excrétés mais ceux qui sont
fixés à la paroi bactérienne. Ils se fixent donc sur le peptidoglycane de la paroi et induisent
à la coloration de la colonie d’une souche non-productrice. En masquant la coloration (par
les EPS) apparaissent les colonies productrices en blanc sur le fond du milieu coloré. On
appelle cette technique : la méthode de détection des clones bactériens muc+ (Dupont,
1998).
Le rouge de ruthénium est l’un de ces colorants cationiques utilisé par Bouzar et al., (1995)
pour détecter des EPS de souches de Lb . delbrueckii ssp. Bulgaricus CNRZ 1187 productrices
de différents niveaux d’EPS, il colore le milieu en rose foncé sur lequel apparaissent les
clonies non productrices (clones Muc-) colorées en rose et celles productrices (Muc+) en
blanc grâce au masquage par les EPS (Ruas-Madiedo et de los Reyes, 2005).
15.3 .Microscope électronique:
Dans le but de l’illustration du fonctionnement des EPS ; Hassan et al., en 2002 a réalisé une
étude de microstructure du lait fermenté se basant sur la Microscopie confocale de laser de
balayage (CSLM) , comme méthodologie de visualisation directe des EPS des espèces
lactiques (Str. thermophilus CHCC 3534, CHCC2136 et 3855, Lb. delbrueckii ssp. Bulgaricus
CHCC 769 et RR, L.lactis CHCC 3367), dans les produits laitiers entièrement hydratés.
Sachant qu’elle est potentiellement impliquée dans ce contexte. Il a employé une nouvelle
astuce impliquant la souillure ou le marquage des EPS par l’agglutinine de germe du blé
marquée avec le fluor 488 d’Alexa ou la souillure avec la concanavaline A 488, puis
l’observation des échantillons par CSLM. Le résultat de l’observation est dans la figure cidessous.
Les lectines (liant les protéines et les carbohydrates) et leur conjugués fluorescents, à
liaison spécifiée permettent la visualisation des EPS en biofilmes : comme la concanavaline
(qui se lie spécifiquement aux résiduels α-mannopyranosyl et α-glucopyranosyl) et à
43
l’agglutinine du germe de blé qui se lie aux résiduels N-acétyle glucosamine et acide Nacetylneuraminique) (Chaplin, 2008).
D’habitude, avant observation par microscopie de balayage d’électron conventionnelle
(SEM : Scanning electron microscopy) une déshydratation est impliquée car les EPS sont
fortement hydratés et ne peuvent être fixés chimiquement, ainsi ; ils apparaissent sous
forme de filaments (résultat d’effondrement de leur structure pendant la déshydratation) ;
associés aux cellules bactériennes et au réseau de la caséine. Alors, cette nouvelle méthode
confère une bonne visualisation des EPS au sein des produits laitiers dans leur état hydraté
sans chevaucher l’intégrité structurale du gel.
Figure 17 : distribution d’exopolysaccharides (en vert) dans la structure du lait fermenté.
a. Lait fermenté par Streptococcus thermophilus CHCC 3534 visqueuse et l’espèce non visqueuse
Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus CHCC 769.
B. Lait fermenté par. S. thermophilus CHCC 3534 visqueuse et l’espèce non visqueuse Lactobacillus
delbrueckii ssp. Bulgaricus CHCC769 après agitation.
C. Lait fermenté par Lactococcus lactis CHCC3367 visqueuse.
D. Lait fermenté par Lactococcus lactisCHCC3367 visqueuse après agitation. La barre = μm 10.
44
Figure 18 : le lait fermenté par l’espèce Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus RR après agitation.
Les flèches principales fermées indiquent les agrégats rouges de protéine) et les flèches principales
ouvertes indiquent les EPS (en jaune). La concanavaline A a été employée pour souiller les EPS.
Barre =25μm.
Figure 19 : micrographes de microstructure et de morphologie de surface des KF5 EPS observées
par SEM.
15.4 .Détection des EPS par mesure de la viscosité du milieu fermenté :
Une méthode très utilisée mais reste comme toutes autres méthodes limitée. La viscosité en
milieu liquide n’est pas affectée seulement par la quantité de polysaccharides formée.
Comme, elle ne peut pas être stable ; à cause de, plusieurs facteurs les plus majeurs sont le
type de polymère et les métabolites produits ; comme l’acide lactique qui acidifie le milieu,
précipite la caséine (dans le cas du lait) et donc introduit la coagulation). Comme dans
plusieurs d’autres cas il peut se produire des interactions entre cellules ou entre EPS et
certains composants comme la caséine (Bouzar et al., 1996).
On à la mesure directe dans le milieu de culture « viscosité apparente » ou bien à partir
d’un échantillon purifié, resuspendu dans de l’eau distillée « viscosité intrinsèque ».L’unité
fondamentale de mesure de viscosité est le «poise» ou le «centipoise». Alors que l’unité de
45
mesure de viscosité du système internationale qui est souvent utilisée conjointement avec
le système métrique est
le «pascal-seconde» (Pa*s) ou «millipascal-seconde* » (mPa*s)
(Dupont, 1998).
15.5. Méthodes de purification des EPS :
L’étude caractéristique des EPS exige un isolement qui n’altère ni les propriétés chimiques
ni celles physiques des échantillons d’EPS.
Au fur et à mesure que la complexité du milieu de culture augmente, une purification
additionnelle est nécessaire (Ruas-Madiedo et de los Reyes-Gavilan, 2005).
L’extraction des EPS dans le lait est plus compliquée ; les constituants du lait peuvent
interférer dans la précipitation des polymères et les EPS bactériens ont tendance à
s’associer aux protéines du lait pour former un complexe glycoprotéique (figure20 ). II faut
alors hydrolyser les caséines avec des enzymes spécifiques et bien purifier les polymères
recueillis par une précipitation à l’éthanol (Bouzar et al., 1997).
Figure 20 : modèle de gomme arabique avant et après traitement avec la pronase.
Pour cela on emploie surtout la chromatographie échangeuse d’ion sur colonne, pour
séparer les EPS des acides téichoïques et les acides nucléiques ; comme on emploie des
méthodes enzymatiques telle : la Dnase, la Rnase et la protéase (Gorska et al., 2013).
16.Quantification des EPS :
La quantification des glucides peut se faire par des méthodes colorimétriques dont
souvent on utilise la méthode du phénol/acide sulfurique ;
celles-ci sont largement
employées en raison de leur rapidité, simplicité et faible coût. (Dubois et al., 1956 ; RuasMadiedo & de los Reyes-Gavilan, 2005 ; Amatayakul et al., 2006) ou des méthodes de
46
chromatographie d’exclusion moléculaire permettant la séparation des biopolymères selon
la taille (Looijesteijn et al., 2000).
17.L’analyse des polysaccharides :
Il est important de connaître la composition et la structure tridimensionnelle des EPS, pour
bien comprendre leurs propriétés physicochimiques et par conséquence leurs fonctions;
sauf qu’une seule méthode analytique n’est pas suffisante. Diverses techniques sont
impliquées, mais; aucune compilation complète de ces méthodes analytiques n’a été mise
en main, actuellement.
Pour analyser, il faut d’abord l’extraction, puis la purification des EPS de la masse
bactérienne dont certains emploient la chromatographie échangeuse d’ions. En suite,
viennent les différentes méthodes d’analyse de masse par chromatographies :sur gel de
filtration , GC, HPLC, ou bien de structure qui impliquent plusieurs méthodes (résumées
dans le tableau ), surtout pour les carbohydrates complexes telles les techniques d’analyse
de sucre, analyse par méthylation (pour déterminer la configuration absolue GórskaFraçzek et al., 2013), dérivations chimiques, modifications chimiques ; les enzymes, analyse
élémentaire (C, H, N, S et P) polarimétrie, diffusion de la lumière, modélisation
moléculaire, spectroscopie infrarouge
transformée par Fourier , et analyse par
spectrométrie et RMN résonance magnétique nucléaire à haute résolution 1D et 2D : 1H 13C
31Pqui
incluse les méthodes d’analyse bidimensionnelle par les méthodes 1H,1H COSY,
TOCSY, NOESY, et 1H,13C HSQC, HMBC, méthodes complémentaires dont l’une renforce
l’autre (Vaningelgem et al., 2004 ; Van Clasteren, 2010 ; Vijayabaskar et al., 2011 ; Ahmed et
al., 2013 ; Gorska et al., 2013).
Habituellement, une détermination structurelle complète d’un carbohydrate inconnu porte
sur les stages suivants selon l’ordre dans lequel sont présentés :
-Détermination des constituants monosaccharides, leur configuration absolue (D ou L),
leur taille d’anneau et toute dérivation subie comme la sulfation, la méthyltion ou
l’acetylation ;
-Détermination de la taille moléculaire ou la distribution de taille moléculaire
47
-Détermination de la configuration anomérique des liaisons (α ou β)
-Détermination de la position de liaison entre les unités de monosaccharides
-Détermination de leur séquence, incluant tout modèle répétitif de structure et le degré de
toute hétérogénéité,
-Détermination de toute conformation préférée des pièces ou de toute molécule (s) présente
(Chaplin, 2008 ; Van Clasteren, 2010).
Avant, le travail analytique a porté sur l’utilisation de la chromatographie sur papier pour
séparer les sucres composants des polysaccharides hydrolysés par l’acide. Avec beaucoup
d’effort étant appliqué au choix des solvants de développement et de la méthodologie de
détection. Bien que la chromatographie sur papier soit facile et peu coûteuse. Elle peut
séparer une large variété de types structuraux ; y compris des oligosaccharides et quelques
polysaccharides, sans une dérivation antérieure et s’assure généralement, que tous les
composants soient détectés. Elle est seulement et rarement employée de nos jours. Puis, la
chromatographie sur papier a été développée en chromatographie en couche mince avec sa
plus grande puissance de résolution.
Ces méthodologies améliorées possèdent une puissance de résolution beaucoup plus
grande et une quantification améliorée. Mais ; elles sont peu employées dans l’analyse
moderne d’hydrate de carbone, indépendamment de leur utilité importante pour séparer
des glycolipides, généralement excellé par des techniques à rendement élevé de
chromatographie liquide (Chromatographie liquide sous haute pression).
Tableau 3 : les méthodes analytiques majeures des carbohydrates (d’après Chaplin M. F, 2008) :
Monosaccharides
Les essaies colorimétriques, chromatographie en phase gazeuse/ spectrométrie
de masse, chromatographie échangeuse d’ion haute performance.
Oligosaccharides
Résonance nucléaire magnétique RMN, spectrométrie de masse, analyse par
méthylation, chromatographie échangeuse d’ion haute performance.
Polysaccharides
Clivage enzymatique, analyse par méthylation, chromatographie d’exclusion
plus la méthode de dispersion de lumière laser en multi-angle,
48
Figure 21 : structure d’EPS de Lb.johnsonii 151 (Górska-Fraçzek et al., 2013).
On a aussi des méthodes de caractérisation physiques comme la détermination des
propriétés thermales par Calorimètre de balayage différentiel et plus détaillées par
l’analyse du thermogramme (Ahmed et al., 2013) ; en raison de la grande importance de ce
paramètre dans l’utilisation industrielle.
18.Utilisations des EPS des bactéries lactiques :
Parmi
certaines
applications
commercialisées
des
polysaccharides
qui
ont
été
réalisées dans le domaine : de la cosmétique, de l’analytique, et celui médicale (Rendueles
et al., 2013).Cependant, beaucoup d’autres tests mériteront d’être réalisés en formulation
alimentaire ou non alimentaire. Surtout, si on souhaite profiter des propriétés très
spécifiques de ce polymère en milieux aqueux. Des tests réalisés en agronomie suggèrent
aussi des applications dans le domaine de l’irrigation, problème d’avenir pour notre
planète.
Mais au fait du faible rendement en EPS produits chez la majorité des bactéries lactiques,
leur exploitation commerciale n’est pas très répandue (Badel et al., 2011). Sauf quelques
exceptions pour des HoPS ; comme les dérives de dextranes et des dextranes activés qui
retrouvent une large utilisation commerciale (produits de gels de filtration, comme unités
d’extension du volume de sang et pour améliorer le débit sanguin ; améliorants de pates ;
stabilisateurs de sirops alimentaires ; rétablissement des huiles). Le levane peut aussi être
impliqué comme bioépaississala nt alimentaire (De Vuyst et al., 2001). Ils sont intégrés
dans l’amélioration de la texture, de la viscosité des produits laitiers fermentés: fromages,
crèmes fermentées et surtout les divers types de yaourts (Gorska et al., 2013) ; aussi bien,
pour prévenir la synérèse (Hutkins, 2006).
49
Dans le cas du yaourt, les propriétés du gel sont affectées par : les ingrédients lors de sa
préparation, la façon dont la préparation de yaourt est traitée, l’activité de culture ; et des
facteurs de post-fermentation. Par exemple, le traitement thermique approprié au lait a un
effet profond sur la force du gel et spécifiquement, sur la capacité de rétention d’eau. Si le
gel est mal formé ou abrupte la synérèse se produira, menant au défaut connu sous le nom
de « wheying off ».
Le lait coagulé est essentiellement un gel de protéine qui donne la viscosité, l’effet dans la
bouche et le corps au produit fini. La formation et l’entretien de la structure de gel sont
donc importants pour la qualité de yaourt. Ainsi, dans le cas des yogourts brassés
additionnés de fruits, la présence de polysaccharides empêche que ceux-ci ne se déposent
au fond. Cependant, pour contrôler la synérèse et de maintenir une structure appropriée
du gel, généralement les fabricants de yaourt aux Etats-Unis ajoutent des stabilisateurs au
mélange ; qui sont typiquement des polysaccharides hydrophiles pour lier l’eau (Hutkins,
2006). Ainsi ; au Canada on emploie souvent l’amidon modifié pour ce défaut de qualité,
mais, les problèmes restent toujours (Gentès, 2011).
Parfois, on implique carrément ces bactéries lactiques elles même comme bio-épaississants
et des stabilisants à la place des polysaccharides d’autres origines; notamment, pour leur
statut GRAS (generally recognized as safe) (Mende et al., 2012). En faite, l’utilisation de
souches productrices d’EPS comme ferments du yaourt est plus intéressante, pour
améliorer la rétention d’eau à fin de diminuer la synérèse, améliorer la viscosité et qui
peut remplacer le gras ; avec un choix de souche à combiner en co-culture dans le ferment
bien et adapté au produit final ainsi, une combinaison de Lb. bulgaricus filantes et Str.
thermophilus non filantes à donner de bons résultats (Lapointe, 2009).
Ce qui est davantage, c’est que certains auteurs affirment que : la structure des EPS
produits par les différents microorganismes, leur composition, leur masse moléculaire, leur
conformation spatiale et leurs interactions avec les protéines ; seraient responsables de ces
effets plutôt que de la concentration produite (Duboc & Mollet, 2001 ; Gentès, 2011).
Dans le contexte médical, on trouve certaines applications des EPS bactériens à propriété
anti-biofilme lorsqu’on est face aux tolérances aux antibiotiques « un souci croissant ». On
a essayé d’exploiter ces EPS anti-adhésion qui modifient les propriétés physiques des
50
surfaces biotiques (cellules Gram positif et Gram négatif), et donc selon plusieurs études
l’effet des antibiotiques peut être renforcé contre ces biofilmes ; en les administrant
ensemble avec ces EPS anti-adhésion qui pourront rompre des interactions cellule-cellule
ou même cellule-surface biotique (figure 22A).
D’une autre part, ces EPS modifient les propriétés physicochimiques même des surfaces
abiotiques (ex : surfaces de glasses, surfaces de polystyrène) alors on les a utilisé comme
couvertures ou couches de protection contre la formation des biofilmes, (figure22 B). Ce
qui pourraient être employé sur les appareils médicaux laissés dans un organe (les
cathéters veineux totalement implantés et la tuyauterie de silicone) ou les arrangements
industriels (tubes industriels).
De ce fait, ces bactéries produisant des polysaccharides d’anti-adhésion ont pu être
employées en tant que probiotiques concurrents des microbes pathogènes. Par exemple
dans l’appareil gastro-intestinal ; comme dans le cas des EPS-r de L. acidophilus qui ont
inhibé l’attachement de E. coli O157 :H7 aux cellules humaines du colon adenocarcinoma
HT-29 cultivées. D’ailleurs, des oligosaccharides biodégradables sont actuellement
employés comme prébiotiques pour conférer aux avantages de santé (figure 22C)
(Rendueles et al., 2013).
A
B
C
.
Figure 22 : les applications potentielles du polysaccharide anti-adhésion : A.adjuvants,
B. couverture antiadhésive et C. Prébiotiques/Probiotiques. (d’après Rendueles et al., 2013).
51
19.Les effets non souhaitables des EPS :
Les polysaccharides excrétés par certaines souches peuvent avoir un impact négatif : par
exemple, la production de glucanes par Streptococcus mutans permet à la souche de coller
aux dents et participe à la formation de la plaque dentaire. La production de
polysaccharides par des souches de Leuconostoc ou de Pediococcus donne un aspect filant et
huileux au vin.
