Journée technique bioprocédés

Billet d’étonnement
Journée technique
bioprocédés
Réalisé par Carine DUWAT
Le 27/08/2015
Organisateurs
de l’événement
SOMMAIRE
Introduction_______________________________________________________________ 3
Programme_______________________________________________________________ 3
Note d’observation _________________________________________________________ 4
1.
Développements récents en biotechnologie industrielle _______________________ 4

Les nouveaux outils biologiques issue de l’ingénierie moléculaire _____________ 5

Stratégie et outils de l’ingénierie métabolique _____________________________ 5

La théorie de l’évolution appliquée à la chromatographie ____________________ 5

Les bioraffineries de 2ème génération___________________________________ 6
2.
Des produits remarquables en biotechnologie industrielle _____________________ 6

L’hydrocortisone____________________________________________________ 6

L’artémisinine ______________________________________________________ 6

Le PDO, 1,3 propanediol _____________________________________________ 7

L’isobutène________________________________________________________ 7
Le changement d’échelle des bioprocédés _________________________________ 7
3.

Scale-up et scale down des procédés de culture __________________________ 7

Changement d’échelle : l’apport des outils expérimentaux ___________________ 8

Changement d’échelle : l’apport des simulations numériques par CFD _________ 8

L’apport d’un ingénieur procédé _______________________________________ 8

Perspectives ______________________________________________________ 9
4.
Analyse et suivi en ligne des bioprocédés__________________________________ 9

QbD & PAT : un nouveau paradigme pour l’industrie pharmaceutique __________ 9

QbD & PAT : projet CELLPAT _________________________________________ 9

Suivi et signatures de procédés de production virale ______________________ 10
Ce qu’il faut retenir ________________________________________________________ 11
Carine Duwat // 27/08/2015
Journée Bioprocédés
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INTRODUCTION
Les pôles de compétitivité AXELERA, LYONBIOPOLE et leurs plateformes d’innovation
respectives, AXEL’ONE et ACCINOV, se sont associés pour organiser le jeudi 2 Juillet 2015
à CPE Lyon, une journée de réflexion et de partage sur les bioprocédés.
Une série de conférences mettant en lumière les développements récents depuis l’ingénierie
des micro-organismes jusqu’à la production à l’échelle industrielle ont été proposées, ainsi que
des tables rondes de réflexion et d’échanges.
PROGRAMME

Mots d’ouverture

Session 1 : Bioprocédés : du laboratoire à l’échelle industrielle - Applications et
développements récents
Coordinateurs : Claude DE BELLEFON | LGPC - CPE Lyon et Alain COZZONE |
Lyonbiopôle






Développements récents en biotechnologies industrielles – Pierre MONSAN |
Toulouse White Biotechnology / INSA Toulouse
Biologie de Synthèse, industrialisation du procédé Artémisinine | Paul BADUEL
| Sanofi
Scale-up et scale-down des procédés de culture : apport de quelques outils
expérimentaux et numériques du génie des procédés – Eric OLMOS | LRGP –
CNRS - Nancy
Le Process Design et les évaluations économiques au long de la vie d’un projet
de biotechnologie – Caroline AYMARD | IFP Energies Nouvelles
La théorie de l'évolution appliquée à la chromatographie – Jean BLEHAUT |
Novasep
PDO, 1,3 propanediol : une référence française en biotechnologie industrielle –
Antoine DARBOIS | Metabolic Explorer et Pascal ROUSSEAU | Processium

Formation Bioprocédés – Gérard PIGNAULT | CPE Lyon

Présentations Axel’One et Accinov

Session 2 : Suivi en ligne des bioprocédés
Coordinateur : Annie MARC (LRGP – CNRS – Nancy)


Suivi en ligne et signatures des procédés de production virale – Emma PETIOT
| Université de Lyon
Analyse en-ligne de procédés industriels de cultures de cellules animales par
spectroscopie Raman : suivi du métabolisme cellulaire et développement de
modèles pour le pilotage du procédé (Projet Cellpat) – Eric CALVOSA | Sanofi
Pasteur
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
Session 3 : Tables rondes
 Thème 1 : Analyse et suivi en ligne des procédés
Introduction par Sylvain Peyrache | ACCINOV
 Thème 2 : Mise à l’échelle et modélisation des bioprocédés
Introduction par Helena Gonzales-Penas | IFP EnergiesNouvelles
 Thème 3 : Nouvelles approches d’ingénierie métabolique au service de la santé
et de la chimie
Introduction par Marie-Gabrielle Jouan et Alexia Chandor-Proust | Bgene
NOTE D’OBSERVATION
1. Développements récents en biotechnologie industrielle
Les biotechnologies industrielles s’inscrivent dans le prolongement du génie biochimique en
intégrant les avancées des trente dernières années du génie biomoléculaire pour l’optimisation
des souches et des procédés de culture. Elles ont permis de redécouvrir des produits
renouvelables tels que le bioéthanol, l’isoglucose, le glutamate, l’acide citrique, l’acide lactique,
l’acrylamide ou encore les antibiotiques grâce à de nouvelles méthodologies comme par
exemple la lecture (séquençage) et l’écriture de l’ADN (synthèse). La banalisation de ces
méthodologies a décuplé les champs d’application des biotechnologies en remplaçant dans
certains cas des molécules issues de la pétrochimie par des produits de fermentation et donc
issus du carbone renouvelable. Ces évolutions ont permis des progrès considérables dans
différents domaines des biotechnologies industrielles. Appliquées historiquement au secteur
de la santé et de l’agroalimentaire ces nouvelles approchent s’adressent également désormais
à la chimie de spécialité, aux bioénergies ou aux matériaux, comme le montre la figure cidessous.
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
Les nouveaux outils biologiques issus de l’ingénierie moléculaire
Les enzymes, les microorganismes ainsi que les consortia microbiens sont les outils
biologiques qui sont utilisés dans les développements des biotechnologies industrielles.
L’ingénierie moléculaire enzymatique s’appuie sur des méthodes de l’ingénierie aléatoire et
rationnelle, et permet l’amélioration de catalyseurs biologiques grâce à la création de nouvelles
activités catalytiques. La mutagénèse dirigée est également un outil qui peut par exemple faire
évoluer la sensibilité des enzymes.
L’ingénierie métabolique des microorganismes – ou usines cellulaires – a pour objectif
l’amélioration dirigée de la synthèse d’un produit (ressource renouvelable) par la modification
de voies métaboliques existantes ou l’introduction de nouvelles voies métaboliques.
La métabolomique a également été présentée comme une approche de biologie intégrative
dédiée à l’analyse du métabolisme des microorganismes à l’échelle du système biologique
(cette approche va plus loin que la biologie de synthèse).
La biologie de synthèse (biologie synthétique) progresse à grande vitesse. Elle est définie
comme « l’ingénierie de composants et de systèmes biologiques qui n’existent pas dans la
nature et la réingénierie d’éléments biologiques existants; elle porte sur la conception
intentionnelle de systèmes biologiques artificiels ». Cette combinaison de l’ingénierie
métabolique pour la création de nouvelles voies métaboliques et de la métabolomique pour la
compréhension et l’analyse de ces nouvelles voies permet de développer de nouvelles
molécules non disponibles dans le vivant ou d’améliorer la productivité de produits existants.

Stratégie et outils de l’ingénierie métabolique
L’ingénierie métabolique s’appuie sur des outils bio-informatiques afin d’identifier les
meilleures voies biologiques et de modéliser in silico la transformation de la matière première
(une source de carbone renouvelable pouvant selon l’application être plus ou moins raffinée
et provenir de l’agriculture et ses coproduits, de la foresterie…) en composés d’intérêt
industriel. En aval, la biologie moléculaire quant à elle sert à construire la souche recombinante
(modifiée) pour des essais in vitro, au laboratoire. Lors de ces essais, les flux métaboliques
peuvent être examinés et les données bioinformatiques vérifiées expérimentalement
(quantification des rendements, production de sous-produits…).