La sélection des souches mucoïdes lors de la fabrication de yaourt est cruciale et doit être
faite avec précaution ; pour ne pas compromettre le processus fermentaire. Etant donné
qu’une forte production d’EPS masque la saveur et les arômes et peut produire un yaourt
filamenteux. Mise à part, l’envahissement des autres souches acidifiantes non productrices
d’EPS, sachant que, souvent les souches productrices ne démontrent qu’une faible
production d’acides en début de croissance; ce qui peut compromettre la fermentation
(Dupont, 1998).
52
Matériel et méthodes
1.Origine des échantillons :
L’échantillon de Klila provenait de la wilaya de Msila.
L’échantillon du Raib provenait de la ville d’Ouanougha wilaya de Msila.
L’échantillon de margine d’olive fermentée était recueilli de la wilaya de Tlemcen.
L’échantillon du levain naturel servant à fabriquer le pain est obtenu par
fermentation spontanée de farine et d’eau.
2.Milieux et solutions biologiques utilisés :
Milieu MRS (mis au point par Man Rogosa et Sharpe 1960) gélosé et liquide pH 5.4
pour isolement et purification des Lactobacilles ; en raison de leurs exigences
nutritionnelles.
Milieu M16 BCP Pour la recherche de l’arginine dihydrolase « ADH » (Thomas,
1973),
MSE (Mayeux Sandine et Elliker, 1962),
Milieu MRS BCP : MRS sans extrait de viande ni Glucose,
Milieu kempler et Mc key (kempler et Mc key, 1980) KMK,
Milieu Clark et Lubs (Avril et al., 1992),
Eau physiologique (8.5g NaCl /l),
Tampon phosphate,
Lait écrémé,
Milieu plate count agar PCA au lait,
Milieu agar au tween 80,
Bouillon nutritif pour la culture des bactéries indicatrices pathogènes,
Muller Hinton (Muller et Hinton 1941).
3.Isolement et purification des souches de Lactobacillus :
L’isolement s’effectue par ensemencement en profondeur sur boites (de gélose MRS
acidifiée (pH 5.4) et de gélose MRS au CaCO3) ; de 1ml des dilutions 10-4 , 10-5 pour chacun
des échantillons de Klila et des margines ; et des dilutions 10-6 , 10-7 pour chacun des
échantillons de levain de panification et de Raïb, le milieu en surfusion (45°C), ensuite les
boites séchées sont incubées à 30° pendant 24 à 48 h en anaérobie.
On choisit de la gélose MRS acidifiée les colonies typiques des Lactobacilles (lenticulaires, à
pourtour régulier) et du MRS au CaCO3 celles entourées d’un halo transparent du à
53
l’acidification du milieu par dépôt du calcium, on repique sur bouillon et on incube à 30°C
pendant 24h en anaérobie, le développement d’un trouble bactérien au fond des tubes
témoigne d’une croissance.
La purification se fait par repiquages, successifs sur MRS gélosé en incubant toujours à
30°C pendant 24 à 48h ; jusqu’à obtention de colonies uniformes, de la même couleur
renseignant sur la pureté des souches.
4. Pré-identification des souches de Lactobacillus :
La pré-identification a reposé sur deux étapes :
La première consiste en l’identification par les méthodes classiques du genre ; dont le
Gram, test catalase, type fermentaire à partir du glucose et du gluconate, étude de la
croissance à 15 et 45°C. Les bactéries présumées Lactobacillus subissent la deuxième étape
d’identification d’espèce ; qui étudie le métabolisme azoté par la recherche de l’arginine
dihydrolase « ADH », le métabolisme des carbohydrates par l’étude du profil fermentaire
sur 19 sucres. Le résultat est comparé à plusieurs recommandations de classification des
bactéries lactiques, selon : Carr et al., (2002) ; Axlesson, (2004) ; Hammes et Hertel (2006).
4.1. Le type fermentaire :
4.1.1. A partir du glucose
La recherche des types fermentaires est conduite à partir de cultures bactériennes de 18h,
dans des tubes de bouillon MRS au fond desquels on a des cloches de Durham ; qu’on
incube pendant 24h à 30°C en anaérobiose.
4.1.2. A partir du gluconate
Le même protocole est procédé pour conduire la recherche du type fermentaire à partir du
gluconate, qui particularise le métabolisme homofermentaire obligatoire (absence de gaz)
du facultatif (présence de gaz) sauf que le glucose était remplacé par le gluconate de
sodium (Axlesson, 2004).
54
4.1. Croissance à différentes températures :
Il a pour objectif de différencier
les bactéries lactiques mésophiles des thermophiles.
L’effet de ce paramètre sur la croissance des souches était conduit dans du bouillon MRS,
incubé à 15 et 45°C pour 24 h en anaérobiose.
4.2. Test de l’arginine dihydrolase (ADH) :
La recherche de l’enzyme arginine dihydrolase (ADH) est
intéressante pour la
caractérisation des bactéries lactiques. Cette enzyme libère l’ammoniac et la citruline à
partir de l’arginine.
4.3. Profils fermentaires des isolats :
Etudiés sur 19 sucres : Amidon, L et D-arabinose, Cellobiose, D-Fructose, D-glucose, Dgalactose, Lactose, Maltose, Mannitol, Sorbitol, Sucrose, L-Rhamnose, D-Raffinose, Ribose,
Tréhalose, et D-xylose.
Des cultures jeunes sur MRS sont centrifugées à 6000 trs pendant 10min, le culot est rincé
au tampon phosphate à pH 6.8, une à deux fois, puis on y ajoute dessus du MRS BCP, pour
répartir sur des tubes contenant 1ml de milieu MRS BCP, plus 0.1 ml de chacun des sucres
déjà cités (en raison de 10% dans le milieu). On incube à 30°C, pendant 24 à 48h en
anaérobiose.
4.4. La pré-identification sur API 50 CH et API 20 Strep :
La galerie API 50 CH (de Biomerieux) composée de 49 microtubes contenant des substrats
déshydratés appartenant aux carbohydrates et dérivés (hétérosides, polyalcools et acides
uroniques), pour permettre l’étude du métabolisme des microorganismes. Notamment, les
bactéries lactiques. Le premier microtube sans principe actif sert de témoin négatif.
La galerie API 20 Strep composée de 10 microtubes qui contiennent des carbohydrates. Un
permettant d’étudier la production d’acetoine et l’autre décelant la possession de l’enzyme
Arginine dihydrolase.
Le milieu d’inoculation de la culture bactérienne consiste en MRS sans extrait de viande ni
de glucose, additionné de Pourpre de Bromocrésol (BCP) comme indicateur de pH.
55
5. Etude de quelques aptitudes technologiques des Lactobacilles isolés:
5.1. Etude de la thermorésistance :
On ensemence les souches lactiques dans du MRS liquide puis ils subissent un chauffage à
63,5°C au bain Marie pendant 30 min puis on incube à 30°C pendant 24h à 48h (Badis et al.,
2004).
5.2. Test de croissance à différentes concentrations en NaCl et à différends pH :
On utilise pour ce test des milieux MRS à 2%, 4% et 6.5% de NaCl, dans lesquels en
ensemence la souche bactérienne. Il nous permet de déterminer la résistance de la souche
au stresse dite halin (Badis et al., 2004).
Pour les différents pH on ensemence les cultures de 18h sur MRS à pH 4, pH 6,8 et à pH 9.
On incube à30°C pendant 48h à 72h.
5.3. Pouvoir protéolytique :
L’aptitude à la protéolyse des caséines du lait des différentes espèces de Lactobacillus est
recherchée sur milieu MRS liquide, dont la peptone est remplacée par la caséine du lait.
L’appréciation de l’activité protéolytique se fait par l’apparition d’un coagulum du à
l’hydrolyse de la caséine (Badis et al., 2004).
Pour confirmer on a évalué sur milieu PCA à 5%, MRS à 3% et à 5%de lait écrémé (Moulay
et al., 2006) en mesurant les diamètres de l’hydrolyse appréciés par la zone claire autour
des colonies ; ensemencées à partir de cultures de18h et incubées à 30°C pendant 24h en
anaérobiose.
5.4. Pouvoir lipolytique :
Cette aptitude est décelée sur milieu agar au Tween (Guessas et al ; 2012). On ensemence
des cultures jeunes de 18h, on incube à 30°C pendant 24h en anaérobiose, les souches qui
dégradent le tween sont entourées d’un halo transparent du au dépôt des cristaux du sel
de calcium formé par libération des acides gras libérés par les enzymes ou un précipitât
autour de la colonie du à la dégradation complète des acides gras.
56
5.5. Production de composés aromatiques :
La production de l’acétoïne (acétylméthylcarbinol) est testée sur milieu Clark et Lubs ; les
cultures de 18, ensemencées puis incubées à 30°C pendant 24h en anaérobiose, par la
réaction de Vogues-Proskauer dite réaction de V.P (Avril et al., 1992).
Ainsi, le lait écrémé est employé pour le même but, on y ensemence des cultures jeunes et
on incube en anaérobie à 30°C.
VPI (NaOH à16%) et VPII (α-naphtol à 6% alcool) sont les deux réactifs qui permettent
après incubation de détecter la production de composés aromatiques.
5.6. Utilisation de citrate en présence de sucre fermentescible :
Le citrate est transporté à l’intérieur des cellules par une citrate-perméase, où il est scindé
en acétate (en majeure partie excrétés) et en oxaloacétate par le complexe enzymatique
citrate-lyase.
L’oxaloacétate est ensuite converti en pyruvate et en CO 2 par une oxaloacétate
décarboxylase. Des transformations successives du pyruvate aboutissent à la formation de
composés aromatisants et le produit fini est le 2,3-butylène-glycol (2,3-butanediol).
Cette propriété est étudiée sur milieu Kempler et Mc Key (KMK) ; qui contient un mélange
de deux solutions aqueuses : ferricyanide de potassium à 10% (p/v) et citrate de fer et
citrate de sodium à 2,5% (p/v). Le citrate a pour rôle d’inhiber la réaction entre l’ion
ferrique et le ferricyanide de potassium. L’apparition de colonies à couleur bleu-vert après
une incubation de 2 à 3 jours à 30°C indique une fermentation de citrate en lançant la
réaction entre les ions et le bleu de bromothymol ; tandis que les colonies qui gardent leur
couleur normale étant incapables de fermenter le citrate.
5.7. Etude du pouvoir acidifiant :
L’évaluation est réalisée par le dosage de l’acidité Dornic du lait ensemencé à 1%par des
pré-cultures bactériennes à partir de cultures de 18h ensemencées dans du milieu MRS
liquide , par titrimétrie (titrage de 10 ml d’échantillon de culture avec la soude NaOH N/9
en présence de 5gouttes de phénolphtaléine) jusqu’au virage de la couleur au rose pâle
persistant au moins 10 secondes vis-à-vis la mesure du pH du milieu par un pH-mètre en
57
fonction du temps ; les intervalles de temps d’incubation (à 30°C) et de la mesure étaient de
deux heures, (0 h, 2h, 4h, 6h, 8h…..18H et 24h).
L’acidité est déterminée par la formule : Acidité (°D) = V NaOH x 10.
Où : V NaOH : Volume de NaOH utilisé pour titrer l’acide lactique contenu dans les 10 ml de
lait écrémé.
L’acidité est exprimée en degré Dornic ou 1°D =0.1 g/l d’acide lactique produit.
5.8. Etude des interactions bactériennes :
5.8.1. Entre bactéries lactiques et souches pathogènes :
5.8.1.1. La méthode directe :
Selon la méthode modifiée de Barefoot et Klaenhammer (Spot Agar Test), (1986) ; des
boites de MRS solide sont ensemencées par les souches lactiques à tester en touche (Spot),
incubées à 30°C pendant 24h en anaérobiose. Des cultures de 18h des souches indicatrices
pathogènes référenciées provenant du laboratoire de Microbiologie fondamentale et
appliquée : Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, Listeria
monocytogenes ATCC 33090 et Enterococcus faecalis ATCC 2035 sont préparées en parallèle ;
ensemencées dans le bouillon nutritif et incubées à 37°C pendant 24h.
Des tubes de 7ml de Mueller Hinton semi solide (0.7% agar) en surfusion sont ensemencés
avec 0.5 µl des cultures jeunes des souches indicatrices pathogènes puis chaque boite Pétri
de la gélose MRS ensemencée en touches reçoit une des souches indicatrices en coulant le
tube à la surface. On laisse sécher puis on incube les boites à 37°C en aérobiose de 24 à 48h.
Les zones d’inhibition sont apparaissent en halos clair autour des souches ensemencées
(spots) ; la lecture des résultats se fait par mesure de leurs diamètres. Ce test a été répété
deux fois pour chaque souche indicatrice étudiée.
5.8.1.2. La méthode indirecte :
L’activité inhibitrice du surnageant natif et celui ajusté à pH entre 6.5 et 7 (afin d’éliminer
l’effet de l’acide lactique), est également évaluée par l’application de la technique de
diffusion sur gélose décrite par Barefoot et Klaenhammer (1986) :
58
On utilise le surnageant obtenu par centrifugation à 10000 trs pendant 10min, de
l’inoculum de la bactérie lactique qu’on veut tester. Le surnageant obtenu est divisé en
deux volumes dont le premier est dit surnageant natif, et le deuxième est ajusté à pH 6.5 à
7 avec du NaOH (2N) ; filtrés sur millipore (de 0.45 µm) les surnageant sont ensuite
déposés dans des puits de 5mm de diamètres, d’une gélose MH ensemencée auparavant
par écouvillonnage par une des souches indicatrices pathogènes référenciées utilisées
précédemment, la base des puits est bouchée par 10µl de gélose MH.
Chaque boite ensemencée par une souche pathogène reçoit 5 surnageants de cultures de
bactérie lactique. Chaque puits reçoit 100µl de surnageant. Après incubation 24h à 37°C en
aérobiose, les diamètres des zones d’inhibition sont mesurés.
5.8.2. Entre bactéries lactiques :
Selon la méthode de Fleming et al., (1975), des boites de MRS solide sont ensemencées par
les souches lactiques à tester en touche (Spot), incubées à 30°C pendant 24h en anaérobiose.
Des cultures jeunes des souches indicatrices
lactiques sont
préparées en parallèle ;
ensemencées dans le bouillon MRS et incubées à 30°C pendant 24h en anaérobiose.
Des tubes de 7ml de MRS semi solide (0.7% agar) en surfusion sont ensemencés avec 0.5 µl
des cultures jeunes des souches indicatrices lactiques puis chaque boite Pétri de la gélose
MRS ensemencée en touches reçoit une des souches indicatrices en coulant le tube à la
surface. On laisse sécher puis on incube les boites à 30°C en anaérobiose de 24 à 48h.
5.9. Pouvoir texturant :
5.9.1. Production des EPS :
La production des EPS était évaluée selon différentes méthodes référenciées, dont certaines
sont qualitatives et d’autres sont quantitatives.
Les méthodes qualitatives étaient conduites sur milieux surtout solides : Mayeux, Sandine
et Elliker (MSE), MRS normal et MRS modifiés: à 5% lactose, à 5%sucrose et à 5%glucose ;
sur milieu au colorant de détection : milieu au rouge de ruthénium et sur le milieu
Chalmers agar modifié.
59
 Le milieu MSE pour la détection du dextrane, ayant contenu le sucrose et le Glucose
comme sources de carbone le premier est en forte concentration (10%) alors que le
deuxième est à 5%.
 Le milieu MRS pour détecter les souches productrices des homopolysaccharides tant que
des héteropolysaccharides à partir du glucose comme seule source de carbone (à 2%).
 Le milieu MRS modifié à 5% des sucres (Lac, Glu et Suc) permet de détecter les souches
fortement productrices d’EPS à partir de différentes source de carbone.
 Sur milieu semi-synthétique au rouge de ruthénium approprié à la détection des bactéries
productrices d’EPS, tel que rapporté par Bouzar et al., (1996) ; les cultures de 18h des
souches sont ensemencées à la surface des boites et incubées à 30°C pendant 24h-48h, les
colonies qui apparaissent en rose sont considérées comme souche non visqueuse et les
colonies qui apparaissent en blanc sont considérées comme souche visqueuse productrice
d’exopolysaccharides.
 Le milieu Chalmers Agar modifié à 5% des sucres suivants : sucrose, glucose, fructose et
lactose (Palomba et al., 2012). Après ensemencement par des cultures jeunes sur chacun
des milieux cités, on incube à 30°C en anaérobiose pendant trois jours, on teste le
phénotype des souches visqueuses productrices de longs filaments visibles par une anse ou
par cure-dent stérile.
 Sur milieu MRS saccharosé à 5% (sans peptone, ni glucose), une culture de 18h est cultivée
à 30°C pendant 24h, après centrifugation à 4600 tours durant 30min ( à 4°C) ; on mélange
1volume de l’éthanol brute à 96° avec 1volume du surnageant dans des tubes en verre
bien propres, l’apparition d’une opacité à l’interface révèle la présence des EPS, les isolats
sont classés selon l’intensité de l’opacité : ++ pour une bonne production ; + pour une
faible production et ± pour une pauvre production (Lingani et al., 2010).