La théorie de l’évolution appliquée à la chromatographie
La théorie de l’évolution appliquée à la chromatographie montre qu’à partir d’une même
technique, les contraintes – pression économique, échelle de production, taux de pureté… –
de chaque industrie (sucrière, pharmaceutique, pétrolière…) ont différencié les technologies
au point d’aboutir à des procédés dont les caractéristiques peuvent être très différentes.
L’évolution a permis de générer des techniques chromatographiques différentes, performantes
et adaptées en fonction des applications.
La simulation informatique permet d’orienter les développements en chromatographie (choix
des paramètres et des conditions de travail, optimisation des outils…).
Carine Duwat // 27/08/2015
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
Les bioraffineries de 2ème génération
Aujourd’hui les enjeux des bioraffineries portent sur :
-
la découverte d’autres sources de carbone renouvelable,
l’intégration agriculture / industrie,
la valorisation de la plante entière,
le « craquage » végétal,
les applications alimentaires / non alimentaires.
De nombreux projets ont été lancés (Abengoa, Beta renewables / novozymes / Chemtex,
CIMV / Dyadic / taurus / rolkem / BBE / TWB, Clariant, Dupont cellulosic ethanol, Futurol,
Granbio ou Poet-DSM…) et la pression des coûts face à la baisse du prix du pétrole permettra
sans doute de dresser un bilan économique des installations de 2ème génération très
prochainement.
Les bioraffineries de 3ème génération s’appuieront notamment sur d’autres microorganismes
tels que les micro-algues et devrait s’affranchir de la concurrence avec les agro-ressources.
2. Des produits remarquables en biotechnologie industrielle

L’hydrocortisone
L’hydrocortisone est un bel exemple français de réussite de la synthèse totale d’un
médicament par une levure. Ce développement a été réalisé par Denis Pompon (CNRS). La
biosynthèse totale produit un médicament de façon autonome à partir de sources de carbone
simples (alcool, sucre) et d’oxygène.
La voie de production actuelle, l’hémisynthèse, est complexe, coûteuse et génératrice de sousproduits car elle demande de nombreuses étapes de conversion chimique et de bioconversion,
et utilise des acides biliaires ou du phytostérol.

L’artémisinine
Le besoin d’artémisinine est de 150 à 200 tonnes par an afin de couvrir les besoins de lutte
contre le paludisme. L’artémisinine est traditionnellement obtenue par extraction végétale à
partir de l’armoise. Un procédé combinant la biologie de synthèse et la chimie, développé par
l’université de Berkeley et la société Amyris a été financé par la fondation Gates (BMGF). Ainsi,
le métabolisme végétal de la plante produisant l’acide artemesinique a été intégré dans une
souche de levure pouvant être cultivée en fermenteur industriel.
Sanofi a repris le développement de ce produit a industrialisé le procédé de fabrication.
L’objectif de cette nouvelle approche est de s’affranchir des variations saisonnières et de
sécuriser ainsi l’approvisionnement du médicament. A terme, ce procédé devrait stabiliser le
prix des traitements à base d’artémisinine.
Aujourd’hui, la capacité de production opérationnelle est de 60 à 80 tonnes par an.
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
Le PDO, 1,3 propanediol
Initialement dérivé de la pétrochimie, le PDO peut aujourd’hui être issu des biotechnologies.
Cet intermédiaire entre dans la production de PTT (poly-triméthylène-téréphtalate) et du PU
(polyuréthane) et sa demande est en forte croissance (de 60 kt en 2012, à 160 kt en 2019).
Afin de couvrir ces besoins, de nouveaux procédés ont été développés notamment par le
groupe Dupont (base glucose-Escherichia coli) et la PME Clermontoise Metabolic Explorer
(base glycérine-Clostridium acetobutylicum).
Après avoir développé une souche de Clostridium butyricum (procédé ABE) produisant le
PDO, une souche industrielle a été optimisée. Les procédés de culture amont ont été optimisés
par Metex et les travaux de développement de la purification, en aval, (downstream
processing) ont été traités par Processium. Ces optimisation ont permis de dégager des
avantages compétitifs comme la réduction du nombre d’étapes de purification, la conception
modulaire fermentation / purification, le retraitement des effluents, la nature du procédé
anaérobie vs aérobie, et le procédé continu vs fed-batch.