 On a même étudié la production d’EPS sur lait écrémé par l’appréciation du gel formé et le
caractère visqueux présenté. La viscosité du lait fermenté est évaluée en mesurant le temps
de son passage à travers un entonnoir en plastic d’une capacité de 33 cc à température
ambiante; ainsi, on détecte la formation du filament en touchant avec une anse stérile.
60
 Test quantitatif et estimatif du taux de la production des EPS :
Le screening initial a été poursuivi en réalisant : la production et la purification des
polymères en vue de leur quantification.
La méthode de Shutten et al., (1999) consiste en la mise en évidence de souches
productrices d’EPS sur milieu MRS à une teneur très élevée (10%) des sucres suivants :
glucose, fructose, sucrose et lactose.
Apres ensemencement de 10 ml de chaque milieu à 1% par des cultures jeunes, on incube à
30°C en anaérobiose pendant trois jours.
On extrait les EPS par méthode de précipitation à l’éthanol : on centrifuge 1ml de
suspension (11000g par 4min), on ajoute deux volumes d’éthanol frais à un volume de
surnageant, on laisse précipiter toute la nuit à 4°C.
Le précipitât est collecté par centrifugation (2000/15min) resuspendu dans 1ml d’eau
déminéralisée. Apres précipitation avec deux volumes d’éthanol et centrifugation, le culot
est séché à 55°C puis le précipitât est pesé. On exprime la masse sèche des carbohydrates
totaux en milligrammes par millilitre (mg/ml).
5.9.2. Extraction, purification et quantification des EPS :
La méthode utilisée pour l’évaluation de la production des EPS est conduite sur bouillon
MRSs à 10%. On ensemence le milieu à 3% pour chaque culture jeune et l’incubation se fait
à 30°C en anaérobiose pendant 48h.
Des leur récupération de l’incubateur, les tubes sont placés au bain marie à 100°C pendant
10min. L’extraction est faite selon Ismail et al., (2013): 10ml de suspension est centrifugée à
15000 trs pendant 15min, à 4°C le surnageant est récupéré sur lequel on ajoute 2volumes
d’éthanol frais à 95° puis on laisse précipiter à 4°C toute la nuit.
On centrifuge à 2500trs pendant 20min, puis le culot est dissout dans de l’eau pure, on
ajoute 2volumes d’éthanol à 4°C et on laisse précipiter puis on centrifuge à 2500 trs
pendant 10 min.
61
Cette méthode se base sur la purification totale de la solution EPS par la dialyse et
quantification selon la méthode de Dubois et al., (1956), qui est la plus sensible et la plus
précise.
Les échantillons sont dialysés contre de l’eau déminéralisée pendant 24 heures à 4°C. Avec
de fréquents changements d’eau (au moins deux fois par jour). Cette étape permet
d’éliminer les sucres résiduels, les sels et les acides aminés du milieu de culture.
Pour la quantification des EPS on suit la méthode de Phénol-Acide sulfurique de Dubois.
et al., (1956), qui repose sur le traçage d’une courbe standard à partir de dilutions réalisées
d’une solution stock (ou le glucose est le standard (1g /l)) (voir annexe),
Dans des tubes bien propres on met :
 800µl d’échantillon (généralement on met 50µl d’échantillon+ 750µl d’eau distillée),
 40µl de phénol à 80%,
 2ml d’acide sulfurique et on agite immédiatement par le vortex,
 On laisse refroidir à température ambiante ou bien au bain marie (à 23°C),
 On mesure l’absorbance à λ= 490 nm.
Le principe de dosage colorimétrique par mesure de l’absorbance en spectrophotomètre
(UV/ Visible) à une longueur d’onde λ= 490 nm, repose sur la proportionnalité de la
concentration en EPS avec la densité optique mesurée DO 490. De petites quantités de
carbohydrates peuvent être détectées et la présence de protéines ou de peptides n’influence
pas le dosage. Les quantités de polysaccharides sont exprimées en mg/l (ou en g/l)
d’équivalent glucose selon la courbe standard. Chaque échantillon est préparé deux à trois
fois.
6. La cinétique de croissance des souches Lb. plantarum (Lbl26), Lb.plantarum (Lbl57) et Lb.
acidophilus (Lbl61) :
On a étudié la cinétique de croissance bactérienne en fonction du temps chez les trois
souches : Lb. plantarum (Lbl26), Lb. plantarum (Lbl57) et Lb. acidophilus (Lbl61), permettant
une comparaison de leurs développements cellulaires.
Pour se faire, on ensemence à 1% des tubes de MRS, qui sont ensuite incubés à 30°C en
anaérobiose. A chaque point d’observation choisi (0, 2, 4, 18, 24 h), la croissance
62
bactérienne est suivie par dénombrement sur boite et l’acidification du milieu par pH
mètre.
On calcule d’après la phase exponentielle de la courbe de croissance les paramètres
d’évaluation du développement cellulaire :
µ : le taux de croissance spécifique (en heure-1 (h-1) et G : le temps de génération (temps
nécessaire au dédoublement cellulaire, en minutes (min).
µ= lnN2- lnN1/ t2-t1 ,
G= ln2/µ.
7. Optimisation des conditions de la production des EPS chez Lb.plantarum (Lbl26):
Dans cette partie on a formé des combinaisons entre les différents paramètres de croissance
bactérienne : température d’incubation (T°), pH du milieu de croissance) et la source de
carbone avec la même durée d’incubation. On a évalué la production d’EPS chez la souche
Lb. plantarum (Lbl26) sur MRS modifié
à 10% sucrose (MRSs), glucose (MRSG) et
lactose (MRSL); à deux differents pH : 5.4 et 6.2, à deux temperatures d’incubation : 30°C et
23°C pendant 48h d’incubation en anaerobiose, ainsi ; on a obtenu 12 combinaisons,
comme ce qui suit (en triple):
23°C
pH 5.4
Suc
pH 6.2
30°C
23°C
30°C
Pour se faire on ensemence les tubes de 111 ml MRS modifié à 1% d’une culture jeune de la
souche Lb. plantarum (Lbl26) et l’incubation se fait en anaérobiose.
63
La purification des EPS est procédée selon Ismail et al., (2013), et leur quantification est faite
selon Dubois et al., (1956).
8. Etude de la cinétique de production des EPS en fonction de la croissance bactérienne
chez Lb.plantarum (Lbl26) :
La cinétique de production des EPS est étudiée sur milieu MRSs, pour la souche
considérée comme fortement productrice d’EPS : Lb. plantarum (Lbl26), en fonction de sa
croissance pendant 48h.
On ensemence à 1% des tubes de MRS, ils sont ensuite incubés à 30°C en anaérobiose. A
chaque point d’observation choisi (0, 3, 6, 12, 18, 24, 48 h), la croissance bactérienne est
suivie par dénombrement sur boite. Entre autre; pour la production des EPS ; 10 ml sont
prélevés pour procéder selon le protocole de l’extraction et de la purification de Ismail et
al., (2013) et de la quantification selon Dubois et al., (1956).
9. Etude de quelques aptitudes probiotiques :
9.1. Résistance aux antibiotiques :
La méthode d’application des disques sur milieu solide, selon de Leory et al.,
(2007) ; modifiée; on ensemence par écouvillon la boite de l’inoculum bactérien de chacune
des souches : Lb. plantarum (Lbl( 22,24,26 et57), Lb. casei (Lbl60) et Lb. acidophilus (Lbl61), on
laisse sécher les boites puis on y dépose les 12 disques d’antibiotiques sur dessus :
Amoxicilline 25 µg (AMX), Pénicilline (P6) 6 µg et (P 10) 10µg, Vancomycine 30µg (VA),
Oxacilline 5 µg (OX 5), Gentamicine 10 µg (GM) , Ampicilline 10 µg (Amp 10), Cifotaxime
30 µg (CTX 30), Azithromycine 15 µg(AZM), Fosfomycine 50 µg (FOS), acide fusidique 10
µg (FA), acide nalidixique 30 µg (AN 30).
Le résultat est évalué par diamètres d’inhibition de la croissance des bactéries testées
exprimé en millimètres (mm).
La capacité à résister à l’acidité gastrique est déterminée selon la méthode de Hydrominus
et al., (2000) modifiée. Avant de réaliser ce test, on prépare une culture jeune sur bouillon
MRS. Le culot bactérien de la culture est récupéré par centrifugation à 10000 g pendant
64
4min, puis les cellules sont suspendues dans 10 ml du bouillon MRS ajusté à pH2 et le
témoin est ensemencé à pH5.4.
La résistance des souches à ce facteur hostile est estimée par dénombrement des cellules
sur boites ; avant et après deux heures d’incubation (T 2h) à 30°C en anaérobiose ; le taux
de survie est calculé par l’équation suivante :
Taux de survie (%) = logUFC à T 2h / logUFC à T 0h x 100.
Selon la méthode modifiée de Hydrominus et al., (2000) : on prépare en la culture
bactérienne sur bouillon MRS. Le culot bactérien des cultures jeunes est récupéré après
centrifugation à 10000 g pendant 4min, puis les cellules sont suspendues dans 10ml du
bouillon MRS à 5 % de sels biliaires et ajusté à différentes valeurs de pH (pH2 et pH 8,5).
Le nombre de cellules viables est déterminé à Temps zéro heure. Les tubes sont par la
suite incubés pendant 2h à 30°C.
Taux de survie (%) = logUFC à T 2h / logUFC à T 0h x 100.
65
Résultats et discussion
1. Isolement et purification des Lactobacilles :
L’isolement et la purification d’un total de quarante souches étaient conduits sur milieu
MRS, les colonies en profondeur de la gélose se sont apparues lenticulaires, d’un pourtour
régulier, de couleur beige (figure23).
Figure 23 : aspect macroscopique des colonies de bactéries lactiques : 1.dilution 10-4 ; 2.dilution 10-5
et 3.dilution 10-6 du MRS au CaCO3.
Dépourvues de la catalase (tableau 4); ces bactéries sont ainsi présumées des bactéries
lactiques.
L’observation des colonies de l’ensemble des souches étudiées révèle un aspect presque
semblable : elles sont lisses, légèrement bombées, régulières, translucides ou opaques, de
taille plus ou moins importante (2 à 3mm) et de couleur généralement blanche ou crème
(figure 24).
Figure 24 : pureté des souches sur milieu solide.
La sélection de souches productrices d’EPS a été réalisée sur milieu MRSs (ou le glucose est
substitué par sucrose à 5%) (Figure 42c), dont la majorité des souches productrices,
appartenaient au genre de Lactobacillus ; Sous microscope, les cellules bactériennes
apparues en forme de bâtonnets à Gram positif, isolées, disposées par paires ; ou en petites
chaînettes (figure 25).
66
Figure 25 : aspects microscopiques après coloration de Gram des souches Lbl60 et Lbl23 (Gr X
1250).
2. Pré-identification des isolats de Lactobacilles :
2.1. Selon le groupe :
D’après l’analyse des résultats (tableau 4), les souches de Lactobacillus ont montré presque
les mêmes caractères biochimiques et physiologiques.
Parmi les souches de Lactobacillus, Lbl (21, 22, 23, 24, 25, 26, 55, 56, 57, 58, 59 et 60) sont
classées dans le groupe Streptobactrium
du fait qu’elles soient (héterofermentaires
facultatifs), et qu’elles ne possèdent pas l’enzyme Arginine Dihydrolase (figure 27).
Les souches Lbl61, Lbl62 appartenant au groupe de Thermobacterium (homofermentaires
obligatoires). Les souches Lbl27 et Lbl28 sont classées parmi le groupe Betabacterium. Elles
se développent à 45°C et ne possèdent pas l’Arginine Dihydrolase.
L’ensemble des souches dégrade l’esculine (figure27).
a. production du gaz à partir du glucose.
b. production du gaz à partir du gluconate,
par la souche Lbl56.
Figure 26 : a et b, le type fermentaire des souches lactiques.
67
Figure 27 : test de l’ADH sur milieu M16 BCP des souches Lbl21 et dégradation de l’esculine.
Tableau 4 : Profil physiologique et biochimique des souches isolées.
Lbl21
Lbl22
Lbl23
Lbl24
Lbl25
Lbl26
Lbl27
Lbl28
Lb155
Lbl56
Lbl57
Lbl58
Lbl59
Lbl60
Lbl61
Lbl62
Lbl63
Lbl64
+ - - +
+ - - +
+ - - +
+ - - +
+ - + - - +
+ - - + - - + - - +
+ - - +
+ - - +
+ - - +
+ - - + - - + - - + - - + - - + - - Significations : (+) : test positif ;
homofermentaire ;
Esculine
6,5% NaCl
4%NaCl
2% NaCl
Croissance à pH9
Croissance à pH8
Croissance à pH4
Production d’acétoïne
Thermoresistance 63 ,5°/30min
Citrate
Croissance à 45°C
Croissance à 37°C
Croissance à 23°C
Croissance à 15°C
ADH
Catalase
Gram
Souches
Caractères physiologiques et biochimiques
+ + - - + + + + + + + + +
+ + - - + + + + + + + + +
+ + - - + + + + + + + + +
+ + - - + + + + + + + + +
+ + - - + + + + + + + + +
+ + - ± + + + + + + + + +
+ + + + + + + + + + + + +
+ + + + + + + + + + + + +
+ + - - + + + + + + + + +
+ + - - + + + + + + + + +
+ + - - + + + + + + + + +
+ + - - + + + + + + + + +
+ + - - + + + + + + + + +
+ + - - + + + + + + + + +
+ + - - + + + + + + + + +
+ + - - + + + + + + + + +
+ + - - + + + + + + + + +
+ + - - + + + + + + + + +
(–) : test négatif ; (±) : résultat intermédiaire ; homo :
héter : hetérofermentaire ;
68
2.2. Selon l’espèce :
2.2.1. Profils fermentaires des isolats
La comparaison des profils fermentaires (tableau 5, figure 28) révèle, une diversité d’espèce
de Lactobacillus isolées selon la classification de Carr et al., (2002) et Hammes et Hertel,
(2006).
Les souches appartenant au groupe Thermobacterium Lbl61 et Lbl 62 sont présumées : Lb.
acidophilus pendant que la souche Lbl59 est présumée Lb. helveticus.
Du groupe Streptobactrium on rencontre surtout l‘espèce Lb. plantarum : Lbl21, Lbl22, Lb23,
Lb24, Lb25, Lb26, Lbl57 et Lbl65, on trouve trois souches présumées Lb. casei : Lbl55, Lbl56,
Lbl58, Lbl60 et deux souches qui sont présumées Lb. curvatus : Lbl63 et Lbl64.
Les souches Lbl27 et Lbl28
du groupe Betabacterium se rapprochent de l’espèce: Lb.
cellobiosus.
69
D-Arabinose
Amidon
Cellobiose
D-Fructose
Glucose
D- Galactose
Lactose
Maltose
Mannitol
Mannose
Ribose
L-Rhamnose
D-Raffinose
Sorbitol
Sucrose
Tréhalose
D-Xylose
Lbl61
-
-
-
+
-
+
±
+
±
+
+
-
-
+
+
+
+
-
Lb.acidophilus
Lbl62
-
-
-
+
-
+
+
+
+
-
+
-
-
+
+
+
+
-
Lb.acidophilus
Lbl59
-
-
-
-
-
+
+
+
±
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Lb.helveticus
Lbl55
-
-
-
ND
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
ND
-
+
-
Lb.casei
Lbl56
-
-
-
+
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
-
+
-
-
Lb.casei
Lbl58
-
-
-
-
-
+
-
+
+
+
+
-
-
-
-
+
+
-
Lb.casei
Lbl60
-
-
-
-
ND
+
+
+
±
+
+
-
-
-
-
+
ND
-
Lb.casei
Lbl63
-
-
-
+
+
+
-
+
±
±
-
±
-
-
-
-
+
-
Lb.curvatus
Lbl64
-
-
-
+
+
±
±
+
±
±
+
±
-
-
-
±
-
-
Lb.curvatus
Lbl57
-
±
-
+
-
+
±
+
+
-
+
+
+
+
+
+
-
-
Lb. plantarum
Lbl24
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
±
-
-
+
+
-
Lb.plantarum
Lbl25
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
±
-
-
+
+
+
+
Lb.plantarum
Lbl 26
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
±
+
+
-
Lb.plantarum
Lbl27
-
-
-
+
-
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
+
+
-
Lb.cellobiosus
Lbl28
-
-
-
+
-
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
+
+
-
Lb. cellobiosus
Souches
Significations : (+) : test positif ;
(–) : test négatif ;
Présumées :
L-Aabinose
Tableau 5 : le profil fermentaire des differentes souches de Lactobacillus.
(±) : résultat intermédiaire, ND :non défini.
Figure 28 : sucres témoins (à gauche) du profil fermentaire de la souche Lbl26 (à droite).
70
2.2.2. Pré-identification sur API50CH et API20 STREP :
Deux souches ont été sélectionnées pour la confirmation de leurs profils fermentaires des
carbohydrates sur API 50CH : Lbl26 et Lbl60 qui sont considérées comme fortement
productrices d’EPS.
La pré-identification de la souche Lb. plantarum (Lbl26) était confirmée par galerie API
50CH (figure 29), le tableau 6 indique le résultat qui en comparaison avec le document
technique de microbiologie technique (2emme édition) révèle l’identité présumée Lb.
plantarum.
Sur API20 STREP, les deux souches Lbl57 et Lbl61 sont confirmées pour leur préidentification, les sucres déjà
testés (Ribose, Arabinose, Mannose, Sorbitol, Lactose,
Tréhalose, Raffinose, et Amidon) donnent le même résultat (figure 30, tableau7). En plus
du Glycogène et
l’Inuline qui sont négatifs chez les deux souches ; ils ne sont pas
fermentés.
Les deux tests : esculine et VP sont toujours les mêmes en comparaison avec le résultat
obtenu par les méthodes classiques : positifs.
71
Tableau 6 : résultat des profils fermentaires sur API 50 CH
Souches
Carbohydrates
Carbohydrates
Lbl26
Lbl60
Glycérol
-
-
Erythritol
-
D- Arabinose
Souches
Lbl26
Lbl60
Salicine
+
+
-
D- Celiobiose
+
+
-
-
D- Maltose
+
+
L- Arabinose
-
-
D- Lactose 1
+
+
D- Ribose
+
+
D- Melibiose
+
+
D- Xylose
-
-
D-Saccharose
+
+
L- Xylose
-
-
D- Trehalose
+
+
D- Adonitol
-
-
Inuline
-
-
Méthyl-ΒdXylopyranoside,
D- Galactose +
-
-
D- Mélézitose
+
-
+
-
D- Raffinose
-
-
D- Glucose
+
+
Amidon
-
-
D- Fructose
+
+
Glycogène
-
-
D- Mannose
+
+
Xylitol
-
-
L- Sorbose
-
-
Gentiobiose
+
+
L- Rhamnose
-
-
D-Turanose
±
-
Dulcitol
-
-
D- Lyxose
-
-
Inositol
-
-
D- Tagatose
-
-
D- Mannitol
+
+
D- Fucose
-
-
D- Sorbitol
±
-
L-Fucose
-
-
MDM
-
-
D- Arabitol
+
-
MDG
±
-
L-Arabitol
-
-
NAG
+
+
Potassium Gluconate
-
-
Amydaline
+
+
Potassium 2-cétogluconate
-
±
Arbutine
+
+
Potassium 5-cétogluconate,
±
-
Esculine citrate de
fer,
+
+
Pré- identifiée
Lb.
comme étant :
plantarum
Lb.
Casei spp.
rhamnosus
72
Figure 29 : test de fermentation des hydrates de carbone sur Api 50CH des souches Lbl26 et Lbl 60.
Figure 30 : profil fermentaire de la souche Lbl63 sur API20 STREP.
Tableau 7: résultats sur API 20 STREP.
VP Esc ADH Rib Ara Man Sor Lac Tre Inu Raf Glyg Amid Pré-identifiée :
Lbl57
+
+
-
+
+
+
+
+
+
-
+
-
-
Lb. plantarum
Lbl61
+
+
-
+
-
+
+
+
+
-
+
-
-
Lb. acidophilus
3. Etude de quelques aptitudes technologiques des Lactobacilles isolés :
Les résultats dans le tableau 4 résument cette étude :
73
Ainsi, on note que seules les souches Lb. plantarum (Lbl26) et Lb. cellobiosus (Lbl27, Lbl28)
résistent sous l’effet de température à 63.5°C, pendant 30min ; avec une faible croissance
après 72h d’incubation, les autres souches sont incapables d’y persister. A cet effet, elles ne
sont pas thermorésistantes, elles ne sont même pas thermophiles.
Entre autre, toutes les souches de Lactobacillus isolées marquent une résistance au stresse
halin allant jusqu’à 6.5% en NaCl. Alors que, les souches de Lb. plantarum, Lb. casei isolées
par Badis et al., (2004) n’ont pas résisté à la salinité élevée sauf Lb. helveticus. Pour l’effet de
la diversification en pH du milieu (pH 4 acide et pH 9 alcalin (figure a)) sur la croissance,
les souches s’y répondent très bien, ce qui compense la défaillance précédente.
Toutes les souches sont dites aromatiques ; d’après les résultats du test de la réaction de
Vogues Proskauer (dans le tableau 4) ; puisqu’elles produisent à partir du pyruvate des
composés responsables des aromes des produits laitiers ; comme l’acétoïne détecté par
l’apparition d’anneau rose-rouge à l’interface (figure 30 c).En plus, toutes les souches
utilisent le citrate en présence du glucose (figure 30b). Un critère très désirable en industrie
laitière puisqu’elles en produisent à partir le diacétyle.
Les souches Lb. plantarum (Lbl22, Lbl23 et 2Lbl4) dégradent la caséine du milieu MRS à la
caséine ; d’après l’apparition d’un coagulum dense (figure 30 d). Entre autre, les souches
Lb. plantarum (Lbl26, LBL65), Lb. casei (Lbl56, Lbl59 et Lbl60), Lb. cellobiosus (Lbl27, Lbl28) et
Lb. acidophilus (Lbl61, Lbl62) ont presque totalement dégradé la caséine avec une
importante production de coagulum qui a été précipité.
La souche est dite protéolytique si elle présente une zone de lyse de diamètre compris
entre 5 et 15 mm. Ainsi, sur milieu PCA à 5% lait écrémé toutes les souches s’entoure d’une
zone de protéolyse mais seules Lb. plantarum (Lbl26, Lbl57) et Lb. casei (Lbl56) qui exhibent
un grand halo allant jusqu’à 2mm de diamètre pour Lb. plantarum (Lbl26), Lb. casei (Lbl58)
et 2.5 mm pour Lb. casei (Lbl60). Les autres diamètres vont de 0.7 à 0.9mm (voir tableau 8).
Cependant, sur milieu MRS à 5% jusqu’à 10% de lait écrémé, le caractère protéolytique des
isolats est bien distinct. Les halos sont importants (entre13 et 20 mm de diamètre). Sauf la
souche Lb. casei (Lbl58) qui exhibe un faible diamètre de protéolyse. Les souches: Lb.
plantarum (Lbl25) et Lb. casei (Lbl60) représentent les diamètres les plus grands (20mm).
74
Ces résultats montrent que l’activité protéolytique dépend de la souche et qu’il existe une
relation entre la composition du milieu de croissance et l’expression de l’activité
protéolytique.
Le pouvoir lipolytique testé selon Guessas et al., (2012), sur milieu agar au tween 80
(tableau 8), est prononcé chez toutes les souches isolées : Lb. plantarum (Lbl (22,23, 24 ,25
,26 , 57), Lb. casei (Lbl56), Lb. cellobiosus (Lb27, Lbl28), Lb. acidophilus (Lbl61, Lbl62) et Lb .
curvatus (Lbl63,Lbl64), dont on note des zones de précipitation importantes (figure 31 f).
Les souches qui dégradent le tween 80 sont entourées d’un précipitât visible, du au dépôt
des cristaux de sel de calcium formé par la libération des acides gras libérés par les
enzymes ou un précipitât autour de la colonie du à la dégradation complète des sels des
acides gras, les diamètres des zones de précipitas chez: Lb. plantarum (Lbl21), Lb. acidophilus
(Lbl61 et Lbl62), sont petits. En comparaison avec les résultats de lipolyse des travaux de
Guessas et al., (2012), sur agar au tween 80, qui ne sont guère importants à signaler chez
toutes les souches de Lactobacillus. Car nulle n’a montré une aptitude dégradante.
Toutefois, la recherche du caractère par Karam et al., (2012), sur MRS au tween 80 à 3%
représente des résultats semblables. On considère que le résultat ainsi obtenu est fructueux
mais à faible concentration en tween 80 (0.25%).
Lbl62
Lbl27
Lbl56
Lbl26
Lbl26
Lbl61
Lbl55
Figure a : croissance sur MRS à pH 9.
Lbl 24
Figure b : utilisation du citrate en présence du glucose sur
KMK
Témoin Lbl25
VP-
Lbl26 Lbl63
Lbl56
VP+
==+=++
==+=
Coagulum précipité :
hydrolyse de la
caséine.
Figure c : production d’acetoine sur
Figure d : dégradation de la caséine du lait
milieu Clarck et Lubs et sur lait écrémé.
bovin par la souche Lbl27, témoin à gauche.
++
75
Lbl60
Lbl58
Lbl61
Lbl64
Lbl25
Lbl55
Lbl21
Lbl63
Lbl61
Lbl 28
Lbl22
Lbl56
557
Figure e : pouvoir protéolytique sur milieu MRS et PCA
Figure f : lipolyse sur milieu agar au
5% de lait écrémé.
Tween 80.
Figures 31 : a. b. c. d. e. f : études des aptitudes technologiques des souches.
Tableau 8 : activités protéolytique et lipolytique des Lactobacilles.
Diamètres (mm) Protéolyse sur
PCA à 5%
Protéolyse sur
Hydrolyse
MRS
de la caséine du lait
Lipolyse
(diamètre en mm) (diamètre en mm)
à 3%
à 5%
à10%
Souches
Lbl22
+
+
+
+
+
+
Lbl23
+
+
+
+
+
++
Lbl21
+
+
+
+
+
+
Lbl24
+
+
+
+
+
++
Lbl25
+
+
+
+
+
++
Lbl26
++
+
+
+
+
++
Lbl27
+
+
+
+
++
++
Lbl28
+
+
+
+
++
+
Lbl55
+
+
+
+
+
++
Lbl56
++
+
+
+
+
++
Lbl57
++
+
/
/
+
++
Lbl58
+
+
+
+
+
++
Lbl59
+
+
+
+
+
+
Lbl60
+
+
++
+
+
+
Lbl61
+
+
+
++
+
+
Lbl62
+
+
+
++
+
++
Lbl63
+
+
+
+
+
++
Lbl64
+
+
+
+
+
+
76
Significations : + : présence de caractère ; ++ : caractère fort.
3.7. Pouvoir acidifiant
Les figures A et B: 32, 33, 34, 35, 36, 37 révélant la cinétique d’acidification des différentes
souches de Lactobacillus, indique une diversité en pouvoir acidifiant qui dépond du
pouvoir protéolytique et de la capacité de métaboliser les différentes substances du milieu.
Les souches Lb. plantarum (Lbl26 Lbl22, Lbl24 et Lbl25) sont bien acidifiantes avec des
valeurs d’acide lactique très élevées (10, 10.5, 11.9 et 16.6 g/l), produites au bout de 24h.
La vitesse maximale de l’abaissement du pH du milieu est exercée par la souche Lb.
plantarum (Lbl24) (figure 32 A et B).
Les cinétiques des deux souches de Lb. cellobiosus (Lbl27 et Lbl28) sont presque semblables ;
sauf que, Lbl27 est un peu plus acidifiante que Lbl28 avec une valeur de 12.1 g/l d’acide
lactique produit (figure33.A et B).
Les souches Lb. casei (Lbl56 et Lbl60) abaisse le pH du milieu à 4.53 et à 3.63,
successivement. Le taux d’acide lactique produit est plus élevé chez Lbl56 (98g/l), que chez
Lbl60 (70g/l) (figure 34. A et B).
Pour les deux souches de Lb. curvatus, Lbl64 est la plus acidifiante avec une production de
10.5 g/l d’acide lactique et un abaissement de pH du lait jusqu’à 3. 63, par rapport à Lbl63
qui produit 80g/l avec un abaissement de pH jusqu’à 4.19 (figure 36 A et B).
La souche Lb. helveticus (Lbl59) est considérée très acidifiante elle produit 12.3g/l d’acide
lactique avec un abaissement de pH qui atteint 3.70 au bout de 24h (figure 37 A et B).
Le pouvoir acidifiant le plus bas est celui effectué par la souche Lb. casei (Lbl60) (70 °D).
L’abaissement du pH le plus remarquable est celui de la souche Lb. plantarum Lbl22 (figure
32.B).
Les souches Lb. plantarum (Lbl23), Lb. casei (Lbl60) et Lb. curvatus (Lbl63) ne sont pas trop
acidifiantes par rapport aux autres souches avec des valeurs en acide lactique de 79, 70 et
80 g/l, successivement.
77
8
A
B
pH
6
4
2
0
0
4 Temps
8 (h)
12
24
temps, des souches de Lb. plantarum (Lbl26, Lbl22, Lbl23, Lbl25, et Lbl26).
8
B
pH
6
4
2
0
0
2
4
6
10
Temps (h)
18
24
temps, des souches de Lb. cellobiosus (Lbl27 et Lbl28).
8
B
pH
6
4
2
0
0
2
4Temps
6 (h)8
18
24
temps, des souches de Lb. casei (Lbl56 et Lbl60).
78
8
B
6
pH
4
2
0
0
2
4 Temps
6 (h) 8
18
24
temps, des souches de Lb. acidophilus (Lbl61 et Lbl62).
8
B
pH
6
4
Lbl63
Lbl64
2
0
0
2
4 Temps
6 (h) 8
18
24
temps, des souches de Lb. curvatus (Lbl63 et Lbl64).
8
B
pH
6
4
2
0
0
2
46 Temps
8
10
(h) 18
24
temps, des souches de Lb. helveticus (Lbl59).
3.8. Etude des interactions bactériennes (antibiose) :
3.8.1. Entre les souches de Lactobacilles et les souches indicatrices pathogènes :
3.8.1.1. La méthode directe :
Les souches présentant une zone claire d’extension latérale supérieure à 0,5 mm sont
considérées comme productrices de substances antibactériennes (Fleming et al., 1975), alors
on considère que toute les souches de Lactobacillus isolées ont exhibé une activité
antagoniste vis-à-vis des quatre souches indicatrices pathogènes ; car les halos d’inhibition
79
allaient de 14 mm au minimum à 30 mm au maximum, de diamètres (résultats dans
l’annexe).
L’effet inhibiteur majeur est celui marqué par les souches Lb. plantarum (Lbl22, Lbl26, Lbl
27), Lb. casei (Lbl55), Lb. helveticus (Lbl59) et Lb. acidophilus (Lbl61) contre les quatre souches
pathogènes à des valeurs moyennement élevées entre 20 et 28mm. La souche Lb. casei
(Lbl55) est privilégiée. L’inhibition vis à vis de S. aureus la plus élevée est marquée par une
zone de 26 mm de diamètre par la souche Lb. helveticus (Lbl59); par rapport aux autres
souches, ainsi pour Lis. monocytogenes 26mm est le diamètre d’inhibition le plus élevé, pour
En. faecalis 23mm est le diamètre de zone d’inhibition maximal sur tout les diamètres et
finalement, un diamètre de 28mm est marqué sur E. coli par la souche Lb. casei (Lbl55).
Le diamètre 08 mm est considéré comme étant le seuil minimum marqué par la souche Lb.
curvatus (Lbl64) sur Lis. monocytogenes. Les souches Lb. plantarum (Lbl25) et Lb. cellobiosus
(Lbl27) ont aussi marqué un bon effet inhibiteur sur les quatre germes pathogènes : 20mm
de diamètre de zone d’inhibition de la croissance de : S. aureus, Lis. monocytogenes et En.
faecalis sauf pour E.coli dont Lb. cellobiosus(Lbl27) l’a mieux inhibé (20 mm de diamètre) par
rapport à Lb. plantarum (Lbl25)
La souche Lb. casei (Lbl56) contrairement aux autres a mieux inhibé E. coli (22mm) et En.
faecalis (23mm) que Lis. monocytogenes et S. aureus avec des valeurs plus élevées.
En moyenne toutes les souches de Lactobacillus testées ont marqué un effet inhibiteur
notable sur Lis. monocytogenes et S. aureus (figure38) même sur En. faecalis et E. coli mais en
moyenne à diamètres plus ou moins inferieurs.
Lbl 55
Lbl59 Lbl24
Lbl63
Lbl25
Lbl26
Lbl27
Lbl62
Figure 38 : activité inhibitrice des souches isolées sur les souches indicatrices pathogènes :
1 –Listeria monocytogenes 33090, 2 –Staphylococcus aureus 25923, 3- Enterococcus faecalis 2035, 4Escherichia coli 25922, successivement.
3.8.1.2. La méthode indirecte :
80
a. Utilisation du surnageant natif :
L’inhibition des germes pathogènes demeure ainsi significative, pour les souches Lb.
plantarum (Lbl21, Lbl23, Lbl26 et Lbl57). Notamment, pour la souche: Lb. plantarum (Lbl21).
Cependant, l’effet du surnageant de la souche Lb. plantarum (Lbl26) devient plus faible avec
des diamètres compris entre: 10 et 13mm (tableau 9, figure 39).
La méthode des puits donne un résultat plus ou moins différent de celui de la méthode
directe. Les diamètres sont plus petits (entre 10 et 17mm), mais il y a toujours inhibition.