L’isobutène
L’isobutène est un hydrocarbure aliphatique utilisé dans le caoutchouc, les carburants
(essence, kérosène), les plastiques, les lubrifiants, le verre organique, et les peintures. La
production par voies métaboliques artificielles d’isobutène à partir de glucide (glucose,
saccharose) est une découverte importante, une réelle innovation de rupture. Il s’agit du
premier procédé de fermentation par voie gazeuse. Il aura fallu 6 ans pour passer de la preuve
de concept (2009) à la commercialisation en 2015 par IBN-One, en passant par des phases
de développement (construction de souches et fermentation), et d’industrialisation (avec le
pilote industriel Pomacle), et des collaborations industrielles Arkema, Audi…).
3. Le changement d’échelle des bioprocédés

Scale-up et scale down des procédés de culture
Selon Neubauer et al. (2013), la faisabilité de la montée en échelle des bioréacteurs (ingénierie
/ industrialisation) doit être réalisée dès les premières étapes de développement : plans
d’expérience, cultures en parallèle grâce à des mini-réacteurs, mesures et analyse en ligne,
modélisation.
L’extrapolation (scale-up), c’est augmenter l’échelle de production sans modifier les
performances du procédé. A l’inverse l’intrapolation (scale down), c’est réduire les échelles de
culture pour optimiser le procédé à l’échelle du laboratoire en reproduisant les phénomènes
observés. L’objectif du scale-down est de donner une valeur prédictive aux expériences
réalisées à petite échelle pour faciliter ensuite la transposition des procédés à une échelle
industrielle.
Extrapoler un bioréacteur engage des problématiques particulières liées au système
biologique étudié (usine cellulaire) et à son microenvironnement (concentration en substrats,
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transfert de matière, contraintes hydromécaniques, paramètres physiques). La réponse
physiologique des cellules (croissance, viabilité,…) se traduit par des effets en termes de
performance du procédé : consommations des matières premières, productivité et rendement.

Changement d’échelle : l’apport des outils expérimentaux
L’exemple du procédé de production du succinate par Corynebacterium glutamicum 2262
démontre que des systèmes expérimentaux adaptés apportent des réponses quant aux
changements d’échelle de substrats renouvelables. L’acide succinique présente de
nombreuses applications industrielles (produits alimentaires et pharmaceutiques, surfactants,
détergents, solvants verts, plastiques biodégradables). La biosynthèse microbienne est une
alternative à la pétrochimie. L’acide succinique est considéré comme l’une des 12
biomolécules d’intérêt industriel, qui peut être produite à l’échelle industrielle.
Le développement « small-scale » a servi à identifier expérimentalement les conditions de flux
d’O2 favorisant la production de succinate. La culture en bioréacteur « lab-scale » a fourni des
résultats surprenants avec un rendement accru grâce à l’adaptation des stratégies
d’oxygénation / désoxygénation. La culture en bioréacteur « scale-down » permet de prédire
la réponse du procédé de culture à grande échelle car l’accès à des équipements industriels
n’est pas possible. L’outil de prédiction de la croissance à grande échelle est possible si les
fractions de zone mal aérées sont connues.

Changement d’échelle : l’apport des simulations numériques par CFD
Le projet ANR STEMCellREAcTOR (2015-2019) vise à proposer une technologie innovante
(design, supports de culture, conditions opératoires) de culture de hMSC, à une échelle de
quelques litres, reposant sur :
-
une modélisation fine des couplages hydrodynamique / réponse biologique,
la fonctionnalisation à façon des supports d’adhérence,
l’interfaçage simplifié pour son implantation en milieu clinique.
Parmi les outils de caractérisation de l’hydrodynamique des bioréacteurs, la simulation
numérique des écoulements (CFD) a montré de très fortes potentialités.
Dans le cadre de cette étude, la CFD est utilisée pour
-
-
:
caractériser l’hydrodynamique au sein des bioréacteurs de culture (250 mL et 1 L) en
termes de : champs de vitesses, dissipation turbulente, et champs de concentration en
microporteurs et fréquences locales de collision,
construire une toolbox validée pour cribler des configurations de bioréacteur et
rationnaliser la validation des équipements effectivement construits.