L’ensemble des surnageants natifs des souches testées inhibent les quatre souches
pathogènes déjà citées. Cependant, le surnageant natif de la souche Lb. acidophilus(Lbl62)
semble avoir un effet moyennement plus inhibant sur les quatre souches pathogènes.
L’effet majeur sur: Lis. monocytogenes est des surnageants natifs des souches: Lb. plantarum
(Lbl21, Lbl65), Lb. casei (Lbl55) et Lb. acidophilus(Lbl60). Celui sur: S. aureus, est exercé par
les surnageants natifs des souches: Lb. acidophilus(Lbl62) et Lb. plantarum (Lbl21). Tandis
que, sur: En. faecalis est celui exercé par le surnageant natif de la souche : Lb. plantarum
(Lbl22) et en fin sur: E. coli est des surnageants natifs des souches: Lb. acidophilus(Lbl62). En
comparaison avec les résultats de Kalalou et al., (2010), nos souches semblent être de bonne
inhibition vis-à-vis des souches pathogènes.
Tableau 9 : activité antagoniste des surnageants natifs des souches de Lactobacillus.
Diamètres des zones d’inhibition (mm)
Lis.
S. aureus
En. faecalis
E. coli
monocytogenes
Lb. plantarum (Lbl21)
15
16
12
16
14
14
15
15
12
12
10
15
11
13
10
14
15
13
13
14
13
12
13
13
Lb. casei (Lbl55)
15
15
13
13
Lb. acidophilus(Lbl61)
15
15
13
13
13
17
14
17
14
15
12
14
Lb. acidophilus(Lbl62)
Lb. cellobiosus (Lbl27)
µ
81
Figure 39 : activité inhibitrice des surnageants natifs des souches isolées sur les souches indicatrices
pathogènes : 1-Listeria monocytogenes 33090, 2 –Staphylococcus aureus 25923, 3- Enterococcus faecalis
2035, 4- Escherichia coli 25922, successivement.
b. L’utilisation de surnageant neutralisé :
D’après le tableau10: seul le surnageant neutralisé. La souche Lb. plantarum (Lbl23) exerce
une activité inhibitrice vis-à-vis de Lis. monocytogenes, S. aureus et En. Faecalis, mais pas sur
E.coli. Contrairement à ce qu’on note sur l’inhibition passée. Aucun des autres surnageants
neutralisés n’a inhibé les souches indicatrices (figure 40).
De cela, on attribue l’inhibition des souches pathogènes à l’effet de l’acide lactique qui
diminue le pH du milieu. Entre autre, des tests supplémentaires sur la nature de l’agent
inhibiteur secrété par la souche Lb. plantarum (Lbl23) doivent être mis en évidence.
Tableau 10 : activité antagoniste des surnageants neutralisés :
Diamètres d’inhibition (mm)
Lis.
S. aureus
En. faecalis
E. coli
monocytogenes
00
00
00
00
15
15
14
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
Lb. casei (Lbl55)
00
00
00
00
Lb. casei (Lbl56)
00
00
00
00
00
00
00
00
Lb. helveticus (Lbl59)
00
00
00
00
Lb. acidophilus (Lbl61)
00
00
00
00
Lb. curvatus (Lbl63)
00
00
00
00
82
Figure 40: activité inhibitrice des surnageants neutralisés des souches isolées sur les souches
3.8.2. Entre les souches de Lactobacillus :
Certaines souches ont une activité inhibitrice vis-à-vis des souches du même genre. Ce qui
est révélé par le résultat obtenu (tableau 11; figure 41). Toute zone supérieure à 02 mm est
prise en considération dans l’évaluation de l’inhibition.
Toutes les souches testées: Lb. plantarum (Lbl (21, 22, 23, 25, 26, 57), Lb. cellobiosus (Lbl27,
28), Lb. casei (Lbl55), Lb. curvatus (Lbl63) sont inhibées. Ainsi, celles fortement inhibées sont:
Lb. plantarum (Lbl21, 22, 25) et Lb. cellobiosus (Lbl28), les moins inhibées sont: Lb. plantarum
(Lbl23, Lbl26, Lbl65), Lb. casei (Lbl55, 57).
On note quelques cas de symbiose entre : Lb. plantarum (Lbl26) avec Lb. helveticus (Lbl59)
aussi bien qu’avec Lb. acidophilus (Lbl63) ; entre : Lb. curvatus (Lbl63) avec Lb. acidophilus
(Lbl61) et entre : Lb. plantarum (Lbl21) avec Lb. plantarum (Lbl26). Mise à part ces cas,
aucune autre souche ne présente de symbiose, ni avec les espèces des autres écosystèmes,
ni avec celles du même écosystème.
Le résultat obtenu est aussi figuré par Ali, (2010), qui s’est retrouvé face à de telles
interactions symbiotiques et inhibitrices ; entre différentes souches pré-identifiées toutes
comme étant: Lb. plantarum.
Figure 41 : interaction entre bactéries lactiques.
83
Tableau 11 : interactions entre bactéries lactiques.
Lbl23 Lbl25
Lbl26
Lbl65
Lbl27
Lbl28 Lbl55 Lbl57
Lbl63
Lb. plantarum(Lbl21)
+
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
+
_
_
+
_
_
_
_
_
+
_
_
+
_
_
_
_
_
_
_
_
_

_
Lb. casei (Lbl55)
_
_
_
_
_
_

_
_
Lb. plantarum Lbl59)
_
_
_
+
_
_
_
_
_
Lb. casei (Lbl60)
_
_
_
_
_
_
_
_
_
Lb.acidophilus(Lbl61)
+
_
_
+
_
_
_
_
+
Lb.acidophilus(Lbl62)
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_

Lb. curvatus(Lbl64)
_
_
_
_
_
_
_
_
_
Significations : (-) : interaction négative, (+) : interaction positive.
3.9. Etude du pouvoir texturant :
3.9.1. Recherche de la production des EPS :
En se basant sur le phénotype des souches de Lactobacilles, dont on note la formation d’un
long filament visible, dès qu’on touche les colonies visqueuses, soit par une anse ou par
cure-dent stérile. Elle en témoigne une forte production d’EPS sur gélose (résultats tableau
12):
Sur milieu MRS les souches Lb. plantarum (LBL65, Lbl21, Lbl22, Lbl23, Lbl24, Lbl26, Lbl27,
Lbl28,) et Lb. curvatus (Lbl63), ont présenté le résultat désiré. Elles étaient très gluantes
(figure 42a) le filament a dépassé 15mm. Le reste des souches était à phénotype plutôt
crémeux. Les filaments étaient plus courts d’un environ 2mm, à part celle à aspect très sec
et rude Lactobacillus.spp (Lbl20). Elle était gardée comme témoin pour la non production.
Elle n’a pas poussé sur milieu lait gélosé au rouge de ruthénium (figure 42e), ni sur MRS à
5% sucrose (MRSs), ni sur milieu MSE du à la teneur en sucrose élevée.
Sur le milieu MRS modifié au sucrose et au lactose : l’aspect visqueux fut apparu chez les
souches Lbl (21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 56 59, 60) (figure 42b). Tandis que, les souches : Lbl
(55, 57, 58, 61, 62, 63, 64) et Lbl65 montrent un aspect plutôt crémeux que visqueux.
84
Sur milieu MSE, toutes les souches présentent un aspect visqueux avec formation de
filaments bien persistants (figure 35.d). Toutefois, les souches Lbl (58, 60, 61 et 63) forment
des filaments mais qui ne sont pas persistants. La souche Lbl24 est visqueuse sans
formation de filament. Cependant, aucune souche n’exhibe la production du dextrane
apparenté à celui de l’espèce: Lnc. mesenteroides.
Sachant que les bactéries lactiques sont connues pour produire des EPS, soit visqueux ou
non visqueux (Roger, 2010). La recherche de production élevée conduite sur milieu gélosé
se basant sur l’aspect, était fructueuse surtout sur milieu MSE et MRSs. Les souches ayant
présenté cet aspect semblent donc produire des EPS.
Sur milieu au rouge de ruthénium, toutes les souches marquent un aspect très visqueux.
Les colonies sont larges et gluantes (figure 42.f). La croissance sur ces milieux étudiés n’est
pas semblable chez toutes les souches de Lactobacillus isolées. Bien qu’elles présentent un
aspect visqueux, les souches Lbl59 et Lbl63 y forment de petites colonies. Le reste semble
résister au stress osmotique.
85
Tableau 12 : résultats de la recherche qualitative de production des EPS.
Significations : ± : le filament formé par touche à l’anse ne persiste pas trop longtemps (environ 2 secondes) ;
+ : le filament est persistant (5 secondes) ; ++ : le filament est bien persistant.
86
Figure a : aspect visqueux de la souche productrice d’EPS Lbl26 et test de Ruas et de los, (2005) ; du
filament visqueux sur le milieu gélosé de Man Rogosa et Sharpe.
Figure b : aspect muqueux de la souche Lbl56 sur
MRS à 5% au lactose
Lbl57
sucrose
Lbl25
Lbl60
Lbl28
Lbl64
Figure c : aspect des souches sur milieu MRS
Lbl26
Lbl62
Lbl58
Figure d: aspect sur milieu MSE et y formation de filament.
Figure e: aspect des souches sur milieu au rouge de ruthénium
Figures 42 : a, b, c, d, e : recherche qualitative de souches productrices d’EPS.
87
Lbl60
Lbl62
Lbl24
Lbl22
Figure f : à gauche : aspect des souches sur milieu Chalmers modifié au glucose et au fructose et à
droite formation de filament à partir du milieu Chalmers au lactose.
Figure g : aspect de la souche Lbl26 sur Chalmers modifié au sucrose.
Figure 43 f et g : recherche qualitative de souches productrices d’EPS sur milieu Chalmers.
Le développement de la croissance des souches sur milieu Chalmers était lent par rapport
aux autres étudiés pour cet effet. Certaines colonies ont pris la coloration du rouge neutre.
Elles montrent un aspect visqueux après trois jours d’incubation et marquent la formation
du long filament. A partir du fructose et lactose (figure 43.g), toutes les souches marquent
formation du filament dès qu’on touche à l’aide d’une anse ou d’un cure-dent stérile
(figure 43.f). Cependant à partir du sucrose et glucose; seules les souches Lbl25 et Lbl59
n’exhibent pas d’aspect visqueux (tableau13)
88
Tableau 13 : formation d’EPS sur milieu Chalmers agar modifié.
Significations : - : pas de filament formé ; + : le filament est formé ; ++ : le filament est bien persistant.
 Test de Lingani (2010) :
En se référant au tube T qui témoigne d’un milieu MRS sans peptone à 5% sucrose stérile
sur lequel le même procédé d’extraction était appliqué ; sachant que le milieu contient de
l’extrait de levure ; les souches Lb. plantarum (Lbl22, Lbl26, et Lbl65), Lb. cellobiosus (Lbl27,
Lbl28) marquent un lien opaque important à l’interface (tableau 14 ; figure 44) ; elles sont
classées en premier puis se classent les différentes autres souches de Lactobacillus (Lbl24,
Lbl55, Lbl56, Lbl57, Lbl61, Lbl62 , Lbl63 et Lbl64). La souche Lb. plantarum (Lbl24) présente
le lien opaque le plus faible.
Contrairement à ce qu’on note sur milieu gélosé à-propos de la viscosité des souches. Ce
test met en évidence l’inégalité dans la production des EPS par rapport aux souches isolées
des margines qui semblent être toutes fortement productrices. Cependant, les souches de
Lb. plantarum (Lbl65, Lbl27 et Lbl28) qui avaient un aspect plutôt crémeux que visqueux ;
sont parmi les mieux classées.
T
Figure 44 : résultat du test estimatif de production des EPS.
89
Tableau 14 : les résultats du test de Lingani et al., (2010).
Souches
Intensité du
Souches
Intensité du
Souches
Intensité du
lien opaque
lien opaque
Lien opaque
des EPS
des EPS
des EPS
Lbl21
++
Lbl55
++
Lbl63
++
Lbl 22
++
Lbl56
++
Lbl64
+
Lbl23
+
Lbl57
++
Lbl65
++
Lbl24
±
Lbl58
+
Lbl25
+
Lbl59
++
Lbl26
++
Lbl60
++
Lbl27
++
Lbl61
+
Lbl28
++
Lbl62
++
 Sur lait écrémé :
L’étude de la production d’EPS, celle du caractère visqueux, ainsi que, du gel formé sont
résumées dans le tableau 15. On note chez les souches Lb. plantarum (Lbl23, LbL26, Lbl57),
Lb. acidophilus (Lbl61) et Lb. curvatus (Lbl63) un aspect épais et ferme du coagulum, du à la
viscosité très élevée par l’accumulation des EPS. Accompagnée d’une très grande rétention
du lactosérum (figure 45). Ainsi ; on considère les souches très performantes. Cependant,
la fermeté du coagulum est moins grande chez les souches Lb. plantarum Lbl (27, 65 et 57)
bien qu’il y eu parfois une présence de viscosité (Voir tableau ci-dessous).
Les différents résultats obtenus aident à comprendre l’effet des EPS sur la viscosité du lait,
certaines souches (Lb. cellobiosus (Lbl27 et Lbl28), Lb. casei (Lbl(55,56) et Lb. plantarum
(Lbl65), sont classées parmi celles fortement productrices d’EPS, sauf que l’effet de leur
EPS produits sur la modulation de la viscosité n’est pas considérable. Mais, ceci n’empêche
pas qu’il y eu une forte rétention d’eau; ce qui explique l’opinion de ceux qui disent que la
quantité d’EPS ne suffit pas ; c’est plutôt sa structure.
90
Figure 45 : aspect du gel formé sur lait écrémé par les souches Lbl23, Lbl26 et Lbl 27.
91
Tableau 15 : caractères visqueux des EPS dans le lait fermenté par les Lactobacilles.
Souches :
Caractère
formation de
Rétention de
Aspect du
visqueux des
filament
lactosérum
coagulum formé
EPS dans le lait
Lbl21
+
-
forte
Coagulum dense
Lbl22
+
-
Forte
Coagulum dense
Lbl23
+
+
Forte
Coagulum dense
Lbl25
+
-
faible
Petit coagulum
Lbl26
+
+
Forte
Coagulum dense
Lbl27
-
-
Forte
Coagulum dense
Lbl28
-
-
Forte
Coagulum dense
Lbl55
-
-
Forte
Coagulum dense
Lbl56
-
-
Forte
Coagulum dense
Lbl57
+
+
Forte
Petit coagulum
Lbl59
-
-
Moyenne
Petit coagulum
Lbl60
-
-
Faible
Petit coagulum
Lbl61
+
-
Forte
Coagulum dense
Lbl62
-
-
Faible
Coagulum dense
Lbl63
-
-
Forte
Coagulum dense
Lbl64
+
-
Forte
Coagulum dense
Lbl65
-
-
Forte
Petit coagulum
 Test d’estimation de la production des EPS :
La méthode de recherche de production d’EPS est aussi fructueuse. La précipitation a
permis d’évaluer à vu d’œil (figure 46) et à partir de plusieurs sources de carbone dans le
milieu, le rendement en EPS (figure 47). La souche la moins productrice à 30°C est Lb.
plantarum (Lbl24) ; ce qui a été déjà noté dans le test de Lingani et al., (2010). La souche Lb.
plantarum
(Lbl26)
reste
la
plus
fortement
productrice
(voir
tableau
16).
92
Tableau 16 : rendement en production des EPS en mg de masse sèche/ml.
Sources de carbone
Souches
Glucose
Lactose
Sucrose
Fructose
Lbl24
<1
<1
<1
<1
Lbl26
1.0
1.1
1.2
1.0
Lbl59
<1
<1
<1
<1
Lbl60
<1
<1
<1
<1
Lbl61
<1
1.0
1.0
<1
Lbl63
<1
1.0
<1
<1
Lbl63
Lac
Glu
FRU
Suc
T
Figure 46 : précipitation des EPS à l’éthanol.
Lbl62
Glu
Suc
Lac
FRU
Figure 47 : résultats du séchage des differents EPS après précipitation à l’éthanol.
3.9.2. Quantification des EPS purifiés:
Le résultat dans le tableau 17, illustre ce qui est obtenu par méthodes qualitatives. Il éclairci
la distinction entre les différents aspects phénotypiques des souches de Lactobacillus. La
souche : Lb. plantarum (Lbl26) demeure ainsi la plus fortement productrice ; puis se classe la
souche : Lb. plantarum (Lbl57), la souche Lb. acidophilus (Lbl61), Lb. curvatus (Lbl63), Lb.
plantarum (Lbl25) et en dernier vint : Lb. plantarum (Lbl22).
93
Tableau17 : taux de production des EPS quantifiés selon Dubois (1956) (en g/l).
4. Etude de la cinétique de croissance des souches Lb. plantarum (Lbl26), Lb.plantarum
(Lbl57)et Lb.acidophilus(Lbl61) :
En analysant les résultats obtenus (figure 48B) sur MRS à pH 5.4±0.2 à 30°C. On remarque
que la souche Lb. acidophilus (Lbl61) est la plus rapide, vu qu’elle se développe chaque
heure, avec un taux de croissance (µ3) de 0.65 h-1. En seconde place, se situe la souche Lb.
plantarum (Lbl26), qui se dédouble toutes les deux heures avec un taux (µ1) de 0. 297 h-1.