L’apport d’un ingénieur procédé
Les difficultés d’extrapolation en biotechnologie tiennent dans les conditions de mélange et à
certaines limitations (vitesse, transfert…). Le scale-down sert alors à évaluer les impacts
d’hétérogénéités et les limitations.
Dès les premières phases d’étude, l’ingénieur procédé est impliqué pour aider à définir des
cibles, focaliser la recherche sur les verrous, anticiper le « downstream » et construire la
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viabilité économique. Lors de projet de changement d’échelle, les critères déterminants
peuvent ainsi être étudiés ainsi que les phases du changement d’échelle.
Différents vocables sont possibles : pilote, prototype, démonstrateur industriel. Les tailles de
ces unités intermédiaires sont dépendantes du procédé et de la capacité industrielle visée.
L’important est de bien définir les buts, qu’est-ce que l’on veut faire faire avec l’outil : étudier
le microorganisme, le down-stream, la séparation, le recyclage, la qualité produits… La
question de la possibilité / utilité d’un pilote versatile devra également se poser.

Perspectives
De la micro-échelle à l’échelle industrielle, les procédures d’extrapolation seront accélérées,
prédictives, rationalisées basées sur des outils de modélisation hydro-biologiques validés ;
avec par exemple l’intégration de modèle métabolique dans le processus d’extrapolation.
La stratégie de l’axe Bioprocédés Biomolécules du LRGP repose sur une intégration
multiéchelle et pluridisciplinaire des connaissances afin d’obtenir une meilleure maîtrise des
couplages fondamentaux et in fine, de faciliter le processus d’extrapolation.
4. Analyse et suivi en ligne des bioprocédés

QbD & PAT : un nouveau paradigme pour l’industrie pharmaceutique
Le Quality by design (QbD) est un concept d’une quinzaine d’années présenté par les
organismes de régulation. Il est apparu sous forme de directive notamment via la FDA pour
l’industrie pharmaceutique. Le principe n’est plus de contrôler à la fin de la chaine mais
pendant le procédé de fabrication voir en amont de la production.
QbD & PAT (Process Analytical Technology) est un nouveau paradigme pour l’industrie
pharmaceutique. La qualité des produits ne peut plus être testée seulement à la fin du procédé
de fabrication, elle doit y être intégrée et être conçue en amont. Il faut définir les critères
critiques du produit. Les objectifs étant de :
-
libérer les lots en temps réel,
réduire les durées de production,
maîtriser la variabilité,
faciliter l’amélioration continue,
accroître l’automatisation.
Une meilleure connaissance du produit et du procédé de fabrication permet d’obtenir à long
terme une amélioration continue.
Deux approches complémentaires co-existent pour la démarche QbD & PAT et déterminent la
signature du produit :
-
la description et la caractérisation du procédé de production,
la mise en place et/ou le développement d’outils de suivi en-ligne.

QbD & PAT : projet CELLPAT
CELLPAT (projet FUI 2013) a pour objectifs le pilotage et la maîtrise des procédés de la
bioproduction dans les domaines de la culture cellulaire, production de molécules d’intérêts et
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production de particules virales. Cette démarche s’intègre dans les initiatives de « Process
Analytical Technology » et de « Quality By Design » incitées par les autorités de santé. Ce
travail collaboratif permet un suivi en continu d’un grand nombre de paramètres physiques et
biochimiques. La modélisation de ces paramètres et la simulation dynamique du procédé
débouchera sur l’augmentation de la maîtrise et le contrôle en ligne de ces procédés. Les
outils développés pourront ensuite avoir des applications dans d’autres domaines tels que
diagnostic, fermentation, agroalimentaire, biofuel, purification et formulation.
Le projet se focalise sur trois méthodologies : l’analyse Raman, la modélisation et le
métabolomique. Le travail porte sur les paramètres critiques (CQA) : milieu de culture, types
de procédés, concentration de cellule, température…