Pendant que, la souche Lb. plantarum (Lbl57) se dédouble toutes les trois heures avec un
taux de croissance (µ2) de 0.235 h-1.
La souche Lb. plantarum (Lbl57) présente une cinétique de croissance proche à celle de Lb.
plantarum (Lbl26), de même pour la cinétique d’acidification sur MRS. La souche Lb.
acidophilus (Lbl61) diffère en développement cellulaire, ainsi, en acidification sur milieu
MRS elle est moins acidifiante.
6
A
B
5
pH
4
3
Lbl61
Lbl57
Lbl26
2
1
0
0
2
4
6
Temps
(h)
18
24
Figure 48 A et B: cinétique de croissance et d’acidification sur MRS des souches : Lb. plantarum
(Lbl26), Lb. plantarum (Lbl57) et Lb. acidophilus (Lbl61).
5. Etude de la cinétique de production des EPS en fonction de la croissance bactérienne
chez Lb.plantarum (Lbl26):
D’après la courbe de croissance de la souche Lb. plantarum (Lbl26) (figure 49) sur milieu
MRSs à 30°C. On note un développement cellulaire différent à celui étudié sur MRS à 30°C.
Puisque le taux de génération spécifique µ1’ (0.247 h-1) est plus faible par rapport à µ1 (sur
94
milieu MRS) avec une différence de 0.05 h-1. Ce qui fait que le temps de génération
pratique G1’ devienne 2h 80 min ; ce qui signifie qu’on a un retard de 45min de génération.
La cinétique de production des EPS diffère de la cinétique de croissance (tableau 18); le
taux d’EPS à T0 était 1.88g /l. Il atteint son maximum à 24h. Il réduit après 48h pour arriver
à 9.10 g/l.
Tableau 18 : cinétique de la production des EPS en fonction de la croissance.
0h
3h
6h
18h
48h
Quantité d’EPS (g/L)
1.88
3.12
4. 34
11.2
9.10
Log10 Cfu/ml
7.87
8.31
8 .51
9.86
10.12
Figure 49 : cinétique de la production des EPS en fonction de la croissance de la souche Lb.
plantarum (Lbl26) sur MRSs.
6. Optimisation des conditions de la production des EPS chez Lb.plantarum (Lbl26) :
Le développement de la souche Lb. plantarum (Lbl26), sous des conditions définies : 23°C,
en anaérobiose sur MRSs aux deux pH testés (pH 5.4 et pH 6.2) et après 48h d’incubation,
demeure très faible, vue que le trouble ne soit pas intense ; en comparaison avec ceux
obtenus dans les autres milieux (MRSG, MRSF et MRSL), sous les autres conditions de
croissance : pH 5.4, pH 6.2 à 23°C et à 30°C.
L’analyse de la figure 50 fournit des informations sur le comportement producteur d’EPS
en fonction de différentes conditions. A une température de 23°C sur MRSs à pH 5.4 la
production des EPS chez la souche Lb. plantarum (Lbl26), est plus élevée que sur MRSs à
pH 6.2. Ainsi, elle représente la valeur maximale atteinte (12.14 g/l). Alors, qu’à 30°C. Elle
produit huit fois beaucoup plus à partir du pH 5.4 que du pH 6.2.
95
A 23°C sur MRSL et MRSG à pH 5.4 la production d’EPS reste toujours élevée, presque dix
fois plus avec le même pH à 30°C.
A 23°C à pH 6.2 sur MRSL et MRSG, le taux d’EPS produits diminue. Il devient bas pour
atteindre une valeur d’environ : 0.8g/l. Alors qu’à 30°C à partir du MRSL et MRSG la
production atteint son minimum (0.62 g/l).
Sur 12 combinaisons (figure 50); la combinaison (T°=23°C, MRSs, pH 5.4) est la meilleure
pour une production d’un taux maximal d’EPS, chez la souche Lb. plantarum (Lbl26). On les
considère comme conditions optimales pour un meilleur rendement. . On a déjà noté un
tel effet de la source de carbone sur la croissance aussi bien que sur la production des EPS
chez la souche Lb. reteuri ATCC 55730, (Årsköld et al., 2007), ou la meilleure combinaison
est (T°=37°C, pH4.5 et à 100g/l de sucrose) pour un rendement de 0.5g/g en EPS. Comme
chez la souche Lb. paracasei HCT, un privilège au glucose comme source de carbone est
noté (le maximum de sa production d’EPS a atteint 23.78g/l). Alors que le sucrose ne lui a
pas conféré un bon rendement (Xu et al., 2010).
Figure 50 : étude de l’optimisation des conditions de la production des EPS chez Lb. plantarum
(Lbl26).
7. Etude de quelques aptitides probiotiques :
7.1. La résistance aux antibiotiques :
Les souches présentant un diamètre de zone d’inhibition (figure 51 ; tableau 19) supérieur à
15mm sont considérées comme sensibles.
En analysant le tableau ci-dessous, on distingue que toutes les souches testées (Lbl22,
Lbl24, Lbl26, Lbl57, Lbl60 et Lbl61) résistent à la pénicilline à 6µg, l’ampicilline 10, la
Vancomycine et la Fosfomycine 50, l’acide nalidixique, elles sont sensibles à l’Amoxicilline,
96
l’Azithromycine, l’acide fusidique, la Cifotaxime, et la Pénicilline 10. Le comportement des
souches vis-à-vis du reste des antibiotiques était différent. Elles résistent à la gentamicine
contrairement aux souches Lb. acidophilus (Lbl61) et Lb. plantarum (Lbl24). Cependant, elles
sont inhibées par l’oxacilline à part les souches Lb. plantarum (Lbl22) et Lb. casei (Lbl60) qui
en résistent.
Les résistances notées sur la souche Lb. casei (Lbl60) à la Vancomycine, la Gentamycine et
l’Oxacilline sont naturelles. Comme l’a mentionné Belleti et al., (2009). Ainsi, sa résistance à
l’Ampicilline a aussi été notée par Herreros et al., (2005).
Figure 51: antibiogramme de la souche Lb. casei (Lbl60).
Tableau 19: résultats de la résistance et la sensibilité aux antibiotiques.
Antibiotiques
Souches
P10
P
Amx
Ox
Am
Azm
Va
Gm
Ctx
FA
Fos
AN
Lbl22
S
R
S
S
R
S
R
R
S
S
R
R
Lbl24
S
R
S
S
R
S
R
S
S
S
R
R
Lbl26
S
R
S
I
R
S
R
R
S
S
R
R
Lbl57
S
R
S
I
R
S
R
R
S
S
R
R
Lbl60
S
R
S
R
S
I
R
R
S
S
R
R
Lbl61
S
R
S
S
R
I
R
S
S
S
R
R
(R): résistante ; (I) intermédiaire ; (S): sensible.
D’après ce qu’on note dans le tableau 20 sur la survie des souches testées : Lb. plantarum
(Lbl23, Lbl26), Lb. acidophilus (Lbl61) (figure 52) et Lb. curvatus (Lbl63) elles sont
caractérisées par une bonne tolérance à l’acidité qui est en moyenne supérieure à 85%. La
souche Lb. plantarum (Lbl23) est la plus résistante avec un taux de 99.98%. Le reste des
97
souches Lb. plantarum (Lbl26) Lb. acidophilus (Lbl61) et Lb. curvatus (Lbl63) survie avec des
taux de 96.24, 86.69, 85.87%, successivement.
Sur le milieu MRS témoin à pH (5.4) (voir tableau 20), le taux de survie est supérieur à
100%, ce qui affirme un bon développement cellulaire.
Généralement, le taux de croissance diminue avec la diminution du pH. On note
cependant, une survie des souches pendant deux heures qui n’est pas négligeable (Kacem
et Karam, 2006).
Tableau 20: survie des souches à pH 2.
Souches :
Lbl23
Taux de survie (%)
Lbl26
Lbl61
Lbl63
pH 2
pH5.4
pH 2
pH5.4
pH 2
pH5.4
pH 2
pH5.4
99.98
106
96.24
101.8
86.69
101.2
85.87
102
Figure 52 : résistance à l’acidité après 2h par la souche Lb. acidophilus (Lbl61).
Sur l’ensemble des souches testées aucune ne survie sur MRS à 5% de sels biliaires à pH 2
(voir tableau 21). De ce fait; le taux de viabilité est nul chez les quatre souches : Lb.
plantarum (Lbl23, Lbl26) Lb. acidophilus (Lbl61) et Lb. curvatus (Lbl63).
Néanmoins ; a pH 8,5 et sur le même milieu le résultat est tout à fait différent. Les souches
y résistent avec des taux de survie élevés après deux heures d’incubation. Or la souche Lb.
plantarum (Lbl23) est considérée la plus apte à survivre avec un taux de 98.76 %(figure 53)
Le reste des souches Lb. plantarum (Lbl26), Lb. plantarum (Lbl 57) Lb. acidophilus (Lbl61) et
Lb. curvatus (Lbl63) survive avec des taux de 98.44, 96.00, 97.03 et 90.00, successivement.
98
Tableau 21: viabilité des souches sur milieu à 5% de sels biliaires.
Lbl23
Taux de
Lbl26
Lbl57
Lbl61
Lbl63
pH2
pH 8.5
pH2
pH8.5
pH2
pH8.5
pH2
pH8.5
pH2
pH8.5
00
98.76
00
98.44
00
96.00
00
97.03
00
90.00
viabilité (%)
Figure 53: viabilité de la souche : Lb. plantarum (Lbl23) sur MRS aux sels biliaires après 2h.
Figure 54 : viabilité des souches aux conditions extrêmes.
99
D discussion générale
On note une diversité en espèces de Lactobacilles isolées. L’échantillon de Klila. C’est une
niche écologique riche en bactéries lactiques. Elle héberge diverses espèces parmi
lesquelles celles retenues dans notre étude: Lb. casei, Lb. plantarum et Lb. helveticus. Les
margines d’olive fermentées aussi contiennent des bactéries lactiques. Les espèces
prédominantes sont : Lb. plantarum, Lb. brevis, Lb. Casei subsp casei, Lnc. mesenteroides, Lnc.
dextranicum et Pediococcus cerevisiae. Parfois, la présence de l’espèce du genre : Enterococcus
a été constatée (Asehraou et al., 1993 ; Campaniello et al., 2005). Le Raib est très riche en
bactéries lactiques (Taylor et al., 2006). Cependant, les seules retenues appartiennent à
l’espèce : Lb. acidophilus. Le levain de panification est riche en espèces de bactéries lactiques
parmi lesquelles Lb.sanfransiscensis, Lb. plantarum, Lb. salivarius, Lb. coryneformis. Lb casei, Lb.
farciminis, Lb. cellobiosus, Lb. brevis, Lb. fermentum, plus les pediocoques et Leuconostoc (Onno
et al., 2009).
Les souches indigènes de Lactobacillus isolées, ont présenté plusieurs caractères
technologiques désirables
à savoir: la production de composés aromatiques, la
fermentation du citrate,
la résistance au stress halin. Elles sont
protéolytiques,
lipolytiques, acidifiantes et inhibent la croissance des germes pathogènes référenciés qui
ont été testés: E. coli ATCC 29232, E. faecalis ATCC 2035, Lis. monocytogenes ATCC 33090 et
S. aureus ATCC 25923. Toutefois; en éliminant l’effet de l’acidité par neutralisation du
surnageant. L’inhibition des souches pathogènes n’est pas apparue. Ainsi, une inhibition
par la production d’acides organiques est la plus estimée. Mise à part par le surnageant
neutralisé de la souche Lb. plantarum (Lbl23), qui exerce un effet inhibiteur sur les souches
pathogènes mais pas sur l’espèce: E. coli.
Les souches pathogènes S. aureus ; E. coli sont responsables des toxi-infections alimentaires
individuelles et collectives (TIAC), par la production d’enterotoxines qui résistent au suc
digestif ; parfois même thermostables (Avril .J et al., 1992).
Lis.monocytogenes
et Ent.
Faecalis sont aussi des microbes pathogènes de grande préoccupation.
Les souches de Lactobacillus résistantes au sel peuvent présenter un intérêt technologique.
Elles pourraient en effet bien être testées pour transformer le lait, ou encore dans des
fermentations de produits salés (fromages salés, olives, concombres, viandes, …).
Pour la croissance à différents pH: acide (pH4), neutre (pH6.8) et alcalin (pH9), les souches
montrent une aptitude de s’adapter aux changements du pH du milieu de développement.
100
A pH 4, toutes les souches s’y développent. Elles sont donc aptes à prédominer les
substrats naturels ayant atteint un pH bas, pour, déclencher une fermentation spontanée
naturelle. A pH 9, les souches sont toujours capables à se développer. Ceci leur offre une
capacité d’être ubiquiste.
La confrontation entre les mêmes espèces de bactéries lactiques et les différentes espèces
appartenant au même genre (Lactobacillus), a révélé une diversité d’interactions soit
symbiotique ou inhibitrice. Cette dernière oriente vers la possibilité de production de
substances proches des bactériocines et ce qui diminue la possibilité de les exploiter
comme ferments mixtes.
Au-delà de leurs caractères originaux, les souches exhibent une production d’EPS
considérable. La capacité de production d’exopolysaccharides (EPS) par des souches de
bactéries lactiques isolées de levain de panification a été mise en évidence récemment. Ces
EPS correspondent à des homopolysaccharides composés de glucose (glucanes) ou de
fructose (fructanes). Ils sont synthétisés à partir de saccharose par des glycane-saccharases.
Il semble que ces polymères permettent d’améliorer la rhéologie des pâtes, la texture des
produits et de limiter les phénomènes de rassissement des produits céréaliers ; notamment,
par leur propriété d’hydrocolloïdes (Tieking et al., 2003; Marie et al., 2010; Palomba, 2012).
Parmi les effets bénéfiques des levains de panification sur la qualité du pain citons: le
retard du rassissement, l'augmentation de l'acidité, la protection contre les moisissures,
l'abaissement de l'index glycémique et l'amélioration du flaveur et de la texture (De
Vuyst et al., 2002).
Sur un ensemble de souches analysées, les souches Lb. plantarum (Lbl (21, 22, 23, 25, 26, 27
et 28), Lb. casei (Lbl56, 58 et 60) ont présenté un phénotype très visqueux sur différents
milieux de culture contenant du saccharose à concentration élevée. On a déjà marqué la
production des EPS par les espèces Lb. plantarum, Lb. casei et Lb. acidophilus (Wang, 2010 ;
Ismail et Nampoothiri, 2013, Fguiri et al., 2015).
En générale on inspecte la production des EPS principalement par les méthodes
qualitatives guidées, sur des milieux gélosés
(MRS, MSE, milieu au rouge de
ruthénium…).On note trois types d’aspects de colonies sur milieux aux taux élevés en
sucre : soit muqueux, visqueux ou crémeux.
101
Ces milieux modifiés gélosés aux taux élevés en source de carbone permettent une
sélection
préliminaire des souches pouvant produire
des EPS. Cependant, l’aspect
visqueux des souches ne suffit pas à affirmer la production d’EPS libres dans le milieu de
culture et les EPS synthétisés par les bactéries lactiques peuvent être soit visqueux ou non
visqueux. Parfois même, ce sont les EPS capsulaires qui en donnent la texture visqueuse ;
donc pour une extraction globale des méthodes de sonification et de lyse cellulaire doivent
être employées (Sanchez et al., 2006).
On a postulé que l’habilité de moduler la viscosité est corrélée plutôt avec la structure des
EPS (composition du monosaccharide, charge, poids moléculaire, degré d’embranchement
et rigidité du squelette) et leur interaction avec les composants du lait (notamment les
protéines), qu’avec leur quantité produite en (Duboc et Mollet, 2001; Gentes, 2011).
Looijesteijn et al. (2001) ont rapporté qu’au sein d’une même espèce de bactéries lactiques,
les résultats peuvent être différents. On a pu identifier des souches productrices d’EPS
(voire très fortement) et des souches non productrices sans que ce caractère n’engendre des
disparités de croissance.
D’après l’étude de la production des EPS en fonction de la croissance bactérienne
et
l’optimisation des conditions de la production des EPS. On déduit que, la production est
affectée par plusieurs paramètres à savoir la température d’incubation, la durée
d’incubation, le pH du milieu, la concentration de la source de carbone induite et la phase
de croissance. Cependant, à une température de croissance sous l’optimale, à pH acide, à
des taux trop élevés en source de carbone, la souche Lb. plantarum (Lbl26) exhibe une
production immense inattendue.
La production semble commencer à une phase de croissance avancée (6h) pour atteindre
son maximum (entre 18 à 28h). Comme chez la grande majorité des travaux réalisés sauf
quelques exceptions notées pour des espèces qui en produisent durant toutes les phases de
croissance (Dupont, 1998 ; Schutten et al., 1999 ; Aslim, 2005 ; Xu et al., 2010)
Le sucrose et le lactose sont de bonnes sources de carbone, favorisant un bon rendement en
EPS à une température de 23°C à pH 5.4. Le glucose aussi donne un bon rendement à30°C
à pH 5.4 (0.87g/l) par rapport à ce qui a été rapporté dans les travaux publiés (Schutten et
al., 1999).
102
Toutes les souches de Lactobacillus testées exhibent une résistance à au moins deux
antibiotiques ce qui est conforme aux résultats de kyriacou et al., (2008) qui a trouvé que Lb.
acidophilus résiste à un jusqu’à trois antibiotiques testés. Généralement, les Lactobacilles
ont une sensibilité envers les inhibiteurs de la synthèse de la paroi cellulaire comme les
pénicillines rencontrée chez des espèces utilisées comme probiotiques ou des cultures
starter des espèces du tractus
intestinal humain; mais encore plus résistants aux
céphalosporines. Comme ils ont une résistance naturelle élevée à l’acide fusidique,
gentamycine et la Vancomycine; sauf qu’une telle résistance intrinsèque codée sur le
plasmide est habituellement non transmissible (Zhou et al.2005; Snezara et Zora, 2011).
Les quatre souches sélectionnées qui sont testées pour la résistance à pH très acide (pH 2),
marquent un taux de viabilité qui est notable aussi bien que sur MRS à 0.5M de sels
biliaires (figure 54). On attribue leur résistance lors du passage à travers le tractus gastrointestinal à leur capacité de produire des EPS (Lindström et al. 2012) et puisque les
résistances aux antibiotiques testées qui sont déjà mentionnées dans la littérature comme
étant normales, avec une étude de caractères probiotiques supplémentaire (adhésion
cellulaire), ont pourra affirmer leur performance et la possibilité de les investir autant que
des probiotiques au sein des aliments fonctionnels avec des propriétés d’amélioration de la
santé par la production de prébiotiques . Car les EPS possèdent le potentiel à contribuer à
la santé humaine comme prébiotiques ou par leurs activités antitummorales,
antiulcériennes, immunomodulatrices ou réductrices de cholestérol. Mise à part la leur
effet sur la texture et la rhéologie (Ismail et Nampoothiri, 2013, Fguiri et al.,2015).
103
Conclusion
La grande diversité de l’habitat explique pourquoi les lactobacilles sont utilisés pour la
production de nombreux produits fermentés traditionnels.
On note sur les méthodes qualitatives qui sont probablement plus faciles, une incapacité
de détecter les souches visqueuses à faible taux de production.
Cependant, le test de Lingani permet de marquer une estimation approximative sur la
production d’EPS, en se basant sur la précipitation à l’éthanol. Comme il permet aussi une
sélection préliminaire des souches fortement productrices. Mais, ceci n’empêche pas que la
méthode colorimétrique de Dubois reste rapide, simple et surtout la plus fiable.
Cependant, lorsqu’on combine entre l’aspect phénotypique et la quantification précise, on
déduit que les souches qui ne présentent pas de filaments ne produisent pas de grandes
quantités d’EPS. Malgré qu’elles présentent un aspect visqueux. Cas de la souche : Lb.
plantarum (Lbl24). Elle a été gardée pour une comparaison de production avec les autres
isolats de Lactobacillus.
L’appréciation de la structure du lait fermenté (type de coagulum : ferme, non ferme,
dense, rétention du lactosérum, sa taille…), confère la distinction et la bonne
compréhension de la liaison structure-fonction des molécules d’EPS produits par les
souches lactiques étudiées, ainsi leur interaction avec les protéines.
Les paramètres étudiés dans l’optimisation de la production des EPS : température
d’incubation,
durée
d’incubation,
pH
du
milieu
de
culture
(conditions
environnementales) , nature et concentration de la source da carbone (conditions
nutritionnelles) et phase de croissance (conditions physiologiques), se sont apparus des
paramètres abruptes ; affectant la cinétique de la production des EPS ; aussi bien, que la
rentabilité.
Dans cette étude, le paramètre source de carbone a un effet notable sur la croissance, aussi
bien, que le rendement en EPS. Ainsi, le sucrose est la source de carbone la plus rentable
mais qui ne joue pas un bon facteur de croissance, puisqu’il, ralentit le développement
cellulaire de la souche Lb. plantarum (Lbl26). Le Lactose est la deuxième source de carbone
qui confère un bon rendement à des conditions bien définies.
104
Conclusion
Les travaux publiés examinant l’effet de la température sur la production des EPS par les
bactéries lactiques sont contradictoires ; dont certains rapportent une production immense
à température de croissance sub-optimale. Alors que, d’autres travaux suggèrent que la
majorité des EPS soit produite à des températures de croissance inferieures à l’optimale. Ce
qui a été clairement noté d’après le résultat d’optimisation de la production des EPS chez la
souche Lb. plantarum (Lbl26). A cet effet, on note une anomalie dans la littérature pour la
variété des raisons, concernant les différentes méthodes à mesurer les EPS, différents
milieux de culture, les conditions et les temps de mesure, plusieurs façons à exprimer la
production des EPS (mg d’EPS, mg EPS/l, mg EPS/cfu)…
Les EPS obtenus des souches peuvent être des candidats excellents pour la production des
aliments fonctionnels avec allégation santé.
105
Adebayo .C.O and Aderiye. B.I. 2010. Antifungal activity of bacteriocins of lactic acid
bacteria from some Nigerian fermented foods.Research journal of microbiology .5(11).10701082.
Ahmed.Z, Wang.Y, Anjum.N, Ahmad.H, Ahmad.A et Raza.M. 2013. Characterization of
new exopolysaccharides produced by coculturing of L. kefiranofaciens with yoghurt strains.
International Journal of Biological Macromolecules.59: 377– 383.
Alain LS.2004.Antagonistic activities of lactobacilli and bifidobacteria against microbial
pathogens.FEMS MicrobiologyReviews .28.405–440;
Ammor MS.2004.Ecosysteme microbien d’un atelier fermier de salaison : Identification et
propriétés des bactéries lactiques, école doctorale vie-agro-santé, 177Balice V.
Annika.M.M et Marc.B.2004. Industrial Use and Production of Lactic Acid Bacteria. Ed
Marcel Dekker,
Asehraou.A, Faid.M and Akhratouf.R.1993. pure culture fermentation of green olives by
Lactobacillus strains. Microbiologie -Aliments –Nutrition.11:221-228.
Aslim.B, Yu ksekdag.Z.N, Beyatli.Y and Mercan.N. 2005. Exopolysaccharide production by
Lactobacillus delbruckii subsp. bulgaricus and Streptococcus thermophilus strains under diﬀerent
growth conditions. World Journal of Microbiology & Biotechnology. 21:673–677.
Avril. J. L, Dabernat. H, Denis. F et Monteil. H. 1992. Bactériologie Clinique. Ellipses.
Axelsson. L. 2004. Lactic Acid Bacteria: Classification and Physiology. In Lactic acid
bacteria, Microbiological and Functional Aspect. Third Edition. Marcel Dekker.
Badel.S,
Bernardi.T
and
Michaud
.P.
2011.
New
perspectives
for
Lactobacilli
exopolysaccharides. Biotechnology Advances: 29. P 54–66.
Barefoot .S.F et Klaenhammer T.R. 1983. Detection and activity of lacticin B, a bacteriocin
produced by lactobacillus acidophilus. App. Env. Microbiol. 45 : 1808-1815.
Belal.J.M, Zaiton.H,and Sajaa .K.S.2011.Antifungal activity of Lactobacillus fermentum
TE007,Pediococcus pentosaceus Te010, Lactobacillus pentosus G004 and L.paracasei D5 on
selected foods .Journal of food science .V76.N7.M493-M499.
106
Boumehira.A.Z.2010. Identification et caractérisation technologique et fonctionnelle des
souches Lactobacillus plantarum isolées du lait cru de chèvre et de chamelle. Thèse de
doctorat. Faculté des Sciences ES-Senia.
Bouzar, Fm, Cerning, J., Desmazeaud, M. 1997. Exopolysaccharide production and texturepromoting abilities of mixed-strain starter cultures in yogurt production. Journal of Dairy
Science.80: 2310-2317.
Bresin.A, Rinaudo.M, Heyraud.A, Santaella.C, Baynast.R D et Heulin.T.2008 .Production
industrielle d’un polysaccharide bactérien luttant contre le stress hydrique. Innovation 104
TECHNO 1-7.
Carr. F. J, Chill. D, et Maida. N. 2002.The Lactic Acid Bacteria: A Literature Survey. Critical
Reviews in Microbiology, 28(4):281–370.
Campaniello.D, Bevilacqua.A, D’amato.D, Corbo.M.R, Altieri.C and Sinigaglia.M. 2005.
Microbial characterization of table olives: processed According to Spanish and Natural
Styles. Food Technology and Biotechnology.43: (3):289-294.
Cerning, J. 1990. Exocellular polysaccharides produced by lactic acid bacteria. Microbiol.
Rev. 87:113-130.
Chaplin M. F.2008. Carbohydrate Analysis in: Encyclopedia of analytical chemistry by
Meyers.R.A. John Wiley & Sons Ltd.
Cocolin .L and Ercolini. D. 2008 .Molecular Techniques in the Microbial Ecology of
Fermented Foods. Food microbiology and food safety series.Springer Science+Business
Media, LLC. sequencing of 16S rRNA. FEMS Microbiology Letters 77, 5-12.
De Man. J.C, Rogosa. M, et Sharpe. M.E. 1960. A medium for the cultivation of lactobacilli.
J. Appl. acteriol. 23, 130-135
De Vuyst.L and Degeest.B. 1999. Heteropolysaccharides from lactic acid bacteria. FEMS
Microbiol. Rev. 23:157–177.
De Vuyst.L, De Vin.F, Vaningelgem.F and Degeest.B. 2001. Recent developments in the
biosynthesis and applications of heteropolysaccharides from lactic acid bacteria. Int. Dairy
J. 11:687–707.
107
Degeest, B. and L. De Vuyst. 1999. Indication that the nitrogen source influences both
amount and size of exopolysaccharides produced by Streptococcus thermophilus LY03 and
modelling of the bacterial growth and exopolysaccharide production in a complex
medium.Appl. Environ. Microbiol. 65:2863– 2870.
Degeest, B., Mozzi, F. and De Vuyst, L.2002. Effect of medium composition and
temperature and pH changes on exopolysaccharide yields and stability during
Streptococcus thermophilus LY03fermentations. Int J Food Microbiol 79, 161–174.
DoguietKDenis D.2010. Biocontrôle des moisissures du genre Fusarium productrices de
fumonisines par sélection de bactéries lactiques autochtones de maïs. Thèse de doctorat
université Bordereaux école doctorale science de la vie et de la sante.
Dupont.I.1998. Identification moléculaire de souches de lactobacilles productrices
d'exopolysaccharides et comparaison de la production d'exopolysaccharides par trois de
ces souches. 'Université Laval, Faculté des études supérieures.
Duboc.P and Mollet. B.2001. Applications of exopolysaccharides in the dairy industry. Int.
Dairy J. 11:759-768.
Dubois.M, Gilles. K. A, Hamilton.J.K and Rebers.P.A. 1956. Colorimetric method for
determination of sugars and related substances. Anal. Chem. 28:350–356.
Farnworth.E.R.2005. Kefir – a complex probiotic. Food Science and Technology Bulletin:
Functional Foods 2 (1) 1–17.
Franz.C.M, Du Toit.M, Olasupo.N.A, Schillinger.U, Holzapfel.W.H.1998. Plantaricin D, a
bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum BFE 905 ready-to-eat salad. Lett Appl
Microbiol.26(3):231-5.
Fguiri.I, Ziadi.M, Atigui.M, Ayeb.N, Arroum.S, Assadi.M et Lorchani.T. 2015. Isolation and
production of EPS from camel milk. International journal of dairy technology.68:1-11.
Fleming .H.P, Etchells .J.L et Costilow.R.N. 1975. Microbial inhibition of isolates of
Pediococcus from cucumber brine. Appl. Env. Microbiol. 30 : 1040-1042.
108
Gentès.M.C, Daniel .S.G et Sylvie. L. T.2011. Gel formation and rheological properties of
fermented milk with in situ exopolysaccharide production by lactic acid bacteria. Dairy Sci.
& Technol. 90: 645–661.
Gevers.D, Huys.G and Swings.J.2001.Applicability of rep-PCR fingerprinting for
identification of Lactobacillus species.FEMSMicrobiol. Lett.205: 31–36.
Hames.B.D, Hooper.N.M et Houghton.J.D. 2006. Biochimie. Port royal livres, Paris.
Hammes.W.P et Hertel.C. 2006. The Genera Lactobacillus and Carnobacterium in
Prokaryotes. 4th edition.
Hassan. A.N, Frank .J.F and Qvist. K.B. 2002. Direct Observation of Bacterial
Exopolysaccharides in Dairy Products Using Confocal Scanning Laser Microscopy. J. Dairy
Sci. 85:1705–1708.
Herreros.
M.
A.,
Sandoval.H,
Gonzalez.L,
Castro.J.M,
Fresno.M.E.
2005.
TornadijoAntimicrobial activity and antibiotic resistance of lactic acid bacteria isolated
from Armada cheese (a Spanish goats’ milk cheese). Food Microbiology; 22: 455–459.
Ho Thi Nguyet T .2008 .Etude de la flore lactique du Nem Chua, produit carne fermente
cru traditionnel du sud vietnamien et maitrise du processus de fermentation par ajout des
souches lactiques sélectionnées spécifiques du produit. L’université Bordeaux école
doctorale de science de la vie et de la santé. N° d’ordre : 3738 ; 201.
Hydrominus.B , Le Marrec.P, Hadj Sassi.A et Deschamps.A.2000. Acid and bile tolérance of
spore forming lactic acid bacteria. Int.J.Food Microbiol.61:193-197.
Hutkins. R.W. 2006.Microbiology and Technology of Fermented Foods. Blackwell
Publishing. Premiere edition.
Ismail.B, Nampoothiri.K.M. 2010. Production, purification and structural characterization
of an exopolysaccharide produced by a probiotic Lb. plantarum MTCC 9510. Arch Microbiol
192:1049–1057
James.A. J, Martin.J A et David.A G.2005. Modern food microbiology. Springer science +
business media, Inc .Septicemia edition.
Jay JM.1982.Anyimicrobial properties of diacetyl .Appl.Environ.Microbiol.44.525-532.
109
Jolly.L, Stingele .F. 2001. Molecular organization and functionality of exopolysaccharide
gene clusters in lactic acid bacteria. Int Dairy J. 11:733–45.
Kacem.M and Karam N.E.2006.in vitro preselection criteria for probiotic Lb. plantarum
strains of fermented olives origin.International Journal of Probiotics and Prebiotics Vol. 1,
No. 1: 27-32
Kalalou.I, Zerdani. I and Faid .M. 2010. Antagonistic Action of Biopreservative Lactobacillus
plantarum Strain on Pathogenic E. coli O157:H7 in Fresh Camel Meat Stored at 10°C. World
Journal of Dairy & Food Sciences. 5 (1): 07-13.
Kouakou P, Philippe T.2011.Action des cultures protectrices : cas des germes lactiques sur
la flore alimentaire indésirable .Biotechnol. Agron. Soc. Environ. 15(2), 339-348.
Kimmel.S.A. and Roberts .R.F. 1998. Development of a growth medium suitable for
exopolysaccharide production by Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus RR. Int. J. Food
Microbiol. 40:87–92.
Kojic.M, Vujcic.M, Banina.A, Cocconcelli.P, Cerning.I and Topisiorvic.L.1992.Analysis of
Exopolysaccharide
Production
by
Lactobacillus
casei
CG11,
Isolated
from
Cheese.Appl.envir.Micro. Vol. 58, No. 12.p 4086-4088.
Kleanhammer .T.R .1986. Bacterionines of lactic acid bacteria. Biochimie .70:337-349
Lapionte.G.2009. Métabolisme des bactéries lactiques: production d’exopolysaccharides in:
Bactéries lactiques: physiologie, métabolisme, génomique et applications industrielles by
Drider.D et Herve.P. Ed Economia.
Laref.N,
Guessas.B.2013. Antifungal activity of newly isolates of lactic acid bacteria.
Innovative Romanian Food Biotechnology Vol. 13, Issue of September.
Leblond.B.N et Guedon.G .2009.Génétique génome et transcriptome: organisation et
évolution des génomes des bactéries lactiques agroalimentaires in bactéries lactiques by
DriderD et Prévost.H. Ed Economia.
Leroy.S, Lebert.I, Chacornac .J.P, Chevalier .I et Talon.R, 2007. Identification et
caractérisation de la flore d’intérêt technologique : bactéries lactiques et staphylocoques à
coagulase négative. Sci. Tec. V. Prod. Carnés. 25 : 172.