Suivi et signatures de procédés de production virale
Les procédés de production à base de culture cellulaire sont complexes. Au niveau du procédé
il faut connaître :
-
-
les paramètres mécaniques et hydrodynamiques (ex. agitation, mode d’aération,
modèle de réacteur / volume de culture, paramètres physico chimiques, mode
d’alimentation, milieu de culture) ;
les paramètres physico-chimiques (ex. température, pH, pO2) ;
le mode d’alimentation (Batch/Fed-batch /Perfusion) ;
le milieu de culture (avec ou sans sérum de veau fœtal).
Au niveau de la cellule, on observe le métabolisme et l’état cellulaire, la prolifération cellulaire,
et la mort cellulaire.
Les variables critiques pour ce type de procédés sont :
-
la quantité et l’état des cellules (viabilité, métabolisme et transcriptome / protéome)
la quantité et la qualité du produit : quantité de particules virales, et leur qualité
(infectieuses / non infectieuses, morphologie), et celle des antigènes.
Le transcriptome est un indicateur central de l’état cellulaire. La signature transcriptomique
des cellules productrices est une stratégie développée et validée pour l’optimisation de
production de virus. Ce qui serait intéressant à terme serait de créer une bibliothèque de
signatures pour le suivi qualité du procédé. Le couplage / corrélation avec d’autres signatures
obtenues par des technologies de suivi en-ligne est également un indicateur à prendre en
compte.
L’optimisation du procédé passe par la comparaison des signatures pour des souches hyper
et hypo productrices, et l’évaluation de l’impact du procédé sur la production virale au niveau
cellulaire.
Le suivi en ligne des cellules productrices est réalisé par une sonde de capacitance. La
polarisation des structures sphériques par un champ électrique permet de valider que la
production a bien été mise en route, d’interrompre la production et limiter le nombre de cellules
mortes, de contrôler la production. La réplication de virus dans une cellule comprend
différentes phases qui ont un impact direct sur la morphologie et l’état cellulaire. Les
paramètres de la décharge des cellules sont liés à leurs caractéristiques morphologiques et
physiologiques.
Pour faire du suivi en ligne des procédés de production virale, il faut :
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-
-
des procédés de productions opérationnelles,
des outils de qualification et quantification : méthodes analytiques de référence pour la
mise en place d’un suivi en ligne,
une expertise pour le développement d’outils en ligne et des bioprocédés : outils
analytiques développés pour ce type de bioprocédés ou issus d’autres types de
procédés (bactério / chimie),
une expertise sur la compréhension des mécanismes biologiques : connaissance
fondamentale, et réplication virale / biologie cellulaire,
une expertise en bioprocédés : connaissance des procédés USP / DSP, et paramètres
critiques (CQA /CPP).
CE QU’IL FAUT RETENIR
Les biotechnologies industrielles de demain au service de la santé et de la chimie reposent
notamment sur le développement de nouvelles méthodologies en ingénierie métabolique et
biologie de synthèse.
Les prérequis de la biotechnologie industrielle présentés lors de cette journée donnent des
clés de succès aux développements de ces nouvelles méthodologies : des innovations de
rupture en ingénierie métabolique et en génie des procédés, la capacité à nouer des alliances,
la compétitivité des coûts, et la performance du produit en application.
Les enjeux principaux des biotechnologies industrielles ont été présentés en conférence et
discutés en table-ronde tels que : la transposition à l’échelle industrielle et le besoin d’améliorer
les méthodologies d’extrapolation, le suivi qualité et l’analyse en ligne des bioproduits,
l’optimisation de la bioproduction (libération en temps réel, réduction des temps de cycle),
l’acceptabilité sociétale, la gestion de la propriété intellectuelle, le développement d’outils
numériques (simulation, modélisation, prédiction…), la gestion des données (big data)…
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