110
Liu .C.F, Tseng. K.C, Hsu .W.H andPan .T-M.2011.Immunomodulatory and antioxidant
potential of Lactobacillus exopolysaccharides. J Sci Food Agric: 2284–2291
Looijesteijn.P.J, Trapet.L, de Vries.E, Abee. T,and Hugenholtz.J.2001. Physiological function
of exopolysacharides produced by Lactococcus lactis. Int J Food Microbiol : 71–80.
Lindstrom.C, Holst.O, Nilsson. L, Öste. R, Andersson .K.E. 2012. Effects of Pediococcus
parvulus 2.6 and its exopolysaccharide on plasma cholesterol levels and inflammatory
markers in mice. AMB Express 2:66.
Magboul.A.A, McSweeney.P. 1999. Purification and characterization of an aminopeptidase
from Lactobacillus curvatus DPC2024. International Dairy Journal : 107–116.
Marie.S.B, Herve. R, Valerie. G, Sandrine.M, Magali R-S, Bruno.G & Catherine.F-F .2010.
Characterization of dextran-producing Weissella strains isolated from sourdoughs and
evidence of constitutive dextransucrase expression. FEMS Microbiol Lett :18–26.
Marshall.V.M,
Laws.A.P,
Gu
Y,
Levander.F,
Radstrom.P,
De
Vuyst
L.2001.
Exopolysaccharide- producing strains of thermophilic lactic acid bacteria cluster into
groups according to their EPS structure. Lett Appl Microbiol; 32: 433.
Mende.S, Krzyzanowski.L, Weber. J, Jaros .D and Rohm.H. 2012.Growth and
exopolysaccharide yield of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus DSM 20081 in batch and
continuous bioreactor experiments at constant pH. Journal of Bioscience and
Bioengineering VOL. 113, 185.
Messens.W et De.VL. 2002. Inhibitory substances produced by Lactobacilli isolated from
sourdoughs--a review. Int J Food Microbiol.72(1-2):31-43.
Molly .K, Demeyer .D, Johansson .G, Raemaekers .M, Ghistelinck M and GeenenI.1997.The
importance of meat enzymes in repening and flour generation in dry fermented sausages
.First results of a European project .Food chem.59.539-545.
Moulay. M, Aggad. H, Benmechernene. Z, Guessas .B, Henni.D.E and Kihal .M.2006.
Cultivable Lactic Acid Bacteria Isolated from Algerian Raw Goat’s Milk and Their
Proteolytic Activity. World Journal of Dairy & Food Sciences 1 (1): 12-18.
111
Mozzi.F, Rollan.G, Savoy de Giori.G and Font de Valdez.G. 2001.Effect of galactose and
glucose on the exopolysaccharide production and the activities of biosynthetic enzymes in
Lactobacillus casei CRL 87. J Appl Microbiol .91: 160–167.
Mozzi.F, Vaningelgem.F, Hebert.E.M, Van der Meulen.R, Foulquie Moreno.M.R, Font de
Valdez.G and De Vuyst.L. 2006. Diversity of heteropolysaccharide-producing lactic acid
bacterium strains and their biopolymers. Appl Environ Microbiol. 72: 4431–4435.
Muriana.P.M and Klaenhammer.T.R.1991.Purification and Partial Characterization of
Lactacin F, a Bacteriocin Produced by Lactobacillus acidophilus 11088.Appli and Enviro
Microbio 57: 114-121.
Nigatu .A, Ahrne´.S and Molin.G. 2000. Temperature-Dependent Variation in API 50 CH
Fermentation Profiles of Lactobacillus Species. Current Microbiology. Vol. 41 : 21–26.
Onno.B, Valcheva.R et Dousset.X.2009. Les levains de panification : un écosystème
microbien céréalier complexe et des fonctionnalités spécifiques, in: Bactéries lactiques:
physiologie, métabolisme, génomique et applications industrielles by Drider.D et Herve.P.
Ed Economia.
Papamanoli
E,
Kotzekidou
P,
Tzanetakis
N
and
Litopoulou-Tzanetaki
E.2002.Characterisation of Micrococcaceae isolated from dry fermented sausage .Food
Microbiol.19:441-449.
Patrignani.F, Lanciotti.R, Mathara.J.M, Guerzoni.M.E, Holzapfel.W.H. 2006. Potential of
functional strains, isolated from traditional Maasai milk, as starters for the production of
fermented milks, Int. J. Food Microbiol. 107: 1 – 11.
Paulraj.K,
Ramraj.S,
Neelakandan.Y,
KupusamyAlagesan
.P,
Vellaiyan
.P,
and
Venkatesan.A.2011.The role of environmental factors and medium composition on
bacteriocin production by an aquaculture probiotic Enterococcus faecium MC13 isolated
from fish intestine.Korean J. Chem. Eng., 28(3), 860-866.
Pham.PL, Dupont.I, Roy .D and Lapointe .G.2000. Production of exopolysaccharide by
Lactobacillus rhamnosus R and its enzymatic degradation during prolonged fermentation.
App.Envir.Micro.66: 2302-2310.
112
Petry.S, Furlau.S, Crepeau.M, Cerning.J and Desmazeaud.M: 2000.Factors affecting
exocellular polysaccharide production by Lb.delbrueckii subsp. bulgaricus grown in a
chemically defined medium, Appl. Environ. Microbiol., 66, 3427–3431.
Piard. J.Cand Desmazeaud. M.1991. Inhibiting factors produced by lactic acid bacteria. 2.
Bacteriocins and other antibacterial substances . Le Lait . 71, 525.
Prescott,
Harley,
Klein,
Willey.J.M,
Sherwood.L.M
and
Woolverton
.C.J.2010.Microbiologie. 3emme Ed De Boeck universite.p 1984.
Rendueles.O,
Kaplan
.J.
B
and
Ghigo.J-M.
2013.
Antibiofilm
polysaccharides.
Environmental Microbiology .15 , 2 : 334–346
Roger.P. 2006. Organic Acid and Solvent Production Part I: Acetic, Lactic, Gluconic,
Succinic and Polyhydroxyalkanoic Acids in Prokaryotes .1:511–755.Ed 3.
Romain.H. 2011. Caractérisation des régulateurs transcriptionnels Rgg et étude du rôle de
la protéine Rgg0182 de Streptococcus thermophilus. Thèse de doctorat .Université Henri
poincare.
Roudj.S.2010. Protéolyse chez Lactobacillus: purification et caractérisation de protéases et
aminopeptidases. Faculté des Sciences ; Es-Sciences Naturelles.
Ruas.M.P, Hugenholtz.J and Zoon.P. 2002. An overview of the functionality of
exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria. Int. Dairy J. 12:163-171.
Ruas.M. P and de los Reyes.G.C. G.2005. Invited Review: Methods for the Screening,
Isolation, and Characterization of Exopolysaccharides Produced by Lactic Acid Bacteria. J.
Dairy Sci. 88:843–856.
Sanchez.J.I, Martinez.B, Guillen.R, Jimenez.D.R and Rodriguez.A.2006. Culture Conditions
Determine the Balance between Two Different Exopolysaccharides Produced by
Lactobacillus pentosus LPS26.App.Envirenm.Micro. Vol. 72, No. 12. P 7495–7502.
Schutten.V.G.G.H, Fabier.E.G, Smit.E, Bonting.K, Smith.M.R, Brink.B.T, Kamerling.J.P,
vlieginthart.J.F.G and Dijkhuizen.L.1999. Biochemical and Structural Characterization of
the Glucan and Fructan Exopolysaccharides Synthesized by the Lactobacillus reuteri WildType Strain and by Mutant Strains. Appl.Envir.Microbiol. Vol. 65, No. 7 : 3008–3014.
113
Sexar.S, Schwenninger.S.M and Lacroix.C.2013.characterisation of the microflora of
industrial Mexican cheeses produced without added chemical preservatives.LWT-Food
Scienceand Technology.53:314-320.
Smaoui. .2010. Purification et Caractérisation de Biomolécules à partir de microorganismes
nouvellement isolés et identifiés. Doctorat de l’université de Toulouse.
Snezara.B et Zora.M.2011. Antimicrobial susceptibility of lactic acid bacteria isolated from
Sombor Cheese.Acta Veterinaria (Beograd), Vol. 61, No. 2-3, 247-258.
Stoyanova.L.G, Ustyugova.e.A, Netrusov.A.I.2012. antibacterialmetabolites of LAB /their
diversity and properties. Applied Biochemistry and Microbiology. 48:229-243.
Sutherland.I.W.2001.Microbial polysaccharides from Gram negative bacteria.Int Dairy J;
11:663–74.
Tabak.S et Bensoltane.A.2012.L’activité antagoniste des bactéries lactiques (Streptococcus
thermophilus, Bifidobacterium bifidum et Lactobacillus bulgaricus) vis-à vis de la souche
Helicobacter pylori responsable des maladies gastroduodénales. Nature & Technologie.6:79.
Talon.R, Leroy. S, Lebert. I.2007. Microbial ecosystems of traditional fermented meat
products: The importance of indigenous starters. Meat Science.77.p 55–62.
Tieking.M, Korakli. M, Ehrmann . M. A, Ganzle .M.G et Vogel. R. F.2003. In Situ
Production of Exopolysaccharides during Sourdough Fermentation by Cereal and
Intestinal Isolates of Lactic Acid Bacteria. Applied and Ennvironmental Microbiology, Vol.
69, No. 2 : p. 945–952.
Tomomi .H,Melaku .A, Miho .K, Chise .S, Sunee. N, Sadahiro .O.2009. Characterisation of
bacteriocin produced by Enterococcus faecalisN1-33 nd its application as a food
preservative.Journal of food protection .Vol 72. No 3:524-530
Udomsil. N, Rodtong. S, Tanasupawat.S , Yongsawatdigul.J.2010. Proteinase-producing
halophilic lactic acid bacteria isolated from fish sauce fermentation and their ability to
produce volatile compounds. International Journal of Food Microbiology.186–194.
Urshev.Z.L, Dimitrov.Z.P, Fatchikova.N. S,Petrova.I.G, Ishlimova.D.I. 2008. Partial
characterization and dynamics of synthesis of high molecular mass exopolysaccharides
114
from: Lb.delbrueckii ssp. bulgaricus and Str.thermophilus .World J Microbiol Biotechnol .
24:171–179.
Van der Meulen.R , Grosu-Tudor.S, Mozzi.F, Vaningelgem.F, Zamfir.M, Font de Valdez.G,
De Vuyst.L. 2007. Screening of lactic acid bacteria isolates from dairy and cereal products
for exopolysaccharide production and genes involved. International Journal of Food
Microbiology 118 :250–258.
Vandamme.P, Pot.B, Gillis.M, DeVos.P, Kersters.K and Swings.J.1996. Polyphasic
taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics.Microbiol. Rev. 60: 407.
Vandervoorde.L, Chritians.H et Verstraete.W .1991 .In vitro appraisal of the probiotic
value of intestinal lactobacilli. World journal of microbiology and Biotechnology, 7, 587_592.
Vaningelgem.F, Zamfir.M, Mozzi.F, Adriany.T, Vancanneyt.M, Swings.J and De
Vuyst.L.2004. Biodiversity of exopolysaccharides produced by Streptococcus thermophilus
strains
is
reflected
in
their
production
and
their
molecular
and
functional
characteristics.Appl.Environ.Microbiol.70:900–912.
Vedamuthu.E.R and Neville.J.M. 1986. Involvement of ropiness (mucoidness) in milk
cultures by Streptococcus cremoris MS. Appl. Environ. Microbiol. 51: 677 - 682.
Vinderola .G, Perdigon.G, Duarte.J, Thangavel.D, Farnworth .E, Matar.C .Immunobiology
.2006. 211, 149–156.
Wang.Y, Li.C , Liu.P, Ahmed.Z, Xiao.P, Bai.X. 2010. Physical characterization of
exopolysaccharides produced by Lactobacillus plantarum kF5 isolated from Tibet Kefir.
Carbohydrates polymers. 82, 895-903.
Welman. A.D, Maddox .I.S. 2003.Exopolysaccharides from lactic acid bacteria: perspectives
and challenges. Trends Biotechnol.21:269–74.
Xu.R, Ma.S, Wang.Y, Liu.L and Li.P .2010.African Journal of Microbiology Research. Vol
4(9):783-795 .
Zajsek.K, Gorsek.A et Kolar.M.2013.cultivating conditions effects on Kefiran production by
the mixed culture of lactic acid bacteria. Food chemistry. 139:970-977.
115
Zhang.L, Liu.C, Li.D, Zhao.Y, Zhanga.X, Zeng .X, Yang,Li. S. 2013.Antioxidant activity of
an exopolysaccharide isolated from Lactobacillus Plantarum C88. International Journal of
Biological Macromolecules. 54 :270– 275
Zhoua J.S., Pillidge C.J, Gopal P.K, Gill H.S.2005.Antibiotic susceptibility profiles of new
probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium strains. International Journal of Food
Microbiology.98 : 211 – 217.
Zourari.A,
Accolas.J.P
and
Desmazeaud.M.
1992.
Metabolism
and
biochemical
characteristics of yogurt bacteria. A review. Lait 72:1.
116
Annexe
Milieu MRS :
Peptone 10g
Extrait de viande 10g
Extrait de levure 5g
Glucose 20g
Phosphate bipotassique
2g
Acétate de sodium
5g
Citrate d’ammonium
2g
Sulfate de magnésium 0.2g
Sulfate de manganèse, 0.5g
Tween 80 1ml
Agar
15g
Eau distillée qsp
1000ml
Stérilisation par autoclavage à 120°C pendant 15 min, pH 5,4± 0.2.
117
Annexe
Tableau: activité antagoniste des souches de Lactobacillus.
Diamètres des zones d’inhibition (mm)
Lis. monocytogenes
S. aureus
E. faecalis
E. coli
33090
25923
2035
25922
Lb. casei (Lbl55)
24
25
21
28
Lb. casei (Lbl56)
19
18
23
22
Lb. casei (Lbl58)
20
16
16
16
Lb. casei (Lbl60)
15
13
15
30
20
14
15
20
20
25
20
20
20
25
20
15
20
20
20
12
15
13
20
20
21
25
20
20
20
22
16
14
21
20
15
16
25
20
23
27
23
25
19
19
20
11
18
25
08
20
30
20
Lb. helveticus(Lbl59)
26
20
20
22
Lb. cellobiosus(Lbl27)
20
20
21
20
12
10
15
Lb. cellobiosus(Lbl28)
21
118
Résumé
Les investisseurs de l’industrie laitière, désirent bénéficier des effets irremplaçables des
bactéries lactiques à caractères technologiques privilégiés. Les exopolysaccharides (EPS)
produits naturellement par certaines bactéries lactiques suscitent un intérêt technologique du à
leur capacité de rétention d’eau et celles de moduler la viscosité des produits fermentés. Notre
étude a pour but l’isolement de souches lactiques de différents écosystèmes : lait (Raib et
Klila), margines d’olive fermentées et du levain de panification ; ainsi, la sélection et
l’identification de celles productrices d’EPS. Quarante souches de bactéries lactiques
obtenues; appartenaient essentiellement à trois genres : Enterococcus (dix souches),
Leuconostoc (deux souches) et en grande partie à Lactobacillus (vingt huit souches). Environ
67% des souches isolées ont exhibé une production d’EPS ; spécialement, les souches de
Lactobacilles. Cependant, dix neuves souches ont été retenues à identifier et à évaluer leurs
aptitudes technologiques, notamment, le pouvoir texturant. En plus, de quelques aptitudes
probiotiques. Différentes espèces ont été pré-identifiées selon leurs caractères phénotypiques
: 8 souches de Lb. plantarum, 4 souches de: Lb. casei, 2 souches de: Lb .acidophilus et 2
souches de Lb. cellobiosus. Elles ont montré plusieurs performances d’après l’étude des
caractères technologiques et probiotiques ; mise à part leur production d’EPS. La recherche
de la production d’EPS a reposé sur deux types de tests : 1. Tests qualitatifs (sur gélose MRS
modifiée, milieu MSE, milieu au rouge de Rhuténium, milieu Chalmers modifié), lait écrémé, et
2. Tests quantitatifs (bouillon MRS modifié). La quasi totalité des souches ont montré un
aspect très visqueux sur les milieux utilisés pour la recherche de la production des EPS. Une
sélection préliminaire était effectuée grâce au test de Lingani. Néanmoins, la quantification a
révélé une certaine inégalité en production entre ces souches. Les souches les plus
performantes sont Lb. plantarum (Lbl25, Lbl26 et Lbl57), Lb. acidophilus (Lbl61) et Lb.
curvatus (Lbl63) avec des taux de production trop élevés, qui dépassent les 1 g/l.
L’optimisation des conditions de la production des EPS chez la souche Lb. plantarum (Lbl26),
a donné le meilleur rendement avec la combinaison (T°=23°C _ pH 5.4 _ MRS modifié à 10%
de sucrose) : 12.14 g/l.
Mots clés :
Bactéries Lactiques; Exopolysaccharides; EPS; Lactobacillus Plantarum; Optimisation De La
Production; Cinétique De Production; Probiotiques; Cellobiosus; Acidophilus; Casei.

Les exopolysaccharides des bactéries lactiques

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